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Microbiologia de Alimentos: Practica nº 07-Detección de Salmonella

Microbiologia de Alimentos: Practica nº 07-Detección de Salmonella

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Métodos usados para la deteccion de Salmonella sp. en alimentos. Descripcion, fundamento, interpretacion y demas.
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ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

PRÁCTICA Nº 07 Detección del Salmonella
ASIGNATURA : Microbiología de los Alimentos I DOCENTE : Dra. Graciela Albino Cornejo ALUMNO : Rómulo Aycachi Inga CICLO : 2007 - II Lambayeque, 21 de febrero de 2008.

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PRÁCTICA Nº 07

DETECCIÓN DE SALMONELLA
I. Introducción: El género Salmonella se incluye en la familia Enterobacteriaceae, integrada por bacilos Gram negativos anaerobios facultativos. Poseen, por lo tanto, las características generales de las enterobacterias: son fermentadores de la glucosa, catalasa positiva, oxidasa negativa y suelen ser móviles; representa una excepción Salmonella gallinarum, siempre inmóvil. La nomenclatura de Salmonella es compleja. Se han usado diferentes sistemas para referir a este género. Teniendo en cuenta que estas bacterias tienen una muy importante homología general de su ADN, deberían ser caracterizadas como dos únicas especies. Esta propuesta, formulada por Le Minor y Popoff en la década de los ochenta, no ha sido completamente aceptada. No obstante, y teniendo en cuenta la necesidad de uniformizar la comunicación entre los distintos actores (médicos, veterinarios, químicos, etc.), la mayoría ha optado por seguir una antigua propuesta de Kaufmann, con las más recientes modificaciones (formuladas desde el Centro de Referencia colaborador de la OMS, en el Instituto Pasteur); así, se divide el género en dos especies: Salmonella enterica y Salmonella bongori, diferenciables entre sí por características metabólicas tales como la hidrólisis del ONPG, el crecimiento en presencia de KCN y otras. Salmonella enterica se subdivide, a su vez, en seis subespecies: enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houenae(IV), e indica (VI) que corresponden a los antiguos subgéneros. Estas subespecies son diferenciables bioquímicamente. Como todas las enterobacterias, el género Salmonella tiene tres tipos de antígenos: somático (O), flagelar (H) y de envoltura, para Salmonella (Vi). Los antígenos somáticos son termoestables y su especificidad radica en el componente polisacárido de la endotoxina, complejo proteína- lipopolisacárido. Los antígenos O se clasifican en mayores y menores; los mayores son los que definen un grupo antigénico. Así, el factor antigénico 0:4 caracteriza el antiguo grupo B, hoy llamado O:4, mientras que los antígenos menores tienen menor valor discriminativo. Por ejemplo, el antígeno O:12 lo presenta toda Salmonella perteneciente a los grupos A, B y D. Pueden encontrarse otros antígenos menores generados por modificaciones químicas o por conversiones fágicas. Los antígenos capsulares o de envoltura sólo lo presentan algunos serotipos de Salmonella (Typhi y Dublin). Los antígenos flagelares son proteicos y termolábiles. Algunas serovariedades sólo producen un único tipo de antígeno H, siendo, en consecuencia, monofásicos. Sin embargo otros serotipos pueden producir alternativamente dos tipos de antígenos H, por lo que se denominan bifásicos. Mediante el uso de reacciones antígeno anticuerpo se determina la fórmula antigénica de una cepa y, a partir de dicha fórmula, se la clasifica en serovar o serotipo siguiendo el esquema propuesto originalmente por Kauffman y White (que agrupa todas las serovariedades conocidas, mas de dos mil quinientos). II. Objetivos:

Investigar la presencia de Salmonella en alimentos de consumo humano. Realizar un recuento de Salmonella. Conocer el método de análisis y el uso de los medios de cultivo.

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III. -

Materiales: Agar S-S. Placas Petri Tubos de dilución Frascos Pipetas Mechero Bunsen Gradillas

Muestra de alimentos (en este caso huevos de gallina). Medio de enriquecimiento no selectivo (caldo lactosado) Medio de enriquecimiento selectivo (caldo selenito y caldo tetrationato) IV. Procedimiento:

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Como en este caso la muestra a estudiar han sido huevos crudos de gallina se toman diez de estos y se los reparte equitativamente en dos frascos grandes estériles (al introducirlos se los rompe). Luego se le agrega 225 mL de caldo lactosado (enriquecimiento no selectivo). Los frascos se los envía a estufa a 30 ºC por 24 h. Pasado el tiempo, se preparan los tubos conteniendo 10 mL de los medios de enriquecimiento selectivo (dos con caldo selenito y dos con caldo tetrationato). Se inocula 1 mL de la muestra anterior a cada uno de los tubos y luego se los separa, un par de tubos (C. selenito y C. tetrationato) van a incubación a 37 ºC y el otro par de tubos van a 42 ºC y ambos por 24 h. Pasado el tiempo de incubación, se siembran de cada uno de los tubos en placas con agar S-S. Éstas se incubarán a 37 ºC por 24 h. Luego, se realizarán a las colonias características, las pruebas bioquímicas necesarias para su identificación.
Muestra: Huevos

Enriquecimiento no selectivo 1 mL

225 mL caldo lactosado + 25 mL muestra 30 ºC x 24 h.

1 mL
Caldo Tetrationato Caldo Selenito

Enriquecimiento selectivo

Caldo Selenito

Caldo Tetrationato

37 ºC

Incubar por 24 h.

42 ºC

Luego se siembran en agar SS

Se incuba a 37 ºC por 24 h

Pruebas bioquímicas

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V. -

Resultados:

De los tubos con caldo selenito y caldo tetrationato sembrados se los envió a incubación, cada uno a sus temperaturas respectivas por 24 h. Pasado ese tiempo, se vio resultados:

-

De los tubos obtenidos se sembró por agotamiento y estría en placas con agar SS. Se las incubó a 37 ºC por 24 h, pasado el tiempo se observó los resultados.

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-

Como se puede observar, se obtuvieron colonias negras, características de Salmonella productora de H2S. Se escogió una de estas colonias y se le realizó las pruebas bioquímicas respectivas. PRUEBA Indol Rojo de metilo Voges Proskawer Citrato LIA RESULTADO Negativo Positivo Negativo Positivo Positivo, ++

-

Con los resultados obtenidos se pudo identificar a Salmonella enterica. VI. Preguntas:

-

¿Por qué se realiza el uso de medios selectivos y no selectivos? - En la práctica realizada se utilizó como medio no selectivo el caldo lactosado, este, más que un medio no selectivo, es un medio de preenriquecimiento, ya que la lactosa contenida en el caldo va a favorecer el crecimiento de las enterobacterias que pudieran estar presentes en el medio. Los que si son medios selectivos son los caldos selenito y tetrationato. El caldo selenito inhibe el crecimiento de coliformes, enterococos y estafilococos (no así de Salmonella, Shigella, Proteus y Pseudomonas) y el caldo tetrationato inhibe el crecimiento de coliformes y bacterias Gram positivas (estas por los acidos biliares). Originalmente el caldo no contiene tetrationato en su formulación, este se forma por oxidación del tiosulfato sódico merced al yodo contenido en la solución (por eso le agregamos lugol). ¿Con qué finalidad se siembra en agar tetrationato y selenito y por qué se incuba a 37 y 42 ºC? - Las bacterias del género Salmonella tienen una Tº óptima de 35 a 37 ºC, por su característica como patógeno humana, pero tiene un rango de crecimiento 5

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de 7º a 54 º C, por lo cual se la incuba tanto a 37º como a 42 ºC para eliminar del medio a bacterias competidoras como por ejemplo E. coli que tiene una Tº de crecimiento máximo de 45 ºC. Entonces, usamos la Tº como una forma de seleccionar y diferenciar a la bacteria. ¿Cuál es la composición del medio S-S? Agar Salmonella-Shigella
Extracto de carne Proteosa de peptona Lactosa Bilis de buey desecada Citrato de sodio Tiosulfato de sodio 5g 5g 10 g 8.5 g 8.5 g 8.5 g Citrato de fierro amoniacal Verde brillante Rojo neutro Agar Agua destilada 8.5 g 0.0003 g 0.025 g 13 g 1 000 mL

- Realizar una clasificación actual del género Salmonella. El género Salmonella, de taxonomía difícil, conceptualmente se ha modificado en estos últimos años, por el aporte de estudios moleculares de homología de ADN que han clarificado el panorama taxonómico de las enterobacterias. Clásicamente se distinguían tres únicas especies patógenas primarias: S. typhy, S. cholerae-suis y S. enteritidis. A su vez, según la serotipificación de Kauffman y White, eran clasificadas en más de 2000 serotipos en base a los antígenos flagelares H (proteicos) y antígenos somáticos O (fracción polisacárida del lipopolisacárido bacilar). S. typhi posee además un antígeno de virulencia (Vi). El tratamiento taxonómico actual de Salmonella ha simplificado el espectro, reagrupando todas las cepas (patógenas o no) en dos únicas especies: S. entérica y S. bongori. Ésta última (previamente subespecie V) no es patógena para el ser humano. La especie S. entérica tiene seis subespecies (a veces como subgrupos bajo numeración romana):
• • • •

I enterica II salamae IIIa arizonae IIIb diarizonae

• • •

IV houtenae V S. bongori, ya incluida en una especie distinta VI indica

Cada subespecie a su vez, está conformada por diversos serotipos, habiéndose identificado hasta la fecha más de 2500. Una de ellas es S. enterica subsp. enterica (o subgrupo I), se divide en cinco serogrupos: A, B, C, D y E. Cada serogrupo comprende múltiples componentes, son las serovariedades (serotipos). Esta clasificación implica una terminología de uso poco práctico en la clínica bacteriológica, por lo tanto, en términos médicos, la nomenclatura es diferente y simplificada, pues se consideran los nombres de los serotipos (serovaridades) de Salmonella como si fuesen nombres de especies. Por ejemplo, "Salmonella enterica subgrupo entérica serotipo Typhimurium", se refiere como "Salmonella typhimurium". Estas denominaciones, aunque menos correctas desde el punto de vista taxonómico estricto, son de aceptación mundial. Con importancia clínico epidemiológica, las más de 2000 serovariedades de Salmonella pueden agruparse en tres divisiones ecológicas:

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1. Salmonella spp. adaptadas a vivir en el ser humano, entre ellas, S. typhi, S. paratyphi A, B y C; 2. Salmonella spp. adaptadas a hospederos no humanos, que circunstancialmente pueden producir infección en el hombre, entre ellas, S. dublin y S. cholerae-suis; 3. Salmonella spp. sin adaptación específica de hospedero, que incluye a unas 1800 serovariedades de amplia distribución en la naturaleza, las cuales causan la mayoría de las salmonelosis en el mundo. VII. Referencias:

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SALMONELLA (2003) Generalidades del género. Obtenido el 15 de febrero de 2008 en http://www.bvsops.org.uy/pdf/salmonella.pdf L. ORTIZ, M. (2003) Material didactico de Microbiologia de Alimentos: Aislamiento e identificación de Salmonella. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_m icrolimentos.htm FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo en Microbiología: Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3º Edic. Lima. WIKIPEDIA: LA ENCICLOPEDIA LIBRE (2008) Salmonella. Obtenido el 15 de febrero de 2008 en http://es.wikipedia.org/wiki/Salmonella DE LA TORRE MARTINEZ, M. E. (2006). Caracterizacion molecular y fenotípica como herramienta de marcaje epidemiológico para cepas de Salmonella de origen pocino. Obtenido el 15 de febrero de 2008 en http://www.tesisenxarxa.net/TDX-1013106-104441/index.html

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