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¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes?

Southern, Northern y Western Blot


Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis como primer paso para
identificar la presencia de determinadas moléculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventada
por Edward M. Southern en 1975 para la detección de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se
realiza la transferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado. Luego
se utilizó el mismo sistema para detectar ARN y se lo denominó Northern Blot (en clara alusión al
nombre del científico inventor de la técnica basada en ADN).
Estas dos técnicas consisten en una electroforesis seguida de transferencia y emplean secuencias
específicas (sondas) complementarias a la molécula de ácido nucleico a identificar. Es decir, ambas
utilizan la hibridación de ácidos nucleicos para la detección de las moléculas buscadas. Los principios
generales son los mismos, pero hay diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que el
ARN se degrada mucho más fácilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas más
precauciones.
Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corrida electroforética hasta lograr que las
moléculas se separen por tamaños de manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Luego se
transfieren los ácidos nucleicos del gel a la membrana. De esta manera los que quedan retenidos
pueden ser sometidos a ensayos de hibridación con sondas específicas para detectar la presencia de
determinadas secuencias.
Estas dos técnicas persiguen fines distintos: el Southern Blot, que detecta la presencia de ciertas
secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. El Northern, en
cambio, permite detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos visto que
dos células del mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. El Southern
Blot nos permite evidenciar el mismo material genético y el Northern Blot, la expresión de diferentes
genes.
Si luego queremos detectar proteínas, usaremos otra técnica similar: el Western Blot, que deriva de la
electroforesis en gel y separa proteínas mediante la utilización de anticuerpos específicos. Una vez que
la muestra con las proteínas que se quiere identificar ha corrido en un gel, se la transfiere a una
membrana especial donde las proteínas quedan “ancladas” o adheridas. Después, se incuba esta
membrana con el anticuerpo específico contra la proteína blanco, y se revela. Con esta técnica pueden
obtenerse datos aproximados del tamaño de la proteína y su concentración en la muestra sembrada.

Southern Blot: La técnica consiste en cortar el DNA con enzimas de restricción para producir
fragmentos de diferente tamaño. Los fragmentos se separan por su tamaño molecular mediante
electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio (Rybicki y Purves, 1996). Los
fragmentos son luego transferidos a una membrana que actúa como filtro. Para ello el gel se sumerge
en una solución salina para denaturarlo a hebras sencillas. Las hebras se adhieren al papel secante que
las recibe y acepta debido a sus propiedades químicas. Después los fragmentos se fijan (por UV) al
filtro membranoso y pueden ser hibridados con una sonda que se marque radioactivamente y que tenga
una secuencia complementaria a la del fragmento en cuestión. Después de la hibridación, se lava el
filtro y los fragmentos se detectan por radioautografía o mediante fluorescencia (en caso de marcaje
no-radioctivo).

Southern Blot
El Southern Blot es una técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA,
mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas especificas.
Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemplo
utilizando sonicación ó enzimas de restricción.
Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en gel de
agarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan a un
filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon.
A continuación, el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea
identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, DNAds ó RNAm, que reconocerá a la
secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias
de ácidos nucleicos.
El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento de
bases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente.
Cabe señalar que el nombre de la técnica Southern Blot deriva en parte del apellido Southern del
investigador que la desarrolló y de la palabra en inglés Blot que significa traspasar.
Técnica de hibridación de Southern

La huella dactilar de ADN, también conocida como análisis del perfil de ADN, se basa en el uso de la
técnica de transferencia e hibridación de Southern para analizar regiones polimórficas del ADN humano.
Los polimorfismos se explican con mayor detalle en el problema nº 5. Las etapas experimentales
empleadas en un laboratorio de medicina legal o forense para el análisis del perfil de ADN son las
siguientes:

1. Extracción del ADN


Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes
de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una
víctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las
pruebas del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el
extraído de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas,
habitualmente de la sangre.

2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción


El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción,
que es una enzima que corta el ADN dicatenario en donde tenga una seuencia
característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis
legal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.
3. Electroforesis en gel de agarosa
Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según
su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la
electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia
el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de
migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas
menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor
tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los
fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos
más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de
aplicaión de la muestra.
4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")
Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan
mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una
disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario
resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon,
realizando así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés blot,
conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de desnaturalización y
transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de quien lo
inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papel
con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del papel al secante,
el "calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribución
espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado de la
electroforesis.
5. Hibridación con sonda radiactiva
Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de
hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un
fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de
la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases
complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el
"calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo
radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus
genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de Southern
resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda
radiactiva de locus único, bajo condiciones de temeratura y concentración de
sales que favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso de
sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la
membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.
6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía
Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del
ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica,
la membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de
rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las
posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el
revelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern se
conoce como autorradiografía
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales
En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en
varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para
la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada
temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda
radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7,
detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografías de una
misma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN".

Northern blot

Una técnica de laboratorio que se utiliza para identificar y localizar las secuencias de ARNm que son
complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda.
Northern blot o análisis Northern es básicamente una prueba para detectar la presencia del ARN
mensajero en un tejido en particular y la cual permite también determinar el tamaño de la trascripción
de ese ARN mensajero. El procedimiento se hace transfiriendo todo el ARN mensajero de un tipo
determinado de tejido desde un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. La presencia de un ARN
en particular se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de ácido nucleico, generalmente
de cADN o rARN del gen de interés.
Northertn Blot: Es similar a la técnica anterior, pero permite detectar RNA en vez de DNA (Innis y
Gelfand, 1990). En síntesis la técnica consiste en extraer el RNA de las células pertinentes y su
posterior separación por tamaño mediante electroforesis en gel. Las moléculas de RNA son transferidas
y unidas al filtro, al igual que en el Southern blot. Después de la hibridación con una sonda marcada (y
posterior a la detección según el método de marcaje utilizado), las bandas en el gel indican la
ubicación de los tipos de RNA que sean complementarios a la sonda. Teniendo marcadores de RNA de
tamaño adecuado, se puede conocer el tamaño de los RNA que se han identificado. Así, la técnica
permite conocer el tamaño preciso de un mRNA, luego del empalme transcripcional. Además, sirve
para identificar diferentes tipos de mRNA codificados por un mismo gen y para determinar la cantidad y
el tejido específico (o tipo de células) en que se encuentra un mRNA específico. Así, será posible
determinar los niveles de actividad génica, por ejemplo durante el desarrollo, o bien en distintos
tejidos (o tipos celulares) durante un período definido de la vida, o después de haber sido sometido a
los organismos a diferentes estímulos fisiológicos (Russel, 1998).

El Northern Blot es una técnica muy similar al Southern Blot que permite la identificación de
secuencias específicas de RNA.
La muestra de RNA a analizar no requiere fragmentación y se somete a electroforesis en geles de
agarosa, donde las moléculas de RNA se separan desde mayor a menor tamaño.
Una vez terminada la electroforesis, y sin teñir el gel, los fragmentos se traspasan a un filtro de
nitrocelulosa ó a una membrana nylon, luego el filtro se incuba con una sonda marcada, específica
para la secuencia que se desea identificar.
Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo cDNA, que reconocerá a la secuencia de
RNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos
nucleicos.
El nombre de la técnica deriva por analogía al Southern Blot.

El Western blot se basa esencialmente en separar las principales estructuras del virus en un gel de
poliacrilamida, mediante la aplicación de corriente eléctrica la cual hace correr estas proteínas y
glicoproteínas de acuerdo a su peso molecular. Una vez separadas, son transferidas a un papel de
nitrocelulosa donde se agrega el suero en estudio y si éste tiene anticuerpos contra las estructuras
virales nos daremos cuenta por la presencia de bandas.
Los resultados que nos informa el laboratorio son tres: un resultado positivo es cuando aparecen
múltiples bandas, un resultado negativo es cuando no aparece ninguna banda y un resultado
indeterminado es cuando sólo aparece alguna o algunas bandas pero que no son suficientes para ser
considerado como positivo.

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