CIonacin de genes

Una cIona es definida como un gran numero de cIuIas o moIcuIas

todas idnticas provenientes de un origen nico
CIonacin deI DNA ha sido posibIe por:
Enzimas de restriccin.
La capacidad de Ios vectores de cIonacin de muItipIicarse despus
que DNA ha sido insertado en su genoma.
CIonacin deI DNA
Es Ia insercin de DNA en un vector de cIonacin y Iuego este
vector con eI DNA debe ser introducido en bacterias o Ievaduras
u otra cIuIa hospedera.
. Un gen o una secuencia
2. Todo eI genoma de una cIuIa: Librera genomica.
3. Todo Io que se transcribe de una cIuIa (transcriptoma): Librera de cDNA
QUE SE PUEDE CLONAR
Proceso de cIonacin invoIucra:
A. DNA bIanco (producto de PCR o RT-PCR)
B. Un vector de cIonacin
C. CIuIa hospedera
D. Mtodo de introducir Io Iigado aI vector de cIonacion en Ia ceIuIa hospedera
E. Mtodo de tamizaje deI inserto cIonado.
A. DNA BIanco:
PCR: Primers especificos y purificar eI fragmento ampIificado
RT-PCR: cDNA y Iuego primers especificos y purificar eI fragmento ampIificado.
B. Vectores de CIonacion-Expresin: EIementos
PIsmidos, cosmidos, fagos, Bac, Yac, etc.
C. CIuIa hospedera:
E. coli, Ievaduras, CIuIas de insectos.
D. Mtodos de transformacin:
Infectividad.
CIoruro de caIcio, cIoruro de Iitio, Iiposomas, etc.
EIectroporacion, baIistica o shot gun.
CIonacin requiere:
Mtodo de tamizaje de Ia presencia deI inserto.
- IniciaImente, que Ia bacetria crezca en presencia deI marcador de seIeccin.
- Cambio de coIoracin de Ia coIonia bacteriana.
- PCR
- Miniprep y digestin con enzimas de restriccin.
- Hibridizacin con una sonda
- EvaIuando Ia expresin o actividad de Ia protena.
Esquema generaI de cIonacin de una secuencia o DNA
Vector DNA a cIonar
CIuIa hospedera
Tranformacin
SeIeccin de cIonas
"Vector" es un agente que puede llevar un fragmento de DNA dentro de
una clula hospedera.
Vector de cIonacin. Si es usado para reproducir el fragmento de
DNA se llama:
Vector de expresin: Si es usado para expresar cierto gen se
llama.
AmpIificacin de un fragmento de DNA: se puede lograr en una
clula usando vectores de clonacin como plsmidos y
bacterifagos.
Tipos de Vectores: Tipos de Vectores:
PIsmidos Fagos Cosmidos Bac YAC
Amp
R
LacZ

i
n
d

I
I
I
S
p
h
l
P
s
t
1
S
a
l
1
B
a
m

I
E
c
o

R
I
Cos Cos
Eco RI
Brazo Izq. Brazo Der.
pIsmido
Fago Lambda
Cos Cos
Cosmido
Vectores de CIonacin y Vectores de expresin
A ARS CEN B
Brazo Izq. Brazo Der.
TEL
TEL
YAC
Sitio de Sitio de
CIonacin CIonacin
Eco RI
ri
Lac Z
%ipos de vectores
Vecfor CeI. huesped Tomoo inserfo
PIosmids 8ocferio Hosfo Ib kb
8ocferio virus
(Iombdo)
8ocferio Hosfo Zb kb
8AC (bocferioI
orfificioI
chromosome)
8ocferio
I00-b00 kb
YAC (yeosf
orfificioI
chromosome)
Yeosf Zb0-I000 kb
Cosmid
8ocferio
30-4b kb
Son DNA circular (excepciones) de doble cadena que existen en
bacterias y en el ncleo de algunas clulas eucariticas. Se pueden
replicar independientemente de la clula hospedera. El tamao de un
plasmido oscila entre unas pocas kilobases hasta 100 kb.
PLASMIDOS
Debera ser pequeo.
Secuencia debera ser conocida.
Alto numero de copias. rigen de
replicacin
Debe contener un marcador de
seleccin.
Debera contener un segundo
marcador de seleccin que se inactive
por la insercin del DNA clonado.
%ener un gran numero de sitios nicos
para ER en uno de los dos marcadores
de seleccin.
LacZ codifica la .galactosidasa.
Lacl codifica el factor que controla la
transcripcion of lacZ.
Propiedades deseabIes de un pIasmido:
CIonacin en pIsmidos CIonacin en pIsmidos
CIonacin Extremos
Cohesivos
CIonacin Modificando
Extremos
Fagos:
Son virus que infectan bacterias. La principal ventaja de estos vectores es
su alta eficiencia de transformacin, alrededor de 1000 veces mas que un
vector tipo plsmido.
CIonacin en Fago Lambda CIonacin en Fago Lambda
Cosmidos
Son una combinacin de un plasmido y los sitios cos, lo cual permite
empaquetar este DNA en la cabeza de un virion y luego ser introducido
en bacterias facilmente.
Procedimiento para cIonar DNA en cosmidos
YAC
Los cromosomas artificiales de levaduras (Yeast Artificial Chromosome)
(YAC) es capaz de llevar fragmentos de DNA muy largos (hasta 2 Mb), pero
la eficiencia de transformacin es muy baja.
Centromeros (CEN)
%elomeros (%EL).
Secuencias replicantes Autnomas (ARS.
para proliferacin en la cel. hospedera.
,257 para amplificacin selectiva
Marcadores de seleccin tales como %RP1 y
URA3.
Sitios de clonacin para ER (e.g., EcoRI y
B,2 HI)
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Transformacin: CaCI
2
PIasmidos
Bacteria
Ca CI
2
PULSE
DNA
Sitio de
permeacin
ELECTROPORACIN
Antibiotico
Antibiotico
Purificacin deI
pIsmido
Verificar eI fragmento
cIonado
Sistema de Tamizaje de Ias cIuIas transformadas
IucZ gene: 8efo-goIocfosidose
PIusmid
Cut pIusmid for Iigution
in IucZ region
Ligur genomic DNA
No etu-guIuctosiduse produced|
AmpIify in X-guI und
IPTS
SeIect white coIonies
Verificacin o deteccin deI fragmento cIonado
Miniprep y enzima de restriccin.
PCR.
Sonda (Southern bIot).
Deteccin de Ia protena (western bIot).
Caja petri con coIonias
Transferencia a fiItro
Deteccin de Ias
bacterias transformadas
con eI gen de inters
Mtodos de deteccin de
Ia cIona con eI inserto.
CIonacin y expresin de protenas en cIuIas eucariticas
Saccharomyces cerevisiae
Caractersticas de por que se empIea este microorganismo:
. La existencia de herramientas para eI manejo deI DNA de Levaduras, incIuyendo
vectores de expresin y cepas
2. Un ampIio conocimiento de Ia gentica y bioqumica deI organsmo
3. Va secretoria eucaritica (no es muy eficiente para protenas recombinantes,
especiaImente para aIto PM)
4. Modificaciones post-traduccionaI eucariticas (N-Iinked y O-Linked, sin embargo
hay diferencias con Ios mamferos).
5. Organsmo seguro.
Vectores de Expresin en S. cerevisiase
'ector Promotor Marcador
p% PG1 URA3
p%E32 CUP1 %RP1
pMA230 PG1 LEU2
pMRY 2 GPD LEU2d
Pybdt10 PH %RP1
PG1 LEU2
pYEULS1 PG1 LEU2d
URA3
CIuIas de insectos: BacuoIovirus
PARA QUE SE CLONA DNA?
. Conocer Ia secuencia
2. Expresar una protena
3. Para conocer secuencias reguIatorias
4. Conocer secuencia de microorganismos de difciI cuItivo o no cuItivabIes.
2 3 4 5 6 7 8
.5 KDa
Expresin y purificacin de Ia protena
recombinante