TEMA-22.

ASPECTOS CLNICOS DE LA ENZIMOLOGA

1. Determinacin de actividades enzimticas para el diagnostico clnico

Mejor conocimiento molecular metabolismo Desarrollo de mtodos de anlisis enzimticas

2. Herramientas analticas
Purificacin de enzimas

3. Terapia enzimtica
Industria Biotecnolgica

8. Inhibidores enzimticos (Frmacos)

Conocimiento estructural y funcional

1. Determinacin de actividades enzimticas para el diagnostico clnico a) La enzima debe estar presente en fluido biolgico b) La enzima debe ser fcil de ensayar y automatizar la medida c) Los valores de actividad entre individuos sanos y enfermos deben ser significativos y debe haber buena correlacin con los valores patolgicos. d) La enzima debe ser estable

Tipos de fluidos:

Suero (Ms comn) y Orina

LCF, Pleura, Sinovial, etc

SUERO
1. Enzimas especficas
Enzimas su funcin radica en el plasma Ej Enzimas de la coagulacin, activacin del complemento, metabolismo de lipoprotenas, etc

2. Enzimas no especficas
Enzimas que son secretadas por los tejidos. Ej. Amilasas, lipasas, fosfatasas, etc. Enzimas intracelulares. Dao Tisular Creatin quinasa 50.000 veces dao en el musculo. Proliferacin Celular (Neoplasia) Aclaramiento renal deficiente

DIAGNOSTICO

Enzima especfica de tejidos (Raro) -Abundancia relativa

Fosfatasa cida (prostata), Acetilcolinesterasa (eritrocitos)

- Patrn de enzimas caracterstico - Isoenzimas (LDH, Creatin quinasa..

Ciencia forense:, Adenosina deaminasa, adenilato ciclasa, aminopeptidasa, fosfatasa cida, etc.

ENZIMOLOGIA CLNICA DEL INFARTO DE MIOCARDIO

Pruebas enzimticas : Evidencia de la produccin de un infarto Seguimiento del progreso y la recuperacin tras ciruga

Creatina Quinasa Aspartato aminotransferasa Lactato deshidrogenasa

Valor en plasma Concentracin en tejido Velocidad del vertido Grado de degradacin

Vida media 10 130 horas

Creatina Quinasa mas especfica

Test depende del tiempo del infarto

LDH se puede diferenciar por electroforesis

Creatina quinasa

Msculo esqueltico Msculo cardiaco (Mayor concentracin) Cerebro No en el hgado Protena dimrica: Hay dos tipos de monmeros M y B Msculo M-M (99%) y M-B (1%) Corazn MM (80-70%) y M-B (20-30%) Cerebro B-B (100%) M-B (Actividad Total apenas cambia) Inmunoblotting (B)

Pequeo Infarto

Lactato deshidrogenasa
Hgado, Corazn Inmunoblotting LDH-1 Uso de sustratos especficos

LDH1/LDH2 = 0.85 Normal >1 Enfermo

Transaminasas (ALT y AST)

Se utilizan poco actualmente Hgado AST/ALT (3-5) Corazn AST/ALT (20-25)

ENZIMOLOGIA CLNICA DE ENFERMEDADES HEPTICAS

Aspartato aminotransferasa (AST GOT) Alanina aminotransferasa (AST GPT) Fosfatasa alcalina -Glutamil transferasa Otras: Lactato deshidrogenasa, glutation transferasa, etc Transaminasas

Fosfatasa alcalina
4-nitrofenil fosfato Visible

-Glutamil transferasa

Enfermedades hepticas
Crnicas Agdas Intermitentes

Hepatitis Cirrosis Tumores Obstruccin del conducto biliar

USO DE LAS PRUEBAS ENZIMOLGICAS -Diagnstico de enfermedades -Seguimiento de tratamientos con frmacos (Higado metaboliza drogas) -Seguimiento de operaciones hepticas TRANSAMINASAS
No especficas del plasma Clulas parenquimales Hepatitis, cirrosis Necroticas (Hepatitis, cirrosis) Progreso de la enfermedad Vertido al plasma

FOSFATASA ALCALINA
No especficas del plasma Superficie sinusoidal del clulas hepticas y del conducto biliar, Osteoblastos ISOENZIMAS Daos en las clulas del conducto biliar Ratio Fosf.Alc/Transaminasas Hepatitis 0,2-0,6 Obstruccin del 10-20 conducto biliar

-GLUTAMIL TRANSFERASA Alcoholismo crnico Cirrosis

Incremento sntesis y en la secrecin GLUTATION TRANSFERASA

Cataliza reacciones de destoxificacin utilizando glutation Carcinognicos Agentes de quimioterapia Paracetamol Xenobiticos

Contenido alto 5% Vida media corta 90 min Marcador muy rpido y sensible de dao heptico

Tiempo de la Protrombina
Funcin heptica Tiempo requerido para la activacin de la protrombina en Trombina Indica grado de funcionamiento heptico Factores de la coagulacin estn producidos en el hgado y secretados a la sangre Trombina Cataliza el proceso de coagulacin

OTRAS ENZIMAS DE INTERES CLNICO -AMILASA Pncreas Glndulas salivares

Suero normal Baja actividad Suero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30) Diagnstico es complicado sin la medida de la amilasa Suero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30) Amilasa deteccin en orina debido a bajo Peso Molecular CREATINA QUINASA y FRUCTOSA BIFOSFATO ALDOLASA Indicadores de desordenes en la musculatura esqueltica Creatina quinasa Msculo esqueltico, cardiaco, Cerebro

Distrofia muscular, Daos en el msculo, ejercicio intenso, infarto de miocardio, dao cerebral, etc ISOENZIMAS Fructosa bifosfato aldolasa Msculo esqueltico (otros tejidos) Significado clnico menor Precaucin (contaminacin Glb rojos)

FOSFATASA ALCALINA Diagnstico de obstruccin del conducto biliar Enfermedades de huesos Incremento actividad en clulas formadoras de huesos (Osteoblastos) Osteomalacia Raquitismo Hiperparatiroidismo Enfermedad denominada hipofosfatasia Actividad Crecimiento cristales de hidroxiapatito Osteoblastos, Hgado, Intestino,

Pirofosfatos inorgnico (substrato) No estrictamente Isoenzimas Placenta Modificaciones Postraduccionales Diferenciacin Electroforesis muy complicado Uso de inhibidores, Calor FOSFATASA ACIDA Localizacin Hgado, eritrocitos, PROSTATA, etc Diagnostico de carcinoma de Prstata Precaucin en el muestreo - Lbil - Contaminacin con FA de eritrocitos Diferenciacin isoformas

- Sensibilidad sustratos - Uso de inhibidores especficos: Formaldehido

2. HERRAMIENTAS ANALTICAS: USO DE ENZIMAS PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIN DE METABOLITOS Uso de la enzima para transformar un metabolito en un producto el cual se pude determinar analticamente

Ventajas
La enzima es muy especfica Metabolito determinado en presencia de otras sustancias Evita la purificacin necesaria en un anlisis qumico Sustancias lbiles

Inconvenientes
El costo de la enzimas Inmovilizacin Ureasa, Tripsina, Hexoquinasa Inmoviliza en las paredes del tubo Anlisis en continuo Inactivacin de las enzimas. Presencia de inhibidores, etc

1.

Puntos importantes para utilizar una enzima La posicin del equilibrio de la reaccin. Deber ser unidirecional y rpido Equilibrio no favorable a) Acoplando la reaccin a otra reaccin enzimtica

b) Trampas qumicas. Ej. Glutamato deshidrogenasa

2. Utilizar gran cantidad de enzima Depende de la Vmax y de la Km. 3. La especificidad de la enzima debe ser conocida 4. Pureza enzimtica (reacciones colaterales)

Determinacin de glucosa
Test tolerancia a la glucosa Metabolismo de la glucosa Mtodos enzimticos 1. Hexoquinasa acoplada con Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
NADPH Cambio 340 nm Especificidad segundo paso Visible (Ms utilizado) Ms interferencias productos sangre

2. Glucosa oxidasa acoplada con Peroxidasa

3. Glucosa deshidrogenasa

Determinacin de cido rico

Diagnstico de la gota Mtodo qumico y enzimtico

Actualmente slo se utiliza el enzimtico Absorbancia (293 nm) Alantoina; Consumo de O2 Acoplado a peroxidasa (H2O2)

Falta especificidad

Determinacin de urea
Test de la funcin renal: Suero y orina UREA Capacidad de filtracin glomerular NADH

Ureasa

Colesterol

Determinacin de colesterol y trigliceridos

Carbonato amnico. NH4 Acoplado con glutamato DH

Evaluar el riesgo de arterioesclerosis y de infarto de miocardio Mtodo qumico (colorimtrico) No especfico, contaminante

Esteresa Colesterol oxidasa Peroxidasa Absorcin a 500 nm Trigliceridos Seguimiento: Diabetes Mellitus, Nefrosis, obstruccin biliar, etc

Otros metabolitos Creatina

Creatina quinasa, Piruvato quinasa y Lactato deshidrogenasa

Amonio

Glutamato deshidrogenasa

Tiamina difosfato en eritrocitos

Ensayo enzimtico usado para detectar una deficiencia en vitaminas Ensayo diagnostica deficiencia en vitaminas Malnutricin Encefalopata de Wernickes Transquetolasa Sujetos normales: Actividad no cambia al aadir Tiamina Enfermos : Actividad al aadir Tiamina

ENZIMA INMUNOENSAYO
Mtodo indirecto para determinacin de metabolitos, enzimas usadas para amplificar la seal Hormonas, drogas,protenas, etc Anticuerpos son unidos a una enzima: Identifican con un anticuerpo. Fcilmente cuantificables Peroxidasas Fosfatasas. etc

Virus, cocana, anfetaminas opiceos, anfgenos frente a microorganismos patgenos, etc,

3. Terapia enzimtica
Principales reas de trabajo - Eliminacin de sustancias txicas de la sangre - Enfermedades genticas - Cncer

Degradacin de tejidos necrticos usando enzimas proteolticas (Tripsina, quimiotripsina, Bromelaina, Hialuronidasa). Eliminacin de cogulos usando Estreptoquinasa, Uroquinasa, etc. Tratamiento de insuficiencia pancretica (Fibrosis cstica) utilizando proteasas inmovilizadas Forma de administracin Eliminacin de metabolitos (sangre) Endgena: Estreptoquinasa Exgena: Ureasa Bilirrubina oxidasa Posibilidad de usar enzimas inmovilizadas

Tratamiento de Enfermedades genticas Enfermedades metablicas. Deficiencias enzimticas Enfermedad de Gauchers Glucosilceramidasa Acumula un glucocerebrosido en los macrfagos Macrofagos no funcionales Anormalidades hepticas, seas, y hematolgicas. Tratamiento enzima de placentas humanas Alto coste Enzimas recombinantes Pancreatitis Extros pancreticos (lipasas, proteasas, amilasas, etc) Microencapsulados pH 6 liberan Fibrosis cstica Defecto gentico protena transmembrana (1/2000). Mucosidad espesa , pulmones, estmago, etc Conducto pancreticos bloqueado Igual que pancreatitis Tubos bronquiales Desosiribonucleasa (Mucosidad ADN y mucopolisacaridos). Xeroderma pigmentoso Defecto gentico Individuos muy sensibles a la radiacin UV Defecto mecanismo reparador del ADN Tratamiento enzimas reparadoras del ADN Aplicacin tpica con liposomas

Cncer
Asparraginasa hidroliza la asparragina Leucemia aguda limfoblstica Leucemia aguda granuloctica

Tumores Necesitan asparragina Enzima en plantas, animales y bacterias Ausente del suero de los mamiferos Tratamiento en combinacin con quimioterapia Fuente es humana, microbiolgica genera problemas de rechazo.

Glutaminasa Serina hidratasa Fenilalanino amonio liasa Leucina dehidrogenasa

Experimentacin posibles agentes anticancergenos

Ciertos tipos de cncer no tienen la capacidad de sintetizar aminocidos y los obtienen del suero

Activacin de prodrogas Prodrogas son drogas qumicamente modificadas y permanecen inactivas hasta que son especficamente activadas. Drogas anticancerosas inhiben etapas especficas de vas metablicas Metrotrexato anlogo estructural del cido flico dihidrofolato reductasa No se produce tetrahidrofolato Sntesis ADN EVITAR TOXICIDAD EN CELULAS NO CANCEROSAS Terapia enzimtica prodroga dirigida por anticuerpos ADEPT

Terapia enzimtica prodroga gentica dirigida GDEPT La enzima usada para activar la prodroga es dirigida hacia el tumor en la forma de un gen unido a un vector

4. DETECCIN Y SIGNIFICADO DE DEFICIENCIAS ENZIMTICAS Deficiencias enzimticas debido a problemas genticos Ms de 400 deficiencias

Identificacin de un metabolito Ej. Fenilcetonuria Fenilpiruvato Biopsia del tejido y medida de la actividad Pruebas en el ADN

FENILCETONURIA
Dficit de la Fenilalanina 4-mono-oxigenasa

Retraso mental

Prevencin dieta

Deteccin precoz es muy importante

INHIBIDORES ENZIMTICOS (FRMACOS) Inhibicin de la hidroximetilglutaril CoA reductasa Hipercolesterolemia familiar Niveles de colesterol en sangre

Inhibicin de la xantina oxidasa Gota Xantina Niveles de cido rico cido rico Metabolismo de las Purinas

Alopurinol Aloxantina SUSTRATO SUICIDA Inhibidor muy fuerte de la X. Oxidasa

Inhibidores antiretrovirales
nhibidores de la proteasa.

Enfermedad: HIV-1 causante del SIDA.

Enzima proteasa cataliza la ruptura de la poliprotena que encpsula el virus.
Necesarios para completar su proceso de replicacin dando lugar a nuevos virus

Dimero de 99 aminoacidos

Hidrlisis cido-base: Aspartico proteasa

Centro activo en el centro de la molcula

Inhibidores anlogos del substrato Cambio en el enlace peptdico por un isoester

Conclusiones
Medida de actividades enzimtica en diagnstico clnico Enzimas estimacin de metabolitos Equipamiento ms sofisticado gran automatizacin Variedad de enzimas puras: Tecnologa de ADN Procesos tecnolgicos: Inmovilizacin, Radioinmunoensayo, Inmunoensayo, etc Terapia enzimtica Tecnologa de ADN

Estudios estructurales

Diseo de inhibidores