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DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE UNA ENZIMA

DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE UNA ENZIMA

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FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS ESCUELA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

CURSO: BIOTECNOLIGIA DE LOS P.A.I.

TEMA:

DETERMINACIÓN

DE

LOS

PARÁMETROS

CINÉTICOS DE UNA ENZIMA

INTEGRANTES:

  

MEDINA GARCIA, SANDRA ANNA LUCY MINCHOLA GUTIERREZ, ROSMER EDGAR VILLANUEVA CHUNQUE, YONEL GABRIEL

CICLO: IX

TRUJILLO – PERÚ 2011

DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE UNA ENZIMA I. la temperatura 3. pH del medio. Determinar la Vm y Km de la enzima extraída de papaya . la presencia de inhibidores 4. Toda reacción enzimática puede esquematizarse como sigue: La velocidad de una reacción catalizada por un enzima depende de 1. la concentración de moléculas de sustrato [S] 2. La presencia de una enzima se detecta por las reacciones específicas que cataliza. que afecta a la conformación (estructura espacial) de la molécula enzimática II. que son proteínas específicas denominadas enzimas. Las reacciones químicas en los sistemas biológicos sólo ocurren en presencia de catalizadores. OBJETIVOS Conocer los parámetros de la actividad enzimática Observar el comportamiento de una reacción enzimática en un extracto crudo vegetal. INTRODUCCIÓN En los diversos compartimientos celulares transcurre un gran número de reacciones químicas que proporcionan a la célula energía y los componentes necesarios para su mantenimiento.

Una de las transformaciones se obtiene tomando los dobles reciprocos de ambos miembros de la ecuación de MichaelisMenten Ecuación de Lineweaber-Burk Determinación de las constantes de Lineweaber-Burk La representación grafica de este modelo permite identificar la Km y Vmax. y el de abscisas es el valor de -1/Km. MARCO TEORICO Modelo de Lineweaber-Burk La ecuación Michaelis-Menten puede transformarse algebraicamente en otras formas que son mas útiles para la expresión de los datos experimentales. Tal representación doble-recioprica tiene la ventaja de que permite una determinación mucho mas exacta del valor Vmax ya que las representación sencilla de Vo frente a la concentración del sustrato en la curva de Michaelis Menten solo se obtiene por su valor aproximado puesto que es un valor limite a una concentración del sustrato infinita. Figura 1. Representacion de la doble reciproca de la velocidad de reaccion . el punto de corte ciob el eje de ordenadasd es equivalente a la inversa de Vmax.III.

Km es la constante de Michaelis. debido a que asigna el mismo peso a todos los puntos para cualquier rango de concentración del sustrato o de la velocidad de reacción. . Figura 2.Modelo de Eadie-Hofsteen Ota aplicación útil de la ecuación de Michaelis-Menten se obtiene multiplicando ambos miembros de la ecuación Lineweaber-Burl por V y reordenándola se obtiene la ecuación de Eadie-Hofsteen Ecuación de Eadie-Hofsteen Determinación de constantes de Eadie-Hofsteen La representación de Vo frente a Vo/[S] se conoce como la representación de EadieHofsteen.Menten. Representación grafica de la velocidad de reacción y constantes de Vmax y Km de Eadie-Hofsteen. Este diagrama permite visualizar rápidamente los parámetros cinéticos importantes como Km y Vmax a la vez que esta menos afectada por el margen de error que el diagrama de Lineweaver-Burke. Donde Vo representa la velocidad de la reacción.

1 0.4 0.2 y = 1.2 0 0 0. DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN Tabla N°01: Valores de absorbancia y concentración de almidón Componentes Sustrato de almidón Agua deshidratada HCl 0.8 5 2.4 0.2 1 ABS 0.5 2.IV.2 2 1 2 2.4 1.2 0.5 2.884 0.5 0.621 0.1 0.4434x R² = 0.5 0.1 N Solución Yodada Absorbancia mg de Almidón Tubos 3 1.067 0.5 0.1 0.6 B 0 3 2.5 0.6 1.6 0.1 1.1 1.4 4 2 1 2. RESULTADOS 1.8 0.1 0 0 1 0.484 1 Curva de Calibracion 1.5 0.5 0.5 2.5 1.5 0.5 2.8 mg/ml Almidon 1 1.6 0.9919 Figura N°01: Curva de calibración del almidón .295 0.

21892753 0.09976445 0. DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE MICHAELIS MENTEN (Km y Vmáx) Muestra: Papaya Tabla N°02: Valores de Absorbancia.09976445 0.05057503 0.2. residual e hidrolizado TUBO Blanco * Problema1 Problema2 Problema3 Problema4 Problema5 ABS 0 0.09907164 0.143 0.50023555 0.39767216 0.30092836 0.1163919 .8 1 Almidón Almidón residual hidrolizado 0 0 0.316 0.6 0.143 0.58107247 0.574 mg de Almidón 0 0.09907164 0.316 0.4 0.60232784 Tabla N°03: Valores de velocidad y de cantidad de sustrato inicial.1ml) (100ml) 0 0 0.2 0.143 0.8 1 Almidón Almidón USC USC residual hidrolizado (0.05057503 0.0536234 30.073 0.144 0.00747125 7.574 C 0 0.073 0.144 0.0464182 25.03011639 15. TUBO Blanco * Problema1 Problema2 Problema3 Problema4 Problema5 ABS 0 0.2 0.144 0. almidón residual y velocidad.073 0.50023555 0.39767216 0.144 0.574 C 0 0.02905362 0.01504642 0.316 0.6 0.14942497 0.58107247 0.0117777 29.30092836 0.316 0.21892753 0.574 mg de Almidón 0 0.47124844 0.143 0.02501178 0.4 0.14942497 0.60232784 0.073 0.

0653x R² = 0.2 0.2 Figura N°02: Diagrama de velocidad de reacción y constante de Michaelis-Menten Tabla N°04: Valores de los parámetros de Michaelis Menten y valor de R2 Vmax Vmax/2 Km R2 0.04 0.015 0.0208 0.0237x2 + 0.0416 0.6 S 0.005 Vm=0.1) REPRESENTACIÓN DE MICHAELIS MENTEN 0.045 0.01 0.02 0.36 0.36 0 0 0.4 0.03 0.0416 Vmax/2=0.025 V 0.8 1 1.035 0.9838 .9838 Km=0.2.0208 y = -0.

038738165 0.009961665 0. Km y R2 1/V=(Km/Vmáx)x(1/S)+(1/Vmáx) y = 19.614 14.033349037 0.9912 Figura N°03: representación de Lineweaver – Burk Tabla N°06: Valores de Vmáx.84575007 29.2.040155189 [S]inicial (mg.) 0 0.4 0.2 0.81433613 24.25 1 1/V 100.0029985 Km/Vmáx Km 1.90338164 Representación de Lineweaver .051x R² = 0.666666667 1.020061891 0. velocidad y de sus respectivas inversas PAPAYA Veloc.8 1 1/S 5 2.4007 19.6 0.2) REPRESENTACIÓN DE LINEWEAVER – BURK Tabla N°05: Valores de cantidad de sustrato.98587336 25./ml.614x + 1.71392875 1/Vmáx Vmáx 2 0.5 1.Burk 120 100 1/V 80 60 40 20 0 0 2 1/S 4 6 y = 20./min) 0 0.4007 0.3848294 49.9919 R . (mg.

04015519 V 0.) 0 0./ml.4 0.033349037 0.04980832 0. velocidad y de velocidad/sustrato PAPAYA Veloc (mg.2 0.03 0.020061891 0.02 V 0.01 0.01 0 0 0.04842271 0.038738165 0.2.1235 Figura N°04: Representación de de Eadie Hofstee .04 V/S 0.05 0.009961665 0.(1/Km)*V Tabla N°07: Valores de cantidad de sustrato.15x + 0.3) REPRESENTACIÓN DE EADIE HOFSTEE V/S = Vmáx/Km .0531 R² = 0.8 1 V/S 0.02 0.06 0.020061891 0.04 0./min) 0 0.009961665 0.6 0.033349037 0.Hofstee 0.05 Series1 y = -0.040155189 [S]inicial (mg.03 0.040155189 Representación de Eadie .038738165 0.05558173 0.05015473 0.

666666667 Km 2 0.8 1 S/V 20./ml.15x + 0.2 0.2 0.6 0.1235 R 2. Km y R2 V/S= Vmáx/Km .99152402 20.020061891 0.040155189 [S]inicial (mg.0531 0.0531 Vmáx/Km 0.354 Vmáx 6.(1/Km)*V y = -0.6514689 24.4) REPRESENTACIÓN DE LANGMUIR S/V = Km/Vmáx + S*(1/Vmáx) Tabla N°09: Valores de cantidad de sustrato.93830003 17.15 1/Km 0.90338164 S 0.4 0.8 1 ./min) 0 0. velocidad y de sustrato/velocidad PAPAYA Veloc (mg.Tabla N°08: Valores de Vmáx.038738165 0.009961665 0.4 0.07696588 19.033349037 0.) 0 0.6 0.

8 1 1.183 1/Vmáx 0.183x + 17.2 0.603 17.4 0.4137 R .603 R² = 0.6 S 0.Representación de Langmuir 30 25 20 S/V 15 10 5 0 0 0.603 Km/Vmáx 5.4137 Series1 Figura N°05: representación de Langmuir Tabla N°10: Valores de Vmáx.396295582 Km 2 0.183x + 17.192938453 Vmáx 3.2 y = 5. Km y R2 S/v=(Km/Vmáx)+S*(1/Vmáx) y = 5.

4 -0./ml.7 2 3.048 0.04 0.08 0.8 -1 Veloc.12 0.2 0.29 Vmax 0.18 0.0100 0. (mg.5 -0.056 0.2.6 -0./min) 0 0.5 S 2 2.12 0.0333 0.0924 Promedio Km=1.5 1 1.29 Vmax=0.15 1.1 V 0. se obtienen los valores de Km y Vmáx de la siguiente manera: Km 0.15 0.0402 0.0924 .2 -0.) 0 -0.02 0 0.072 0.5 4 Figura N°06: Representación lineal directa -De la figura N°06.0201 0.5 3 3.14 0.166 0.0387 0.06 0.5) REPRESENTACIÓN LINEAL DIRECTA Tabla N°11: Valores de la cantidad de sustrato y velocidad PAPAYA [S]inicial (mg.02 0 -1 -0.16 0.45 0.

9838 0.1235 0.71392875 0. 1998). Este método se recomienda para aquellas enzimas que se conoce que obedecen a una cinética de michaelis menten. Esta metodología hace uso de métodos espectrofotométricos de gran rapidez. Ya que a una baja concentración de almidón. esto demuestra la alta afinidad de la enzima extraída de la papaya.0029985 6. lo que indica la mayor eficacia de esta representación frente a las otras dos. DISCUSIONES -La cinética de las enzimas se estudia usualmente observando las velocidades de reacción para evitar así los problemas relacionados con la inhibición por producto y con cualquier cambio de pH que pueda haber como resultado de la reacción. se vio solo la mitad de la velocidad máxima de la enzima. (Izquierdo.354 2. 2004) -En los métodos utilizados podemos notar como el Km va tomando valores relativamente bajos dependiendo del método de linealizacion realizado. La representación lineal es un método relativamente insensible a las lecturas erróneas individuales que se encuentran lejos de los valores correctos. (Doran.39629558 6. (Atkinson. (Doran.Tabla N°12: Cuadro comparativo de los resultados finales REPRESENTACIÓN MICHAELIS MENTEN LINEWEAVER BURK EADIE HOFSTEE LANGMUIR LINEAL DIRECTA Vmáx 0.4137 - 3. -Los valores de los parámetros biotecnicos obtenidos mediante la representación de langmuir son los más próximos a los de la regresión lineal.98359688 Km 0. 2002) -Un inconveniente de la representación Lineal directa podría dar la dificultad de detectar las desviaciones del comportamiento de michaelis menten.9919 0.10649019 R2 0.82485876 0.36 14. por su sustrato de almidón.0416 0.66666667 3. 1998) .

2002. -Nelson. 2000) 4. Editorial reverte. Eadie Hofstee. Lehninger Principles of Biochemistry. 2000) -Valores bajos de la constante Michaelis-Menten (Km) indican que el complejo ES está unido muy fuertemente y raramente se disocia sin que el sustrato reaccione para dar producto. (2000). Editorial acribia SA. BIBLIOGRAFÍA -Atkinson B.. -Izquierdo Felipe y col. Zaragoza (España). “Principios de Ingeniería de los bioprocesos”.M.). PROBLEMAS RESUELTOS DE CINETICA DE LAS REACCIONES QUIMICAS. a pesar de ello nos sirvió de parámetro la concentración de sustrato conocida como constante de Michaelis-Menten (Km) a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima.L. (Nelson. lo que indica que existe una unión muy fuerte del complejo enzima-sustrato (ES) por el sustrato. (Nelson. . New York . D. 2004. P. Worth Publishers..36).(3 Ed..-En el laboratorio trabajamos con un sustrato la cual a una velocidad máxima no puede ser medido con exactitud. Langmuir y Lineal Directa 5. 1998. Para nuestro caso el valor de Km fue bajo (0.Ediciones de la universidad de Barcelona. Cox. M. REACTORES BIOQUIMICOS. CONCLUSIONES -Se trabajó con los respectivos parámetros que determinan la velocidad enzimática aplicando graficas tales como las de cinética enzimática de Michaelis Menten (Vmax y Km) y se las pudo comparar con los obtenidos por las representaciones Lineweaver – Burk.DORAN.

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