C rcei c nd ls co r a i s aatr ai e o mi og ns z ó r mo d d p rd rs ilgcs e e ua oa boó i a ub n s efn o at o c n r a a d a g s ci s o v taa e t c n e c n l rtmino o v n i a o yd ei n c nd n tine e l ai e ur ts mi ó e d l c macs eL r a e a o ra d éi s d

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Caracterización de los microorganismos de depuradoras biológicas urbanas de fangos activos con tratamiento convencional y de eliminación de nutrientes de las comarcas de Lérida

Jessica Vasco1; Meritxell Mas1; Humbert Salvadó2
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Hydrolab Microbiologica. c/ Blanco 38. 08028 Barcelona. Telf. 93 411 09 40. c.e: info@hydrolab.es 2 Dep. Biologia Animal, Facultat de Biologia, UB. Avda. Diagonal 645. 08028 Barcelona. c.e.: hsalvado@ub.edu

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RESUMEN Conocer las comunidades de los microorganismos presentes en los sistemas de depuración por fangos activos es importante debido a su utilización como bioindicadores del proceso de depuración, constituyendo una herramienta muy importante para el control y la gestión de estos procesos de depuración. El principal objetivo de este proyecto es el de caracterizar la microfauna de una serie de estaciones depuradoras de aguas residuales urbanas, así como estudiar las relaciones que se establecen entre las especies o grupos de microorganismos y los parámetros fisicoquímicos y operacionales del proceso de depuración. En total se analizaron 106 muestras correspondientes a 20 depuradoras urbanas, de las cuales 10 tienen un tratamiento convencional de fangos activos y las otras 10, un tratamiento de eliminación de nutrientes, ya que abocan las aguas a zonas sensibles a la eutrofización. La caracterización de las comunidades de microorganismos se realizó a partir de análisis de bioindicación, en los cuales se identificaron y se realizó el recuento de los diversos tipos de microorganismos presentes en los fangos activos, además, se analizó el estado del fango. Por ultimo, también se analizaron los microorganismos que suelen producir los principales problemas presentes en las plantas depuradoras, y que suelen provocar que la calidad del efluente disminuya notablemente, llegando incluso a no cumplir con los límites de la Directiva 91/271/CEE. A partir de los resultados obtenidos con este estudio se han podido determinar algunas diferencias entre las depuradoras con tratamiento convencional y las depuradoras con tratamiento de eliminación de nutrientes. Se ha comprobado que la mayoría de las depuradoras estudiadas cumplían con los valores límite establecidos por la Directiva europea 91/271. Además, también se han determinado las especies o grupos de microorganismos más frecuentes y abundantes en estas depuradoras, así como los principales causantes de los problemas que tienen.

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ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................7 1.1. DEPURACIÓN BIOLÓGICA DE LAS AGUAS RESIDUALES...................7 1.2. SISTEMA DE DEPURACIÓN MEDIANTE FANGOS ACTIVOS ...............7 1.2.1. Tratamiento de eliminación de nutrientes...............................................7 1.2.2. Parámetros operacionales y de control ...................................................8 1.2.2.1. Carga orgánica .........................................................................8 1.2.2.2. Concentración de biomasa .......................................................8 1.2.2.3. Carga másica (F/M) .................................................................9 1.2.2.4. Edad del fango o tiempo medio de retención celular...............9 1.2.2.5. Índice volumétrico de fangos (IVF).........................................9 1.2.3. Fundamento del proceso .........................................................................9 1.2.4. Formación del flóculos ...........................................................................10 1.3. LOS MICROORGANISMOS DE LOS SISTEMAS BIOLÓGICAS DE DEPURACIÓN........................................................................................................13 1.3.1 Bacterias ..................................................................................................13 1.3.2. Protozoos ................................................................................................15 1.3.3. Metazoos.................................................................................................17 1.4. RELACIONES TRÓFICAS ENTRE LOS MICROORGANISMOS ..............18 1.5. SUCESIÓN TEMPORAL ................................................................................18 1.6. UTILIZACIÓN DE LA MICROFAUNA COMO BIOINDICADOR DEL PROCESO.......................................................................................................19 1.7. PROBLEMAS DE SEPARACIÓN LÍQUIDO/SÓLIDO EN EL TRATAMIENTO DE FANGOS ACTIVOS ..........................................................20 1.7.1. Pin-point floc o pin-floc..........................................................................20 1.7.2. Bulking viscoso.......................................................................................21 1.7.3. Ascensión de los fangos..........................................................................22 1.7.4. Bulking filamentoso ................................................................................23 1.7.5. Foaming..................................................................................................24 2. OBJETIVOS ...........................................................................................................25 3. MATERIALES Y MÉTODOS ..............................................................................26 3.1. DESCRIPCIÓN DE LAS ESTACIONES DEPURADORAS DE AGUAS RESIDUALES .........................................................................................................26 3.2. RECOGIDA DE LAS MUESTRAS.................................................................27 3.3. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA ...............................................................27 3.4. DETERMINACIÓN DEL ESTADO MORFOLÓGICO Y ESTRUCTURAL

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DEL FANGO...........................................................................................................28 3.4.1 Tamaño ....................................................................................................28 3.4.2. Estructura................................................................................................28 3.4.3. Grado de cobertura (concentración) .......................................................28 3.4.4. Otras observaciones ...............................................................................29 3.5. DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS BIOLÓGICOS..........................29 3.5.1. Identificación de los microorganismos ...................................................29 3.5.1.1. Técnicas de tinción ..................................................................29 3.5.2. Determinación de los microorganismos .................................................31 3.5.3. Cuantificación de los microorganismos..................................................32 3.5.3.1. Protozoos, gimnamebas medianas y grandes y metazoos........32 3.5.3.2. Protozoos flagelados y gimnamebas de tamaño pequeño........33 3.5.3.3. Recuento de microorganismos filamentosos ...........................34 3.5.4. Determinación del índice de diversidad .................................................34 3.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS ................................................................................35 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................35 4.1. EL AFLUENTEE ..................................................................................................35 4.1.1. Caracterización del afluente ...................................................................36 4.1.2. Relaciones entre los parámetros físico-químicos ...................................36 4.1.3. Biodegradabilidad del agua del afluente.................................................37 4.2. EL EFLUENTE .....................................................................................................39 4.2.1. Caracterización del efluente ...................................................................39 4.2.2. Relaciones entre los parámetros físico-químicos ...................................41 4.2.3. Rendimiento operacional de las depuradoras estudiadas........................42 4.3. CARACTERIZACIÓN DEL FANGO..................................................................43 4.3.1. Tamaño ...................................................................................................43 4.3.2. Estructura................................................................................................45 4.3.3. Grado de cobertura (concentración) .......................................................46 4.3.4. Otras observaciones ................................................................................47 4.3.4.1. Bacterias dispersas ...................................................................47 4.3.4.2. Bacterias helicoidales...............................................................48 4.3.4.3. Bacterias PAO y GAO .............................................................49 4.3.4.4. Zoogloea ..................................................................................50 4.4. COMUNIDADES DE MICROORGANISMOS FILAMENTOSOS ...................51 4.4.1. Clasificación de los microorganismos filamentosos...............................51 4.4.2. Porcentajes de aparición de los filamentos dominantes y secundarios...52 4.4.3. Relaciones entre los microorganismos filamentosos y los parámetros físico-químicos...............................................................................53 4.4.4. Microorganismos filamentosos más relevantes ......................................56 4.4.4.1. Microthrix parvicella ...............................................................56 4.4.4.2. Actinomicetos nocardioformes ................................................57 4.4.4.3. Tipo 021N ................................................................................58 5

4.4.4.4. Tipo 1851 .................................................................................59 4.5. COMUNIDADES DE PROTOZOOS FLAGELADOS .......................................60 4.5.1. Clasificación de los protozoos flagelados...............................................60 4.5.2. Relaciones entre los protozoos flagelados y los parámetros fisico-químicos ..........................................................................................................................62 4.5.3. Protozoos flagelados más relevantes ......................................................62 4.5.3.1. Coanoflagelados.......................................................................62 4.6. COMUNIDADES DE PROTOZOOS AMEBOIDEOS .......................................63 4.6.1. Clasificación de los protozoos ameboideos............................................63 4.6.2. Relaciones entre los protozoos ameboideos y los parámetros físico-químicos .................................................................................................64 4.6.3. Protozoos ameboideos más relevantes....................................................65 4.6.3.1. Euglypha sp..............................................................................66 4.6.3.2. Tecamebas grandes ..................................................................66 4.7. COMUNIDADES DE PROTOZOOS CILIADOS ...............................................67 4.7.1. Clasificación de los protozoos ciliados...................................................67 4.7.2. Grupos ecológicos de los ciliados...........................................................68 4.7.3. Relaciones entre los protozoos ciliados y los parámetros fisico-químicos ..........................................................................................................................69 4.7.4. Especies de protozoos ciliados más relevantes.......................................71 4.7.4.1. Opercularia articulata .............................................................71 4.7.4.2. Vorticella aquadulcis-complex ................................................72 4.7.4.3. Vorticella convallaria-complex ...............................................73 4.7.5. Diversidad específica de los protozoos ciliados .....................................73 4.8. COMUNIDADES DE METAZOOS ....................................................................74 4.8.1. Clasificación de los metazoos................................................................. 4.8.2. Relaciones entre los metazoos y los parámetros operacionales del proceso .......................................................................................................................... 75 4.8.3. Metazoos más relevantes ........................................................................76 4.8.3.1. Rotíferos...................................................................................76 4.9. PROBLEMAS DE FUNCIONAMIENTO............................................................77 4.9.1. Bulking filamentoso ................................................................................77 4.9.2. Foaming..................................................................................................79 5. CONCLUSIONES ..................................................................................................81 6. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................84

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1. INTRODUCCIÓN
1.1. DEPURACIÓN BIOLÓGICA DE LAS AGUAS RESIDUALES La depuración biológica de las aguas residuales consiste en la coagulación y eliminación de los sólidos coloidales no sedimentables y la estabilización de la materia orgánica presente en el agua mediante la acción de los microorganismos (Metcalf y Eddy, 1995). Así mismo, este conjunto de microorganismos es capaz de eliminar compuestos nitrogenados, fosfatos y otras sustancias tóxicas. Durante este proceso, transforman los contaminantes presentes en las aguas residuales en nueva biomasa, dióxido de carbono y otros productos finales, que dependerán de la naturaleza de los contaminantes y de la distribución de los microorganismos (Irvine et al, 1988). Hay muchos tipos de procesos biológicos aplicados al tratamiento de les aguas residuales, ya que pueden tratarse de procesos aeróbicos, anaeróbicos, anóxicos, procesos combinados y sistemas de lagunaje. A la vez, estos procesos es poden dividir según si el tratamiento se lleva a cabo en un sistema de cultivo en suspensión, fijo o si resulta una combinación de los dos (Metcalf y Eddy, 1995). 1.2. SISTEMA DE DEPURACIÓN MEDIANTE FANGOS ACTIVO La depuración mediante fangos activos consta de un sistema biológico de tratamiento aerobio de cultivo en suspensión. Este proceso es basa en el cultivo suspendido de forma continua, mediante aeración o agitación, de una masa de microorganismos encargados de degradar los residuos del agua por vía aeróbica (Henze et al., 1995). Esta suspensión se denomina licor mezcla. Este sistema de depuración fue desarrollado por Arden y Lockett (Rius, 2003) al introducir la recirculación de la suspensión formada por biomasa activa que se había formado durante el período de aeración del agua residual. 1.2.1. Tratamiento de eliminación de nutrientes Junto con la eliminación de la materia orgánica, en las zonas calificadas como sensibles según la Directiva 91/271/CEE, las depuradoras tienen que eliminar nitrógeno y/o fósforo, para evitar la eutrofización del medio receptor.

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La eliminación de nitrógeno se realiza mediante vía biológica a partir de la nitrificación y la desnitrificación. Estos procesos se consiguen a partir de modificaciones del tratamiento convencional antes descrito, donde se alternan etapas aeróbicas, anóxicas y anaeróbicas para que la microfauna esté sometida a diferentes estados de aireación. Así, en las zonas oxigenadas se pueden producir procesos de nitrificación (paso del ión amonio a nitrito y posteriormente a nitrato), y en las zonas con ausencia de oxigeno se produce la desnitrificación (reducción del nitrato a nitrito y de nitrito a nitrógeno molecular), consiguiendo la eliminación de nitrógeno. El fósforo del agua residual se encuentra principalmente en forma de ortofosfatos, polifosfatos o fósforo orgánico. Este fósforo es puede eliminar del agua residual mediante precipitación química con sales de hierro o mediante eliminación biológica. Una parte del fósforo (10 al 30%) es utilizado por los microorganismos para la síntesis celular y el transporte de energía (Metcalf y Eddy, 1995). El resto se puede eliminar mediante bacterias acumuladoras de fósforo, las cuales acumulan fosfatos en forma de polifosfatos como fuente de energía en condiciones aeróbicas o anóxicas, mientras que en condiciones anaeróbicas, liberan una parte de este fosfato al medio. Con este proceso, en el cual la captación de fósforo es mayor que la liberación, se consigue eliminar fósforo del agua residual a través de la purga de fangos (Metcalf y Eddy, 1995). 1.2.2. Parámetros operacionales y de control En un sistema biológico de fangos activos existen una serie de parámetros físicoquímicos y operacionales que se deben medir y controlar para mantener un funcionamiento óptimo de la planta. Estos parámetros son (Metcalf y Eddy, 1995): 1.2.2.1. Carga orgánica Es la cantidad diaria de DBO5 o DQO que entra al reactor y se calcula a partir de la concentración de DBO5 o DQO y del caudal diario, expresándose en Kg O2/día. 1.2.2.2. Concentración de biomasa La concentración de biomasa se mide en sólidos en suspensión volátiles del licor mezcla, SSVLM, y representa la materia en suspensión de tipo orgánico, expresado en kg/m3 .

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1.2.2.3. Carga másica (F/M) Se considera que es la cantidad de materia o carga orgánica que entra al reactor respecto la concentración de microorganismos presentes en él, y se expresa en unidades de Kg DBO5/Kg SSVLM• día.
F/M = Q • DBO5 V•X

Donde:

Q: caudal del afluente (m3/d) DBO5: DBO5 del afluente (kg/m3) V: volumen del reactor (m3) X: concentración de sólidos en suspensión volátiles en el reactor (kg/m3)

1.2.2.4. Edad del fango o tiempo medio de retención celular Es la masa de microorganismos presentes en el reactor aerobio dividida por la masa diaria de microorganismos purgados del sistema. El resultado se expresa en días.

θx =
Donde:

V⋅X Qw ⋅ X w + (Qe − Qw ) ⋅ X e

V: volumen del reactor (m3) X: concentración de sólidos en el reactor (kg/m3) Qw: caudal de purga (m3/día) Xw: sólidos de la purga (kg/m3) Qe: caudal del efluente (m3/día) Xe: concentración de sólidos en el efluente (kg/m3)

1.2.2.5. Índice volumétrico de fangos (IVF) Es el volumen, expresado en mililitros, que ocupa 1 gramo de sólidos en suspensión del licor mezcla después de 30 minutos de sedimentación en una probeta de 1000 ml.
IVF = V30 • 1000 X

Donde:

V30: volumen de un litro de licor mezcla después de 30 minutos de sedimentación (ml) X: concentración de sólidos en el reactor (mg/l)

1.2.3. Fundamento del proceso El agua residual, proveniente del tratamiento primario, se introduce en el reactor biológico o tanque de aireación, donde se mantiene el cultivo biológico en contacto con el agua residual. El cultivo biológico (o licor mezcla) está formado por un gran número de microorganismos agrupados en flóculos junto con materia orgánica y sustancias

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minerales. Estos microorganismos transforman la materia orgánica mediante reacciones de oxidación biológica. La población de microorganismos debe mantenerse a una determinada concentración (SSVLM) para llegar a un equilibrio entre la carga orgánica a eliminar y la cantidad de microorganismos necesarios para que se elimine esta carga. Esta fase del proceso, que sucede en el reactor biológico, requiere un sistema de aireación y agitación que suministre el oxígeno necesario para llevar a cabo la acción depuradora de los microorganismos aeróbicos, que permita la homogeneización del reactor y por lo tanto, que todo el alimento llegue por igual a todos los microorganismos y que evite la sedimentación de los flóculos y del fango. Una vez la materia orgánica ha sido suficientemente oxidada, cosa que requiere un cierto tiempo de retención del agua en el reactor (Tiempo de Retención Hidráulico o TRH), el licor mezcla pasará al denominado decantador secundario o clarificador. Aquí, el agua se deja reposar y, por lo tanto, los fangos floculados tienden a sedimentar, consiguiendo separar el agua clarificada de los fangos. El agua clarificada constituye el efluente que se vierte al cauce, y parte de los fangos floculados son recirculados de nuevo al reactor biológico para mantener una concentración suficiente de microorganismos. Los fangos excedentes se extraen del sistema y se dirigen al tratamiento de fangos. 1.2.4. Formación del flóculo Además de la importancia que tiene la microfauna en los sistemas de depuración, la calidad del efluente en los sistemas de tratamiento de fangos activos depende de la correcta separación entre el agua tratada y la biomasa, proceso que tiene lugar, como ya se ha comentado, en los decantadores secundarios. Para que se dé esta correcta separación entre la fase líquida y la fase sólida que forma el licor mezcla, hace falta que los microorganismos formen flóculos con un elevado grado de compactación y con una elevada velocidad de decantación, cosa que comporta una disminución de la concentración de sólidos en suspensión en el clarificado. Los flóculos están constituidos por dos tipos de componentes: componentes abióticos, como son las partículas de materia orgánica y inorgánica que provienen del agua residual, así como sustancias poliméricas extracelulares con un importante papel en la 10

biofloculación del fango (Martínez, 2005); y componentes bióticos, donde se incluyen todos los microorganismos que podemos encontrar y que se describen más adelante. La base de los flóculos está constituida por un gran número de bacterias heterótrofas, denominadas formadoras de flóculo, entre las que se incluye el género Zoogloea (Jenkins et. al., 1993). Estas y muchas otras bacterias quimioheterótrofas convierten el sustrato orgánico en sustancias poliméricas extracelulares, denominadas glicocálix (Costerton et. al., 1981). Este glicocálix está compuesto de carbohidratos, sustancias húmicas y proteínas, muy importantes para la floculación (Higgins y Novak, 1997). Como cualquier otro polímero orgánico, incrementa la viscosidad del agua y permite mantener juntas las células individuales o adjuntarlas a las superficies sólidas, formando flóculos más grandes que sedimentan mejor debido a su aumento de peso. La teoría del esqueleto filamentoso (Filamentous backbone theory) en los sistemas de fangos activos (Sezgin et. al., 1978) considera que existen dos tipos de niveles floculares, denominados “microestructura” y “macroestructura”: - La microestructura está formada por las bacterias formadoras de flóculo mediante la adhesión, agregación y biofloculación de estas bacterias. Esta es la base de la formación de los flóculos, puesto que sin este tipo de microorganismos no se podrían formar los grandes agregados que conforman los fangos activos. Cuando los flóculos sólo están formados por bacterias floculantes (sólo presentan microestructura), son generalmente de tamaño pequeño y con una morfología esférica y compacta. En este caso, la sedimentación suele ser deficiente, obteniendo un efluente con una elevada turbidez. - La macroestructura está formada por las bacterias filamentosas. Cuando además de las bacterias formadoras de flóculos también hay presentes bacterias filamentosas, los flóculos presentan la denominada macroestructura, puesto que estos microorganismos filamentosos forman como una red o esqueleto al cual se van adhiriendo las bacterias floculantes. En este caso los flóculos son de mayor tamaño, con formas más irregulares y menos compactas (Jenkins et. al., 1993; Wanner, 1994), obteniendo así una buena sedimentación y por lo tanto, un efluente con baja turbidez. Las bacterias filamentosas pueden ocupar varios espacios dentro del licor mezcla. Dependiendo de su localización tendrán un carácter más o menos problemático.

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Pueden crecer dentro de los flóculos. El resultado es el llamado flóculo ideal, en el cual los microorganismos filamentosos y las bacterias formadoras de flóculos crecen en un cierto equilibrio. Los microorganismos filamentosos se desarrollan dentro de los flóculos en equilibrio con las bacterias floculantes, cosa que confiere al flóculo una estructura compacta, con una elevada cohesión, puesto que actúan como esqueleto alrededor del cual se van agregando el resto de microorganismos.

Pueden extenderse desde el interior de los flóculos o desde la superficie de éstos hasta el medio líquido que los rodea. Esto afecta de manera negativa a la morfología del flóculo por la irregularidad de los márgenes y por su interacción con otros agregados. Un desarrollo excesivo de los microorganismos filamentosos puede llegar a formar los denominados puentes interfloculares (uniones entre diferentes flóculos), dificultando así su sedimentación y provocando el fenómeno denominado bulking o esponjamiento del fango que se describe en el apartado 1.6.5. de este capítulo. Este esponjamiento del fango puede conducir a situaciones donde los fangos del decantador se escapan, comportando un empeoramiento en la calidad del efluente.

También pueden crecer masivamente en el interior de los flóculos, disgregando su estructura. En este caso los flóculos suelen ser de tamaño grande, con márgenes difíciles de distinguir, de formas irregulares y con grandes huecos en el interior, presentando lo que se denomina estructura abierta. Esta estructura también puede conducir a episodios de esponjamiento del fango dado que la densidad de los flóculos abiertos es más similar a la del agua y su capacidad de decantación y compactación disminuye.

La correcta formación de los flóculos determina la calidad de los fangos activos, puesto que está relacionada con la sedimentabilidad, el esponjamiento y el espesamiento del fango, y con la calidad final del efluente. Una completa observación del fango, incluyendo el análisis microscópico para examinar las características típicas del flóculo cómo pueden ser el tamaño, la forma, la estructura, la consistencia, etc., es necesaria para evitar problemas indeseados en la sedimentación.

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1.3. LOS MICROORGANISMOS DE LOS SISTEMAS BIOLÒGICOS DE DEPURACIÓN En estos tipos de sistemas de depuración se puede encontrar una gran variedad de organismos. Las poblaciones de microorganismos de estos sistemas están constituidas principalmente por descomponedores (bacterias y ocasionalmente hongos), que utilizan la materia orgánica disuelta del agua, y los consumidores (flagelados, amebas, ciliados y pequeños metazoos) que se alimentan de bacterias dispersas y otros organismos (Madoni, 1994). La relación entre los diversos componentes biológicos de estas poblaciones constituye una red trófica compleja que va cambiando con el tiempo y en función de las condiciones del sistema. A continuación se describen los diferentes grupos de organismos que se pueden encontrar en estos sistemas. 1.3.1 Bacterias El componente mayoritario en un sistema de depuración biológico son las bacterias (Ríos, 2003), las cuales son el grupo más importante de los microorganismos de los fangos activos debido a que pueden metabolizar una gran cantidad de compuestos orgánicos, y en algunas ocasiones, también algunos nutrientes presentes en el agua residual. Las bacterias presentes en los sistemas de depuración se pueden dividir en tres grandes grupos según su relación con los flóculos y su morfología: a) Bacterias dispersas: son aquellas que se encuentran libres por el licor mezcla, sin agregarse formando flóculos, pudiendo ser consumidas por los protozoos o escaparse con el efluente. Las bacterias floculantes pasan por una etapa inicial donde su capacidad de flocular es nula o muy limitada y se encuentran dispersas por el licor mezcla. Si la abundancia de bacterias dispersas es muy elevada, la turbidez del efluente incrementa. b) Bacterias floculantes: son capaces de segregar polímeros extracelulares, los cuales tienen una consistencia pegajosa que permite que muchos microorganismos se unan y formen flóculos. Los flóculos constituyen una formación estable puesto que decantan y pueden ser recirculados desde el decantador hacia el reactor aerobio, por lo cual no son eliminados con el efluente (Fernández-Galiano et. al., 1996). c) Bacterias filamentosas: son bacterias que, tras su división, las células no se separan y quedan asociadas entre sí formando filamentos.

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Por otra parte, las bacterias también se pueden clasificar según sus propiedades metabólicas y el tipo de sustrato del que son capaces de alimentarse (Wanner, 1994), distinguiéndose los siguientes grupos: a) Bacterias aeróbicas heterótrofas: corresponden a la mayoría de las bacterias presentes en los fangos activos. Son bacterias capaces de metabolizar la materia orgánica biodegradable presente en el agua residual. b) Bacterias nitrificantes: son bacterias autótrofas y aeróbicas estrictas. Los géneros más importantes en fangos activos son Nitrosomonas y Nitrobacter, que son responsables, respectivamente, de la oxidación del amoníaco a nitrito y posteriormente a nitrato (Ríos, 2003). c) Bacterias desnitrificantes: son bacterias anaeróbicas facultativas capaces de utilizar el nitrato como aceptor final de electrones, convirtiendo el nitrato en nitrógeno atmosférico (Henze et. al., 1995). d) Bacterias fermentativas: estas bacterias pueden realizar reacciones que tienen lugar en ausencia de oxígeno y nitrógeno. Sólo son abundantes en fangos activos si se produce un mal funcionamiento del sistema o en la zona anaerobia en sistemas con procesos biológicos de eliminación de fósforo. e) Bacterias acumuladoras de polifosfatos (PAO): incluyen todas aquellas bacterias capaces de acumular grandes cantidades de fosfatos en forma de gránulos de polifosfatos. Este fosfato es utilizado por las bacterias como reserva de energía y, en condiciones anaeróbias, para asimilar el carbono orgánico y almacenarlo en forma de gránulos de poli-hidroxibutirato (gránulos de PHB) (Beccari y Ramadori, 1994). En este estudio no se han diferenciado de las bacterias acumuladoras de glicógeno (GAO) dado que son morfológicamente iguales. Por esta razón en este estudio se habla de bacterias PAO/GAO. f) Bacterias sulfato-reductoras: son bacterias anaerobias estrictas que pueden utilizar los sulfatos como aceptor de electrones, reduciéndolos a sulfuros. g) Bacterias sulfuroxidantes: son capaces de oxidar las formas reducidas de azufre hasta azufre elemental, forma que estas bacterias pueden acumular como reservas intracelulares (gránulos refulgentes, visibles con el microscopio óptico con contraste de fases). Estas reservas pueden ser metabolizadas en condiciones aerobias con carencia de

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sustrato externo. En fangos activos son importantes las bacterias filamentosas Thiothrix y Beggiatoa, entre otros (Wanner, 1994). 1.3.2. Protozoos Los protozoos son organismos unicelulares eucariotas, no tan abundantes como las bacterias, pero con un papel muy importante en la clarificación del agua residual puesto que se alimentan de las bacterias libres presentes en los sistemas de fangos activos. Además, segregan enzimas que estimulan la floculación de las bacterias (Curds, 1963). Dentro de los protozoos que podemos encontrar en los fangos activos diferenciamos tres grandes grupos según su morfología y movilidad: flagelados, amebas y ciliados. Flagelados: los protozoos flagelados poseen uno o más flagelos que utilizan para el desplazamiento y/o la alimentación. Se distinguen dos grupos, los fitoflagelados y los zooflagelados (Levine et. al., 1980). Entre los primeros se encuentran aquellos géneros que presentan plastos y que normalmente no son abundantes en los sistemas de fangos activos debido a que la turbidez del agua no permite el paso de la luz. Los zooflagelados son heterótrofos y son frecuentes en los fangos activos, su abundancia puede variar de pocos centenares de células por mililitro a millones de células por mililitro (Salvadó et al, 1997). Pueden alimentarse de materia orgánica soluble o de bacterias (Wanner, 1997). Los flagelados, en concreto los de pequeño tamaño (< 20 µm), aparecen principalmente en las fases de inicio de la colonización de los fangos activos o bien asociados a un mal funcionamiento del proceso, como por ejemplo una baja concentración de oxígeno disuelto o un exceso de carga orgánica (Madoni, 1991). Son ejemplos comunes de flagelados presentes en sistemas de depuración biológicos los géneros Bodo, Peranema, Entosiphon, etc. Rizópodos o amebas: este tipo de microorganismos se desplazan mediante la emisión de seudópodos (extensiones del propio cuerpo). Se alimentan de materia orgánica particulada, bacterias y otros protozoos mediante fagocitosis. Se distinguen dos grupos según la presencia o ausencia de teca: las gimnamebas o amebas desnudas, con el cuerpo sin forma definida, y las tecamebas, que presentan una estructura de protección denominada teca que recubre la célula. Al igual que los flagelados, las gimnamebas de pequeño tamaño (< 20 µm) suelen asociarse a bruscos incrementos en la carga orgánica del afluente, apareciendo sobre todo en las primeras etapas de colonización de un fango (Sangüesa et al., 2007). Contrariamente, las de tamaño grande (> 50 μm) suelen

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aparecer en sistemas con cargas másicas inferiores y, en general, con un buen rendimiento del proceso. Las tecamebas suelen estar relacionadas con la presencia de procesos de nitrificación (Madoni, 1994). Entre las gimnamebas se pueden destacar los géneros Amoeba, Mayorella y Vahlkampfia y como géneros más comunes de tecamebas se pueden destacar Arcella, Euglypha y Centropyxis (Rius, 2003). Ciliados: se caracterizan por presentar cilios que utilizan por desplazarse y/o alimentarse. Además, presentan dos tipos de núcleos, uno más grande (macronúcleo), que tiene función vegetativa, y uno más pequeño (micronúcleo), con función reproductora. Los principales caracteres que se utilizan para su clasificación son la posición y forma del citostoma y la ciliatura oral, el tipo de ciliación somática, la forma y tamaño del cuerpo y el número, morfología y posición de los núcleos y las vacuolas contráctiles. Los protozoos ciliados son el grupo más estudiado y más utilizado en el control de los procesos de depuración del sistema de fangos activos. Esto se debido a las siguientes características: a) Son organismos muy abundantes en los fangos activos, con concentraciones que oscilan entre los 2.000 y 100.000 individuos por mililitro, y con una gran variedad de especies, habiéndose descrito un total de 160 especies en depuradoras (Curds, 1975). Además, su identificación es mucho más sencilla y rápida de realizar en comparación con la de las bacterias y flagelados. b) Su principal función es la ingestión de bacterias dispersas, contribuyendo a la clarificación del efluente debido a una disminución de la turbidez así como de la DBO5 (Fernández-Galiano, 1994). Además, también eliminan bacterias patógenas y fecales, observándose que en tanques aerobios con presencia de protozoos se puede llegar a una eliminación del 95 % de la bacteria Escherichia coli (Curds y Fey, 1969). c) La estructura de las comunidades de protozoos han sido utilizadas como parámetro de control del proceso, sin necesidad de efectuar largos o costosos análisis. Un fango bien colonizado, estabilizado y con un buen rendimiento de depuración posee una microfauna bien diversificada. En cambio, un fango colonizado únicamente por una sola especie indica un desequilibrio trófico (García, 2003). d) Estimulan el metabolismo bacteriano, ya que al ingerir bacterias se estimula el crecimiento y el metabolismo de otras, lo que comporta un incremento del rendimiento

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del proceso. Además, presentan la capacidad de inducir la floculación de las bacterias presentes debido a la secreción de polisacáridos (Curds, 1963). e) Inducen un proceso de selección en el crecimiento de las bacterias floculantes y filamentosas, puesto que con la formación de flóculos grandes son más difíciles de ingerir que las bacterias libres, lo que facilita la formación de la denominada “macroestructura” (Salvadó, 2007). f) Mediante su actividad depredadora sobre el fango y las bacterias libres contribuyen significativamente a que la cantidad de fango producida sea menor (Salvadó, 2007). Los protozoos ciliados pueden clasificarse, según su alimentación, en especies carnívoras, cuando se alimentan de otros protozoos, o en especies bacteriófagas, cuando se alimentan de bacterias. Otra clasificación a partir de su hábitat o relación con el flóculo los engloba en tres grupos funcionales: nadadores, reptantes y sésiles (Madoni, 1994). Los nadadores corresponden a los ciliados que nadan activamente por el licor mezcla y entre los flóculos; los reptantes también son formas libres pero se encuentran normalmente en las superficies de los flóculos, explotando los recursos alimentarios asociados a ellos, y los sésiles están unidos a los flóculos mediante el propio cuerpo, una cubierta o loriga o un pedúnculo. El análisis de la abundancia y frecuencia de estos grupos da una idea de la estructura de la comunidad y puede servir como índice de estabilidad del sistema. Esto es debido a que, como ya se ha comentado, los flóculos formados en el reactor sedimentan en el decantador secundario y son recirculados al reactor, favoreciendo selectivamente a las especies asociadas a los flóculos respeto las libres, puesto que estas pueden ser eliminadas con el efluente (Madoni, 1991). Por lo tanto, un sistema funcionalmente estabilizado tendrá una abundancia superior de especies reptantes y sésiles frente al resto, debido al hecho de permanecer asociadas a los flóculos. 1.3.3. Metazoos Los metazoos son organismos pluricelulares. Suelen ser más abundantes en sistemas de depuración mediante película fija que en fangos activos. Se alimentan de bacterias dispersas y floculantes, así como de pequeñas partículas orgánicas (Doohan, 1975). En general se considera que su aparición indica una elevada edad del fango (Madoni, 1988). Los grupos más comunes en los sistemas de fangos activos son los rotíferos y los nematodos, y en menor frecuencia los oligoquetos, los gastrotricos y los tardígrados.

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1.4. RELACIONES TRÓFICAS ENTRE LOS MICROORGANISMOS En los procesos de depuración intervienen una gran cantidad de relaciones interespecíficas entre los diferentes microorganismos (Figura 1.1.), estableciéndose entre ellos relaciones de competencia y/o dependencia, de tal forma que tanto la materia orgánica como el flujo de energía se transforman y fluyen por el sistema. El desarrollo de as bacterias heterótrofas, descomponedores de la materia orgánica, está limitado tanto por la cantidad como por la calidad de los nutrientes presentes en el licor mezcla. Los aumentos de la población de protozoos depredadores depende de la cantidad de bacterias de los que se alimentan, mientras que estos son depredados por otros organismos de tamaño más grande (Madoni, 1986).

Figura 1.1. Esquema de las relaciones tróficas entre los grupos de microorganismos que forman la comunidad biótica del proceso de fangos activos (Salvadó, 2006b).

1.5. SUCCESIÓN TEMPORAL Las relaciones tróficas son dinámicas y cambiantes en el tiempo debido a la depredación y la competición que tienen lugar entre los diferentes microorganismos que coexisten en el licor mezcla así como por las características del agua residual que alimenta al

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sistema, las cuales acaban llevando a una situación de estabilidad dinámica dentro del reactor aerobio (Madoni, 1994). La modificación de alguna variable que altere las interrelaciones puede alterar gravemente el correcto funcionamiento del sistema. En las primeras etapas de puesta en marcha de una planta o en edades del fango bajas hay muchos nutrientes disponibles respecto la cantidad de microorganismos presentes, siendo la carga másica muy elevada (superior a 1 Kg DBO5/kg SSVLM). En estos ambientes los primeros microorganismos que aparecen son las bacterias libres, que tienen una tasa de división muy elevada. Estas van retirando materia orgánica del sistema permitiendo que otros microorganismos colonicen el medio. A medida que va incrementando la edad del fango, van apareciendo diferentes tipos de protozoos: primero los flagelados de pequeño tamaño y pequeños ciliados libre-nadadores, después otros ciliados nadadores así como reptantes y, posteriormente, ciliados sésiles y metazoos. Las bacterias dispersas van desapareciendo, siendo sustituidas por bacterias floculantes y filamentosas, y los flóculos van compactándose y aumentando de tamaño. Esta evolución temporal en la sucesión nos indica una mejora de la calidad del proceso de depuración y, en consecuencia, del agua de salida de la planta. Si esta sucesión sucediera a la inversa, indicaría que las condiciones del sistema están empeorando y, por lo tanto, la calidad del efluente también disminuiría. 1.6. UTILITZACIÓN DE LA MICROFAUNA COMO BIOINDICADOR DEL PROCESO La bioindicación se puede definir como un método de trabajo en el cual, a través de la observación microscópica de un fango activo, podemos saber como está funcionando el proceso y como modificar los parámetros operacionales para obtener un rendimiento óptimo. Los microorganismos que se utilizan en la bioindicación son, principalmente, los protozoos y los metazoos. La abundancia y diversidad de sus comunidades son fundamentales para evaluar el grado de funcionamiento de los sistemas y la calidad del efluente. Las comunidades, pero, van cambiando a medida que varían las diferentes variables de funcionamiento de los reactores aerobios, por lo tanto, no se pueden hacer generalizaciones. Así y todo, existen grupos de microorganismos que toleran rangos muy estrechos de ciertas condiciones ambientales, y su presencia en un sistema indicará condiciones determinadas del medio.

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Así, los microorganismos pueden ser indicadores de varios parámetros operacionales del proceso como son: la calidad del efluente, la carga másica, la edad del fango, la concentración de oxígeno disuelto en el tanque aerobio y la presencia de toxicidad. Si se conocen estas características de vida se pueden preveer situaciones que a veces no son detectables mediante técnicas analíticas convencionales y esto da capacidad de actuar antes de que aparezcan graves problemas en el proceso. La bioindicación tiene, además, la ventaja de ser un método de realización rápida. 1.7. PROBLEMAS DE SEPARACIÓN LÍQUIDO/SÓLIDO EN EL

TRATAMIENTO DE FANGOS ACTIVOS En las estaciones depuradoras de tratamiento por fangos activos se desarrollan muchos problemas que pueden afectar gravemente a la calidad del efluente. La mayor y más común de las consecuencias es la pérdida de sólidos con el efluente debido a una separación insuficiente entre el agua tratada y la biomasa o fango durante la decantación secundaria. Esta pérdida de sólidos puede provocar problemas en el sistema receptor del efluente por contaminación bacteriana así como por contaminación por materia orgánica con una DBO y DQO muy elevada, produciendo problemas de deficiencia de oxígeno (eutrofización del medio receptor). Estos problemas pueden ser originados por varios factores, aunque en este estudio nos centraremos en los problemas de tipo microbiológico que aparecen en los procesos de depuración por fangos activos. Entre estos podemos encontrar la formación del denominado pin-point floc, el bulking viscoso, la ascensión de los fangos en el decantador secundario, el esponjamiento del fango (bulking filamentoso) y la producción de espumas de origen biológico (foaming). También se pueden producir más de uno de estos procesos a la vez. 1.7.1. Pin-point floc o pin-floc El pin-point floc (o “flóculo en punta de aguja”) se puede definir como un problema originado cuando, en la formación de los flóculos, sólo hay presentes las bacterias floculantes y no aparecen o en muy poca cantidad los microorganismos filamentosos. Estos flóculos sólo presentan microestructura y son de pequeño tamaño y consistencia débil (Figura 1.2) y, por lo tanto, son fácilmente desgarrados y rotos por la turbulencia propia del tanque de aireación. Generalmente los flóculos más grandes y compactos sedimentan más rápidamente, pero los más pequeños se quedan en suspensión, hecho 20

que normalmente se traduce en un clarificado turbio durante la separación líquido/sólido en decantación secundaria.

Jessica Vasco Figura 1.2. Microfotografía en contraste de fases que muestra la apariencia de los flóculos en una situación de pin-point floc. (100x aumentos).

Los factores que pueden interrumpir la formación de los flóculos y producir pin-point

floc son: una edad del fango muy baja o una excesiva edad del fango, turbulencias
excesivas en el reactor aerobio, presencia de tóxicos o surfactantes y deficiencia de oxígeno (Martínez, 2006). 1.7.2. Bulking viscoso Este problema, también conocido como bulking no filamentoso, se produce por una producción excesiva de polímeros extracelulares, normalmente asociada al crecimiento de las bacterias floculantes como Zoogloea o bacterias PAO/GAO (Figura 1.3). Esta producción excesiva de exopolímeros puede dar una consistencia gelatinosa al fango activo, provocando una reducción de la velocidad de sedimentación y de la compactación del fango (Jenkins et. al., 1993), así como disminuir su rendimiento de deshidratación. Frecuentemente también se producen espumas producidas por los exopolímers que generan el bulking viscoso. La excesiva presencia de los polímeros extracelulares se puede poner de manifiesto microscópicamente con tinta china (Jenkins et. al., 1993). Se deposita una gota de tinta china junto al cubreobjetos con la muestra y se deja que penetre por el cubreobjetos. Si hay una excesiva cantidad de exopolímeros la tinta no penetrará dentro de los flóculos. Los principales factores que producen bulking viscoso son la deficiencia de nutrientes, la deficiencia de oxígeno y cargas másicas elevadas (Richard, 2003). 21

a)

Jessica Vasco

b)

Jessica Vasco

Figura 1.3. Microfotografías en contraste de fases de las bacterias que pueden producir bulking viscoso: a) bacterias PAO/GAO; b) bacteria Zoogloea. (1000x aumentos).

1.7.3. Ascensión de los fangos Este fenómeno se produce por la presencia de procesos de desnitrificación en el decantador secundario, cosa que indica que primero han tenido lugar procesos de nitrificación en el reactor aerobio. Durante la desnitrificación, los nitratos y nitritos se convierten en nitrógeno gas. El nitrógeno gas se adhiere a la superficie de los flóculos y estos son arrastrados a la superficie, haciendo que floten por la superficie del decantador secundario, produciéndose la pérdida de sólidos con el efluente. No se debe confundir la ascensión del fango con el bulking ni con las espumas; en el caso del bulking, los fangos sedimentan, pero el manto de fango se encuentra más o menos cerca de la superficie, y en el caso de las espumas, estas suelen aparecer primero en el reactor aerobio y posteriormente pasar al decantador secundario. A la hora de determinar las principales causas de ascensión de fangos hace falta diferenciar entre las EDARs que están diseñadas para nitrificar y desnitrificar (eliminación de nitrógeno), de las EDARs que no lo están. En las depuradoras que normalmente eliminan nitrógeno, la subida de fangos está producida por una incompleta desnitrificación en el tanque anóxico debido a un periodo de anóxia insuficiente, a carencia de materia orgánica, etc. En cambio, en las depuradoras que no están diseñadas para eliminar nitrógeno, si se producen procesos de nitrificación pero la desnitrificación es incompleta en el reactor aerobio, el fango acaba de desnitrificar en el decantador secundario, produciéndose el problema de la ascensión de fangos a la superficie. Los principales factores que pueden

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provocar la desnitrificación en los decantadores secundarios son un edad del fango elevada, elevadas temperaturas y la presencia de materia orgánica (Martínez, 2006). 1.7.4. Bulking filamentoso El bulking filamentoso, también denominado esponjamiento del fango, es, probablemente, el problema más frecuente en las EDARs de todo el mundo. Se produce por una proliferación masiva de microorganismos filamentosos, cosa que dificulta la sedimentación del fango en el decantador secundario. Los microorganismos filamentosos pueden crecer en el interior de los flóculos y producir una estructura flocular difusa o abierta, o bien pueden extenderse desde los márgenes de los flóculos, uniéndolos entre sí, dando lugar a puentes interfloculares (Figura 1.4). Estos dos tipos de crecimiento pueden llegar a generar bulking filamentoso. El tipo de interferencia en la compactación de los flóculos depende del tipo de microorganismo filamentoso. Así, microorganismos filamentosos como Microthrix

parvicella, Nostocoida limicola I y II, el Tipo 0092 o el Tipo 0675 producen,
normalmente, estructuras difusas, mientras que Nostocoida limicola III, Sphaerotilus

natans, Thiothrix I y II o el Tipo 021N originan puentes interfloculares (Jenkins et. al.,
2003). Para determinar episodios de esponjamiento del fango generalmente se utiliza como referencia el índice volumétrico del fango (IVF). Así, la probabilidad de producirse problemas por bulking filamentoso es importante cuando el IVF toma valores superiores a los 150-200 ml/g. Microscópicamente, se habla de susceptibilidad de producirse un episodio de bulking filamentoso cuando la concentración total de microorganismos filamentosos supera los 200 m/ml (Salvadó, 1990).

a

Jessica Vasco

b

Jessica Vasco

Figura 1.4. Microfotografias en contraste de fases de los efectos de los microorganismos filamentosos en la morfologia de los flóculos: (a) puentes interfloculares (100x); (b) estructura flocular difusa. (400x).

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Las principales causas que provocan bulking filamentoso son aquellas que producen un crecimiento masivo de los microorganismos filamentosos, y en general son: concentraciones bajas de oxígeno disuelto, cargas másicas bajas, septicidad (concentración de sulfuros), deficiencia de nutrientes, pH bajos y presencia de grasas y/o aceites (Jenkins et. al., 2003). No todos los microorganismos proliferan con las mismas condiciones, por eso es importante una correcta identificación microscópica de los microorganismos filamentosos. En la tabla 1.1. se muestran las principales posibles causas y los microorganismos filamentosos relacionados con estas causas.

Tabla 1.1. Resumen de las condiciones asociadas con el crecimiento de los microorganismos filamentosos en los sistemas de fangos activos (adaptado a partir de Jenkins et al., 2003).

Causas Concentración de oxígeno disuelto baja Septicidad Deficiencia de nutrientes Carga másica baja Aceites y/o grasas pH bajo

Microorganismos filamentosos

S. natans, H. hydrossis, Tipo 1701 Thiothrix Y y II, Beggiatoa sp., Tipo 021N y Tipo 0914 Thiothrix Y y II, S. natans, Tipo 021N, Tipo 0041, Tipo 0675, N. limicola III y H. hydrossis M. parvicella, actinomicetos nocardioformes, H. hydrossis, Tipo 021N, Tipo 0041, Tipo 0675, Tipo 0092, Tipo 0581, Tipo 0961, Tipo 0803 y Tipo 1851 Actinomicetos nocardioformes, M. parvicella y Tipo 1863 Hongos

1.7.5. Foaming El foaming o espumas es otro problema relacionado con la abundancia elevada de algunos microorganismos filamentosos específicos que provoca la aparición de flotantes, también denominados natas, en la superficie tanto del reactor aerobio como del decantador secundario. También existen otros tipos de espumas como las originadas por surfactantes biodegradables y no biodegradables, que suelen aparecer en puestas en marcha de procesos (EMASESA, 1997). Los microorganismos filamentosos o grupos de microorganismos filamentosos que pueden provocar espumas son principalmente tres: los actinomicetos nocardioformes y

Microthrix parvicella (los dos más comunes) y el Tipo 1863 (pocas veces). Además de
estos tres, hay otros microorganismos filamentosos que también se han encontrado en la observación de espumas, lo que podría indicar que también provocan espumas. Estos 24

otros microorganismos son: el Tipo 0041, el Tipo 0675, el Tipo 0092 y Nostocoida

limicola II (Eikelboom, 1991).
La principal característica que provoca la formación de espumas es la naturaleza hidrofóbica de las paredes celulares, que en contacto con las burbujas de aire presentes en el reactor aerobio hacen que los flóculos floten (Jenkins et. al., 2003). Además, estos microorganismos también producen materiales extracelulares hidrofóbicos (lípidos, lipoproteínas, proteínas y carbohidratos con propiedades de biosurfactantes...) que incrementan la capacidad de flotar de las células y, en consecuencia, de formar espumas (Wanner, 1994). Las espumas producidas por el Tipo 1863 son de color gris a blanco y generalmente de poca consistencia; en cambio, las espumas producidas por los actinomicetos nocardioformes y por Microthrix parvicella son de color marrón a marrón oscuro y mucho más persistentes. Se considera que concentraciones de actinomicetos nocardioformes superiores a los 50 m/ml son susceptibles de producir espumas (Salvadó, 1990). Las causas que provocan espumas dependen del tipo de microorganismo filamentoso que las está originando. El crecimiento de los actinomicetos nocardioformes está asociado a cargas másicas bajas, edades del fango elevadas, presencia de grasas, aceites y/o hidrocarburos, así como elevadas temperaturas. Las condiciones que favorecen el crecimiento de Microthrix parvicella son cargas másicas bajas, edades del fango elevadas, procesos de nitrificación y/o desnitrificación incompletos (presencia de nitratos y/o nitritos), presencia de aceites y/o grasas en el sistema y bajas temperaturas. El Tipo 1863 no es muy común en los sistemas de fangos activos y suele aparecer en las primeras etapas de estabilización de un fango; las posibles condiciones que favorecen su crecimiento son elevadas cargas másicas, concentraciones de oxígeno disuelto bajas (Martínez, 2006) y episodios de cloración periódicos.

2. OBJECTIVOS
El principal objetivo de este proyecto ha sido el de estudiar el proceso de depuración de una serie de depuradoras biológicas de fangos activos, con tratamiento convencional y tratamiento de eliminación de nutrientes (nitrógeno y fósforo), y caracterizar las comunidad de microorganismos presentes en estos sistemas.

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Ampliar los conocimientos sobre el proceso de depuración por fangos activos y las comunidades de microorganismos tiene como objetivo mejorar la gestión de los procesos de depuración para reducir el impacto ambiental provocado por los vertidos de las aguas depuradas al medio receptor. Como objetivos más concretos nos hemos propuesto: 1.- Analizar el proceso de depuración de las depuradoras estudiadas a través de los parámetros físico-químicos, tanto del afluente como del efluente, y operacionales del proceso. 2.- Estudiar las diferencias existentes, en cuanto a la eficiencia del tratamiento, entre los sistemas de tratamiento convencionales y lo de eliminación de nutrientes. 3.- Caracterizar la estructura flocular del fango. 4.- Determinar las comunidades de los microorganismos que se desarrollan en los sistemas de depuración mediante fangos activos convencionales y con eliminación de nutrientes. 5.- Estudiar las relaciones que se establecen entre las especies o grupos de microorganismos y los parámetros físico-químicos y operacionales del proceso de depuración. 6.- Analizar los efectos de los microorganismos filamentosos sobre los fangos activos y estudiar los principales problemas de separación líquido-sólido que producen.

3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. DESCRIPCIÓN DE LAS ESTACIONES DEPURADORAS DE AGUAS RESIDUALES Para realizar este estudio se han identificado las poblaciones de microorganismos y las estructuras floculares en dos grupos diferenciados de muestras: 106 muestras correspondientes a 20 EDARs urbanas (EDARU) de la comarca de Lérida, comprendidas en el periodo de 2005 a 2007. De estas 20 depuradoras, la mitad corresponden a depuradoras con tratamiento convencional, representando un total de 55 muestras, y la otra mitad a depuradoras con tratamiento de eliminación de nutrientes, constituyendo 51 muestras.

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La periodicidad de muestreo y el número de muestras analizadas es diferente para cada EDAR, según los requerimientos de cada estación depuradora. Esto provoca que se hayan acumulado muchos datos de algunas depuradoras y pocas de otras. Las muestras han sido analizadas en el laboratorio de la empresa Hydrolab Microbiologica. Los datos físico-químicos y operacionales utilizados en este estudio han sido proporcionados por la empresa que se encarga de la gestión de las depuradoras estudiadas. 3.2. RECOGIDA DE LAS MUESTRAS La observación microscópica se llevó a cabo a partir de las muestras de licor mezcla correspondientes al reactor aerobio de las diferentes estaciones depuradoras estudiadas. Las muestras para el análisis biológico se recogieron en frascos de plástico de aproximadamente 500 ml. Los recipientes se llenaron con unos 250 ml de fango activo (licor mezcla), dejando una cámara de aire para que el fango no se quedara sin oxígeno. El traslado hasta el laboratorio se realizó en un periodo de como máximo 24 horas tras la recogida de la muestras para evitar su alteración. 3.3. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA La observación microscópica es uno de los análisis más importantes que se deben realizar en una estación depuradora de fangos activos. Esta observación permite deducir si el sistema está bien equilibrado o si existe algún tipo de disfunción (Salvadó, 1999). El análisis microscópico se realizó en el laboratorio de la empresa Hydrolab Microbiologica y consistió básicamente en la observación de la estructura y morfología del fango y en la identificación y cuantificación de los diferentes tipos de microorganismos presentes en las muestras (microorganismos filamentosos, protozoos flagelados, protozoos rizópodos, protozoos ciliados y metazoos). Todas las observaciones se realizaron mediante la observación en vivo con un microscopio triocular NIKON, modelo Eclipse 50i, utilizando tanto la iluminación de campo claro como el contraste de fases, dotado con los objetivos de 100x, 400x y 1000x. Las microfotografías obtenidas, tanto de las muestras en vivo como de las muestras en tinción, se realizaron a partir de una cámara fotográfica NIKON Coolpix 4500 incorporada al microscopio.

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3.4. DETERMINACIÓN DEL ESTADO MORFOLÓGICO Y ESTRUCTURAL DEL FANGO La evaluación de las características morfológicas y estructurales de los flóculos del fango activo (tamaño, estructura, cobertura, etc.) proporciona información sobre las propiedades de decantación y compactación del fango activo durante la fase de clarificación del licor mezcla. También se determinaron otras observaciones que permiten hacer una valoración global más completa del estado del fango. 3.4.1 Tamaño El tamaño de los flóculos se refiere al diámetro máximo de los mismos y se midió con un ocular de microscopio con micrómetro incorporado. Se midieron entre 10 y 20 flóculos y se escogió el rango mayoritario o con más predominio. Según Jenkins et. al. (1993) y EMASESA (1997) se distinguen entre: Flóculos pequeños: flóculos menores de 150 μm. Flóculos medianos: flóculos entre 150 y 500 μm. Flóculos grandes: flóculos mayores de 500 μm.

3.4.2. Estructura También se observó el grado de compactación del flóculo. Se determinó observando también entre 10 y 20 flóculos (EMASESA, 1997), distinguiendo entre: Flóculos compactos: no existen casi huecos en la estructura interna del flóculo. Flóculos moderadamente abiertos: se observan algunos huecos, no excesivamente grandes, en el interior de los flóculos. Flóculos abiertos: los flóculos tienen muchos huecos en el interior, rompiéndose la estructura interna. Generalmente esta situación vendrá asociada con una abundancia muy elevada de microorganismos filamentosos (disgregación). 3.4.3. Grado de cobertura (concentración) Con el objetivo de 10x se observaron varios campos visuales representativos de la muestra y se calculó el grado de cobertura que representaban los flóculos respecto del campo visual:

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-

Baja: los flóculos cubren menos del 10 % de la superficie del campo visual. Mediana: los flóculos cubren entre el 10 y el 50 % de la superficie del campo visual. Elevada: los flóculos cubren entre el 50 y el 90 % de la superficie del campo visual. Muy elevada: los flóculos cubren más del 90 % de la superficie del campo visual.

3.4.4. Otras observaciones Las observaciones que se realizaron fueron: Abundancia de bacterias dispersas mediante rangos de abundancia de 1 a 3, siendo 1 poco abundantes y 3 muy abundantes. Abundancia de bacterias helicoidales (espiroquetas y espirilos) mediante rangos de abundancia de 0 a 3, siendo 0 ausencia y 3 muy abundantes. Abundancia de nódulos de bacterias GAO/PAO mediante rangos de abundancia de 0 a 2, siendo 0 ausencia y 2 abundantes. Presencia/Ausencia de nódulos de Zoogloea sp, mediante rangos de abundancia de 0 a 1, siendo 0 ausencia y 1 presencia. 3.5. DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS BIOLÓGICOS 3.5.1. Identificación de los microorganismos La identificación de los diferentes microorganismos presentes en las muestras de licor mezcla se realizó a partir de observaciones en vivo mediante microscopía óptica de campo claro y de contraste de fases, así como mediante tinciones específicas en los casos que eren necesarias. Para la identificación de los microorganismos muy activos, se extrajo agua de entre el cubreobjetos y el portaobjetos mediante un papel de filtro sin llegar a secar totalmente la muestra o se esperó a que se evaporara algo de agua para retardar el movimiento de los microorganismos y conseguir así, una mejor observación de sus características taxonómicas. 3.5.1.1. Técnicas de tinción Se utilizaron diferentes técnicas de tinciones para la identificación de los microorganismos presentes en los fangos activos, tanto de los protozoos ciliados como

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de los microorganismos filamentosos (los protocolos de todas las tinciones citadas se encuentran en el anejo). Para facilitar la identificación de los protozoos ciliados se realizó la coloración vital con verde de metil acético, que tiñe el material genético y permite la observación de los núcleos con más claridad. a) Coloraciones vitales Se pueden utilizar diferentes colorantes, entre los cuales se ha utilizado el verde de metil-acético, que permite visualizar los núcleos de un color verde esmeralda. La muestra teñida se observa al microscopio con campo claro y a 400x aumentos. En el caso de los microorganismos filamentosos se realizaron las tinciones diferenciales de Gram y Neisser, la tinción de gránulos de PHB, la tinción de vainas y la tinción de gránulos de azufre según Jenkins et. al. (1993). La observación de las muestras teñidas se realiza a campo claro y a 1000x aumentos. b) Tinción de Gram Se trata de una técnica de tinción diferencial que permite distinguir entre bacterias Gram positivas y Gram negativas, en función del grado de permeabilidad de las paredes celulares al disolvente aplicado durante la tinción. Los filamentos Gram positivos se observarán de color azul y los Gram negativos de color rojo-rosa. c) Tinción Neisser Esta tinción pone de manifiesto la presencia de gránulos de reserva de polifosfato en el interior celular, observados con un color azul-lila. Esto es debido a que el azul de metileno es catiónico y se une a las zonas aniónicas de las cadenas de polímeros de polifosfato. Los filamentos Neisser positivos se observarán de color azul-lila y los Neisser negativos de color marrón o amarillento. Si el tricoma es marrón y presenta gránulos de color lila, el filamento será Neisser negativo con presencia de gránulos Neisser positivos. d) Tinción de poli-β-hidroxibutirato (PHB) Esta tinción permite observar los gránulos intracelulares de tipo lipídico como el PHB que algunos organismos pueden presentar bajo ciertas condiciones ambientales como

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por ejemplo en presencia de deficiencia de nutrientes. Los gránulos de PHB se observan de color negro-azul y el citoplasma celular de color rosa claro o sin teñir. e) Tinción de vainas Esta tinción pone de manifiesto la presencia de vaina mediante la utilización del colorante, que sólo penetrará en las células que no presenten vaina, puesto que la presencia de ésta actúa como una barrera frente el colorante, impidiendo la tinción del filamento. Las células sin vaina se tiñen intensamente de color violeta, mientras que las vainas aparecen de color rosa claro. f) Test de azufre Este test pone de manifiesto la posibilidad de generar gránulos de azufre por parte de algunos microorganismos filamentosos. Si el resultado es positivo se observan gránulos de azufre, es decir, gránulos intracelulares muy brillantes que hacen iridiscencias amarillas-rosadas-azulosas. En algunos microorganismos filamentosos, dependiendo de las condiciones ambientales donde se encuentran, los gránulos de azufre pueden ser visualizados directamente in situ, sin necesidad de someterlos al test. 3.5.2. Determinación de los microorganismos Protozoos y metazoos La determinación de los protozoos flagelados, gimnamebas y tecamebas se realizó en vivo, y se determinaron según Patterson y Hedley (1992). La determinación se estableció a nivel de orden, familia o género según el caso, debido a la dificultad existente para la determinación a nivel genérico o específico de algunos taxones. La identificación de protozoos ciliados se realizó a partir de observaciones en vivo y sobre muestras teñidas, utilizando las técnicas de tinción citadas anteriormente. Para su clasificación se utilizaron los trabajos de Curds (1969), Férnandez-Galiano et al, (1996) y Foissner et. al. (1996). Estos microorganismos se determinaron a nivel de especie o género. La identificación de rotíferos, nematodos, oligoquetos y tardígrados se realizó en vivo, y su determinación se realizó según Streble y Krauter (1978). Estos organismos se identificaron únicamente a nivel de filum.

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Microorganismos filamentosos La determinación de los microorganismos filamentosos se realizó preferentemente a 1000x aumentos mediante observaciones en vivo con microscopía de contraste de fases y con la utilización de un objetivo de inmersión. En algunas ocasiones, cuando no se podía identificar el filamento con este estudio, se utilizaron las tinciones mencionadas anteriormente (Gram, Neisser, PHB, tinción de vaina y test de azufre), la observación de las cuales se realizó mediante microscopía de campo claro a 1000x aumentos. La determinación se realizó atendiendo a una serie de características morfológicas y estructurales según Jenkins et. al. (1993). Algunos microorganismos filamentosos se encuentran caracterizados a nivel taxonómico, recibiendo su denominación de género y especie, otros sólo están determinados como integrantes de un género e incluso la mayoría reciben una identificación alfanumérica atendiendo a caracteres morfológicos. 3.5.3. Cuantificación de los microorganismos El recuento de los diferentes tipos de microorganismos se ha realizado mediante la observación en vivo, con un microscopio NIKON, modelo Eclipse 50i, utilizando la iluminación de contraste de fases. Para realizar el recuento se agita suavemente la muestra para homogeneizarla totalmente pero sin llegar a afectar a la estructura flocular. Los recuentos se realizan a partir de 1 a 4 submuestras de 25 µl dosificadas con una micropipeta. A continuación se deposita la gota sobre un portaobjetos y se tapa con un cubreobjetos de 20 x 20 mm de superficie. Las abundancias de organismos del licor mezcla se dan en individuos por mililitro (ind/ml), a excepción de los recuentos de los microorganismos filamentosos, que se dan en metros por mililitro (m/ml). 3.5.3.1. Protozoos, gimnamebas medianas y grandes y metazoos El recuento de metazoos y protozoos mayores de 20 µm, donde se incluyen los flagelados grandes, las gimnamebas medianas (entre 20 y 50 µm) y grandes (mayores de 50 µm) y los ciliados, se realiza a partir de la observación en vivo a 100x aumentos y en contraste de fases mediante el método de las submuestras (Madoni, 1984). En principio se analizan dos gotas, pero si el número total de individuos por gota es inferior a 50 se amplía el número de gotas hasta un total de cuatro.

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Se coloca un extremo del cubreobjetos en el campo visual del microscopio (Figura 3.1) y, observando también el líquido que puede haber quedado por fuera del cubreobjetos, se va desplazando la muestra, por ejemplo verticalmente, hasta llegar al extremo opuesto. Una vez en este extremo se desplaza la muestra hacia la derecha, hasta que aparece un nuevo campo visual que no se solapa con el anterior, y a continuación se desplaza de nuevo la muestra en dirección vertical. Se cuentan todos los protozoos flagelados mayores de 20 µm y ciliados, gimnamebas medianas y grandes y metazoos que se van encontrando con el rastreo al nivel taxonómico más específico posible.
inicio

final
Figura 3.1. Esquema del procedimiento para el recuento al microscopio de la microfauna. Los círculos indican el campo visual del microscopio.

3.5.3.2. Protozoos flagelados y gimnamebas de pequeño tamaño El recuento de protozoos flagelados y gimnamebas de pequeño tamaño (menores de 20 µm) se realizó a 400x aumentos, en contraste de fases y sobre dos réplicas de 25 µl, según el método de Salvadó (1990a). Este recuento se realiza contabilizando los protozoos y gimnamebas de pequeño tamaño observados en un total de 15 campos visuales distribuidos al azar por todo el cubreobjetos. Se observan dos gotas de muestra como mínimo. A partir de los individuos contabilizados se realiza una estimación de los individuos por mililitro según la siguiente ecuación:

Individuos / ml = Donde:

Ni × A π × r 2 × Vm

Ni = número de individuos contabilizados dividido por el número de campos observados A = área ocupada por la muestra (dimensiones del cubreobjetos), en m2. Vm = volumen de la muestra en ml

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π = 3,1416 R = radio del campo visual 3.5.3.3. Recuento de microorganismos filamentosos Para realizar el recuento de los microorganismos filamentosos se utilizó el método de Salvadó (1990b). Esta técnica se basa en encontrar la relación existente entre la circunferencia que conforma el ocular del microscopio y el número medio de intersecciones que se obtienen al cruzar los microorganismos filamentosos con esta circunferencia. El procedimiento consiste en contabilizar el número de intersecciones existentes entre los filamentos y la circunferencia que traza el campo visual. Se realiza a 400x aumentos y en contraste de fases, observando 15 campos visuales distribuidos al azar por todo el cubreobjetos, observando como mínimo dos gotas. Para obtener el resultado en unidades de m/ml es necesario aplicar la ecuación:

Longitud de filamentos / volumen = Donde:

Ni × A H × Vm

Ni = número de intersecciones / número de campos observados A = área ocupada por la muestra (dimensiones del cubreobjetos), (m2). H = longitud del segmento dibujado por el ocular multiplicado seno medio de @ = (L)x(2/π), (m). seno @ = media del seno de 0º a 360º = 0,63662 =2/π @ = ángulo entre L (longitud del segmento dibujado por el ocular) y los filamentos. Vm = volumen de la muestra (ml).
3.5.4. Determinación del índice de diversidad

Una vez determinadas las especies y las abundancias relativas de los protozoos ciliados presentes en las muestras se calculó el índice de diversidad de Shannon-Weaver (Shannon y Weaver, 1949). Este valor indica la relación entre el número de individuos de una especie respecto el número total de individuos de la muestra y se expresa en bits por individuo.

H'=∑
i =1

n

Ni N × log 2 i N N

34

Donde:

Ni = número de individuos de una especie N = número total de individuos

3.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS

A continuación se describen las técnicas estadísticas que se utilizaron para realizar el tratamiento de los datos. Para todos los cálculos estadísticos se utilizó el programa SPSS 13.0 (Statistical Package for Social Sciences). El test de Kolmogorov-Smirnov se utiliza para comprobar si los datos utilizados siguen una distribución normal. La hipótesis nula de normalidad se rechazó considerando un nivel de significación α=0,05. En los casos en que los datos no sigan esta distribución normal, se utiliza el test no paramétrico de Kruskal-Wallis para comparar una variable en dos o más muestras independientes. En nuestro caso se utilizó para comprobar si existían diferencias significativas en los parámetros físico-químicos del efluente y en los microorganismos según los dos tipos de tratamiento estudiados, convencional y de eliminación de nutrientes. La hipótesis nula de homogeneidad se ha rechazado cuando el nivel de significación p<0,05. Por último, se han realizado correlacionas bivariadas, con los datos físico-químicos y los microorganismos, mediante el coeficiente de correlación de Spearman, que se utiliza en aquellos casos en que los datos no sigan una distribución normal. Estas correlaciones miden como están relacionadas linealmente dos variables, y los valores que pueden adoptar estos coeficientes están comprendidos entre +1 y -1.

4. RESULTADOS Y DISCUSSIÓN
4.1. EL AFLUENTE

Las poblaciones de microorganismos muestran variaciones en función de los cambios en los diferentes parámetros físico-químicos y operacionales de las EDARs. Por lo tanto, para poder estudiar los efectos sobre la microfauna se ha caracterizado el agua residual de entrada y las relaciones existentes entre los diversos parámetros. Posteriormente, se han estudiado las posibles relaciones entre estos parámetros físico-químicos y la microfauna de los fangos activos.

35

4.1.1. Caracterización del afluente

En primer lugar se han calculado las medianas, desviaciones estándar y los valores máximos y mínimos de los afluentes. No se han diferenciado según el tipo de tratamiento, convencional o de eliminación de nutrientes, puesto que prácticamente no había diferencias entre los parámetros (Tabla 4.1.).
Tabla 4.1. Resultados de los parámetros físico-químicos del afluente de las plantas estudiadas, donde X: media, Des. std: desviación estándar y n: número de muestras.

Conductividad (mS/cm) pH SSLM (mg/l) STLM (mg/l) SVLM (mg/l) Aceites y grasas (mg/l) Detergentes (mg/l) DBO5 soluble (mg O2/l) DBO5 (mg O2/l) DQO soluble (mg O2/l) DQO (mg O2/l) Mat. Volátiles (%) MES (mg/l) Cloruros (mg/l) Fósforo total (mg/l) N (NO2-+NO3-) (mg/l) N Kjeldahl (mg/l) N amoniacal (mg/l) N total (mg/l) Sulfatos (mg/l)

X 0,96 7,29 1941,68 2533,05 76,12 14,08 1,31 58,46 192,32 104,83 376,13 93,03 223,15 108,74 7,34 0,13 35,78 21,96 35,26 175,72

Des. std 0,50 0,32 897,16 825,76 7,53 10,78 1,03 51,44 158,49 80,97 396,37 10,71 328,05 76,34 12,23 0,25 31,46 12,02 31,73 158,63

n 86 86 19 19 19 40 21 47 89 47 89 47 89 19 89 86 89 61 86 19

Máximo 3,54 8,05 3952 4212 84,8 46 3,55 263 943 365 3162 99,9 2819 380 104 1,84 264 52,4 264 727

Mínimo 0,2 6,4 756 1184 53,8 5 0,05 14 14,7 15 38 38,3 11 49 1,17 0,005 5,9 5,16 6 71,7

Si se comparan estos valores con la composición típica del agua residual urbana expuesta en Metcalf y Eddy (1995), se puede considerar que en general el agua residual de las depuradoras estudiadas presenta una concentración media para la gran mayoría de los valores, aunque en la mayoría de parámetros se puede observar una desviación estándar muy grande, lo cual indica la gran variación de composición que presentan las aguas residuales de entrada a las plantas depuradoras estudiadas.
4.1.2. Relaciones entre los parámetros físico-químicos

Primero se comprobó, mediante el test de Kolmogorov-Smirnov, que los datos de los parámetros físico-químicos no seguían una distribución normal. Se obtuvo que los únicos parámetros que seguían una distribución normal eran el pH y el amonio. Por lo tanto, como la mayoría de parámetros no seguían una distribución normal, se determinaron las 36

relaciones entre los diferentes parámetros físico-químicos del agua de entrada a partir de los coeficientes de correlación de Spearman. Entre los coeficientes de correlación obtenidos (Tabla 4.3.) se pueden destacar los coeficientes de correlación positivos entre la conductividad y la concentración de varios iones presentes en el agua residual como el amonio, los sulfatos y los cloruros. Como era de esperar, también hay una correlación positiva entre la DQO y la DBO5.
4.1.3. Biodegradabilidad del agua del afluente

También se ha estudiado el cociente DBO5/DQO, que da una idea de la biodegradabilidad del agua de entrada. El valor de este cociente se encuentra, generalmente, dentro del intervalo 0,4-0,8, siendo poco biodegradable si es menor de 0,2 (Metcalf y Eddy, 1995; Salas et. al., 2007). En el caso de las depuradoras estudiadas se puede observar en la tabla 4.2., que en general el afluente presenta un valor para esta relación que se encuentra dentro del intervalo típico comentado. Sin embrago, hay 10 muestras que presentan un cociente menor de 0,2, cosa que, como ya se ha comentado también, indica que en estos casos el agua de entrada es poco biodegradable.
Tabla 4.2. Valores del cociente DBO5/DQO, n: número de muestras.

Media Desviación estándar n Máximo Mínimo

Cociente DBO5/DQO 0,54320635 0,14273718 89 1,03773585 0,13975155

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Tabla 4.3. Coeficientes de correlación de Spearman (p<0,05) entre los parámetros físico-químicos del afluente. El primer valor corresponde al coeficiente de correlación, el segundo a la probabilidad, y el tercero al número de casos. En negrita se muestran los coeficientes de correlación con p<0,01. Las casillas en blanco indican falta de correlación.
Fósforo total N amoniacal

Detergentes

DQO total

0,550403 0,693551 0,82457 Conductividad 0,000001 0,000001 0,00001 86 58 19 pH

0,56720 0,464928 0,01132 0,000006 19 86

0,34077 0,494797 0,549542 0,79346 0,00132 0,000001 0,000001 0,00001 86 86 86 21 0,6759 0,0007 21 -0,244 0,023 86 -0,755 0,030 8 0,60556 0,02828 13 0,89445 0,00003 13

SSLM

-0,87831 0,00410 8 0,89445 0,872236 0,00003 0,000101 13 13 0,854210 0,820299 0,000001 0,000001 86 61 0,844398 0,702915 0,000001 0,000001 86 61

0,56034 0,04639 13 0,68334 0,01002 13

SVLM

DBO5

0,760710 0,771542 0,902488 0,000001 0,000001 0,000001 89 89 89 0,76700 0,794275 0,000001 0,000001 89 89 -0,544 -0,55315 -0,34673 -0,56740 0,015 0,01402 0,01695 0,00003 19 19 47 47

DQO total

Mat. volátiles

MES

0,781874 0,606181 0,000001 0,000001 86 61 0,855252 0,695433 0,000001 0,000001 86 61 0,637 0,003 19 0,999849 0,852354 0,000001 0,000001 86 61 0,845398 0,000001 58

0,816931 0,000001 89

Fósforo total

Cloruros

N Kjeldahl

N amoniacal

38

Nitratos y nitritos

Aceites y grasas

Cloruros

Sulfatos

N total

DBO5

MES

4.2. EL EFLUENTE

Tal y como se ha realizado con el afluente, también se ha caracterizado el agua de salida de las depuradoras estudiadas y se han determinado las relaciones existentes entre los diferentes parámetros. Posteriormente, se han estudiado las posibles relaciones entre estos parámetros físico-químicos y la microfauna de los fangos activos.
4.2.1. Caracterización del efluente

Con los datos de los parámetros físico-químicos y operacionales del efluente se han calculado las medias, desviaciones estándar y los valores máximos y mínimos (Tabla 4.4.).
Tabla 4.4. Resultados de los parámetros físico-químicos del efluente de las plantas estudiadas, donde X: media, Des. std: desviación estándar y n: número de muestras.

Conductividad (mS/cm) pH DBO5 (mg O2/l) DQO (mg O2/l) MES (mg/l) Fósforo total (mg/l) N (NO2-+NO3-) (mg/l) N Kjeldahl (mg/l) N amoniacal (mg/l) N total (mg/l) % DBO eliminada % DQO eliminada % N eliminado % P eliminado

X 1,05 7,58 11,04 39,78 14,14 2,04 5,34 6,52 5,84 11,52 93,58 85,74 43,99 55,33

Des. std 0,52 0,38 8,99 30,63 20,47 1,35 5,53 7,67 7,30 7,93 6,15 12,64 37,98 28,86

n 47 57 39 89 98 89 99 94 64 99 32 78 50 87

Máximo 3,72 8,25 48,7 219 168 6,07 36,1 36,8 32,7 40,3 99,40 99,68 93,06 98,68

Mínimo 0,21 6,55 5,1 10 1 0,28 0,08 0,3 0,11 1,77 68,78 36,84 -70,70 -57,39

Al igual que con los datos del afluente, también se comprobó, mediante el test de Kolmogorov-Smirnov, que los datos no seguían una distribución normal. Los únicos datos del efluente que seguían una distribución normal eran el pH y el fósforo total. Como la mayoría de variables no seguían una distribución normal se realizó la prueba de Kruskal-Wallis para determinar si los parámetros físico-químicos y operacionales estudiados presentaban diferencias significativas según el tipo de tratamiento de las depuradoras, tratamiento convencional o tratamiento de eliminación de nutrientes. Los datos que presentaron diferencias significativas según el tipo de tratamiento de las depuradoras fueron el fósforo total, los nitratos y nitritos, el nitrógeno Kjeldahl y el total, el

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porcentaje de eliminación de la DQO y el porcentaje de eliminación de nitrógeno (Tabla 4.5.).
Tabla 4.5. Resultados del análisis de Kruskal-Wallis, donde H: estadístico de Kruskal-Wallis, g.l.: grados de libertad y p: probabilidad.

Fósforo total Nitratos y nitritos N Kjeldahl N total % Eliminación DQO % Eliminación N

H 7,05 6,80 5,22 11,81 7,589 7,41

g.l. 1 1 1 1 1 1

p 0,01 0,01 0,02 0,001 0,006 0,01

Como se puede observar en la Tabla 4.6. el rango promedio del porcentaje de eliminación de nitrógeno, es, como era de esperar, más elevado en el caso de las depuradoras con tratamiento de eliminación de nutrientes. Además, tanto el fósforo, como las diversas formas del nitrógeno, presentan rangos promedios más elevados en el caso de las depuradoras con tratamiento convencional, puesto que al no estar diseñadas para eliminar nutrientes tendrán concentraciones de salida de estos nutrientes más elevadas que las diseñadas para eliminarlos.

Tabla 4.6. Resultados de la prueba de Kruskal Wallis con los rangos promedios para cada variable, donde n: número de casos.

Parámetro

Tratamiento Eliminación de nutrientes Fósforo total Convencional Eliminación de nutrientes Nitratos y nitritos Convencional Eliminación de nutrientes N Kjeldahl Convencional Eliminación de nutrientes N total Convencional Eliminación de nutrientes % Eliminación DQO Convencional Eliminación de nutrientes % Eliminación N Convencional

N 44 45 50 49 50 49 50 49 43 45 14 36

Rango promedio 37,64 52,18 42,55 57,60 43,47 56,66 40,18 60,02 52,17 37,17 34,5 22

40

4.2.2. Relaciones entre los parámetros físico-químicos

Como la mayoría de parámetros no seguían una distribución normal, se determinaron las relaciones entre los diferentes parámetros físico-químicos y operacionales del agua del efluente a partir de los coeficientes de correlación de Spearman.
Tabla 4.7. Coeficientes de correlación de Spearman (p<0,05) entre los parámetros físico-químicos y operacionales del efluente. El primer valor corresponde al coeficiente de correlación, el segundo a la probabilidad, y el tercero al número de casos. En negrita se muestran los coeficientes de correlación con p<0,01. Las casillas en blanco indiquen falta de correlación. N Kjeldahl N amoniacal Fósforo total

N total

DQO

MES

Conductividad

0,2988 0,0413 47 0,2984 0,0394 48 0,4596 0,000002 99 0,5643 0,000001 99 0,3310 0,0009 98 0,6239 0,000001 89 0,3490 0,0004 99 0,6141 0,000001 99 0,5314 0,000002 70 0,2953 0,0220 60 -0,4377 0,0002 70 0,8840 0,000001 70 0,3694 0,0016 70 0,4399 0,0001 70

0,3185 0,0291 47

0,4765 0,0007 47

0,2952 0,0464 46

pH

DBO5

0,5354 0,000001 99 0,5944 0,000001 99 0,4275 0,000011 98 0,4186 0,000045 89 -0,3613 0,0002 99

0,4053 0,0001 89 0,5013 0,000001 89 0,2873 0,0063 89

0,6854 0,000001 98 0,6932 0,000001 98

0,6762 0,000001 99

DQO MES

Fósforo total

Nitratos y nitritos

N Kjeldahl

N amoniacal

Los coeficientes de correlación obtenidos se pueden observar en la Tabla 4.7., y destacan los coeficientes positivos existentes entre los diferentes parámetros indicadores de la contaminación del efluente como la DQO, la DBO5 y la materia en suspensión (MES).

pH

41

También se observa un coeficiente de correlación negativo entre la concentración de amonio y la concentración de nitratos y nitritos, es decir, mayores concentraciones de nitratos y nitritos coinciden con menores concentraciones de amonio, cosa que indica presencia de procesos de nitrificación, y a la inversa, cosa que indica inhibición de los procesos de nitrificación.
4.2.3. Rendimiento operacional de las depuradoras estudiadas

Según la Directiva 91/271/CEE, que regula los vertidos al cauce público, hay una serie de parámetros con un límite máximo de vertido. Estos parámetros corresponden a la DBO5, DQO y Sólidos en suspensión totales. En el caso de las depuradoras que abocan las aguas depuradas a una zona sensible propensa a la eutrofización también hay límite de vertido para el nitrógeno total y el fósforo total, que será diferente según el número de habitantes equivalentes. En el caso del parámetro de la DQO, este límite máximo es de 125 mg O2/l. Como se puede observar en la tabla 4.4., el valor máximo obtenido por este parámetro en las muestras analizadas es de 219 mg O2/l. Solamente en dos casos se ha superado este valor límite establecido, los cuales podrían ser debidos a un escape de sólidos debido a la proliferación de espumas. El valor máximo observado para el parámetro DBO5 es de 48,7 mg O2/l, el cual también supera el valor límite de 25 mg O2/l establecido por la Directiva 91/271/CEE. También se ha superado este valor sólo en dos de las muestras analizadas, que, como era de esperar, son las mismas que superaban el valor límite para la DQO. Respecto a las materias o sólidos en suspensión, el valor límite establecido por esta Directiva corresponde a 35 mg/l. Este valor ha sido superado en cinco de las muestras analizadas, probablemente debido también a un escape de sólidos producido por una sedimentación deficiente del fango. Para el caso del nitrógeno y del fósforo sólo se han estudiado los datos de las depuradoras diseñadas para eliminar estos nutrientes, lo que corresponde a un total de 10 depuradoras y 51 muestras. Se puede observar que todas las depuradoras estudiadas presentan un límite de vertido de 2 mg/l de fósforo total y 15 mg/l de nitrógeno total, puesto que están diseñadas para una población de 10.000 a 100.000 habitantes equivalentes. Por lo tanto, para el caso del fósforo, hay 10 muestras que no cumplen este valor límite; y en el caso del nitrógeno, hay 8 muestras que no cumplen el valor límite de 15 mg/l. Por tanto, se

42

concluye que entre las depuradoras estudiadas diseñadas para eliminar nutrientes, una parte no cumplen los niveles límites de vertido establecidos por la normativa, especialmente para el caso del fósforo total.
4.3. CARACTERIZACIÓN DEL FANGO

A partir de las características morfológicas y estructurales de los flóculos y otras observaciones generales del fango se puede obtener información sobre la calidad del fango activo y complementar la información obtenida con la identificación y el recuento de los microorganismos.
4.3.1. Tamaño

El tamaño de los flóculos puede afectar a la calidad de los fangos activos, puesto que está relacionado, principalmente, con la sedimentabilidad del fango durante la fase de clarificación del licor mezcla, y por lo tanto, con la calidad final del efluente. Los flóculos se pueden clasificar en tres categorías según su tamaño (Jenkins et. al., 1993; EMASESA, 1997). Los flóculos pequeños (< 150 μm) tienen, en general, una forma redonda y una estructura compacta, y no presentan microorganismos filamentosos o en una abundancia muy baja. Estos flóculos pueden producir el fenómeno denominado pin-point floc, con el que se obtiene un bajo IVF y un efluente de elevada turbidez debido a que decantan con dificultad y muchos sólidos se quedan en suspensión. También pueden producirse flóculos pequeños debido a una elevada concentración de microorganismos filamentosos que crecen dentro de los flóculos, disgregándolos y rompiéndolos. En nuestro caso casi el 20 % de las muestras han presentado flóculos de pequeño tamaño de los cuales un 35 % son debidos a pin-point floc y el 65 % restante, a una elevada concentración de filamentos. De los datos relacionados con el tamaño de los flóculos solamente se ha podido observar la abundancia de filamentos, la cual es bastante elevada, 273,5 m/ml de media, debido a que, como ya se ha comentado, la mayoría de muestras con flóculos de tamaño pequeño eran debidas a una estructura disgregada y no a pin-point floc. Los flóculos de tamaño mediano (entre 150 y 500 μm) se caracterizan por un crecimiento equilibrado de las bacterias floculantes y de los microorganismos filamentosos. En general se obtiene un IVF inferior a 150 ml/g, y un sobrenadante bien clarificado. Casi la mitad de las muestras han presentado flóculos de tamaño mediano, pero el valor medio de la

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abundancia total de filamentos es bastante elevado, dando un valor de 252,4 m/ml de media. Los flóculos grandes (> 500 μm), debidos en general a un crecimiento masivo de microorganismos filamentosos, tienden a tener los márgenes irregulares, y se obtienen IVF elevados y en general un sobrenadante muy clarificado, pero en algunos casos el manto de fango puede ascender mucho y acabar abocándose con el efluente. De las muestras analizadas, casi un 34 % han presentado flóculos de tamaño grande y una abundancia mediana de filamentos de 378,6 m/ml.
700 Abundancia de filamentos (m/ml) 600 500 400 300 200 100 0
Tamaño pequeño Tamaño mediano Tamaño grande

Categorias de tamaño de los flóculos

Figura 4.1. Abundancia media de microorganismos filamentosos en m/ml según el tamaño medio de los flóculos.

Para determinar si la abundancia de microorganismos filamentosos presentaba diferencias significativas según el tamaño medio de los flóculos se realizó la prueba de KruskalWallis. A partir de los resultados se comprobó que únicamente había diferencias significativas entre el tamaño de flóculos grande y el resto de tamaños.

Tabla 4.8. Resultados de la prueba de Krukal-Wallis, n=número de casos.

Tamaño de los flóculos Pequeños Abundancia de filamentos Medianos Grandes

Variable

n Rango promedio 20 43,725 50 49,41 36 64,6111111

Por tanto, como solamente existen diferencias significativas entre los flóculos de tamaño grande y los otros tamaños, se podría decir que el tamaño de los flóculos no depende

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únicamente de la abundancia de microorganismos filamentosos; hay otras variables y/o parámetros operacionales que influyen en el tamaño de los flóculos.
4.3.2. Estructura

La estructura de los flóculos también afecta a la calidad final del efluente. Así los flóculos de estructura compacta sedimentarán correctamente y en general el fango tiene un IVF medio menor de 150 ml/g, produciendo un efluente bien clarificado con pocos sólidos en suspensión (EMASESA, 1997). En este caso un 23,6% de las muestras han presentado una estructura moderadamente abierta y un 26,4 % una estructura compacta. En cambio, los flóculos de estructura abierta, generalmente por una abundancia muy elevada de microorganismos filamentosos que crecen en el interior de los flóculos, presentarán un IVF elevado puesto que estos flóculos no sedimentan bien (EMASESA, 1997). La mitad de las muestras observadas han presentado flóculos de estructura abierta. En este estudio no hemos podido comprobar si la estructura de los flóculos está relacionada con la sedimentabilidad del fango al no disponer de datos de IVF. Por lo tanto, se ha vuelto a observar la abundancia total de filamentos, que está relacionada, al menos indirectamente, con la sedimentabilidad del fango.
700 600

Abundancia de filamentos (m/ml)

500 400 300 200 100 0

M oderadamente Compacta abierta Categorias de la estructura de los flóculos Abierta

Figura 4.2. Abundancia media de microorganismos filamentosos en m/ml según la estructura media de los flóculos.

Con estos datos se determinó si la abundancia de microorganismos filamentosos presentaba diferencias significativas según la estructura media de los flóculos a partir de la prueba de Kruskal-Wallis. Aún habiendo cierta relación, a partir de los resultados se pudo

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comprobar que la estructura flocular no depende, al menos únicamente, de la abundancia total de microorganismos filamentosos.
Tabla 4.9. Resultados de la prueba de Kruskal Wallis con los rangos promedio para cada variable, donde n: número de casos.

Estructura flocular Abierta Abundancia de filamentos Moderada Compacta
Wallis, g.l.=grados de libertad y p=probabilidad.

Variable

n Rango promedio 53 60,21 25 43,74 28 49,5

Tabla 4.10. Resultados de la prueba de Kruskal-Wallis, n=número de casos, H=estadístico de Kruskal-

H g.l. p

Abundancia de filamentos 5,523 2 0,0631

4.3.3. Grado de cobertura (concentración)

El grado de cobertura flocular o concentración de flóculos corresponde al parámetro físicoquímico de los sólidos en suspensión (SSLM). En este caso, una concentración baja puede indicar una carga másica demasiado baja que no permite que los flóculos se desarrollen, o bien puede responder a una purga de fangos excesiva. Por el contrario, una concentración elevada a muy elevada de flóculos puede empeorar las condiciones de sedimentación del fango, y normalmente acostumbra a ser causa de un caudal de purga insuficiente.
3500 3000 2500 SSLM (mg/l) 2000 1500 1000 500 0 Elevada Muy elevada Baja Moderada Categorías de concentración flocular

Figura 4.3. Abundancia media de los sólidos en suspensión del licor mezcla (mg/l) en las diferentes categorías de concentración flocular de las muestras.

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En las muestras observadas ha predominado, con un porcentaje de casi el 54%, las muestras con una concentración elevada de flóculos, seguido de un 31% de muestras con una concentración moderada. Las otras dos categorías de concentración de flóculos, baja y muy elevada, han presentado el mismo porcentaje de muestras, un 7,5 % (figura 4.3). Aunque la disponibilidad de datos de los sólidos en suspensión no es muy elevada, se puede observar que hay cierta relación con el grado de cobertura de flóculos de las muestras. Una posible razón de que la mayoría de muestras presenten una concentración elevada puede ser debido a que el tratamiento de los fangos excedentes tiene un coste muy elevado y por eso se tiende a operar con concentraciones elevadas de sólidos, cosa que reduce el coste aparente de operación de la planta.
4.3.4. Otras observaciones

4.3.4.1. Bacterias dispersas Las bacterias dispersas se han considerado de forma conjunta, sin determinar la gran diversidad de taxones que pueden aparecer. Una concentración elevada de bacterias dispersas puede incrementar la turbidez del efluente debido a que se quedan en suspensión durante la clarificación del agua. Además, también indica que el sistema sufre una cierta desestabilización o que está afectado por algún tipo de perturbación. En algún caso han sido relacionadas con una concentración baja de oxígeno disuelto y una presencia muy baja o nula de procesos de nitrificación (Rius, 2003). En nuestro caso han predominado, con casi un 70 %, las muestras que presentaban una concentración baja de bacterias dispersas. Casi un 17% de las muestras presentaban una concentración moderada de bacterias dispersas y el 13% restante de las muestras, una concentración elevada. No se ha podido observar si hay cierta relación con el oxígeno disuelto por carencia de datos, pero si que se ha estudiado si la concentración de bacterias dispersas tiene cierta relación con la materia en suspensión del efluente. Como se puede observar en la tabla 4.11., no se ha encontrado relación entre el parámetro de materia en suspensión del efluente y la concentración de bacterias dispersas como se

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podía esperar en un principio, ya que los resultados estadísticos muestran que la materia en suspensión no es más elevada cuando mayor es la concentración de bacterias dispersas. De las muestras con una concentración moderada de bacterias dispersas se ha observado que el 44,4 % presentaban problemas de bulking filamentoso y/o espumas, posiblemente es por esta razón que estas muestras presentaban una concentración bastante elevada de materias en suspensión.
Tabla 4.11. Resultados de los parámetros físico-químicos del efluente; siendo X=media y Desv. std=desviación estándar.

MES (mg/l)

Concentración baja Concentración moderada Concentración elevada X ± Desv. std n X ± Desv. std n X ± Desv. std n 10,39±9,12 68 28,9±43,02 16 13,43±8,66 14

4.3.4.2. Bacterias helicoidales Dentro de lo que denominamos bacterias helicoidales se han incluido las espiroquetas y los espirilos. Las espiroquetas son bacterias móviles, doblemente enrolladas en forma de espiral y extremadamente flexibles que se mueven helicoidalmente. Los espirilos son otro tipo de bacteria más rígida, solamente enrolladas una vez en forma de espiral, y con un movimiento más rápido (Isac, L., et al, 2005). Estos dos tipos de bacterias helicoidales indican una concentración de oxígeno baja y presencia de septicidad en algún punto del sistema (Jenkins et. al., 1993). Normalmente, estas bacterias provienen del agua de entrada o del decantador primario, dónde pueden proliferar, entrando posteriormente al reactor aerobio, así como entrar a cabecera a partir de los retornos procedentes de la línea de fangos. Además, una presencia elevada o muy elevada puede suponer un incremento de la turbidez del efluente.

Elevada 15% Ausencia 47% Moderada 25% Baja 13%

Baja 6%

Moderada 9%

a

b

Ausencia 85%

Figura 4.4. Resultados obtenidos de los rangos de abundancia de las bacterias helicoidales en las muestras analizadas en: a) espiroquetas y b) espirilos.

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La ausencia de estas bacterias en las muestras analizadas predomina, en el caso de las espiroquetas, en el 47% de las muestras, y en el caso de los espirilos en el 85% de las muestras. La presencia de espirilos ha sido bastante más baja que la de espiroquetas, apareciendo con una abundancia baja en el 5,6% de las muestras, y con una abundancia moderada en el 9,4% de las muestras. Los porcentajes de aparición de las espiroquetas, en cambio, son: en el 13% de las muestras han aparecido con una abundancia baja, en el 24,5% con una abundancia moderada, y en el 15% restante con una abundancia elevada (figura 4.4). La presencia de bacterias helicoidales en las depuradoras urbanas es debida, en el 98% de los casos, a una entrada elevada de retornos a cabecera procedentes de la línea de fangos, mientras que un 1,5% de la presencia de estas bacterias se debe a que el sistema presenta una etapa anaeróbica para eliminar fósforo, y el 0,5% restante se debe a la entrada de estas bacterias con el afluente debido a una elevada septicidad en los colectores. 4.3.4.3. Bacterias PAO y GAO Dentro de las bacterias denominadas PAO (Organismos Acumuladores de Polifosfatos), se incluyen todas aquellas bacterias capaces de acumular grandes cantidades de fosfatos en forma de gránulos de polifosfatos. En cambio, las bacterias GAO (Organismos Acumuladores de Glicógeno), aunque tienen un metabolismo muy parecido a las PAO, no son capaces de acumular polifosfatos intracelulares y por lo tanto, no pueden eliminar grandes cantidades de fósforo del medio. Entre estos dos tipo de bacterias se produce una competencia por el mismo sustrato en condiciones anaerobias (Borràs, 2007). En este trabajo se han considerado conjuntamente las bacterias PAO y GAO debido a la dificultad de diferenciarlas únicamente con el microscopio óptico. Estos dos tipos de bacterias producen polímeros extracelulares, que en cantidades elevadas pueden producir bulking viscoso. Como ya se ha comentado en el apartado “1.7.3. Bulking viscoso” los principales factores que lo producen son la deficiencia de nutrientes, la deficiencia de oxígeno y cargas másicas elevadas (Richard, 2003). El 98% de las muestras analizadas no presentaron estas bacterias, y sólo en el 2% de las muestras fueron poco abundantes. Como ya se ha comentado, las bacterias GAO y PAO aparecen generalmente cuando las concentraciones de nutrientes están descompensadas, y esto generalmente sucede en las

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aguas residuales industriales, que a diferencia de las urbanas, se caracterizan por presentar un ratio bajo de nutrientes respecto la DQO (De Lucas, et al,. 2007). La composición del agua residual urbana, por el contrario, suele presentar una composición, resultado de una mezcla de compuestos tanto de origen urbano como industrial y/o productos de la ganadería y de la agricultura, que hace que las concentraciones de nutrientes presenten la proporción adecuada de 100:5:1 de carbono (como DBO5), nitrógeno (como nitrógeno total Kjeldahl) y fósforo (como fósforo total) respectivamente (Jenkins, 2003), necesaria para mantener un crecimiento equilibrado de las bacterias GAOs y/o PAOs. A partir de la tabla 4.12., se puede observar que esta relación, para las muestras observadas, ha sido siempre superada tanto por el nitrógeno como por el fósforo.

Tabla 4.12. Valores de la relación DBO5/N/P de las muestras observadas. Los valores de N y P están expresados considerando una DBO5 de 100.

DBO5 NTK Fósforo total n 89 86 89 Media 100 21,62 3,71 Desviación estándar 8,58 1,96 Máximo 59,55 10,8 Mínimo 7,46 1,31

4.3.4.4. Zoogloea Se trata de bacterias en forma de bacilo que aparecen constituyendo masas de bacterias unidas por una matriz gelatinosa formada por un exopolímero. Suelen aparecer como nódulos que sobresalen de los flóculos con formas irregulares o presentar extensiones digitiformes o ramificadas (EMASESA, 1997). Un crecimiento masivo de Zoogloea spp. puede ser debido a una elevada carga másica y baja edad del fango, condiciones que se dan normalmente en puestas en marcha, o a una deficiencia de nutrientes (especialmente deficiencia de nitrógeno o fósforo) (Richard, 2003; Martínez 2005). Como el exopolímero retiene mucha agua puede dar lugar a un aumento del IVF y al fenómeno denominado bulking viscoso (Jenkins et. al., 1993). No se ha observado de forma masiva la bacteria Zoogloea spp. en ninguna muestra de las observadas. Esto puede ser debido a que, como ya se ha estudiado en el apartado anterior, 50

las depuradoras estudiadas no han presentado en ningún momento deficiencia de nutrientes, ni de nitrógeno ni de fósforo, además, también hace falta decir que las depuradoras estudiadas no corresponden a puestas en marcha, sino que son sistemas estabilizados, condiciones que no favorecen el crecimiento masivo de estas bacterias.
4.4. COMUNITADES DE MICROORGANISMOS FILAMENTOSOS

Los microorganismos filamentosos (que incluyen tanto bacterias filamentosas como actinomicetos) son fundamentales en el proceso de depuración de las aguas residuales puesto que son, juntamente con los otros tipo de bacterias que se pueden encontrar en un fango activo, responsables de la mineralización de la materia orgánica y de la formación de los flóculos que contribuyen a la clarificación del efluente (Rius, 2003). A la vez, estos microorganismos sirven de sustrato y alimento para los protozoos y metazoos. Son también muy importantes en la conformación de los flóculos dado que sirven de esqueleto dónde adherirse las bacterias floculantes (conforman la denominada macroestructura flocular), incrementando la consistencia de los flóculos y permitiendo que incrementen de tamaño. También son importantes por los problemas operacionales que pueden originar en los sistemas de depuración mediante fangos activos cuando proliferan de forma masiva, dando lugar a problemas de separación líquido-sólido como por ejemplo problemas de esponjamiento del fango (bulking filamentoso) y formación de espumas o natas (también denominado foaming) (Eikelboom, 1977; Jenkins et. al., 1993).
4.4.1. Clasificación de los microorganismos filamentosos

Se han descrito unas 30 morfoespecies diferentes de microorganismos filamentosos, de las cuales 18 son más frecuentes en fangos activos (Eikelboom, 1977; Jenkins et. al., 1993). En total, durante este estudio, se han determinado 23 morfoespecies diferentes de microorganismos filamentosos atendiendo a los morfotipos descritos por Eikelboom, 1977 y Jenkins et. al., 1993. Primeramente se ha determinado la abundancia media, la desviación estándar y la frecuencia de aparición (tabla 4.2.1.) de los diferentes tipos de microorganismos filamentosos encontrados. A partir de los resultados obtenidos se puede observar que el filamento más frecuente corresponde al grupo de los actinomicetos nocardioformes, el cual ha aparecido casi en el 90 % de las muestras analizadas. El siguiente filamento más frecuente corresponde al Tipo 1851, que ha aparecido en el 77 % de las muestras, seguido del Tipo 0041, con un porcentaje de aparición del 71 % y del Tipo 021N, que ha aparecido 51

en el 65 % de las muestras (tabla 4.2.1.). En cuanto a la abundancia, el microorganismo filamentoso más abundante ha sido Microthrix parvicella, con una abundancia media de 80,5 m/ml. El siguiente ha sido el Tipo 1851, con una abundancia media de 57,5 m/ml, seguido del grupo de los actinomicetos nocardioformes y el Tipo 021N, con unas abundancias medias de 51 y 47 m/ml respectivamente (tabla 4.2.1.).
4.4.2. Porcentajes de aparición de los filamentos dominantes y secundarios

En base a los resultados obtenidos se han determinado los filamentos dominantes y secundarios de cada muestra y se han calculado los porcentajes respecto el número total de microorganismos filamentosos contabilizados (tabla 4.2.1.). En la tabla 4.2.1. podemos observar que en total han aparecido 9 morfotipos diferentes de microorganismos filamentosos dominantes, cosa que representa un 37,5% del total de microorganismos observados. Como morfotipos que predominan hace falta destacar el Tipo 1851, que ha sido el filamento dominante en el 30% de las muestras observadas, seguido del Tipo 021N, siendo dominante en casi el 22% de las muestras. Por último, se podría destacar los porcentajes de dominancia del grupo de los actinomicetos nocardioformes, que ha estado de casi el 19%, y de Microthrix parvicella, del 16%. Por otra parte, la diversidad del filamento secundario es algo más elevada, puesto que han aparecido 15 morfoespecies diferentes, representando un 65% del total de filamentos observados. Los actinomicetos nocardioformes son el filamento secundario más frecuente, con un porcentaje del 25%. El segundo filamento que ha aparecido más veces como filamento secundario ha sido el Tipo 021N, apareciendo en el 14% de las muestras. Los siguientes filamentos más frecuentes como filamentos secundarios han sido Microthrix parvicella y el Tipo 1851, apareciendo los dos en casi el 10% de las muestras. Como ya se ha comentado anteriormente, las aguas residuales urbanas presentan una composición rica de compuestos, lo que permite que microorganismos filamentosos como Microthrix parvicella y los actinomicetos nocardioformes, que requieren ambientes bastante estables y, sobre todo, con presencia de grasas y/o aceites, aparezcan con tanta frecuencia y abundancia en las EDARs urbanas (Eikelboom, 2000). Además, también han aparecido con bastante frecuencia y abundancia otros microorganismos filamentosos más oportunistas y que soportan deficiencias nutricionales como el Tipo 021N, el Tipo 0041 y Haliscomenobacter hydrossis entre otros (Jenkins et. al., 1993, Stover et. al., 1994).

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Tabla 4.13. Abundancias, expresadas en m/ml, y frecuencias de aparición de los microorganismos filamentosos encontrados en las muestras, y porcentajes de aparición de los filamentos dominantes y secundarios, donde X: media, Desv. std: desviación estándar y %: frecuencia de aparición.

Actinomicetos nocardioformes Beggiatoa Hongos Haliscomenobacter hydrossis Microthrix parvicella Nostocoida limicola II Nostocoida limicola III Sphaerotilus natans Streptococcus Thiothrix Y Thiothrix II Tipo 0041 Tipo 0092 Tipo 021N Tipo 0581 Tipo 0675 Tipo 0803 Tipo 0914 Tipo 0961 Tipo 1701 Tipo 1851 Tipo 1852 Tipo 1863

X 51,46 0,27 0,59 4,84 80,50 1,33 0,33 1,54 0,40 0,11 0,61 9,13 22,15 47,03 1,38 5,55 0,05 0,06 7,21 0,16 57,52 0,20 0,07

Desv. std. 77,39 0,94 2,72 17,22 203,95 6,37 0,98 5,40 3,21 0,63 2,99 19,43 70,36 93,20 8,16 11,26 0,37 0,50 30,27 0,81 93,92 1,27 0,40

% % dominante % secundario 89,62 18,87 25,23 11,32 0 0,90 6,60 0 1,80 48,11 0 2,70 48,11 16,04 9,91 14,15 0 0,90 15,09 0 0 13,21 0 2,70 2,83 0 0,90 3,77 0 0 7,55 0 0,90 71,70 3,77 8,11 25,47 4,72 8,11 65,09 21,70 14,41 2,83 1,89 0 45,28 0 7,21 1,89 0 0 1,89 0 0 20,75 2,83 6,31 5,66 0 0 77,36 30,19 9,91 4,72 0 0 3,77 0 0

4.4.3. Relaciones entre los microorganismos filamentosos y los parámetros físicoquímicos

Se han determinado las relaciones existentes entre los diversos tipos de microorganismos filamentosos y los parámetros físico-químicos y operacionales del proceso, utilizando el coeficiente de correlación de Spearman. Sólo se han considerado los microorganismos filamentosos que han presentado una frecuencia superior al 10% del total, lo cual ha reducido el estudio a 13 tipos de microorganismos filamentosos. Al estudiar las correlaciones entre los microorganismos filamentosos y los parámetros físico-químicos y operacionales del proceso destacan los coeficientes positivos obtenidos entre el filamento Beggiatoa y la DBO5 y la DQO del efluente y el coeficiente negativo con el porcentaje de eliminación de DQO, indicando que este filamento podría estar relacionado con efluentes de calidad deficiente (tabla 4.14).

53

También se puede destacar la correlación positiva entre los microorganismos del grupo de los actinomicetos nocardioformes con los sólidos en suspensión del efluente y los porcentajes de eliminación de DBO5 y de nitrógeno. Hace falta a decir que los actinomicetos nocardioformes producen problemas de espumas que pueden llegar a ser muy graves, generando escapes de sólidos con el agua de salida, por esto es coherente que se correlacione positivamente su abundancia con el incremento de sólidos en suspensión del agua de salida. Por último, se puede destacar los coeficientes de correlación negativos entre el microorganismo filamentoso Tipo 0092 y los parámetros indicadores de la calidad del efluente como la DBO5, la DQO, los sólidos en suspensión y el nitrógeno total, cosa que indica que este filamento puede estar relacionado cono una buena calidad del efluente.

54

Tabla 4.14. Coeficientes de correlación de Spearman (p<0,05) entre la abundancia de los microorganismos filamentosos y los parámetros físico-químicos del efluente y operacionales del proceso. El primer valor corresponde al coeficiente de correlación, el segundo a la probabilidad, y el tercero al número de casos. En negrita se muestran los coeficientes de correlación con p<0,01. Las casillas en blanco indican falta de correlación.

Total filamentos

Actinomicetos nocardioformes

N.limicola III

N. limicola II

H. hydrossis

Beggiatoa

S. natans

T021N

T0041

T0092

T0961 -0,214 0,033 99 0,258 0,014 89

DBO5 e

0,217 0,030 99 0,204 0,042 99 0,207 0,040 98 0,201 0,046 98 0,254 0,016 89 -0,303 0,003 89 -0,342 0,0005 99 0,276 0,020 70 0,324 0,006 70 0,319 0,001 99 0,269 0,011 88 -0,249 0,019 88 0,304 0,031 50 -0,387 0,00007 99 0,293 0,005 88 0,244 0,021 88 0,459 0,0007 50 0,256 0,015 88 0,422 0,002 50 -0,495 0,000001 99 -0,347 0,0008 89 -0,202 0,044 99 0,238 0,017 99

-0,250 0,012 99 -0,348 -0,404 0,462 0,0004 0,00003 0,000001 99 99 99 -0,363 0,0002 98

DQO e

-0,226 0,024 99

MES e

0,254 -0,229 0,011 0,023 98 98 0,367 0,0003 89

Fósforo total e

Nitratos y nitritos e

N amoniacal e

N total e

-0,255 0,527 0,010 0,000001 99 99 -0,303 0,003 88

% DBO5 elim.

% DQO elim.

% Elim. N

55

T1851

4.4.4. Microorganismos filamentosos más relevantes

A continuación se detallan las condiciones en las que suelen aparecer los microorganismos filamentosos más abundantes de las muestras analizadas respeto los parámetros físicoquímicos más relevantes con los que están relacionados. 4.4.4.1. Microthrix parvicella Microthrix parvicella produce frecuentemente problemas de bulking en sistemas convencionales de fangos activos. Este microorganismo filamentoso aparece en sistemas con cargas másicas bajas, bajas concentraciones de oxígeno disuelto, afluentes con elevado contenido en grasas y/o aceites (Eikelboom, 2000), especialmente ácido oleico (Andreasen te al, 2000) e incluso en bajas temperaturas (Eikelboom, 2000). Su crecimiento puede verse favorecido con la presencia de procesos incompletos de nitrificación y/o desnitrificación ya que puede utilizar los nitratos y nitritos como aceptor de electrones (Salvadó, 2006), por tanto, las condiciones de las depuradoras con sistema de eliminación de nutrientes le son muy favorables (Eikelboom, 2000). También se ha descrito que sólo puede crecer con pH>7, siendo su desarrollo óptimo a pH 8 (EMASESA, 1997). Aunque no se ha encontrado una correlación entre Microthrix parvicella y la concentración de aceites y grasas del afluente, se ha estudiado su frecuencia de aparición según diferentes rangos de concentración de aceites y grasas, puesto que como se ha comentado, suele aparecer en sistemas con afluentes con elevado contenido en grasas y/o aceites.
Tabla 4.15. Frecuencias de aparición del filamento Microthrix parvicella con diferentes abundancias según diversos rangos de concentración de aceites y grasas del afluente.

Microthrix parvicella (m/ml) 600-700 500-600 400-500 300-400 200-300 100-200 0-100
0-10

1 1 4
10-20

1 1 1 1 8
20-30

1 1 1
30-40 40-50

1

Aceites y grasas (mg/l)

56

Como se puede observar en la tabla 4.15, la frecuencia de aparición más elevada de Microthrix parvicella se da con concentraciones bajas de aceites y grasas. En estos casos suele aparecer con abundancias relativamente bajas, aunque también aparece con abundancias muy elevadas pero baja frecuencia. También se observa que a concentraciones más elevadas de aceites y grasas, todo y que no es muy frecuente, puede llegar a aparecer con abundancias de 300 m/ml (a partir de abundancias de 200 m/ml de microorganismos filamentosos se considera que el sistema puede tener problemas de esponjamiento del fango y en algunos casos, con abundancias a partir de 200 m/ml e incluso inferiores, Microthrix parvicella puede producir problemas de espumas). 4.4.4.2. Actinomicetos nocardioformes En este trabajo se han denominado actinomicetos nocardioformes puesto que existen varios géneros de Actinomicetos (Rhodococcus, Mycobacterium...) que se han identificado conjuntamente. También se pueden encontrar denominados como GALO (Gordonia amarae like organisms), NALO (Nocardia amarae like organisms), Gordona sp o Nocardia sp. Estos microorganismos filamentosos proliferan en condiciones de bajas cargas másicas, elevadas edades del fango y elevadas temperaturas. También puede verse favorecido su crecimiento con la presencia de compuestos hidrofóbicos como grasas, aceites, hidrocarburos, etc., siempre en condiciones aeróbicas estrictas (Jenkins te al 1993). Tal y como se ha realizado con Microthrix parvicella, al no presentar una correlación significativa con la presencia de aceites y/o grasas, se ha estudiado su frecuencia de aparición según diferentes rangos de concentración de estos compuestos hidrofóbicos. En este caso también se observa que las mayores frecuencias de aparición de estos microorganismos filamentosos se dan con concentraciones de aceites y grasas de hasta 20 mg/l (tabla 4.16). En este caso hay que destacar que los actinomicetos nocardioformes son susceptibles de producir espumas generalmente con concentraciones a partir de 50 m/ml (Salvadó, 1990), por lo tanto, aunque no es muy elevada, es importante la frecuencia con que aparece este filamento con concentraciones mayores de 50 m/ml a bajas concentraciones de aceites y grasas dado que pueden producir problemas de formación de flotantes y escapes de sólidos.

57

Tabla 4.16. Frecuencias de aparición del microorganismo filamentoso del grupo de los actinomicetos nocardioformes con diferentes abundancias según diversos rangos de concentración de aceites y grasas del afluente.

Actinomicetos nocardioformes (m/ml) 400-500 1 300-400 200-300 100-200 1 50-100 1 0-50 9
10-20 0-10

1 1 3 6 9
20-30

2
30-40 40-50

1

Aceites y grasas (mg/l) 4.4.4.3. Tipo 021N Este filamento produce frecuentemente problemas de bulking filamentoso, con unos IVF muy elevados (> 500 ml/g). Se considera que su crecimiento se ve favorecido por aguas residuales sépticas o que contengan importantes cantidades de sulfuros y/o ácidos orgánicos (EMASESA, 1997), por situaciones de deficiencia de nutrientes y/o presencia de sustratos fácilmente biodegradables y bajas cargas másicas (Eikelboom, 2000). Se ha descrito que el filamento Tipo 021N es muy versátil metabólicamente, pudiendo utilizar diferentes azúcares, aminoácidos y ácidos orgánicos como fuente de carbono, cosa que le permite proliferar en muchos ambientes diferentes. Además, como fuente de nitrógeno utiliza aminoácidos y no nitratos, cosa que le permite proliferar en sistemas con deficiencia de nitrógeno (Williams y Unz, 1989). Mediante la prueba de Kruskal Wallis se ha determinado que el microorganismo Tipo 021N presenta diferencias significativas en referencia a su aparición en plantas depuradoras convencionales respecto plantas diseñadas para eliminar nutrientes (tabla 4.17). En la tabla 4.18 se puede observar que el rango promedio de este microorganismo filamentoso ha sido más elevado en las depuradoras con tratamiento de tipo convencional que en las de eliminación de nutrientes, cosa que coincide con Eikelboom (2000) que describe que el Tipo 021N es más frecuente en depuradoras urbanas sin eliminación de nutrientes.

58

Tabla 4.17. Resultados del análisis de Kruskal-Wallis, donde H: estadístico de Kruskal-Wallis, g.l.: grados de libertad y p: probabilidad.

H g.l. p Tipo 021N 11,68 1 0,00062
Tabla 4.18. Resultados de la prueba de Kruskal Wallis con los rangos promedios para cada variable, donde n: número de casos.

Tipo 021N

Tipo de tratamiento Eliminación de nutrientes Convencional

N 51 55

Rango promedio 43,12 63,11

Como este filamento está relacionado con la presencia de sustratos fácilmente biodegradables, se ha estudiado su frecuencia de aparición según los diversos grados de biodegradabilidad del agua de entrada. Así, se obtiene que la mayor frecuencia y abundancia de este filamento se da en aguas biodegradables (DBO5/DQO entre 0,4 y 0,8) y muy biodegradables (DBO5/DQO ≥ 0,8) (Metcalf y Eddy, 1995; Salas et. al., 2007).
Tabla 4.19. Frecuencias de aparición del filamento Tipo 021N con diferentes abundancias según los rangos del cociente DBO5/DQO, indicador de la biodegradabilidad del agua del afluente.

Tipo 021N (m/ml) 400-500 300-400 200-300 100-200 0-100
0-0,2

2 2 6 30
0,4-0,8 0,8-1

1

1

13
0,2-0,4

Cociente DBO5/DQO 4.4.4.4. Tipo 1851 El filamento Tipo 1851 se observa regularmente en depuradoras de baja carga, pero normalmente no domina nunca en sistemas de tratamiento de aguas residuales urbanas (Eikelboom, 2000). Las condicionas que le favorecen son las bajas cargas másicas y compuestos de bajo peso molecular (Eikelboom, 2000), así como elevadas edades del fango (Jenkins et. al 1993).

59

Al no disponer de datos de cargas másicas ni de edades del fango, se ha estudiado la frecuencia de aparición del filamento Tipo 1851 a partir de rangos de concentración de DBO5 del afluente. Todo y que no es exactamente lo mismo, normalmente a más DBO5 de entrada más elevada es la carga másica, todo y que no siempre, puesto que la carga másica también depende de otros factores como el volumen del reactor, la concentración de sólidos y el caudal del afluente. Aun así, se puede observar en la tabla 4.20. que a concentraciones más bajas de DBO5 de entrada más abundante y frecuente es el Tipo 1851.
Tabla 4.20. Frecuencias de aparición del filamento Tipo 1851 con diferentes abundancias según diversos rangos de DBO5 del afluente.

Tipo 1851 (m/ml) 500-600 400-500 300-400 200-300 100-200 0-100

1 2 2 3 12
0-100

1 1 7 22
100-200 200-300

1 3 8
300-400

3
400-500

1 3
500-1000

2

DBO5 del afluente (mg O2/l)

4.5. COMUNITADES DE PROTOZOOS FLAGELADOS

Los protozoos flagelados son microorganismos muy comunes en los sistemas de depuración por fangos activos, especialmente durante las primeras etapas de colonización de los fangos activos (Curds, 1975). También contribuyen, como los protozoos ciliados, a la clarificación del efluente mediante la digestión de bacterias dispersas.
4.5.1. Clasificación de los protozoos flagelados

Debido a la dificultad que supone clasificar los protozoos flagelados en vivo y sin hacer cultivos específicos, en este trabajo se han clasificado fundamentalmente en base a su tamaño: flagelados pequeños (menores de 20 µm) y flagelados grandes (mayores de 20 µm). Dentro de cada rango de tamaño, en los casos que ha sido posible y, debido fundamentalmente a su valor como bioindicadores, algunos grupos de flagelados se han diferenciado del resto y clasificado en base a la clasificación taxonómica Systema Naturae

60

2000 (Brands, propuesta por la Society of Protozoologist (Lee, J.J., Leedale, G.F. y Bardbury, P, 2000) (ver clasificación en el anejo). Se ha determinado la abundancia de flagelados de tamaño pequeño (inferior a 20 μm), expresada en ind/ml, a partir del método descrito por Salvadó (1990a), mientras que la cuantificación de los flagelados de tamaño superior a 20 μm se ha determinado mediante el método de submuestras (Madoni, 1984), expresando los resultados también en ind/ml. Se ha calculado la media y la desviación estándar de las abundancias, así como la frecuencia de aparición de los diferentes grupos y/o géneros estudiados (tabla 4.21)
Tabla 4.21. Abundancias, expresadas en ind/ml, y porcentajes de aparición de los protozoos flagelados encontrados en las muestras, donde X: media, Desv. std: desviación estándar y %: frecuencia de aparición. Flagelados < 20 µm Flagelados < 20 µm (bodónidos) Flagelados < 20 µm (coanoflagelados) Flagelados < 20 µm (coloniales) Flagelados < 20 µm (Bicosoeca sp.) Flagelados < 20 µm (Hexamita sp.) Flagelados < 20 µm (Trepomonas sp.) Flagelados > 20 µm (Entosiphon sp.) Flagelados > 20 µm (Peranema sp.) Flagelados > 20 µm (Petalomonas sp.) X 120656,01 44167,64 5046,95 2329,36 3948,86 64,71 1488,21 86,79 31,32 10,94 Desv. std 201755,54 100757,65 17609,55 23982,21 37980,77 666,20 13353,37 312,12 86,06 60,86 % 86,79 30,19 17,92 0,94 4,72 0,94 3,77 16,98 27,36 5,66

Entre los flagelados de tamaño pequeño destaca la elevada abundancia y frecuencia de los flagelados de tamaño pequeño en general, que básicamente están formatos por el grupo de los bodónidos. Por lo tanto, si atendemos a grupos más concretos, los más abundantes y frecuentes serian el grupo de los bodónidos, seguidos por el grupo de los coanoflagelados. Los flagelados en general de tamaño pequeño (< 20 µm), entre ellos el género Bodo, aparecen principalmente en las fases de inicio de la colonización de los fangos activos o bien asociados a un mal funcionamiento del proceso, como por ejemplo una baja concentración de oxígeno disuelto o un exceso de carga orgánica (Madoni, 1991). Dentro de los flagelados de tamaño grande, el más abundante ha sido el género Entosiphon, que generalmente se asocia a elevadas concentraciones de oxígeno disuelto (Rius, 2003); mientras que el más frecuente corresponde al género Peranema, la proliferación del cual se asocia, en general, a edades del fango elevadas (Salvadó, 1994).

61

4.5.2. Relaciones entre los protozoos flagelados y los parámetros físico-químicos

Se han determinado las relaciones existentes entre los diversos grupos y/o géneros de flagelados y los parámetros físico-químicos del efluente, utilizando los coeficientes de correlación de Spearman. Sólo se ha trabajado con los protozoos flagelados que han presentado una frecuencia superior al 10% del total. De las correlacionas obtenidas se pueden destacar los coeficientes de correlación positivos entre los flagelados del grupo de los bodónidos y algunos parámetros indicadores de la calidad del efluente, especialmente la DQO y la materia en suspensión, así como el fósforo y el nitrógeno Kjeldahl y total (tabla 4.22.). Estos flagelados han sido asociados a un mal funcionamiento del proceso, como por ejemplo una baja concentración de oxígeno disuelto o un exceso de carga orgánica (Madoni, 1991), por lo tanto, se podría decir que son indicadores de una calidad del efluente deficiente.
Tabla 4.22. Coeficientes de correlación de Spearman (p<0,05) entre le abundancia de los diversos grupos de protozoos flagelados y los parámetros físico-químicos del efluente. El primer valor corresponde al coeficiente de correlación, el segundo a la probabilidad, y el tercero al número de casos. En negrita se muestran los coeficientes de correlación con p<0,01. Las casillas en blanco indican falta de correlación.

Nitratos y nitritos

N Kjeldahl

Fósforo total

Bodónidos Peranema sp.

0,2634 0,2521 0,2649 0,0088 0,0127 0,0126 97 88 98

0,2993 0,3997 0,0028 0,00005 98 98

0,2150 0,0326 99

4.5.3. Protozoos flagelados más relevantes

En este apartado se ha analizado más detalladamente el grupo de los coanoflagelados debido a su elevado valor bioindicador. El resto de flagelados, o no han sido muy abundantes, o su papel bioindicador es muy restringido solamente a un único parámetro, del cual no disponemos de datos para establecer relaciones. 4.5.3.1. Coanoflagelados Generalmente están asociados a buenas calidades del efluente, y proliferan en sistemas con bajas cargas másicas (Rius, 2003).

N total

DQO

MES

pH

62

Como no se ha obtenido ninguna correlación entre los coanoflagelados y parámetros que indiquen una buena calidad del efluente, se ha estudiado la frecuencia y abundancia con que aparecen este grupo de flagelados de tamaño pequeño según unos rangos de porcentajes de eliminación de DBO5. Así, se puede observar en la tabla 4.23., que los coanoflagelados sólo han aparecido con rendimientos de eliminación de DBO5 bastante elevados, siempre mayores del 85%. Pero las frecuencias y abundancias más elevadas se dan con unos porcentajes de eliminación mayores del 95%, lo que indica, tal y como se ha comentado, que este grupo de flagelados de tamaño pequeño aparecen principalmente cuando la calidad del efluente es muy buena.
Tabla 4.23. Frecuencias de aparición del grupo de los coanoflagelados con diferentes abundancias según diversos rangos de porcentajes de eliminación de DBO5.

Coanoflagelados (ind/ml) 40000-100000 30000-40000 20000-30000 10000-20000 0-10000

1 1 1 1 2
85-90 90-95

4 5
95-100

% de eliminación de DBO5
4.6. COMUNITADES DE PROTOZOOS AMEBOIDEOS

Las amebas, al igual que los protozoos flagelados, son microorganismos muy comunes en los sistemas de depuración por fangos activos. También contribuyen a la clarificación del efluente mediante la ingestión de bacterias dispersas, aunque hay amebas, especialmente dentro de las amebas de tamaño grande, que pueden ser depredadoras de otros protozoos e incluso de metazoos.
4.6.1. Clasificación de los protozoos ameboideos

Se han considerado las gimnamebas (o amebas desnudas) y las tecamebas como dos grandes grupos separados dada su diferenciación morfológica. Las gimnamebas se han clasificado, a su vez, en tres grupos diferentes atendiendo a su tamaño, puesto que es muy difícil diferenciarlas taxonómicamente en vivo y sin realizar cultivos específicos; además, los taxones de gimnamebas no suelen estar asociados a un valor bioindicador. En cambio, las tecamebas se han clasificado a nivel genérico atendiendo a la morfología de la teca en 63

base a la clasificación taxonómica Systema Naturae 2000 (Lee te al, 2000) (ver clasificación en el anejo). Al igual que en el caso de los protozoos flagelados, se ha cuantificado la abundancia de amebas (tanto de gimnamebas como de tecamebas) de tamaño pequeño (inferior a 20 μm) utilizando la técnica descrita por Salvadó (1990a), expresando los resultados en ind/ml. La abundancia de gimnamebas medianas (entre 20 y 50 μm), gimnamebas grandes (> 50 μm) y tecamebas de tamaño grande (> 20 μm) se ha realizado mediante el método de las submuestras (Madoni, 1984), expresándose los resultados en ind/ml. Se ha calculado la media y desviación estándar de las abundancias, y la frecuencia de aparición de los grupos estudiados (tabla 4.24).
Tabla 4.24. Abundancias, expresadas en ind/ml, y porcentajes de aparición de los protozoos ameboideos encontrados en las muestras, donde X: media, Desv. std: desviación estándar y %: frecuencia de aparición.

X Desv. std Gimnamebas < 20 µm 51468,45 153399,94 Gimnamebas entre 20 y 50 µm 933,21 2031,80 Gimnamebas > 50 µm 314,72 638,33 Tecamebas < 20 µm (Cryptodifflugia sp.) 1013,71 3443,16 Tecamebas > 20 µm (Arcella sp.) 244,53 907,98 Tecamebas > 20 µm (Centropyxis sp.) 18,87 159,64 Tecamebas > 20 µm (Euglypha sp.) 247,92 427,28 Tecamebas > 20 µm (Trinema sp.) 11,32 66,65

% 73,58 79,25 58,49 9,43 33,96 6,60 56,60 6,60

En el caso de las gimnamebas se puede observar que las más frecuentes han sido las de tamaño mediano y pequeño. Las gimnamebas de tamaño pequeño suelen asociarse a bruscos incrementos en la carga orgánica del afluente, apareciendo sobre todo en las primeras etapas de colonización de un fango (Ferrer et. al., 2007). A medida que se va estabilizando el proceso, las amebas pequeñas son sustituidas por gimnamebas de tamaño mediano y estas finalmente por amebas de tamaño grande, las cuales son indicadoras de ambientes más estables. En el caso de las tecamebas de tamaño grande las más frecuentes y también abundantes han sido Euglypha sp. y Arcella sp.
4.6.2. Relaciones entre los protozoos ameboideos y los parámetros físico-químicos

Para estudiar las relaciones entre los diversos grupos y/o géneros de amebas y los parámetros físico-químicos del efluente, se han utilizado los coeficientes de correlación de

64

Spearman. Sólo se ha trabajado con los protozoos ameboideos que han presentado una frecuencia superior al 10% del total. En la tabla 4.25., se pueden observar las correlacionas negativas entre el género Euglypha y los indicadores de la calidad del efluente DBO5 y DQO, así como con los rendimientos de eliminación de materia orgánica. Esto indicaría que Euglypha sp., estaría relacionada con una buena calidad del efluente. Además, también se observa una correlación negativa con el amonio del efluente, cosa que indica la relación de esta tecameba con la presencia de procesos de nitrificación. Si consideramos los tres grupos de gimnamebas estudiados (pequeñas, medianas y grandes) vemos que están relacionados positivamente con la DQO y con el amonio del efluente y, por lo tanto, están relacionados con una calidad del efluente más deficiente.
Tabla 4.25. Coeficientes de correlación de Spearman (p<0,05) entre la abundancia de los diversos grupos de protozoos ameboideos y los parámetros físico-químicos del efluente. El primer valor corresponde al coeficiente de correlación, el segundo a la probabilidad, y el tercero al número de casos. En negrita se muestran los coeficientes de correlación con p<0,01. Las casillas en blanco indican falta de correlación.

N Kjeldahl

N amoniacal

% DBO eliminada

-0,2608 -0,38192 -0,46934 -0,49836 Euglypha sp. 0,0091 0,0001 0,000003 0,000001 99 99 89 99 0,265762 0,293543 Arcella sp. 0,007844 0,003351 99 98 0,2432 Gimnamebas 0,0153 medianas 99 0,2639 Gimnamebas 0,0083 pequeñas 99 0,2045 Gimnamebas 0,0423 grandes 99

-0,3190 -0,45408 0,2388 0,3961 0,0071 0,000002 0,0251 0,0001 88 70 99 88 0,2459 0,0209 88 0,3703 0,0004 88 0,2895 0,0151 70

4.6.3. Protozoos ameboideos más relevantes

Tal y como se ha realizado con los flagelados, únicamente se ha estudiado con más detalle las amebas con un papel bioindicador más relevante. En este caso han sido las tecamebas y en particular el género Euglypha. 65

% DQO eliminada

Fósforo total

N total

DBO5

DQO

MES

4.6.3.1. Euglypha Este género de tecamebas está asociado a cargas másicas de moderadas a bajas y edades del fango elevadas, indicando también presencia de procesos de nitrificación en el sistema (Canler te al, 1999). En este estudio, este género de tecameba ha presentado diferencias significativas entre los sistemas de tratamiento convencionales y los sistemas de eliminación de nutrientes según el análisis de Kruskal-Wallis (tabla 4.26). Ha sido más abundante en los sistemas de eliminación de nutrientes (tabla 4.27.), puesto que como ya se ha comentado, está asociada a procesos de nitrificación.

Tabla 4.26. Resultados del análisis de Kruskal-Wallis, donde H: estadístico de Kruskal-Wallis, g.l.: grados de libertad y p: probabilidad. H 9,94 g.l. 1 p 0,0016

Euglypha sp.

Tabla 4.27. Resultados de la prueba de Kruskal Wallis con los rangos promedio para los dos tipos de tratamiento, donde n: número de casos. Rango promedio 62,86 44,81

Tratamiento Eliminación de nutrientes Euglypha sp. Convencional

N 51 55

4.6.3.2. Tecamebas grandes En general, las tecamebas están asociadas a efluentes con baja DBO5, baja concentración de amonio, baja carga másica y buena oxigenación, es decir, a procesos de nitrificación. A partir de estos supuestos, se ha analizado si se ve alguna relación entre la frecuencia de aparición de las tecamebas y la concentración de amonio del efluente. En la tabla 4.28 se puede observar que la frecuencia de aparición de tecamebas de tamaño grande más elevada se da cuando las concentraciones de amonio del efluente son más bajas. Además, también se observa que las abundancias más elevadas de tecamebas han aparecido con concentraciones de amonio en el efluente menores de 5 mg/l. En cambio, todo y que también han aparecido en concentraciones más elevadas de amonio, se puede ver que lo han hecho con una abundancia baja.

66

Tabla 4.28. Frecuencias de aparición del total de tecamebas de tamaño grande con diferentes abundancias según diversos rangos de concentración de nitrógeno amoniacal del efluente.

Tecamebas de tamaño gran (ind/ml) 4000-5000 3000-4000 2000-3000 1000-2000 0-1000 1 1 4 29
5-10 0-5

2
10-15

3
15-20 20-25

2

Amonio del efluente (mg/l)

4.7. COMUNITADES DE PROTOZOOS CILIADOS

Los protozoos ciliados son muy importantes en los sistemas de depuración por fangos activos puesto que contribuyen a la clarificación del efluente mediante la depredación y induciendo la floculación (Curds et. al., 1968 y Curds, 1992). Además, ha sido uno de los grupos más estudiados dentro de este hábitat y más utilizado como indicadores del funcionamiento del proceso de depuración.
4.7.1. Clasificación de los protozoos ciliados

En total se han identificado 58 especies de protozoos ciliados que han sido clasificadas según la clasificación taxonómica propuesta por Lynn y Small (2000) (ver clasificación en el anejo). Se ha calculado la abundancia media, en individuos/ml, y la desviación estándar, así como la frecuencia de aparición (tabla 4.29.) de las diferentes especies de protozoos ciliados encontrados. En esta tabla sólo se muestran aquellas especies que han tenido una frecuencia de aparición superior al 10%. La tabla completa con los resultados se encuentra en el anejo. Como se puede observar en la tabla 4.29 las especies más abundantes han sido Aspidisca cicada y Vorticella aquadulcis, seguidas de Carchesium polypinum, Vorticella convallaria, Acineria uncinata y Trochilia minuta. Si miramos las especies que han aparecido en un mayor número de muestras vemos que la mayoría coinciden con las más

67

abundantes, Vorticella aquadulcis, Aspidisca cicada, Acineria uncinata, Vorticella convallaria, Carchesium polypinum y Thigmogaster oppositevacuolatus.
Tabla 4.29. Abundancias, expresadas en ind/ml, y frecuencias de aparición de las especies de protozoos ciliados que han presentado una frecuencia de aparición superior al 10% y de los grupos ecológicos, donde X: media, Desv. std: desviación estándar y %: frecuencia de aparición.

Acineria uncinata Acineta tuberosa Aspidisca cicada Aspidisca lynceus Calyptotricha lanuginosa Carchesium polypinum Cinetochilum margaritaceum Coleps hirtus Epistylis coronata Epistylis entzii Epistylis plicatilis Epistylis sp Euplotes affinis Litonotus lamella Litonotus varsaviensis Opercularia articulata Plagiocampa rouxi Pseudochilodonopsis fluviatilis Thigmogaster oppositevacuolatus Thuricola kellicottiana Tokophrya quadripartita Trochilia minuta Uronema nigricans Vorticella aquadulcis Vorticella convallaria Libre depredador Libre bacterívoro Reptante depredador Reptante bacterívoro Sésil depredador Sésil bacterívoro Parásito

X 428,68 24,15 2034,34 293,58 21,13 536,75 44,15 49,81 99,25 295,85 192,74 183,77 170,19 78,87 6,04 304,53 76,60 48,68 256,23 96,60 7,92 379,62 18,49 1065,28 504,57 215,85 75,09 428,68 3416,23 48,68 3362,45 2,64

Desv. std 1024,91 64,83 5155,43 1969,82 97,87 1617,67 627,59 522,41 878,42 3140,92 925,59 1842,42 812,88 612,58 27,50 4872,69 501,64 195,84 1570,93 564,53 30,72 1811,60 252,09 2033,12 1551,13 463,91 292,52 886,40 5346,18 67,16 3729,76 16,81

% 66,04 25,47 71,70 23,58 16,98 41,51 12,26 13,21 15,09 15,09 19,81 13,21 33,02 21,70 10,38 14,15 23,58 27,36 35,85 16,04 12,26 31,13 11,32 74,53 52,83 56,60 27,36 66,04 90,57 51,89 98,11 3,77

4.7.2. Grupos ecológicos de los ciliados

Para poder evaluar el papel ecológico de los protozoos ciliados dentro los sistemas de depuración urbanos e industriales se han agrupado las diferentes especies estudiadas según

68

sus características ecológicas de afinidad al sustrato y según su estrategia alimentaria a partir de Madoni (1994) y Foissner y Berger (1996). El grupo más abundante, ha sido el de protozoos ciliados reptantes bacterívoros (tabla 4.29). El siguiente grupo más abundante corresponde a los sésiles bacterívoros, cosa que concuerda con Madoni (1994) que explica que estos dos grupos suelen ser co-dominantes en los fangos activos debido a que al tener diferentes tipos de alimentación (los reptantes se alimentan básicamente de bacterias floculantes y los sésiles de bacterias libres) no compiten entre ellos. Se puede destacar la baja abundancia y frecuencia de aparición del grupo de los libres nadadores bacterívoros, los cuales suelen proliferar cuando hay elevadas concentraciones de bacterias dispersas (Madoni, 1994), cosa que como ya se ha comentado, indica que el sistema sufre una cierta desestabilización o está afectado por algún tipo de perturbación.
4.7.3. Relaciones entre los protozoos ciliados y los parámetros físico-químicos

Con las especies de protozoos ciliados que han presentado una frecuencia superior al 10% y los grupos ecológicos, se han determinado las relaciones existentes con los parámetros físico-químicos y operacionales del proceso, utilizando el coeficiente de correlación de Spearman. De las correlacionas obtenidas se puede destacar la correlación positiva entre la especie Opercularia articulata y la eliminación de nitrógeno, coincidiendo con la asociación de esta especie con procesos de nitrificación por algunos autores (Foissner y Berger, 1996). También se han observado correlaciones positivas entre la especie Litonotus varsaviensis y los parámetros indicadores de la calidad del efluente como la DBO5, la DQO y la materia en suspensión, indicando que este especie está asociada a una calidad del efluente deficiente. La especie Cinetochilum margaritaceum ha presentado correlación positiva con los nitratos y nitritos del efluente así como negativa con la eliminación de nitrógeno, cosa que podría indicar que esta especie no está relacionada con la presencia de procesos de nitrificación, en contra de lo expuesto en la bibliografía, ya que esta especie se asocia a procesos de nitrificación (Isac et. al., 2005).

69

Tabla 4.30. Coeficientes de correlación de Spearman (p<0,05) entre las especies y grupos ecológicos de protozoos ciliados y los parámetros físico-químicos del efluente. En negrita se muestran los coeficientes de correlación con p<0,01. Las casillas en blanco indican falta de correlación. % DBO5 eliminada 0,242 -0,199 0,234 0,220 0,237 0,305 0,395 0,226 0,216 0,388 0,394 0,211 0,287 0,2301 0,367 0,255 0,256 0,212 0,291 0,266 0,219 -0,258 -0,253 0,209 0,345 0,315 0,411 0,302 0,264 0,278 0,200 0,292 -0,256 -0,266 -0,419 -0,222 0,218 0,242 -0,192 -0,255 0,232 0,286 0,219 -0,271 0,405 0,218

Acineria uncinata Aspidisca cicada Aspidisca lynceus Carchesium polypinum Cinetochilum margaritaceum Coleps hirtus Epistylis Plicatilis Euplotes affinis Litonotus lamella Litonotus varsaviensis Opercularia articulata Pseudochilodonopsis fluviatilis Thigmogaster oppositevacuolatus Uronema nigricans Vorticella aquadulcis Vorticella convallaria Total Diversidad Libre depredadores Libre bacterívoros Reptante depredadores Reptante bacterívoros Sésil depredadores Sésil bacterívoros

0,210

0,287 0,257 0,322

0,283 0,236

0,383 0,210

70

% DQO eliminada

Nitratos y nitritos

Conductividad

DBO5

pH

% Eliminación N

N amoniacal

Fósforo

N total

DQO

MES

4.7.4. Especies de protozoos ciliados más relevantes

En este apartado se relacionan las especies de protozoos ciliados con un valor bioindicador más importante con aquellos parámetros con los que están asociados según la bibliografía aunque no se hayan encontrado correlaciones. Por lo tanto, algunas especies como Acineria uncinata y Aspidisca cicada, aunque han sido de las especies más abundantes y frecuentes, no se comentan debido a que aparecen en amplios rangos de calidades del efluente (Poole, 1984), siendo muy frecuentes en sistemas de depuración (Curds y Cockburn, 1970), y encontrándose tanto en aguas urbanas como industriales, por lo tanto, no se consideran buenas indicadoras del proceso de depuración. 4.7.4.1. Opercularia articulata El género Opercularia generalmente está asociado a fangos de calidad deficiente, a la presencia de vertidos industriales y a bajas concentraciones de oxígeno disuelto (Isac et. al. 2005., y Sangüesa et. al., 2007). Dentro de este género algunos autores diferencian la especie Opercularia articulata de otras especies de Opercularia de tamaño pequeño, asociadas a estas condiciones, y la asocian a calidades del efluente elevadas, a bajas cargas másicas y a presencia de procesos de nitrificación (Foissner y Berger, 1996). En nuestro estudio se ha correlacionado positivamente con el rendimiento de eliminación de nitrógeno. Además, mediante la prueba de Kruskal Wallis se ha determinado que Opercularia articulata presenta diferencias significativas respecto su aparición en plantas depuradoras convencionales frente a plantas diseñadas para eliminar nutrientes (tabla 4.31). En la tabla 4.32. se puede observar que el rango promedio de esta especie de protozoo ciliado ha sido más elevado en las depuradoras con tratamiento de eliminación de nutrientes.
Tabla 4.31. Resultados del análisis de Kruskal-Wallis, donde H: estadístico de Kruskal-Wallis, g.l.: grados de libertad y p: probabilidad.

H Opercularia articulata 3,909

g.l. 1

p 0,048

71

Tabla 4.32. Resultados de la prueba de Kruskal Wallis con los rangos promedio para cada variable, donde n: número de casos.

Tratamiento n Rango promedio Eliminación de nutrientes 51 57,21 Opercularia articulata Convencional 55 50,05 4.7.4.2. Vorticella aquadulcis-complejo Es una especie sésil, adherida a los flóculos mediante el pedúnculo contráctil, y se alimenta de bacterias dispersas (Foissner y Berger, 1996). Con respecto a su papel bioindicador, es característica de sistemas que operan con cargas másicas de moderadas a bajas, así como en edades de fango elevadas. También es indicadora de buena calidad del efluente. Aunque no se ha obtenido una correlación positiva entre esta especie y la eliminación de DBO5, se ha estudiado su frecuencia de aparición por rangos a ver si existe alguna relación con la calidad del efluente. En la tabla 4.33. se puede observar que la frecuencia de aparición más elevada de esta especie se da cuando el porcentaje de eliminación de DBO5 es del 95 al 100%. Además, también se observa que las mayores abundancias también aparecen con elevados rendimientos de eliminación de materia orgánica.
Tabla 4.33. Frecuencias de aparición de la especie Vorticella aquadulcis a partir de diversas abundancias y diferentes rangos del porcentaje de eliminación de DBO5.

Vorticella aquadulcis (ind/ml) 10000-11000 9000-10000 8000-9000 7000-8000 6000-7000 5000-6000 4000-5000 3000-4000 2000-3000 1000-2000 0-1000
70-75

1 1 1 1 2 1 2 10 26
95-100

2 1
75-80 80-85

1
85-90

4
90-95

5 4

% Eliminación DBO5

72

4.7.4.3. Vorticella convallaria-complejo Se trata de un protozoo ciliado sésil y su alimentación es básicamente bacterívora (Curds, 1982). Su presencia está asociada a efluentes de buena calidad (Curds, 1982) y a concentraciones adecuadas de oxígeno disuelto (Madoni y Antonietti 1984). Tal y como se ha realizado con V. aquadulcis, también se ha estudiado la frecuencia de aparición de V. convallaria con diversos rangos de porcentajes de eliminación de DBO5 para ver si existe alguna relación con la calidad del efluente. Así, se observa en la tabla 4.34, que la mayor frecuencia de aparición de esta especie se da cuando el porcentaje de eliminación de DBO5 es elevado, entre el 95 y el 100%. Además, también se puede observar que las mayores abundancias también aparecen con elevados rendimientos de eliminación de materia orgánica.
Tabla 4.34. Frecuencias de aparición de la especie Vorticella convallaria a partir de diversas abundancias y diferentes rangos del porcentaje de eliminación de DBO5.

Vorticella convallaria (ind/ml) 8000-9000 7000-8000 6000-7000 5000-6000 4000-5000 3000-4000 2000-3000 1000-2000 0-1000 1
65-70 70-75 75-80 80-85

1 1 2 1 1
85-90

3
90-95

1 8

3 3 22
95-100

% Eliminación de DBO5
4.7.5. Diversidad específica de los protozoos ciliados

El índice de diversidad de Shannon-Weaver se ha utilizado para estudiar las comunidades de protozoos. Se considera que la diversidad es baja en comunidades inestables o bajo condiciones ambientales muy fluctuantes (Margalef, 1977). También cuando domina una especie o grupo, normalmente debido a la existencia de algún factor limitante que impide el desarrollo de otras especies. En cambio, la microfauna de un sistema que funciona correctamente, está muy diversificada (Madoni, 1994).

73

En este estudio han predominado las muestras cono una diversidad de ciliados entre moderada y elevada (tabla 4.35), cosa que indica un funcionamiento bastante bueno del sistema y, por lo tanto, que se encuentra más estructurado, presentando una mayor capacidad de asumir cambios en las condiciones del sistema.
Tabla 4.35. Diversidades medias, expresadas en bits/ind, y frecuencias de aparición de los rangos de diversidad de los protozoos ciliados, donde n: número de muestras, X: media, Desv. std: desviación estándar y %: frecuencia de aparición.

Diversidad Baja (0-1 bits/ind) Moderada (1-2 bits/ind) Elevada (2-3 bits/ind) Muy elevada (>3 bits/ind)

n 8 44 53 1

X 0,72 1,54 2,38 3,17

Desv. std 0,265 0,292 0,276 ---

% 7,547 41,50 50 0,943

La diversidad específica de ciliados ha presentado correlacionas positivas con el pH y la conductividad (tabla 4.30). Además, aunque no haya presentado correlación, se puede deducir una relación con el rendimiento de eliminación de DBO5 (tabla 4.36.), porque como se puede observar, los mayores rendimientos de eliminación de materia orgánica se dan, con mayor frecuencia, cuando la diversidad específica es entre moderada y elevada.
Tabla 4.36. Frecuencias de aparición de los diferentes rangos de la diversidad específica de los ciliados y de los porcentajes de eliminación de DBO5.

% Eliminación de DBO5 90-100 80-90 70-80 60-70
0-1

4 2

32 5 1
1-2

39 3 1
2-3 3-4

1

Diversidad específica (bits/ind)
4.8. COMUNITADES DE METAZOOS

En los fangos activos se pueden encontrar metazoos, aunque generalmente son más abundantes en otros sistemas de depuración mediante cultivo fijo como los filtros percoladores y los biodiscos (Rius, 2003). Los grupos más comunes que habitan los sistemas de depuración por fangos activos son los rotíferos y los nematodos, aunque también se pueden encontrar oligoquetos, gastrotricos y tardígrados (Martínez, 2005).

74

4.8.1. Clasificación de los metazoos

En este estudio todos los tipos de metazoos encontrados se determinaron a nivel de filum. La clasificación taxonómica utilizada ha sido la de Brusca y Brusca (1990) (ver clasificación en el anejo). Como se observa en la tabla 4.37, el grupo de metazoos más abundante y más frecuente ha sido el de los rotíferos, y el siguiente grupo de metazoos tanto en abundancia como en frecuencia ha sido el de los nematodos, coincidiendo con la bibliografía. También se observaron gastrotricos y tardígrados en las muestras analizadas, pero en una abundancia, y sobre todo frecuencia, bastante baja.
Tabla 4.37. Abundancias, expresadas en ind /ml, y porcentajes de aparición de los diferentes grupos de metazoos encontrados en las muestras, donde X: media, Desv. std: desviación estándar y %: frecuencia de aparición.

Gastrotricos Nematodos Rotíferos Tardígrados

X 3,40 14,72 181,70 12,83

Des std 34,97 27,78 319,07 59,08

% 0,94 27,36 66,98 8,49

4.8.2. Relaciones entre los metazoos y los parámetros operacionales del proceso

Se han determinado las relaciones existentes entre los diversos grupos de metazoos y los parámetros físico-químicos y operacionales del proceso, utilizando el coeficiente de correlación de Spearman. En cuanto a los coeficientes encontrados se puede destacar el coeficiente de correlación positivo entre los rotíferos y el rendimiento de eliminación de DBO5 (tabla 4.38.), cosa que coincide con otros autores, que describen la presencia de rotíferos en sistemas altamente estabilizados y con eficiencias de eliminación de DBO5 superiores al 93-95% (Mc Kinney, 1967; Klimowicz, 1970).

75

Tabla 4.38. Coeficientes de correlación de Spearman (p<0,05) entre los parámetros físico-químicos del afluente y los diversos grupos de metazoos. El primer valor corresponde al coeficiente de correlación, el segundo a la probabilidad, y el tercero al número de casos. En negrita se muestran los coeficientes de correlación con p<0,01. Las casillas en blanco indican falta de correlación.

% DBO5 eliminada

Nitratos y nitritos

0,3628 0,2544 -0,244 0,244 0,3607 0,0005 0,0161 0,0235 0,0217 0,0100 89 86 88 50 86 -0,217 Nematodos 0,0443 86

Rotíferos

4.8.3. Metazoos más relevantes

4.8.3.1. Rotíferos Los rotíferos son organismos muy frecuentes en sistemas de depuración de aguas residuales, lo que coincide con los resultados obtenidos. Los géneros más comunes son Lecane, que puede fragmentar los flóculos y alimentarse de las bacterias floculantes, y Philodina, que se alimenta filtrando las bacterias dispersas y/o de materia orgánica particulada (Doohan, 1975). El mucus contenido en sus excreciones también contribuye a la formación de flóculos (Calaway, 1968). Como los protozoos, son organismos aerobios estrictos, y en general se asocian a edades del fango elevadas. Su presencia generalmente indica fangos establos y cantidades de oxígeno disuelto elevadas (Martínez, 2006). Se ha analizado la frecuencia de aparición de los rotíferos con el rendimiento de eliminación de DBO5, puesto que, como se ha comentado, en la bibliografía se describe que están asociados a sistemas altamente estabilizados y con eficiencias de eliminación de DBO5 elevadas y en este estudio, se confirma la correlación positiva existente entre estos metazoos y este parámetro.

% Eliminación N

Conductividad

DQO

76

De los resultados obtenidos, se puede destacar que la gran mayoría de los rotíferos han aparecido con porcentajes de eliminación de materia orgánica elevados (del 95 al 100%), aunque la mayor frecuencia haya sido con abundancias bajas (tabla 4.39.). Así y todo, las abundancias encontradas más elevadas han sido también con los porcentajes de eliminación de materia orgánica más elevados.

Tabla 4.39. Frecuencias de aparición de los metazoos del grupo de los rotíferos con diferentes abundancias según diversos rangos de eliminación de DBO5.

Rotíferos (ind/ml) 1600-2000 1200-1600 800-1200 400-800 0-400
80-85

2 2 1
85-90 90-95

2

1 1 7
95-100

1 5 34

% eliminación DBO5

4.9. PROBLEMAS DE FUNCIONAMENTO 4.9.1. Bulking filamentoso

El porcentaje de muestras que presentaban bulking filamentoso se determinó teniendo en cuenta la concentración total de microorganismos filamentosos, considerando que es susceptible de producirse un episodio de bulking filamentoso cuando esta concentración supera los 200 m/ml (Salvadó, 1990). Hay que comentar que no se han podido comparar con los valores de IVF, el cual a partir de 150-200 ml/g también indica probabilidad de producirse bulking filamentoso (Jenkins, 1993) debido a que no se disponía de estos datos. El porcentaje de muestras que eran susceptibles de tener problemas de esponjamiento del fango (con más de 200 m/ml de microorganismos filamentosos) ha sido del 55 %, cosa que indica que un poco más de la mitad de las muestras eran susceptibles de tener problemas de separación líquido-sólido debido a bulking filamentoso. También se han determinado los principales microorganismos filamentosos que han producido este bulking en las depuradoras estudiadas (tabla 4.40.). En general se puede

77

observar que los microorganismos filamentosos con mayor porcentaje de generar bulking filamentoso, con casi un 26 %, han sido Microthrix parvicella y el Tipo 1851. Recordemos que el microorganismo filamentoso M. parvicella ha sido el más abundante en las muestras estudiadas y el Tipo 1851, el segundo más abundante y frecuente.
Tabla 4.40. Porcentajes de aparición de los microorganismos que han producido problemas de bulking filamentoso y espumas en les muestras estudiadas.

Microorganismo filamentoso Actinomicetos nocardioformes Microthrix parvicella Tipo 0092 Tipo 021N Tipo 0961 Tipo 1851

Bulking 17,24 25,86 5,17 24,13 1,72 25,86

Espumas 61,82 27,27 10,91 -------

Mediante el análisis de Kruskal-Wallis se ha determinado si había diferencias en los parámetros de calidad del efluente (DBO5, DQO y MES) entre las muestras que presentaban problemas de bulking filamentoso a partir de la abundancia total de filamentos y las que no. Como se puede observar a la tabla 4.41, estos parámetros no han presentado diferencias significativas dependiendo de si las muestras presentaban una abundancia de filamentos total superior o inferior a 200 m/ml.
Tabla 4.41. Resultados del análisis Kruskal-Wallis, donde H: estadístico de Kruskal-Wallis, g.l.: grados de libertad y p: probabilidad.

DBO5 DQO MES

H 1,636 1 0,2007

g.l. 0,229 1 0,632

p 0,058 1 0,808

Se han analizado las frecuencias de aparición de la suma total de filamentos por rangos de abundancias y rangos de concentración de materias en suspensión del efluente (Tabla 4.42.). Como se puede observar, de las muestras que superan los 35 mg/l permitidos por la Directiva 91/271/CEE, sólo dos han presentado una concentración de microorganismos filamentosos superior a 200 m/ml. La gran mayoría de muestras, aunque tenían una elevada abundancia de filamentos, cumplían con el valor de la Directiva (tabla 4.42.), cosa que se atribuye a qué las medidas que se toman en los decantadores secundarios para evitar el escape de sólidos y los sistemas para eliminar flotantes funcionan incluso cuando la

78

concentración de filamentos es muy elevada y susceptible de producir problemas graves de separación sólido-líquido y de escapes de sólidos con el agua de salida.
Tabla 4.42. Frecuencias según diversas abundancias del total de microorganismos filamentosos según diversos rangos de concentración de materia en suspensión del efluente

Microorganismos filamentosos totales (m/ml) 1400-1600 1200-1400 1000-1200 800-1000 600-800 400-600 200-400 0-200 1 1 1 4 2 11 32 42
35-50 0-35

1 1 1
50-100

2
100-150 150-200

MES (mg/l)
4.9.2. Foaming

Para determinar el porcentaje de muestras que presentaban problemas de foaming, se utilizó la referencia de Salvadó (1990b) para el grupo de los actinomicetos nocardioformes, la cual considera que concentraciones de actinomicetos nocardioformes superiores a los 50 m/ml son susceptibles de producir espumas. También se ha considerado, a partir de las observaciones realizadas, al no haber ninguna referencia bibliográfica, que Microthrix parvicella puede producir espumas a partir de concentraciones de 200 m/ml. Se ha considerado que ninguna muestra ha presentado espumas producidas por el microorganismo filamentoso Tipo 1863, puesto que ninguna muestra ha presentado concentraciones elevadas de este microorganismo. En cambio, para el Tipo 0092, para el que tampoco hay ninguna referencia bibliográfica de la concentración a la cual puede producir espumas, se observaron cuatro muestras con una elevada concentración de este filamento y que además, presentaban espumas. Se ha considerado que las espumas estaban producidas por el filamento Tipo 0092, puesto que la concentración de otros microorganismos filamentosos como Microthrix parvicella o el grupo de los actinomicetos nocardioformes era muy baja, y además, porque al observar las espumas se observó una abundancia elevada de este filamento. Las concentraciones del

79

filamento en estas muestras fue de 143,0 m/ml, 146,2 m/ml, 144,0 m/ml y 460,0 m/ml y 478,0 m/ml; por lo tanto, se podría considerar que el microorganismo filamentoso Tipo 0092 es susceptible de producir espumas cuando se encuentra en concentraciones a partir de aproximadamente 150 m/ml. Casi en la mitad de las muestras, exactamente en un 42 %, los microorganismos filamentosos presentes eran susceptibles de generar espumas en el sistema. De estas muestras, más de la mitad, casi un 62 %, eran producidas por el grupo de los actinomicetos nocardioformes (tabla 4.40). Este resultado coincide con el encontrado por Jenkins et. al. (1993), dónde este microorganismo filamentoso es el más observado en sistemas con espumas en los Estados Unidos. Además, hay siete muestras dónde las espumas eran producidas por este filamento juntamente con Microthrix parvicella, el cual ha presentado abundancias susceptibles de generar espumas en el 27 % de las muestras de sistemas con problemas de flotantes. Como ocurre con el problema del esponjamiento del fango, no se han observado diferencias significativas en los parámetros indicadores de la calidad del efluente entre las muestras que presentaban una abundancia de actinomicetos nocardioformes superior a 50 m/ml y las que presentaban una abundancia inferior a 50 m/ml (tabla 4.43). Esto se atribuye a qué los sistemas estudiados están preparados para evitar el escape de sólidos causados por la formación de espumas biológicas (placas deflectoras, sistemas de eliminación de flotantes, etc.).
Tabla 4.43. Resultados del análisis Kruskal-Wallis, donde H: estadístico de Kruskal-Wallis, g.l.: grados de libertad y p: probabilidad.

DBO5 DQO MES

H 0,049 1 0,825

g.l. 0,644 1 0,422

p 0,496 1 0,481

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5. CONCLUSIONES
-

El agua residual de entrada a las depuradoras estudiadas se puede clasificar como un agua residual de carga media según Metcalf y Eddy (1995). La relación DBO5/DQO, que indica la biodegradabilidad del agua de entrada, se encuentra, en la mayoría de muestras, dentro de los intervalos típicos de las aguas residuales urbanas.

-

La relación DBO5/N/P se encuentra dentro del intervalo típico de 100:5:1 (Jenkins et. al., 1993) para todas las muestras observadas, por lo tanto, las aguas residuales de las plantas depuradoras estudiadas no sufren de problemas causados por deficiencias de nutrientes.

-

Los valores de DBO5, DQO y MES del efluente han sido mayoritariamente inferiores a los límites de vertido establecidos por la Directiva 91/271/CEE. Los parámetros de concentración de nutrientes (nitrógeno y fósforo) del efluente, la eliminación de nitrógeno y la eliminación de DQO presentan diferencias significativas entre las depuradoras con tratamiento convencional y las depuradoras con tratamiento de eliminación de nutrientes, siendo más bajos en estas últimas.

-

Los valores de nitrógeno y fósforo del efluente para las depuradoras con tratamiento de eliminación de nutrientes han sido, mayoritariamente, inferiores a los límites de la Directiva 91/271/CEE, aunque se han observado bastantes muestras que no los cumplían.

-

Casi la mitad de las muestras presentaron flóculos de tamaño mediano pero con una abundancia de microorganismos filamentosos muy elevada. Además, se determinó que el tamaño de los flóculos no dependen únicamente de la abundancia de microorganismos filamentosos.

-

Más de la mitad de las muestras analizadas han presentado una concentración de flóculos elevada, presentando cierta relación con los sólidos en suspensión del licor mezcla (SSLM).

-

La gran mayoría de muestras han presentado una concentración baja de bacterias dispersas. La presencia de bacterias helicoidales, especialmente de espiroquetas, ha sido bastante elevada, aunque el porcentaje de muestras con una abundancia elevada ha sido sólo del 15 % en el caso de las espiroquetas.

81

-

No se ha observado ninguna muestra con presencia masiva de la bacteria Zoogloea spp., y sólo un 2% de las muestras analizadas han presentado bacterias GAO y/o PAO en una concentración moderada, lo que seguramente es debido a que, como ya se ha comentado, el agua de entrada de estas depuradoras no ha presentado deficiencia de nutrientes.

-

El microorganismo filamentoso más abundante ha sido Microthrix parvicella, mientras que el más frecuente el del grupo de los actinomicetos nocardioformes. Aunque no se han observado correlaciones entre los microorganismos Microthrix parvicella y el grupo de los actinomicetos nocardioformes con la concentración de aceites y grasas del afluente, se ha observado que hay cierta relación principalmente con concentraciones de aceites y grasas de hasta 20 mg/l.

-

El microorganismos filamentoso Tipo 021N ha sido más abundante en las depuradoras con tratamiento convencional, coincidiendo con Eikelboom (2000), puesto que se trata de un microorganismos aeróbico estricto, y en las depuradoras con eliminación de nutrientes tienen zonas anaeróbicas y zonas anóxicas. También se ha observado cierta relación con la biodegradabilidad del agua de entrada, apareciendo principalmente cuando el agua de entrada es entre biodegradable y muy biodegradable.

-

Los flagelados de tamaño pequeño del grupo de los bodónidos se pueden asociar a un efluente de mala calidad, mientras que el grupo de los coanoflagelados, tal y como indica la bibliografía, a buenas calidades del efluente, observándose en nuestras caso, cierta relación con la eliminación de DBO5.

-

Se ha observado que las tecamebas de tamaño grande, y especialmente la tecameba Euglypha sp, aparecen asociadas a la presencia de procesos de nitrificación, debido a que se correlacionan negativamente con la concentración de amonio del efluente.

-

Entre las especies más frecuentes y abundantes observadas se encuentran Aspidisca cicada y Acineria uncinata, las cuales son muy frecuentes en sistemas de depuración (Curds y Cockburn, 1970) debido a que aparecen en amplios rangos de calidades del efluente (Poole, 1984), por lo tanto, no se han considerado buenas indicadoras del proceso de depuración.

-

Destaca la correlación positiva obtenida entre la especie Opercularia articulata y el rendimiento de eliminación de nitrógeno así como la diferencia de abundancias entre los dos tipos de tratamientos analizados, siendo superior en los de eliminación de nutrientes. Esta asociación no coincide con el resto de especies correspondientes 82

a este género, que se asocian a fangos de calidad deficiente, a la presencia de vertidos industriales y a bajas concentraciones de oxígeno disuelto (Isac et. al. 2005., y Sangüesa et. al., 2007).
-

Han predominado las muestras con una diversidad de ciliados entre moderada y elevada. Además, se ha observado que la mayoría de muestras con diversidades entre 1 a 3 corresponden a rendimientos de eliminación de DBO5 elevados.

-

El grupo de metazoos más abundante y frecuente en las muestras observadas ha sido el de los rotíferos, seguido por los nematodos. Los rotíferos han presentado correlaciones positivas con los rendimientos de eliminación de DBO5 y de nitrógeno, por lo tanto, se puede decir que están asociados a sistemas con elevados rendimientos de eliminación de materia orgánica y con presencia de nitrificación y, por lo tanto, con una buena calidad del efluente.

-

Casi la mitad de las muestras han sido susceptibles de tener problemas de bulking filamentoso y/o espumas. Los principales microorganismos filamentosos que han generado problemas de esponjamiento del fango han sido Microthrix parvicella, el Tipo 1851 y el Tipo 021N.

-

La gran mayoría de muestras que eran susceptibles de tener problemas de espumas, eran debidas al grupo de los actinomicetos nocardioformes, puesto que les hace falta una abundancia menor que a otros filamentos por poder producir espumas y han sido el filamento más frecuente.

-

A partir de los datos observados, se ha establecido que el Tipo 0092 podría producir espumas a partir de abundancias de 150-200 m/ml. Se ha observado que todavía aunque la mitad de las muestras presentaron una abundancia superior a 200 m/ml de filamentos totales, abundancia a partir de la cual se considera susceptible de producirse bulking filamentoso (Salvadó, 1990), y una abundancia de actinomicetos nocardioformes superior a 50 m/ml, abundancia susceptible de generar espumas (Salvadó, 1990b), la gran mayoría cumplían con los valores límites establecidos por la Directiva 91/271/CEE.

-

De las tres muestras que no cumplían con los valores establecidos por la Directiva europea, se pudo comprobar, gracias al análisis de la estructura del fango, que eran debidas a que el fango presentaba problemas de pin-point floc.

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ANEJO I
Clasificación de los microorganismos

Dominio Eucariota
Reino Protista (Goldfuss, 1818) R. Owen, 1858 Flagelados pequeños (<20 µm) Filum Euglenozoa Cavalier-Smith, 1981 Clase Kinetoplastida (Honigberg, 1963) Margulis, 1974 Orden Kinetoplastea Honigberg, 1963 Suborden Bodonida Hollande, 1952 Familia Bodonidae Bütschli, 1887 Filum Neomonada Cavalier-Smith, 1997 Classe Choanoflagellata Kent, 1880 Filum Opalozoa Cavalier-Smith, 1991 Orden Bicosoecales Grassé, 1926 Familia Bicosoecaceae Stein, 1878 Bicosoeca Filum Metamonada Cavalier-Smith, 1981 Clase Trepomonadea Cavalier-Smith, 1993 Orden Distomatida Klebs, 1892 Familia Hexamitidae Hexamita Dujardin, 1838 Trepomonas Dujardin, 1841 Flagelados grandes (>20 µm) Filum Euglenozoa Cavalier-Smith, 1981 Clase Euglenoidea Bütschli, 1884 Orden Peranemida Bütschli, 1884 Peranema sp Dujardin, 1841 Entosiphon sp Stein, 1878 Orden Petalomonadida Cavalier-Smith, 1993 Petalomonas Stein, 1859

Gimnamebas Gimnamebas de tamaño pequeño (< 20 µm) Gimnamebas de tamaño mediano (20-50 µm) Gimnamebas de tamaño grande (>50 µm) Tescamebas Filum Cercozoa Cavalier-Smith, 1998 Clase Imbricatea Cavalier-Smith i Chao, 2003 Orden Euglyphida Copeland, 1956 Familia Euglyphidae Wallich, 1864 Euglypha Dujardin, 1841 Familia Trinematidae Hoogenraad & de Groot, 1940 Trinema Dujardin, 1841 Filum Amoebozoa Corlis, 1984 Clase Tubulinea Smirnov et al., 2005 Orden Arcellinida (Kent, 1880) Familia Arcellidae Ehrenberg, 1843 Arcella Ehrenberg, 1832

Familia Centropyxidae Jung, 1942 Centropyxis Stein, 1857 Familia Cryptodifflugiidae Jung, 1942 Cryptodifflugia Penard, 1890

Filum Ciliophora Doflein, 1901. Subfilum Postciliodesmatophora Gerassimova i Seravin, 1976 Clase Heterotrichea Stein, 1859 Orden Heterotrichida Stein, 1859 Familia Stentoridae Carus, 1863 Stentor muelleri Ehrenberg, 1831 Familia Blepharismidae Jankowski en Small y Lynn, 1985 Blepharisma undulans Stein, 1868 Subfilum Intramacronucleata Lynn, 1996 Clase Spirotrichea Bütschlii, 1889 Subclase Hypotrichia Stein, 1859 Orden Euplotida Ehrenberg, 1838 Familia Euplotidae Small i Lynn, 1985 Euplotes affinis, Dujardin, 1842 Familia Aspidiscidae Ehrenberg, 1838 Aspidisca cicada (Müller, 1786) Claparède y Lachmann, 1958 Aspidisca lynceus (Müller, 1773) Ehrenberg, 1830 Aspidisca lynceus var. turrita (Ehrenberg, 1831) Claparède i Lachmann, 1958 Subclase Stichotrichia Small i Lynn, 1985 Orden Stichotrichida Faurè-Fremiet, 1961 Familia Spirofilidae Von Gelei, 1929 Chaetospira muelleri Lachmann, 1856 Clase Litostomatea Small i Lynn, 1981 Subclase Haptoria Corliss, 1974 Orden Haptorida Corliss, 1974 Familia Spathiidae Kahl in Doflein & Reichenow, 1929 Spathidium sp. Dujardin, 1841 Orden Pleurostomatida Schewiakoff, 1896 Familia Litonotidae Kent, 1882 Litonotus lamella (Ehrenberg) Schewiakoff, 1896 Litonotus varsaviensis (Wrzesniomski, 1866) Acineria uncinata Tucolesco, 1962 Clase Phyllopharyngea Puytorac et al., 1974 Subclase Phyllopharyngia Puytorac et al., 1974 Orden Chlamydodontina Deroux, 1976 Familia Chilodonellidae Deroux, 1970 Chilodonella uncinata (Ehrenberg, 1838) Strand, 1928 Thigmogaster oppositevacuolatus Augustin y Foissner, 1989 Thigmogaster potamophilus Pseudochilodonopsis fluviatilis Foissner, 1988 Pseduchilodonopsis piscatoris (Blochmann, 1895) Foissner, 1979 Trithigmostoma cucullulus (Müller, 1786) Jankoswki, 1967 Trithigmostoma steini (Blochmann, 1895) Foissner, 1987

Orden Disteriida Deroux, 1976 Familia Diisteridae Claparède i Lachmann, 1858 Trochilia minuta (ROUX, 1899) Kahl, 1931 Subclase Suctoria Claparède i Lachmann, 1858 Orden Exogenida Collin, 1912 Familia Podophrydae Haeckel, 1866 Podophrya sp. Ehrenberg, 1838 Familia Metacinetidae Bütschli, 1889 Metacineta mystacina (Ehrenberg, 1831) Bütschli, 1889 Orden Endogenida Collin, 1912 Familia Acinetidae Stein, 1859 Acineta tuberosa (Pallas, 1766) Ehrenberg, 1833 Familia Tokophrydae Jankowski in Small & Lynn, 1985 Tokophrya infusionum (Stein, 1859), Büetschli, 1889 Tokophrya lemnarum (Stein, 1859), Entz, 1903 Tokophrya quadripartita (Claparède y Lachmann, Büetschli, 1889 Familia Endosphaeridae Jankowski in Corliss, 1979 Endosphaera sp. Engelmann, 1876 Clase Nassophorea Small i Lynn, 1981 Orden Microthoracida Jankowski, 1967 Familia Microthoracidae Wrzesniowski, 1870 Microthorax pusillus Engelmann, 1861 Microthorax costatus Kahl, 1926 Drepanomonas revoluta Penard, 1922 Trochiliopsis opaca Penard, 1922 Clase Prostomatea Schewiakoff, 1896 Orden Prorodontina Corliss, 1974 Familia Plagiocampidae Kahl, 1926 Plagiocampa rouxi Kahl, 1926 Familia Colepidae Ehrenberg, 1838 Coleps hirtus (Müller, 1786) Nitzsch, 1827 Familia Holophrydae Perty, 1852 Holophrya discolor Ehrenberg, 1833 Orden Prostomatida Schewiakoff, 1896 Familia Metacystidae Kahl, 1926 Metacystis sp. Cohn, 1866 Clase Olygohymenophorea Puytorac et al., 1974 Subclase Peniculia Corliss, 1956 (Fauré-Fremiet) Orden Peniculida Fauré-Fremiet in Corliss, 1956 Familia Parameciidae Dujardin, 1840 Paramecium putrinum Subclase Scuticociliatia Small, 1967 Orden Philasterida Small, 1967 Familia Cinetochilidae Perty, 1852 Cinetochilum margaritaceum Perty, 1852 Familia Uronometidae Thompson, 1964 Uronema nigricans (Müller, 1786) Florentin, 1901 Orden Pleurostomatida Schewiakoff, 1896 Familia Calyptotrichidae Small i Lynn, 1985

1859)

Calyptotricha lanuginosa Penard, 1922 Familia Cycliidae Ehrenberg, 1838 Cyclidium glaucoma Müller, 1773 Cyclidium heptatrichum Schewiakoff, 1893 Subclase Hymenostomatia Delage i Hérouard, 1896 Orden Hymenostomaida Delage i Hérouard, 1896 Familia Tetrahymenidae Corliss, 1952 Colpidium campylum (=Dexiostoma campylum) (Stokes, 1886) Jankowski, 1967 Tetrahymena pyriformis (Ehrenberg, 1830) Lwoff, 1947 Subclase Peritrichia Steein, 1859 Orden Sessilida Kahl, 1933 Familia Vorticellidae Ehrenberg, 1838 Vorticella aquadulcis-complex Foissner et al., 1992 Vorticella campanula-complex Foissner et al., 1992 Vorticella convallaria-complex Foissner et al., 1992 Vorticella infusionum-complex Foissner et al., 1992 Vorticella microstoma-complex Foissner et al., 1992 Vorticella octava-complex Foissner et al., 1992 Carchesium polypinum Linnaeus, 1758 Familia Operculariidae Fauré-Fremiet in Corliss, 1979 Opercularia articulata Ehrenberg, 1838 Opercularia asymetrica Familia Epistylidae Kahl, 1933 Epistylis entzii Stiller, 1935 Epistylis plicatilis Ehrenberg, 1838 Epistylis chrysemidis Bishop i Jahn, 1941 Epistylis coronata Nusch, 1970 Epistylis sp. Ehrenberg, 1830 Familia Vaginicolidae de Fromentel, 1874 Thuricola kellicottiana (Stokes, 1887) Kahl, 1935 Cothurnia annulata Stokes, 1885 Reino Animal Filum Nematoda (Rudolph, 1808) Lankester, 1877 Filum Rotifera Cuvier, 1791 Filum Gastrotricha Metschnikoff, 1864 Filum Tardigrada (Spallanzani, 1777) Ramazzotti, 1962

ANEJO II
Protocolos de las tinciones

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Coloraciones vitales

La composición del colorante verde de metil-acético es la siguiente: 0,5 g de verde de metileno 1 ml de ácido acético glacial 100 ml de agua destilada Procedimiento: El procedimiento de esta coloración consiste en depositar una gota de verde de metilacético al lado del cubreobjetos, que está encima de la muestra, i con un papel de filtro al otro lado del cubreobjetos se hace entrar el líquido entre el cubreobjetos y el portaobjetos. También se puede realizar añadiendo una gota de verde de metil-acético directamente sobre la muestra en el portaobjetos y cubrirla posteriormente con el cubreobjetos. La muestra teñida se observa en el microscopio con camp claro y a 400x aumentos. Tinción de Gram (Jenkins et al. 1993)

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Reactivos: Solución I: A: 2 g de cristal violeta + 20 ml de etanol 95% B: 0,8 g de oxalato de amonio + 80 ml de oxalato amónico Las soluciones A y B se tienen que mezclar en el momento de su utilización y se han de tirar a las 24 horas de su preparación. Solución II: 1 g de iodo 2 g de ioduro potásico 300 ml de agua destilada Solución III: 10 ml de safranina al 2,5% en etanol 95% 100 ml de agua destilada Procedimiento: Se extienden una o dos gotas de la muestra en un portaobjetos y se dejan secar al aire. Un vez seca la muestra se tiñe con la solución I durante un minuto. Se lava con agua destilada y después se tiñe con la solución II durante un minuto. Se lava de nuevo con agua destilada y seguidamente se decolora con etanol 95% gota a gota durante 25 segundos. Seguidamente se lava con agua destilada y se añade la solución III, dejándola actuar

durante un minuto. Finalmente se lava con agua destilada y se deja secar al aire o suavemente con un papel de filtro. La muestra teñida se observa al microscopio con campo claro, aceite de inmersión directamente sobre la muestra teñida y a 1000x aumentos. Los filamentos Gram positivos se observaran de color azul y los Gram negativos de color rojo-rosa. Tinción Neisser (Jenkins et al. 1993)

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Reactivos: Solución I: A: 0,1 g de azul de metileno + 5 ml de ácido acético glacial + 5 ml de etanol 95% + 100 ml de agua destilada B: 3,3 ml de cristal violeta 10% en etanol 95% + 6,7 ml de etanol 95% + 100 ml de agua destilada Se mezclan dos partes de la solución A con una parte de la solución B. Esta solución tiene que prepararse mensualmente. Solución II: 33,3 ml de Bismark Brown (1 g de Bismark Brown en 100 ml de agua destilada). 66,7 ml de agua destilada. Procedimiento: Se extienden una o dos gotas de la muestra en un portaobjetos y se dejan secar al aire. Un vez seca la muestra se tiñe con la solución I durante 30 segundos. Se lava con agua destilada y después se tiñe con la solución II durante un minuto. Se lava de nuevo con agua destilada y se deja secar al aire o se seca suavemente con un papel de filtro. La muestra teñida se observa al microscopio con campo claro, aceite de inmersión directamente sobre la muestra teñida y a 1000x aumentos. Los filamentos Neisser positivos se observaran de color azul-lila y los Neisser negativos de color marrón o amarillento. Si el tricoma es marrón y presenta gránulos de color lila, el filamento será Neisser negativo con presencia de gránulos Neisser positivos. Tinción de poli-β-hidroxibutirato (PHB) (Jenkins et al. 1993)

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Reactivos: Solución I: 0.33 % (p/v) de Negro de Sudan B (IV) en etanol al 60%. Solución II:

Safranina al 0,5% en solución acuosa. Se extienden una o dos gotas de la muestra en un portaobjetos y se dejan secar al aire. Un vez seca la muestra se tiñe con la solución I durante 10 minutos, añadiendo más colorante si este se evapora. Se lava con agua destilada y después se tiñe con la solución II durante unos 15 segundos. Se lava de nuevo con agua destilada y se deja secar al aire o con papel de filtro. La muestra teñida se observa al microscopio con campo claro, aceite de inmersión directamente sobre la muestra teñida y a 1000x aumentos. Los gránulos de PHB se observan de color negro-azul y el citoplasma celular de color rosa claro o sin teñir. Tinción de vainas (Jenkins et al. 1993)

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Reactivos: 0,1 g de cristal violeta en 100 ml de agua destilada. Procedimiento: Se mezcla una gota de muestra de fango activo con una gota de la solución de cristal de violeta en un portaobjetos. A continuación se coloca un cubreobjetos y se examina al microscopio en campo claro a 1000x aumentos y con aceite de inmersión. Las células sin vaina se tiñen intensamente de color violeta, mientras que las vainas aparecen de color rosa claro. Test de azufre (Jenkins et al. 1993)

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Reactivos: 1 g de tiosulfato sódico (Na2S2O3) en 100 ml de agua destilada. Procedimiento: Se deja decantar la muestra de fangos activos y se traspasan 20 ml del sobrenadante a un matraz Erlenmeyer de 100 ml. Se añaden entre 1 o 2 ml de fango activo al matraz. A continuación se añade 1 ml de la solución de tiosulfato sódico y se deja agitando durante 12 horas a temperatura ambiente y con homogenización constante de la mezcla. Transcurridas las 12 horas se coge una gota de la muestra y se observa al microscopio, bajo un cubreobjetos, en contraste de fases a 1000x aumentos y con aceite de inmersión. Si el resultado es positivo se observan gránulos de azufre, es decir, gránulos intracelulares muy brillantes que hacen iridiscencias amarillentas-rosadas-azulosas.

ANEJO III
Resultados de los análisis

Tabla con los resultados de las abundancias medias en m/ml (X), desviaciones standards (Desv. std.) i frecuencias de aparición de los microorganismos filamentosos para las depuradoras con tratamiento de eliminación de nutrientes y convencional, y para el conjunto total de muestras.

Tratamiento de eliminación de nutrientes X Desv. std % Microorganismos filamentosos Actinomicetos nocardioformes 62,29 82,92 94,12 0,23 0,83 9,80 Beggiatoa Hongos 0,59 2,82 5,88 7,04 24,35 47,06 Haliscomenobacter hydrossis 80,62 163,47 52,94 Microthrix parvicella Nostocoida limicola II 0,94 3,54 13,73 Nostocoida limicola III 0,50 1,22 23,53 1,20 4,11 9,80 Sphaerotilus natans 0,64 4,54 1,96 Streptococcus Thiothrix I 0,21 0,89 5,88 Thiothrix II 0,96 3,80 11,76 Tipo 0041 14,14 26,31 76,47 Tipo 0092 42,28 95,73 45,10 Tipo 021N 41,26 103,19 47,06 Tipo 0581 2,86 11,64 5,88 Tipo 0675 7,37 12,06 50,98 Tipo 0803 0,09 0,53 3,92 Tipo 0914 0,09 0,67 1,96 Tipo 0961 0,4 1,41 9,80 Tipo 1701 0,16 0,75 5,88 Tipo 1851 65,23 99,81 70,59 Tipo 1852 0,09 0,49 3,92 Tipo 1863 0,14 0,57 7,84

Tratamiento convencional X Desv. std % 41,41 71,18 85,45 0,31 1,03 12,73 0,60 2,66 7,27 2,81 4,30 49,09 80,40 236,94 43,64 1,69 8,19 14,55 0,17 0,65 7,27 1,85 6,38 16,36 0,17 0,94 3,64 0,02 0,16 1,82 0,28 1,95 3,64 4,48 6,87 67,27 3,48 20,05 7,27 52,39 83,48 81,82 0 0 0 3,87 10,29 40 0 0 0 0,03 0,24 1,82 13,52 41,17 30,91 0,16 0,87 5,45 50,37 88,42 83,64 0,31 1,70 5,45 0 0 0

X 51,46 0,27 0,59 4,84 80,50 1,33 0,33 1,54 0,40 0,11 0,61 9,13 22,15 47,03 1,38 5,55 0,05 0,06 7,21 0,16 57,52 0,20 0,07

Total Desv. std 77,39 0,94 2,72 17,22 203,95 6,37 0,98 5,40 3,21 0,63 2,99 19,43 70,36 93,20 8,16 11,26 0,37 0,50 30,27 0,81 93,92 1,27 0,40

% 89,62 11,32 6,60 48,11 48,11 14,15 15,09 13,21 2,83 3,77 7,55 71,70 25,47 65,09 2,83 45,28 1,89 1,89 20,75 5,66 77,36 4,72 3,77

Tabla con los resultados de las abundancias medias en ind/ml (X), desviaciones standards (Desv. std.) i frecuencias de aparición de las especies de protozoos flagelados para las depuradoras con tratamiento de eliminación de nutrientes y convencional, y para el conjunto total de muestras.

Protozoos flagelados Flagelados < 20 µm Flagelados < 20 µm (bodónidos) Flagelados < 20 µm (coanoflagelados) Flagelados < 20 µm (coloniales) Flagelados < 20 µm (Bicosoeca) Flagelados < 20 µm (Hexamita) Flagelados < 20 µm (Trepomonas) Flagelados > 20 µm (Entosiphon) Flagelados > 20 µm (Peranema) Flagelados > 20 µm (Petalomonas)

Tratamiento de eliminación de nutrientes Tratamiento convencional Total X Desv. std % X Desv. std % X Desv. std % 118331,24 161052,99 82,35 122811,71 234782,08 90,91 120656,01 201755,54 86,79 31603,65 76964,82 21,57 56033,63 118479,82 38,18 44167,64 100757,65 30,19 2420,73 9080,74 13,73 7482,18 22672,88 21,82 5046,95 17609,55 17,92 0 0 0 4489,31 33293,61 1,82 2329,36 23982,21 0,94 537,94 2312,96 5,88 7111,71 52714,39 3,64 3948,86 37980,77 4,72 134,49 960,45 1,96 0 0 0 64,71 666,20 0,94 2824,16 19212,86 3,92 249,42 1295,79 3,64 1488,21 13353,37 3,77 103,53 289,46 23,53 71,27 333,66 10,91 86,79 312,12 16,98 39,22 110,70 31,37 24 54,21 23,64 31,32 86,06 27,36 22,75 86,63 11,76 0 0 0 10,94 60,86 5,66

Tabla con los resultados de las abundancias medias en ind/ml (X), desviaciones standards (Desv. std.) i frecuencias de aparición de las especies de protozoos ameboideos para las depuradoras con tratamiento de eliminación de nutrientes y convencional, y para el conjunto total de muestras.

Tratamiento de eliminación de nutrientes Tratamiento convencional X Desv. std % X Desv. std % X Protozoos ameboideos Gimnamebas < 20 µm 65944,94 205044,37 72,55 38044,80 80283,45 74,55 51468,45 Gimnamebas entre 20 i 50 µm 998,43 2447,07 80,39 872,73 1573,13 78,18 933,21 Gimnamebas > 20 µm 185,10 487,67 52,94 434,91 735,88 63,64 314,72 Tecamebas < 20 µm (Cryptodifflugia) 1434,49 4288,35 11,76 623,53 2387,90 7,27 1013,71 Tecamebas > 20 µm (Arcella) 240,00 1032,47 33,33 248,73 784,85 34,55 244,53 Tecamebas > 20 µm (Centropyxis) 3,14 13,49 5,88 33,45 221,21 7,27 18,87 Tecamebas > 20 µm (Euglypha) 344,31 487,28 70,59 158,55 343,83 43,64 247,92 Tecamebas > 20 µm (Trinema) 6,27 28,14 5,88 16 88,64 7,27 11,32

Total Desv. std 153399,94 2031,80 638,33 3443,16 907,98 159,64 427,28 66,65

% 73,58 79,25 58,49 9,43 33,96 6,60 56,60 6,60

Tabla con los resultados de las abundancias medias en ind/ml (X), desviaciones standards (Desv. std.) i frecuencias de aparición de las especies de protozoos ciliados para las depuradoras con tratamiento de eliminación de nutrientes y convencional, y para el conjunto total de muestras. Tratamiento de eliminación de nutrientes X Desv. std. % 614,12 1197,78 68,63 23,53 48,12 29,41 1792,94 2939,35 76,47 297,25 1202,48 25,49 80 460,89 5,88 0 0 0 23,53 73,40 15,69 550,12 1224,19 43,14 0 0 0 1,57 11,20 1,96 65,10 341,10 7,84 63,53 172,36 23,53 2,35 12,42 3,92 12,55 55,71 7,84 4,71 33,61 1,96 0,78 5,60 1,96 3,92 22,99 3,92 4,71 23,52 5,88 8,63 61,61 1,96 75,29 213,11 17,65 404,71 1826,15 19,61 82,35 284,69 11,76 21,18 135,14 3,92 151,37 357,62 33,33 3,14 15,68 3,92 76,08 371,05 13,73 2,35 9,51 5,88 Tratamiento convencional X Desv. std. % 256,73 369,80 63,64 24,73 56,83 21,82 2258,18 5658,21 67,27 290,18 966,34 21,82 102,55 755,02 3,64 1,45 10,79 1,82 18,91 47,98 18,18 524,36 1221,77 40 1,45 7,56 3,64 0,73 5,39 1,82 24,73 79,81 16,36 37,09 264,31 3,64 0 0 0 0,73 5,39 1,82 0 0 0 0 0 0 16,73 100,28 3,64 0,73 5,39 1,82 59,82 210,93 9,09 121,45 529,15 12,73 194,91 772,95 10,91 295,09 717,79 27,27 334,55 1089,87 21,82 187,64 642,12 32,73 2,18 9,17 5,45 81,45 263,53 29,09 9,45 25,49 14,55 Total Desv. std. 886,40 52,57 4542,44 1081,12 628,05 7,77 61,28 1217,17 5,47 8,65 243,09 224,16 8,65 39,09 23,31 3,89 73,92 16,81 159,21 407,63 1380,71 561,22 802,70 522,76 12,67 318,26 19,75

Protozoos ciliados Acineria uncinata Acineta tuberosa Aspidisca cicada Aspidisca lynceus Aspidisca lynceus var. turrita Blepharisma undulans Calyptotricha lanuginosa Carchesium polypinum Chaetospira muelleri Chilodonella uncinata Cinetochilum margaritaceum Coleps hirtus Cothurnia annulata Cyclidium glaucoma Cyclidium heptatrichum Dexiostoma campylum Drepanomonas revoluta Endosphaera sp Epistylis chrysemydis Epistylis coronata Epistylis entzii Epistylis plicatilis Epistylis sp Euplotes affinis Holophrya discolor Litonotus lamella Litonotus varsaviensis

X 428,68 24,15 2034,34 293,58 91,70 0,75 21,13 536,75 0,75 1,13 44,15 49,81 1,13 6,42 2,26 0,38 10,57 2,64 35,19 99,25 295,85 192,74 183,77 170,19 2,64 78,87 6,04

% 66,04 25,47 71,70 23,58 4,72 0,94 16,98 41,51 1,89 1,89 12,26 13,21 1,89 4,72 0,94 0,94 3,77 3,77 5,66 15,09 15,09 19,81 13,21 33,02 4,72 21,70 10,38

continuación Metacineta mystacina Metacystis sp Microthorax costatus Microthorax pusillus Opercularia articulata Opercularia asymetrica Paramecium putrinum Plagiocampa rouxi Podophrya sp Pseudochilodonopsis fluviatilis Pseudochilodonopsis piscatoris Spathidium sp Stentor sp Suctor Thigmogaster oppositevacuolatus Thigmogaster potamophilus Thuricola kellicottiana Tokophrya infusionum Tokophrya lemnarum Tokophrya quadripartita Trithigmostoma cucullulus Trithigmostoma steini Trochilia minuta Trochiliopsis opaca Uronema nigricans Vorticella aquadulcis Vorticella campanula Vorticella convallaria Vorticella infusionum Vorticella microstoma Vorticella octava 0 0,78 0 64,31 121,57 0,78 5,49 58,04 2,35 46,27 3,92 0 1,57 2,35 413,33 30,59 14,90 2,35 3,92 8,63 4,71 10,20 565,49 0 0,78 872,94 0 624,39 0 3,14 8,63 0 5,60 0 365,56 433,03 5,60 39,21 174,41 9,51 147,38 28,01 0 11,20 12,42 1335,20 218,44 55,40 9,51 12,01 25,69 33,61 47,22 1531,72 0 5,60 1181,85 0 1446,10 0 15,68 56,18 0 1,96 0 13,73 21,57 1,96 1,96 27,45 5,88 25,49 1,96 0 1,96 3,92 49,02 1,96 7,84 5,88 9,80 11,76 1,96 5,88 35,29 0 1,96 74,51 0 58,82 0 3,92 3,92 7,27 2,18 2,91 0 474,18 8,73 0 93,82 1,45 50,91 0 3,63 0 0 110,55 2,91 172,36 8,73 4,36 7,27 98,91 33,45 207,27 7,27 34,91 1243,64 1,45 393,45 18,91 0 2,91 25,64 16,18 15,11 0 2650,56 41,95 0 346,94 7,56 110,07 0 19,27 0 0 475,28 21,57 418,74 33,28 18,33 21,90 669,81 171,06 579,10 44,28 132,68 2317,63 10,79 966,61 114,40 0 16,96 9,09 1,82 3,64 0 7,27 5,45 0 20 3,64 29,09 0 3,63 0 0 23,64 1,82 23,64 9,09 7,27 12,73 7,27 12,73 27,27 3,64 20 74,55 1,82 47,27 5,45 0 3,64 3,77 1,51 1,51 30,94 304,53 4,91 2,64 76,60 1,89 48,68 1,89 1,89 0,75 1,13 256,23 16,23 96,60 5,66 4,15 7,92 53,58 22,26 379,62 3,77 18,49 1065,28 0,75 504,57 9,81 1,51 5,66 18,74 12,25 10,94 254,32 1932,28 30,59 27,20 276,97 8,52 128,76 19,43 13,95 7,77 8,65 994,09 152,17 312,87 24,96 15,55 23,69 483,22 127,46 1149,80 31,97 96,75 1860,70 7,77 1220,56 82,59 10,94 40,73 4,72 1,89 1,89 6,60 14,15 3,77 0,94 23,58 4,72 27,36 0,94 1,89 0,94 1,89 35,85 1,89 16,04 7,55 8,49 12,26 4,72 9,43 31,13 1,89 11,32 74,53 0,94 52,83 2,83 1,89 3,77

Tabla con los resultados de las abundancias medias en ind/ml (X), desviaciones standards (Desv. std.) i frecuencias de aparición de los grupos de metazoos para las depuradoras con tratamiento de eliminación de nutrientes y convencional, y para el conjunto total de muestras.

Metazoos Gastrotricos Nematodos Rotíferos Tardígrados

Tratamiento de eliminación de nutrientes X Desv. std % 0 0 0 18,04 33,29 29,41 225,49 389,77 68,63 3,92 20,01 3,92

Tratamiento convencional X Desv. std % 6,55 48,54 1,82 11,64 21,32 25,45 141,09 231,95 65,45 21,09 79,20 12,73

X 3,40 14,72 181,70 12,83

Total Desv. std 34,97 27,78 319,07 59,08

% 0,94 27,36 66,98 8,49

ANEJO IV
Fotografías de los microorganismos

Listado de las ilustraciones Fotografía 1. Microorganismo filamentoso correspondiente a Microthrix parvicella, (contraste de fases, 1000x). Fotografía 2. Microorganismo filamentoso correspondiente al grup de los actinomicetos nocardioformes, (contraste de fases, 1000x). Fotografía 3. Microorganismo filamentoso correspondiente al Tipo 021N, (contraste de fases, 1000x). Fotografía 4. Microorganismo filamentoso correspondiente al Tipo 1851, (contraste de fases, 1000x). Fotografía 5. Flagelado de tamaño pequeño del grupo de los Bodónidos, (contraste de fases, 1000x). Fotografía 6. Flagelado de tamaño pequeño del grupo de los coanoflagelados, (contraste de fases, 1000x). Fotografía 7. Tecameba de tamaño grande correspondiente al género Euglypha, (contraste de fases, 400x). Fotografía 8. Protozoo ciliado correspondiente a la especie Acineria uncinata, (contraste de fases, 400x). Fotografía 9. Protozoo ciliado correspondiente a la especie Aspidisca cicada, (contraste de fases, 400x). Fotografía 10. Protozoo ciliado correspondiente a la especie Vorticella aquadulcis, (contraste de fases, 400x). Fotografía 11. Protozoo ciliado correspondiente a la especie Vorticella convallaria, (contraste de fases, 400x). Fotografía 12. Protozoo ciliado correspondiente a la especie Opercularia articulata, (campo claro, 400x). Fotografía 13. Metazoo del grupo de los rotíferos del género Lecane, (contraste de fases, 400x).

Fotografía 14. Metazoo del grupo de los rotíferos del género Philodina, (contraste de fases, 400x).

1

Jessica Vasco

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Jessica Vasco

3

Jessica Vasco

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Jessica Vasco

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Jessica Vasco

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Jessica Vasco

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Jessica Vasco

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Jessica Vasco

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Jessica Vasco

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Jessica Vasco

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Jessica Vasco

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Jessica Vasco

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Jessica Vasco

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Jessica Vasco

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