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分生實驗 第十二組 四生三甲 蔡一誠 931242003

利用 SDS 的鹼性裂解配製質體 DNA

目的:
利用 Alkaline Lysis 和 SDS 分離出質體 DNA,分離出質體 DNA 配製品能藉著被
電泳篩選或限制內核酸酶分解。利用 PEG 的處理〈聚乙烯乙二醇〉能更進一步純
化,產物可被當作核酸排序的模板。

<材料>
Alkaline lysis solution I(冰):25 mM Tris-HCl、10 mM EDTA。
Alkaline lysis solution II(室溫、需現配):0 . 2N NaOH、1% SDS。
Alkaline lysis solution III(冰)
Phenol:choroform(v / v=1:1)
Ethanol
TE(PH= 8 . 0)containing 20 μg/ml DNase-free RNase A
Pipette、Tip
離心機、Microfuge tube

<方法:>
Preparation of Cells
1. 製造 2ml 充滿營養的環境容納適量的抗生素和單一菌落的突變細菌,細菌培
養物會在攝氏 37 度 C 下的晃動一個晚上後慢慢形成。
2. 注入 1.5ml 的培養菌至離心管中。在攝氏 4 度 C 下以最高速離心 30 秒。貯存未
使用的部份的最初培養菌於攝氏 4 度中。
3. 離心後,盡可能將上清液完全移除,留下顆粒狀物。
4. 此顆粒小物經由強而有力的旋轉再次懸浮在 0.1ml 冰冷的 Alkaline lysis
solution I 中。
5. 加入 0.2ml 新配製的 Alkaline lysis solution II 到上清液中。密封住試管快速地上
下搖晃均勻 5 次。不要用旋轉的! 之後試管存放於冰塊中。
6. 加入 0.15ml 冷凍的 Alkaline lysis solution III。密封試管以上下顛倒的方法混合
數次使鹼性裂解分散到黏性的 Bacterial Lysate。貯存試管在冰上 3-5 分鍾。
7. Bacterial Lysate 置於離心機中在 4 度 C 中以最大速度離心 5 分鍾。將其上清液
移到新試管中。
8. 加入一等量體積的 Phenol:chloroform.利用旋轉混合有機的和水的相。並將其
乳狀物在 4 度 C 以最大轉速離心 2 分鍾。將其上層液體移到新的試管中。
9. 從表層沉澱的核酸在室溫中加入 2 毫升的酒精。混合均於後在室溫下使用離
心機離心兩分鐘。
10. 取沉澱的核酸在 4 度 C 以最大轉速離心五分鐘。
11. 和緩地把上層液抽取掉,如第三步驟。把試管反置在紙毛巾上排掉液體。使用
Kimwipe 或用完既丢移液管去除黏附在管壁上的溶液。
12. 剩餘下來的顆粒狀物加入 70% 1 毫升的酒精搖晃數次。再放入微量離心管在
4 度 C 用最大轉速離心兩分鐘即取得所要的 DNA。
13. 再一次和緩地把上層液抽取掉,如第三步驟。
14. 去除在管邊的酒精氣泡後,在室溫下儲存直到酒精蒸發掉且看不到液體。
15. 使用包含 20 μg /毫升胰核糖酸水解酶的 50 μl TE 溶液 (Ph 8.0)溶解掉核酸,
再和緩地搖晃幾下。接著儲存 DNA 在-20 度 C。