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Bacterias Degradadoras de Petroleo

Bacterias Degradadoras de Petroleo

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Descripcion de las bacterias degradadoras del petroleo usadas en la biorremediacion, limpieza biologica de la contaminacion ppor derrames petroleros. Generalidades sobre el tema y las bacterias a aislar. Desarrollo de la parte practica (su aislamiento).
Descripcion de las bacterias degradadoras del petroleo usadas en la biorremediacion, limpieza biologica de la contaminacion ppor derrames petroleros. Generalidades sobre el tema y las bacterias a aislar. Desarrollo de la parte practica (su aislamiento).

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“Biodegradación de Petróleo Diesel”

Autor: Rómulo Aycachi Inga

Docente: MSc. Carmen Rosa Carreño Farfán

Facultad de Ciencias Biológicas Departamento de Microbiología y Parasitología Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallos

Lambayeque, 04 de abril del 2008.

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I.

Introducción:

La industria petroquímica es importante en una sociedad moderna, no obstante la falta de un programa de protección ambiental, hace que el medio ambiente se contamine al producirse derrames de petróleo, principalmente de crudo, por un deterioro de los oleoductos, descargas de efluentes contaminados, afloramientos naturales a través de fisuras de la corteza terrestre y debido a la producción, transporte y almacenamiento de este recurso natural. A nivel mundial, el volumen de derrame de petróleo es de 1.7 a 8.8 millones de toneladas métricas por año y en nuestra región (Pacífico Sudeste) es de 6000 toneladas métricas al año. En el Perú se registran derrames de petróleo desde 1978, uno de ellos fue el producido en el oleoducto marino de Talara, estando entre los últimos el ocurrido el año 2000 en el río Marañón que afectó la Reserva Pacaya-Samiria y el producido el 30 de enero del 2008 en el que, debido a una explosión producida en un barco carguero, se derramaron frente al mar de Tumbes 1300 barriles de crudo de petróleo. Pero no sólo derrames mayores causan contaminación sino también los constantes derrames accidentales en suelos de nuestra selva, los que se producen por el rompimiento del Oleoducto Nor-Peruano, debido a accidentes naturales y por la actividad extractiva. Los mares del planeta sufren cada año millones de pequeños derrames contaminantes procedentes de barcos, refinerías costeras y plataformas petrolíferas. Un estudio de la Universidad Politécnica de Cataluña advierte de que el impacto ambiental de los pequeños vertidos diarios es mucho mayor que el ocasionado por un gran accidente y han lanzado una seria advertencia sobre el enorme impacto ambiental que provocan los pequeños vertidos de petróleo -desde un litro a unas 80 toneladas- por su excesiva frecuencia. Los dispersantes químicos utilizados para favorecer la remediación de los ambientes contaminados pueden causar un mayor impacto ecológico que el mismo derrame, por su toxicidad y recalcitrancia a la biodegradación. Por tanto, una mejor alternativa de solución es el proceso de biorremediación, que es el tratamiento biológico del suelo, aire y agua, mediante la biodegradación de compuestos tóxicos para transformarlos en compuestos de menor o ningún impacto ambiental. Así en la biodegradación de hidrocarburos, se utilizan bacterias con alta capacidad degradativa, entre estas: Brevibacterium, Spirillum, Xanthomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Nocardia, Flavobacterium, Vibrio, Achromobacter, Acinetobacter, Micrococcus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia rubidae, Bacillus sp., Pseudomonas mendocina, Pseudomonas aureofasciens, etc., las cuales disminuyen la concentración de hidrocarburos presentes en el ambiente y al mismo tiempo son inocuas para la salud y el medio ambiente. Estas bacterias producen bioemulsificantes y biosurfactantes que disminuyen la tensión superficial entre el petróleo y el medio acuoso facilitando el acceso microbiano a la fuente de carbono insoluble para su degradación.

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II.

Generalidades: a. El crudo de petróleo:

El crudo de petróleo se caracteriza por ser un líquido negro, viscoso y con una composición química sumamente compleja, pudiendo contener miles de compuestos, básicamente de la familia de los hidrocarburos. Los hidrocarburos componen la familia predominante de compuestos (un 50-98% de la composición), por lo que constituyen uno de los grupos de contaminantes ambientales más importantes, tanto por su abundancia, como por su persistencia en distintos compartimentos ambientales. Mayoritariamente son alcanos de cadena lineal (n-alcanos o nparafinas), alcanos ramificados (en menor cantidad), cicloalcanos (o naftenos) y cantidades variables de hidrocarburos aromáticos. La composición elemental de un crudo está condicionada por la predominancia de los compuestos tipo hidrocarburo: 84-87% de C, 11-14% de H, de 0-8% de S, y de 0-4% de O y N y metales como el níquel y el vanadio. Los principales componentes se subdividen y purifican en distintas fracciones: i) fracción saturada (nalcanos, alcanos ramificados con cadenas alquílicas y las cicloparafinas), ii) fracción aromática (monoaromáticos, diaromáticos y hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), iii) fracción de resinas y iv) fracción de asfaltenos que son menos abundantes y consisten en compuestos más polares, pudiéndose encontrar hidrocarburos heterocíclicos, hidrocarburos oxigenados y agregados de alto peso molecular .

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b. Refinado del crudo de petróleo: Para comprender la naturaleza química de los diferentes derivados del petróleo que potencialmente pueden ser contaminantes en el medio ambiente, hay que entender el proceso de refinado del crudo utilizado para la obtención de estos productos petrolíferos. El refinado pasa por un proceso de destilación, con la finalidad de eliminar el color y olor, así como también, los compuestos del azufre. Se destila a emperaturas crecientes obteniendo 4 fracciones principales: gasolina, queroseno, destilados medios (querosenos, gasoil, aceites lubricantes) y un residuo. Este residuo se destila al vacío obteniéndose otros aceites lubricantes (más pesados), ceras y parafinas y betumes asfálticos (alquitranes). Durante el proceso de refinado, se eliminan componentes de la fracción asfalténica (altamente recalcitrante) lo que implica que los refinados intermedios (gasoil, fueles, querosenos y también las gasolinas) sean productos relativamente más biodegradables que los coques o alquitranes residuales. Así pues, la composición química de la gasolina es diferente a la del gasoil debido a que se han obtenido como productos de destilación del petróleo a partir de diferentes intérvalos de temperatura (tabla 1.4). La obtención de gasolina es menos directa que la de los fueles y gasóleos, ya que en una primera fase se obtiene por destilación del crudo entre 20-180ºC. Esto implica una composición de n-alcanos más ligera (C6-C11) que los fueles y gasóleos (C10-C25). En la gasolina encontramos como componentes más abundantes: nbutano, isopentano, pentano, mono y dimetilpentanos, hexano, BTEX, mono y dimetil hexanos, trimetilbencenos, metiletilbencenos, y en menor cantidad los naftalenos, sus mono y dimetilados y heptano (de menor índice de octanaje).

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Los fueles ligeros y el gasoil forman parte de la fracción intermedia de destilación en el proceso de refinado, lo que implica un rango de puntos de ebullición entre 185-345ºC, encontrando compuestos de 10 a 25 átomos de carbono, siendo los más abundantes los C15-C17. (fig. 1.2). Su composición es de un 30% en parafinas (nalcanos e isoprenoides), 45% de naftenos (cicloalcanos) y un 25% de aromáticos. En concreto a nivel de compuestos aromáticos encontramos alquilbencenos, y más abundantemente, el naftaleno y sus alquilados. También se ha encontrado, en cantidades menores, el fenantreno y el fluoreno. No contienen pireno ni fluoranteno (compuestos de 4 anillos aromáticos), cuyos puntos de ebullición son más elevados que el intervalo utilizado en la destilación de fracciones intermedias.

c. Biorredediación del petróleo Diesel usando diversos microorganismos: La biorremediación es la adición de materiales a ambientes contaminados para producir una aceleración del proceso natural de biodegradación1.

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Biodegradación: se refiere al proceso natural mediante el cual bacterias u otros microorganismos alteran y convierten moléculas orgánicas en otras sustancias, como ácidos grasos y CO2.

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La elevada complejidad de la composición del crudo de petróleo y derivados, implica la existencia de una amplia capacidad enzimática si se quiere conseguir una degradación significativa del crudo. La mayor parte de los estudios realizados se han llevado a cabo con cepas bacterianas individuales o con la combinación de diferentes cepas aisladas. En la mayoría de los casos, son degradadoras de alcanos, debido a que los alcanos son los componentes más abundantes del crudo de petróleo. No obstante en algunos casos, estas cepas tienen la capacidad de oxidar selectivamente las cadenas alquílicas de ciertos HAPs alquilados, compuestos abundantes en el crudo. Recientemente, se han descrito algunas cepas con la capacidad de degradar tanto HAPs de elevado peso molecular como alcanos pero ésta, no parece que sea una norma general. De hecho los degradadores de alcanos citados habitualmente en la bibliografía generalmente no son capaces de romper el anillo aromático de los HAPs, mientras que los degradadores de HAPs generalmente no crecen con alcanos. La alternativa a la utilización de cepas individuales es la obtención y utilización de cultivos mixtos, los cuales pueden ser consorcios definidos y consorcios no definidos. Los consorcios definidos se caracterizan por ser una combinación de cepas aisladas con capacidades degradativas conocidas que son complementarias entre sí. Los consorcios no definidos se caracterizan por ser el resultado de procesos directos de enriquecimiento a partir de muestras ambientales con historia previa de contaminación y por lo tanto no son el resultado de una combinación de cepas previamente aisladas. d. Biosurfactantes Se dice que un soluto es un agente tensoactivo o surfactante cuando da lugar a un descenso significativo de la tensión superficial. El descenso de la tensión facilita la eliminación de las partículas de la suciedad de las superficies sólidas. Son moléculas que contienen un segmento liposoluble (soluble en aceite) y otro hidrosoluble (soluble en agua o disolventes polares). La solubilidad parcial tanto en agua como en aceite permite al surfactante ocupar la interfase. Así pues, reducen la tensión superficial y las tensiones interfaciales entre moléculas individuales en la superficie y la interfase, respectivamente. Tienen propiedades emulsionantes. Atendiendo a estos criterios un biosurfactante sería una molécula biológica (orgánica) con propiedades surfactantes o tensoactivas producidas sobre superficies vivas, mayormente superficies de células microbianas, o excretados al medio extracelular. Con excepción del poder bactericida de ciertos surfactantes, fenómeno del cual no hay una explicación absolutamente segura, se puede decir que todas las propiedades y usos de los surfactantes provienen de dos propiedades fundamentales de estas sustancias: su capacidad de adsorberse a las interfases y de otra parte su tendencia a asociarse para formar estructuras organizadas.

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Clasificación de los biosurfactantes Los surfactantes microbianos son moléculas complejas que cubren un amplio rango de estructuras químicas incluyendo péptidos, ácidos grasos, fosfolípidos, glicolípidos, antibióticos, lipopéptidos, etc. Los microorganismos también producen en algunos casos, surfactantes que son combinaciones de muchas estructuras químicas como los surfactantes microbianos poliméricos. Muchos surfactantes microbianos han sido purificados y sus estructuras químicas son conocidas. Mientras que los de alto peso molecular son generalmente heteropolisacáridos polianiónicos que contienen tanto polisacáridos como proteínas, los de bajo peso molecular suelen ser glicolípidos. Podemos clasificar los biosurfactantes atendiendo a tres criterios: naturaleza química, peso molecular y carga iónica de la parte superficialmente activa de la molécula. 1. Naturaleza química a) Lípidos b) Hidrtos de carbono c) Aminoácidos 2. Peso molecular a) Bajo peso molecular: Suelen ser glicolípidos. El más estudiado es el rhamnolípido, producido por diversas especies como Pseudomonas. La función principal de estos biosurfactantes es reducir la tensión superficial entre fases (agua-roca por ejemplo). b) Alto peso molecular: Suelen ser polisacáridos, proteínas, lipoproteínas, lipopolisacáridos o mezclas de estos polímeros. Estos biosurfactantes no son tan eficaces en cuanto a la reducción de la tensión superficial entre fases, pero si son bueno emulsionantes. Además se ha demostrado que son muy eficaces a bajas concentraciones y poseen una considerable afinidad por el sustrato. Un ejemplo sería Alasan producido por Acinetobacter radioresistens. d) Glucolípidos e) Lipopéptidos

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3. Carga iónica a) Agentes aniónicos: Contiene generalmente uno de cuatro grupos polares solublescarboxilato, sulfonato, sulfato o fosfato- combinado con una cadena hidrocarbonada hidrófoba. Si esa cadena es corta son muy hidrosolubles y en el caso contrario tendrán baja hidrosolubilidad y actuaran en sistemas no acuosos como aceites lubricantes. Se usan principalmente en la industria de jabones y detergentes. b) Agentes catiónicos: Están compuestos por una molécula lipofílica y otra hidrofílica, consistente de uno o varios grupos amonio terciarios o cuaternarios. Son utilizados comúnmente en detergentes, agentes limpiadores, líquido de lavaplatos, tratamiento de textiles, como sustancias activas antimicrobianas y en cosmética. c) Agentes no iónicos: No se disocian en iones hidratados en medio acuoso. Las propiedades hidrofílicas son provistas por hidratación de grupos amido, amino, éter o hidroxilo.

d) Otros tipos de surfactantes: La combinación en la misma molécula de un grupo con tendencia aniónica y de un grupo con tendencia catiónica produce un surfactante anfotérico, como por ejemplo los aminoácidos, las betainas o los fosfolípidos. Según el pH del medio una de las dos disociaciones prevalece. Este tipo de surfactante se usa sólo en casos particulares debido a su alto costo. Utilización de los Biosurfactantes Los contaminantes hidrofóbicos presentes en los hidrocarburos del petróleo, suelos y aguas del medio ambiente requieren su solubilización antes de ser degradados por la célula microbiana. La mineralización está gobernada por la desorción de los hidrocarburos del suelo. Los surfactantes pueden aumentar el área de los materiales hidrofóbicos, como pesticidas en suelos y agua del medio, aumentándose así su solubilidad en agua. Por tanto, la presencia de biosurfactantes puede aumentar la degradación microbiana de los contaminantes. Se le ha dado una atención considerable a la producción de moléculas tensoactivas de origen biológico por sus aplicaciones en el procesado de alimentos, aromatización de bebidas alcohólicas, reciclaje de papel, fabricación de pulpa de papel,

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en farmacología, y la industria del aceite. En relación a esa última aplicación, los accidentes que llevan a vertidos de aceite han llegado a ser numerosos y han causado catástrofes tanto sociales como ecológicas. La habilidad de los biosurfactantes para emulsionar hidrocarburos mezclados con agua ha sido ampliamente divulgada. Estas propiedades emulsionantes también se ha demostrado que favorecen la degradación de los hidrocarburos en el medio ambiente, por tanto los hacen muy útiles para el control de la contaminación por vertidos de aceites. En la biorremediación en vertidos de petróleo, estudios recientes han mostrado que se puede utilizar el poder solubilizante de las micelas para extraer ciertas sustancias contaminantes aún cuando su concentración sea extremadamente baja.

Las funciones que harían estos biosurfactantes a la hora de aumentar la biodisponibilidad serían: - Dispersar el petróleo aumentando la superficie de contacto. - Aumenta la biodisponibilidad de compuestos hidrofóbicos. Serían en este caso sobre todo los de bajo peso molecular. - Poseen también funciones evolutivas para los propios microorganismos. Pueden ayudar a los microorganismos productores a desprenderse de las gotas de petróleo una vez se ha agotado la fuente de hidrocarburo que utilizaba. Hay que tener en cuenta que un microorganismos suele utilizar un solo tipo de hidrocarburo entre la mezcla que existe. Por eso les sería útil poderse desprender de estas interacciones hidrofóbicas que mantiene la membrana con la gota de petróleo, para así ir en busca de nuevas fuentes de carbono. Además deja una microcápsula alrededor de la gota para marcarla como usada, favoreciendo así a toda la población. Una propiedad de los biosurfactantes curiosa es su actividad bactericida. Dicha actividad se debe a su capacidad detergente.

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Surfactantes Microbianos El interés por los surfactantes microbianos ha estado en aumento en los últimos años debido a sus diversas características deseables tales como una efectiva selectividad, respetuosos para la naturaleza, su estabilidad a elevadas temperaturas, a pH y concentración de sales. Hay que añadir que los biosurfactantes han aumentado la versatilidad en comparación a muchos surfactantes sintéticos y tienen la ventaja de poder producirse por fermentación. Hay células microbianas intactas con una superficie celular altamente hidrofóbica que son ellas mismas surfactantes. En algunos casos, los propios surfactantes juegan un papel natural en el crecimiento de las células microbianas sobre sustratos insolubles en agua. Los surfactantes extracelulares están implicados en la adhesión celular, emulsión, dispersión, floculación, agregación celular y fenómenos de desorción. Aunque el tipo y cantidad de surfactante microbiana producido depende primeramente del organismo productor, factores como el carbono y el nitrógeno, elementos traza, temperatura, y aireación, también afectan a su producción por el organismo. Existen varios biosurfactantes producidos por bacterias, entre ellos tenemos:

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Algunos ejemplos de bacterias y la producción de biosurfactantes: 1. Bacillus pumilus (estirpe 28-11) produce biosurfactantes con una gran capacidad de emulsionar y eliminar compuestos hidrocarbonatos. Esto hace que se considere esta estirpe como prometedora en el campo de la tecnología medio ambiental. 2. Candida ishiwade (Tailandia) es una levadura termotolerante que produce monoacilgliceroles y glicolípidos. 3. Pseudomonas sp. Pueden reducir la tensión superficial, estabilizar emulsiones, y promover la formación de espumas y generalmente son no tóxicos, no peligrosos y

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biodegradables. Debido a su diversidad, inocuidad para el medio ambiente, posibilidad de producción a gran escala, selectividad, efectividad bajo condiciones extremas en pequeñas cantidades, producción sobre recursos renovables, y sus aplicaciones potenciales para la protección del medio ambiente, los biosurfactantes han ganado importancia frente a los surfactantes químicos. Hay que añadir el valor del carbohidrato presente, la ramnosa de los ramnolípidos biosurfactantes, es usada para el transporte de drogas insolubles en humanos y actúa como precursor de componentes de saborizantes de alta calidad. Los biosurfactantes potencian la emulsión de hidrocarburos y por eso tienen el poder de solubilizar contaminantes hidrocarbonados y aumentar su disponibilidad para la degradación microbiológica. Así los microorganismos productores de biosurfactantes pueden jugar un importante papel en la biorremediación acelerada de lugares contaminados con hidrocarburos. Debido al alto costo de los procesos de remediación y otras aplicaciones potenciales, la necesidad de aumentar la producción de biosurfactantes es determinada por la genética del microorganismo, otros factores tales como las condiciones ambientales y la naturaleza del sustrato también influyen en el nivel de expresión. Así, la optimización de esas condiciones puede llevar a una producción elevada y segura de biosurfactantes. Existen estudios para el desarrollo de métodos económicos para aumentar la producción usando materias primas de bajo costo. 4. Pseudomonas aeruginosa LBI es un ejemplo claro de estructura química, propiedades superficiales y actividad biológica en la producción de biosurfactantes. La naturaleza química de los biosurfactantes producidos sería en este caso ramnolípidica, cuya estructura de ramnosa contiene propiedades biosurfactantes. 5. Pseudomona putida PCL1445 produce biosurfactantes interesantes a nivel industrial. En este caso se caracterizo dos lipopéptidos con actividad biosurfactante: putisolvin I y putisolvin II; los cuales inhiben la formación de biopelículas o provoca la destrucción de las mismas. Esta estirpe PCL1445 fue aislada de la raíz de una planta, crecida en una zona contaminada con PAHs (hidrocarburos aromáticos policíclicos). Se vió que la estirpe PCL1445 produce actividad biosurfactante hasta el final de la fase de crecimiento. Teniendo en cuenta el uso potencial de los tensioactivos en las tecnologías de biorremediación, la utilización de los biotensioactivos parece tener más potencial que los tensioactivos de síntesis (químicos), debido a la mayor diversidad estructural, biodegradabilidad y biocompatibilidad de los biotensioactivos. Los biotensioactivos más estudiados han sido los emulsanos de Acinetobacter sp. y el grupo de ramnolípidos producidos por Pseudomonas aeruginosa. e. Ventajas y limitaciones de los procesos de biorremediación de suelos contaminados. Entre las distintas tecnologías disponibles para la descontaminación de un suelo, es importante diferenciar aquéllas que suponen una solución temporal o el posible traslado del contaminante a otros compartimentos ambientales de aquéllas que potencialmente pueden transformar los contaminantes en productos inocuos. La tecnología de la biorremediación, basada en la utilización de los microorganismos y su

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potencial metabólico biodegradador para eliminar o transformar los contaminantes del medio en productos inocuos, tiene ciertas ventajas respecto a los métodos fisicoquímicos (excavación, extracción química y incineración) tanto por su menor coste económico, como por la no afectación de otros compartimentos ambientales y la optimización de los recursos. Los costes de las técnicas biológicas (bioventing, biopila, landfarming y plantas de tratamiento biológico) son mucho más rentables económicamente que las técnicas fisicoquímicas. Una consecuencia de ello es que en Alemania, por ejemplo, en 1998, aproximadamente de las 2,2 MTm de suelo que fueron tratadas en las 109 plantas de tratamiento que dispone, un 60% fueron tratadas de forma biológica. Si tenemos en consideración que cada planta de tratamiento de suelos, tiene una capacidad de 4 x 10 5 Tm x año-1, se podría llegar a tratar una cantidad de suelo 10 veces superior que la procesada en 1998. Una de las limitaciones que presentan las técnicas biológicas respecto a las técnicas fisicoquímicas es el tiempo necesario para alcanzar una biodegradación aceptable según las normativas. Durante un proceso de biorremediación se produce una ralentización del proceso de biodegradación ya sea por un enriquecimiento de componentes más recalcitrantes o por una disminución de la biodisponibilidad de los contaminantes. Sin embargo, las técnicas fisicoquímicas, aún pudiendo ser más rápidas y efectivas en la disminución de la concentración de contaminantes, alteran o eliminan por completo la microbiota autóctona del suelo, modifican las características fisicoquímicas del suelo, y además, no eliminan los contaminantes, si no que los trasladan a otro compartimento ambiental. Por lo tanto no cumplen con los criterios de sostenibilidad en los que se debería basar la ley de protección de suelos. Factores que condicionan la biorremediación de un suelo. La biodegradabilidad de una mezcla de hidrocarburos presente en un suelo contaminado depende de diversos factores como son: la presencia de una población microbiana degradadora potencialmente activa, la estructura molecular del contaminante, su concentración y biodisponibilidad, y factores ambientales como el pH, temperatura, humedad del suelo, presencia de aceptores de electrones disponibles, y la existencia de nutrientes inorgánicos (fuente de N y P) disponibles. El pH, temperatura y la humedad Cada cepa microbiana tiene un determinado rango de tolerancia a factores ambientales como son: la temperatura, el pH y la salinidad, los cuales pueden afectar al crecimiento y actividad de las poblaciones microbianas. En consecuencia, cuanto mayor sea la diversidad de microorganismos existentes, potencialmente mayor será el rango de tolerancia. No existen unas condiciones preestablecidas que sean óptimas en todos los casos, pero en términos generales a pH y temperaturas extremas y en suelos salinos la biodegradación se ralentiza, siendo los rangos óptimos para la biodegradación: pH entre 6- 8 y temperaturas entre 20-30ºC. La variación del pH del suelo afecta a la actividad microbiana y también a la solubilización y adsorción/absorción de los contaminantes y de los iones. Las formas catiónicas (NH4+, Mg2+, Ca2+) son más solubles a pH ácido mientras que las formas aniónicas (NO3-, NO2-, PO43 Cl-) son más solubles a pH alcalino. En general, el pH óptimo para las bacterias heterótrofas es neutro (pH 6-8), mientras que es más ácido
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para los hongos (pH 4-5). El pH óptimo establecido para procesos de biodegradación es neutro (pH 7,4-7,8). La temperatura es uno de los factores ambientales más importantes que afecta la actividad metabólica de los microorganismos y la tasa de biodegradación. La mayor parte de estudios realizados indican que las condiciones mesofílicas (20-30ºC) son las óptimas para la biorremediación de suelos contaminados. No obstante, también se ha descrito biodegradación de hidrocarburos temperaturas extremas: a 10ºC en suelos subárticos y subalpinos, 5ºC en suelos árticos y hasta 60ºC por una cepa termófila de Bacillus stearothermophilus aislada de un suelo contaminado con crudo de petróleo del desierto kuwaití. La humedad del suelo puede limitar de forma severa la biodegradación, fundamentalmente en suelos superficiales afectados por oscilaciones importantes en el contenido de agua. No obstante el nivel óptimo de humedad depende de las propiedades de cada suelo, el tipo de contaminación y si la biodegradación es aeróbica o anaeróbica. Un déficit de agua puede disminuir el transporte de nutrientes y de contaminantes, así como también la migración bacteriana a través del suelo. El exceso de agua en un suelo desplaza el aire residente en los poros del suelo, generándose con mayor facilidad condiciones anaeróbicas, al agotarse el oxígeno disuelto en agua. Estructura química De las distintas familias de hidrocarburos del petróleo, los n-alcanos y los alcanos ramificados (isoprenoides) de cadena intermedia (C10-C20) son los sustratos más fácilmente degradables por los microorganismos del suelo, y que por lo tanto tienden a ser eficazmente biodegradados. Sin embargo, los alcanos de cadena larga (>C20) son más difíciles de degradar debido a su (elevado peso molecular) y su baja solubilidad en agua. Los cicloalcanos, por norma general, se degradan más lentamente que los nalcanos y alcanos ramificados. Asimismo, los HAPs que contienen de 2 a 3 anillos aromáticos pueden ser biodegradados eficazmente en el suelo en condiciones ambientales óptimas, mientras que los HAP de 4 anillos, y especialmente, los de 5 o más anillos bencénicos presentan una mayor recalcitrancia inherente y una baja solubilidad. Las fracciones de resinas y asfaltenos son las que presentan una menor degradabilidad debido a las complejas estructuras químicas y al elevado peso molecular de sus moléculas. Biodisponibilidad La tasa de degradación depende tanto de la capacidad de transporte y del metabolismo microbiano, como de la transferencia de masas del compuesto. La relación entre estos factores se conoce como biodisponibilidad. En los suelos uno de los factores limitantes para la biodegradación es la transferencia de masas, ya que los microorganismos de los suelos contaminados, suelen tener amplias capacidades biodegradativas al estar expuestos a una gran variedad de compuestos orgánicos diferentes. Por lo tanto la adsorción, la absorción, desadsorción, disolución y la difusión son fenomenos, propios de la transferencia de masas, que condicionan la biodisponibilidad de los contaminantes. Un fenómeno que afecta de forma negativa a la biodisponibilidad de los contaminantes es el envejecimiento o ageing que se define como la pérdida de la biodegradabilidad de los compuestos a lo largo del tiempo en el suelo (aunque la población microbiana mantenga intacto su potencial catabólico), el cual es más importante en suelos con elevado contenido en materia orgánica. Este efecto

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se produce por una serie de fenómenos como son: la adsorción con la materia particulada del suelo, absorción a la materia orgánica del suelo, a la baja difusividad de los compuestos, principalmente desde los microporos; a la disolución en fases líquidas no acuosas (FLNAs), o a la formación de uniones covalentes con la materia orgánica e inorgánica del suelo. Con la finalidad de aumentar la biodisponibilidad de los contaminantes existen numerosos ejemplos en la bibliografía de la utilización de tensioactivos sintéticos y biotensioactivos en la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos. Presencia de aceptores de electrones La mayor parte de hidrocarburos presentes en los productos petrolíferos son degradados con mayor extensión y rapidez de forma aeróbica (O2 como aceptor final de electrones), ya que en ausencia de O2, y en presencia de aceptores de electrones alternativos (NO3-, SO42-, CO2, Mn4+ y Fe3+) los hidrocarburos pueden ser degradados, pero con unas tasas de biodegradación muy inferiores a las aeróbicas. Nutrientes inorgánicos Las concentraciones de nitrógeno y fósforo asimilables presentes en el suelo, suelen ser limitantes para un incremento y activación de la población microbiana, mientras que otros nutrientes esenciales como el Ca2+, Na+, Fe2+ y SO42- ya están presentes en cantidades suficientes en el suelo. La adición de fuentes de N y P inorgánicas, generalmente tiene un efecto positivo incrementando las poblaciones microbianas y las tasas de biodegradación de hidrocarburos en suelos contaminados. Las proporciones molares de C:N:P, descritas en la bibliografía, respecto al contenido de carbono a degradar son muy distintas. La Agencia de Proteccion Ambiental de USA recomienda utilizar proporciones C:N de 100:10 a 1000:10 para la biodegradación de suelos contaminados por hidrocarburos, y dentro de este intervalo se han descrito proporciones C:N de 600:10, 500:10 y de 100:10:1 a 300:10:1 respecto al Carbono Orgánico Total a degradar. Aunque en general la adición de fuentes inorgánicas de N y P al suelo es beneficiosa para los procesos de biodegradación, existen estudios que han descrito efectos inhibitorios en la adición de nutrientes inorgánicos. Además es importante destacar que la acción de los nutrientes inorgánicos puede estar limitada debido a la interacción química con los minerales del suelo (el amonio se puede unir a las arcillas por intercambio catiónico y el fosfato puede unirse y precipitar con iones calcio, hierro y aluminio). f. Microorganismos reportados como degradadores de Petróleo: Todos los ecosistemas acuáticos y marinos contienen algún tipo de microorganismos degradadores de petróleo, entre los géneros reportados están: Bacterias: o Achrornobacter o Acinetobacter o Actinomyces o Alcaligenes o Arthrobacter o o o o o Bacillus Beneckea Brevebacterium Coryneformes Erwinia 15

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Flavobacterium Klebsiella Lactobacillus Leumthrix Moraxella Nocardia Peptococcus

o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o

Pseudomonas Sarcina Spherotilus Spirillum Streptomyces Vibrio Xanthomyces Oidiodendrum Paecylomyses Phialophora Penicillium Rhodosporidium Rhodotorula Saccharomyces Saccharomycopisis Scopulariopsis Sporobolomyces Torulopsis Trichoderma Trichosporon

Hongos: o Allescheria o Aspergillus o Aureobasidium o Botrytis o Candida o Cephalosporium o Cladosporium o Cunninghamella o Debaromyces o Fusarium o Gonytrichum o Hansenula o Helmintrosporium o Mucor

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También se ha reportado la utilización de dos especies de camarones en la biodegradación del petróleo, siendo estos Peanus duorarum y Peanus aztecuz cuya capacidad de degradar los hidrocarburos casi en su totalidad van desde los compuestos de 12 carbonos hasta los compuestos de 22 carbonos. La cantidad y diversidad de los microorganismos degradadores de petróleo depende de la exposición de las aguas a estos hidrocarburos. La velocidad de degradación de los compuestos presentes en el petróleo es como sigue:

HC saturados > aromáticos ligeros > aromáticos de alto PM > asfaltenos, resinas III. IV. Objetivos: Aislar bacterias degradadoras de de Petróleo Diesel. Cuantificar la actividad degradativa del Petróleo Diesel de cada una de las bacterias aisladas. Materiales y métodos:

 Materiales: o Muestra: 100 g de suelo de servicentro contaminado con Petróleo Diesel. o Medios: Agar Bushnell Hass, Agar Tripticasa Soya, Petróleo Diesel. o Frascos estériles.

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o o o o o o o o o o

Tubos de dilución Tubos medianos Placas de Petri Gradillas Mechero Bunsen Asas bacteriológicas Viales Pipetas Jeringas Biorreactores tipo tanque Bacht Air Lift

 Método: o Enriquecimiento de las muestras de suelo y adaptación de los microorganismos a concentraciones crecientes de petróleo. Diseñar y acondicionar dos biorreactores tipo tanque Bacht Air Lift con flujo descendente de 1 L de capacidad. Pesar 50 g de muestra de suelo previamente tamizada y llevarla hacia un biorreactor conteniendo 100 mL de caldo Bushnell Hass (BH) con 1% de Petróleo Diesel. Incubar a 30 ºC durante 72 h. Tomar 10 mL de la muestra enriquecida y llevarla hacia el segundo biorreactor conteniendo 100 mL de caldo BH con 2% de Petróleo Diesel. Lavar y esterilizar el primer biorreactor. Incubar a 30 ºC durante 72 h. Tomar 10 mL de la muestra enriquecida y llevarla hacia el primer biorreactor conteniendo 100 mL de caldo BH con 4% de Petróleo Diesel. Incubar a 30 ºC durante 72 h. o Aislamiento de las bacterias degradadoras de Petróleo Diesel. A partir de la muestra enriquecida en caldo BH con 4% de Petróleo Diesel (PD) tomar una alícuota y sembrarla mediante la técnica de agotamiento y estría sobre la suèrficie de placas de Petri conteniendo Agar BH con 4% de PD. Incubar a 30 ºC durante 48 h. Seleccionar y repicar las cinco colonias que presenten la mayor biomasa y mayor rapidez en el crecimiento hacia viales conteniendo agar BH con 4% de PD y agar Tripticasa Soya (TSA). Incubar a 30 ºC durante 48 h. Conservar las cepas de bacterias biodegradadoras de PD en refrigeración o Cuantificacion de la actividad degradativa sobre el PD de cada una de las cepas de bacterias aisladas. La actividad degradativa sobre el PD de cada una de las cepas bacterianas aisladas será cuantificada a través del tiempo requerido para la utilización del PD como fuente de carbono y energía y del número de Unidades de Actividad Emulsificante (UAE) de cada una de ellas.

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Preparación del inóculo: o Reactivar cada una de las cepas bacterianas degradadoras del PD en 5 mL de caldo nutritivo a 30 ºC durante 24 h. o Cantrifugar el caldo nutritivo a 3500 RPM durante 15 min; eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento con SSFE por dos veces. o Con el paquete celular obtenido preparar una suspensión de celulas en SSFE y estandarizarla con el tubo Nº 3 del Nefelómetro de McFarland (9x108 celulas/mL). Tiempo requerido para la utilización del PD como fuente de carbono y energía: o De cada inóculo bacteriano previamente estandarizado tomar 1 mL e inocular por triplicado en tubos de prueba de 16 x 150 mm conteniendo 10 mL de caldo BH con 0,2 mL de resarzurina y 0,1 mL de PD (dejar un tubo con medio de cultivo no inoculado como testigo). o Incubar a 30 ºC hasta por 5 días en agitación constante (150 RPM). o Observar diariamente en busca del cambio de coloración del indicador resarzurina (azul a rosado brillante) que será interpretado como positivo para la utilización del PD como fuente de carbono y energía. Cuantificación de las Unidades de Actividad Emulsificante: o De cada inóculo bacteriano previamente estandarizado tomar 1 mL e inocular por triplicado con tubos de prueba de 16 x 150 mm conteniendo 10 mL de caldo extracto de levadura más 0,2 mL de etanol. Dejar un tubo con medio de cultivo no inoculado como testigo. o Incubar a 30 ºC durante 3 días en agitación constante (150 RPM). o Diariamente observar en busca de la información de burbujas y turbidez del medio de cultivo. o Centrifugar el contenido de cada uno de los tubos, a 2000 RPM durante 30 min. o Tomar 1 mL de cada uno de los sobrenadantes y colocarlos en tubos de prueba conteniendo 9 mL de caldo levadura etanol más de 0,2 de PD. Tapar herméticamente los tubos y agitarlos durante un min. Hasta lograr la emulsión. o Calibrar a cero el espectrofotómetro con tubo “blanco” conteniendo caldo extracto de levadura con etanol no inoculado (testigo) y leer la absorvancia de cada una de las muestras a 540 nm. o Realizar la conversión de la absorvancia de cada una de las muestras a UAE considerando 0.816 de absorvancia como una Unidad de Actividad Emulsificante por mL (1 UAE/mL). Resultados: Tiempo requerido para la utilización del PD como fuente de carbono y energía:
CEPA DÍAS DE VIRAJE COLOR DE VIRAJE pH

-

-

V. -

Cepa 01 Cepa 02 Cepa 03

---5 días 12 días

---Violeta Amarillo

---≥ 6.8 ≤ 5.2

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El indicador utilizado en este proceso de cuantificación fue el “púrpura de bromocresol”. Este indicador se caracteriza por virar de acuerdo al pH, siendo amarillo a un pH menor o igual a 5.2 y violeta a un pH mayor o igual a 6.8.

Inóculos al 1º día

Inóculos al 5º día

Inóculos a 15 días Cuantificación de las Unidades de Actividad Emulsificante: CEPA Cepa 01 Cepa 02 Cepa 03 UAE 1.281 1.353 1.561

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Con el tubo blanco se lee la absorvancia a 540 nm. Luego los resultados obtenidos se los divide entre 0.816 (1 UAE = 0.816). Identificación de las cepas aisladas: CEPA 01 Bacilos cortos, espora central no deformante De a dos o en cadenas cortas Positivo Positivo Película, turbidez y sedimento CEPA 02 Bacilos largos, delgados, espora terminal no deformante De a dos Positivo Positivo Película, turbidez y sedimento CEPA 03 Bacilos medianos no esporulados Aislados y de a dos Negativo Positivo Película, turbidez y sedimento

CARACTERISTICAS Morfología Disposición Tinción Gram Catalasa Crecimiento en caldo Reducción de NO3O – F glucosa Rojo de Metilo Voges Proskawer Hidrólisis de almidón Indol Caldo glucosa Caldo maltosa Hidrólisis de gelatina Género VI. Referencias:

+ + + + + Bacillus sp.

+ + + + + Bacillus sp.

+

Pseudomonas sp.

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LU CHAU, T. (2006). Biorremediación. Dpto. de Ingeniería Química. Universidad de Santiago de Compostela. Obtenido el 24 de marzo de 2008 en http://www.usc.es/uscmn/investigacion/documento/PrestigeBiorremediaci%F3n.pdf VIÑAS C., M. Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos: caracterización microbiológica, química y ecotoxicológica. Facultad de Biología. Universidad de Barcelona. Obtenido el 24 de marzo de 2008 en http://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UB/AVAILABLE/TDX-0920105085623//TESIS_MVI%D1AS_CANALS.pdf ALTAMIRANO, M. G. (2005). Aislamiento e identificación de bacterias hidrocarburolíticas provenientes de un suelo sometido a biorremediación. ORTIZ, J. y J. RODRIGUEZ (2007). Biomarcadores y su utilidad en la evaluación de la biodegradación del petróleo. Obtenido el 24 de marzo de 2008 en http://ingenierosdeminas.org/docu/documentos/biomarcadores_petroleo.pdf V. BOTELLO, A. (1974) Utilización y degradación del petróleo crudo por dos especies de camarón: Penaeus duorarum y Peneaus aztecas. Universidad Nacional Autónoma de México. Centro de Ciencias del Mar y Limnología. Obtenido el 24 de marzo del 2008 en http://biblioweb.dgsca.unam.mx/cienciasdelmar/centro/1975-1/articulo11.html

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SULBARAN MORA, Miguel, BAHSAS, Ali, VELASQUEZ, William et al. Caracterización de Biosurfactantes producidos por Pseudomonas Fluorescentes aisladas de emulsiones de petróleo pesado. CIEN, jun. 2005, vol.13, no.2, p.228239. ISSN 1315-2076. PINEDO R., T. (2005) Biosurfactantes. Obtenido el 24 de marzo del 2008 en http://www.personal.us.es/evpolo/pdf/trab_dirig/pinedorevilla_trigochorda.pdf Anexos:

VII.

 Fluxograma de trabajo:

Tamizar

Muestra: 100 g de suelo contaminado con PD A 50g de tamizado
B

100 mL de caldo BH + 1% PD
30 ºC x 72 h

10 mL de la muestra enriquecida A

100 mL de caldo BH + 2% PD 10 mL de la muestra enriquecida A
C
30 ºC x 72 h

100 mL de caldo BH + 4% PD 30 ºC x 72 h

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Sembrar

Agar BH + 4% PD
30 ºC x 48 h

Tomar una alícuota de la muestra enriquecida C Seleccionar y repicar 3 colonias

Repicar

> biomasa, > rapidez de crecimiento
Incubar

Agar BH + 4% de PD + TSA

30 ºC x 48 h

Conservar las cepas en refrigeración  Cuantificación de la actividad degradativa de las cepas aisladas sobre PD. Tiempo requerido para su utilización Reactivar Incubar 30 ºC x 24 h 5 mL caldo nutritivo Centrifugar

3500 rpm x 15 min. 22

Lavar sedimento con SSFE x 2 veces consecutivas

Realizar esto por cada cepa

Eliminar sobrenadante

1 mL Inocular de cada cepa en botellas Preparar suspensión al Tubo Nº 3 del NMF (9x108 cel/mL)

Dejamos un tubo con medio no inoculado como testigo

10 mL caldo BH con 0.2 mL de resarzurina y 0.1 mL de PD

Observar diariamente si cambia de azul a rosado brillante

Incubar a 30 ºC x 5 d. a agitación cte. (150 rpm)

Como se usó púrpura de bromocresol veremos el cambio de color de lila a amarillo

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 Cuantificación de las unidades de actividad emulsificante (UAE). Del inóculo preparado al Tubo Nº 3 del NMF (9x108 cel/mL)

1 mL Inocular en tubos de dilución con 10 mL de caldo Extracto de Levadura + 0.2 mL de etanol Incubar 30 ºC x 3 d. en agitación constante (150 rpm)

Observar y diariamente formación de burbujas y turbidez del medio

Tomar el sobrenadante (1mL)

Centrifugar cada uno de los tubos (2000 rpm) 9 mL caldo levadura etanol + 0.2 mL de PD Agitamos 1 min. hasta lograr una emulsión

Tapamos herméticamente

Leer absorvancia a 540 nm Calibramos a cero el espectrofotómetro con el tubo blanco

Realizar la conversión de la absorvancia de cada una de las muestras a UAE

Considerar 0.816 de 24 absorvancia como 1 UAE/mL

ÍNDICE

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