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Enzimas - Fondo Blanco

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Sistema Cerrado Equilibrio

•Mayor desorden •Menor capacidad para realizar un trabajo útil •No apto para sistemas biológicos (muy organizados)

JGP

Sistema Abierto
(Sistema Biológico)

Impide el Equilibrio

Materia

Materia

Sistema Biológico
•Intercambio de energía y materia •Eficiente •Capacidad de perpetuarse •Altamente Organizado (funcional y estructuralmente) •Posee mecanismos de regulación •Isobárico •Isotérmico

Por lo tanto no pude usar el calor como mecanismo de transferencia de energía, por lo que recurre al trabajo para este fin (catalizadores). (catalizadores).

ENZIMAS
CATALIZADORES BIOLÓGICOS GLUCOSA + ATP hexoquinasa GLUCOSA 6P + ADP

EFICIENTES AUMENTAN 106- 1012 VECES LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN. NATURALEZA QUÍMICA MAYORITARIAMENTE PROTEICA Mr: 12,000 - >1 x 106 Mr:

COFACTOR IONES INORGANICOS: Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ COMPLEJOS ORGANICOS: COENZIMAS GRUPO PROSTETICO COENZIMA O IÓN METALLICO UNIDO COVALENTEMENTE A LA ENZIMA (halo)enzima = coenzima + apoenzima

Clasificación de las enzimas
Nomenclatura: sufijo “asa”
Nº 1 2 3 4 Clase Oxidoreductasas Transferasas Hidrolasas Liasas Tipo reacción catalizada Transferencia de electrones Reacciones transferencia de grupos Reacciones de hidrólisis Adición de grupos a dobles enlaces, o formación dobles enlaces por eliminación de grupos Transferencia de grupos dentro de moléculas dando formas isoméricas Formación enlaces C-C, C-S, C-O y C-N mediante reacciones de condensación acopladas a rotura de ATP

5 6

Isomerasas Ligasas

Ej: ATP glucosa fosfotransferasa (Hexoquinasa) ATP + D-glucosa → ADP + D-glucosa-6-fosfato DD-glucosa-

E.C. 2.7.1.1
REGULABLES •Concentración de sustrato •Acción de efectores •pH y temperatura •Modificación covalente •Variación en la cantidad de enzima que se sintetiza SUSTRATO Molecula fijada en el sitio activo y sobre la que actúa la enzima SITIO (CENTO) ACTIVO Confines de una bolsa de la enzima donde tiene lugar una reacción catalizada enzimáticamente

SITIO ACTIVO
•Porción relativamente pequeña •Entidad tridimensional •Sustrato se une a enzima por fuerzas débiles •Sitios activos hendiduras •Especificidad depende de disposición exactamente definida de átomos del sitio activo

•Para ello la enzima debe disponer de grupos funcionales que permitan establecer interacciones iónicas, puente hidrógeno, etc., etc. además de situarse en posiciones precisas durante el estado de transición. transición. •Grupos catalíticos específicos que contribuyen con la catálisis: catálisis: Ácidos: Glu, Ácidos: Glu, Asp Básicos: Lys, Básicos: Lys, Arg Cys Tyr, Tyr, Ser

NO ALTERAN LA CONSTANTE DE EQUILIBRIO DE LA REACCIÓN

S

K1 K2

P

Keq = P = K1 S K2

DISMINUYEN LA ENERGIA DE ACTIVACIÓN

Cada enzima que cataliza la reacción S→P, cataliza también la reacción contraria P→S; la acción enzimática radica en acelerar las transformaciones mutuas de S y P (hasta alcanzar el estado de equilibrio); la enzima no es equilibrio); utilizada en éste proceso, y no altera el equilibrio de la reacción. reacción.

E. Fischer (1894) – Modelo “Llave-Cerradura” “Llave-

D. Koshland (1958) – Modelo del “Ajuste Inducido”

CINETICA

- Corresponde al estudio de las velocidades de reacción y la forma en que cambian en respuesta a cambios en los parámetros experimentales. experimentales.

CINETICA

- Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima (manteniendo constante la [E]) •Velocidad inicial (Vo): número de moles de producto que se forma por unidad de tiempo, medidos antes de que se haya formado suficiente producto para que permitir que ocurra la reacción contraria (la [S] es generalmente mucho mayor que la [E]) La Vo es siempre proporcional concentración de enzima. enzima. a la

CURVA DE SATURACIÓN

Ecuación de Michaelis-Menten Michaelis-

Michaelis y Menten (1913) propusieron un modelo simple que explica 1913) las características cinéticas de enzimas sencillas (no sujetas a regulación), considerando: considerando:

E + S ⇔ ES → E + P

Necesitamos una expresión que relacione la velocidad de catálisis con las concentraciones de sustrato y enzima y las velocidades de las etapas individuales. individuales. V = k3 [ES] ES] V de formación de ES = k1[E][S] k1[ ][S V de destrucción de ES = (k2 + k3)[ES] k3)[ES] Condiciones de estado estacionario: Las concentraciones de estacionario: intermediarios permanecen invariables, mientras que concentraciones de los materiales de partida y de los productos cambiando ⇒ las v de formación y destrucción del complejo ES iguales k1[E][S] = (k2 + k3)[ES] k1[ ][S (k2 k3)[ES] [ES] = [E][S]/ (k2 + k3)/ k1(*) ES] ][S (k2 Como: Km = (k2 + k3)/ k1 Sustituyendo (*): [ES] = [E][S]/Km (**) ][S /Km los las van son

Como: ES] [E] = [Et] - [ES] Sustituyendo [E]: ES] ([ ES] /Km [ES] = ([Et] - [ES])[S]/Km Reagrupando: ES] /Km/1 /Km [ES] = [Et] [S]/Km/1 + [S]/Km O bien: ES] Km [ES] = [Et] [S]/[S] + Km Sustituyendo (**): V = k3[Et] [S]/[S] + Km k3[ Km Como: Vmax = k3[Et] k3[ Sustituyendo se obtiene la ecuación de Michaelis-Menten: Michaelis-Menten:

V = Vmax [S]/ Km + [S]

A baja [S], Km >> [S] ⇒ [S] ≅ 0 entonces, entonces, V = Vmax [S]/ Km Km dado que Km y Vmax son constantes ⇒ V ≅ K [S] A alta [S], [S] >> Km ⇒ Km ≅ 0 entonces, Km V = Vmax

Cuando V = ½ Vmax: Vmax: Vmax/2 Vmax/2 = Vmax [S]/ Km + [S] /: Vmax Km ½ = [S]/Km + [S] /Km Km = [S]

CINETICA ENZIMATICA

ECUACION DE LINEWEAVER-BURK 1/V = Km / Vmax x 1/ [S] + 1/ Vmax ]

•Los valores de Km pueden variar considerablemente de una enzima a otra o en una misma enzima con distintos sustratos. sustratos. • El valor de Km se utiliza (aunque no siempre correctamente; sólo si k3 << correctamente; k2) para evaluar la afinidad de una enzima frente a su sustrato. sustrato. Km = (k2 + k3)/ k1 en caso de que k3 << k2, ⇒ Km = k2/ k1 ⇒ Kd del complejo ES (Kd = [E][S]/[ES]) (Kd ][S ES] en estas condiciones Km es una medida de la estabilidad del complejo ES: Km alta ⇒ unión débil Km baja ⇒ unión fuerte •En condiciones de saturación de la enzima, cuando la mayor parte de ella se encuentra en la forma EP, es útil definir una constante de velocidad mas general denominada kcat (es equivalente a k3) o número de recambio; éste recambio; corresponde al número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo por una molécula de enzima cuando ésta está totalmente saturada de sustrato •Cuando [S] << Km se utiliza otro parámetro cinético para evaluar la eficiencia catalítica, correspondiente a kcat/Km catalítica,

Reacciones con múltiples sustratos

Reacciones con múltiples sustratos
Ej: acetil-CoA carboxilasa: acetil-

INHIBICION ENZIMATICA

INHIBICION ENZIMATICA
•Reversible (unión no covalente del inhibidor factible de revertirse) •Irreversible (unión covalente del inhibidor a la enzima, incapacitándola) Inhibición reversible: a) competitiva b) no competitiva c) mixta

1a) Inhibición competitiva

•Tanto el sustrato como el inhibidor pueden ajustarse al sitio activo (competición) •El sustrato puede procesarse por la enzima, mientras que el inhibidor no •El inhibidor competitivo aumenta la Km aparente

A altas concentraciones de sustrato se minimiza la probabilidad de que se fije una molecula del inhibidor ⇒ Vmax normal

Ej.: terapeútica en ingestión accidental de metanol Ej.:

1b) Inhibición no competitiva

Se fija a un sitio distinto del que se fija el sustrato ⇒ nulo efecto sobre Km

La enzima se inactiva cuando está fijado el inhibidor, tanto si el sustrato está o no está presente ⇒ disminución de Vmax aparente

Ej.: bloqueo reversible de grupos –SH por acción de uniones con Cu o Hg Ej.:

1c) Inhibición mixta La unión del inhibidor a la enzima puede modificar tanto el Km como la Vmax El inhibidor (que no tiene porqué parecerse al sustrato) no se une al sitio activo aunque tiene efecto competitivo. competitivo. La unión de uno y otro no son excluyentes. El resultado excluyentes. final depende de cual de los dos prevalezca. prevalezca.

2) Inhibición irreversible •Se combina el inhibidor con un grupo de la enzima, que es esencial para su actividad o la destruyen (enlace covalente) •Son, por lo general, sustancias tóxicas, naturales o sintéticas •Reaccionan con un grupo funcional del sitio activo para bloquear el sitio activo del sustrato o para dejarlo catalíticamente inactivo •Gran utilidad para realizar estudios de mecanismos de reacción enzimática •Ej.: a) diisopropil fluorofosfato (DFP) (reacciona rápida e irreversiblemente con los grupos hidroxilos de serina) serina)

Penicilina inactiva irreversiblemente a la enzima clave en la síntesis de la pared celular bacteriana, al unirse covalentemente con una Ser del sitio catalítico

Influencia de la temperatura sobre la velocidad de reacción enzimática
Tº óptima

Influencia del pH sobre la velocidad de reacción enzimática

Estrategias catalíticas
Ejemplo de mecanismos de reacción enzimático específico: serina proteasas (quimotripsina) Serina proteasas: proteasas: •Catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos (o éster) en polipéptidos y proteínas •La mayoría, tienen estructuras tridimensionales semejantes y relación evolutiva evidente

En el sitio activo siempre existe un residuo de aspartato (Asp102), un residuo de histidina (His57) y un residuo de serina (Ser195) ⇒ triada catalítica

•La quimotripsina cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos o éster en 2 etapas distintas (cinética de hidrólisis del acetato de pnitrofenilo)
a) acilación: combinación del acetato de p-nitrofenilo con quimotripsina para acilación: formar el complejo enzima-sustrato (unión covalente), liberándose penzimanitrofenol (etapa rápida)

b) desacilación: hidrólisis del intermediario acetil-enzima, regenerándose la desacilación: acetilenzima libre (estado estacionario; etapa más lenta) estacionario; •cuando se emplean grandes cantidades de enzima, se produce una explosión rápida inicial del producto p-nitrofenol, seguida por la formación del producto a una velocidad mucho mas lenta, en régimen de estado estacionario

REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Es esencial para el flujo ordenado del metabolismo Mecanismos de regulación enzimática
•Control a nivel de sustrato •Interacción directa de los sustratos y los productos de cada reacción catalizada enzimáticamente con la propia enzima

•Control por retroacción
a) Retroacción negativa (retroinhibición): retroinhibición)

Un aumento de la concentración del producto E ⇒ descenso en la velocidad de producción por del primer paso de la línea metabólica ⇒ eficiente regulación de rutas metabólicas complejas

b) Retroacción mediante activación o inhibición en patrones metabólicos más complicados: complicados: Para controlar las rutas de manera que G y N se mantengan en equilibrio: equilibrio: las concentraciones elevadas de G podrían inhibir la enzima C N); → D y/o activar la enzima C → K (a la inversa de N); también tanto G como N pudieran inhibir la enzima A → B para establecer una regulación global

Enzimas alostéricas
•Control de las rutas producidas por moléculas procedentes de un lugar alejado de la línea de montaje, que no se parecen a los sustratos ni a los productos directos de las enzimas a regular (alostérico ⇒ “otra estructura”) •Funcionan a través de la unión reversible, no covalente, de un metabolito regulador denominado modulador . •En las enzimas alostéricas heterotrópicas el sitio de fijación del sustrato y el sitio(s) de fijación del modulador se encuentran en subunidades diferentes, la subunidad catalítica (C) y la reguladora (R); la fijación del modulador (R); positivo (M) a su sitio específico en la subunidad R (sitio regulador o alostérico) alostérico) ⇒ cambio conformacional en ambas subunidades ⇒ activación de la subunidad C ⇒ fijación del sustrato con mayor afinidad

•En las enzimas alostéricas homotrópicas el propio sustrato es a menudo un activador, siendo entonces el sitio activo y el sitio regulador el mismo •El sitio regulador (alostérico) es específico para su modulador; las enzimas modulador; con varios moduladores tienen generalmente diferentes sitios de fijación específicos •Son mayores y más complejos que las enzimas sencillas, poseyendo la mayoría 2 o más cadenas polipeptídicas o subunidades •Presentan propiedades cinéticas diferentes; dan lugar a una curva de diferentes; saturación sigmoídea cuando se representa Vo frente a [S]. En vez de Km se utiliza el símbolo K0.5 o [S]0.5, para representar la concentración de sustrato que da la mitad de la Vmax

(+): activador

(0) : control

(-): inhibidor

•El comportamiento sigmoideo es generalmente reflejo de interacciones cooperativas entre múltiples subunidades proteicas; la fijación de una proteicas; molécula de sustrato a un sitio de fijación altera la conformación de la enzima facilitando mucho la fijación de otras moléculas de sustrato. sustrato. •Para evaluar la cinética sigmoide de la saturación, se utiliza la gráfica de la ecuación de Hill, que escrita de manera lineal es: es:

log V/Vmax –Vi = n log[S] – log K V/Vmax
(y =m x + b)
•n corresponde al coeficiente de Hill, que es una medida del grado de cooperatividad: cooperatividad: •n = 1 ⇒ la unión del ligando no es cooperativa (cinética de Michaelis-Menten) Michaelis-Menten) •n > 1 ⇒ hay una cooperatividad positiva en la unión del ligando, donde la unión de una molécula de ligando facilita la unión de otras •n < 1 ⇒ cooperatividad negativa, donde la unión de una molécula de ligando dificulta la unión de otras

Modelo concertado (fig. a) (fig.

Modelo secuencial (fig. b): (fig. b):

Modificaciones covalentes
•Se modula la actividad por modificación covalente de la molécula enzimática •Grupos modificadores: fosfato, adenosina monofosfato (AMP), uridina modificadores: fosfato, monofosfato (UMP), adenosina difosfato ribosa, metilo •Los grupos se unen covalentemente y se eliminan de la enzima reguladora por otras enzimas (proceso reversible) reversible) •Ej.: regulación por modificación covalente (fosforilación) de la glucógeno Ej.: fosforilasa, fosforilasa, que cataliza la siguiente reacción: reacción:

Activación por escisión proteolítica
•Se parte de un precursor inactivo de la enzima denominado zimógeno (o proenzimas); proenzimas); éstos pasan a ser catalíticamente activos cuando sufren la ruptura •Muchas enzimas proteolíticas (proteasas) del estómago (pepsinógeno → pepsina) y del páncreas (quimotripsinógeno → quimotripsina; tripsinógeno quimotripsina; tripsina; → tripsina; proelastasa → elastasa) resultan así activadas •La rotura específica produce cambios conformacionales que hace asequible el sitio activo de la enzima •Tipo de activación irreversible ⇒ se requieren otros mecanismos para inactivarlas (proteínas inhibidoras que se fijan fuertemente al sitio activo de la enzima; ej.: enzima; ej.: α1-antiproteinasa, inhibidor de tripsina pancreático, etc.) etc. •Otros ejemplos de activación de zimógenos: hormonas, tejido conjuntivo y zimógenos: sistema de coagulación sanguínea

BQ Javier Grandón

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