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Planes de Muestreo

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Módulo 1.

Muestreo y examen microscópico de los alimentos Cuando se elaboran alimentos o cuando se tiene que controlar su calidad y/o seguridad, los análisis microbiológicos proporcionan información muy valiosa, respecto a: la calidad de las materias primas, las condiciones sanitarias en que se procesó el alimento, y sobre la efectividad del proceso, específicamente de los métodos de conservación. Como químicos sabemos que antes de proceder a un análisis es indispensable: • tener claro el objetivo de un análisis, • identificar los analitos adecuados y las técnicas para determinarlos, y • planear correctamente el tipo y la forma de muestreo y de manejo de las muestras.

Parte A. PLANES DE MUESTREO Y CRITERIO MICROBIOLÓGICO
ICMSF es la Comisión Internacional para la Especificación Microbiológica de los Alimentos (en inglés, International Comssion on Microbiological Specification for Food) y forma parte de la Organización Mundial para la Salud (OMS). Está constituida por representantes de la mayoría de los países en el mundo. ICMSF surgió por la necesidad de regular el comercio internacional de alimentos estableciendo límites microbiológicos, métodos de análisis y de muestreo. Existen diversos métodos de muestreo, pero el de ICMSF está siendo adoptado rápidamente por la industria de alimentos relacionada con el comercio internacional. La calidad de los alimentos Según Adams y Moss (2000), la calidad de los alimentos depende de 3 factores: • Seguridad. Un alimento no debe contener ciertos niveles de microorganismos patógenos o de sus toxinas que causen enfermedades cuando éste se consuma. • Aceptabilidad. Un alimento no debe contener niveles de microorganismos tales que lo conviertan en organolépticamente inaceptable en poco tiempo. • Consistencia. La calidad de los alimentos debe ser consistente, es decir, no mostrar variaciones de lote a lote, tanto desde el punto de vista de seguridad como de aceptabilidad. Para determinar la calidad de un alimento se debe tomar una muestra y suponer que la calidad de esa muestra refleja la del lote del que fue tomado. La validez de esta extrapolación dependerá de la representatividad de las muestras y de la exactitud y precisión del análisis. De ahí la importancia de establecer un plan de muestreo adecuado. 1

que es el número máximo de unidades defectuosas aceptables. • El número y tamaño de muestra que debe ser tomado de un lote de alimento. evaluando la seguridad del alimento.Es necesario entonces contar con un criterio microbiológico para determinar si un alimento es de buena o de mala calidad. Un plan de muestreo está descrito por 2 valores: n. de acuerdo con el alimento y el microorganismo a analizar. deben incluirse los siguientes factores en un criterio microbiológico: • Una descripción del alimento al que aplica el criterio. Una muestra es un grupo de unidades que se sustraen para estimar el carácter de una población. 2002) Un plan de muestreo debe incluir un procedimiento de muestreo y un criterio de decisión. • Una descripción de los microorganismos o toxinas capaces de causar problemas. La unidad de muestra es cada uno de los elementos que constituyen la muestra. 1997). 2 . El riesgo del productor describe la probabilidad de que un lote aceptable sea falsamente rechazado (1 . PLANES DE MUESTREO (ICMSF. mientras que el riesgo del consumidor describe la probabilidad de que un lote malo sea aceptado falsamente (Pa). cada alimento representa diferentes problemas de descomposición y de seguridad. el seguimiento de buenas prácticas de manufactura. • Los límites microbiológicos apropiados.Pa). 2002). ya que al diferir en origen. la vida de anaquel y la utilidad o adecuabilidad de un alimento o ingrediente para cierto propósito (Smoot y Pierson. Un plan de muestreo es más estricto mientras mayor sea el número de unidades analizadas (n) y menor el número máximo de unidades defectuosas a aceptar (c). • Detalles de los métodos analíticos para detectar o cuantificar esos microorganismos o toxinas. En esta curva se grafica la probabilidad de aceptación de un lote contra la calidad real del lote (porcentaje de unidades defectuosas). composición y procesamiento. que es el número de unidades a analizar y c. Mediante el uso de una curva de operación característica (para un par determinado de valores n y c) se puede determinar qué tan discriminante es un plan de muestreo. Según la Comisión Internacional para la Especificación Microbiológica de Alimentos (ICMSF.

• La sustracción de un número grande de unidades pequeñas provee mayor protección que la del mismo peso total de muestra en menos unidades. Esto traerá como consecuencia el aumento en la probabilidad de error. • A menor uniformidad. MÉTODOS DE MUESTREO Existen diferentes tipos de datos: En el caso de los de atributos. • Los análisis microbiológicos son laboriosos y lentos y los alimentos son perecederos. destruido o prohibido para el consumo humano. sino el tamaño de la muestra tomada al azar y los criterios de aceptación y de rechazo. Son aquéllos en los que la muestra se divide en dos clases. ésta deberá ser representativa. para minimizar la probabilidad de aceptar un lote que debería ser rechazado. después de analizar las unidades: ⇒ Las unidades con las que se obtengan valores entre 0 y m se consideran aceptables. se le llama a esta sección el marco y los resultados y conclusiones aplicarán solamente a éste. Por estas razones existen presiones políticas o administrativas para reducir el muestreo. Los de medida pueden ser convertidos en los del tipo atributo estableciendo un valor límite. será necesario sustraer un mayor número de muestras. • Al aumentar el riesgo debe aumentar el número y el tamaño de las unidades. • Cuando no es posible tomar una muestra al azar de todo un cargamento. En los de medida la variable es continua. • Lo relevante no es la sustracción de una fracción del lote. las decisiones se basan en la presencia o ausencia de algún microorganismo o en el resultado positivo o negativo de una prueba. ser reprocesado. Planes de 2 clases (Figura 1). Para lograr lo anterior se sugiere realizar un muestreo al azar o un muestreo estratificado. Se consideran los siguientes principios fundamentales: • n se refiere al número de unidades que se sustraen de manera separada e independiente. ⇒ Las unidades con las que se obtengan valores mayores de m se consideran defectuosas. Para asegurar que la condición de la muestra tomada sea lo más similar a la del lote del que se sustrajo. sino sólo de una sección accesible. 3 . en el caso que se esperen diferencias en la calidad del lote. • El tamaño de la muestra es crítico en situaciones de análisis de presencia o ausencia. como una concentración o un número.Un lote rechazado deberá regresarse al productor. • La muestra real consiste de aquéllas unidades que se examinan.

si existe una tendencia de aumento en el número de unidades marginalmente aceptables. Son aquéllos en los que la muestra se divide en tres clases. ⇒ Las unidades con las que se obtengan valores mayores de M defectuosas. después unidades: ⇒ Las unidades con las que se obtengan valores entre 0 y m aceptables. y se pueden aceptar. m es un valor crítico arriba del cual la unidad analizada se considera defectuosa. 4 . Planes de 3 clases (Figura 2). sin causar problemas. algunas unidades pueden resultar en el rango marginalmente aceptable. debidos a causas desconocidas. Las ventajas del uso de los planes de tres clases son: • De acuerdo con la experiencia práctica. • Se afectan menos por cambios en la distribución de microorganismos dentro de un lote. de analizar las se consideran se consideran se consideran En ambos casos la probabilidad de aceptación dependerá de los valores n y c seleccionados. ⇒ Las unidades con las que se obtengan valores entre m y M marginalmente aceptables.Se pudo haber realizado una prueba para determinar la presencia o ausencia de un microorganismo o una para determinar una cuenta microbiana o la concentración de una toxina. aún observando buenas prácticas de manufactura. • Permiten advertir aumentos en los riesgos.

PLAN DE MUESTREO DE DOS CLASES n = número de unidades a analizar c = número máximo de unidades defectuosas que se pueden aceptar m = Cantidad que distingue aceptables de defectuosas m Aceptables Defectuosas Figura 1 Planes de muestreo de dos clases. PLANES DE 3 CLASES Resultados cuantitativos Concentraciones m M Aceptables Marginalmente aceptables Defectuosas 5 .

Medición del microorganismo por: Pruebas de presencia o ausencia concentración ↓ Plan de dos clases ↓ Es posible aceptar la presencia de este microorganismo en el alimento? ↓ ↓ NO SI c=0 c≥0 ↓ ↓ Seleccionar Seleccionar n nyc Figura 3 Selección del tipo de plan de muestreo. El efecto de n y c en la rigurosidad del plan de muestreo En la Figura 5 se presentan las curvas de operación para diversos valores de n y c. Se presentan 4 figuras con curvas para diferentes valores de n (5. Entonces cuando el lote no contiene ninguna unidad defectuosa la probabilidad de aceptación es de 95% y cuando contiene 45% de unidades defectuosas. la probabilidad de rechazo sería de 95%. la Pa disminuye cuando n aumenta y cuando el valor c disminuye. Como se puede observar. 10.Figura 2 Planes de muestreo de 3 clases. con el plan establecido.15 y 20) y en cada figura se presentan curvas de operación para diferentes valores de c. Se presenta en la Figura 4 la curva de operación para el plan de muestreo n = 5 c = 0. con valores entre 0 y 1 y el porcentaje real de unidades defectuosas del lote (considerando que se hubieran analizado cada una de las unidades del lote). En la Figura 3 se presenta un diagrama de flujo sugerido por el ICMSF (2002) para la selección del tipo de plan de muestreo. Pruebas ↓ Plan de tres clases ↓ Seleccionar n y c de 6 . Curvas de operación Una curva de operación (Figura 4) es la que se obtiene al graficar la probabilidad de aceptación. o sea que para considerar que la calidad del lote es buena analizarse 5 unidades del lote y no se acepta ninguna unidad defectuosa.

c=0. 2002). diseñar planes de muestreo tan estrictos como se requiera. modificando los valores de n y c. (ICMSF. 7 . Figura 4 Curva de operación característica para el plan de muestreo n=5.Es posible entonces.

2002). La seriedad del tipo de riesgo según el microorganismo a analizar. su frecuencia. que produce una toxina fatal. o como Clostridium botulinum. Los factores a considerar en el tipo de riesgo son: • Médicos y epidemiológicos. • Etiológicos. que incluyen la severidad clínica de la enfermedad producida. la infectividad del microorganismo. que sobreviven y se multiplican en el hombre. amenazan su vida y presentan dosis infectivas pequeñas. como la asociación inherente con riesgos severos. Shigella dysenteriae. Las condiciones a las que se expondrá el lote del alimento. 8 . Entamoeba histolytica. Tipo de riesgo. El plan de muestreo deberá ser más estricto mientras mayor sea el riesgo que implique el tipo de microorganismo a analizar. duración. Vibrio cholerae. 2.Figura 5 Efecto de los valores n y c en la rigurosidad del plan de muestreo (ICMSF. dañan su salud. la posibilidad de ocurrencia del estado portador y la extensión potencial. Taenia solium y Taenia saginata. SELECCIÓN DEL PLAN DE MUESTREO Para seleccionar un plan de muestreo adecuado es necesario considerar: 1. como ocurre en el caso de Salmonella typhi.

Son diseminados por alimentos específicos. La enfermedad resulta de inóculos relativamente pequeños. la paratifoidea. Se incluye aquí a los grupos microbianos responsables de la descomposición de alimentos. • Factores epidemiológicos. Se clasifica entonces a los microorganismos o grupos de microorganismos de acuerdo al tipo de riesgo que representan en: Sin riesgo a la salud. las costumbres dietéticas y de la preparación de los alimentos.• Factores clínicos. Riesgo severo. los estándares de higiene. Efecto de las condiciones a las que se expondrá el alimento. Riesgo moderado de extensión amplia. la brucelosis y la vulnerabilidad de niños. la asociación entre ciertos tipos de patógenos con ciertos alimentos. que indican (de manera indirecta) la posible presencia de microorganismos patógenos. Riesgo moderado de extensión moderada. Incluye microorganismos que presentan riesgos epidemiológicos severos. ancianos y enfermos. para un adulto. En la Tabla 1 se presenta una clasificación de microorganismos y parásitos de acuerdo con los criterios anteriores. los coliformes totales y fecales. Riesgo indirecto. Se debe mencionar que ésta no es una clasificación rígida. los enterococos y Staphylococcus aureus. pero que como grupo de microorganismos no se considera que causen daño a la salud. pero pueden introducirse al alimento por contaminación ambiental o cruzada. Se considera a los microorganismos indicadores. las costumbres locales. su vida de anaquel. que disminuyen su aceptabilidad. la convalescencia larga de enfermedades como la fiebre tifoidea. un bebé o un enfermo puede ser un riesgo severo. existen condiciones que pueden provocar: 9 . Se deberán tomar en cuenta las altas tasas de mortalidad ocasionadas por enfermedades como la disentería y el botulismo. las secuelas severas de la acción de Streptococcus beta-hemolítico. Dependiendo de la naturaleza del microorganismo y de la del alimento. La propensidad de ciertos tipos de microorganismos patógenos de encontrarse distribuidos ampliamente en el reino animal. Los microorganismos incluidos en este grupo presentan riesgos severos a la salud. como los microorganismos mesófilos aerobios. ya que se debe tomar en cuenta que lo que para un adulto normal representa un riesgo moderado. Son microorganismos ubicuos en la naturaleza y la enfermedad que producen está relacionada con números grandes del patógeno.

• El riesgo no se modifica. Puede tener un valor de cero o de ausencia de cierto microorganismo. Determinación de los valores m y M. El valor M es un nivel de contaminación riesgoso. B. El valor m se define como el nivel de microorganismos aceptable y obtenible con buenas prácticas de manufactura.• Aumento del riesgo. Combinando estos dos aspectos. cuando se sabe que se aplicará al alimento un procesamiento térmico. 1997). así como un plan de muestreo para cada uno (Tabla 2). Éste puede ocurrir por recontaminación después del procesamiento. uso de tal manera que permita la multiplicación de microorganismos. cuando la cocción no ocurre inmediatamente antes del consumo. Tabla 1 Agrupación de microorganismos y de parásitos de acuerdo al tipo de severidad del riesgo (Smoot y Pierson. o un valor numérico. o el nivel de detectabilidad de una prueba. Microorganismos que presentan un riesgo a la salud: los niveles de microorganismos (o concentración de toxinas) que producen enfermedades. Tipo de riesgo Riesgo severo Organismo Clostridium botulinum tipos A. E y F Shigella dysenteriae Salmonella typhi serotipos paratyphi A y B Escherichia coli enterohemorrágica virus de la hepatitis A y E Brucella abortus. provocado por malas prácticas higiénicas. Microorganismos de descomposición: serán los niveles de microorganismos que producen una descomposición detectable (olor o sabor) o una vida de anaquel inaceptablemente corta. el ICMSF propone que se consideren 15 casos. Brucella suis Vibrio cholerae 01 Vibrio vulnificus Taenia solium 10 . Indicadores de sanidad: niveles que indican una condición de sanidad inaceptable. Por ejemplo. • Disminución del riesgo.

otras cepas enterovirulentas de E. coli Streptococcus pyogenes Rotavirus Virus del grupo Norwalk Entamoeba histolytica Diphyllobotrium latum Ascaris lumbricoides Criptosporidium parvum Riesgo moderado de extensión limitada Bacillus cereus Campylobacter jejuni Clostridium perfringens Staphylococcus aureus Vibrio cholerae no 01 Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica Giardia lamblia Taenia saginata 11 .Riesgo moderado de potencialmente amplia extensión Listeria monocytogenes Salmonella spp. Shigella spp.

(2001). directo. extensión limitada Moderado. c = 2 n = 5.P. 12 . Montville T. Gran Bretaña. Fundamentals and Frontiers. c = 1 Caso 7 Caso 8 Caso 9 3 clases 3 clases 3 clases n = 5. E. Beuchat L. Condiciones en las que se espera que el alimento sea manejado y consumido después del muestreo Condiciones que Condiciones que Condiciones que reducen el riesgo no modifican el incrementan el riesgo riesgo Vida de anaquel Sin cambio Vida de anaquel aumenta disminuye Caso 1 Caso 2 Caso 3 3 clases 3 clases 3 clases n = 5. M. c = 0 Grado de riesgo Sin riesgo directo. Washington. Moss. c = 1 n = 10.. D. c = 2 n = 5.C. c = 0 n = 30. c = 0 n = 10. c = 2 n = 5. Doyle M.. Food Microbiology.U. c = 3 n = 5. c = 3 n = 5.Tabla 2 Planes de muestreo sugeridos por el ICMSF (2002) para las diferentes combinaciones de riesgo a la salud y condiciones de uso. c = 1 Riesgo disminuye Riesgo no cambia Riesgo aumenta Caso 4 Caso 5 Caso 6 3 clases 3 clases 3 clases n = 5. directo.. The Royal Society of Chemistry.R. descomposición Riesgo a la salud Bajo.O. c = 0 n = 20. directo Referencias Adams M. ICMSF (2002) Microorganisms in Foods 7. (2000). c = 0 Caso 13 Caso 14 Caso 15 2 clases 2 clases 2 clases n = 15.J. ASM Press.R. indirecto (indicadores) Moderado. Food Microbiology. extensión amplia Severo. c = 1 Caso 10 Caso 11 Caso 12 2 clases 2 clases 2 clases n = 5. c = 0 n = 60. Microbiological Testing in Food Safety Kluwer Academic/Plenum Publishers. vida de anaquel.

(Eds) Food Microbiology. condiciones aeróbicas o anaeróbicas) y relacionarlas con los posibles contaminantes. (1997) Indicator microorganisms and microbiological criteria. D. Parte B.. ASM Press. tratamiento térmico. la microbiota que se encuentra en una tinción de Gram de dicha preparación puede orientar al analista sobre el problema.Smoot L. Fundamentals and Frontiers. aún cuando los microorganismos pueden no estar viables.D. Por ejemplo la presencia de gran cantidad de cocos Grampositivos puede implicar la presencia de toxina estafilocóccica. Yersinia.M.R. La presencia de bacilos Gramnegativos se debe relacionar con los síntomas y periodos de incubación. En: Doyle M..P.J. ya que el calentamiento puede destruir a la bacteria pero no a la toxina. para buscar alguno de los géneros posiblemente implicados: Salmonella. Vibrio. es importante hacer un examen microscópico directo del alimento o de una de las primeras diluciones. Escherichia. Washington. A continuación se describe el método para el examen microscópico de alimentos en general: Equipo Microscopio óptico Material y muestras Alimento homogenizado o dilución 10-1.. evitar exposición en embarazo 13 . aún si los cultivos resultan negativos. Portaobjetos previamente marcados Asa microbiológica Reactivos Colorantes de Gram Metanol Xilol (xileno ó dimetil-bencenos) PRECAUCIÓN: Flamable. ó Campylobacter. Si se encuentran cantidades importantes de bacilos Grampositivos esporulados. Montville T. Shigella. EXAMEN MICROSCÓPICO DEL ALIMENTO Cuando se tiene un alimento alterado por microorganismos ó en descomposición y cuando se sospecha que un alimento está involucrado en una ETA. 66-80. Pierson M. conviene considerar el manejo que ha tenido el alimento (refrigeración.C. Beuchat L.

que es muy volátil y flamable. Teñir las preparaciones con el método de Gram 4. PRECAUCIÓN: El xileno es muy flamable y es tóxico. NO USAR MECHEROS CUANDO SE USA XILOL. 2006. Examinar al microscopio. escurrir. el método se aplica de manera cuantitativa. Disponible a través de Internet en: http://www.Procedimiento 0. (ILO). cocos Grampositivos y bacilos Gramnegativos. Hacer preparaciones fijas. Disponible a través de Internet en: http://www. International Chemical Safety Cards (ICSC). en particular costridia. 2002. Bacteriological Analytical Manual (online). Desengrasar las muestras de alimentos (que lo requieran). USFDA. enjuagar y secar al aire.htm 14 .html International Labour Organisation. ya que es insoluble en agua. escurrir y secar. EVITAR LA EXPOSICIÓN EN EL EMBARAZO. EVITAR LA INHALACIÓN. P-xylene. Aplique las muestras con pipeta Pasteur. 3.org/public/english/protection/safework/cis/products/icsc/dtasht/_icsc00/i csc0086.cfsan.gov/~ebam/bam-2. secar al aire y fijar con metanol durante 1 a 2 minutos. aplicando una cantidad conocida de muestra en una superficie definida. así como de leche bronca. En esta práctica NO SE UTILIZA MECHERO por el xilol. 1. escurrir. lavar en metanol para eliminar el exceso de xilol. Para el examen microscópico de huevo congelado y en polvo. buscando los tipos predominantes de microorganismos.fda. sumergiendo en xilol por 2 minutos. EMPLEAR LENTES DE PROTECCIÓN. con 1000x y aceite de inmersión.ilo. Se deben examinar al menos 10 campos de cada preparación. 2. Referencias CFSAN. International Occupational Safety and Health Information Centre.

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