EXTRACCION DE CEREBROS Día Anterior • Buffer Homogenización o Hepes 20mM, pH 7,4 250 mL 5mL de 1M o NaCl 100 mM 250mL  5mL

de 5M o NaF 50 mM (inhibidor de fosfatasas) 250 mL 12,5 mL de 1M o EDTA 5mM (quelante de Ca/Mg ++) 250 mL -> 2,5 mL de 0,5M o Triton X-100 1% añadir el primero, cortando una punta de P1000 250 mL  2,5 mL PFA 4% (fijador) o Primero PFA al 8% en H2O destilada (para 200 ml  16 g) o Calentar en la placa con agitación. Nunca puede pasar de 60ºC (se carameliza y se quema) o Añadir NaOH 10N (o 1N) (hasta 20 mL) o Cuando se quede transparente se deja enfriar a Tª ambiente. o Filtrar a traves de 0,22µm o Añadir el mismo volumen de 0,2M SORENSEN.

Día 1 •

o

0,2 M SORENSEN (tampon fosfato) o Preparar solución stock de fosfato o 27,59 g/l NaH2PO4 en H2O Preparar solución stock de fosfato disodico o 28,39 g/l Na2HPO4 en H2O 1 parte de Na + 4 partes de Na2  0,2M Sorensen pH7,2-7,3 Tubos Para analisis de protenina: Hc St Cb Cx 0,5 ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml de tampon de homogenizacion 4ºC

Para secciones: Botellitas de centelleo con PFA 4% Tampón de Homogenización: - Añadir inhibidor de proteasas: o 1 pastilla en 2 mL de H2O up 25x - Añadir ortovanadato (inhibidor te P-tyr-fosfatasas) alícuotas 100x - Añadir okadaico una alícuota por muestra (3ml) en exceso (5µ l) ½ cerebro a PFA al 4% (∼ 2 noches a 2ºC) ½ cerebro: - Homogenizar. 10 pases con potter de teflón en hielo - Centrifugar 12000g, 4ºC, 10 min - Sedimento  -70ºC - Sobrenadante  Alícuotas de 100µ L a -70ºC

Con la base una moneda sobre nieve carbonica un borde de cello. cerebro y OCT por encima y alrededor. limpiar cuchilla con EtOH y dejar engrasada. .Dia 3 Cerebros en PFA 4% a 4ºC o 3 lavados PBS 10 Min en balancín o dejar en sacarosa 30 % (60g en 200mL) minimo 2 noches hasta que el cerebro se hunda (crioprotector) Dia 5 o posterior . base OCT. Seccionar en criostato en flotación Guardar secciones en placa de 24 pocillos con glicol a -20ºC Al terminar. Guardar a -20ºC.Montar en OCT. Dia 6 Antes de comenzar colocar cuchilla del criostato y muestras y pinzas para que este todo a -20ºC.

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