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23099813-Curva-de-Crecimiento-de-E-Coli-y-Levadura-Candida

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PRÁCTICA No.

1

“DETERMINACION Y CURVA DE CRECIMIENTO DE MICROOGANISMOS (E. COLI Y LEVADURA CANDIDA)”.
EQUIPO No 1.
• • • • GUZMÁN LÓPEZ AMAYRAN CONCEPCIÓN. HERNÁNDEZ GUZMÁN MARIO. JIMÉNEZ PINTO DIANA CAROLINA. MENDOZA SANTIAGO DAYANA CAROLINA.

ING. BIOQUÍMICA.

5to. SEMESTRE.

CATEDRÁTICA: QBP. AURA FLORES PÉREZ.

TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS. NOVIEMBRE DE 2009.

CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA E.“DETERMINACIÓN DE CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS” OBJETIVO GENERAL: CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA ESCHERICHIA COLI Y DE LA LEVADURA CANDIDA.CUANTIFICAR EL NUMERO DE CELULAS DE LA LEVADURA CANDIDA POR UN RECUENTO DIRECTO (CON DILUCIONES) EMPLEANDO LA CAMARA DE NEUBAUER. . CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CANDIDA MEDIANTE DIFERENCIAS DE MASA. CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CANDIDA (COLONIAS) INOCULADO EN CALDO NUTRITIVO MEDIANTE LECTURAS DE TURBIDIMETRIA (NEFELOMETRICO KLETTS) CADA 12 HORAS DURANTE 96 HORAS. OBJETIVO ESPECIFICO: CUANTIFICAR EL CRECIMIENTO DE LA BACTERIA E. COLI EMPLEANDO LA TECNICA DE VACIADO EN CAJAS PETRI CON AGAR NUTRITIVO (72 HORAS DESPUES DE SU INOCULACION) MEDIANTE EL RECUENTO DE UFC. . COLI (UFC) EN CALDO NUTRITIVO MEDIANTE LECTURAS DE TURBIDIMETRIA (NEFELOMETRICO KLETT) CADA 2 HORAS DURANTE 24 HORAS.

Agar E.). es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa . etc. GLUCOSA AGAR (P.y su prueba de IMVIC es ++--. actividad metabólica.. Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de genética y biotecnología molecular porque es ampliamente conocida su organización. La Escherichia coli es una bacteria gram (-) que se encuentra generalmente en los intestinos animales y en aguas negras. Las levaduras en general son células esféricas a elípticas cuyo diámetro varía de 3-15µm. glucosa y agar Medio de jugo de uva (para enología) o medio mosto de cerveza ( para cervecería) Estos medios se hacen selectivos frente a numerosas bacterias por la acidificación a pH 4-3. etc. Entre los métodos indirectos se encuentran: . Las especies del género Cándida producen levaduras elipsoides o esféricas con brotes que miden alrededor de 3 a 6 µm.5 a 3 mm.M.A) Extracto de levadura. pero que pueden relacionarse de forma directa con éste (masa celular. se puede inocular en Agar y caldo nutritivo(por poseer todo tipo de nutrientes son excelentes para su uso). Después de la proliferación en un medio con agar durante 1-3 días las levaduras producen colonias pálidas y opacas y en general alcanzan un diámetro de 0.B. agar (O. Si bien unas pocas levaduras se reproducen por fisión binaria la mayoría se reproduce por brotación o blastoconidios. estructura y función.D. Generalmente las bacterias se reproducen por fisión binaria.A) MEDIO DE PATATA.Ello es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los constituyentes celulares y así la velocidad de crecimiento de la población puede estimarse por la velocidad del incremento de cualquiera de estos parámetros. Los medios para el recuento de levaduras son: • • • • • Medio sabouraud Oxiteclicina.5. De manera habitual se forman múltiples brotes y pseudohifas en medios deficientes de sustratos fácilmente metabolizables. coli para ser usada en laboratorio sin riesgos patogénicos. Además.G.INTRODUCCION Cuando un microorganismo es colocado en un medio nutricionalmente completo aumenta de tamaño y con el tiempo se reproduce para formar nuevos individuos dando como resultado una población de células vegetativas no diferenciadas. Agar McConkey. glucosa. Existen varios métodos para medir el crecimiento microbiano: Métodos indirectos: son aquellos que utilizan parámetros distintos del nº de células. se han modificado E. no forma esporas. móvil por flagelos perítricos (que rodean su cuerpo). es anaeróbico facultativo.

Θ Medida de la turbidez del cultivo (bacterias y levaduras). Medir el contenido proteico del cultivo. Se basa en la capacidad de las células y partículas en general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Esta técnica de recuento por diluciones seriadas nos permite conocer el número de microorganismos viables en una determinada muestra. Frecuentemente las muestras naturales tienen un numero muy elevado de microorganismos (bacterias). aumento de la concentración de alguna enzima constitutiva. b) mezclándolo previamente con el medio fundido y temperado. es el método mas difundido para la estimación de la biomasa total en suspensión. Se trata de medir la masa celular presente en un cultivo y estimar el nº de células proporcional a ésta. Este método. Simultáneamente a las medidas de absorbancia se realizan recuentos en placa (bacterias). La inoculación de la placa con la muestra que contiene los microorganismos pueden realizarse: a) directamente sobre el medio ya solidificado en la placa (método de extensión sobre placa). como para evaluar los efectos antimicrobianos en bacterias. El espectrofotómetro es un aparato que hace pasar la luz a través de una suspensión celular y detecta la luz no dispersada. Θ Determinación del nitrógeno celular. Es el método más habitual para la determinación de células viables se basa en contar el número de colonias UFC. etc. La viabilidad en microbiología se define como la capacidad del microorganismo para dividirse y dar lugar a una descendencia. Una aplicación directa de turbidimetría es la realización de una curva patrón en la que se relaciona la medida de la absorbancia con el número de células viables del cultivo. es útil como referencia en el trabajo de aislamiento y purificación de otros métodos. liberación de CO2 u otro producto de fermentación. . Un cultivo celular aparece turbio porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. Θ Determinación del DNA Θ Determinación de una actividad metabólica según el tipo de microorganismo: consumo de oxígeno (en aerobios). para verterlo después sobre la caja petri vacía (método en vertido en placa o siembra en profundidad). El método más habitual para la determinación de células viables se basa en contar el número de colonias UFC. incorporación en la célula de algún material radiactivo. La turbidez es proporcional al número de células y puede medirse utilizando un espectrofotómetro.Θ Determinación del peso seco (bacterias y levaduras). por lo que se requiere diluirlas de forma seriadas que posteriormente se siembra en placas con el medio de cultivo adecuados. aunque lleva tiempo. Las técnicas turbidimétricas son totalmente útiles para determinar tanto la masa de células durante el desarrollo.

de la actividad metabólica y de la susceptibilidad a los agentes químicos y físicos. Este método tiene el inconveniente de que no diferencia entre células viables y no viables.Métodos directos: son aquellos en los que se cuenta el nº total de células en un volumen conocido y así se estima el nº total en la población. Las células mueren a una velocidad mayor a la que se originan debido al agotamiento total de la nutriente y/o excesiva acumulación de sustancias tóxicas. . Cuando en un medio adecuado se inocula con bacterias o levaduras y se toman muestras pequeñas a intervalos regulares. Entre ellos: Θ Recuento directo del nº de células al microscopio (levaduras). cámaras de Petroff-Hauser. fase estacionaria y fase de declinación. Las células son suspendidas en un fluido conductor que pasa Lentamente a través de una abertura fina por la que pasa una corriente eléctrica permiten medir la distribución de tamaños y el número de células en las suspensiones bacterianas pero son muy costosos. La curva de crecimiento bacteriano se puede dividir en cuatro fases: fase de latencia. la representación grafica de los datos dará una curva de crecimiento característico. A veces la muerte va acompañada de lisis celular y esto disminuye la absorbancia del cultivo. Neubauer o de Helber) estas consisten de portaobjetos excavados y cuadriculados que facilitan el recuento por unidad de superficie y de volumen. Se utilizan portas especialmente diseñados para el recuento celular y son denominados cámaras de recuento en donde un volumen conocido de muestra es depositado en un portaobjetos especial para cuenta (hemacitómetros. Θ Fase de muerte celular.Durante este periodo la masa ye l volumen de las células aumentan por el mismo factor y de tal manera que la composición promedio de las células y las concentraciones relativas de los metabolitos se mantienen constantes. Θ Contadores electrónicos. la variación del pH y otros factores que ejercen un efecto nocivo sobre el cultivo. Θ Fase de latencia: durante esta fase hay un aumento de los componentes macromoleculares. Es poco preciso. fase del crecimiento exponencial. Θ Fase estacionaria: en esta fase hay productos de desecho. Θ Fase de crecimiento exponencial: en esta fase las células se encuentran es un estado equilibrado . lo que produce una disminución de la velocidad de crecimiento. agotamiento de nutrientes.

es decir. que se pase un cultivo crecido en MM+Glc a MM+Gal o de MR a MM+Glc. 3. de color crema y opacas. En este medio de crecimiento de mohos se parece a esferas de algodón más o menos grande. La curva de crecimiento variará dependiendo de que se parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial. Las células crecerán más lentamente en un medio mínimo (MM) que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes.5. Dependiendo de la fuente de carbono y de la facilidad con que la asimilen crecerán más o menos rápidamente (por ejemplo. crecen mejor con glucosa (Glc) como fuente de carbono que con galactosa (Gal). las bacterias se reproducen por fisión binaria a un ritmo máximo promedio de cada 20 min. Se modifican y adoptan la forma de capas membranosas mientras que el crecimiento de levaduras o bacterias se manifiesta por turbidez homogénea que se reconoce por investigación microscópica. comúnmente en un medio de pH 5. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de cada célula individual y su división celular. La procedencia y características del inóculo. La mayoría de los hongos son aerobios. Para el aislamiento se usa con más frecuencia el medio de ensayo o de conservación de Sabouraud y el medio de Pensilvania. la homogenización y aire reacción del medio de cultivo se realizara en forma manual cada doce horas por 7 días. son factores importantes. a 25ºC. El medio de caldo de maltosa Sabouraud esta especificado para el desarrollo de levaduras.MARCO TEORICO El crecimiento microbiano se define como un incremento en el nº de células. etc. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como: 1. pero este ritmo se mantiene solo por un corto periodo. La composición del medio de cultivo. en condiciones óptimas E. la agitación. El microorganismo en sí. En la mayor parte de los medios de especies del género Cándida no pueden identificarse sobre la base del aspecto de sus colonias. El proceso de crecimiento del microorganismo (levadura) se desarrollara en condiciones asépticas y a temperatura ambiente. Por ejemplo para las bacterias patógenas el óptimo de crecimiento se consigue a los 37ºC y para las levaduras y otros hogos.5 a 6. a aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro. los hongos se desarrollan mejor a la temperatura de la habitación (20 a 25ºC) o a 37ºC. En 24 – 48 horas producen colonias sobreelevadas. En contraste. Así por ejemplo. Coli tiene un ciclo de vida de 15-20 minutos por que en una población joven el número de bacterias muertas es mínimo. 2.Por ejemplo el crecimiento de las bacterias sobre un medio de cultivo liquido es claramente exponencial. . mohos y bacterias así como la investigación en las pruebas de esterilidad. se refiere al crecimiento de poblaciones. Las condiciones de incubación. En general. la concentración de CO2 en la atmósfera de cultivo. 4. Después de varios días en un medio con agar es posible observar hifas que penetran en el agar. La temperatura de incubación.

con la técnica de vaciado por duplicado. .Toma de muestra de una cepa pura cultivada en el cepario del laboratorio de microbiología del ITTG.. 3.METODOLOGIA CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO (E. 2. Coli) 1.Preparación del medio de cultivo. 3 matraces nefelométricos con 50 ml) y agar nutritivo para la técnica de vaciado en cajas (por duplicado).Inoculación Matraz 1: Colocar 2 ml de la muestra (cepa pura) en un matraz nefelométrico que contiene 50 ml de caldo nutritivo. Cada dos horas tomar las lecturas de densidad óptica (Klett).. Matraz 2: Inocular 2 ml de muestra a un matraz con 50 ml de caldo nutritivo estéril. Utilizamos el jabón “Escudo”. previamente esterilizado. hacer las diluciones y la inoculación en cajas para estudiar su crecimiento. sobre determinadas áreas y en estas inocular por la técnica de estría masiva. agitar y posteriormente hacer diluciones 1:9 para inocular en cajas petri. Matraz 3: Blanco. Hacer lecturas en el turbidímetro Klett cada 2 horas. Caldo nutritivo (150 ml. servirá de referencia para verificar el crecimiento (turbidez) de la bacteria comparándolo con éste. Para comprobar el efecto antimicrobiano de un producto comercial y estudiando el crecimiento de la bacteria.. Colocando en dos cajas petri una pequeña proporción de solución del jabón preparada con agua. Poner en agitación el matraz una vez inoculado a 110 revoluciones /minuto.

Preparar matraces con 50 ml de caldo YM. inocular en un matraz nefelométrico con caldo estéril... Posteriormente filtrar el contenido del matraz con ayuda de una bomba de vacío. P1 = peso del papel filtro a peso constante.Inoculación: Tomar 2 ml de muestra.Preparación del medio de cultivo: Caldo YM para el cultivo de la levadura Cándida. agitar y leer su contenido de células en la cámara de Neubauer.LEVADURA 1. posteriormente leer su densidad óptica en el equipo Klett. Esterilizar. para determinar su biomasa. Repetir este paso cada 12 horas durante 4 días. P2= peso del papel con la muestra (levadura) P2 – p1= peso neto total de levadura. 2. En un segundo matraz inocular 2 ml de muestra en 50 ml de caldo YM. someter a agitación (110 rpm) durante 12 horas.Filtración: Para determinar su biomasa: diferencia de pesos. . ………………………………………………………………………………………………….. el papel filtro debe estar a peso constante.

coli y turbidimetría en el equipo Klett .Grafica 1: que muestra el crecimiento microbiano. Graficando lo datos. en las cuales se midieron dos datos. lectura en el Klett y las UFC’s (conteo en placa). La siguiente tabla muestra los datos obtenidos: No.5 68 x 106 13:00 55 25 x 106 15:00 102 557 x 106 17:00 185 1155 x 106 19:00 209 1314 x 106 21:00 202 2200 x 106 Tabla 1: datos obtenidos de las lecturas cada dos horas de los matraces. para demostrar el crecimiento bacteriano se obtiene la siguiente curva normal de crecimiento: Curva de crecimiento E.RESULTADOS E. coli Se realizaron 6 lecturas. coli 250 200 Unidad Klett 150 100 50 0 0 2 4 6 8 10 12 14 tiempo (c/ dos horas) ……. De lectura (Hora) 0 1 2 3 4 5 6 Hora Lectura en el Klett UFC’s / ml 09:00 11:00 2. por los datos de turbidimetría (Klett) y las lecturas cada 2 horas. Conteo en placa de UFC de e. cada 2 horas. en el Klett y ………conteo en placa.

500 >1000 1:100 6 Jueves 12/11 08:40 214. midiendo dos tres datos: a) Turbidimetría (Klett) b) Conteo de microorganismo (cámara de Neubauer) c) Biomasa (diferencias de peso en papel filtro) Los datos obtenidos se muestran a continuación: No. Fecha Lectura UFC’s Klett Dilución 1 Lunes 09/11 08:00 5777.5 260 1:10 2 Martes 10/11 10:30 56. coli Levadura (Cándida) Se realizaron 6 lecturas.Imagen 1: conteo en placa---------------------------------------------Imagen 2: equipo Klett (turbidez. cada 12 horas durante 4 días.900 485 1:100 (Miércoles Noche) 5 20:40 208.500 >1000 1:100 --------------------Tabla 2: Datos obtenidos en la lecturas del Klett y conteo en placa .900 465 1:100 4 Miércoles 11/11 08:40 140. coli en caja petri: -------------Imagen 3: agar nutritivo inoculado con e. lectura) Crecimiento de e.500 405 1:100 (martes noche) 3 20:40 66.

..Grafica 2: Conteo de microorganismos en Neubauer vs tiempos de lecturas. la lectura en el Klett y el conteo en la cámara de Neubauer. por vacio). Graficando dicho dato vs las lecturas hechas. obteniendo la diferencia de ambos se tiene la biomasa. 60 80 Conteos en cámara de Neubauer:--------------------------------Conteo en placa: Imagen 4: Conteo en cámara de Neubauer---------------Imagen 5: conteo en placa de levaduras CALCULO DE LA BIOMASA DE LA LEVADURA (DIFERENCIA DE PESOS) P2-P1 = PESO NETO TOTAL DE LEVADURA. Tabla 3: Muestra los pesos de los papeles filtro a peso constante y con muestra biológica (levadura filtrada. P1= Peso del papel filtro a peso constante P2=Peso del papel filtro con muestra. se graficaron dos datos. Crecimiento de la levadura 250000 200000 Conteo Neubauer 150000 100000 50000 0 0 20 40 Tiempo (c/ 12 horas) …….Para obtener la grafica que muestre el crecimiento de la levadura.

48 0.Peso constante.31 0.25 0.16 Peso con muestra 0 0.49 Horas de lectura 0 12 24 36 48 60 Biomasa (peso de levadura) 0 0.05 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 0.30 0.23 0.15 0.18 0.25 0.16 0.1 0.23 0.33 TIEMPO (HORAS) ----------Grafica 3: muestra los gramos de levadura vs los tiempos de lectura hechos.18 0.31 0. Se muestra un grafica normal de crecimiento de microorganismo.18 0. se obtiene la siguiente grafica CURVA BIOMÁSICA 0. Papel filtro 0 0.35 GRAMOS DE LEVADURA 0. . en general son los microorganismos que pueden pesarse.3 0. La levadura (hongos).3 0.34 0.54 0. que conforme las horas de agitación pasaban.48 0.2 0. la levadura creció de una manera impresionante.25 0. ------Dicha grafica muestra.33 Graficando “Horas de lectura vs Biomasa”. pesando incluso gramos de organismo.

El resultado total del conteo de UFC/ml se realizo a las 48 después de las inoculaciones hechas y no a las 24 horas que era lo correcto.DISCUSION DE RESULTADOS La cepa utilizada de E. Otro factor importante que provoco un desajuste en los resultados en la segunda lectura de UFC/ml fue provocado por la contaminación de una caja inoculada. Los datos en el cálculo de la biomasa. dando como resultado un crecimiento no muy óptimo. . Otro factor prescindible en los resultados de la misma lectura fue el calentamiento excesivo de la pipeta con la que se inoculo causando la muerte de las bacterias y dando un resultado muy pequeño. Coli para la inoculación fue una reserva que llevaba días. no fueron correctos. esto ocurrió por una mala esterilización del área de trabajo. así como los datos de los pesos de los papeles filtro. Las últimas dos lecturas En equipo Klett se obtuvo un resultado aproximado debido a que el rango de lectura del equipo no fue suficiente para el conteo de las levaduras.

En el caso de la inoculación utilizando un producto comercial antimicrobiano (jabón “Escudo”). ya que no hubo inhibición de ningún tipo. nos muestra una curva normal de crecimiento. El crecimiento bacteriano fue de mayor rapidez en comparación del crecimiento de la levadura.CONCLUSIÓN Según los resultados obtenidos en la tabla de E. . Las UFC crecieron alrededor del agente. cual función fue pésima. coli. Comprobando así la mala función de este. las colonias fueron notorias en el medio inoculado. demostrando así que el crecimiento bacteriano fue casi ideal y continuo. pero su biomasa fue mayor en esta última. se estudio el efecto de dicho producto.

Zinsser.blogspot. 1983.. 20ª ed. Microbiología alimentaria.Bibliografía Bacteriología principios y practicas. Argentina 1994.a. de C.A.com/search/label/Divulgaci%C3%B3n%20cient%C3%ADfica Microbiología. Editorial Acribia S. Zucca. Arthur. .jueves 16 de octubre de 2008 http://dicitblog. Dicit . editorial continental S. México D. 8ª ed.F. Bourgeois. Editorial Medica panamericana. Mescle. Bryan h. Bacterias y levaduras .V.

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