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Biologia Forense

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Curso de verano

Biología Forense

La Rábida, 1 al 5 de agosto de 2005
Directores Dra. Pilar Sanz Nicolás Dr. Manuel López soto

LAS CIENCIAS FORENSES EN ESPAÑA. INTCF, IML, LABORATORIOS DE POLICÍA CIENTÍFICA Y GUARDIA CIVIL

PILAR SANZ NICOLÁS Directora de Departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses.

La definición más sencilla de Ciencia Forense, de acuerdo con la Forensic Science Society del Reino Unido, es la que la considera como la aplicación de los conocimientos científicos a cuestiones legales. Cuestiones legales que puedan requerir la intervención de un científico son todos los sucesos que necesitan la decisión de un juez o un jurado y en los que hay que investigar causas que excedan de los conocimientos que aporta el derecho (un robo, una falsificación de documentos, el derrumbamiento de un edificio, un vertido a un río, una homicidio...). Expertos de cualquier rama del conocimiento pueden ser llamados a colaborar con la justicia. En ese mismo momento pasan a ser expertos forenses. Recogerán información de las personas que han intervenido en el suceso, del lugar en que ha ocurrido o de los objetos relacionados, para aportar datos objetivos que ayuden a esclarecer el caso judicial. El biólogo forense recogerá esa información de pistas biológicas (fluidos corporales, restos humanos o animales, vegetales) que han ido quedando sobre los propios implicados y en el lugar de los hechos o los objetos. Las analiza, las identifica, las individualiza y colabora así a aclarar los hechos. Los biólogos forenses intervienen en casos civiles, como son los estudios de parentesco (por ejemplo filiaciones: reconocimiento o impugnación de paternidad), en casos penales como puede ser un robo en el que el ladrón se ha herido y ha dejado su sangre en un cristal, o en casos criminales (homicidios, agresiones sexuales) y en desastres en masa (accidentales o terroristas).

En la investigación de delitos (investigación de la escena del crimen, CSI) intervienen muy distintos tipos de profesionales. Al lugar de los hechos acuden distintos cuerpos policiales (local, nacional, guardia civil); también puede ser necesaria la presencia de bomberos, si hay un incendio, una inundación o cualquier otro percance que los requiera, del 061 y otros grupos asistenciales si hay heridos o muertos. El primero que se entera avisa a la policía y se pone el hecho en conocimiento del Juzgado de Guardia. Si hay personas heridas o fallecidas acude el médico forense. También puede ocurrir que una víctima de cualquier tipo de agresión acuda directamente a la policía, al hospital o al Juzgado a poner la denuncia. Esquemáticamente, el médico forense se encarga del reconocimiento de las personas o de la autopsia en su caso, la policía inspecciona el lugar de los hechos y busca al delincuente (que también puede ser atendido por el médico forense). Tanto unos como otros, en el desempeño de su función, recogen cuantos vestigios y objetos presenten interés y los envían al laboratorio para su análisis. Tanto Policía Nacional como Guardia Civil disponen de laboratorios propios y los Médicos Forenses, actualmente organizados en Institutos de Medicina Legal provinciales o regionales (según autonomías; algunos de ellos disponen también de laboratorios), mandan las muestras al Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses (INTCF). Existen en España tres Departamentos del INTCF, dependientes del Ministerio de Justicia, en Madrid, Barcelona y Sevilla y una Delegación en Tenerife. No obstante esta multiplicidad de laboratorios con funciones muy parecidas, pertenecientes a distintos Ministerios, intercambian a menudo muestras e información. Los laboratorios forenses realizan pruebas periciales y emiten informes forenses.

LA PRUEBA PERICIAL EN LA RESOLUCIÓN DE DELITOS

PILAR SANZ NICOLÁS Directora de Departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. La Administración de Justicia tiene una doble misión; por una parte el conocimiento de la Ley y por otra la consideración de los hechos a los que se aplica. En esta segunda misión, si se sobrepasa el conocimiento que proporciona el Derecho es necesario recurrir a la prueba pericial. “El Juez acordará el informe pericial cuando, para conocer o apreciar algún hecho o circunstancia importante en el sumario, fuesen necesarios o convenientes conocimientos científicos o artísticos” (Artículo 456 de la Ley de Enjuiciamiento Criminal). Las pruebas periciales al ser actos jurídicos se rigen por leyes, la de Enjuiciamiento Civil para los casos civiles (para nosotros los estudios de filiación) y por la ley de Enjuiciamiento Criminal (LEC), donde están definidos perfectamente todos los momentos y circunstancias de la prueba: La recogida y conservación de los vestigios o pruebas materiales Como debe describirse el lugar del delito y los objetos que se encuentren. Como deben recogerse los vestigios o huellas para garantizar su autenticidad En que circunstancias se recurre a la colaboración de peritos. Es una ley que data de 1882 y aunque ha sufrido numerosas modificaciones, la última en 2003, todavía conserva un lenguaje decimonónico y habla de Ministerio de Gracia y Justicia como se denominaba antes. Cuando habla de pruebas periciales se refiere normalmente a análisis de sustancias químicas, y alguna vez cita los análisis biológicos. En la modificación última se incluye un apartado dedicado al ADN. El Perito se define como la persona no-jurista con conocimientos especiales (“experto”), que informa al Juez sobre puntos litigiosos y el Perito Biólogo es por tanto el facultativo especializado en Biología que proporciona

conocimientos y experiencias conforme a su profesión y emite dictámenes no jurídicos. La Biología forense es muy amplia, abarca muchos aspectos y en el Laboratorio de Biología Forense lo mismo hay que identificar plantas que setas, realizar estudios microbiológicos, buscar diatomeas en sangre o tejidos de personas ahogadas, identificar alimentos en un contenido gástrico, pero el grueso del trabajo lo constituyen los estudios de parentescos y la individualización de vestigios en casos penales o criminales. La herramienta de elección es la individualización genética por lo que los laboratorios de Biología Forense actuales están altamente especializados en Genética Molecular. De acuerdo con la LEC, los Peritos pueden ser titulares (con titulación académica) o no titulares y a su vez los Titulares pueden ser oficiales o no oficiales. Los Peritos oficiales son funcionarios de un organismo estatal como el INTCF. Normalmente los jueces prefieren peritos titulares y, siempre que los haya, oficiales y la LEC exige que la prueba pericial se lleve a cabo por dos peritos. En resumen, la prueba pericial es el “examen” de las pruebas por un experto aunque la LEC se refiere a ella como reconocimiento o acto pericial, porque presupone (pensemos en el siglo XIX) que se realiza en el transcurso del juicio oral. Como es lógico los recursos técnicos que se aplican hace que el “acto pericial” biológico se lleve a cabo en laboratorios especializados donde el perito. por orden del Juez Instructor y a través del Instituto de Medicina Legal, hace los análisis y emite los informes. La prueba pericial auxilia a la administración de justicia, es eficaz y a menudo decisiva (exclusión de una paternidad), pero no es vinculante, es decir que no es obligatorio que jueces y tribunales se atengan a ella y resuelven libremente de acuerdo con todos los demás datos y circunstancias del hecho.

MESA REDONDA
ACTUACION EN EL ESCENARIO DEL CRIMEN. POLICIA JUDICIAL. LA INSPECCION OCULAR: BUSQUEDA Y RECOGIDA DE INDICIOS. LA VICTIMA. EL AGRESOR. MARIANO PERELLÓ RIUS Laboratorio Biología/ADN de la Brigada Provincial de Policía Científica de la Jefatura Superior de Policía de Andalucía Occidental. INTRODUCCION: LA POLICIA CIENTIFICA Se enuncia cual es la misión asignada a las unidades de Policía Científica dentro de la estructura básica de la Dirección General de la Policía así como las funciones desarrolladas por las mismas en la práctica habitual. Breve explicación de cómo se incardina la actuación de la Policía Científica en la investigación policial de un hecho delictivo.

LA INSPECCION OCULAR TECNICO-POLICIAL: OBJETIVO, FASES Y MEDIOS Definición genérica de la Inspección Ocular Técnico-Policial y su concreción dentro del campo de actuación de la Biología Forense. Antes de proceder a la Inspección Ocular propiamente dicha, es preceptiva la realización de unas Actuaciones previas que abarcan tanto la asistencia a la víctima como el aislamiento de la zona. La Inspección Ocular tiene un triple objetivo: Comprobar la realidad del delito y servir de base a la investigación (saber que hecho delictivo ha ocurrido), Evidenciar los medios empleados (como se ha producido el delito) e Identificar a los autores. La investigación pericial de los indicios en general, y de los biológicos en particular, consta de tres etapas: - Búsqueda en la escena del delito. - Recogida y envío al Laboratorio de los indicios. - Investigación analítica de los mismos. Es de capital importancia señalar que el resultado final de “la prueba del ADN” va a depender en gran medida de la correcta ejecución de los procesos

de recogida y envío de muestras al laboratorio; y además, la admisibilidad de dicha prueba en los Tribunales de Justicia también vendrá condicionada por el cumplimiento de la cadena de custodia. En cuanto a los medios que habitualmente se emplean en el examen del lugar de los hechos, a efectos de la búsqueda y recogida de indicios biológicos podemos englobarlos en dos apartados: Medios que facilitan la búsqueda y localización de los indicios (reactivos químicos y equipos de iluminación). Medios empleados para la recogida de muestras (maletines de Inspecciones Oculares y Kits de recogida). BUSQUEDA DE INDICIOS BIOLOGICOS Como introducción se enumeraran cuales son los indicios biológicos más frecuentes en los Laboratorios Forenses. La metodología a seguir en la búsqueda vendrá condicionada por las circunstancias particulares de cada caso en concreto; si bien es muy conveniente efectuar una interpretación “in situ” de los indicios antes de manipular nada, ya que una correcta valoración de los mismos exige su estudio dentro del contexto del lugar en que se ha producido el delito. La búsqueda en sí debe de ser minuciosa, ordenada y sistemática, extremando las precauciones para no pasar por alto algún indicio o destruirlo inadvertidamente; siendo muy recomendable seguir los métodos de dividir la escena en cuadrículas, que se irán examinando sucesivamente, o bien en círculos concéntricos, tomando como centro el lugar que consideremos más importante, por ejemplo, la ubicación del cadáver. En cualquier caso, antes de proceder a la recogida, se debe documentar la localización de todos los indicios biológicos que se vayan a recoger mediante esquemas, fotografías o vídeo, lo cual nos podrá servir para poder plantear una hipótesis sobre los hechos. En cuanto a los lugares de búsqueda, vendrán condicionados por las circunstancias particulares de cada caso en concreto. A título de ejemplo, se

describirá como se procedería en los casos más comunes (lugar cerrado, abierto, vehículos, víctima y agresor). RECOGIDA DE INDICIOS BIOLOGICOS Durante el proceso de recogida es muy conveniente adoptar una serie de precauciones que abarcan un doble ámbito: La protección del personal encargado de la recogida y la protección de las muestras (esta última para evitar distintos procesos que puedan afectar a su integridad, fundamentalmente la posible contaminación de las mismas). Como complemento a la práctica de la Inspección Ocular, en muchos casos se efectúa la toma de las denominadas muestras de referencia o indubitadas, que serían aquellas de las que sabemos de qué persona proceden (víctima, sospechoso, cadáver) para su cotejo con las evidencias recogidas en el lugar del delito (muestras dubitadas). En lo referente a la recogida de indicios biológicos en el lugar de los hechos, se enumerarán las normas básicas a seguir para efectuar una correcta recogida de los indicios, con ejemplos de la casuística mas frecuente (manchas en soportes pequeños y de fácil transporte, en soportes no transportables, soportes absorbentes y no absorbentes, indicios húmedos, líquidos, pelos, etc.)

MESA REDONDA ACTUACIÓN EN EL ESCENARIO DEL CRIMEN. POLICÍA JUDICIAL. INSPECCIÓN OCULAR: BÚSQUEDA Y RECOGIDA DE INDICIOS LA VÍCTIMA. EL AGRESOR FÉLIX SÁNCHEZ UGENA Director del Instituto de Medicina Legal de Badajoz. La existencia de una persona fallecida en condiciones extrañas o de forma violenta, supone un acontecimiento desde el punto de vista Policial y Judicial que pone en marcha un dispositivo específico encaminado a esclarecer las causas y circunstancias de ese fallecimiento. Entre las actuaciones previstas está la práctica de la autopsia Médico Legal, conforme a lo establecido en la Ley de Enjuiciamiento Criminal (Art. 343) La autopsia judicial no se limita al examen interno del cadáver como podría pensarse, sino que comprende una serie de pasos bien diferenciados y de gran trascendencia cada uno de ellos, a saber: - Inspección ocular y levantamiento del cadáver. - Examen externo y examen interno del cadáver. - Pruebas y estudios de laboratorio complementarios.

EL LEVANTAMIENTO DEL CADÁVER
Se trata de una actuación judicial por la que se constituye en el lugar de los hechos la Comisión Judicial, formada por el Juez, el Secretario, el Médico Forense y el Agente Judicial. Una vez practicada, el Juez ordena el LEVANTAMIENTO DEL CADÁVER y su traslado al lugar donde vaya a realizarse la autopsia. La diligencia de inspección ocular y levantamiento del cadáver es de extraordinario interés médico forense ya que como dice el profesor Gisbert un examen a la ligera del cadáver en el lugar de los hechos puede invalidar y hacer ineficaz la más minuciosa y perfecta de las autopsias. En primer lugar, se trata de proceder al examen del cuerpo para comprobar la realidad de la muerte, el momento estimado del fallecimiento y el posible origen (natural o violento) de la misma. A continuación habrá que

recoger aquellos datos e indicios que nos permitan la posibilidad de reconstruir los hechos, una aproximación a la causa, circunstancias de la muerte y la posible intervención de terceros. Para ello se tomará nota de los siguientes datos: posición del cuerpo y relaciones con el entorno, examen somero de las ropas, apreciación de lesiones de forma general, búsqueda y recogida de indicios biológicos y no biológicos y cualquier otra circunstancia de interés. Es fundamental apoyar la recogida de estos elementos con croquis, esquemas, fotografías o videos. Ciñéndonos al tema que nos ocupa es evidente que en el estudio biológico forense de un determinado caso nosotros somos el primer eslabón de la cadena. De nada sirve un extraordinario laboratorio, con los mejores recursos humanos y materiales, sí el médico forense no sabe que indicios buscar, como los tiene que recoger y conservar y enviar y que tiene que solicitar al laboratorio. VESTIGIOS DE INTERÉS MÉDICO LEGAL
BIOLÓGICOS - Sangre - Semen - Restos - Tejidos - Uñas - Mordeduras / saliva -Otros NO BIOLÓGICOS - Ropas - Balas, tacos, perdigones - Fibras diversas. - Restos de pintura - Fragmentos de vidrio - Tierra - Otros

CONSERVACIÓN DE LOS VESTIGIOS

A.- DURANTE EL TRASLADO - Evitar pérdidas y contaminaciones. - Proteger las manos - Envolver el cuerpo.

B.- EN EL DEPÓSITO - Mínima manipulación. - No retirar envoltorio. - No desnudar ni lavar. - No obtener la necrorreseña.

RECUPERACIÓN DE LOS VESTIGIOS I.- EXAMEN CUIDADOSO DEL CUERPO - Búsqueda de elementos adheridos en ropa / piel. - Toma de muestras de sangre. - Toma de muestras de uñas - Toma de muestra de boca / ano / vagina. II.- RECOGIDA DE VESTIGIOS BIOLÓGICOS III.- RECOGIDA DE VESTIGIOS NO BIOLÓGICOS RECONOCIMIENTO Y RECOGIDA DE MUESTRAS DEL POSIBLE AUTOR INSPECCIÓN GENERAL. Encaminada a la búsqueda de lesiones o signos de lucha o defensa, que puedan orientarse hacia su participación en los hechos. RECOGIDAS DE INDICIOS. Ropas que llevaba en el momento de la agresión. Muestras de pelos: cabellos, barba, bigote, vello púbico... Muestras de sangre y/o saliva. Hisopo lavado de glande. OTROS PROBLEMAS MÉDICO LEGALES QUE NOS PUEDE RESOLVER LA BIOLOGÍA FORENSE

− INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA DEL PARENTESCO.
− INDIVIDUALIZACIÓN DE RESTOS HUMANOS. − IDENTIFICACIÓN DE RESTOS ÓSEOS. − ESTUDIO BIOLÓGICOS DE LA MUERTE POR SUMERSIÓN.

ENVÍO DE MUESTRAS AL LABORATORIO FORENSE

VICTORIA PRIETO RUIZ-CANELA Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla El estado actual de las técnicas de identificación genética hace posible el análisis de cantidades trazas de restos biológicos y la convierten en una herramienta imprescindible en la investigación de vestigios biológicos de interés forense. Desde una colilla dejada en el lugar del crimen, un pelo o unos escasos restos epiteliales restantes en unas uñas tras un arañazo son hoy valiosas “pruebas” que pueden por si solas arrojar la información suficiente para identificar a un sospechoso. Sin embargo, paralelamente al aumento de sensibilidad en las técnicas de detección de ADN, ha crecido el riesgo de contaminaciones exógenas de las que puede derivarse el fracaso de la investigación. Además, una mala praxis en la toma de muestras o el incumplimiento de la cadena de custodia puede incurrir en la invalidación de la prueba ante los Tribunales. Conscientes de estos riesgos, se han realizado desde hace tiempo muchos esfuerzos encaminados a mejorar las condiciones de recogida de indicios, su preservación y envío al laboratorio, como son la elaboración de recomendaciones y normas para la recogida de muestras, diseño de protocolos de actuación en su recogida y formularios que permitan sintetizar toda la información referente a una muestra concreta. En el año 1996, el Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses (INTCF) elaboró unas “Normas para la preparación y remisión de muestras objeto de análisis por el Instituto de Toxicología”, que se publicaron en el BOE nº 308 de 23 de diciembre de 1996 (Orden de 8 de noviembre de 1996) que contiene, entre otros apartados, información sobre el tipo de muestras que deben estudiarse, cómo deben enviarse y los formularios que deben cumplimentarse cuando se solicitan análisis genéticos. Estas normas se

encuentran hoy en revisión para adaptarlas a las nuevas técnicas y se espera su pronta publicación en el BOE. Por otro lado, dentro del GEP-ISFG (Grupo Español y Portugués de la Sociedad Internacional de Genética Forense) se elaboró un documento de “Recomendaciones para la recogida y envío de muestras con fines de identificación genética” en el año 1999, cuya misión es la de difundir buenas practicas en la toma y manejo de muestras que permitan garantizar la autenticidad e integridad de las mismas, así como asegurar el cumplimiento de la cadena de custodia. Este documento se aprobó en la reunión del GEP-ISFG del 2000 y fue publicado por el Ministerio de Justicia en el 2001 y difundido entre todos los Médicos Forenses del Estado. No existe aún en España una normativa oficial para la recogida de muestras, aunque esperamos que se derive de actuales proyectos tales como los de la ley de bases de datos de ADN y los procesos de acreditación de los laboratorios forenses. Entre los puntos más importantes que observaremos en relación con el envío de muestras al laboratorio forense destacaremos las precauciones destinadas a la protección del personal, las precauciones destinadas a la protección de las muestras, la documentación necesaria y la toma de muestras. 1. Precauciones destinadas a la protección del personal. En la manipulación de evidencias biológicas será necesario tomar precauciones universales asumiendo que cualquier muestra puede ser infecciosa: uso de guantes, mascarilla, bata u otra ropa protectora; prohibición del consumo de bebidas, comidas y tabaco; uso de material desechable siempre que sea posible y uso de contenedores específicos para residuos biológicos; vacunación del personal (hepatitis, tétanos, etc.). 2. Precauciones destinadas a la protección de las muestras. Todo lo expuesto anteriormente tiene cabida también en cuanto a la protección de la muestra, que debe ser protegida tanto de la contaminación biológica por otro material genético ajeno al de la evidencia como de la degradación por una incorrecta manipulación de la misma.

La prevención de contaminaciones biológicas de la muestra debe contemplarse en todos los estadíos de recogida, procesado previo y análisis de las muestras y en este sentido la primera regla de oro a observar será: Nunca, bajo ninguna circunstancia, se permitirá al sospechoso ocupar el mismo área de la víctima (o viceversa) hasta que todas las evidencias se hayan recogido. Esto incluye vehículos, salas de espera, salas de interrogatorio, etc. La misma regla cuenta para el envío de muestras dubitadas e indubitadas que jamás deben compartir el mismo embalaje, e incluso en el laboratorio durante el alicuotado y procesado de las muestras debe observarse una separación espacial y temporal entre evidencias y muestras indubitadas. Además, deben preservarse las evidencias de la exposición a condiciones medioambientales adversas que podrían favorecer la proliferación microbiana, utilizar embalajes de papel con preferencia al plástico y nunca añadir conservantes del tipo del formol. 3. Documentación necesaria. Formularios de envío de muestras en casos de interés criminal y de investigación de la paternidad, especificando el tipo de estudio solicitado. Datos de identificación de la muestra. Cadena de custodia: nombre y firma del personal que recoge la muestra, fecha y hora, y condiciones de almacenamiento hasta su envío. Fecha de envío y medio de transporte utilizado. Documentos adicionales: informe preliminar de autopsia, antecedentes clínicos, fotografías de la localización de los indicios, etc. 4. Toma de muestras. Muestras de referencia en personas vivas: sangre, saliva, pelos. Muestras de referencia en cadáveres: sangre, saliva, pelos. Muestras de referencia en cadáveres en avanzado estado de putrefacción o esqueletizados: dientes, hueso largo. Otras posibles muestras de referencia: biopsias, preparaciones histológicas, objetos personales del fallecido.... . Indicios biológicos: recoger en función de la naturaleza del indicio y del soporte sobre el que se presenta. Empaquetar cada indicio por separado.

CRITERIOS DE ORGANIZACIÓN Y CALIDAD

PILAR SANZ NICOLÁS Directora de Departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses.

El Laboratorio Forense reúne una serie de requisitos que lo hacen muy diferente de otros tipos a los que estamos más acostumbrados como son los de centros de investigación, universitarios o incluso los de algunas empresas. Estos requisitos se refieren al propio tipo de trabajo, que por ser judicial está sujeto a absoluta confidencialidad. El perito también tiene que reunir una serie de requisitos, independientemente de su preparación técnica, y no puede participar en una pericia si existen relaciones de parentesco, consanguíneo o de afinidad, o amistad o enemistad, con el acusado o la víctima, tampoco si tiene algún tipo de interés en la causa judicial. Y por último una de las diferencias más importantes en el trabajo pericial lo constituyen las propias muestras, sobre todo en los casos criminales. Por tratarse de pruebas para el esclarecimiento de un delito, se les denomina vestigios, suelen ser únicas, las más de las veces irrepetibles (salvo las muestras de referencia que se toman a un acusado o a una víctima viva), son limitadas y muy frecuentemente muy escasas, sobre todo desde que disponemos de la tecnología del ADN y podemos analizar muestras mínimas. Todo ello exige por parte del experimentador (facultativo o auxiliar de laboratorio) altas dosis de cuidado y responsabilidad. Pero además, como necesariamente tienen que estar perfectamente autentificadas, es obligatorio conservar al menos una parte para futuros análisis y muchos de los objetos son también piezas de convicción que hay que aportar al momento del juicio (un arma, unas ropas), es necesario tener rigurosamente establecida y controlada la cadena de custodia.

La cadena de custodia no debe presentar ni una sola discontinuidad; debe en todo momento estar documentada la localización exacta de las muestras originales, de las muestras de análisis, sus alícuotas y extractos. Esta custodia abarca desde la entrega al Centro por el transportista, la entrega al laboratorio, la conservación hasta el momento del análisis y durante el mismo y la custodia postanálisis hasta la devolución de las muestras originales al Juzgado cuando procede o su destrucción. Todos los cambios de ubicación o de mano deben estar registrados y los posibles envíos al exterior documentados (devoluciones al Juzgado o envío a otros Laboratorios para ampliación de análisis). El informe escrito está también estipulado y la LEC exige que conste una descripción detallada de las muestras y de su estado, una relación detallada de los análisis y de los resultados. Esto y la necesaria rigurosidad de los estudios hace que se disponga de protocolos normalizados de trabajo para todas las operaciones del laboratorio, de hojas de recogida de datos en los que se consignan todas las circunstancias de cada ensayo y sus resultados y que estos estén contrastados por los dos peritos que firman el informe. El laboratorio forense debe estar por tanto sometido a medidas de control de la calidad basadas en la norma internacional ISO17025 y a la larga tendrá que estar acreditado. Por último y como ya se ha dicho al comentar la necesidad de conservar una parte de las muestras originales, las pruebas periciales pueden estar sometidas a contraanálisis por otros peritos, para confirmar resultados no aceptados por alguna de las partes (acusación o defensa). Por ese motivo y para que los análisis puedan ser comparativos, los laboratorios forenses deben utilizar Métodos Normalizados Oficiales desarrollados por Centros de Referencia y regirse por normativas de carácter internacional. En el caso de la Genética Forense estas normas las dicta la Sociedad Internacional de Genética Forense a los que todos los miembros de los laboratorios de Biología Forense de España pertenecemos. Para revalidar la calidad de nuestras pericias realizamos además controles de calidad internos y ejercicios anuales interlaboratorios.

TIPOS DE ESTUDIOS EN UN LABORATORIO DE BIOLOGÍA FORENSE

VICTORIA PRIETO RUIZ-CANELA Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla Si nos dejásemos llevar por nuestra imaginación, uno pensaría que no hay nada imposible para un laboratorio de biología, en este caso forense, y esto es porque la visión que la sociedad recibe de la biología moderna suele ser a menudo una simplificación llena de falsedades procedentes del sensacionalismo periodístico y de la ciencia-ficción. A pesar de los avances tecnológicos, aún quedan cuestiones por resolver, tales como la data exacta de una mancha, por ejemplo. Los tipos de estudios solicitados más frecuentemente en un laboratorio de biología forense son: Estudios de filiación: el caso más simple sería la investigación biológica de la paternidad o maternidad en un trío hijo-madre-padre o bien contando únicamente con el progenitor cuestionado y el hijo. Las complicaciones aparecen cuando no es posible contar con el progenitor cuestionado por fallecimiento, siendo necesario en tal caso recurrir al análisis de otras muestras biológicas del fallecido, al análisis de familiares directos de éste que permitan reconstruir su genotipo cadáver. Estudios de identificación de restos cadavéricos: se realiza mediante el análisis biológico de maternidad o paternidad o en su defecto análisis de otros familiares que compartan la línea materna o paterna. También puede recurrirse al análisis de otras muestras biológicas del fallecido o de objetos personales del mismo. Identificación de indicios biológicos de interés criminal: son el tipo de análisis más solicitado en el laboratorio de biología forense. Todos los indicios recogidos sobre la víctima, el sospechoso o el lugar de los hechos deben ser objeto de un minucioso y exhaustivo estudio que permita localizar, conocer o confirmar la naturaleza de los indicios, que variaran en función de las o incluso a la exhumación del

características del suceso investigado. Los vestigios biológicos más frecuentes son los restos de sangre, fluidos seminales, fluidos vaginales, saliva, pelos y restos orgánicos en uñas. Otro tipo de restos biológicos menos frecuentes son la orina, las heces, la caspa, las uñas... . En el próximo tema de este curso tendremos ocasión de conocer en detalle cuales son los métodos de detección de estos indicios en función de sus características, los tipos de soporte más frecuentes sobre los que se encuentran individualización. Identificación de especie: determinados restos hallados casualmente pueden ser indicios de hechos delictivos que puedan ser causa para abrir una investigación. La solicitud de identificación de especie suele ir frecuentemente ligada al hallazgo de restos óseos muy fragmentados o cualquier otro resto orgánico del que pueda sospecharse un origen humano. Estudios complementarios en casos de muerte por sumersiónasfixia: siempre que se recupera un cadáver del agua o cuando se sospecha que la causa de la muerte puede haber sido la sumersión, será necesario confirmar los datos macroscópicos obtenidos en la autopsia mediante estudio anatomopatológico y considerar otros datos tales como la existencia de hidremia ( hemodilución de la sangre del ventrículo izquierdo respecto de la del derecho) y la existencia de elementos formes en las vísceras del cadáver que deben compararse, siempre que sea posible, con las del líquido de sumersión. Estudios bioquímicos en casos de muertes súbitas e así como sus posibilidades de

intoxicaciones: En casos de shock anafiláctico, los marcadores biológicos que se investigan son la histamina, la triptasa y la IgE total y la específica. En casos de muerte súbita interesa la determinación de glucosa, urea, creatinina y cloruros. En casos de intoxicación por organofosforados y carbamatos se procederá a la determinación de acetilcolinesterasas y/o pseudocolinesterasas. Identificación de setas y plantas superiores en casos de

intoxicación: cuando se sospecha una intoxicación debida a setas o plantas tóxicas es necesario la identificación del elemento tóxico para confirmar si es el responsable de los síntomas observados. La confirmación del origen de la intoxicación servirá para adecuar el tratamiento médico al tóxico concreto en

función de su naturaleza. A tal fin, deben enviarse al laboratorio los especimenes completos responsables de la intoxicación, si se cuenta con ellos, o restos cocinados o de contenido gástrico. Es posible identificar restos de setas en contenido gástrico o en otras muestras utilizando técnicas de ADN, como veremos a lo largo de este curso. Estudios microbiológicos en muestras postmortem en casos de etiología no aclarada: en el caso concreto del INTCF se realizan únicamente en el Departamento de Madrid y su finalidad es intentar arrojar algo de luz en aquellos casos de muertes de etiología desconocida en los que se sospeche un origen infeccioso. Si durante el curso de la investigación se detecta algún patógeno de reconocida alarma social tal como el meningococo, en colaboración con otros centros de referencia se procederá a informar a la consejería de salud correspondiente y a la puesta en marcha de los dispositivos de control epidemiológico. Estudio del contenido gástrico: en algunos casos, conocer el estado de la digestión así como la naturaleza de la última comida puede aportar datos en una investigación. A menudo, la integridad de los fragmentos de alimento hallados en un contenido gástrico podría indicar un período corto de digestión, sin embargo, este dato no puede correlacionarse con una ingesta inmediata al momento de la muerte ya que pueden confluir muchos factores que hacen esta correlación muy inexacta. Los estados emocionales del individuo así como la propia naturaleza de los alimentos influyen en el tiempo de digestión y permanencia de los alimentos en el estómago.

IDENTIFICACIÓN DE INDICIOS

VICTORIA PRIETO RUIZ-CANELA Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla Los tipos de indicios más comúnmente estudiados en el laboratorio de biología forense son los restos de sangre, semen, fluidos vaginales, saliva y pelos, que se presentan sobre una amplia variedad de soportes. Casi todos tienen en común que son escasos, están degradados o contaminados y son únicos e irrepetibles. La localización de una determinada evidencia de asiste a menudo con el uso de una fuente de luz forense que nos permite la utilización de diversas longitudes de onda y diversos filtros para detectar la fluorescencia típica de los fluidos orgánicos. En nuestro laboratorio contamos con una de estas fuentes (MCS-400 de Spex Forensics) basadas en el uso de distintos filtros, que han ido reemplazando a las fuentes laser por sus ventajas en el campo forense. Tras ser localizado, realizaremos una serie de pruebas preliminares, específicas para cada tipo de indicio, con las que estableceremos el diagnóstico de orientación o de certeza sobre la naturaleza del indicio. Sangre: es un tipo de indicio fácilmente reconocible sobre determinados soportes. Existe una amplia variedad de tests de diagnóstico previo que ponen de relieve su presencia (luminol, benzidina, fenolftaleina, o-toloidina, guayacol, verde leucomalaquita...). Los tipos de soporte más comunes sobre los que se presenta son ropas, armas, uñas, en el lugar de los hechos (tierra, suelo, piedras, paredes..). El estudio de la morfología de las manchas en la escena del delito proporciona información a cerca de cómo se produjeron los hechos. Semen: el principal componente celular del semen es el

espermatozoide, célula especializada flagelada que suele medir entre 50 y 55 µm, distinguiéndose básicamente dos partes: cabeza y cola. Su número puede variar entre 50 x 106 y 150 x 106 por mililitro de eyaculado, con una media de unos 100 x 106/ml en individuos normospermos. El volumen de eyaculado también varía entre unos 2 ml y 6 ml con un valor medio de unos 3,5 ml. Existe

una gran variabilidad en estos datos no sólo entre individuos, sino también dentro del mismo individuo según la edad o entre distintos eyaculados. Además de los espermatozoides, en el semen podemos encontrar otros elementos formes tales como leucocitos y células epiteliales del tracto urinario aunque en número mucho menor. Así, si en un individuo normospermo podemos esperar unos 450 µg de ADN/ml de eyaculado, en un individuo azoospérmico esperaremos unos 30 µg, esto es, sólo un 6,3% del normal. Otros rasgos característicos del semen son su pH básico (8,3) y su capacidad de fluorescer en la región visible del espectro cuando es irradiado con luz ultravioleta. La presencia característica de altas concentraciones de fosfatasa ácida y de una proteína específica (proteína P30 ó PSA) serán rasgos que se utilicen en el diagnóstico previo ( test presuntivos) en la investigación de restos de semen. Las técnicas de confirmación implican la observación de espermatozoides en preparaciones microscópicas realizadas a partir de las muestras a analizar. Fluidos vaginales: las células del epitelio vaginal sintetizan glucógeno bajo la acción de los estrógenos. La identificación de estos restos se basa en esta particularidad (Reacción de PAS (+) Periodic Acid-Schiff) así como en la presencia de flora bacteriana característica (bacilos de Döderlein). Sin embargo, este carácter glucogenogénico está ausente en mujeres amenárquicas (aunque las terapias con estrógenos pueden afectar esto) y sufre variaciones durante el ciclo menstrual, alcanzándose los niveles más altos de glucógeno durante la ovulación. Estas células no son exclusivas del epitelio vaginal ya que se encuentran también en menor cantidad en la boca y en el tracto uretral de hombres (en concreto en la fosa navicular). Por tanto, el hallazgo de unas pocas células puede ser comprometido, hecho que se da a veces cuando se solicita la localización de células procedentes del epitelio vaginal en un hisopo penil. Saliva: a menudo estos restos se hallan en cantidades mínimas, por lo que es comprometido decidir entre la identificación del tipo de vestigio o la obtención del perfil de ADN. Los humanos producimos entre 1 y 1,5 litros de saliva al día y, acompañando a la saliva, se encuentran las células descamadas del epitelio bucal que serán el sustrato para la extracción de ADN

en estos restos. Las pruebas de orientación se basan en la detección de actividad alfa-amilasa. Esta enzima no es específica de la saliva, se encuentra también en el páncreas, en el sudor, en la leche materna, en el semen y en los fluidos vaginales. Puede considerarse un buen marcador para la presencia de saliva ya que sus niveles son 50 veces más altos en saliva que en el resto de fluidos orgánicos. Las amilasas se encuentran también en animales (tipo alfaamilasas) y en plantas (tipo beta-amilasas). Para la confirmación de presencia de restos de saliva deberán observarse células del epitelio bucal en los extractos de las muestras. Los soportes más comunes son colillas, sellos, sobres, mordazas, mordeduras, manchas en ropas, chicles, vasos... . Pelos: en los mamíferos, el pelo atraviesa tres fases en su ciclo de crecimiento, anágena, catágena y telógena. La fase anágena es la fase de crecimiento activo del pelo, en ella las células del folículo se multiplican por mitosis y forman el pelo al queratinizarse completamente. Un cabello humano crece a un ritmo aproximado de 0.35 mm por día. La fase catágena es una transición entre el estado de crecimiento activo y el estado de no crecimiento. En la fase telógena, ha cesado la actividad del folículo. Una cabeza humana tiene aproximadamente entre 100.000 y 150.000 folículos pilosos, de los cuales entre el 80 y el 90% estarán en fase anágena y entre el 10 y el 20% en fase catágena o telógena. En nuestra actividad diaria, los humanos perdemos entre 50 y 100 pelos. A menudo un perito es consultado sobre la cuestión de sí un determinado pelo hallado en la escena de un crimen puede haber sido arrancado o simplemente cayó allí. Si el pelo fue arrancado por la fuerza muy probablemente quedará tejido folicular adherido a la base del pelo, sin embargo es posible arrancar pelos que estuviesen en fase telógena o que no cuenten con ningún tejido adherido a la base. Por tanto, la ausencia de tejido folicular no prueba necesariamente que el pelo fuese caído y no arrancado. A diferencia de los cabellos, los pelos púbicos pasan más tiempo en fase telógena que en anágena. La mayoría de los pelos que encontraremos en casos de agresión sexual serán telógenos. De entre todas las evidencias, los pelos son los más susceptibles de transferencias secundarias.

Restos en uñas: una excoriación leve en la piel, cuyas señales desaparezcan a las 24 horas, puede dejar restos epidérmicos en las uñas suficientes para obtener un perfil de ADN por PCR. Un estudio realizado entre voluntarios que se produjeron excoriaciones leves y superficiales que desaparecieron dentro de las 24 horas posteriores al experimento concluyó que: los dedos índice y medio producen los arañazos más largos y profundos; a igual fuerza aplicada, en los arañazos sobre regiones de piel más suave tales como el cuello o zona superior del brazo se recuperaron restos epidérmicos pero no así en zonas de piel muy curtidas como el antebrazo; se encontró una correlación entre la fuerza aplicada y la cantidad de ADN recuperado. Otros tipos de indicios menos frecuentes en el laboratorio: a veces se solicita al laboratorio el análisis de restos que, aunque no son habituales, pueden aportar datos importantes a la investigación de un caso determinado. Entre estos restos podemos citar: Restos de orina: La identificación de la orina se basa en la detección de iones o compuestos orgánicos que se hallan más concentrados en orina que en otros fluidos fisiológicos, tales como la urea o creatinina, también presentes en sudor, sangre, saliva, semen... pero en menor concentración. Contiene células epiteliales del tracto urinario, así como leucocitos y eritrocitos, muy diluidas en la orina, por lo que la esperanza de recuperar ADN a partir de manchas de orina es muy baja. Además, la flora bacteriana propia de la orina acelera los procesos de degradación en la muestra. Heces: La identificación de restos fecales se basa en la presencia de pigmentos biliares y de restos alimenticios no digeridos. Son un pésimo sustrato para la extracción de ADN. No es posible el estudio de ADN nuclear en estos restos debido a la extrema degradación y a su contaminación natural (aproximadamente la tercera parte del peso seco de las heces son bacterias). Sin embargo, si se han conseguido resultados en ADN mitocondrial, en concreto la región HV1, partiendo de 10 mg de heces frescas. Otros restos también analizados en el laboratorio son secreciones nasales, uñas, restos de tejido, caspa...

TECNOLOGÍA DEL ADN EN EL PROCESADO DE MUESTRAS FORENSES

MANUEL LÓPEZ SOTO Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla. De todas las partes que comprende una investigación criminal, ésta que a continuación desarrollaremos, pondrá de manifiesto la capacidad pericial y profesional del laboratorio de biología forense. De forma general y una vez que tenemos seleccionadas las muestras objeto de análisis, todo el proceso analítico se puede dividir en tres grandes bloques: EXTRACCIÓN de ADN, AMPLIFICACIÓN (PCR) y DETECCIÓN. Extracción de ADN Posiblemente, de los tres bloques citados anteriormente, la extracción constituya el paso más crítico, ya que cualquier manipulación errónea de la muestra en esta etapa inicial del proceso puede conducirnos a su descarte, siendo en algunos casos, el único indicio biológico de que se dispone para resolver un delito. Cualquier laboratorio forense debe contar con diferentes métodos de extracción que permitan obtener en cantidad y calidad suficiente ADN de la enorme variabilidad muestral que recibe. Los métodos de extracción se pueden dividir en tres grupos: a) Aquel que comprende una digestión, una extracción orgánica y una purificación-concentración o, como alternativa, una precipitación con etanol. Se utiliza para la mayoría de las muestras biológicas de interés forense. b) Aquel que comprende una etapa de digestión seguida de una precipitación con etanol. Se usa, principalmente, para obtener mucha cantidad de ADN a partir de sangre en buen estado.

c) Aquel que comprende solo una extracción directa mediante membranas especiales o bolas de sílice o similares. Su uso se limita normalmente a muestras de sangre líquida. Centrándonos en el primer método de extracción, y en concreto en la digestión lo que se consigue con ella es romper toda la estructura celular, es decir, se alteran todos los sistemas membranosos de la célula así como todas las estructuras en las que estén implicadas proteínas (nucleosomas, citoesqueleto celular, etc.), dejando el ADN libre. Para ello, se utiliza un tampón de lisis con detergente (SDS) para solubilizar los lípidos y una enzima proteolítica (Proteinasa K) para lisar las proteínas. Una vez que se encuentran todos los componentes celulares libres entre sí, pasamos al proceso de extracción propiamente dicho, donde se recuperará el ADN de todo ese “caldo molecular”. El método más extendido de todos es el de extracción orgánica con fenol cloroformo isoamílico (FCI). Al mezclar esta solución de FCI con el lisado celular obtenido de la etapa de digestión se genera una emulsión, que después de un centrifugado, permitirá separar el ADN de todo el material celular, aunque a veces junto con el ADN se separen otras moléculas que ser una fuente potencial de inhibidotes para el proceso de amplificación. Seguidamente, se añade N-butanol para eliminar los posibles restos de fenol que pudieran haber quedado en la solución acuosa. A continuación, esta solución acuosa se pasa por unidades de microfiltraciónpurificación para obtener un ADN lo más “limpio” posible, óptimo para el proceso de amplificación. Alternativamente a esta última etapa podremos llevar a cabo una precipitación con etanol. Como ejemplo de métodos de extracción directa expondremos la extracción con Chelex y con columnas GFx, entre otros. Por último, realizaremos un recorrido por los distintos tipos de muestras que llegan al laboratorio y por los métodos de extracción que se aconseja aplicar en cada caso. Además, se abordará brevemente la cuantificación del ADN humano y sus diferentes métodos.

Amplificación de ADN Sin lugar a dudas, posiblemente el desarrollo de esta tecnología de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y su aplicación a la biología molecular ha permitido que este campo de la ciencia se haya desarrollado a un ritmo espectacular. El proceso en sí mismo es muy sencillo; utilizando solo unos cuantos “ingredientes” se puede multiplicar (en millones de copias) cualquier fragmento de ADN que queramos. Desde el punto de vista molecular se requiere exclusivamente dNTPs, Cl2Mg, cebadores, polimerasa termorresistente, agua y el molde de ADN que se quiera multiplicar. El proceso de amplificación se puede dividir en tres etapas: a) Desnaturalización del ADN a 95ºC b) Annealing o unión de los cebadores al molde de ADN c) Extensión, es decir, la polimerasa empieza a fabricar la nueva cadena de ADN. Como requerimiento instrumental se necesitará un Termociclador. En definitiva, la PCR constituye un método fiable, sencillo, rápido y económico. Sistemas de detección de ADN Hace unos años, la gran mayoría de los laboratorios de genética molecular utilizaba como principal sistema de detección, geles de poliacrilamida seguidos de una tinción con plata. Sin embargo, con el desarrollo de los secuenciadores automáticos, que combinan química y fluorescencia tanto en su formato de gel como de capilar, no solo se ha mejorado en gran medida la calidad y la rapidez en la detección de un producto amplificado, sino que además ha permitido incluso analizar simultáneamente fragmentos de ADN del mismo peso molecular. Dentro de los secuenciadores automáticos parece que ha tomado ventaja en el mercado el de capilar respecto al de gel entre otras razones porque requiere una menor manipulación de la muestra y permite reanalizarla sin tener que volver a prepararla. En la actualidad existen varios modelos de secuenciadores del formato de capilar: uno, cuatro, dieciséis y noventa y seis capilares.

APLICACIÓN FORENSE DE MICROSATÉLITES AUTOSÓMICOS

MARÍA JOSÉ FARFÁN Espuny Jefa del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla La primera aplicación de la tecnología del ADN a la resolución de un caso judicial data de 1985, cuando las autoridades británicas exigieron una prueba biológica de filiación en un asunto de inmigración en el que con la batería de ensayos disponibles en ese momento se pudo deducir que el joven ghanés investigado pertenecía al entorno familiar de su supuesta madre, pero no se podía resolver si era su hijo biológico o su sobrino. Para resolver el caso se solicitó la colaboración de Alec Jeffreys que acababa de publicar la posibilidad de aplicar el análisis de determinadas regiones repetitivas y muy polimórficas del ADN a cuestiones de identificación humana, incluidos los estudios de filiación. Mediante el análisis de la huella genética del joven y de sus presuntos madre y tres hermanos pudo confirmarse la maternidad. Desde entonces, la tecnología del ADN ha experimentado un espectacular avance del que se ha visto beneficiada enormemente la Genética Forense. Actualmente la “prueba del ADN” constituye una pericia de enorme trascendencia en muchos casos judiciales lo cual ha supuesto en los últimos años un incremento considerable en la intervención de este tipo de pericias en los tribunales de justicia. En una célula humana, el ADN se localiza principalmente en el núcleo, aunque también existe una pequeña cantidad de ADN en las mitocondrias, de cuya aplicación forense se hablará en otro capítulo. El ADN nuclear se encuentra dividido y muy compactado en los cromosomas, que son unas estructuras muy densas formadas por ADN y proteínas. El genoma humano nuclear está constituido por 22 pares de cromosomas autosómicos y un par de cromosomas sexuales, X e Y, cuya combinación determina el sexo femenino (XX) o masculino (XY).

La mayor parte de los análisis de identificación genética humana se centra en marcadores polimórficos localizados en regiones no codificantes de los cromosomas autosómicos. Casi la mitad del ADN no codificante está constituido por ADN repetitivo, en el que destacan las secuencias repetidas en tándem, constituidas por una secuencia determinada que se repite consecutivamente una detrás de la otra un número variable de veces. Atendiendo al tamaño de la unidad de repetición, estas secuencias se denominan satélites (unidad de repetición: 1 000-10 000 nucleótidos), minisatélites (unidad de repetición: 7-100 nucleótidos) y microsatélites o STRs (“Short Tandem Repeats”) (cuya unidad de repetición contiene de 2 a 6 nucleótidos), siendo éstos últimos los más ampliamente utilizados en Genética Forense.

Análisis de STRs mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La introducción de la PCR en Genética Forense ha hecho posible el análisis de una gran variedad de muestras cuyo estudio resultaba imposible mediante las técnicas convencionales. La PCR permite la obtención in vitro de millones de copias de un fragmento de ADN específico a partir de una cantidad ínfima de ADN mediante una reacción enzimática cíclica. Dados los espectaculares avances científicos y tecnológicos

experimentados en los últimos años (que incluyen el desarrollo de múltiples fluorocromos para el marcaje diferencial de fragmentos de ADN y plataformas complejas de detección capaces de discriminar selectivamente entre ellos), hoy en día se pueden analizar de forma conjunta 15 STRs o más a partir de tan sólo 0,1-1 ng de ADN, obteniéndose un perfil genético suficiente para la individualización de un resto biológico. La principal ventaja de la aplicación de la PCR al laboratorio forense reside en el espectacular incremento en la sensibilidad de la técnica de individualización por ADN. No obstante, ello conlleva el inconveniente de un elevado riesgo de contaminación. Además, aunque la PCR ha supuesto una revolución en biología forense, presenta una serie de limitaciones que a veces son muy difíciles de salvar y que se refieren principalmente a las posibilidades

de degradación, inhibición de la reacción de PCR o la modificación del ADN. Por otra parte hay que tener en cuenta que durante la amplificación por PCR de marcadores STRs pueden originarse una serie de artefactos que pueden interferir con una clara interpretación de los resultados y cuya consideración es necesaria para garantizar un correcto genotipado. Por otra parte, con cierta frecuencia llegan al laboratorio muestras en las que se detectan perfiles genéticos que reflejan la presencia de una mezcla de células procedentes de más de un individuo cuyo análisis es más complicado y laborioso que en casos de perfiles únicos y requiere un alto grado de formación y experiencia por parte del perito para distinguir entre los alelos verdaderos presentes en la mezcla y los posibles artefactos, lo cual no siempre es posible.

STRs autosómicos de uso generalizado en genética forense Con fines de identificación humana es importante disponer de marcadores de ADN que exhiban una alta variación entre individuos y que en conjunto permitan discriminar entre ellos. Actualmente existen miles de STRs identificados y se calcula que en el genoma humano existe un STR cada 10 000 pares de bases. En los criterios a seguir para la selección de STRs con aplicación en identificación humana deben primar los siguientes factores: alto poder de discriminación, alta heterocigosidad, localización en distintos cromosomas para evitar el ligamiento entre marcadores, robustez y reproducibilidad de resultados en reacciones múltiplex, baja tasa de mutación y longitud de alelos en el rango de 90-450 pares de bases. Para un intercambio y comparación de resultados efectivo entre distintos laboratorios es necesaria la utilización de una batería de marcadores genéticos comunes. Actualmente, los marcadores más extendidos en el ámbito mundial son los 13 STRs autosómicos integrados en el sistema CODIS (“Combined DNA Index System”) establecido en 1997 por el FBI para la creación de un banco de datos nacional. La probabilidad de coincidencia al azar entre individuos no relacionados mediante el análisis de los 13 marcadores del CODIS es inferior a uno en un billón.

APLICACIÓN FORENSE DE LOS CROMOSOMAS X e Y

MARÍA JOSÉ FARFÁN ESPUNY Jefa del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla

Aparte de los STRs autosómicos, estrellas de la individualización mediante técnicas de ADN y a los que hemos dedicado el capítulo anterior, existen marcadores genéticos de especial relevancia en los cromosomas sexuales, cuyas peculiaridades los hacen idóneos para determinadas aplicaciones concretas. Un marcador de sexo: amelogenina La amelogenina es un locus localizado en una región homóloga de los cromosomas sexuales. Existe una diferencia de 6 pares de bases entre el tamaño del alelo presente en el cromosoma X y el Y, que se debe a una pequeña deleción en el cromosoma X. El resultado de la amplificación por PCR de este locus en un ADN femenino (XX) será de una única banda, mientras que si el ADN es masculino (XY), el resultado serán dos bandas de distinto tamaño. La mayoría de los kits comerciales actuales incluyen este marcador, que permite la designación del sexo del individuo donante de la muestra. No obstante, hay que tener en cuenta que, aunque ocurre con muy baja frecuencia, se ha detectado la existencia de deleciones en esta región del cromosoma Y, de tal forma que una muestra masculina podría asignarse erróneamente como femenina. En este caso, el análisis de marcadores específicos del cromosoma Y permitirían una correcta asignación del sexo.

STRs del cromosoma Y El cromosoma Y presenta una diferencia importante respecto al resto de cromosomas, su herencia es exclusivamente paterna, es decir, se transmite de padres a hijos varones sin que exista la posibilidad de recombinación. Por

tanto, la información genética contenida en el mismo se hereda como haplotipo, o sea, los genotipos para cada uno de los marcadores del cromosoma Y se transmiten en bloque y no de forma independiente. De esta forma, salvo posibles mutaciones, todos los individuos varones emparentados por vía paterna comparten el mismo haplotipo para el cromosoma Y. En los últimos años, el análisis de marcadores del cromosoma Y se ha extendido en los estudios de evolución humana para trazar linajes paternos. En Genética Forense, estos marcadores han demostrado también su utilidad en casos de mezclas complejas, en estudios de filiación cuando los individuos implicados son varones y resultan de especial utilidad en los casos de agresión sexual. En éstos es común encontrar indicios donde existe una mezcla de células femeninas de la víctima y masculinas del agresor. Aunque existen métodos de extracción basados en una lisis diferencial que permite la separación del ADN de las células epiteliales (normalmente vaginales) del ADN de los espermatozoides, esta separación no siempre es posible, especialmente si los espermatozoides están muy deteriorados o el agresor es azoospérmico. En estos casos, el uso de marcadores específicos del cromosoma Y aumenta las posibilidades de detectar pequeñas cantidades de ADN masculino presentes en un fondo de abundante ADN femenino, el cual en otro tipo de análisis (STRs autosómicos, por ejemplo) enmascararía la obtención de resultados a partir del ADN masculino. La limitación de este tipo de análisis reside en que, dado que el cromosoma Y no está sujeto a recombinación, es menos variable entre individuos, por lo que es necesario el análisis de muchos marcadores para obtener un alto poder de discriminación. STRs del cromosoma X En las células femeninas existe una pareja de cromosomas X de forma que éstos pueden recombinar entre sí comportándose de la misma forma que los cromosomas autosómicos, hablando en términos de su herencia. No obstante, los individuos varones transmiten a su descendencia femenina todos los marcadores localizados en su cromosoma X en bloque, es decir, uno de los cromosomas X de cada mujer es idéntico al de su padre. Esta peculiaridad

proporciona una herramienta útil en casos de paternidad con descendencia femenina así como en estudios de filiación o identificación en los que el presunto padre no está disponible y hay que recurrir a familiares en primer o segundo grado de parentesco.

APLICACIÓN FORENSE DEL ANALISIS DEL ADN MITOCONDRIAL

MANUEL CRESPILLO MÁRQUEZ Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Barcelona. Todo el patrimonio genético que poseemos los seres humanos se encuentra confinado en dos orgánulos celulares: núcleo y mitocondria dando nombre al ADN que en dichos estructuras se localiza: ADN nuclear (ADNn) y ADN Mitocondrial (ADNmt). La mayor parte del ADN celular se encuentra empaquetado en el núcleo, sin embargo, las mitocondrias, que se encuentran ubicadas en el citoplasma y constituyen las autenticas plantas generadoras de energía de la célula, poseen un ADN propio dispuesto circularmente y cerrado que se encuentran en múltiples copias dentro de la célula (1000 a 10000 copias). Por su composición bioquímica, las dos cadenas son diferentes, ya que en la secuencia nucleotídica de una de ellas prevalecen las bases púricas (adenina y guanina), por lo que es más pesada que su complementaria donde, para respetar la complementariedad han de predominar las pirimidínicas (timina y citosina). Así la primera de las hebras se denomina H (Heavy o pesada) y a la segunda L (Light o ligera). El ADNmt tiene 16569 pares de bases y en esa secuencia se distribuye 37 genes que codifican aproximadamente para el 10 % de las proteínas constitutivas de la mitocondria. Únicamente un 10% del genoma mitocondrial es no codificante. El ADNmt fue secuenciado completamente en 1981 por Anderson et al. La mayor parte de las variaciones entre individuos aparecen en una región no codificante del ADNmt de aproximadamente 1112 pares de bases y denominada bucle de desplazamiento (displacement loop, D-loop o región de control) (1-3 nucleótidos diferentes cada 100 bases), y dentro de esta región aparecen dos regiones descritas como región hipervariable I (HVR1) y región hipervariable II (HVRII) que son las que más interés han suscitado para la comunidad forense.

Pero, ¿Por qué interesa el ADNmt?. Tres son las características que hacen del ADNmt una herramienta útil para el laboratorio forense. 1. El número de copias de ADNmt por célula puede oscilar entre 1000 y 10000 dependiendo del tipo de célula y su actividad metabólica. Esta peculiaridad permite que ante muestras degradadas o con escasa o nula cantidad de ADNnuclear (pelos caídos) por una cuestión de mera probabilidad siempre puedan presentarse moléculas de ADNmt íntegras dispuestas para ser analizadas. Posiblemente, características estructurales como la disposición circular y su escasa extensión (sólo 16569 pb) la hacen también ser más difícilmente vulnerable a la acción de nucleasas, de manera que esta “resistencia” al proceso de degradación, tan usual en las muestras procesadas en el laboratorio forense, aumenta extraordinariamente el atractivo del ADNmt. 2. La ubicación de la molécula de ADNmt en zonas próximas a la membrana interna de la mitocondria, lugar donde se lleva a cabo la fosforilación oxidativa, expone de forma permanente al ADN a la acción de los radicales libres generados con el consiguiente efecto mutagénico. A diferencia de lo que ocurre con el ADN nuclear el ADNmt no posee histonas, de manera que dicho ADN quedará mucho más expuesto a la acción mutagénica. Por último la ADNmt polimerasa tiene una pobre actividad reparadora. El resultado de todo ello es un ADN con unos índices de mutación superiores al ADNn (5-10 veces superior). Esta gran variabilidad es siempre una propiedad interesante en el ámbito forense a efectos de poder discriminar entre individuos. 3. El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, por tanto todos aquellos individuos emparentados por vía materna poseerán, salvo mutaciones de “novo” puntuales, idéntico ADNmt. Esta propiedad es especialmente útil en casos de identificación de cadáveres en los que no se dispone de muestras de familiares próximos y se tiene que recurrir a familiares lejanos emparentados por vía materna. Hay un caso que ilustra a la perfección lo expuesto, se trata de la

identificación de los restos del último zar de Rusia Nicolás II y parte de su familia, los cuales fueron ejecutados y sepultados tras la Revolución bolchevique en 1918 y el hecho de poder contar con muestras de referencia de parientes maternos, algunos de ellos aún vivos, permitió su identificación certera mediante el análisis del ADNmt. Por tanto, el tipo de muestras en las que el análisis de ADNmt resulta especialmente útil son en aquellas que presentan un avanzado estado de degradación o en aquellas que la cantidad de ADN nuclear sea escasa o nula (por ej. pelos caídos o carentes de raíz). Actualmente el análisis del ADNmt se lleva a cabo mediante secuenciación directa de las regiones HVR1 (~400pb) y HVR2 (~400pb) tras la reacción de PCR. En los últimos años y gracias a un importante avance tecnológico, los métodos y procedimientos de secuenciación han experimentado un espectacular avance que ha permitido rápidos y precisos procesos de análisis y gran culpa de ello lo ha tenido especialmente la aparición de secuenciadores automáticos y el empleo de fluorocromos. Sin embargo, recientemente, la comunidad científica forense ha fijado sus esfuerzos en el análisis de otro tipo de polimorfismo que se presenta en el genoma (ADNn y ADNmt) con gran frecuencia, se trata de los SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). En este caso las variaciones entre individuos están basadas en mutaciones puntuales en la base ubicada en una cierta posición del genoma. Las estrategias así como las plataformas de análisis desarrolladas para el análisis de SNPs son muy variadas. El análisis de este tipo de polimorfismo dentro del ADNmt supone una herramienta muy útil cuando analizamos muestras altamente degradadas y el análisis de secuenciación no es viable o en aquellos casos en los que la secuencia obtenida es altamente frecuente y requerimos una mayor discriminación. El análisis del ADNmt presenta también una serie de limitaciones que convienen describir aunque sea sucintamente:

1. En primer lugar nos encontrado con la temida contaminación, que supone uno de los auténticos caballos de batalla de los laboratorios forenses. El análisis de ADNmt es mucho más sensible a la acción de contaminaciones, pensemos que la incorporación accidental de una sola célula aportando ADN exógeno al propio de la evidencia supone la adición de miles de copias de ADNmt. Esta circunstancia supondrá la aparición de resultados no interpretables y en el peor de los casos resultados erróneos. Es por tanto fundamental extremar al máximo las medidas encaminadas a evitar contaminaciones. 2. El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, de manera, que en un individuo cabe esperar un único tipo de ADNmt, sin embargo esto no es siempre así y en ocasiones podemos encontrar individuos en los que coexisten más de un tipo de ADNmt. A este fenómeno lo denominamos heteroplasmia. Estas pueden clasificarse en dos grandes tipos: de secuencia, caracterizadas por ser moléculas que discrepan en una determinada base en una posición concreta, y las llamadas heteroplasmias de longitud, cuya característica es diferenciarse unas de otras en el número de citosinas presentes en determinados tractos de las regiones HV1 y HV2. La aparición de una heteroplasmia en una muestra de referencia y no en la dubitada o viceversa puede, en ocasiones, complicar la interpretación y posterior valoración de resultados sin embargo en otros casos cuando la heteroplasmia se presenta tanto en la muestra dubitada como en la de referencia puede dar más peso, si cabe, al hecho de la coincidencia. 3. El análisis de ADNmt se muestra como una prueba realmente eficiente en casos de exclusiones, sin embargo cuando detectamos una coincidencia entre las muestras dubitadas y las muestras de referencia se hace imprescindible un tratamiento estadístico, y por tanto darle un peso a dicho “match”. El hecho de que la herencia del ADNmt sea exclusivamente materna, lo que implica una ausencia de recombinación, obliga a tratar la secuencia de ADNmt como un único locus. La práctica corriente y por otra parte recomendada por la Internacional Society of Forensic Genetic (ISFG) consiste en determinar la “rareza”de una determinada secuencia mediante

comparación con bases de datos poblacionales, y determinar el número de secuencias idénticas a la de la muestra problema que hayan sido detectadas en dicha base de datos. Las bases de datos que actualmente se disponen están nutridas con un número de secuencias relativamente escaso (3500-4000), el resultado es un bajo poder de discriminación si lo comparamos con el que el análisis del ADNn nos ofrece. Es por tanto muy importante hacer crecer dichas bases de datos y en esa línea ha volcando la comunidad forense sus esfuerzos con el fin de generar una gran base de datos mundial que contenga secuencias perfectamente contrastadas (EMPOP -EDNAP mtDNA population database-www.empop.org). En resumen, hemos de señalar que la molécula de ADNmt reúne una serie de características que hacen de ella una herramienta imprescindible en los laboratorios forenses. La comunidad científica ha hecho y sigue haciendo grandes esfuerzos para que en la actualidad su uso ante los Tribunales de Justicia de todo el mundo esté ampliamente aceptado. El análisis del ADNmt ha posibilitado emitir conclusiones y dictámenes en casos, que sin este tipo de estudio, hubiera sido del todo imposible, es por tanto justo darle la importancia que requiere este tipo de análisis con las ventajas e inconvenientes que hemos descrito anteriormente.

NUEVAS TECNOLOGÍAS EN GENÉTICA FORENSE

LOURDES PRIETO SOLLA Laboratorio de Biología-ADN de la Comisaría General de Policía Científica.

Introducción
La genética forense es una ciencia que no ha dejado de evolucionar y que sigue en constante cambio. Desde sus comienzos en España a principios de los años 90, hasta hoy, se han producido muchos avances en el campo molecular que se han ido incorporando a la rutina de los laboratorios forenses. Hace unos años se requería una mancha de sangre de considerable tamaño para poder realizar una identificación y hoy se puede obtener un perfil genético de un filtro de cigarrillo e incluso de los restos epiteliales presentes en las prendas de vestir producidas por el contacto continuado con la piel. Pero ¿qué podemos esperar en los próximos años?; si el análisis de ADN con fines forenses es una técnica tan estandarizada y establecida ¿por qué buscar nuevas tecnologías? Aunque es verdad que la tecnología del ADN ha permitido mejorar las investigaciones criminales, todavía existen limitaciones que actualmente están tratando de superarse. En la mayoría de los casos, los resultados de “la prueba del ADN” son claros y no están sujetos a debate. Sin embargo, no podemos obviar que los resultados analíticos de algunos casos son ambiguos. Desgraciadamente, las muestras biológicas relacionadas con el delito se encuentran a veces, diluidas, degradadas o proceden de varios contribuyentes. En estos casos, el análisis estándar de ADN y las búsquedas en las bases de datos son menos productivas y los resultados que ofrecen no son de elevada confianza. Por otro lado, el tiempo que transcurre desde que las evidencias biológicas llegan al laboratorio hasta que se emite el informe pericial puede ser considerablemente largo si el número de muestras involucradas en el caso es elevado. Por ello, las nuevas tecnologías en el análisis forense de muestras biológicas con fines identificativos se centran fundamentalmente en: posibilitar

el análisis de muestras degradadas, facilitar el análisis de mezclas y aumentar la rapidez y eficacia de los análisis.

Estrategias en el estudio de muestras degradadas
La identificación genética puede complicarse cuando existen largos períodos de tiempo entre la muerte y la aparición del cadáver, cuando la muerte ocurrió en unas condiciones críticas (explosiones por ejemplo), o cuando las muestras han estado sometidas a condiciones ambientales muy desfavorables (temperatura, humedad, cambios en el pH, agentes oxidantes, radiación, etc.), incluso aunque el tiempo transcurrido no sea muy largo. En estos casos el escaso ADN que pueda permanecer en las muestras se encuentra totalmente degradado (rotura de hebras, pérdida de nucleótidos, etc.). En estas muestras críticas, el análisis de STRs convencionales es problemático, pues los de mayor tamaño (300-400 pares de bases) no se logran amplificar en la reacción PCR. Actualmente, para evitar este problema, muchos laboratorios están centrándose en el diseño de nuevas PCR multiplexes con el fin de obtener amplicones más cortos (miniSTRs) que no den problemas en muestras de ADN de escasa calidad. Los miniSTRs, por tanto, son polimorfismos STR que se analizan mediante el diseño de los “primers” en una zona cercana al propio polimorfismo, evitando grandes regiones flanqueantes. Con ello se pueden analizar muestras degradadas que típicamente producen perfiles genéticos parciales y ausencia de información para loci grandes. Otro tipo de polimorfismos que pueden utilizarse en muestras degradadas son los SNPs (single nucleotide polymorphisms). Se trata de cambios de una única base dentro de una secuencia concreta de ADN. Pueden amplificarse mediante PCR produciendo amplicones muy cortos (50-100pb), pero además presentan otras ventajas como: su abundancia en el genoma humano, su baja tasa de mutación (característica muy importante en los casos de paternidad e identificación cadavérica) y la posibilidad de automatizar su análisis. Es ya una realidad en muchos laboratorios el estudio de SNPs situados en el ADN mitocondrial y el cromosoma Y, pues al tratarse en estos

casos de genomas haploides, su análisis es menos dificultoso. Sin embargo, ya se están comenzando a estudiar SNPs autosómicos, sobre todo con fines de fenotipaje. Cuando no disponemos de una muestra de referencia para comparar con una evidencia, no se puede deducir ninguna información útil a partir del ADN que habitualmente estudiamos (excepto el sexo). Por ello, actualmente se están buscando SNPs que ofrezcan información sobre el individuo que dejó la evidencia en el lugar del delito. Así se podrá orientar la investigación hacia uno u otro sospechoso en casos delictivos, pero también será una herramienta útil a la hora de facilitar la investigación de la identidad de una víctima en casos de cadáveres en mal estado de conservación. Aunque la ciencia forense está encaminada hacia estas investigaciones, el tipaje de SNPs autosómicos probablemente tardará años en ser aceptado en los tribunales.

Estrategias en el análisis de mezclas
El análisis de mezclas de ADN es una práctica habitual en la rutina forense. Su interpretación es delicada dado que se hace imposible diferenciar qué alelos pertenecen a cada contribuyente a la mezcla. Si además la mezcla está desequilibrada (uno de los contribuyentes aportó más cantidad de fluido biológico que el otro u otros) podemos cometer errores al asignar alelos que en realidad son artefactos de la amplificación (sttuters) o al no detectar alelos que realmente existen en la mezcla (drop out alélico). Si la mezcla está formada por el mismo tipo de fluido procedente de dos o más individuos la posibilidad de separar los perfiles genéticos se complica, pero si los fluidos que formaron la mezcla presentan diferentes características puede lograse la separación. Tal es el caso de las agresiones sexuales, en las cuales nos encontramos mezclados el perfil genético de la víctima procedente del fluido vaginal con el perfil genético del sospechoso procedente del semen. Habitualmente estas muestras se procesan extrayendo su ADN mediante lisis diferencial, basada en la resistencia que presentan los espermatozoides (y no las células del epitelio vaginal) a la digestión mediante proteinasa K. Sin embargo, cuando el número de espermatozoides es escaso (bien por que la toma de muestra se realizó transcurrido un tiempo desde la agresión, porque la

víctima retirara la mayoría mediante lavado, o porque el agresor sea oligospérmico) la lisis diferencial no es eficaz. Para solucionar estos problemas se han creado programas informáticos que nos ayudan a la interpretación de mezclas (Pendulum) cuando no existe la posibilidad de la separación física de los perfiles genéticos. Por otro lado, en casos de delitos contra la libertad sexual, donde la separación física es posible, es cada vez más frecuente el uso de microscopios capturadores de espermatozoides. Estos microscopios permiten aislar mediante láser cada espermatozoide que visualizamos e introducirlos en un tubo para extraer su ADN independientemente del de la víctima, evitándose así los perfiles mezcla.

Automatización y rapidez del análisis forense
Uno de los principales problemas hoy en los laboratorios forenses es el gran número de datos electrónicos que se generan regularmente. Desde que una muestra llega al laboratorio hasta que se escribe el informe pericial son muchos los pasos que se dan y los resultados analíticos que se producen. Hemos de tener en cuenta el carácter judicial de las muestras que analizamos, y como tales han de estar controladas en todo momento, siguiendo una cadena de custodia tanto de los efectos como de las sub-muestras que se generan de ellos. Por tanto, en los últimos años ha sido necesario desarrollar sistemas informáticos que permitieran el manejo fácil y seguro de toda esta información generada, los LIMS (Laboratory Information Management Systems). Estos sistemas nos permiten saber dónde están en cada momento las muestras que se analizan y en qué fase del análisis se encuentran (trazabilidad), nos proporcionan las herramientas necesarias para las revisiones administrativas de cada caso y contienen módulos analíticos para estudios de ADN (comparación y almacenamiento de perfiles genéticos, análisis estadísticos, etc.). Las técnicas de análisis en sí también están automatizándose. Existen hoy en día robots para extraer ADN de un elevado número de muestras en un par de horas, aunque aún no están preparados para muestras críticas. También se está realizando un gran esfuerzo en acortar los tiempos de análisis utilizando tecnologías que permitan realizar PCR multiplexes de un gran

número de loci (zip-code primers) así como técnicas de genotipaje alternativas a la secuenciación. La mayor parte de los nuevos métodos de genotipaje se basan en dos principios: hibridación con oligonucleótidos específicos de alelo y uso de enzimas modificadores de ADN. Ejemplos del primer tipo serían el uso de sondas ASO (allele specific oligonucleotides) o de primers específicos de alelo durante la PCR. Entre los enzimas modificadores de ADN podemos nombrar la ADN polimerasa (minisecuenciación), la ADN ligasa (ligamiento de oligos) y las ya clásicas enzimas de restricción). Estos diferentes métodos de análisis pueden combinarse con multitud de nuevos métodos de detección. Los sofisticados biochips en todas sus modalidades (conventional spoting microarrays, electronically activates microarrays) y la espectrometría de masas (MALDI-TOF), son algunos de los ejemplos que ya hoy son una realidad en los laboratorios forenses más punteros.

TÉCNICAS MOLECULARES DE IDENTIFICACIÓN DE SETAS CON INTERÉS FORENSE Mª JESÚS ITURRALDE PARDO Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Madrid. Introducción A lo largo de los últimos 50 años las intoxicaciones por setas presentan un crecimiento significativo en todo el mundo. Las causas de este hecho se deben tanto a la mayor afición de recolectar y consumir setas como al incremento del consumo voluntario de setas alucinógenas. En cuanto a la etiología médico legal, la mayor parte son accidentales; le siguen el uso intencionado de hongos psicoactivos siendo excepcional la etiología homicida o suicida. La importancia de los micetismos se encuentra, no tanto en la frecuencia con que se presentan sino porque los pacientes pueden haber ingerido setas con toxinas potencialmente mortales. El análisis de laboratorio no sólo sirve para confirmar el diagnóstico de un micetismo y aportar nuevos taxones al catálogo de especies tóxicas, sino también para evitar tratamientos agresivos, hospitalizaciones innecesarias y diagnosticar síndromes mixtos o micetismos cuyos períodos de incubación queden solapados. La identificación tradicional de las setas tóxicas se basa en criterios morfológicos y en la detección de toxinas. Estos análisis en ejemplares muy deteriorados e incluso triturados, cocinados y a veces en vómitos o heces suelen ser muy difíciles. Por ello un método de identificación independiente tanto de la calidad del material fúngico como de la cantidad sería extremadamente útil. La determinación de especie mediante el estudio de marcadores genéticos podría ser una buena herramienta.

Tabla 1. Clasificación de los micetismos en función del periodo de latencia y del órgano sobre el que actúa la toxina.
Periodo de latencia Inferior a 6 horas Organo diana Sistema nervioso Tipo de reacción - Colinérgico - Glutaminérgico Toxinas Muscarina Ac. iboténico Muscimol - Epileptogénico - Alucinogénico Hidracinas Psilocina Psilocibina Gastrointestinal - Reacción disulfiram - Miscelánea gastrointestinal Alérgico - Inmunohemolítico - Neumónico Entre 6-24 horas Hígado - Hepototóxico Amatoxinas Coprina Coprinus atramentarius Boletus sp; Entoloma sp, etc Paxilus involutus Lycoperdon sp. Amanita phalloides Lepiota sp; Galerina sp. Riñón - Nefrotóxico Amanita proxima Amanita smithiana Otros - Eritromelalgia Acidos acromélicos Clitocybe acromelalga Clitocybe amoenolens Superior a 1 día Riñón Sistema nervioso Músculo - Nefrotóxico - Neurotóxico - Rabdomiolisis Orellanina Cortinarius sp Hapalopilus rutilans Tricholoma equestre (*) Russula subnigricans Especies Clitocybe/Inocybe Amanita muscaria Amanita pantherina Giromitra Psilocybe

(*) considerada gran comestible hasta el año 2001

Regiones polimórficas del ADN en hongos. De los diferentes genes del ADN que han sido investigados en micología, gen de la Beta-tubulina, gen de la Orotidina descarboxilasa, gen de la Chitina sintetasa, gen de la Actina, gen del Factor de elongación, son las regiones ITS-1 e ITS-2 (internal transcribed spacer) del nrDNA las que más se han utilizado para la identificación molecular de hongos. Metodología de análisis del ADN. Basada en la Técnica de Amplificación génica por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa). Para amplificar cada una de las regiones diana de interés en taxonomía se diseñan cebadores específicos para ellas. Los productos amplificados pueden ser caracterizados de diferentes maneras. Las técnicas más utilizadas en micología son: PCR/RAPD (Análisis del ADN amplificado al azar). Se trata de un método en el que no se necesita tener conocimientos previos sobre el genoma de un determinado organismo y se realiza a partir del genoma entero. Se utilizan diferentes iniciadores de secuencia arbitraria. Los productos amplificados se

separan mediante electroforesis. Se obtiene un patrón de bandas PCR/RAPD para cada especie. PCR/RFLP (Análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción). Esta técnica permite obtener, para cada organismo, una serie de fragmentos del ADN de diferentes tamaños que dan lugar a un patrón de bandas PCR/RFLP. Ello se consigue fragmentando la región amplificada mediante el uso de enzimas de restricción. Comentarios: técnicas rápidas y económicas pero dan patrones difíciles de interpretar y poco reproducibles. PCR/SSCA (Análisis conformacionales del ADN de una sola cadena). Es un método rápido y económico para detectar polimorfismos de secuencia sin necesidad de secuenciar. Se basa en la movilidad de las cadenas sencillas de ADN. Los cambios en la migración tienen un alto grado de sensibilidad, de tal manera que dos cadenas del ADN que difieran en una sola base migrarán de forma diferente. La región amplificada se desnaturaliza y se realiza una separación electroforética en condiciones desnaturalizantes. El patrón de bandas PCR/SSCA es propio para cada organismo. Comentarios: Al igual que ocurre con las técnicas anteriores, el perfil que se obtiene no es siempre reproducible pero puede utilizarse como método de screening previo a la secuenciación. PCR/Secuenciación. El método más fiable y sensible para detectar la diversidad genética es la secuenciación directa de los productos de amplificación de la región diana. La técnica más utilizada es la secuenciación cíclica con terminadores de cadena marcados con fluorocromos. Las secuencias de nucleótidos que se obtienen para la región diana en cada organismo y en diferentes laboratorios pueden ser publicadas en bases de datos electrónicas (GENBANK, EMBL, etc). Comentarios: en ocasiones puede que el material de herbario no esté identificado correctamente o que no se utilice la misma nomenclatura sin olvidar las contaminaciones del laboratorio debido a una mala praxis. Estas situaciones dan lugar a que existan secuencias erróneas en las bases de datos públicas. Por ello sería conveniente disponer de bases de datos propias, cuidadosamente generadas, de las especies tóxicas.

Análisis de las secuencias de la región ITS para la identificación de hongos El análisis comparativo de una secuencia desconocida con las bases de datos públicas, EMBL o Gen Bank, puede ser un método útil de identificación de especie. Estas bases de datos disponen, via Internet, de programas de comparación de secuencias: FASTA y BLAST (Based Local Alignment Search Tool). Comentarios: aunque existen muchas secuencias publicadas de las regiones ITS todavía son insuficientes para identificar algunos hongos. El constante aumento de secuencias permitirá ir identificando las setas responsables de producir intoxicaciones. Diseño de test rápidos para la identificación de especie El alineamiento y comparación de las secuencias nucleotídicas de una determinada región diana entre ejemplares de la misma y de distinta especie, permite conocer la variabilidad de la región y si es apta para el diseño de nuevos test. Cada vez se investiga más el diseño de iniciadores específicos de especie o sondas TaqMan mediante Real-Time PCR (RT-PCR). Comentarios: son sistemas de identificación menos problemáticos y más rápidos que la secuenciación.

GENETICA FORENSE NO HUMANA: IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES

LOURDES PRIETO SOLLA Laboratorio de Biología-ADN de la Comisaría General de Policía Científica La necesidad de estudiar ADN no humano con fines forenses se hace cada día más patente y actualmente es frecuente que se solicite a los laboratorios el análisis de muestras de origen no humano. Existen multitud de situaciones en las que cabe este tipo de análisis: restos de origen no humano en la escena del crimen (pelos de animales domésticos, restos vegetales, etc), tráfico ilegal de especies protegidas o en peligro de extinción, identificación de fauna cadavérica con el fin de estimar la data la muerte (identificación de larvas de insectos), fraude en la composición de alimentos procesados, investigación de accidentes de tráfico causados presuntamente por animales, negligencia médica en casos de infecciones (transmisión de VIH o hepatitis C), bioterrorismo (ántrax), etc. El análisis de restos biológicos no humanos con interés forense se ha abordado tradicionalmente mediante estudios inmunológicos o análisis de proteínas. Estos métodos encuentran su limitación cuando las muestras a estudiar no se encuentran en condiciones idóneas de conservación. Con el desarrollo de la biología molecular han surgido nuevos métodos basados en las diferencias genéticas entre especies. El análisis de ADN mitocondrial (ADNmt) es el más apropiado para estudiar restos no humanos fundamentalmente por dos motivos: (i) la gran cantidad de copias por célula permite que muestras críticas, que no dan resultados con el estudio de ADN nuclear, puedan ser analizadas (pelos, alimentos tratados) y (ii) su tasa de mutación es más rápida que la del ADN nuclear, hecho que permite encontrar diferencias en las secuencias de especies muy cercanas. Las regiones de ADNmt más utilizadas en genética forense con fines de identificación de especie son el gen responsable del citocromo b (cytb) y los ADNs ribosómicos 12S y 16S. Los análisis se realizan mediante PCR y posterior secuenciación del producto amplificado. Para ello, dentro de estas tres regiones se han buscado dos tipos de zonas nucleotídicas: (i) zonas muy

conservadas (con poca variabilidad entre especies) con el fin de poder diseñar primers universales que permitan la amplificación de ADN de los principales grupos taxonómicos y (ii) zonas menos conservadas que permitan la discriminación entre las muestras estudiadas al menos a nivel de género. Así, con un único par de primers se puede amplificar cada región en distintas especies y la secuencia obtenida tras la amplificación puede comparase con secuencias conocidas de diferentes especies. El uso de esta técnica implica el conocimiento de la filogenia de las especies involucradas, el manejo de las bases de datos de secuencias de ADN disponibles en la red (GenBank, EMBL), así como el uso de los softwares de comparación de secuencias (ej: BLAST, CLUSTAL). Es fundamental, por tanto, que el biólogo forense se familiarice con las herramientas que la bioinformática pone a nuestra disposición. Una base de datos biológica es una lista de datos persistentes larga y organizada, asociada generalmente a un software automatizado diseñado para actualizar, buscar y recuperar los datos almacenados dentro del sistema. Actualmente existen organismos que proporcionan bases de datos gratuitas para que los usuarios las puedan utilizar a través de Internet. Uno de los organismos que más ha desarrollado las bases de datos biológicas y las herramientas bioinformáticas es el NCBI (National Center for Biotechnology Information). Este organismo dispone de una página web (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) muy útil que y que la mayoría de investigadores del campo de la genómica y la proteómica manejan habitualmente. El NCBI tiene múltiples bases de datos biológicas (de secuencias, de proteínas, de genomas, taxonómica, de publicaciones, etc) ligadas entre sí, de tal forma que se puede usar un único sistema de búsqueda y recuperación de datos llamado ENTREZ. Este sistema de búsqueda permite que un usuario tenga acceso y recupere información de muchas bases de datos a la vez. Por ejemplo, la base de datos de secuencias de ADN Entrez está ligada a la base de datos de taxonomía Entrez. Esto permite al investigador encontrar información taxonómica de la especie a la que pertenece la secuencia. Otro de los recursos que ofrece el NCBI y que más se utilizan en biología forense es el software BLAST (Basical Logical Alignment Search Tool). Entre otras aplicaciones este software ofrece la posibilidad de comparar la secuencia

que hemos obtenido en el laboratorio con las secuencias presentes en las bases de datos de manera automática. Aunque las bases de datos de ADN están en constante crecimiento, para ciertos organismos no existen datos de las secuencias que nos interesan. Como consecuencia de esto, el éxito en la identificación del origen de una muestra forense no humana depende en gran medida de la disponibilidad de la secuencia de interés en la base de datos. Sin embargo, este problema puede superarse cuando en la base de datos existen secuencias de especies relacionadas con nuestra muestra problema o tenemos idea de qué especie puede tratarse mediante datos no genéticos del caso en cuestión (por ejemplo, el análisis de pelos encontrados en un vehículo involucrado en el robo de abrigos de visón). En estas situaciones podemos recurrir al análisis de una muestra indubitada de la especie que sospechamos y a la comparación de dicha muestra de referencia con nuestra muestra problema. Por otro lado, no es extraño que tanto cytb, como 12S y 16S presenten cierto nivel de polimorfismo, lo cual complica la interpretación de los resultados. Así, secuencias similares en un 98% de sus nucleótidos pueden derivarse tanto de distintos miembros de la misma especie como de dos especies estrechamente relacionadas que se han separado recientemente. En ocasiones el problema que se nos plantea es comprobar si los restos biológicos encontrados en el lugar de los hechos coinciden en cuanto a especie con los restos encontrados en, por ejemplo, las ropas de un sospechoso. En los casos en los que no tenemos idea de a qué tipo de organismo pueden pertenecer o el posible organismo está pobremente caracterizado a nivel genético en las bases de datos, podemos recurrir al análisis de sus ADNs por medio de RAPDs (random amplified polimorphic DNA). La técnica consiste en el desarrollo de una reacción PCR en la que los primers se han diseñado al azar. Estos primers de corta longitud (8-12 nucleótidos) anillan en diferentes regiones del genoma del organismo problema generando productos amplificados al azar de diferente longitud. Los fragmentos pueden separarse mediante electroforesis dando un patrón de bandas característico de la especie. Muchos laboratorios forenses españoles tienen ya la tecnología necesaria para el análisis de los fragmentos mitocondriales cytb, 12S o 16S.

Sin embargo queda mucho trabajo por hacer en identificaciones de restos vegetales o de microorganismos. Sin duda, la genética forense no humana es una nueva puerta que se abre para responder a las preguntas aquí expuestas, pero el campo es tan amplio que se necesitarán grandes inversiones para satisfacer tan amplia demanda.

VALORACIÓN ESTADÍSTICA DE LA PRUEBA DE ADN

MARÍA JOSÉ FARFÁN ESPUNY Jefa del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla. Una vez obtenidos los perfiles genéticos resultantes de la

individualización de una muestra biológica mediante la aplicación de la tecnología del ADN, éstos carecen de valor sin una valoración estadística apropiada. En otro capítulo se tratará con más detalle la valoración estadística en casos de filiación, por lo que aquí nos referiremos sólo a los casos de investigación criminal. En la mayoría de estos casos, la prueba del ADN sólo tiene sentido si es posible una comparación de perfiles de un vestigio frente a una muestra indubitada o entre diferentes vestigios. Cuando se trata de investigar si un resto biológico puede pertenecer a un determinado individuo o al donante de otros vestigios, es necesario realizar un cotejo de los perfiles genéticos obtenidos. Si los perfiles son distintos, puede asegurarse que ese resto biológico no pertenece al individuo en cuestión o que ambos vestigios proceden de personas diferentes. Pero si existe una coincidencia entre los perfiles comparados es necesario hacer una valoración estadística para estimar el grado de incertidumbre de que esos perfiles coincidan entre sí sólo por cuestiones de azar y no porque procedan del mismo individuo. Para ello se requiere disponer de datos fiables sobre las frecuencias de los alelos presentes en la población de referencia, las cuales se estimarán mediante la realización de estudios poblacionales basados en el tipado de numerosos individuos no relacionados. Para estimar el valor de la prueba es necesario considerar (al menos) dos hipótesis alternativas para su ocurrencia. La prueba debe evaluarse calculando su probabilidad bajo cada una de las hipótesis. Por ejemplo, se detecta una mancha de semen en la prenda de una víctima de agresión sexual y el perfil genético del semen coincide con el del sospechoso. Es necesario establecer dos hipótesis alternativas, que en este caso serían: H0: el semen

pertenece al sospechoso; H1: el semen pertenece a un individuo al azar de la población. A continuación se procede a calcular la probabilidad de obtener ese perfil genético para el semen bajo la hipótesis H0, y bajo la hipótesis H1. La valoración más correcta consiste en calcular, mediante la aplicación del teorema de Bayes, la razón de verosimilitud o LR (“Likelihood Ratio”) que es el cociente entre ambas probabilidades. El resultado obtenido refleja cuántas veces la coincidencia de perfiles es más probable si consideramos la hipótesis H0, (o sea, que el semen pertenezca al sospechoso) que si consideramos la hipótesis H1, (que el semen pertenezca a un individuo al azar de la población). Un elemento importante en la comparación de perfiles genéticos con fines de investigación criminal o en casos de identificación reside en la creación de bases de datos de ADN, aspecto que se tratará más detalladamente en otro capítulo.

ORÍGENES POBLACIONALES MEDIANTE MARCADORES DE HERENCIA UNIPARENTAL: ADN MITOCONDRIAL y CROMOSOMA Y

MANUEL LÓPEZ SOTO Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla. La primera pregunta que tal vez pudiera plantearse un alumno de este curso podría ser ¿qué sentido tiene hablar de los orígenes poblacionales en un curso de Biología Forense?. La respuesta a esta pregunta hay que buscarla en los propios fundamentos de la genética forense, que no son sino, la aplicación de conceptos de la Genética de Poblaciones a la identificación de individuos. En este sentido, siempre que obtenemos un perfil genético (STRs autosómicos, ADN mitocondrial, STRs de cromosomas X e Y) es necesario realizar una valoración estadística de dicho perfil mediante comparación con la población de referencia. Esto requiere, por un lado, conocer qué frecuencias alélicas definen a dicha población y por otro, qué distribución haplotípica o de haplogrupos presenta respecto al ADN mitocondrial y al Cromosoma Y. Estos dos marcadores, como ya se ha explicado a lo largo del curso, se caracterizan entre otras cosas, por presentar un modo de herencia uniparental; el ADN mitocondrial es transmitido por la madre a todos sus descendientes y el cromosoma Y es transmitido por el padre a sus hijos varones. Este hecho biológico nos permite trazar linajes a lo largo de la historia hasta remontarnos al origen de nuestros antepasados. Con respecto al origen de los humanos anatómicamente modernos (del que derivan las poblaciones humanas actuales) se han expuesto dos hipótesis alternativas. La primera de ellas, llamada multirregional o policéntrica, explica que los humanos modernos surgieron al mismo tiempo en cuatro regiones distintas, llevando una evolución paralela a través de largos períodos de tiempo, teniendo a la migración y a la selección natural como principales motores del proceso evolutivo. La otra hipótesis, conocida como OUT OF AFRiCA, se basa en que los humanos modernos se originaron en África y desde allí emigraron hacia Asia y Europa y después a América y Oceanía. Esta

segunda hipótesis, más aceptada por la comunidad científica internacional, ha sido apoyada por estudios de ADN mitocondrial y de cromosoma Y. En otras palabras, parece claro que los humanos anatómicamente modernos del que derivan todas las poblaciones actuales surgieron como un único proceso de especiación originado en África, aunque no está del todo claro si estos humanos llevaron un reemplazamiento total o parcial de las otras especies de homínidos existentes, como los neardentales en Europa. Como hemos dicho anteriormente, estos humanos anatómicamente modernos llegaron a Europa. Existen opiniones contrarias en relación con cómo se produjo el poblamiento de este continente. Para muchos genetistas, encabezados por la figura de Cavalli-Sforza, Europa se pobló durante el Neolítico a través de la llegada de colonos agricultores procedentes de Oriente Medio, a juzgar por lo que muestran los análisis genéticos de marcadores clásicos. Sin embargo, para otros genetistas como M. Richards, V. Macaulay y A. Torroni, basados en los análisis de ADN mitocondrial, y O. Semino en los de Cromosoma Y, llegan a la conclusión de que Europa ya estaba poblada durante el Paleolítico, que además se produjo una expansión desde los pocos territorios libres de hielo en la última glaciación y que hubo una pequeña colonización durante el Neolítico. Una controversia parecida se da con respecto al poblamiento de América. Para A. Torroni et al. y basados en estudio de ADN mitocondrial, el poblamiento llegó procedente de Asia, entrando un haplotipo de cada uno de los haplogrupos existentes en América en tres oleadas diferentes. Sin embargo, para Merriwheter et al. en América entraron varios haplotipos de ADN mitocondrial en una sola oleada. Haremos una pequeña mención a dos poblaciones: la brasileña y los inuits. Brasil se caracteriza por ser la población más diversa del mundo desde el punto de vista genético-poblacional. De hecho, podemos encontrarnos dos individuos fenotípicamente muy distintos (blanco y mulato) y presentar ambos el mismo haplogrupo de ADN mitocondrial o de Cromosoma Y. A modo de ejemplo, el 28% de la población blanca de Brasil tiene una ADN mitocondrial africano, que puede explicarse por ser el resultado de la masiva llegada de esclavos desde el Golfo de Guinea ocurrida en siglos anteriores. Algo similar, pasa con la población de los Inuits, en la que al analizar el ADN mitocondrial y

el Cromosoma Y se observa que el marcador materno es amerindio y el paterno, europeo. Se sabe que a estos territorios de hielo llegaron colonos procedentes de Europa y que era costumbre en estas poblaciones esquimales ofrecer alimento, alojamiento y la mujer a sus huéspedes, de ahí el haplogrupo europeo observado en esta población. Se presentarán los datos obtenidos de un estudio de ADN mitocondrial realizado por el departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses en la población andaluza. Cuestiones tales como ¿qué legado genético han dejado los ocho siglos de invasión árabe en Andalucía? ¿encaja el sustrato mitocondrial en la variabilidad europea? ¿qué origen tiene la población andaluza? ¿hay homogeneidad genética entre las provincias?, entre otras, serán resueltas en este curso. Por último, y enlazando con el principio de este resumen, se presentarán ejemplos de la aplicación forense que tiene conocer la distribución geográfica o el origen de los patrones de ADN mitocondrial y de Cromosoma Y.

INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA DEL PARENTESCO

JUAN ANTONIO LUQUE GUTÍERREZ Jefe del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Barcelona. La investigación biológica de la paternidad en un sentido amplio (investigación biológica del parentesco), abarca cualquier estudio de la relación biológica entre dos individuos, ya que una relación genética entre dos individuos, siempre puede resolverse como una sucesión de relaciones paternofiliales ascendentes y descendentes dentro de un árbol genético, por muy distantes que sean sus posiciones. Así podemos hablar del estudio más simple como es el caso estándar (trío Presunto Padre-Madre-Hijo/a), de paternidad/maternidad con un solo progenitor, de estudios con abuelos, estudio de hermanos, paternidades a partir de familiares (cuando el padre está fallecido o no disponible), etc... Casos especiales de estos estudios son los casos de desastres en masa, identificaciones de restos cadavéricos, o la búsqueda de familiares del autor de un delito a través de una base de datos, que tienen como base los estudios de paternidad pero que conllevan una problemática asociada adicional que se verá en otro momento en este mismo curso. También pueden considerarse paternidad/maternidad en su sentido amplio el estudio de marcadores de cromosoma Y y de ADN mitocondrial, estudiando en este caso no una relación p(m)aternofilial directa, sino una relación genética de toda una línea genética padres/hijos o madres/hijos. En ocasiones (algunos laboratorios de rutina) emplean estas técnicas como complementarias en los estudios de paternidad. El estudio de la paternidad en su sentido más estricto, como es el aclarar la paternidad (maternidad) biológica de un hijo cuestionado, tiene unas implicaciones legales (aunque se haga de forma privada y no judicial) que hay que tener presentes. Por suerte, tanto la legislación como la ciencia han

llegado a un punto en el que es posible la investigación de la paternidad con garantías suficientes, pero no siempre ha sido así. Desde el principio de la historia de una u otra manera se ha permitido o prohibido la investigación de la paternidad. En un principio la ciencia no disponía de herramientas adecuadas para su resolución, pero se recurría a la investigación de otros indicios. Así podemos considerar que el Rey Salomón celebró el primer juicio de paternidad (en este caso maternidad) documentado históricamente (en la Biblia), en el que se recurrió a métodos “psicológicos”. Durante mucho tiempo, la ciencia no pudo aportar métodos adecuados para dicha investigación, recurriéndose a métodos circunstanciales (como el tiempo de gestación) o físicos (color de pelo, ojos, parecido...). No fue hasta la descripción del grupo ABO por Landsteiner en 1900 y la descripción de su transmisión hereditaria en 1910, que se dispuso de pruebas objetivas, naciendo así la hemogenética forense. Desde entonces se han utilizado gran cantidad de sistemas genético moleculares hasta nuestros días en que los estudios de ADN han desplazado por su potencia y facilidad al resto de técnicas. En España, no es hasta 1978 que la Constitución Española en su articulo 39.2 establece que “...La ley posibilitará la investigación de paternidad”, y posteriormente en 1981 se produce la reforma del Código Civil recogiendo en su artículo 127 que “En los juicios sobre filiación será admisible la investigación de la paternidad y de la maternidad mediante toda clase de pruebas, incluidas las biológicas”. Desde entonces, el desarrollo ha sido vertiginoso, uniéndose, a los escasos laboratorios que por entonces hacían pruebas, un sinfín de laboratorios cada vez más dotados, y que hoy día pueden considerarse de primer nivel a escala mundial. En cuanto a las técnicas utilizadas, los primeros laboratorios utilizaban una larga batería de grupos sanguíneos, enzimas y proteínas polimórficas y HLA, mediante reacciones antígeno-anticuerpo o mediante técnicas electroforéticas. Dichas técnicas suponían un gran trabajo, pero la potencia obtenida era la justa. La aplicación en el campo forense por Jeffreys en 1985 del análisis de VNTR de ADN mediante las llamadas “sondas” supuso una revolución, ya que permitía poder analizar directamente genotipos y no fenotipos como hasta entonces. Al final de los 80 ya se hacían en España, permaneciendo hoy día un par de laboratorios que todavía mantienen una

variante, dado que tienen gran capacidad de discriminación. Sin embargo, en el mismo 1985, K. Mullis descubrió un proceso al que denominó reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por la que luego recibiría el premio Nobel, que imita la replicación del ADN de las células en un tubo, consiguiendo hasta un millón de copias de pequeños fragmentos de ADN. Desde el principio de los 90, la mayoría de los laboratorios trabajan mediante análisis de marcadores de PCR. La prueba biológica la podemos dividir en varias fases: Toma de muestras Este punto es fundamental para una buena pericia. No puede haber un análisis de calidad si las muestras no son adecuadas. Ya antes de comenzar hay que hacer una selección de las personas que realizarán la prueba. En casos estándar (PP-M-H) los individuos vienen predefinidos, pero hay que tener mucho cuidado en asegurarse de que se toman las muestras con todas las garantías necesarias, y que se rotulan y se procesan de forma que se minimice la posibilidad de un cambio de muestras o un fraude de identidad. En casos complejos (cuando no se dispone del padre), la elección de familiares es crucial para poder alcanzar un resultado fiable, siendo uno de los puntos que más aumentan el resultado final el disponer de la madres del hijo dubitado y de otros hijos “legítimos” si es que se necesita. En ocasiones los individuos vienen condicionados por el propio caso, y por tanto no se pueden elegir teniendo que realizar la prueba con las muestras disponibles. Obtención de perfiles de ADN y análisis genético Como ya hemos comentado anteriormente, la mayoría de laboratorios usan hoy día marcadores de PCR. Es necesario disponer de una amplia batería de marcadores para conseguir lo que llamamos un “poder de exclusión a priori” alto, o lo que es los mismo, la probabilidad de excluir de forma directa a un presunto padre falsamente acusado. Para casos de tríos, con 13-15 marcadores suele ser suficiente. A partir de ahí, es como un puzzle, cuantas más piezas tengamos, más fácil es saber que dibujo contiene. Por tanto si la información genética que se aporta es baja (por falta de individuos o por

tratarse de relaciones genéticas lejanas), la cantidad de marcadores que se usen debe incrementarse. Los análisis genéticos en estos casos suelen ser fáciles, ya que las muestras se suelen recoger en abundancia y en condiciones óptimas. En casos forenses, a veces las muestras no son tan buenas, teniendo que recurrir a estrategias especiales. Hay que tener en cuenta que además de las leyes de la genética y de la estadística, hay que tener en cuenta las leyes de Murphy, y saber que todo el proceso se realiza partiendo de unos supuestos teóricos, que a veces se alteran con anomalías varias como pueden se mutaciones, trisomías, superfecundaciones, etc. Una vez que tenemos unos perfiles genéticos, hay que contrastar los resultados para comprobar la compatibilidad genética antes de pasar a la siguiente fase, que es la valoración estadística. La valoración genética se basa en los principios de la herencia mendeliana, sabiendo que cada individuo de los dos alelos (variantes) que presenta para cada marcador (pseudogen) hereda uno de su padre y otro de su madre. Si sabemos cual es el alelo que transmite la madre, tendremos cual es el alelo “obligatorio” que ha transmitido el padre biológico, y podremos contrastar con el presunto padre si posee dicho alelo o no. En caso de que no lo posea hablamos de exclusión, y por tanto de incompatibilidad genética. En caso de compatibilidad habrá que valorar estadísticamente los resultados como veremos más adelante. No obstante, debido a que en ocasiones hay anomalías como hemos comentado anteriormente, en caso de exclusiones aisladas o incluso de únicamente dos exclusiones, se suele valorar igualmente la prueba con las pertinentes modificaciones. En casos más complejos, la solución se complica, puesto que puede ser que la madre no esté disponible, o lo que es peor, que no lo esté el presunto padre. En estos casos, lo que se hace es reconstruir el posible perfil genético. Si no se obtiene el perfil completo, habrá que valorar todas las combinaciones genéticas compatibles con los individuos analizados, y a su vez comprobar si al menos una de las combinaciones es compatible con el hijo. Si todas son incompatibles, volveremos a hablar de exclusión. En caso contrario, habrá que valorar estadísticamente todas las combinaciones de forma ponderada.

Valoración estadística Una vez demostrada la compatibilidad de las personas estudiadas,

habrá que valorar dicha compatibilidad. De forma simplificada y genérica podemos decir que el cálculo de

paternidad se basa en calcular la probabilidad del genotipo del hijo (aunque este cálculo se ve afectado por múltiples circunstancias). Habrá que diferenciar cuando el hijo es homozigoto y heterozigoto. Hijo homozigoto (AA): Prob. genotipo hijo = prob. Padre trasmita A x prob. Madre trasmita A Pr(AA) = P->A x M->A Hijo heterozigoto (AB): Prob. genotipo hijo = prob. Padre trasmita A x prob. Madre trasmita B + +prob. Padre trasmita B x prob. Madre trasmita A Pr(AB) = P->A x M->B + P->B x M->A Estas fórmulas las vamos a usar continuamente para valorar las paternidades, y en función de cada tipo de caso este padre (P) y esta madre (M) variarán y por tanto las probabilidades de transmisión variarán. De forma genérica podemos decir que si tenemos un progenitor de genotipo conocido homozigoto la probabilidad de transmisión del alelo es 1, ya que no tiene otra opción y en el 100% de los casos lo trasmite. Si el progenitor es heterozigoto, la probabilidad de transmisión de cada alelo es la mitad, o sea 0,5. Si el progenitor no tiene el alelo, la probabilidad de transmisión será 0.

Probabilidad de transmisión del alelo A AA AB BB,BC -> -> -> 1 0,5 0

Si desconocemos el genotipo del progenitor la probabilidad de transmisión será la frecuencia poblacional para dicho marcador, es decir la probabilidad de transmisión del alelo A será a. Para la valoración, se establecen siempre dos hipótesis excluyentes: H1: el presunto padre (PP) es el padre biológico del hijo H0: el presunto padre (PP) no es el padre biológico del hijo y por tanto es otro hombre Estas dos hipótesis tienen una probabilidad (condicionada) en función de la información del caso (I) y del análisis genético (E de evidencia genética). A través del teorema de Bayes podemos expresarlas en forma de cociente u “odds”:

Pr(H 1 | E, I) Pr(E | H 1 , I) Pr(H 1 | I) = x Pr(H 0 | E, I) Pr(E | H 0 , I) Pr(H 0 | I)

(Fórmula 1)

Como podemos ver hay tres términos: Odds a posteriori = LR x Odds a priori El odds a posteriori es lo que intenta determinar el juzgador, es decir, saber en función de la información del caso que tiene, genética (E) y de otro tipo (I), la relación a favor/en contra de la paternidad. Para ello hay que combinar el LR (likelihood ratio o coeficiente de verosimilitud) con los odds a priori. El LR es el valor que puede obtener el laboratorio, que en casos de

paternidad de denomina Índice de Paternidad (IP). Los odds a priori es un valor que debe proporcionar el juzgador, y que no viene a ser otra cosa que la relación a favor en contra de la paternidad que se tiene antes de realizar la prueba genética (con las evidencias no genéticas). Tradicionalmente se establece, a falta de otra indicación, un a priori neutro, es decir, que hay las mismas probabilidades a favor que en contra. No obstante, este valor puede no ser adecuado, y de hecho se discute que es incluso erróneo. En varios países, los tribunales proporcionan un a priori concreto e incluso se hace el cálculo con un panel de a prioris diferentes. En el caso de las paternidades Pr(H1|E,I)=1- Pr(H0|E,I) Pr(H1|I)=1- Pr(H0|I) Por lo que sustituyendo nos queda (Fórmula 2)

Pr(H 1 | E, I) =

LR × Pr(H 1 | I) LR × Pr(H 1 | I) + [1 − Pr(H 1 | I)]

Donde Pr(H1|E,I) es la probabilidad de paternidad o W (Wahrscheinlickeit según Essen-Möller) y Pr(H1|I) es la probabilidad de paternidad a priori. Si consideramos que la probabilidad de paternidad a priori es igual que la probabilidad de no paternidad, y por tanto igual a 0,5 (aplicar fórmula 2), tendríamos la ecuación de Essen-Möller: W=LR/(LR+1)=1/(1+1/LR) W)) En general, para simplificar tendremos que asumir una serie de premisas: 1. Ambos progenitores biológicos (Padre y Madre) no están relacionados genéticamente (por tanto LR=W/(1-

2. Hay equilibrio de Hardy-Weinberg en la población de referencia (lo que implica que no hay subestructuración poblacional, que los marcadores son independientes y que no hay alelos silentes) 3. No ocurren mutaciones 4. La herencia es mendeliana con sistemas codominantes Ninguna de las premisas son ciertas en mayor o menor grado, y hay que ser conscientes de si conocemos dichas circunstancias y en que manera pueden alterar nuestros resultados. Asumiendo todas las premisas expuestas vamos a abordar el caso más simple al que podemos enfrentarnos, el caso estándar (trío PP-M-H). Para calcular el IP (LR) lo que tenemos a nuestra disposición es el tipaje genético del presunto padre (padre alegado), madre e hijo para un número adecuado de marcadores. Suponemos la maternidad cierta, y que a priori se excluye cualquier pariente próximo del presunto padre. El IP total será el producto de los IP de cada marcador. Tradicionalmente se expresa el IP como el cociente X/Y genotipos del presunto padre, madre e hijo (GP, GM, GH). Por tanto:
X Pr(E | H 1 , I) Pr(G P , G M , G H | H 1 , I) = = Y Pr(E | H 0 , I) Pr(G P , G M , G H | H 0 , I)

siendo

X=Pr(E|H1,I) e Y=Pr(E|H0,I). La evidencia genética que tenemos (E) son los

IP = LR =

Dónde aplicando la tercera ley de la probabilidad

IP =

X Pr(GH | G P , G M , H 1 , I) Pr(GP , G M | H 1 , I) = × Y Pr(GH | G P , G M , H 0 , I) Pr(GP , G M | H 0 , I)

(Fórmula 3) En esta ecuación en el segundo término, los genotipos de los padres son independientes de las hipótesis, por lo que serán iguales en el numerador y en el denominador, y por tanto su valor será 1. En otros casos (complejos) no será así y no se eliminarán de los cálculos. Aun así hay autores que prefieren no

eliminarlos de las fórmulas y por tanto la X y la Y serán algo diferentes a las que veremos. Para hacer más comprensible la explicación abandonaremos la notación estadística a partir de aquí y volveremos a la notación más genética y genérica que es más intuitiva. El desarrollo completo puede encontrarse en varios textos. Como vimos antes se trata de calcular la probabilidad del genotipo del hijo condicionada al genotipo de los padres bajo ambas hipótesis diferenciando cuando el hijo es homozigoto y heterozigoto. Hijo homozigoto (AA):

IP =

X PP → A × M → A = Y Pob → A × M → A

Hijo heterozigoto (AB):
X PP → A × M → B + PP → B × M → A = Y Pob → A × M → B + Pob → B × M → A

IP =

En la X usaremos los genotipos de los padres (presunto padre: PP y madre biológica: M) y aplicaremos las probabilidades de transmisión que vimos anteriormente. En el caso de la Y (denominador), consideramos que el padre no es el presunto padre, sino otro individuo no relacionado (padre alternativo), lo que se conoce como padre de la población (Pob). En este caso la probabilidad de transmisión será la frecuencia poblacional para dicho marcador. Para la madre, que conocemos su genotipo hacemos igual que en el numerador (X). Habrá casos en los que el padre es incompatible con la combinación Madre-Hijo, por lo que el valor de X será cero, y por tanto el IP será cero. Para casos más complejos, las premisas modifican los cálculos, y en casos defectivos hay que jugar con el calculo ponderado de todas las

combinaciones posibles. Con unos ejemplos prácticos podremos entender mejor la forma de calcularlo. Emisión de informe y defensa ante los tribunales Una vez valorada la prueba, tanto genéticamente como

estadísticamente, hay que emitir un informe. En dicho informe se deben reflejar todos los datos que afecten a la valoración, como técnicas y marcadores, las referencias poblacionales empleadas, y las hipótesis valoradas y los resultados. Deben evitarse aseveraciones como “es el padre”, ya que lo que hace el laboratorio es evaluar únicamente la evidencia genética mediante el IP, y por tanto siempre hablamos de probabilidades que no son absolutas. Si es requerido, el perito deberá defender y explicar su informe ante los tribunales, cuestión harto difícil, dado el desconocimiento de personas ajenas a la genética de temas tan complejos.

IDENTIFICACIÓN DE RESTOS CADAVÉRICOS

MANUEL LÓPEZ SOTO Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla. La aparición de restos humanos en lugares tan diversos, la exhumación de restos óseos cuando está en litigio alguna prueba de filiación, los accidentes domésticos y de tráfico, los últimos atentados terroristas que están conmocionando al mundo, están haciendo que la identificación de restos cadavéricos forme parte de la rutina diaria de un laboratorio de biología legal o forense. Cuando se trata de identificar a individuos vivos podemos recurrir a multitud que mecanismos que permiten resolver esta cuestión de forma rápida, como por ejemplo, los datos fisonómicos, el peso, la talla, el registro de voz, el D.N.I. Sin embargo, cuando queremos identificar un cadáver, es decir, reconocer si una persona es la que se busca, todos esos mecanismos que en principio parecen tan obvios para los sujetos vivos, en el caso de los cadáveres, brillan por su ausencia en ocasiones. Cuando nos encontramos ante unos restos cadavéricos que necesitamos identificar unos restos cadavéricos, es preciso observar en primer lugar el estado de conservación en el que se encuentra. Éste dependerá de si se han puesto en marcha o no los procesos de destrucción natural tales como los mecanismos de autólisis, originados por la fermentación anaeróbica de las enzimas propias del organismo y los mecanismos de putrefacción originados por la contaminación bacteriana. No obstante, en algunos casos, el cadáver se puede encontrar, de forma natural o artificial, conservado en estados de: momificación, embalsamación, saponificación, corificación o congelación. De forma general, un cadáver se puede identificar siguiendo tres etapas independientes entre sí o consecutivas: datación de los restos cadavéricos mediante unos criterios morfológicos y químicos; un diagnóstico de especie mediante análisis inmunológicos o de ADN y por último, un diagnóstico

individual mediante la determinación de la etnia, sexo, talla, y por supuesto, ADN. Cuando un laboratorio de biología forense se enfrenta a la identificación genética de unos restos humanos, se va a encontrar con el problema de que posiblemente en dichos restos se han puesto en marcha los mecanismos de modificación del ADN postmortem, cuyos agentes causales son los agentes oxidantes, las radiaciones ultravioletas, la humedad, la temperatura, los microorganismos y el pH ambiental. Todos estos factores, además de producir daños moleculares van generar un foco de contaminación y una fuente de posibles inhibidores que requerirá una excelente praxis pericial por parte del laboratorio. Desde el punto de vista del análisis genético y con relación a qué tipo de muestra se selecciona para su análisis, existe un gran consenso en el ámbito internacional. El orden más lógico de selección sería, en primer lugar, sangre; en segundo lugar, músculo o pelos con raíz y, en tercer lugar, dientes o huesos, prefiriendo de estos últimos, los huesos largos a los cortos o planos. Aunque cada laboratorio puede elegir el método de extracción que más crea más conveniente, nosotros recomendamos para la sangre fenolcloroformo-isoamílico (FCI) seguido de un paso de microfiltración-purificación o precipitación con etanol (si la sangre está en mal estado) o mediante columnas de extracción del tipo GFx o NSB (si la sangre es líquida y está en buen estado); para el músculo, los pelos, los huesos o los dientes también recomendaríamos el mismo método de extracción expuesto para la sangre en mal estado. No obstante, tanto los huesos como los dientes necesitarán de un procesado previo consistente en: limpieza, para eliminar restos de suciedad adheridos a los mismos, exposición a U.V., para eliminar contaminantes superficiales, pulverización en nitrógeno líquido, descalcificación (opcional) y extracción orgánica con FCI. Los huesos, además, se someterán a un lijado y corte en secciones transversales de la superficie que se va a analizar entre el paso de lavado y pulverización. Una vez extraído el ADN de los restos cadavéricos se cuantificará y se decidirá si analizar marcadores de STRs (autosómicos como de cromosoma Y) o ADN mitocondrial.

Por último, se comentarán algunas de las identificaciones de interés histórico como fueron las de Josef Mengele y Martin Bormann, las de Jesse James, las de la familia Romanov y las del Tercer Presidente de los Estados Unidos, Thomas Jefferson. También abordaremos, dado el interés social que ha generado en la actualidad, la identificación de los restos óseos de Cristóbal Colón y de Diego Colón, su hermano, así como las de Hernando Colón, hijo del afamado almirante.

IDENTIFICACIÓN GENÉTICA EN GRANDES CATASTROFES

ANTONIO ALONSO ALONSO Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Madrid. La utilización de bases de datos de ADN cobra también una vital importancia en los procesos de identificación humana en grandes catástrofes en los que a menudo se requiere el uso de herramientas bioinformáticas capaces de realizar búsquedas sistemáticas de un alto número de perfiles de ADN de acuerdo a diferentes algoritmos y que al mismo tiempo permitan evaluar con rapidez la significación estadística (LR) de los distintos grados de coincidencia observados entre los perfiles genéticos de las muestras postmortem y los perfiles obtenidos de las posibles muestras antemortem de las víctimas (utensilios de aseo personal, biopsias,...) o de muestras de referencia (sangre o saliva) de sus familiares vivos. Existe un conjunto interrelacionado de factores y circunstancias que pueden comprometer o dificultar el objetivo final de la identificación genética de las víctimas de una gran catástrofe, tales como: (1) el número de víctimas y modelo poblacional (población abierta o cerrada), (2) los mecanismos de destrucción de los cuerpos, (3) el grado de fragmentación, (3) el estado de degradación del ADN, (4) la accesibilidad a las muestras post-mortem o (5) el tipo de muestra de referencia disponible. En esta lección examinaremos las diferentes fases del proceso de identificación genética (toma de muestras, análisis de ADN y tecnología aplicable, sistemas de búsqueda y comparación de perfiles de ADN en base de datos, valoración estadística y criterios de significación de los distintos grados de coincidencia) y revisaremos la problemática de este tipo especifico de análisis de ADN en diversos casos de grandes catástrofes descritos en la literatura científica. Pondremos especial énfasis en el progreso científico obtenido de los esfuerzos de colaboración entre diversos laboratorios públicos y privados de EEUU durante la identificación de victimas del atentado terrorista contra el WTC de Nueva York el 11 de Septiembre de 2001. Incluyendo no solamente el desarrollo de nuevas tecnologías (Min-STRs, SNPs, ) aplicables

al estudio de muestras post-mortem altamente degradadas, sino también diversos aspectos de la toma de muestras y su registro y documentación electrónicas, así como de la interpretación estadística de la prueba del ADN y su significación en distintos escenarios. Analizaremos los principales retos y los posibles obstáculos para la identificación de las más de 200.000 víctimas producidas por el Tsunami (26 de Diciembre de 2004) que afectó a 12 países del sur del continente Asiático. Presentaremos también nuestra propia experiencia y la problemática surgida en algunos casos recientes tales como el ataque terrorista en Madrid del 11 de marzo de 2004 que arrojo 191 víctimas, o el accidente aéreo del Yakolev-42 en Trabzon (Turquía) el 23 de Mayo de 2003 en el que perdieron la vida 62 militares españoles que volvían a España de una misión de paz en Afganistán.

BASES DE DATOS DE ADN

ANTONIO ALONSO ALONSO Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Madrid. Las bases de datos de ADN con fines de investigación criminal son actualmente las bases de datos genéticas de mayor interés para los laboratorios forenses. Gracias a la experiencia acumulada por un gran número de países en todo el mundo (que ya han desarrollado una legislación específica) hoy sabemos que la comparación sistemática de los perfiles de ADN provenientes de distintas causas penales estructurados en una misma base de datos, puede ser una herramienta muy eficaz para reducir el índice de criminalidad de determinados delitos sin autor conocido y, especialmente, aquellos en los que existe una alta reincidencia. De esta forma la prueba del ADN ha dejado de ser un mero testigo “a posteriori" de los hechos criminales para convertirse potencialmente en una herramienta preventiva de la criminalidad. Serán, por tanto, estas bases de datos las que centren gran parte del contenido de esta presentación en la que realizaremos una revisión de la situación en Europa para, con posterioridad, hablar de la situación especifica de nuestro país en este tema. No debemos de olvidar, sin embargo, que existen otro tipo de bases de datos genéticas de gran interés para la comunidad científica forense y que también serán abordadas en esta lección del curso. Me estoy refiriendo por ejemplo a las bases de datos de ADN para la identificación de desaparecidos entre las que destacan los proyectos de identificación de victimas de conflictos bélicos o de victimas de catástrofes. (Los retos a los que se enfrenta la prueba del ADN en la identificación genética de victimas de grandes catástrofes, serán tratados por el autor en otra lección de la presente edición del curso de Biología Forense). Por otro lado, se abordarán las bases de datos poblacionales de marcadores de ADN humanos utilizados en genética forense (muchas de ellas

públicas y accesibles por Internet) que se han convertido en una herramienta esencial para poder realizar una evaluación bioestadística adecuada del valor de la prueba del ADN, tanto de marcadores STR autosómicos como de datos haplotípicos (Y-STR o mtDNA). Haremos también una breve referencia a un grupo heterogéneo de bases de datos de ADN que emergen en los diversos ámbitos de aplicación de las ciencias forenses y que pueden ser de utilidad en muy diversos diagnósticos que van desde la identificación genética de vestigios de distintas especies animales en la escena del crimen a la identificación de especies tóxicas o patógenas. Por último, nos asomaremos al futuro de las bases de datos de ADN forense en la era de la genómica.

MESA REDONDA EL INFORME PARCIAL Y SU DEFENSA ANTE LOS TRIBUNALES

PONENTE: CARLOS PUIGCERVER ASOR Profesor de Derecho Procesal de la Universidad de Valencia LA VALORACIÓN DE LA PRUEBA PERICIAL 1.- INTRODUCCIÓN Cuando un Juez o Tribunal dicta una sentencia realiza un acto de pensamiento que es un juicio lógico jurídico que responde a la estructura del silogismo en el que, la premisa mayor es la norma, la premisa menor es el hecho y la consecuencia es el fallo o parte dispositiva de la resolución judicial. La sentencia es, pues, aplicación del derecho mediante la subsunción de un hecho en una norma jurídica de manera que se produzca una determinada consecuencia jurídica. En uno de los estadios de este proceso intelectual el juez debe fijar los hechos ocurridos en la realidad y para ello deberá valorar la prueba practicada. 2. LA VALORACIÓN DE LOS MEDIOS DE PRUEBA En definitiva, para que el juzgador conozca si se han producido o no los hechos afirmados en el proceso debe valorar la prueba practicada lo que implica dos operaciones, una primera denominada interpretación en la que deberá extraer cuáles son las afirmaciones, las consecuencias que se desprenden de las pruebas y una segunda que será la de darles valor para fijar o no unos determinados hechos como producidos o existentes. A) Valoración libre y valoración tasada o legal de los medios de prueba Esa segunda labor que consiste en la de fijar el valor de ese medio de prueba, puede estar reglada por la ley, en el sentido de establecer unas normas o criterios para valorar, son los llamados medios de prueba de

valoración legal o tasada, o, por el contrario, puede dejarse a la libre apreciación del juzgador, son los llamados medios de prueba de valoración libre. B) La valoración de la prueba pericial La prueba pericial es un medio de prueba de libre valoración, es decir, desde el plano teórico, los informes periciales, cualquiera que sea la autoridad científica de la que emanan no constituyen verdad intangible o incontrovertible, sino que sólo son una opinión científica o técnica que será valorada por el Juez o Tribunal, pues de otro modo, como afirma ALONSO PÉREZ, se le llegaría a vincular de tal manera que el perito se convertiría en juez sustituyendo a éste en su función. Ahora bien, prueba de valoración libre no quiere decir prueba arbitraria de modo que el Tribunal no puede rechazar de manera irrazonada o caprichosa un dictamen pericial, sino que deberá expresar las razones que le llevan a no darle valor y el proceso lógico llevado a cabo para llegar a esa conclusión, lo que no resultará fácil cuando deban de manejarse conocimientos científicos o técnicos de gran precisión o complejidad, por lo que en innumerables ocasiones el juzgador concederá a la prueba pericial un valor absoluto. 3. TRATAMIENTO JURISPRUDENCIAL DE LAS PRUEBAS BIOLÓGICAS DE PATERNIDAD El valor que se concede por los Tribunales a las pruebas biológicas de paternidad es absoluto, casi de certeza, aunque dicho valor no se atrevan a confesarlo directamente en todos los casos, disimulando el valor determinante de la misma mediante referencias a otros medios de prueba que valorados conjuntamente les llevan a la misma conclusión. Es significativo que en todos los casos en que se ha practicado una prueba de paternidad y su resultado ha dado alta probabilidad de paternidad, la sentencia ha terminado por declarar la filiación, eso sí declarando que no se le está dando valor absoluto o de certeza. Sirva de muestra la Sentencia del Tribunal Supremo (Sala de lo Civil), de 20 mayo 1991 en donde se afirma que la probanza biológica de la paternidad constituye una prueba directa, pero no plena y absoluta, no obstante ha de atribuírsele valor de casi total aproximación a la verdad, sobre todo, cuando

sucede, como en la presente controversia, que dicho informe pericial, ha sido emitido por un órgano técnico oficial, dotado de medios y eficacia, para su elaboración más exacta, cual es el Instituto Nacional de Toxicología, dependiente del Ministerio de Justicia y que concurren el 99,9998 por cien de probabilidad, y con un índice (IP) de paternidad de 840191:1, y según la posición científica de K. Hammel, ello supone una «paternidad prácticamente probada». También la Sentencia del Tribunal Supremo núm. 1070/1992 (Sala de lo Civil), de 24 noviembre que con un porcentaje del 99,9324% en las pruebas biológicas afirma que debe entenderse que la paternidad está prácticamente probada, encontrándonos con ante una prueba de casi absoluta fiabilidad. Finalmente es de destacar la Sentencia del Tribunal Supremo de 2 de enero de 1991 en donde se decía que «La probabilidad de paternidad (w) obtenida es de 99,91% valor que se encuentra dentro del rango considerado por K. Hummel y colaboradores como Paternidad prácticamente probada. Asimismo el Índice de Paternidad (IP) obtenido es de 1293,48, valor que se encuentra dentro de rango considerado por los mismos autores como Paternidad prácticamente probada, y de aquí, que proyectando cuanto antecede al meritado caso de que se trata, es de llegar a la conclusión de que en él, se consiguió una certeza casi absoluta en el resultado de la valoración de la prueba». 4. VALORACIÓN JUDICIAL DE LA NEGATIVA A SOMETERSE A LAS PRUEBAS BIOLÓGICAS DE PATERNIDAD Para concluir debemos hacer una referencia a las graves y negativas consecuencias que tiene el no someterse a las pruebas biológicas, pues, generalmente, dan lugar a una sentencia declarando la paternidad siempre y cuando en el proceso se hayan acreditado otras circunstancias tales como la existencia de relaciones, sostenimiento económico o relación personal, habiéndose rechazado todos las excusas alegadas para negarse a su práctica cuando están basadas en los derechos constitucionales a la intimidad personal y familiar o a la integridad física y moral, admitiéndose tan solo en dos casos, a saber, cuando exista un grave peligro para la salud, o cuando no exista un mínimo de prueba que permita deducir la posibilidad de paternidad.

Recogen esta doctrina las siguientes sentencias: Sentencia Audiencia Provincial núm. 14/2004 Asturias (Sección 5ª), de 22 enero de 2004, Sentencia del Tribunal Supremo de 11 de septiembre de 2003 y Sentencia del Tribunal Constitucional 95/1999, de 31 de mayo. BIBLIOGRAFÍA DE INTERÉS: 1.- FONT SERRA, EDUARDO; El dictamen de peritos y el reconocimiento judicial en el proceso civil. Ed.: La Ley, 1ª edición, mayo de 2000. Las Rozas (Madrid) 2.- LÓPEZ-MUÑIZ GOÑI, MIGUEL; La prueba pericial. Guía práctica y jurisprudencia. Ed.: Colex. 2ª edición. Madrid 2004. 3.- ALONSO PÉREZ, FRANCISCO; Medios de investigación en el proceso penal. Ed.: Dykinson, 2ª edición. Madrid 2003. 3.- MONTERO AROCA, JUAN; BARONA VILAR, SILVIA; GÓMEZ COLOMER, JUAN-LUIS Y MONTÓN REDONDO, ABERTO, “Derecho jurisdiccional I”, Ed. Tirant lo Blanch. 13ª edición, Valencia 2004. 4.- MONTERO AROCA, JUAN; BARONA VILAR, SILVIA; GÓMEZ COLOMER, JUAN-LUIS Y MONTÓN REDONDO, ABERTO, “Derecho jurisdiccional II”, Ed. Tirant lo Blanch. 13ª edición, Valencia 2004. 5.- ALMAGRO NOSETE, JOSÉ; GIMENO SENDRA, VICENTE; CORTÉS DOMÍNGUEZ, VALENTÍN Y MORENO CATENA, VÍCTOR, “Derecho procesal” Tomo I (Vol. I), Ed. Tirant lo Blanch. 4ª edición, Valencia 1989.

PONENTE: FELIX SÁNCHEZ UGENA Director del Instituto de Medicina Legal de Badajoz El Juez solicitará un informe pericial cuando, para conocer o apreciar algún hecho, fueran necesarios conocimientos científicos especializados. Aunque tradicionalmente se dice que los Jueces sentencian según se les informa, lo cierto es que nuestra Legislación establece que “Los Jueces y Tribunales apreciaran la prueba pericial según las reglas de la sana crítica, sin estar obligados a sujetarse al dictamen de los peritos”.

REQUISITOS Y CUALIDADES QUE DEBE REUNIR EL PERITO 1.- CUALIDADES PERSONALES a) Objetividad. b) Capacidad de reflexión y sentido común c) Prudencia. d) Imparcialidad.. e) Veracidad. 2.- FORMACIÓN CIENTÍFICA. 3.- CONOCIMIENTOS JURÍDICOS. VALOR JERÁRQUICO DE LA PRUEBA PERICIAL

− CERTEZA MATEMÁTICA. Consiste en la comprobación de las leyes
mismas del pensamiento, por lo que partiendo de postulados ciertos se ha de llegar a resultados exactos.

− CERTEZA MORAL. Se trata de una convicción sin pruebas sólidas
que la sustenten.

− CERTEZA FÍSICA. Se encuentra entre lo absoluto de la certeza
matemática y la relatividad de la certeza moral.

− CERTEZA LEGAL. A estos tres grado de certeza podemos añadir en
la práctica la denominada certeza legal. Es aquella que aunque no es absoluta, si es suficiente para la administración de justicia, ya que “permite razonablemente fijar una conclusión que responda a criterios científicos y lógicos, aunque no alcance una evidencia integral”.

EL INFORME PERICIAL Es un documento médico-legal emitido por orden de las autoridades o a petición de particulares sobre el significado de ciertos hechos con trascendencia judicial o administrativa. Puede ser evacuado por un solo perito o por una corporación científica: Instituto Nacional de Toxicología, Cuerpo de Médicos Forenses, Colegios de Médicos, Reales Academias, etc. y suele ser solicitado en actuaciones judiciales ya adelantadas. Sus características fundamentales serian:

a) Se trata de un documento oficial, parte integrante e importante en el procedimiento, que contienen datos médico-biológicos y datos susceptibles de ser discutidos. b) La discusión tiene como objetivo reconstruir un hecho de interés judicial sucedido en el pasado. c) No se trata de aportar una opinión, sino una demostración. d) El informe generalmente se continua en una declaración verbal ante el tribunal. Desde el punto de vista formal, un Informe Pericial debe constar de consta de las siguientes partes

PREÁMBULO. Se inicia con los hombres del perito o peritos, sus títulos, residencia, autoridad o persona que ha solicitado el informe y objeto del mismo, reproduciéndolo literalmente de la orden recibida.

RELACIÓN Y DESCRIPCIÓN DE LOS OBJETOS ACERCA DE LOS CUALES DEBE EMITIRSE EL INFORME. Pueden ser documentos médicolegales, objetos (armas, manchas, huellas o cualquier otro tipo de pruebas de convicción) o personas (inculpado lesionado, cadáver). Tanto la trascripción de los documentos como la descripción de los objetos y

personas será minuciosa y fidedigna, y a ser posible acompañarse de fotografías, croquis...

OPERACIONES PRACTICADAS. Conviene su descripción, puntualizando las técnicas que se hayan usado en cada caso.

VALORACIÓN. Es lo fundamental del informe. Se trata de la discusión de estos resultados, de su estudio científico, doctrinal y técnico. Precisa un razonamiento lógico y claro que sirva de nexo de unión entre los hechos que se recogen y las conclusiones que se sientan.

CONCLUSIONES.

Deben

ser

entresacadas

de

las

consideraciones

efectuadas en el razonamiento anterior. Se formulan numerándolas en párrafos separados, haciendo tantos apartados como afirmaciones o negaciones se hagan.

FÓRMULA FINAL. Generalmente es la siguiente: “Lo cual es cuanto puede manifestar en cumplimiento de la misión que le había sido encomendada”. Fecha y firma.

EXPOSICIÓN DE CASOS PRÁCTICOS

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