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08 Introducción a la ingeniería genética

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Introducción a la ingeniería genética

Ingeniería genética: trabaja principalmente con la manipulación de genes (manipulación de secuencia de DNA). Como herramienta principal se usan las enzimas de restricción, que son las enzimas que cortan o modifican en sitios específicos cadenas de DNA de doble hebra o simple hebra. La ingeniería genética se basa en técnicas tales como el DNA recombinante y clonamiento molecular, por ejemplo mezclar el DNA de una bacteria con el de un ser humano, producir insulina humana, etc. El DNA sin genes también es clonable. Otros usos que se le da es la creación de organismos transgénicos, con DNA mezclado. En estos organismos transgénicos se encuentran la creación de vegetales que resisten al ataque de plagas. Las sistemas de las enzimas de restricción se estudiaron inicialmente en bacterias. Se basa en la observación de la especificidad en infecciones por bacteriófagos. La genética molecular y microbiana investigada por primera vez por Stamford en 1972. Metodología: (permite cortar, modificar y unir) 1. El DNA es cortado con enzimas de restricción. Se generan fragmentos de DNA. (enzimas, mecánicamente, sonicacion, métodos físicos o químicos, etc) 2. Se modifican con enzimas como por ejemplo, fosfatasa alcalina (desfosforilar), nucleasa S1 para cortar hebra simple,etc 3. Unión: La ligasa une el OH 3’ con el fosfato 5’ formando un enlace fosfoester. El DNA se une a una molecula vector. Se introduce a la célula hospedera. Se selecciona la secuencia deseada con los vectores (vectores virales). Los vectores virales son específicos ya que tienen un receptor. (Mecanismos de selección para diferenciar, quienes son las bacterias que incorporaron el DNA, lo que se usa es que en las bacterias se tiene un gen de resistencia a antibiótico, las bacterias que no incorporan el gen se mueren) Enzimas de restricción: (enzimas de restricción de bacterias) Cuando se estudiaba el fago lambda en los años 50 se hace un experimento para determinar si todos los virus son líticos. Se tienen diferentes cepas (Strain) de DNA de virus, la cepa A y la Cepa B. En el experimento se observa que una cepa viral produce lisis a una bacteria y que la otra cepa no produce lisis en la misma. La cepa A es infectada con un virus de la cepa B, el DNA entra desnudo en las bacterias. La cepa B

estos sistemas protegen el DNA cromosomal de la célula hospedadora con un similar corte y degradación. Como se muestra en las imágenes cuando el DNA esta metilado la enzima de restricción no reconoce la secuencia y no puede cortar. Las enzimas de restricción reconocen secuencias palindrómicas: 5’-3’GAATTC ** Las secuencias siempre se leen 5’-3’. las enzimas de restricción de la cepa B degradan al DNA invasor. Las enzimas de restricción cortan los segmentos de DNA donde no se encuentra metilado. es la misma secuencia en ambas hebras. por lo que se conoce como DNA hemimetilado El DNA hemimetilado no puede ser cortado por una endonucleasa y es un excelente sustrato para la metilasa. Esta metilación es hecha por una enzima llamada metilasa. . Al mismo tiempo. Para que exista replicación en el DNA. En cambio en la cepa A existen distintas moléculas que cortan el DNA de la cepa B.corta el DNA viral que es inyectado por el virus. CTTAAG La modificación es una simple metilación. este debe estar completamente metilado. la cepa B produce enzimas de restricción que reconocen y cortan diferentes secuencias. este se encuentra metilado. Si la replicación es semiconservativa quedan segmentos metilados y otros no metilados de DNA. La misma secuencia metilada es reconocida por la metilasa y por la endonucleasa. Las diferentes cepas de bacterias tienen diferentes secuencias de reconocimiento para la restricción y la modificación. Cuando el fago A infecta a la cepa B. Mientras la cepa A del ejemplo anterior puede estar metilada y protegida con una secuencia especifica. Por esto como defensa de las enzimas de restricción del DNA celular. Razones: Muchas cepas de bacterias tienen enzimas de restricción-modificación y reconocen el DNA foráneo (como el DNA del fago) y lo cortan para prevenir infecciones.

dejando un extremo de hebra simple. Enzimas tipo II Son los sistemas más simples y más comunes comercializados. En la siguiente replicación el DNA es hemimetilado. ECO R1 (enzima endonucleasa de E. coli) La enzima ECO R1 rompe un enlace fosfoester. Nomenclatura: Su nombre proviene de la bacteria donde se produce. 5’. Si el DNA se encuentra completamente metilado no hay corte. En este sistema hay enzimas R y M separadas. el DNA hemimetilado es ahora sustrato de la metilasa. El número es de 46.En las bacterias encontramos diferentes casos: R(restricción) Endonucleasa R+ RR+ RM(modificación) Metilasa M+ M+ MM- Tiene modificación y restricción Esta todo metilado. ya que como no metila. . capaces de reconocer el sitio de corte sin ocupar proteína S. ya que reconoce 6 pares de bases y existen 4 nucleótidos distintos. El corte en el sitio de reconocimiento (o adyacente a él) puede producir extremos romos o “sticky ends”. No requieren de formación de complejo. las que cortan al inicio dejan extremos pegajosos y son más fáciles de unir por la ligasa. las enzimas de restricción cortan todo el DNA donde encuentren el palíndrome. La cepa de la bacteria de donde se obtiene la enzima protege a su propio DNA produciendo una metilasa específica. Reconoce la secuencia 5-GAATTC-3. hay menor probabilidad de cortes. esta toma un grupo metilo desde la S-adenosinmetionina y la pone en el N6 de la segunda adenina en la secuencia de reconocimiento de la ECOR1. no se puede cortar el DNA. y la célula queda con muchos DNA metilados. la secuencia palindrómica es de 4 a 6 pares de bases. Estas bacterias son usadas en ingeniería genética ya que con esto se asegura que el DNA no se modifica. Si se desea cortar un DNA grande y la enzima de restricción reconoce 6 pares de bases. por lo que solo los DNA hemimetilado pueden ser metilados. El sitio de reconocimiento es corto. Estas enzimas no requieran ATP para su actividad endonucleasa. (I por la primera enzima descrita) Las enzimas que cortan al medio son las que dejan extremos romo. ¿Por qué el DNA del fago invasor no es metilado cuando entra a la bacteria? Solo el DNA hemimetilado es sustrato de la metilasa. esto está codificado en el plásmido. La bacteria se muere. estos DNA quedan protegidos de la restricción.

Deben cortar ambas hebras en la misma posición. donde se separa por tamaño. En una banda que uno vea puede haber más de un tipo de molécula del mismo tamaño o pueden haber quedado fragmentos pequeños. En la imagen siguiente se muestran los tipos de corte de diferentes enzimas y los extremos 3’ y 5’. por que se acercan solos y luego la DNA ligasa los une. nos preguntamos cuál es el tamaño del DNA. Neoisoesquizómeros: Reconocen la misma secuencia pero no cortan de igual manera. Si en el gel se ven 5 bandas. Para confirmar el tamaño real del DNA se corta con diferentes enzimas para poder comparar los tamaños y determinar efectivamente el tamaño. Tienen la misma actividad enzimática pero trabajan en distintas células. ECORI deja extremos libres 5’ y PstI deja extremos libres 3’. el último nucleótido del primer 3’ OH.La enzima de restricción tiene una estructura cuaternaria: tiene dos subunidades: dos polipéptidos separados que son idénticos. (Dato: La polimerasa replica de 5’ a 3’). ¿Cuál es sustrato de una DNApol? En la replicación una RNA polimerasa debe tener un molde y un primer. por lo que es un homodímero. En la figura se muestra una electroforesis. unos cortan dejando extremos romo y los otros cortan dejando extremos sticky) . (Por ejemplo. se mira el DNA fragmentado por enzimas de restricción. Los extremos màs fáciles para pegar por DNA ligasa son los cohesivos. este debe estar libre para la replicación. Para pegar extremos romo se necesita mayor concentración de DNAligasa. Isoesquizómeros: Son enzimas que reconocen y cortan secuencias iguales pero provienen de distintos genes. pero no se puede saber con una banda ya que la intensidad de la banda se relaciona con la cantidad. no directamente con el tamaño.

DMSO) . Un ejemplo de una enzima que puede tener esta actividad es la enzima EcoRI. pero al salir de este estado la concentración no debe ser mayor del 5% para que la enzima no pierda especificidad. Por ejemplo: si hay una mutación. Las condiciones no estándar pueden ser las siguientes: • • Alto pH (>8. el corte puede ocurrir con la misma secuencia que reconoce normalmente (GAATTC) pero con una sustitución simple de alguna base. (e. • • Concentración de enzimas extremadamente alta (>100 U/ug of DNA) Presencia de solventes orgánicos en la reacción. Star Activity Cuando el DNA es digerido con algunas enzimas de restricción bajo condiciones no estándar. el corte puede ocurrió en diferentes sitios de la secuencia normal de reconocimiento. lo que no las afecta por que con la baja temperatura estas enzimas no están activas.Mutación: Una mutación puede hacer aparecer un sitio nuevo de corte o hacer desaparecer otro. esto es llamado “star activity”. ethanol. sin embargo las enzimas son mantenidas en 50% de glicerol. Generar DNA recombinante. estudios clínicos. Polimorfismo de longitud de fragmento: Se tiene una cepa A y una cepa B y se corta con una enzima de restricción se esperaría que del mismo patrón de fragmentos. si se olvida poner un tampón) Concentraciones de glicerol > 5% : El glicerol se ocupa como anticongelante o persevante. si la persona tiene una patología se determina con esta técnica.0) o baja fuerza iónica (ej.g. el sitio desaparece y se genera un fragmento C suma de A y B. esto tiene como utilidad diferenciar cepas.

• • Concentración de enzimas extremadamente alta (>100 U/ug of DNA) Presencia de solventes orgánicos en la reacción. (e. lo que no las afecta por que con la baja temperatura estas enzimas no están activas. si se olvida poner un tampón) Concentraciones de glicerol > 5% : El glicerol se ocupa como anticongelante o persevante.Las condiciones no estándar pueden ser las siguientes: • • Alto pH (>8. ethanol. DMSO) .g. pero al salir de este estado la concentración no debe ser mayor del 5% para que la enzima no pierda especificidad.0) o baja fuerza iónica (ej. sin embargo las enzimas son mantenidas en 50% de glicerol.

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