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Proyecto de tesis: "Efecto inhibitorio in Vitro a diferentes concentraciones del extracto metanólico de Caesalpinia spinosa (Taya) sobre Leishmania braziliensis – peruviana"

Proyecto de tesis: "Efecto inhibitorio in Vitro a diferentes concentraciones del extracto metanólico de Caesalpinia spinosa (Taya) sobre Leishmania braziliensis – peruviana"

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Proyecto de tesis relacionado al efecto inhibitorio que presentaria la taya en extracto metanólico, sobre cultivos de Leishmania sp. causante de la uta. Este trabajo se empezó a realizar el 2008, aun no se llega a su terminacion (resultados).
Proyecto de tesis relacionado al efecto inhibitorio que presentaria la taya en extracto metanólico, sobre cultivos de Leishmania sp. causante de la uta. Este trabajo se empezó a realizar el 2008, aun no se llega a su terminacion (resultados).

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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DECANATO

PROYECTO DE TESIS
TÍTULO : “Efecto inhibitorio in Vitro a diferentes concentraciones del extracto metanólico de Caesalpinia spinosa (Taya) sobre Leishmania braziliensis – peruviana” AUTOR (es) PATROCINADOR APROBADO POR : : : MIEMBRO SECRETARIO JEFE CENTRO INVESTIGACIÓN DECANO Lambayeque, 22 de abril de 2008. Rómulo Aycachi Inga Juan José Augusto Moyano Muñoz Mblga. M. Teresa Silva García

PRESIDENTE DEL JURADO MIEMBRO VOCAL JEFE DEPARTAMENTO

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGIAS DECANATO

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I.

GENERALIDADES:

1. TÍTULO: “Efecto inhibitorio in Vitro a diferentes concentraciones del extracto metanólico de Caesalpinia spinosa (Taya) sobre Leishmania braziliensis – peruviana” 2. PERSONAL INVESTIGADOR: 2.1. Autores: Est. Rómulo Aycachi Inga Est. Juan José A. Moyano Muñoz 2.2. Patrocinador: Mblga. M. Teresa Silva García 3. CARRERA PROFESIONAL/ESPECIALIDAD: • • Carrera Profesional de Biología Especialidad de Microbiología y Parasitología : Aplicada

4. TIPO DE INVESTIGACIÓN: 4.1. De acuerdo al fin que persigue

4.2. De acuerdo a la técnica de contrastación: Explicativa 5. RÉGIMEN DE INVESTIGACIÓN: Libre 6. LUGAR DE EJECUCIÓN: Laboratorio de Microbiología y Parasitología U.N.P.R.G. – Lambayeque. 7. DURACIÓN ESTIMADA: 7 meses 8. FECHAS DE INICIO Y TERMINACIÓN: 8.1. Inicio : 22 de enero de 2008.

8.2. Terminación : 30 de setiembre de 2008.

9. CRONOGRAMA DE TRABAJO:

ACTIVIDADES
FASE DE PLANEAMIENTO

2008
E F M A My J Jl A S

2

Revisión Bibliográfica Elaboración del proyecto Aprobación del proyecto Implementación del proyecto FASE DE EJECUCION Recolección de muestras Procesamiento de muestras Registro de datos Análisis estadístico de datos FASE DE COMUNICACIÓN Análisis e interpretación Elaboración del informe final Presentación del informe final

X X

X X X X X X X X X X

X X X X

X X X X

10. RECURSOS DISPONIBLES: 10.1.Personal: • • Personal docente y administrativo de la Facultad de Ciencias Biológicas U.N.P.R.G. – Lambayeque. Personal de servicio técnico del Laboratorio de Microbiología y Parasitología U.N.P.R.G. – Lambayeque.

10.2.Equipos e Instrumentos:

EQUIPOS
Autoclave Vertical Mod. 415 Estufa Horno Refrigeradora Balanza Digital Centrífuga Hornilla Eléctrica Microscopio binocular Pipeta Automática 10 - 100 µL Computadora de Escritorio Cámara Digital

MARCA
FANEM THELLO PRECISION THELLO PRECISION FAEDA EXCELL MANN SURGE ZEISS PRIMO STAR BRAND TOSHIBA CANON

MATERIALES
Placas de Petri Tubos de ensayo tapa rosca Matraz Erlenmeyer Balones Pipetas de 1 mL y 10 mL Embudo Viales Láminas Laminillas 10.3.Materiales y Reactivos:

MARCA
PIREX PIREX PIREX PIREX PIREX PIREX PIREX WHELL BRAND WHELL BRAND

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MATERIAL
Medio Novy McNeal Nicolle Solución Salina Fisiológica Penicilina Streptomicina Lidocaína Metanol comercial (CH3OHCl) Alcohol de 70º Colorante de Giemsa Aceite de Cedro Agua Oxigenada Agujas hipodérmicas descartables Nº 21 y 25. Jeringas descartables de 1, 5 y 10 mL Cámara de Neubauer Lanceta Algodón Pinzas Papel Watman Nº 3 Gotero Soporte de Tinción 10.4.Local: •

MARCA
MERCK LUSA LAB. MEDROCK LAB. MEDROCK SHERFARMA MERCK LAB. C y R AKY MERCK MERCK LAB. ALKOFARMA TERUMO TERUMO MARIENFELD TERUMO CKF INDUSTRIAL

Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Biológicas.

11. PRESUPUESTO: Bienes ……………………………………… ……………. S/. 950. 00 S/. 100. 00

Material de escritorio ……………… ……………. - 1 millar de papel Bond - 25 unid. de fólderes Manila - 4 lapiceros, 2 plumones indelebles, 2 correctores, 2 resaltadores, 2 borradores Material de laboratorio …………….. ……………. - 50 unid. Tubos de ensayo tapa rosca - 3 matraces, 3 fiolas - 1 caja de láminas porta y cubre objetos - 1 lb. de agar agar - 5 lb. De medio NNN - Penicilina - Streptomicina - Lidocaína

S/. 600. 00

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Material para procesamiento de datos ……………. - 1 memoria USB Kingstong 1 GB - 01 caja de CD Room Princo - 02 cartuchos tinta para impresora Canon iP1800 Servicios …………………………………... …………….

S/. 250. 00

S/. 1500. 00 S/. 500. 00

Pasajes y Subvenciones …………………. ……………. - 1 viaje a Trujillo, 06 días - Viajes internos: Lambayeque – Chiclayo – Distritos (Inkahuasi, Salas) Publicaciones ……………………………... ……………. - Publicación de información final, 08 ejemplares Pruebas Moleculares ………………………. - Identificación de sp. por PCR Otros ……………………………………….. - Procesado de fotografías Diapositivas - Imprevistos y ……………. …………….

S/. 200. 00

S/. 600. 00 S/. 200. 00

TOTAL ……………. 12. FINANCIACIÓN: •

S/. 2450. 00

Será financiado por los responsables del trabajo de investigación.

II.

PLAN DE INVESTIGACIÓN:

1. REALIDAD PROBLEMÁTICA: Leishmania braziliensis – peruviana es un protozoario dimórfico, hemoflagelado, perteneciente a la familia Trypanosomatidae (orden Kinetoplastida), que junto con otras 20 especies en el mundo, son 5

causantes de la enfermedad conocida como “Leishmaniosis” (Borda et. al., 2005; Arévalo et. al 2005). Ésta es una enfermedad crónica, de baja patogenicidad, alta morbilidad, metaxénica y zoonótica que se caracteriza por comprometer piel, mucosas y vísceras dependiendo de la especie de Leishmania causante y de la respuesta inmune del huésped. Esta protozoosis es transmitida por la picadura de un insecto flebotomino hembra del género Phlebotomus, en Europa, Asia y África, y Lutzomyia en América. La afinidad de este protozoario por los tejidos hace que se manifieste una reacción inflamatoria característica (Sánchez et. al. 2004). La leishmaniosis cutánea y mucocutánea es una enfermedad de alta prevalencia en muchas áreas tropicales y subtropicales del mundo. Descrita en 24 países de América, extendiéndose del sur de los Estados Unidos (Texas) hasta el norte de Argentina. Esta enfermedad constituye un grave problema de salud pública por los altos costos que representa a nivel psicológico, socio-cultural y económico y es considerada, conjuntamente con la malaria, esquistosomiosis, filariosis, tripanosomiosis y hanseniosis, como una de las seis enfermedades tropicales de mayor importancia en el mundo (Ampuero, 2000; OPS, 1996). En el Perú la leishmaniosis constituye la segunda endemia de tipo tropical y es la tercera causa de morbilidad por enfermedades transmisibles luego de la Malaria y Tuberculosis, teniendo como zona endémica aproximadamente el 74% del área total del país, extendiéndose a través de los Andes y los valles interandinos para la leishmaniosis cutánea y a las zonas de selva alta y selva baja en la leishmaniosis mucocutánea (MINSA, 2006; Ampuero, 2000). Además de los problemas en si de la enfermedad, están también los problemas del tratamiento actual, por los efectos secundarios causados por los medicamentos utilizados en el tratamiento. Los antimoniales pentavalentes usados en el tratamiento de la leishmaniosis cutánea andina (Uta) y como primer tratamiento de la leishmaniosis mucocutánea (Espundia) a dosis elevadas y/o prolongadas puede causar náuseas, vómitos, prurito, fiebre, cefalea, mareos, insomnio, nerviosismo, shock pirogénico, edema y herpes zóster. Es también muy conocida su alta cardiotoxicidad y, a veces, acompañada de nefrotoxicidad. La anfotericina B, usado en caso de falla consecutiva del tratamiento con antimoniales en la leishmaniosis mucocutánea y en los casos de compromiso mucoso severo, es muy conocido por sus efectos colaterales, siendo los más graves la aparición de shock anafiláctico, arritmias cardíacas, falla hepática, mialgias y convulsiones (Rojas, et. al. 2005, MINSA 2006). Se conoce además, que muchos pobladores usan para su tratamiento, ya sea por su desconocimiento u otro motivo, todo tipo de agentes corrosivos, estando entra los más extremos el uso de polvo de pilas, ácido de baterías, petróleo y aceite quemado. 2. PROBLEMA: ¿Tendrá efecto inhibitorio in Vitro a diferentes concentraciones el extracto metanólico de Caesalpinia spinosa (Taya) sobre el crecimiento de Leishmania braziliensis – peruviana?

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3. HIPÓTESIS: “El extracto metanólico de Caesalpinia spinosa (Taya) tiene efecto inhibitorio in Vitro sobre el crecimiento de Leishmania braziliensis – peruviana”. 4. JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA: La leishmaniosis cutánea y mucocutánea es una enfermedad de alta prevalencia en muchas áreas tropicales y subtropicales del mundo y es la segunda endemia de tipo tropical en el Perú (74% del territorio nacional), razones que la convierten en una entidad de gran interés nacional (Ampuero, 2000). Es una enfermedad en la cual quedan aún muchas interrogantes por resolver. No existe vacuna y para su tratamiento se usan aún terapias de principios de siglo que consisten en saturar al cuerpo con inyecciones de antimonio. Además, por las características geográficas de la enfermedad (selvas y valles interandinos) está mas difundida en gente de bajos recursos económicos, en la que además de mermar su salud y economía, también causa indirectamente problemas psicológicos (baja autoestima) por las deformaciones que genera. La medicina tradicional o alternativa usa desde hace mucho tiempo diversos tipos de plantas para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades. Para el tratamiento de Leishmaniosis por estos métodos, se usan por ejemplo, de acuerdo a la zona, plantas tan diversas como maíz, eucalipto, sábila, llantén, malva, matico, taya y muchos otros (Rojas et. al., 2005). La “Taya” (Caesalpinia spinosa (Mol.) O. Kuntz), también conocida como “Tara”, es una leguminosa muy utilizada para estos fines, sobre todo en los departamentos de Amazonas, Cajamarca y San Martín (Basurto, 2003; Llatas, 2005). Esta planta muy utilizada en la actualidad en la industria por sus altas concentraciones de tanino y ácido gálico, es conocida además por su alto poder astringente por coagular las albúminas de las mucosas y de los tejidos, creando una capa aislante y protectora que reduce la irritación y el dolor; por tal motivo son usados externamente para detener pequeñas hemorragias locales; en inflamaciones de la cavidad bucal, catarros, bronquitis, quemaduras, hemorroides, e internamente contra la diarrea, enfriamiento intestinal, afecciones vesiculares, y como contraveneno en caso de intoxicación por alcaloides vegetales. (De La Cruz, 2004; Quispe, 2006). Otras sustancias presentes en esta planta son el ácido galotánico, pirocatecol, pirogalol, elágicos e hidrocoloides, también de mucha importancia (López et.al. 1998). Además, el uso de medicamentos de origen químico para el tratamiento de enfermedades como la Leishmaniosis ha demostrado un efecto cada vez más común, la “saturación farmacológica”, sobre todo en niños y personas de avanzada edad, que llegan a causar, en la mayor parte de los casos, efectos secundarios graves. Gran cantidad de científicos han encontrado en el uso terapéutico de flores, raíces, hojas y frutos de las plantas un valioso aliado, ya que ayudan, de forma contundente, a combatir todo tipo de trastornos sin que, por ello, aporten ningún tipo de contraindicación o efecto nocivo para la salud, además de ser un

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tratamiento económico y de fácil acceso, sobre todo para la población de bajos recursos. (Innatia, 2007). 5. OBJETIVOS: Aislar e identificar Leishmania braziliensis – peruviana de muestras clínicas. Determinar el efecto inhibitorio del extracto metanólico de C. espinosa (taya) sobre L. braziliensis – peruviana. Determinar la concentración mínima inhibitoria del extracto metanólico de C. espinosa (taya) sobre L. braziliensis – peruviana.

6. ANTECEDENTES: La leishmaniosis cutánea y mucocutánea es una enfermedad de alta prevalencia en muchas áreas tropicales y subtropicales del mundo. En el Perú constituye la segunda endemia de tipo tropical y la tercera causa de morbilidad por enfermedades transmisibles, luego de la malaria y al tuberculosis, teniendo como zona endémica aproximadamente el 74% del total del área del país (Ampuero, 2000; OPS, 1996; Torres y Barroeta, 1996). Se usan diferentes esquemas terapéuticos contra las diversas formas clínicas de leishmaniosis. Aunque muchas investigaciones coinciden en considerar a los antimoniales pentavalentes como las drogas más efectivas, se usan además otros medicamentos como: anfotericina B, licochalcone A, miconazol, isoniazida, dapsona, rifampicina, trimetoprim, sulfametoxazol e interferón gamma (Pérez et. al. 2005). Estos tratamientos presenta tres dificultades fundamentales: 1. escases y alto costo de las drogas; 2. elevada toxicidad y 3. grandes diferencias en la respuesta individual, dependiendo de la especie de parásito involucrado y sobre todo del estado inmunológico del hospedador. (Torres y Barroeda, 1996; Muñoz y Pareja, 2003, Monzote et. al. 2004). Muñoz y Pareja. 2004, reportaron que en la actualidad en el Perú, pobladores de la sierra y tribus selváticas como los Ashaninkas utilizan plantas con propiedades curativas contra la leishmaniasis, siendo de gran interés el valor de éstas como fuentes de agentes medicinales debido a sus constituyentes químicos , específicamente los metabolitos secundarios. Entre las plantas reportadas están el tahuarí (Tabebuia serratifolia), piñón (Jatropa curcas), ojé (Ficus insipida), barbasco (Lonchocarpus nicou), cedro (Cederla fissilis) y mito (Carica candicans). Delorenzi et. al. en Monzote et. al. (2004) reportaron el efecto de un extracto de Pescheria australis frente a promastigotes de L. braziliensis en el cual obtuvieron un 30% de inhibición del crecimiento al incubar los parásitos con 100 µg/mL, sin embargo, al purificar el alcaloide indólico coronaridina obtuvieron un 97% de inhibición del crecimiento de los promastigotes a una concentración de 12.5 µg/mL. La maca, Lepidium peruvianum, es una Brassicaceae de los andes peruanos en la cual se ha determinado la presencia de alcaloides imidazólicos, benzil glocosinolatos, taninos, flavonoides y saponinas, compuestos, todos ellos, muy activos frente a Leishmania y a trofozoitos de Giardia intestinales. El

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efecto leishmanicida podría deberse a la presencia de isotiocianatos biológicamente activos: benzil-isotiocianato y p-metoxibenzil isotiocianato (Li et. al. 2001); además se ha demostrado que las concentraciones de dichos compuestos contenidos el L. peruvianum difieren entre ecotipos y serían las causas de las diferencias en el efecto leishmanicida (Alzadora et. al 2007). La tara, Caesalpinia espinosa, es un árbol de hasta 5 m de alto cuyo hábitat abarca desde Venezuela hasta Bolivia. En el Perú, desarrolla en forma silvestre o cultivada, en las lomas costeras y en los valles interandinos, entre 1,000 y 3,100 msnm. De esta Caesalpinaceae se obtiene el polvo de tara que contiene un gran porcentaje de taninos y además ácido tánico, ácido gálico y ácido galotánico. Los taninos son sustancias que se producen en diversas partes de la planta, como son: corteza, frutos, hojas, raíces y semillas (Unten en Bazurto, 2006). Los taninos tiene la propiedad de formar complejos con macromoléculas, particularmente con las proteínas; así forman enlaces colocándose entre las fibras de colágeno de la piel, empleándolos en medicina en tratamientos de escoriaciones y quemaduras de la piel donde las proteínas forman una capa protectora antiséptica bajo la cual se regeneran los tejidos, además los preparados a base de drogas ricas en taninos, como las decocciones, se emplean para detener pequeñas hemorragias locales; en inflamaciones de la cavidad bucal, catarros, bronquitis, hemorroides y otros (Siccha en Bazurto, 2006). 7. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO: 7.1. Material: Una cepa de L. braziliensis – peruviana identificada mediante Pruebas Moleculares identificadas en el Laboratorio del Instituto de Biología Molecular de la F. CC. BB. – U.N.P.R.G. – Lambayeque. Las vainas y hojas de C. espinosa (Taya) serán recolectadas en la comunidad de Chiribamba, distrito de Huambos (Región Cajamarca). En el laboratorio se procederá a seleccionar las mejores hojas y frutos, quedando aptos para su procesamiento. 7.2. Métodos: 7.2.1.Población y Muestra de Estudio: La población objeto de estudio estará representada por cepas de L. braziliensis – peruviana. La muestra estará constituida por una cepa de L. braziliensis – peruviana enfrentada a cinco concentraciones de extracto metanólico de C. espinosa (Taya) (50, 100, 200, 400 y 800 mg/mL) y tres tipos de extracto (de hoja, semilla y hoja + semilla); haciendo un total de 15. 7.2.2.Técnica e Instrumentos de Recolección de Datos:  Identificación del Parásito (Ampuero, 2000):

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Para identificar Leishmania braziliensis – peruviana se realizarán los siguientes pasos: o Observación Directa por Frotis de la Lesión: en la cual se confirmará la presencia del parásito. Obtención de la muestra: 1. Lavar la lesión con agua y jabón 2. Desinfectar con alcohol al 70% los bordes de la lesión. 3. Presionar con firmeza los bordes de la lesión hasta que empalidezca; en el borde interno, hacer una pequeña incisión con hoja de bisturí tratando de levantar la piel, secar la sangre con gasa y raspar el tejido. 4. Con el material obtenido en la hoja de bisturí, hacer el frotis en una lámina, procurando que este sea delgado y evitando pasar dos veces por el mismo sitio. 5. Rotular la lámina y dejar secar al medio ambiente. Procesamiento de la muestra: 1. Fijar la lámina que contiene el frotis con alcohol metílico durante 3 minutos. Descartar el alcohol y dejar secar a temperatura ambiente. 2. Cubrir la lámina con solución de trabajo Giemsa (una gota de solución Giemsa stock por cada mL de solución buffer pH 7,2 – 7,4) por 30 minutos. 3. Descartar el colorante y lavar ligeramente con agua corriente. 4. Secar al medio ambiente y hacer la lectura con lente de inmersión. o Obtención de cultivos de L. braziliensis – peruviana: la positividad de la prueba anterior nos permitirá extraer con seguridad una muestra para la posterior obtención de los cultivos de L. braziliensis – peruviana, para esto se realizará el siguiente procedimiento: 1. Lavar la lesión con agua y jabón. 2. Desinfectar la zona elegida con alcohol al 70% y agua oxigenada. 3. Con una jeringa de tuberculina, la cual, ha sido cargada previamente con 0,2 mL de solución salina estéril con antibióticos, se punza y se inyecta el contenido suavemente dentro del área decolorada de la pápula o dentro del margen no necrotizado de la úlcera. 4. Enseguida se aspira. La aguja y jeringa son retiradas aplicando ligera presión hacia atrás, al mismo tiempo que se gira suavemente hacia derecha e izquierda. El procedimiento es relativamente indoloro, sin embargo, puede utilizarse un anestésico local (Lidocaína al 2%).

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5. Dos a tres gotas del material aspirado son inoculados en tubos con tapa rosca que contienen medio de cultivo Novy McNeal Nicolle (NNN), al cual se le ha añadido 0,1 mL de solución salina que contiene 500 IU de penicilina y 500 mg de streptomicina/mL para prevenir la contaminación. 6. Mantener los tubos de cultivo a 24°C y revisarlos diariamente. Si no se dispusiera de estufa, los cultivos se pueden mantener a temperatura ambiente, siempre que ésta no exceda los 26°C. 7. Se realizarán recuentos diarios a fin de determinar la fase logarítmica del parásito. o Identificación Específica de Especie por Técnicas Moleculares: L. braziliensis – peruviana será identificada específicamente mediante las técnicas de PCR y RFLP.

 Obtención del Extracto Metanólico de Caesalpinia spinosa (Taya) (Alzadora et. al., 2007): o Se prepararán extractos metanólicos de hoja, fruto y hoja y fruto (1:1) de Caesalpinia spinosa (Taya), para lo cual se seguirá el siguiente procedimiento:  Se recolectarán las hojas y frutos de “Taya” teniendo en cuenta su tamaño, color y estado.  Luego, se obtendrá un kilogramo de muestra fresca, la cual se pondrá a secar al horno a una temperatura de 45 ºC/24 – 36 h. con la finalidad de eliminar de forma eficiente la humedad.  Luego, se procederá a moler las muestras secas utilizando un mortero, hasta obtener un pulverizado homogéneo.  Luego, se pesarán 50 gr de la muestra molida y se colocará en un balón con 500 mL de metanol comercial (CH3 OH Cl), para posteriormente llevarlo a maceración por 10 días.  Luego se filtrará el macerado utilizando papel Watman Nº 3 en un matraz estéril para luego colocarlo en un crisol y llevarlo a estufa de aire circulante a 40 ºC, hasta obtener ¼ del volumen inicial.  Luego se secó en estufa a 40 ºC, hasta la evaporación total del solvente.  El extracto seco y en polvo será recibido en viales estériles.  Estandarización de la Solución Stock (Rimarachín y Vasquéz, 2004): o Se pesará 4 g de extracto puro en un recipiente estéril y luego se agregará 5 mL de Solución Salina Fisiológica

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Estéril (SSFE), para obtener la Solución Stock cuya concentración final será 800 mg/mL. o Luego de obtenida la Solución Stock se procederá a preparar las concentraciones de 50, 100, 200, 400 y 800 mg/mL.  Prueba de “Efecto Inhibitorio” in Vitro (Alzadora et. al., 2007): o Para esta prueba se utilizarán cultivos de promastigotes de Leishmania braziliensis – peruviana en fase log. o Pasado 5 días de cultivo a la fase líquida se le añadirá el extracto metanólico de cada tipo (hoja, fruto y hoja + fruto). o Se emplearán concentraciones de 50, 100, 200, 400 y 800 mg/mL de Extracto Metanólico. o Los ensayos se realizarán por triplicado para cada tipo de extracto, considerando como controles cultivos sin Extracto Metanólico. o El recuento de parásitos se realizará diariamente desde el primer hasta el quinto día de incubación con el Extracto Metanólico. o Para el recuento del parásito se empleará cámara de Neubauer (400x) lo que además permitirá evaluar la morfología y la supervivencia del parásito, ésta última, relacionada con su movimiento. o El efecto inhibitorio in Vitro del Extracto Metanólico de C. espinosa (Taya) se demostrará a través de la Actividad Leishmanicida (reducción en la cantidad de promastigotes). Ésta se determinará aplicando la siguiente fórmula: Actividad Leishmanicida = [100 – (L2/L1)] x 100)

o Donde L1 será el número de células viables en el cultivo control y L2 será el número de células viables después del tratamiento con los extractos. o El porcentaje de viabilidad se determinará por comparación con el número de promastigotes de los controles. 7.2.3.Diseño de contrastación de Hipótesis: La investigación a realizar es experimental y corresponde al diseño de estímulo creciente (Alzadora et. al., 2007). Para este diseño se utilizará una cepa experimental y una cepa control. A la cepa experimental se le inocularán dosis de 50, 100, 200, 400 y 800 mg/mL del extracto metanólico. La cepa control quedará sin inocular. Este procedimiento se

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realizará para los tres tipos de extracto (hoja, fruto y hoja + fruto). Se compararán los resultados antes y después de inocular los extractos metanólicos a través de la determinación de la Actividad Leishmanicida. Se realizarán 3 repeticiones por cada tipo de extracto. 7.2.4.Análisis Estadístico de los Datos: Se utilizará un diseño con arreglo factorial 1 x 5 x 3, correspondiendo el primer factor al número de cepas, el segundo factor a las concentraciones del extracto metanólico (50, 100, 200, 400 y 800 mg/mL) y el tercer factor a los tipos de extractos (hoja, fruto y hoja + fruto). El experimento se realizará con 3 repeticiones (Gráfico Nº 1), lo que harán un total de 45 unidades experimentales. El diseño factorial se aplicará para cada tipo de extracto (hoja, fruto y hoja + fruto). Para el análisis estadístico de los datos se utilizará la prueba de “t de Student” y la prueba de Significación de Tuckey a 0,05 de nivel de significación. Para la mejor interpretación, los resultados de los datos serán presentados en tablas y gráficos.

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8. REFERENCIAS: Alzadora, L.; Solis H.; Rojas, M. 2007. Actividad leishmanicida de los extractos metabólicos de cuatro ecotipos de Lepidium peruvianum, Chacón (Brassicaceae) Rev. Peru. Biol. Número especial 13(3): 211-214. Ampuero, J. 2000. Leishmaniasis. Módulos Técnicos. Serie de Documentos Monográficos Nº 8. MINSA. 2000. 80 pp. Bazurto, L. 2006. Todo sobre la Tara: Caesalpinia spinosa o Caesalpinia tinctoria. ALNICOLSA del Perú. Universidades Latinoamericanas. Monzote, L. y cols. 2004. Propiedades antiprotozoarias de aceites esenciales extraídos de plantas cubanas. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”. Muñoz, A. y B., Pareja. 2003. Plantas medicinales empleadas en el tratamiento de la leishmaniasis. Folia Dermatológica Peruana. Círculo Dermatológico del Perú. 14 pp. Organización Panamericana de la Salud. 1996. Epidemiología y Control de la Leishmaniasis en las Ameritas por País o por Territorio. Cuaderno Técnico Nº 44. 1 – 3, 18 – 19 pp. Pérez, J.; J., Pérez y Castanys, S. 2007. Estrategias terapéuticas y bases moleculares de la resistencia a fármacos frente a la leishmaniasis. Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra” (CSIC). Rimarachín, J. y M. Vasquéz. 2004. Sensibilidad in vitro de Candida albicans, Sthaphylococcus aureus y Salmonella Typha al extracto etanólico de Bidens pilosa L. “Amor seco”. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. Lambayeque. Torres, R, y S., Barroeta. 1996. Tratamiento de la Leishmaniasis Cutánea Localizada con Infiltraciones Perilesionales de Glucantime y Lidocaína. Facultad de Medicina. Universidad del Zulla.

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GRAFICO Nº 1: Diseño experimental para determinar TIPOS DE EXTRACTO
EXTRACTO METANOLICO HOJA EXTRACTO METANOLICO FRUTO EXTRACTO METANOLICO HOJA + FRUTO

Leishmania braziliensis - peruviana en fase log
50 mg/mL R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3

CONCENTRACIONES

100 mg/mL

200 mg/mL

400 mg/mL

800 mg/mL

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