LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISORES

REVISIÓN

Liberación de neurotransmisores: un proceso de fusión

de membranas que transcurre en fracciones de milisegundos
E. Alés, J.M. Poyato, V. Valero, G. Álvarez de Toledo

RELEASE OF NEUROTRANSMITTERS: A PROCESS OF MEMBRANE FUSION OCCURRING

IN FRACTIONS OF MILLISECONDS
Summary. Introduction. The physiological mechanisms involved in neurotransmitter release were established thanks to the
pioneer work of Katz, Del Castillo and Miledi at the neuromuscular junction. They termed their work as the quantal hypothesis
of synaptic transmission. This hypothesis was further established morphologically by the work of Heuser and Reese. However,
the molecular events underlying this process are poorly understood. We are starting to know which proteins interact between
the vesicle and plasma membrane to promote fusion and to identify which molecules participate in the sensing of cytosolic
calcium. Development. Thanks to the combination of molecular biology, electrophysiology and microfluorometry, a huge
amount of new information is been obtained on the mechanisms participating in synaptic transmission. This data deals with
processes concerning to different pools of synaptic vesicles and their availability to reach the presynaptic membrane; the
molecular events responsible for the targeting of these vesicles with the plasma membrane; the sensitivity to calcium at the
presynaptic membrane; the fusion of membranes required to release the vesicle contents, and the mechanisms responsible for
membrane retrieval needed for presynaptic homeostasis. Conclusions. In this review we discuss new data regarding synaptic
function. However, some key points are still a matter of controversy. Meanwhile the quantal hypothesis is valid, the precise
processes by which channels and vesicles interact, membrane is recycled and vesicles reused are still controversial. New
techniques should be developed to address these points [REV NEUROL 1998; 27: 111-7].
Key words. Calcium channels. Cell membrane capacitance. Exocytosis. Neurotransmitters. Synaptic transmission. Synaptic
vesicles.

SINAPSIS QUÍMICAS Y RETARDO SINÁPTICO
Una de las características fundamentales del funcionamiento del
sistema nervioso es su capacidad para reaccionar ante distintos
estímulos. Esta capacidad de respuesta se pone de manifiesto en
multitud de funciones nerviosas, que incluyen desde el reflejo
involuntario más sencillo, como puede ser el reflejo de retirada
ante un estímulo doloroso, hasta reflejos condicionados comple-
jos en los que participan un elevado número de estructuras del
sistema nervioso y donde se requiere el relevo en múltiples neu-
ronas para elaborar dicha respuesta refleja. En todas estas reaccio-
nes la rapidez en la ejecución ha sido una de las directrices que la
evolución ha ido seleccionando. Los seres más rápidos en respon-
der, en los que las respuestas ante estímulos se desarrollan de
forma más veloz y coordinada, han sido los que fundamentalmen-
te han conseguido dominar en la escala animal.
El retardo en la ejecución de las respuestas en el sistema ner-
vioso viene determinado por la distancia que tiene que recorrer el
impulso nervioso a lo largo del axón y el número de estaciones de
relevo (neuronas) que intervienen en la generación de la respues-
ta. En aquellas situaciones donde el efector es un músculo distal,
por ejemplo en el reflejo rotuliano, parece claro que es el retardo
en la velocidad de conducción a través de un metro de axón de
una motoneurona espinal el factor principal que determina la
latencia (el impulso nervioso tarda de 10 a 20 milisegundos en
recorrer un metro de axón). Sin embargo, cuando las distancias
que tiene que recorrer el impulso nervioso son cortas, por ejemplo
Recibido: 11.11.97. Aceptado tras revisión externa sin modificaciones: 29.11.97.
Departamento de Fisiología Médica y Biofísica. Facultad de Medicina.
Universidad de Sevilla. Sevilla, España.
Correspondencia: Dr. Guillermo Álvarez de Toledo. Departamento de Fi-
siología Médica y Biofísica. Facultad de Medicina. Universidad de Sevilla.
Avda. Sánchez Pizjuán, 4. E-41009 Sevilla. Fax: +34 95455 1769. E-mail:
gatoledo@cica.es
 1998, REVISTA DE NEUROLOGÍA
todas aquellas respuestas reflejas generadas por estímulos visua-
les, auditivos o funciones superiores, ya no es la distancia que
debe recorrer el potencial de acción, sino el número de sinapsis
químicas que deben superarse para transmitir el impulso nervioso
de una neurona a otra lo que determina la eficacia en la transmisión
de información.
La visión actual del funcionamiento de la transmisión del
impulso nervioso entre dos neuronas proviene de los trabajos clá-
sicos realizados en las décadas de los 50 y 60 por el español José
del Castillo, Bernad Katz y Roberto Miledi. Con sus trabajos, este
grupo de fisiólogos estableció las bases del funcionamiento sináp-
tico utilizando como preparación experimental la placa neuro-
muscular. En esta preparación realizaron los experimentos que
sirvieron como base de la teoría cuántica de liberación del neuro-
transmisor, donde la cantidad mínima liberada de neurotransmi-
sor (‘cuanto’) debería ser liberada a la hendidura sináptica de
forma instantánea [1]. Esta teoría fue comprobada morfológica-
mente a principios de los 70 por Heuser y Reese [2]. Sus conocidos
experimentos de criofractura de la placa neuromuscular mostra-
ron de forma inequívoca que la liberación de un cuanto de acetil-
colina se debía a la fusión de una vesícula sináptica clara con la
membrana presináptica. Del Castillo, Katz y Miledi, además de
fijar las bases y formalizar numéricamente la teoría cuántica de
liberación del neurotransmisor, realizaron una serie de experi-
mentos sobre el retardo sináptico [3]. Uno de los experimentos
clásicos de este trabajo se muestra en la figura 1. El dispositivo
experimental consiste en la estimulación eléctrica del terminal
nervioso y el registro de la actividad extracelular registrada en la
superficie del músculo en una zona cercana a la placa neuromus-
cular. El retardo sináptico en la placa neuromuscular oscila entre
0,5 y 2,6 ms, siendo el retardo más frecuente de 0,9 ms. En ningún
caso observaron retardos inferiores a 0,5 ms. En la brillante dis-
cusión de este trabajo, Katz y Miledi llegaron a la conclusión de
que el retardo sináptico se debe al tiempo que tardan en activarse
los mecanismos implicados para que se produzca la liberación del

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Estímulo

Presináptica

Corriente

Postsináptica

Retardo sináptico

60

40

20

0
0 1 2 3
Tiempo

Figura 1. Determinación del retardo sináptico en la placa neuromuscular. a) Registro extracelular de la corriente postsináptica registrada tras la
estimulación eléctrica del terminal. El retardo sináptico aparece como el período que transcurre desde la invasión del terminal por el potencial de acción
(pre) y la generación de la corriente postsináptica. El artefacto de estimulación se observa al comienzo del registro. b) Secuencia de registros donde
se observa un período de latencia (retardo sináptico) variable. c) Distribución de frecuencias de retardos sinápticos. El retardo mínimo es de 0,5 ms,
el más largo de 2,6 ms y la media de la distribución se encuentra a 0,9 ms. (Tomado de Katz y Miledi [3]).

neurotransmisor y no al tiempo de difusión de las moléculas de
acetilcolina a través de la hendidura sináptica. En experimentos
anteriores realizados por Eccles y Jaeger (1958) [4] se había esti-
mado el tiempo de difusión de la acetilcolina y determinado la
distancia de la hendidura sináptica en la placa neuromuscular en
1 µm; estos cálculos indicaban que el retardo sináptico por difu-
sión de neurotransmisor debía ser de tan sólo 1 µs, a diferencia del
retardo mínimo observado de 500 µs (0,5 ms). Posteriormente,
estudios por microscopía electrónica mostraron que la hendidura
sináptica es mucho más estrecha (unos 50-70 nm), lo que sugiere
un menor retardo debido a la difusión [2]. Los elegantes experi-
mentos de Katz, Miledi y Del Castillo mostraron no sólo que la
transmisión sináptica se producía por la liberación cuántica del
neurotransmisor, sino que además sugerían que a nivel presináp-
tico tenían lugar fenómenos moleculares que permiten acoplar la
llegada de un potencial de acción con la maquinaria secretora que
libera el neurotransmisor en fracciones de milisegundos.
El avance reciente de la fisiología celular y la biología mole-
cular está permitiendo caracterizar la cadena de eventos que
tiene lugar durante la liberación del neurotransmisor e identifi-
car las distintas moléculas que intervienen en el llamado acopla-
miento excitación-secreción. El conocimiento detallado de es-
tas etapas moleculares, no sólo permite entender desde un punto
de vista molecular lo que ocurre en un terminal sináptico, sino
que además ofrece el sustrato molecular de enfermedades o in-
toxicaciones del sistema nervioso. Por citar dos buenos ejem-
plos, se conoce desde hace tres años el lugar concreto de actua-
ción de la toxina tetánica o de la toxina botulínica, dos sustancias
que bloquean de forma irreversible la transmisión sináptica. En
este artículo de revisión nos proponemos presentar de forma
detallada las etapas por las que debe pasar una vesícula sináptica
clara, que determinan el retardo de 500 microsegundos, entre la
llegada de un potencial de acción y la liberación del neurotrans-
misor a la hendidura sináptica.
UNA POBLACIÓN DE VESÍCULAS SINÁPTICAS
SE ENCUENTRA LISTA PARA LA FUSIÓN
CON LA MEMBRANA PRESINÁPTICA
Al objeto de cumplir los requisitos de rapidez anteriormente ex-
puestos en la transmisión sináptica, las vesículas sinápticas nece-
sitan estar muy cerca de la membrana presináptica. Determinacio-
nes realizadas sobre el transporte axónico, o transporte a través del
citoplasma celular, indican que la velocidad de transporte de or-

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ganelas intracelulares se produce con extrema lentitud, compara-
do con el tiempo en microsegundos requerido para la fusión de
vesículas sinápticas. Por ejemplo, los motores moleculares de
actina, que posiblemente participan en el transporte de vesículas
u otras organelas a un botón sináptico, transportan vesículas a una
velocidad de dos micrómetros por segundo [5], lo que daría un
retardo de al menos algunas centenas de milisegundos en trans-
portar vesículas sinápticas del interior del terminal sináptico a la
zona submembranaria donde va a tener lugar la fusión. Estos tiem-
pos son demasiado largos para la rapidez requerida en una sinap-
sis. Para solventar este problema, la biología ha dispuesto una
población de vesículas sinápticas claras ancladas con la membra-
na presináptica (docked vesicles) (Fig. 2), que no necesitan reco-
rrer ni ser transportadas al lugar de fusión en el momento de la
llegada del potencial de acción. Estas vesículas se encuentran ya
a una distancia inferior a los 100 nm de la membrana plasmática,
por tanto, no tienen que transportarse a la membrana presináptica,
y poseen unas características moleculares específicas que las ha-
cen responder con la fusión de membranas ante la llegada del
estímulo fisiológico para la fusión, es decir, el incremento de la
concentración intracelular de Ca2+ por la llegada del potencial de
acción a través del axón. Actualmente existen evidencias electro-
fisiológicas, moleculares y morfológicas que sugieren la existen-
cia de esta población de vesículas adosadas.
El estudio funcional de las distintas poblaciones de vesículas
sinápticas ha avanzado de forma espectacular en los últimos años
gracias a la combinación de varias técnicas. Éstas incluyen técni-
cas para fijar la concentración de Ca2+ en el citosol o terminal
sináptico, técnicas de simulación mediante ordenador de cómo
tienen lugar los cambios de concentración de Ca2+ en la zona
submembranaria, técnicas de medida de la exocitosis mediante la
determinación eléctrica de la superficie de membrana celular,
técnicas electroquímicas que permiten detectar la liberación de
neurotransmisores procedente de una única vesícula y técnicas de
fluorescencia en células únicas que permiten visualizar la dinámi-
ca de la exo y la endocitosis.
Uso combinado de técnicas de fijación de la concentración
de Ca2+ y medida de la capacidad eléctrica de la membrana
Una de las grandes dificultades para el estudio de la dependencia
de Ca2+ en el proceso de exocitosis ha sido la imposibilidad de
mantener constante la concentración de Ca2+ intracelular. Sin este
control de la concentración no es posible realizar estudios de dosis
respuesta y, por tanto, obtener información cinética de la exocito-
sis. Desde la introducción de la técnica de patch-clamp [6] es
posible dializar el citosol de una célula con soluciones que contie-
nen distintas concentraciones de Ca2+ y por tanto estudiar la de-
pendencia de Ca2+ de la exocitosis. Más recientemente se han
desarrollado técnicas que permiten no sólo introducir una solu-
ción con concentración conocida de Ca2+, sino además permiten
elevar la concentración de este ion a distintos niveles. El método
más utilizado es el de liberar iones Ca2+ de compuestos enjaulados
(caged compounds). Estos compuestos enjaulados son molecular-
mente muy similares a compuestos que tamponan Ca2+, como el
EGTA, pero que ante un estímulo intenso de luz (flash) se destru-
yen y pierden su afinidad por los iones de Ca2+, provocando, por
tanto, una liberación masiva de iones en el citosol. El compuesto
enjaulado más utilizado ha sido el DM-nitrofeno, que permite
liberaciones de Ca2+ controlables en función de la intensidad y
duración del flash de luz. Así pues, en una misma célula se puede
incrementar la concentración de Ca2+ a niveles conocidos y así
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LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISORES
Terminal presináptico
Vesículas
sinápticas
Vesículas
ancladas
Terminal postsináptico
Figura 2. Poblaciones de vesículas sinápticas en un terminal nervioso. La
mayor parte de las vesículas se encuentran en el citosol a distancias
superiores a los 100 nm. Una pequeña población de vesículas está anclada
y lista para la fusión ante la llegada de un potencial de acción. La presencia
de vesículas ancladas hace posible la rapidez en la transmisión sináptica.
poder estudiar el fenómeno secretor con la utilización de técnicas
de medida de la superficie de membrana o la determinación elec-
troquímica de productos de secreción.
Las técnicas de fijación de la concentración de Ca2+ se han
utilizado en combinación con técnicas que miden directamente la
exocitosis. La técnica con mayor resolución para estudiar la exo-
citosis es la de la medida de la capacidad eléctrica de la membrana.
Esta técnica se basa en la relación directa que existe entre la ca-
pacidad eléctrica de la membrana plasmática y la superficie de
membrana celular. Por tanto, cuando tiene lugar la exocitosis, que
produce un incremento neto en la superficie de membrana celular
al incorporarse la membrana vesicular en la membrana plasmáti-
ca, se produce un incremento de la capacidad eléctrica de la mem-
brana. Con esta técnica se pueden medir fusiones de vesículas
únicas de hasta 50 nm de diámetro.
Hasta ahora, estas poderosas técnicas no se han podido utilizar
en un terminal sináptico en el sistema nervioso de mamíferos
debido a su reducido tamaño. La información sobre las distintas
poblaciones de vesículas se ha obtenido en células neuroendocri-
nas.
Cuando se eleva la concentración de Ca2+ en el citosol median-
te la fotólisis de DM-nitrofeno se observa que la superficie de la
membrana se incrementa en tres fases. La primera fase se produce
con un latencia muy corta después de haberse producido la eleva-
ción de Ca2+ y determina la fusión de un pequeño número, pero con
una gran rapidez, de vesículas con la membrana plasmática. En
células de la parte intermedia de la hipófisis la velocidad de fusión
de vesículas es de unas 17.000 vesículas por segundo [7], habién-
dose obtenido resultados similares en células cromafines [8]. Pos-
teriormente a esta fase se produce la liberación de vesículas a una
velocidad inferior, unas 2.000 vesículas por segundo. Esta fase
incorpora un mayor número de vesículas y debido a su menor
velocidad perdura durante más tiempo. Finalmente, se produce en
el citosol, mientras se mantiene elevada la concentración de Ca2+,
una liberación residual a una menor velocidad. Estos datos se han
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 E. ALÉS, ET AL
NT
Endosoma
temprano
Entrada de NT
Vesiculación
Fusión de endosomas
Translocación
Translocación
Anclaje
Habilitación Flicker Fusión
transitoria
Fusión
completa
Membrana ATP 4 Ca2+
plasmática
Hendidura
Ca2+
sináptica
1 2 3 4
Figura 3. Ciclo vital de una vesícula sináptica.
interpretado como indicativos de vesículas que se encuentran en
distintas fases del proceso secretor, correspondiendo las que se
liberan de forma más rápida a la población de vesículas más próxi-
mas a la membrana y más competentes para la fusión. Las otras
dos poblaciones de vesículas corresponden a vesículas de reserva
que únicamente son liberadas cuando se ha producido el agota-
miento de la primera población de vesículas. La población de
vesículas cercanas a la membrana plasmática se ha puesto de
manifiesto en estudios de microscopía electrónica en células cro-
mafines [9].
EL SENSOR DE Ca2+ DE LAS VESÍCULAS ANCLADAS
ES DE BAJA AFINIDAD
En células excitables, como lo son las células neuroendocrinas y
las neuronas, el factor activador fundamental de la exocitosis es
el incremento de la concentración de Ca2+ en el citosol o terminal
sináptico. En estos tipos celulares la elevación de la concentración
de Ca2+ se produce por la entrada al citosol de los iones de Ca2+ a
través de canales iónicos voltaje-dependientes situados en la mem-
brana plasmática. Estos canales se abren por la despolarización
generada por la invasión del terminal nervioso por el potencial
de acción, y permiten la entrada de iones de Ca2+ al interior
celular. Se debe recordar que los iones de Ca2+ penetran al inte-
rior celular gracias al enorme gradiente químico existente entre
el exterior y el interior celular (2 mM en el exterior comparado
con 20 nM en el interior, diferencia de cinco órdenes de magni-
tud). La entrada de los iones de Ca2+ genera, a su vez, un gradiente
de concentración para este ion en el interior celular, alcanzándose
la máxima concentración en la vecindad del poro del propio canal
de Ca2+ y disminuyendo ésta hacia el interior celular. Este hecho
determina que las vesículas ancladas sientan concentraciones al-
tas de Ca2+, mientras que las vesículas de la población de reserva
únicamente detecten concentraciones más bajas de este ion. Si la
maquinaria secretora respondiera con la fusión de vesículas sináp-
ticas cuando se incrementa ligeramente la concentración de Ca2+
en el citosol, tendría lugar una respuesta de exocitosis mantenida
(vesículas ancladas y de reserva) hasta que se restableciera a ni-
veles basales la concentración de Ca2+. Este tipo de respuesta
impediría discriminar la llegada de un nuevo estímulo ya que el
terminal aún estaría activo (liberando neurotransmisor) cuando
llegara el siguiente potencial de acción. Por esta razón, se cree que
en un terminal nervioso el sensor de Ca2+ es de baja afinidad, es
114
0111_155_R_04_Alés.p65 114
decir, se activaría únicamente cuando las concentraciones de Ca2+
son muy elevadas, produciéndose, por tanto, la liberación del neu-
H+ rotransmisor únicamente cuando se alcanzan concentraciones del
orden de 100 µM. De esta forma se obtiene una respuesta más
fásica que permite sincronizar la llegada de un potencial de acción
con la fusión de un grupo reducido de vesículas sinápticas.
EL CICLO DE LAS VESÍCULAS SINÁPTICAS
Endocitosis
En los últimos años se ha producido un gran avance en el conoci-
Ca2+? miento de cómo una vesícula sináptica se fija a la membrana
presináptica y cómo se dirige desde su lugar de síntesis a la mem-
brana presináptica. Se han descubierto proteínas que participan en
este proceso y que son las responsables de las distintas etapas por
5
las que tiene que pasar una vesícula sináptica hasta que sea reuti-
lizada en el terminal sináptico [10]. Las vesículas sinápticas atra-
viesan varias etapas hasta que pueden ser reutilizadas, éstas son: 1.
Síntesis de la vesícula sináptica a partir de endosomas tem-
pranos; 2. Acumulación del neurotransmisor en el interior vesi-
cular; 3. Aproximación a la membrana presináptica; 4. Habilita-
ción de la vesícula para la fusión; 5. Fusión y formación de un
poro que conecta el interior de la vesícula con el espacio extrace-
lular; 6. Apertura completa del poro de fusión, y 7. Endocitosis
y recaptación de la membrana vesicular para la posterior síntesis
de vesículas. Estas etapas se muestran de forma esquemática en la
figura 3.
La formación de vesículas a partir de endosomas tempranos
(budding) es un proceso no bien estudiado y del que se desconocen
los factores que lo regulan. Sí parece que en la selección de la
vesícula participan proteínas con actividad GTPásica, que son las
responsables de dirigir las vesículas sinápticas hacia la membrana
presináptica. La fase de acumulación del neurotransmisor en el
interior vesicular se produce mediante transportadores específi-
cos para los distintos neurotransmisores en la propia membrana
vesicular. Existen cuatro tipos de transportadores, cada uno de
ellos es suficiente para introducir los distintos tipos de neurotrans-
misores. Por ejemplo, las catecolaminas, serotonina y dopamina
pueden acumularse en el interior vesicular sólo por un único trans-
portador que no discrimina entre los distintos neurotransmisores
de esta familia. Lo mismo ocurre para la acetilcolina y el glutama-
to, que se acumulan por el mismo transportador. Por ejemplo, una
neurona con vesículas sinápticas colinérgicas puede liberar gluta-
mato si éste es introducido en el soma mediante técnicas de mi-
croinyección. Este ‘engaño’ se debe a la falta de selectividad del
transportador de la vesícula sináptica. Para que un transportador
funcione adecuadamente necesita que se forme un gradiente de
protones (acidificación) en el interior vesicular. La disipación de
este gradiente es el que utiliza el transportador de neurotransmi-
sores para cargar la vesícula de neurotransmisor. El gradiente de
protones se genera gracias a la presencia en la membrana vesi-
cular de una bomba de protones, similar a la que existe en las
vacuolas de las células vegetales, que consume ATP. Estos me-
canismos de concentración de neurotransmisor se han demostrado
para las sinapsis catecolaminérgicas, donde la concentración de
noradrenalina en el interior vesicular puede llegar a ser del orden
de 1 M. La aproximación de la vesícula a la membrana presináp-
tica es un proceso regulado por el incremento residual de la con-
centración de Ca2+ en el citosol. En estudios realizados en células
cromafines se ha demostrado que los niveles de Ca2+ requeridos
para esta acción son del orden de unas pocas unidades micromo-
lares [8]. De esta forma, se garantiza un aporte continuo de vesí-
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VS
Sbv
NSF S25
Stx
Figura 4. Proteínas que participan en la fusión de vesículas sinápticas. Sbv: sinaptobrevina; NSF: proteína de fusión sensible a N-etilmaleimida acoplado
a proteína SNAP; Stx: sintaxina; S25: SNAP-25; Stg: sinaptotagmina; Sfi: sinaptofisina; M: Munc18-1.
culas a la zona presináptica. A este nivel parece ser que los micro-
túbulos son los principales responsables para esta aproximación.
Experimentos recientes sugieren que parte de los microtúbulos se
tienen que desestructurar para facilitar la aproximación de las
vesículas a la zona submembranaria [11], siendo la destrucción de
la capa submembranaria de actina dependiente de la concentra-
ción citosólica de Ca2+.
Las vesículas se anclan y se habilitan para la fusión con la
membrana presináptica. Estudios recientes han demostrado nu-
merosas etapas en este proceso. Un paso crítico para la habilita-
ción es la presencia de ATP, que permite la habilitación (priming)
de vesículas sinápticas. Por tanto, existen moléculas ancladas con
la membrana plasmática que no son susceptibles de producir fu-
sión. El incremento de los niveles intracelulares de Ca2+ permite
la fusión de membranas y la apertura del poro de fusión. En vesí-
culas sinápticas parece que existe la maquinaria secretora y los
canales de calcio responsables para la fusión se encuentran muy
próximos. Por esta razón, la maquinaria secretora detecta y se
activa por concentraciones muy elevadas de Ca2+ citosólico. La
apertura del poro de fusión determina, desde su formación, la
salida del neurotransmisor al espacio extracelular [12]. Experi-
mentos realizados en mastocitos y células cromafines ponen de
manifiesto que cuanto menor es el tamaño de una vesícula secre-
tora, mayor es la fracción de contenido liberada durante las prime-
ras etapas de expansión del poro de fusión. La apertura del poro
de fusión puede ser un fenómeno transitorio (flicker) [13], con lo
que incluso en situaciones de fusión transitoria se produce libera-
ción de neurotransmisor al espacio extracelular [12]. Esta hipóte-
sis de liberación de neurotransmisor durante fusiones transitorias
fue propuesta como mecanismo de liberación en la placa neuro-
muscular hacia los años 80 [14], pero tuvo escaso eco en la comu-
nidad científica internacional después de la instauración de la
teoría vesicular y de reciclado de membrana [2]. Experimentos
recientes realizados con técnicas de patch-clamp para determinar
el incremento de superficie que tiene lugar durante la exocitosis
y la combinación de técnicas electroquímicas que permiten detec-
tar la liberación de neurotransmisor de vesículas únicas están
permitiendo abordar de nuevo esta hipótesis de liberación a través
de fusiones transitorias. La apertura del poro de fusión se produce
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LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISORES
VS
Sfi
Sbv
Stg Stg
D
CAC
M
Stx
de una forma dependiente de Ca2+ [15,16], acelerándose la aper-
tura del poro de fusión cuando la concentración citosólica de Ca2+
se encuentra por encima de 1 mM. Este paso puede ser crítico para
determinar si una fusión va a ser transitoria o completa, pues
dependiendo de la cantidad de iones de calcio que hayan entrado
durante el curso de un potencial de acción se producirá una fusión
completa o transitoria. Esta hipótesis aún debe demostrarse a nivel
de un terminal sináptico. La fusión completa de la vesícula permi-
te la liberación de todo el contenido vesicular, quedando incorpo-
rada la membrana de la vesícula sináptica con la de la membrana
plasmática. El siguiente paso que tiene lugar durante la exocitosis
es la recaptación de membrana mediada por vesículas revestidas
de clatrina. Este paso también parece ser dependiente de Ca2+ y de
unas proteínas asociadas al citoesqueleto, entre las que la dinami-
na parece desempeñar un papel relevante. La posterior transloca-
ción de la vesícula hasta su completo reciclado está aún poco
estudiada. El ciclo completo de una vesícula sináptica se produce
en la placa neuromuscular en aproximadamente 1 minuto [17].
BASES MOLECULARES DEL ANCLAJE
DE LAS VESÍCULAS SINÁPTICAS
Las proteínas implicadas en el anclaje de las vesículas sinápticas
con la membrana presináptica, y el lugar exacto donde éste debe
producirse, se han descubierto muy recientemente. La hipótesis
del lugar de reconocimiento y los cambios conformacionales que
tienen lugar hasta que se produce la apertura del poro de fusión se
muestran en la figura 4. Esta hipótesis, conocida como la hipótesis
SNARE, fue propuesta por el grupo de Rothman en 1993 [18]. Se
basa en la presencia de dos proteínas complementarias, una situa-
da en la membrana vesicular y la otra en la membrana presináp-
tica. Estas dos proteínas son distintas dependiendo del tejido don-
de se encuentren y son el sustrato de una proteína soluble existente
en el citosol, llamada NSF, o proteína de fusión sensible a N-
etilmaleimida. Esta proteína forma un complejo en el citosol con
otra proteína, la SNAP, o proteína de acoplamiento de la NSF.
Este complejo tiene actividad ATPásica y forma el complejo de
fusión cuando se une a las dos proteínas complementarias comen-
tadas anteriormente. Por este motivo, las proteínas complemen-
115
02/06/99, 10:59
 E. ALÉS, ET AL
tarias reciben el nombre de receptores de las SNAPS (SNARE).
La proteína existente en la membrana vesicular (SNAREv) se ha
identificado y se la ha denominado, además, sinaptobrevina. La
proteína existente en la membrana presináptica (SNAREt) se
conoce con el nombre de sintaxina. La formación del complejo
de fusión es el paso crítico previo a la fusión de membranas.
Además de estas proteínas, existe una quinta proteína que par-
ticipa en el complejo de fusión, la SNAP-25. Tanto la sinapto-
brevina, como la sintaxina y la SNAP-25 son los lugares de
actuación de las toxinas botulínica y tetánica. Una vez alcanzada
esta fase del proceso, se adhiere una nueva proteína al complejo
de fusión, la sinaptotagmina. Esta proteína parece ser el sensor
de la concentración de Ca2+. La sinaptotagmina entra a formar
parte del complejo de fusión y parece que debe salir del lugar
donde se va a generar el poro de fusión para que éste pueda formar-
se. La sinaptotagmina requiere de la unión de varios iones de Ca2+
para que pueda realizar esta transición [10]. Los factores que de-
terminan la expansión del poro de fusión no son conocidos, aun-
que se conoce el papel de los iones de Ca2+ a este nivel. Para que
se produzca la fusión de vesículas sinápticas en el lugar apropiado
(zona activa) parece ser que otra proteína, Munc18-1, desempeña
un papel fundamental. La sinaptofisina se ha postulado como la
responsable de formar el poro de fusión, aunque esta hipótesis aún
está por demostrar.
BIBLIOGRAFÍA
1. Del Castillo J, Katz B. Quantal components of the end-plate potential.
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LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISORES:
UN PROCESO DE FUSIÓN DE MEMBRANAS
QUE TRANSCURRE EN FRACCIONES DE MILISEGUNDOS
Resumen. Introducción. Las bases fisiológicas de la liberación de
neurotransmisores a la hendidura sináptica quedaron establecidas
gracias a los trabajos pioneros de Katz, Del Castillo y Miledi en la
placa neuromuscular. Estos experimentos obtuvieron una corrobo-
ración morfológica con los experimentos realizados por Heuser y
Reese. Sin embargo, sólo muy recientemente se ha obtenido informa-
ción detallada sobre cómo se produce a nivel molecular la fusión de
vesículas sinápticas con el terminal presináptico. Gracias a estos
estudios se ha podido conocer el mecanismo de acción de la toxina
tetánica y botulínica, y las distintas etapas por las que atraviesa una
vesícula sináptica hasta liberar su contenido a la hendidura sináp-
tica. Desarrollo. La gran confluencia de resultados obtenidos en los
últimos años con técnicas tan diversas como de biología molecular,
electrofisiología y técnicas fluorescentes está permitiendo identifi-
car las moléculas que participan en la fusión de vesículas sinápticas
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CONCLUSIONES Y NUEVAS PERSPECTIVAS
La gran confluencia de resultados obtenidos en los últimos años
con técnicas tan diversas como biología molecular, electrofisiolo-
gía y técnicas fluorescentes ha permitido identificar y disecar
distintas etapas que intervienen en la liberación de neurotransmi-
sores a la hendidura sináptica. Gracias a este abordaje multidisci-
plinar se han identificado moléculas que participan en la fusión de
vesículas sinápticas en el terminal presináptico, moléculas que
detectan los niveles de calcio en el terminal presináptico –que son
las responsables de disparar el proceso de fusión–, y las distintas
etapas por la que pasa una vesícula sináptica antes de liberar el
neurotransmisor. Esta amplia visión del funcionamiento de un
terminal sináptico ha permitido comprender en profundidad, a
nivel molecular y fisiológico, entre otros, los mecanismos de ac-
ción de neurotoxinas como la tetánica y la botulínica. Sin embar-
go, aún quedan por dilucidar aspectos tan importantes como las
bases moleculares y fisiológicas del estrecho acoplamiento que
tiene lugar entre la maquinaria secretora y los canales de calcio
del terminal presináptico y la estrecha regulación a la que está
sometido un terminal nervioso para que funcione según las de-
mandas de transmisores sinápticos particulares. Una mejor com-
prensión de estos aspectos será sólo posible con el desarrollo de
nuevas técnicas que permitan estudiar el fenómeno secretor en
terminales sinápticos individuales.
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LIBERTAÇÃO DE NEUROTRANSMISORES:
UM PROCESSO DE FUSÃO DE MEMBRANAS
QUE DECORRE EM FRACÇÕES DE MILISEGUNDOS
Resumo. Introdução. As bases fisiológicas da libertação de neuro-
transmisores na fenda sináptica foram estabelecidas graças aos tra-
balhos pioneiros de Katz, Del Castillo e Miledi na placa neuromus-
cular. Estas experiências tiveram uma corroboração morfológica
com as experiências realizadas por Heuser e Reese. No entanto, só
muito recentemente se obteve informação detalhada sobre como se
produz, a nível molecular, a fusão de vesículas sinápticas com o
terminal pré-sináptico. Graças a estes estudos pode-se conhecer o
mecanismo de acção da toxina tetânica e botulínica, e as diversas
etapas pelas quais passa uma vesícula sináptica até libertar o seu
conteúdo na fenda sináptica. Desenvolvimento. O grande conjunto
de resultados obtidos nos últimos anos com técnicas tão diversas
como da biologia molecular, electrofisiologia e técnicas fluorescen-
tes estão a permitir identificar as moléculas que participam na fusão
de vesículas sinápticas no terminal pré-sináptico, moléculas que
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en el terminal presináptico, moléculas que detectan los niveles de
calcio en el terminal presináptico y las distintas etapas por la que
pasa una vesícula sináptica antes de liberar el neurotransmisor.
Conclusiones. Los datos obtenidos recientemente amplían conside-
rablemente la visión molecular de los eventos que tienen lugar en la
transmisión sináptica. Sin embargo, aún quedan por dilucidar as-
pectos tan importantes como las bases moleculares y fisiológicas del
estrecho acoplamiento que tiene lugar entre la maquinaria secretora
y los canales de calcio del terminal presináptico y la estrecha regu-
lación a la que está sometido un terminal nervioso para que funcione
según las demandas de transmisores sinápticos particulares. Una mejor
comprensión de estos aspectos será sólo posible con el desarrollo de
nuevas técnicas que permitan estudiar el fenómeno secretor en termi-
nales sinápticos individuales [REV NEUROL 1998; 27: 111-7].
Palabras clave. Canales de calcio. Capacitancia. Exocitosis. Neuro-
transmisores. Transmisión sináptica. Vesículas sinápticas.
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LIBERACIÓN DE NEUROTRANSMISORES
detectam os níveis de cálcio no terminal pré-sináptico e as diversas
etapas pelas que passa uma vesícula sináptica antes de libertar o
neurotransmisor. Conclusões. Os dados obtidos recentemente au-
mentam considerávelmente a perspectiva molecular dos eventos
que têm lugar na transmissão sináptica. No entanto, ficam aínda
por clarificar aspectos tão importantes como as bases moleculares
e fisiológicas do estrecho acoplamiento que ocorre entre a maqui-
naria secretora e os canais de cálcio do terminal pré-sináptico e a
estreita regulação a que está sobmetida um terminal nervoso para
que funcione de acordo com as necessidades de transmisores si-
nápticos particulares. Uma melhor comprenssão destes aspectos
será possível apenas com o desenvolvimento de novas técnicas que
permitam estudar o fenómeno secretor nos terminais sinápticos
individuales [REV NEUROL 1998; 27: 111-7].
Palavras chave. Canais de cálcio. Neuro transmisores. Transmissão
sináptica. Vesículas sinápticas.
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