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Southern Blot: La técnica consiste en cortar el DNA con enzimas de restricción para producir
fragmentos de diferente tamaño. Los fragmentos se separan por su tamaño molecular mediante
electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio (Rybicki y Purves, 1996). Los
fragmentos son luego transferidos a una membrana que actúa como filtro. Para ello el gel se sumerge
en una solución salina para denaturarlo a hebras sencillas. Las hebras se adhieren al papel secante que
las recibe y acepta debido a sus propiedades químicas. Después los fragmentos se fijan (por UV) al
filtro membranoso y pueden ser hibridados con una sonda que se marque radioactivamente y que tenga
una secuencia complementaria a la del fragmento en cuestión. Después de la hibridación, se lava el
filtro y los fragmentos se detectan por radioautografía o mediante fluorescencia (en caso de marcaje
no-radioctivo).
Southern Blot
El Southern Blot es una técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA,
mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas especificas.
Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemplo
utilizando sonicación ó enzimas de restricción.
Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en gel de
agarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan a un
filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon.
A continuación, el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea
identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, DNAds ó RNAm, que reconocerá a la
secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias
de ácidos nucleicos.
El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento de
bases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente.
Cabe señalar que el nombre de la técnica Southern Blot deriva en parte del apellido Southern del
investigador que la desarrolló y de la palabra en inglés Blot que significa traspasar.
Técnica de hibridación de Southern
La huella dactilar de ADN, también conocida como análisis del perfil de ADN, se basa en el uso de la
técnica de transferencia e hibridación de Southern para analizar regiones polimórficas del ADN humano.
Los polimorfismos se explican con mayor detalle en el problema nº 5. Las etapas experimentales
empleadas en un laboratorio de medicina legal o forense para el análisis del perfil de ADN son las
siguientes:
Northern blot
Una técnica de laboratorio que se utiliza para identificar y localizar las secuencias de ARNm que son
complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda.
Northern blot o análisis Northern es básicamente una prueba para detectar la presencia del ARN
mensajero en un tejido en particular y la cual permite también determinar el tamaño de la trascripción
de ese ARN mensajero. El procedimiento se hace transfiriendo todo el ARN mensajero de un tipo
determinado de tejido desde un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. La presencia de un ARN
en particular se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de ácido nucleico, generalmente
de cADN o rARN del gen de interés.
Northertn Blot: Es similar a la técnica anterior, pero permite detectar RNA en vez de DNA (Innis y
Gelfand, 1990). En síntesis la técnica consiste en extraer el RNA de las células pertinentes y su
posterior separación por tamaño mediante electroforesis en gel. Las moléculas de RNA son transferidas
y unidas al filtro, al igual que en el Southern blot. Después de la hibridación con una sonda marcada (y
posterior a la detección según el método de marcaje utilizado), las bandas en el gel indican la
ubicación de los tipos de RNA que sean complementarios a la sonda. Teniendo marcadores de RNA de
tamaño adecuado, se puede conocer el tamaño de los RNA que se han identificado. Así, la técnica
permite conocer el tamaño preciso de un mRNA, luego del empalme transcripcional. Además, sirve
para identificar diferentes tipos de mRNA codificados por un mismo gen y para determinar la cantidad y
el tejido específico (o tipo de células) en que se encuentra un mRNA específico. Así, será posible
determinar los niveles de actividad génica, por ejemplo durante el desarrollo, o bien en distintos
tejidos (o tipos celulares) durante un período definido de la vida, o después de haber sido sometido a
los organismos a diferentes estímulos fisiológicos (Russel, 1998).
El Northern Blot es una técnica muy similar al Southern Blot que permite la identificación de
secuencias específicas de RNA.
La muestra de RNA a analizar no requiere fragmentación y se somete a electroforesis en geles de
agarosa, donde las moléculas de RNA se separan desde mayor a menor tamaño.
Una vez terminada la electroforesis, y sin teñir el gel, los fragmentos se traspasan a un filtro de
nitrocelulosa ó a una membrana nylon, luego el filtro se incuba con una sonda marcada, específica
para la secuencia que se desea identificar.
Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo cDNA, que reconocerá a la secuencia de
RNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos
nucleicos.
El nombre de la técnica deriva por analogía al Southern Blot.
El Western blot se basa esencialmente en separar las principales estructuras del virus en un gel de
poliacrilamida, mediante la aplicación de corriente eléctrica la cual hace correr estas proteínas y
glicoproteínas de acuerdo a su peso molecular. Una vez separadas, son transferidas a un papel de
nitrocelulosa donde se agrega el suero en estudio y si éste tiene anticuerpos contra las estructuras
virales nos daremos cuenta por la presencia de bandas.
Los resultados que nos informa el laboratorio son tres: un resultado positivo es cuando aparecen
múltiples bandas, un resultado negativo es cuando no aparece ninguna banda y un resultado
indeterminado es cuando sólo aparece alguna o algunas bandas pero que no son suficientes para ser
considerado como positivo.