UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POSTGRADO DOCTORADO EN MICROBIOLOGA

Seminario: Western Blot Fundamento y aplicaciones en el diagnstico parasitolgico

Curso: Tpicos selectos en el diagnstico microbiolgico y parasitolgico
Ms. C. Luis Alberto Snchez Angulo

Trujillo Agosto 2010

Western Blot

Fundamento
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Western Blot
Es una tcnica muy sensible que permite identificar Acs. la tcnica de Western Blot se basa en:
La separacin electrofortica de protenas en geles de poliacrilamida. La transferencia (blotting) de dichas protenas a un soporte slido (membrana de nitrocelulosa o nylon). La posterior deteccin de una ms bandas identificadas por Acs especficos.
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Western Blot
La tcnica consta de tres fases:
Separacin de protenas por electroforesis en gel de SDS poliacrilamida (SDS-PAGE). Transferencia de protenas a una matriz slida (papel de nitrocelulosa) por electroforesis transversal. Inmunoreaccin, en otras palabras la identificacin de cada protena mediante anticuerpos conocidos por la prueba de ELISA.
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Electroforesis
Las protenas suelen tener una carga neta positiva o negativa, que refleja la cantidad de aminocidos cargados que contienen. Si se aplica un campo elctrico a una solucin que contenga una molcula proteica, la protena migrar a una velocidad que depender de su CARGA NETA, de su TAMAO y de su FORMA.
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Equipos de electroforesis
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Equipo de electroforesis
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Electroforesis (continuacin):
Esta tcnica conocida como electroforesis, se utiliz inicialmente para separar mezclas de protenas. A mediados de los aos 1960 se desarroll una versin modificada de este mtodo conocida como electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (o SDS-PAGE PolyAcrilamide-Gel Electrophoresis), que a revolucionado los sistemas de anlisis rutinarios de protenas.
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Electroforesis (continuacin): Como matriz inerte a travs de la que migran las protenas, se utiliza un gel de poliacrilamida. Normalmente se prepara inmediatamente antes de utilizarse mediante la polimerizacin a partir de sus monmeros. El tamao del poro del gel puede ajustarse de forma que sea el adecuado para retrasar la migracin de las molculas proteicas de inters.
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Electroforesis (continuacin): Las protenas no se colocan en una solucin acuosa simple, sino en una solucin que contiene un potente detergente de carga negativa el, dodecil sulfato sdico, o SDS (de Sodium Dodecyl Sulfate). Como este detergente se une a las regiones hidrofbicas de las molculas proteicas, haciendo que se desplieguen las cadenas polipeptdicas, las diferentes molculas proteicas quedan liberadas de sus asociaciones con otras molculas proteicas o lipdicas y se disuelven libremente en la solucin del detergente.
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Dodecil sulfato sdico potente detergente de carga negativa

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Electroforesis (continuacin): Adems, se suele aadir un agente reductor como el mercaptoetanol con el objeto de romper los enlaces S-S que puedan existir en la protenas, de forma que puedan analizarse separadamente todos los polipptidos constitutivos de las molculas que tengan varias subunidades.

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Electroforesis (continuacin): Qu sucede cuando una mezcla de protenas solubilizadas con SDS se somete a electroforesis a travs de una lmina de gel de poliacrilamida? Cada molcula de protena se une a una gran cantidad de molculas de detergente, cargadas negativamente, que anulan la carga intrnseca de la protena y hacen que cuando se aplique un voltaje a la protena esta migre hacia el electrodo positivo.
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Resumiendo: Se cargan diferentes muestras en los pozos o depresiones en la parte superior de un gel de poliacrilamida. Las protenas se desplazan a travs del gel cuando se aplica un campo elctrico. El gel mantiene al mnimo las corrientes de conveccin producidas por pequeos gradientes de temperatura y tambin minimiza los movimientos de protenas que no sean producidos por el campo elctrico.

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Resumiendo: Despus de la electroforesis se pueden visualizar las protenas tratando el gel con un colorante tal como el azul de Coomassie, que se fija a las protenas pero no al gel. Cada banda del gel representa una protena diferente (o subunidad proteica); las protenas ms pequeas se desplazan ms rpidamente que las protenas grandes, por lo que se encuentran cerca del extremo inferior del gel.
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Electroforesis (continuacin): En consecuencia, una mezcla compleja de protenas es fraccionada en series de bandas proteicas discretas, que se hallan ordenadas en funcin de su peso molecular. En consecuencia: la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS es un procedimiento ms poderoso que cualquier otro mtodo anterior de anlisis de protenas, principalmente debido a que puede utilizarse para separar todos los tipos de protenas.
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Electroforesis (continuacin): Pueden separarse protenas de membrana, protenas componentes del citoesqueleto, y protenas que forman parte de grandes agregados macromoleculares. Debido a que este mtodo separa los polipptidos en funcin de su tamao, tambin proporciona informacin sobre el peso molecular. Despus de la electroforesis las protenas se visualizan aadiendo un colorante tal como el azul de Coomassie, que se fija a las protenas y no al gel.
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Resultados electroforesis

Quiste hidatdico Productos Fasciola hepatica

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Protenas teidas con Coomassie tras una electroforesis en gel de poliacrilamida

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1.

Electroforsis en gel de SDS - poliacrilamida Separacin de protenas por su masa molecular en gel de poliacrilamida, empleando un campo elctrico. SDS disocia la mayora de las protenas y reacciona con ellas equilibrando sus cargas. Las protenas cargadas negativamente migran en direccin al nodo (+).

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Electroforesis en gel de SDS - poliacrilamida
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2. Transferencia de protenas Sistema humedo

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Sistema semi seco

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3. Reaccin antgeno - anticuerpo

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Reaccin Antgeno - anticuerpo
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Hidatidosis

Fasciolosis

Lectura de resultados
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Cisticercosis Cistiblot

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EFICACIA DEL WESTERN BLOT EN LA DETECCION DE ANTICUERPOS EN PACIENTES CON CISTICERCOSIS

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Aplicaciones en el diagnstico parasitolgico El diagnstico clnico de la neurocisticercosis es difcil por la gran variedad de signos y sntomas que produce esta enfermedad. El uso de la Tomografa Axial Computarizada y la Resonancia Nuclear Magntica estn permitiendo realizar un mejor diagnstico; sin embargo, el uso de estas tcnicas no est al alcance de la mayora de los pacientes que generalmente son de bajo recursos econmicos.
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Western Blot
Aplicaciones en el diagnstico parasitolgico (cont.) La tcnica de Western Blot estandarizada en el Per, ha demostrado ser altamente eficiente y de bajo costo, constituyendo un valioso apoyo para el diagnstico de la enfermedad y su consiguiente tratamiento.

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Western Blot con antgenos de la larva de Taenia solium

A fines de 1991 se estandariz la tcnica de WB para el diagnstico de la neurocisticercosis con antgenos de fluido vesicular de la larva de T. solium, alcanzando: una Sensibilidad de 91% y una Especificidad de 100%. Estudios posteriores realizados por otros investigadores encontraron las siguientes sensibilidades: 92 % con 2 o ms quistes intracraneales. 90 % para quistes viables. 71 % con quistes calcificados. Se encontr que la prueba es ms sensible con suero que con LCR.
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Antgenos de Excrecin/secrecin de la larva de Taenia solium

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EN EL LABORATORIO SENSIBILIDAD : 91.40 % ESPECIFICIDAD: 100.00 % (8 bandas antignicas especficas)

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El CISTIBLOT es un reactivo de diagnstico que permite la deteccin de anticuerpos especficos de tipo IgG en suero o lquido cefalorraqudeo de pacientes con cisticercosis utilizando la tcnica de Electroinmunotransfer encia o Western Blot
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Cistiblot

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Principio de la prueba:
Los antgenos de la larva de Taenia solium, son separados en geles de poliacrilamida y luego transferidos al papel de nitrocelulosa. La lmina de nitrocelulosa con las bandas antignicas de 42, 35, 31, 24, 23, 18, 17, 14 y 33 Kda son cortadas en tiras de tres mm de ancho, de tal manera que cada una contenga las bandas inmunoenzimticas segn el procedimiento siguiente:

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Procedimiento: Tira con antgenos. Suero problema con anticuerpos. Conjugado (Anti-anticuerpo marcado con enzima). Sustrato cromognico. RESULTADO = Tira con antgenos y anticuerpos

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El Kit (CISTIBLOT) El kit contiene todos los componentes para realizar la
deteccin de anticuerpos en suero y LCR de pacientes con sospecha clnica de cisticercosis. Componentes del KIT: 20 tiras de nitrocelulosa con antgenos de la larva de Taenia solium. Suero control negativo. Suero control positivo. Solucin de lavado. Solucin detergente.
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El Kit (CISTIBLOT): continuacin Conjugado enzimtico. Sustrato A. Sustrato B. Bloqueador en polvo.

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Ventajas del Kit (CISTIBLOT):

Fcil realizacin. Altamente especfico y sensible. No requiere entrenamiento previo. Reproducible. Estable por 8 meses. No requiere equipamiento sofisticado.

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Evaluacin de las Pruebas Inmunodiagnsticas

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Interpretacin de pruebas diagnsticas

Precisin
Es una indicacin que relaciona cuan exactos son los resultados de una investigacin o medicin con la verdad de los hechos.

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Interpretacin de pruebas diagnsticas

Confiabilidad
Una prueba diagnstica es confiable si produce similares resultados cuando es repetida. Entonces repetibilidad es caracterstica de una tcnica confiable

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Interpretacin de pruebas diagnsticas

Validacin
Si una tcnica diagnstica mide lo que esta diseada para medir se debe considerar vlida. La validez de una prueba diagnstica depende de: Enfermedad investigada. Mtodo de diagnstico
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Validacin de las pruebas serolgicas

Principales indicadores:

Sensibilidad analtica. Sensibilidad diagnstica. Especificidad diagnstica. Valor predictivo positivo. Valor predictivo negativo. Precisin.
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