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Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina, el Caribe, Espaa y Portugal
Gonzlez Moreno, Sergio;Perales Vela, Hugo;Salcedo Alvarez, Martha O
LA FLUORESCENCIA DE LA CLOROFILA a COMO HERRAMIENTA EN LA
INVESTIGACIN DE EFECTOS TXICOS EN EL APARATO FOTOSINTTICO DE
PLANTAS Y ALGAS
Revista de Educacin Bioqumica, Vol. 27, Nm. 4, diciembre-sin mes, 2008, pp. 119-
129
Universidad Nacional Autnoma de Mxico
Mxico
Cmo citar? Nmero completo Ms informacin del artculo Pgina de la revista
Revista de Educacin Bioqumica
ISSN (Versin impresa): 1665-1995
reb@bq.unam.mx
Universidad Nacional Autnoma de Mxico
Mxico
www.redalyc.org
Proyecto acadmico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
LA FLUORESCENCIA DE LA CLOROFILA a COMO
HERRAMIENTA EN LA INVESTIGACIN DE
EFECTOS TXICOS EN EL APARATO FOTOSINTTICO
DE PLANTAS Y ALGAS*
Sergio Gonzlez Moreno, Hugo Perales Vela, Martha O Salcedo Alvarez
RESUMEN
El anlisis de la emisin de fluorescencia de la clorofila
a del fotosistema II del aparato fotosinttico de plantas
terrestres, acuticas y algas hace posible caracterizar los
efectos y modos de accin de diferentes tipos de estrs
ambiental (temperatura, sequa, alta intensidad luminosa,
salinidad, inundacin) y diversos contaminantes del agua
como metales pesados, herbicidas, detergentes, as como
de una variedad de compuestos contaminantes del aire.
Tambin puede ser de gran ayuda en la identificacin de
contaminantes txicos y sus fuentes. Este mtodo de
anlisis puede ser aplicable a las plantas o algas intactas
in situ e in vivo, o a cloroplastos aislados, siendo adems,
no invasivo o destructivo, rpido y sensible.
PALABRAS CLAVE: fotosntesis, fluorescencia de clo-
rofila a, plantas, algas, efectos txicos.
ABSTRACT
Chlorophyll a fluorescence emission analysis of
photosystem II from the photosynthetic apparatus of
terrestrial and aquatic plants and algae makes possible
to characterize the effects and modes of action of
different kinds of environmental stress (temperature,
drought, high irradiance, salinity, flooding), several water
pollutants such as heavy metals, herbicides, detergents,
and a variety of air pollutants, as well. It may be of great
help for identification of toxic pollutants and their
sources. In addition, this method of analysis can to be
applied to plants and algae in situ, and in vivo or to
isolated chloroplasts, is not invasive neither destructive
and it is a fast and sensitive technique.
KEY WORDS: photosynthesis, chlorophyll a
fluorescence, plants, algae, toxic effects.
*Recibido: 29 de febrero de 2008 Aceptado: 11 de noviembre de 2008
Laboratorio de Bioqumica, Unidad de Morfofisiologa, Facultad de Estudios Superiores Iztacala, Universidad Nacional Autnoma de
Mxico, Tlalnepantla, Estado de Mxico, Mxico. CP 54090. Correo E: sergon_9@yahoo.com
INTRODUCCIN
La fotosntesis es el proceso por el
cual las plantas, algas, cianobacterias
y bacterias fotosintticas convierten
la energa luminosa en energa qu-
mica en forma de enlaces qumicos y
es la base de todas las cadenas alimen-
ticias de las que depende la vida ani-
mal y humana.
El proceso fotosinttico se inicia
cuando la luz es absorbida por los
pigmentos fotosintticos (bsicamen-
te clorofila a, b y carotenoides) de los
complejos antena de la membrana
fotosinttica. Parte de la energa ab-
sorbida es transferida como energa de
excitacin y atrapada por el centro de
reaccin, en donde es utilizada para
hacer trabajo qumicamente til, y la
otra parte es disipada principalmente
como calor y en menor grado re-emi-
tida como energa luminosa de menor
energa (fluorescencia). Esta distribu-
cin de la energa en los tres procesos
ocurre simultneamente, de tal forma
que el incremento en la eficiencia de
uno de ellos, resultar en la disminu-
cin de los otros dos. Por lo tanto, a
travs de la medicin del rendimien-
to de la fluorescencia de la clorofila
se puede obtener informacin de la
eficiencia fotoqumica y la disipacin
trmica de la energa absorbida (1).
En los complejos antena, la energa de
un fotn absorbido se suma a la de la
molcula de pigmento que la absorbe,
quedando sta en un estado excitado
inestable, con marcada tendencia a ce-
der este exceso de energa denomina-
do energa de excitacin o excitn y
volver al estado fundamental de ener-
ga mnima. La desexcitacin se efec-
ta por tres rutas: a) prdida de energa
como calor, b) como transferencia de
energa a otras molculas suficiente-
REB 27(4): 119-129, 2008 119
120
Gonzlez Moreno S, Perales Vela H, Salcedo Alvarez MO
mente cercanas y c) liberacin de
energa radiante como fotn visible de
menor energa (fluorescencia) que el
que caus la formacin del estado ex-
citado. La energa transferida entre las
clorofilas de las antenas y canalizada
a las clorofilas del centro de reaccin
hace que, en stas, un electrn pase
del estado basal a un estado excitado.
Cuando la molcula de clorofila ex-
citada pierde un electrn, se produce
la separacin de carga elctrica den-
tro del centro de reaccin (quedando
la clorofila a oxidada (Chl a
+
) y una
molcula de feofitina aceptora del
electrn reducida (Pheo
-
)). Esto se
conoce como evento fotoqumico pri-
mario y utiliza alrededor del 97% de
los fotones absorbidos, mientras que
el 2.5 % son transformados a calor y
0.5% son re-emitidos como luz fluo-
rescente roja. Si no ocurre la separa-
cin de carga, 95-97% de la energa
luminosa absorbida se libera como
calor y 2.5-5.0%como fluorescencia.
En las plantas, las molculas de clo-
rofila a asociadas a los fotosistemas I
y II (PSI, PSII) son las responsables
de la emisin de la fluorescencia, sin
embargo, a la temperatura de ambien-
te (25
o
C), la contribucin del PSI a la
emisin total es mnima en compara-
cin con el PSII. Las caractersticas
cinticas de la reaccin de la fluores-
cencia emitida son determinadas por
la intensidad luminosa de excitacin,
la concentracin de pigmentos que
absorben la luz, la transferencia de la
energa de excitacin, la naturaleza y
orientacin de los pigmentos
fluorescentes, el estado redox de
aceptores y donadores del PSII, el
apilamiento de los tilacoides y la
translocacin de protones, entre otros.
En condiciones naturales, in vivo, la
emisin de fluorescencia de los siste-
mas fotosintticos cambia continua-
mente siguiendo su adaptacin al am-
biente cambiante. Diversos factores
fsicos o qumicos de estrs ambien-
tal como temperaturas altas, heladas,
sequa, cambios en la intensidad lu-
minosa, salinidad, deficiencias
nutricionales, presencia de metales
pesados, detergentes, herbicidas y ozo-
no entre otros, afectan la funcin del
PSII de manera directa o indirecta lo
cual modifica la emisin de la fluo-
rescencia. Por ello, los cambios en la
emisin de la fluorescencia, pueden
utilizarse para revelar mecanismos de
respuesta, cuantificacin de respues-
tas al estrs e identificacin de cier-
tos contaminantes y sus fuentes (1-4).
Las primeras evidencias de la re-
lacin entre las reacciones primarias
de la fotosntesis y la emisin de fluo-
rescencia de la clorofila del PSII se
tuvieron al exponer a la luz, hojas
adaptadas a la oscuridad, donde se
obtuvo un registro de emisin de fluo-
rescencia roja. La curva de induccin
de fluorescencia (conocida como
"cintica de Kautsky", en honor a
quien la describi) mostr una fase de
incremento rpido de fluorescencia en
el primer segundo de iluminacin se-
guida de una fase lenta de declive de
fluorescencia durante varios minutos.
La "fase rpida", O-I-D-P (cada una
designada secuencialmente por las le-
tras O, J, I, P), tambin llamada O-J-
I-P, est relacionada principalmente
con eventos primarios del PSII. Por
otro lado, la "fase lenta" compuesta
de las fases o inflexiones P-S-M-T,
est asociada principalmente con
interacciones entre procesos de las
membranas de los tilacoides y proce-
sos metablicos en el estroma del
cloroplasto, relacionados con un incre-
mento en la asimilacin de CO
2
(Fig.
1). El aumento de fluorescencia en la
"fase rpida" O-P se ha explicado
como una consecuencia de la reduc-
cin (ganancia de electrones) del to-
tal de aceptores de electrones en el
PSII, particularmente la quinona A
(Q
A
) y la plastoquinona (PQ). Una vez
que el PSII absorbe luz y Q
A
ha acep-
tado un electrn, no es capaz de acep-
tar otro hasta que el primero ha pasa-
do al siguiente acarreador de elec-
trones, la quinona B (Q
B
). Durante
este periodo, el centro de reaccin
est "cerrado" porque est totalmen-
te reducido. En cualquier punto en el
tiempo, la presencia de una propor-
cin de centros de reaccin reducidos
"cerrados", conduce a una disminu-
cin en la eficiencia fotoqumica, con
un correspondiente incremento en la
fluorescencia. Despus de esto, a par-
tir de la fase P y hasta la fase T, el
nivel de fluorescencia empieza a de-
caer en el transcurso de minutos. Aun-
que muchos factores pueden modifi-
car la fluorescencia de las membra-
nas tilacoides, son principalmente dos
los que hacen la mayor contribucin
al nivel de fluorescencia durante la
fases de decaimiento P-T; el primero
es el estado redox de Q
A
y el segun-
do, la magnitud del gradiente de po-
tencial electroqumico protnico
(ApH) que existe a travs de las mem-
branas tilacoides. Los cambios en el
estado redox de Q
A
ocurren como re-
sultado de cambios en la velocidad de
transporte de electrones no cclico y
el incremento en el consumo de
NADPH por el metabolismo del car-
bono lo que resulta en un incremento
en la velocidad de transporte de elec-
trones y oxidacin de Q
A
. El decai-
miento de fluorescencia debido a la
oxidacin de Q
A
se ha denominado
"decaimiento fotoqumico" qP, mien-
tras que, el debido a cambios en la
magnitud del gradiente de potencial
electroqumicoprotnicotranstilacoidal
se denomina "decaimiento no-
fotoqumico" (qNP). La magnitud del
coeficiente de decaimiento no
fotoqumico (qNP) refleja adems de
los cambios en el gradiente de pH,
inactivacin de centros de reaccin
(fotoinhibicin), cambios confor-
macionales dentro de los complejos
de pigmentos en la membrana
tilacoide, desconexin de complejos
cosechadores de luz mviles del PSII,
formacin de zeaxantina, disminu-
121
REB 27(4): 119-129, 2008 Fluorescencia de clorofila a
cin del rendimiento cuntico efec-
tivo de la fotoqumica del PSII
(u
PSII
) y la velocidad de transporte
de electrones fotosinttico (ETR).
Los cambios en estos dos procesos
se completan en 15-20 minutos (varia-
ble entre las especies) en los que se al-
canza un estado estacionario (1, 5).
Desde la descripcin inicial de los
procesos mencionados a la fecha, el co-
nocimiento de la relacin entre reac-
ciones primarias de la fotosntesis y
la fluorescencia de la clorofila a se
ha incrementado notablemente gracias
a los avances en la instrumentacin
Figura 1. Curva de induccin de fluorescencia de clorofila a (fases rpida y lenta,OIDPSMT) y su correspondencia con las reacciones de la
cadena transportadora de electrones. La primera seal registrada se denomin O (Origin) y su intensidad usualmente se expresa como Fo
(fluorescencia inicial o basal). En este punto, Q
A
est en su mayora oxidada. La fase I (inflexin) corresponde a la reduccin de Q
A
. La fase D
(declive) es indicativa de la oxidacin de Q
A
en la transferencia de electrones de Q
A
a Q
B
. El nivel de fluorescencia P corresponde a la reduccin
de PQ y su intensidad normalmente se denomina Fm (fluorescencia mxima). La fase S (Estado estacionario) de decaimiento de fluorescencia
est relacionada con la re-oxidacin de Q
A
, la energizacin de la membrana tilacoide debida a translocacin de protones (ApH) y a transicin
de estado1 2. Las fases M (mxima) y T (terminal) corresponden a la disminucin de qP e incremento de qN (ApH) y estn relacionadas con
la captacin de CO
2
, velocidad de liberacin de O2 y la disponibilidad de NADP
+
, ADP y fosfato.
Q
A
reducido
Q
B
reducido
Estado estacionario
PQ reducido
Complejo
fotosistema II
Complejo
fotosistema I
G
r
a
d
i
e
n
t
e
e
l
e
c
t
r
o
q
u

m
i
c
o
p
r
o
t

n
i
c
o
C
o
m
p
l
e
j
o
F
o
F
1
C
o
m
p
l
e
j
o
a
n
t
e
n
a
C
o
m
p
l
e
j
o
a
n
t
e
n
a
Plastoquinina
Plastocianina
0.5 ms 0.5 - 2 s 180 - 300 s
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a
Q
B
Q
A
lumen
C
i
t
b
6
/
f
F
B
F
A
F
X
A
1
A
0
Complejo citocromo
b
6
-f
D
S
M
T
Fase rpida Fase lenta
P
Estroma
Lumen
Estado estacionario
H
2
O
Complejo liberador
de O
2
O
2
Ferredoxina
ATP
Ciclo
de
Calvin
NADP
+
NADPH
ADP+Pi
Luz
Grana
Tilacoides
Cloroplasto
Mn
PC
PC
PQ
O
122
Gonzlez Moreno S, Perales Vela H, Salcedo Alvarez MO
La interpretacin de estas seales
experimentales con los cambios en los
componentes moleculares de las re-
acciones se ha establecido sobre un
modelo que supone que los comple-
jos cosechadores de luz (LHC-PSII)
donde se encuentran los pigmentos
antena y los centros de reaccin (RC-
PSII) son sistemas individuales. El
modelo permite un anlisis simple del
flujo de energa a travs del PSII (2,
6). El flujo de energa puede ser en-
tendido por varios parmetros: Flujo
absorbido (flujo de fotones absorbi-
do por pigmentos de la antena (ABS),
flujo atrapado (flujo de energa trans-
ferida al centro de reaccin que ser
convertida en energa redox reducien-
do Q
A
a Q
A
-
(TR), flujo de transporte
electrnico (al oxidarse Q
A
-
se inicia
el transporte de electrones que con-
duce a la fijacin de CO
2
)(ET) y el
flujo de disipacin de energa no atra-
pada como calor o transferida a otros
sistemas no fluorescentes (DI) (Fig.
3). Como puede observarse en el mo-
delo, la eficiencia cuntica mxima de
la reaccin fotoqumica primaria TRo/
ABS = m
Po
, la eficiencia con la que
un excitn atrapado puede mover un
electrn mas all de Q
A
-
en la cadena
transportadora de electrones ETo/TRo
= v
o
, y la probabilidad de que un fo-
tn absorbido mueva un electrn en
la cadena transportadora de electro-
nes ETo/ABS = m
Eo
estn directamen-
te relacionados a los tres flujos como
cocientes de 2 de ellos. m
Eo
se deriva
de la multiplicacin de m
Po
y v
o
. El
producto cuntico mximo de la
fotoqumica primaria (m
Po
) es tambin
denominado como fase luminosa, de-
bido a que su valor puede ser modifi-
cado por la intensidad lumnica. Por
otro lado, la eficiencia con la que un
excitn atrapado mueve un electrn
Figura 2. Cintica de emisin de fluorescencia de la clorofila a del fotosistema II en la fase
rpida y su relacin con las reacciones en la cadena transportadora de electrones. O, es el
valor mnimo de la fluorescencia (Fo). Aparece alrededor de los 50 us y en ese momento todos
los centros de reaccin estn oxidados "abiertos". J, se desarrolla a los 2 ms (F
J
= F
2ms
) y est
relacionada con la reduccin parcial de la Q
A
. I, se desarrolla a los 20 ms (F
I
= F20
ms
) y est
relacionada con la reduccin parcial de Q
A
y Q
B
. P, es el valor mximo de la fluorescencia
(Fm). El tiempo en el que se alcanza depende del protocolo experimental. En este momento
todos los centros de reaccin estn reducidos "cerrados".
E
m
(
v
o
l
t
i
o
s
)
Tiempo (s)
para medir la fluorescencia con tiem-
pos de resolucin altos (10 us) y a la
capacidad de adquisicin de datos
misma que se ha mejorado en varios
rdenes de magnitud.
Relacin entre la emisin de fluo-
rescencia registrada y los eventos
fotoqumicos primarios
Cuando una muestra preacondi-
cionada a la oscuridad es iluminada,
la fluorescencia de la clorofila a se
incrementa rpidamente. Este incre-
mento es un reflejo de la reduccin
"cierre" de los centros de reaccin
del PSII y por lo tanto provee infor-
macin de la actividad fotoqumica
del PSII y la reduccin "llenado" de
la poza de plastoquinona. La cintica
de la fluorescencia de la clorofila pre-
senta cuatro inflexiones nombradas
OJIP cuando se grafica el tiempo en
logaritmo (Fig. 2):
(1) O, es el valor mnimo de la fluo-
rescencia (Fo). Aparece alrededor de
los 50 us y en ese momento todos
los centros de reaccin estn oxida-
dos "abiertos", qP = 1 y qNP = 0.
(2) J, se desarrolla a los 2 ms (F
J
=
F
2ms
) y est relacionada con la reduc-
cin parcial de la Q
A
.
(3) I, se desarrolla a los 20 ms (F
I
=
F
20ms
) y est relacionada con la reduc-
cin parcial de Q
A
y Q
B
.
(4) P, es el valor mximo de la fluo-
rescencia (Fm). El tiempo en el que
se alcanza depende del protocolo ex-
perimental aunque en condiciones fi-
siolgicas normales se alcanza en al-
rededor de 1s. En este momento to-
dos los centros de reaccin estn re-
ducidos "cerrados", qP = 0 y qNP = 1.
P es el punto de fluorescencia mxi-
ma debido a que el flujo de electro-
nes desde PQ a travs del complejo
b/f es el paso ms lento de la cadena.
Por otra parte, el tiempo para llegar
desde las fases I (o J) a P no es ms
corto debido a que hay mucha ms PQ
que Q
A
.
Feofitina
calor
H
2
O
O
2
Mn
Tir
123
REB 27(4): 119-129, 2008 Fluorescencia de clorofila a
despus de Q
A
-
en la cadena transpor-
tadora de electrones (v
o
), es denomi-
nada fase trmica, ya que sta no es
modificada por la intensidad lumnica,
pero s por la temperatura. Lo ante-
rior ha sido de mucho valor, ya que
en condiciones de estrs se puede de-
finir de manera especfica la fase que
est afectando la condicin a la cual
ha sido expuesto el organismo (Fig. 5
y tabla anexa 5B).
El anlisis cuantitativo de la
cintica de la reaccin de produccin
de la de fluorescencia, llamada "prue-
ba OJIP", puede usarse para explicar
el flujo de energa a travs del PSII
como el flujo de energa por rea de
emisin (CS), y tambin por centro de
reaccin (RC). La relacin entre los
datos experimentales y la formulacin
planteada, estuvo basada en la consi-
deracin y los siguientes experimen-
tos (2): en tiempo cero, (despus de
un periodo de oscuridad), todos los
centros de reaccin estn oxidados
"abiertos", la velocidad de
atrapamiento TRo/CR que conduce
a la reduccin de Q
A
a Q
A
-
, debe ser
mxima; al bloquear la reoxidacin de
Q
A
-
con DCMU 3-(3,4-Diclorofenil)-
dimetilurea (inhibidor del paso de
electrones de Q
A
a Q
B
), TRo/RCesta-
r dada por la pendiente inicial nor-
malizada (Mo
DCMU
) de la curva de in-
duccin de fluorescencia (entre 50 y
300 s) en la fluorescencia variable
mxima Fv = Fm-Fo. Si no se bloquea
la reoxidacin de Q
A
-
, el valor norma-
lizado de la pendiente inicial, Mo, in-
dica la velocidad neta de cierre de los
centros de reaccin RCs, donde el pro-
ceso de atrapamiento incrementa el
nmero de centros reducidos y el
transporte de electrones lo disminuye
(Mo = TRo/RC-ETo/RC). Mo en las
muestras tratadas con DCMU puede
simularse por la amplificacin de Mo
medida en muestras sin DCMU por
un factor recproco a Vj (Vj =(F
2ms
-
Fo)/(Fm-Fo)) y entonces, TRo/CR
= Mo
DCMU
= Mo/Vj . A partir de
estas ecuaciones se definieron otras
que permiten el anlisis cuantitativo
de los flujos especficos en relacin
al rea de emisin (utilizando los va-
lores de Fo y Fm) o al centro de reac-
cin (utilizando los valores de Mo y
Vj y de las eficiencias cunticas o
relaciones de flujo) (Tabla 1).
Medicin de la emisin de fluores-
cencia de la clorofila del fotosistema
II
En la actualidad se utilizan principal-
mente 2 tcnicas fluoromtricas, una
que mide la fluorescencia directa, in-
ducida por excitacin continua y otra,
la fluorescencia modulada, inducida
por excitacin modulada. En el pri-
mer caso, la hoja se adapta previamen-
te a la oscuridad por 10-30 minutos,
posteriormente se expone a luz de 650
nm con una intensidad de alrededor
de 3000 umoles.m
-2
.s
-1
durante 1-10
segundos y simultneamente se miden
y almacenan los valores de la fluo-
rescencia emitida nicamente por la
clorofila del PSII, desde los 10 us has-
ta los segundos programados. As se
obtiene la cintica de emisin de fluo-
rescencia, y los valores de algunos
parmetros como Fo, Fm, Fv, Fv/Fm
(eficiencia fotoqumica del PSII) y
t
Fmax
(tiempo (ms) en el que se alcan-
za la fluorescencia mxima); a partir
de los valores registrados, se calcu-
lan otros parmetros que expresan el
funcionamiento de diversos compo-
nentes del PSII (2).
Para medir la fluorescencia modu-
lada se utiliza un fluormetro que con-
siste bsicamente de 4 fuentes de luz
cualitativa y cuantitativamente dife-
rentes: a) luz roja modulada de baja
intensidad (2 umoles.m
-2
.s
-1
, 583 nm),
b) pulsos de luz actnica de alta inten-
sidad ( 5-20,000 umoles.m
-2
.s
-1
), c) luz
actnica blanca continua de 300-600
umoles.m
-2
.s
-1
, d) luz rojo lejano
Figura 3. Modelo simplificado de los flujos de energa en el aparato fotosinttico. ABS se
refiere a el flujo de fotones absorbido por los pigmentos de la antena (Chl*). Parte de esta
energa de excitacin se disipa como calor y en menor grado como emisin de fluorescencia y
la otra parte es canalizada como flujo atrapado TR al centro de reaccin y es convertido a
energa redox reduciendo al aceptor de electrones QA a QA- el cual se oxida creando transpor-
te de electrones ET. La figura derecha ilustra la derivacin de: rendimiento cuntico mximo
de la fotoqumica primaria ( Po), la eficiencia con la que un excitn atrapado puede mover un
electrn ms all de QA- en la cadena transportadora de electrones ( o) y la probabilidad de de
que un fotn absorbido mueva un electrn en la cadena transportadora de electrones ( Eo); a
partir de las relaciones de flujo de energa especficos.
LHC-PSII
RC
ABS
TR
ET
ABS
TRo
ETo
RC
RC
RC
TRo
ETo
ABS
TRo
m
Po
v
o
=
=
m
Eo
=
ETo
ABS
Q
A
Q
A
-
DIo
ABS
m
Do
=
LUZ
Flujo atrapado
Flujo de transporte
electrnico
Flujo absorbido
124
Gonzlez Moreno S, Perales Vela H, Salcedo Alvarez MO
(umoles.m
-2
.s
-1
, de 735 nm) y un de-
tector de fluorescencia que registra
solamente la fluorescencia emitida en
la frecuencia y la fase de luz modula-
da. La hoja se expone a la luz modu-
lada de baja intensidad para determi-
nar Fo, luego se sobrepone un pulso
de luz de alta intensidad para deter-
minar Fm, y enseguida, tambin so-
brepuesta a la luz modulada, se apli-
ca luz actnica blanca continua duran-
te algunos minutos para llevar al es-
tado estacionario; nuevamente, se
aplica un pulso de luz saturante para
determinar Fm' y al final se aplica luz
rojo lejano para promover la
reoxidacin de plastoquinona y deter-
minar Fo'. (Fig. 5D). A partir de es-
tos parmetros se calculan los valo-
res de rendimiento fotoqumico ope-
racional del PSII (u
PSII
), decaimiento
fotoqumico (qP), decaimiento no-
fotoqumico (qNP) y transporte de
electrones (ETR) (1, 5). Ambos m-
todos pueden dar informacin no
idntica totalmente, pero tampoco
contradictoria. En la actualidad los
fluormetros de mayor uso a nivel
mundial son los de las marcas alema-
na (Walz) e inglesa (Hansatech). La
figura 4 muestra 2 de los equipos
Hansatech para la medicin de fluo-
rescencia directa o fluorescencia mo-
dulada en plantas y algas.
Informacinque se obtiene median-
te el anlisis de emisin de fluores-
cencia de la clorofila a del
fotosistema II
De acuerdo al anlisis de la fase rpi-
da OJIP y las ecuaciones planteadas
para la cuantificacin del comporta-
miento del PSII (3, 5), se puede tener
informacin sobre: a) los flujos de
energa especficos para absorcin
(ABS), atrapamiento, (TRo), transpor-
te de electrones (ETo) y disipacin
(DIo) por centro de reaccin o por rea
activa de la hoja; b) eficiencia
cuntica o relacin de flujos como el
rendimiento cuntico de la
fotoqumica primaria (m
po
), la eficien-
cia con la cual un excitn atrapado
puede mover un electrn en la cadena
transportadora de electrones mas all
de Q
A
-
(v
o
), y el rendimiento cuntico
de transporte de electrones (m
Eo
); c)
la cantidad de centros de reaccin ac-
tivos por rea de emisin; ndice de
funcionamiento (PI) el cual combina
criterios estructurales y funcionales
del PSII; d) el nmero de centros de
reaccin de reapertura muy lenta o
centros de reaccin que no unen Q
B
;
e) estimacin del nmero de centros
liberadores de oxgeno (OEC); f) el
nmero de veces que Q
A
se reduce
desde el tiempo 0 to al tiempo en el
que se alcanza al mximo de fluores-
cencia t
Fmax
(N); g) la fraccin pro-
medio de centros de reaccin abier-
tos durante el tiempo necesario para
completar la reduccin de todos los
centros de reaccin (Tabla 1). En
cuanto al anlisis de la fase lenta de
TABLA1
Formulacin del anlisis JIP usando los datos de la fase rpida de
emisin de fluorescencia.
Parmetros Tcnicos
Flujos especficos expresados por centros de reaccin (RC)
Flujos especficos expresados por rea (cross section) (CS)
Eficiencias cunticas (o relaciones de flujo)
ndices vitales
Fluorescencia a 50 us
Fluorescencia mxima
Fo
Fm
Fv
Mo
Vj Fluorescencia variable a 2ms
Pendiente desde el origen de la
fluorescencia
= Fm-Fo
= (F300us-Fo)/(Fm-Fo)
= (F2ms-Fo)/(Fm-Fo)
Absorcin por RC
Atrapamiento a tiempo 0 por RC
Disipacin a tiempo 0 por RC
Transporte electrnico a tiempo 0 por RC
Absorcin por CS
Atrapamiento a tiempo 0 por CS
Disipacin a tiempo 0 por CS
Transporte electrnico a tiempo 0 por CS
Densidad de RC por CS
ABS/RC
TRo/RC
DIo/RC
= (Mo/Vj)/(1-Fo/Fm)
= Mo/Vj = (ABS/RC) m
Po
= (ABS/RC) - (TRo/RC)
ETo/RC = (TRo/RC) v
o
ABS/CS
TRo/CS
DIo/CS
= Fo o Fm
= (TRo/ABS)/(ABS/CS)
= (ABS/CS) - (TRo/CS)
ETo/CS = (ETo/RC)(RC/ABS)
= (ABS/CS)(RC/ABS) RC/CS
Producto cuntico mximo de la
fotoqumica primaria
Producto cuntico mximo de disminucin
de excitacin fotoqumica
Eficiencia con la que un excitn atrapado
puede mover un electrn despus de QA
-
Probabilidad de un excitn absorbido
mueva un electrn despus de QA
-
ndice de funcionamiento
Fuerza impulsora de la fotosntesis
m
Po
m
Do
v
o
m
Eo
= DIo/ABS =1- m
Po
= Fo/Fm
= m
Po
-v
o
= (TRo/ABS)/(ETo/TRo)=
ETo/ABS = (1-Fo/Fm)(1-Vj)
= TRo/ABS = (Fm-Fo)/(Fm = (1-
(Fo/Fm) = Fv/Fm
= ETo/TRo = 1-Vj
= [RC/ABS][m
Po
/(1m
Po
)][v
o
/1v
o
] PI
ABS
= Log [PI
ABS
] DF
ABS
Fluorescencia variable a 2ms
125
REB 27(4): 119-129, 2008 Fluorescencia de clorofila a
la cintica de induccin de fluorescen-
cia (7) se puede obtener informacin
importante en relacin a los procesos
fotoqumicos y no fotoqumicos aso-
ciados con la conversin de energa
en los cloroplastos. Varios parmetros
de la fluorescencia de la clorofila a
proporcionan informacin sobre el
proceso de fotosntesis en las plantas
o algas bajo diferentes condiciones
externas o internas. Los valores nu-
mricos de los parmetros de fluores-
cencia reflejan la interaccin de las
plantas con su medio, el metabolismo
de cloroplastos, los mecanismos
regulatorios en la membrana tilacoide,
y la transferencia de energa de exci-
tacin.
Medicin de la emisin de fluores-
cencia de la clorofila a en algas
Para tener informacin de la activi-
dad fotosinttica de un alga a travs
de la medicin de la emisin de la
fluorescencia de la clorofila a, es ne-
cesario el poder distinguir entre la li-
beracin de la energa absorbida por
procesos fotoqumicos (qP) y los No-
fotoqumicos (qNP). La manera usual
de hacerlo, es a travs del "apagado"
de una de las dos vas, de tal manera
que se puede medir el producto de la
otra. Generalmente se "apaga" la va
fotoqumica a travs de la tcnica de
dos pulsos, la cual permite que mo-
mentneamente la contribucin de los
procesos fotoqumicos sean igual a
cero. Por medio de esta tcnica se
puede calcular el decaimiento
fotoqumico (qP), el cual representa
la proporcin de la energa de excita-
cin atrapada por los centros de reac-
cin abiertos y que ha sido usada para
el transporte electrnico.
qP = (Fm'-Fs)/(Fm'-Fo')
Otro trmino relacionado con el
anterior es el rendimiento fotoqumico
operacional del PSII (u
PSII
). ste mide
la proporcin de energa absorbida
que est siendo usada para impulsar
el proceso fotoqumico. De modo que,
es una medida de la eficiencia del
transporte electrnico lineal.
u
PSII
= (Fm'-Fs)/Fm'
El parmetro anterior puede ser
usado para calcular la tasa de trans-
porte electrnico (ETR).
ETR = ((Fm' - Fs)/ Fm') x 0.84 x 0.5
x PAR (m
-2
s
-1
)
Donde el valor de 0.84 en la fr-
mula, equivale a la proporcin de luz
que es absorbida por el alga y el de
0.5 a la proporcin de luz que es trans-
ferida al sistema a cada uno de los
fotosistemas (PSII y PSI) y la radia-
cin fotosintticamente activa (PAR)
utilizada en moles.m
-2
.s
-1
(1)
Por otro lado, el decaimiento no
fotoqumico (qNP o NPQ) representa
la proporcin de energa disipada
trmicamente y puede ser calculado
de dos maneras:
qNP = Fm-Fm'/Fm-Fo'
NPQ = Fm - Fm'/Fm'
El trmino qNP o NPQ refleja la
influencia de procesos no
fotoqumicos en la emisin de fluo-
rescencia de la clorofila durante la
transicin de una muestra del estado
adaptado a la oscuridad al estado
adaptado a la luz, como cambios en
el gradiente de pH transtilacoidal,
inactivacin de centros de reaccin
(fotoinhibicin) y cambios confor-
macionales dentro de los complejos
de pigmentos en la membrana
tilacoide, desconexin de complejos
cosechadores de luz mviles del PSII
y formacin de zeaxantina. El
parmetro ms usado en la emisin de
la fluorescencia es el rendimiento
cuntico mximo para la fotoqumica
primaria cuando todos los centros de
reaccin del PSII estn oxidados o
"abiertos" (Fv/Fm) (9).
Figura 4. Fluormetros Hansatech para el registro de fluorescencia directa o modulada en
plantas y algas.
Fluormetro de fluorescencia continua
Handy PEA Hansatech
Fluormetro de fluorescencia modu-
lada FMS2 Hansatech
126
Gonzlez Moreno S, Perales Vela H, Salcedo Alvarez MO
Fv/Fm = (Fm-Fo/Fm)
Es importante sealar que mientras
u
PSII
est relacionado con la eficien-
cia cuntica alcanzada por el PSII, qP
y Fv/Fm proveen informacin sobre
los procesos que pueden modificar
esta eficiencia. Por lo tanto, una dis-
minucin en qP est dada por la re-
duccin o "cierre" de los centros de
reaccin, como resultado de una sa-
turacin lumnica o de una inhibicin
del transporte electrnico. Por otro,
lado una disminucin en Fv/Fm est
dada por un aumento en qNP (1).
Aplicaciones del anlisis de la emi-
sin de fluorescencia de la clorofi-
la a
Por el anlisis de la cintica de emi-
sin de fluorescencia directa y los
parmetros registrados y calculados,
podemos saber si determinado factor
de estrs tiene efecto en los eventos
fotoqumicos del PSII o en eventos no
dependientes de luz. Cuando los even-
tos fotoqumicos son los afectados por
un factor de estrs de manera directa
o indirecta, podemos conocer si la
alteracin se produjo en alguno de los
siguientes componentes o reacciones:
a) el complejo antena (LHC), por
ejemplo, reducindose la captacin de
energa o incrementndose la disipa-
cin de la energa captada; b) la trans-
ferencia de energa de la antena al
centro de reaccin (RC), la cual po-
dra ser reducida o disipada al momen-
to de transferirse por desconexin con
el centro de reaccin; c) el centro de
reaccin, que no "atrape" la energa
transferida y sta sea disipada; d) la
velocidad de reduccin de Q
A
o alte-
racin de los niveles de Q
A
, la velo-
cidad de reduccin de Q
B
o la altera-
cin de los niveles de Q
B
; e) el blo-
queo de la transferencia de electrones
entre Q
A
y Q
B
; f) disminucin de la
velocidad de reduccin de PQ; g) el
complejo liberador de oxgeno, dis-
minuyendo su actividad y como con-
secuencia limitando el aporte de elec-
trones al centro de reaccin del PSII.
Por el anlisis de la fluorescencia
modulada podemos conocer si deter-
minado factor ambiental tuvo efectos
en la fotoqumica del PSII y en la di-
sipacin no fotoqumica, como calor
y el gradiente de pH. Estas tcnicas
tienen aplicacin en las prueba de pro-
ductividad agrcola en funcin de tra-
tamientos con fertilizantes, hormonas,
pesticidas y herbicidas; en ensayos de
seleccin de cultivos tolerantes a di-
ferentes factores de estrs (incluyen-
do cultivos transgnicos); en experi-
mentacin sobre respuesta a cambios
de intensidad y calidad de luz, tem-
peratura etc., y a la combinacin de
Figura 5. (A) Efecto del DCMU [3-(3,4-Diclorofenil)-dimetilurea] y del cobre (Cu
2+
) en la
emisin del fluorescencia de la clorofila a del fotosistema II y (B) los rendimientos cunticos
operacionales de Scenedesmus incrassatulus. Los datos mostrados fueron obtenidos en el la-
boratorio para ilustrar este caso.
Control DCMU Cu
2+
Producto cuntico
0.710 0.495 0.616
0.521 0.042 0.517
0.369 0.020 0.318
Producto cuntico mximo de
la fotoqumica primaria (m
po
)
Eficiencia con la que un excitn
atrapado puede mover un
electrn despus de Q
A
(v
o
)
Probabilidad de que un fotn
absorbido mueva un electrn
despus de Q
A
-
(m
Eo
)
0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a
(
m
V
)
0
1000
2000
3000
4000
5000
0.00 mM Cu
2+
3.14 mM Cu
2+
DCM U
O
J
I
P
A
Tiempo (ms)
0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a
v
a
r
i
a
b
l
e
[
V
t
=
(
F
t
-
F
o
)
/
(
F
m
-
F
o
)
]
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
O
J
I
P
B
0.00 mM Cu
2+
3.14 mM Cu
2+
DCM U
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a
v
a
r
i
a
b
l
e
[
V
t
=
(
F
t
-
F
o
)
/
(
F
m
-
F
o
)
]
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a
(
m
V
)
Tiempo (ms)
127
REB 27(4): 119-129, 2008 Fluorescencia de clorofila a
factores de estreses fsicos y qumi-
cos; en la optimizacin del estableci-
miento de condiciones de luz, tempe-
ratura, humedad en invernaderos, as
como en los estudios de productos
comercializados como flores y frutos
en relacin a condiciones de almace-
namiento y factores que retardan o
aceleran la maduracin o senescencia.
Las mencionadas tcnicas del estudio
de la emisin de la fluorescencia de
la clorofila a tambin tienen aplica-
cin en el estudio de la conducta de
ecosistemas ante cambios globales, en
la ecodinmica de sistemas hortcolas
y forestales y en la utilizacin de al-
gas y plantas como biorremediadores
de aguas y suelos contaminados con
metales pesados.
Algunos ejemplos de la utilizacin
del anlisis JIP en el estudio de los
efectos de varios tipos de estrs en la
fotosntesis de plantas y microalgas
se presentan en las figuras 5-6
La figura 5A muestra el efecto del
DCMU y del cobre (Cu
2+
) en la
cintica de emisin de fluorescencia
del alga verde Scenedesmus
incrassatulus. El DCMU es un cono-
cido herbicida cuyo efecto es bloquear
el flujo de electrones entre Q
A
y Q
B
,
lo que se puede evidenciar en la gr-
fica como un incremento rpido de la
fluorescencia hasta alcanzar un valor
mximo (Fm) en la fase J, la cual est
relacionada con la reduccin de Q
A
.
Por otro lado, se puede observa en la
misma figura que la exposicin du-
rante 168 h a 3.14 M de Cu
2+
dismi-
nuye los valores de fluorescencia
mxima y mnima. La figura 5Bmues-
tra los valores de fluorescencia
graficados como fluorescencia relati-
va en el tiempo [Vt = (Ft-Fo)/(Fm-
Fo)]. Esta expresin experimental
permite visualizar de manera dinmi-
ca la reduccin de Q
A
Q
A
-
. Se pue-
de observar en esta figura que la
incubacin con DCMU o Cu
2+
incrementa la velocidad inicial de la
fluorescencia (Mo), lo que se explica
Figura 6. (A) Efecto de la temperatura en la cintica de emisin de fluorescencia de la cloro-
fila a del PSII de plantas de P. vulgaris (obtenida con el fluormetro Handy PEA, Hansatech);
(B) "Grfica de araa" que muestra los efectos de la temperatura en las actividades aparentes
ABS/CS, TRo/CS, ETo/CS, DIo/CS; eficiencias cunticas m
Po
, v
Po
, m
Eo
e ndice de vitalidad
PI
ABS
en plantas de P. vulgaris. Los datos presentados fueron calculados usando las ecuaciones
indicadas en la tabla 1 y los valores de fluorescencia registrados con el fluormetro Handy
PEA, mediante el programa "Biolyzer", diseado especficamente para ste propsito por el
grupo de Strasser en la Universidad de Ginebra). Los valores fueron normalizados sobre el
control (25C). (C) Modelo de hoja obtenido con el programa Biolyzer, que ilustra los efectos
de la temperatura en los flujos de energa (por rea de absorcin de la hoja, (CS)) del PSII de
P. vulgaris. Las flechas indican los flujos de absorcin de luz (ABS), energa de excitacin
atrapada (TRo), energa de disipacin (DIo), y transporte de electrones (ETo) mas all de Q
A
-
. El ancho de cada flecha representa la intensidad de flujo de energa respectivo. Cada crculo
blanco indica centro de reaccin activo y cada crculo negro representa centro de reaccin
inactivo. (D) Efecto de la temperatura en la actividad del fotosistema II de P. vulgaris medida
por emisin de fluorescencia modulada. (Los registros se obtuvieron utilizando un medidor de
fluorescencia modulada FMS2, Hansatech). Todos los datos presentados fueron obtenidos por
los autores para ilustrar este caso especfico.

P. vulgaris Jamapa
Temp. (C)
Fo
Fm
Fv
Fv/Fm
Fs
Fm
Fo
Fv
Fv/Fm
uPSII
qP
qNP
ETR
25
224
1169
945
0.808
366
533
244
289
0.542
0.313
0.578
0.688
0.724
45
258
613
355
0.579
304
358
238
120
0.335
0.151
0.450
0.680
0.348
Tiempo (s)
0 100 200 300 400
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
25 C
45 C
P. vulgaris Jamapa
Tiempo(s)
0 100 200 300 400
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
25C
45C
P. vulgaris Jamapa
D
Fm
Fo
Fm
Fo
Fs
Tiempo(ms)
0.01 0.1 1 10 100 1000 10000
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a
0
1000
2000
3000
4000
P. vulgaris
A
45C
40C
25C
35C
O
J
I
P
K
ETo/CSo
DIo/CSo
TRo/CSo
ABS/CSo
ETo/CSo
DIo/CSo
TRo/CSo
ABS/CSo
ETo/CSo
DIo/CSo
TRo/CSo
ABS/CSo
ETo/CSo
DIo/CSo
TRo/CSo
ABS/CSo
C
25C 35C 40C 45C
1.00
2.00
Fo
Fm
dV/dto
m
Po
v
o
m
Eo
RC/CSo
ABS/CSo
TRo/CSo
ETo/CSo
DIo/CSo
PI
ABS
25C 35C 40C 45C
B
Tiempo (ms)
Tiempo (s)
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a
128
Gonzlez Moreno S, Perales Vela H, Salcedo Alvarez MO
como un incremento en la velocidad
de reduccin de los centros de reac-
cin del PSII. Esto se explica debido
a que en caso de la inhibicin com-
pleta del PSII con DCMU, los cen-
tros de reaccin son reducidos con la
entrada de un slo electrn. El efecto
del cobre podra ser similar, es decir
inhibiendo el paso de electrones en-
tre Q
A
y Q
B
, sin embargo, es posible
que algunos centros de reaccin no
puedan llevar a cabo la separacin de
cargas, lo cual aumentara la veloci-
dad del cierre de total de los centros
de reaccin. Por otro lado, el valor de
fluorescencia despus de la fase "J"
es el mximo para el caso de la
incubacin con DCMU, sin embargo,
comparado con el control, la exposi-
cin a cobre no modifica la dinmica
de reduccin de Q
A
entre las fases de
J a P. Cuando se analiza la cintica de
la figura 4A y la tabla anexa (4B) con
base en el modelo de la prueba OJIP
para obtener los productos o
eficiencias cunticas, se puede obser-
var que la eficiencia con la cual se
mueven los electrones a travs del
PSII (m
Eo
) disminuye en un 94% y
14%por efecto del DCMUy Cu
2+
res-
pectivamente comparado con el con-
trol. Esta disminucin, en caso del
DCMU, se debe principalmente a la
disminucin del flujo de electrones
despus de Q
A
(v
o
), fase trmica y en
menor proporcin a la fase lumnica
(m
Po
). Por otro lado, en el caso del Cu
2+
a concentraciones no letales para este
organismo (0.2 ppm), el efecto apa-
rentemente est ms relacionado con
la salida de electrones del centro de
reaccin del PSII, es decir a la fase
lumnica (m
Po
), ya que el movimiento
de electrones despus de Q
A
(v
o
),
prcticamente no es afectado.
La figura 6 muestra los efectos de
la temperatura en la cintica de emi-
sin de fluorescencia y en algunos
parmetros de fluorescencia de plan-
tas de frijol comn (Phaseolus
vulgaris) obtenidos por la medicin
de fluorescencia directa y fluorescen-
cia modulada respectivamente. En la
figura 6Ase observa que el incremen-
to de la temperatura hasta 40C dis-
minuye gradualmente la intensidad de
fluorescencia mientras que a 45 C
se produce una disminucin abrupta
y la cintica de emisin de fluores-
cencia muestra una fase (K) entre Fo
y J (alrededor de los 300 us), lo que
refleja una limitacin de la donacin
de electrones por el complejo libera-
dor de oxgeno y cambios en la arqui-
tectura de la antena del PSII con la
consecuente alteracin de la distribu-
cin de energa. Despus del incre-
mento rpido inicial de fluorescencia
debido a la reduccin de Q
A
, la
reoxidacin de Q
A
-
contina, transfi-
rindose los electrones a Q
B
, pero de-
bido a la carencia de electrones pro-
cedentes del complejo liberador de
oxgeno, la intensidad de la fluores-
cencia decrece formandose el pico K.
La figura 6B muestra el efecto de la
temperatura en diversos parmetros de
fluorescencia entre los cuales desta-
can el fuerte decremento en el rendi-
miento cuntico mximo para la
fotoqumica del PSII (m
Po
), y el ndi-
ce de funcionamiento PI
ABS
. La figu-
ra 6C muestra el efecto de la tempe-
ratura en los flujos de energa por rea
de emisin, en hojas de frijol comn,
visualizado en un modelo de hoja en
donde la magnitud del cambio est
ajustada al ancho de la flecha corres-
pondiente y los centros de reaccin
activos estn indicados por crculos
claros y los inactivos por crculos os-
curos. Se observan: a) disminucin en
el transporte de electrones debido a
la inactivacin de los centros de reac-
cin (causado por una inactivacin del
complejo liberador de oxgeno); b)
disminucin en la densidad de los cen-
tros de reaccin activos; c) incremen-
to en la disipacin de energa por rea
de emisin y d) disminucin en la
energa absorbida por rea de emisin.
La figura 6D ilustra el efecto de la
temperatura alta en el fotosistema II,
registrado mediante la medicin de
fluorescencia modulada. Destaca la
disminucin en los valores del rendi-
miento cuntico mximo para la
fotoqumica primaria (Fv/Fm), en el
rendimiento fotoqumico operacional
del PSII (u
PSII
), en el decaimiento
fotoqumico de la fluorescencia (qP)
y en la tasa de transporte electrnico
(ETR). Estos resultados son con-
gruentes con los observados por el
anlisis basado en la medicin direc-
ta de fluorescencia.
En resumen, ya que la fotosntesis
es una funcin esencial en los orga-
nismos fotoautotrficos, resulta evi-
dente que la evaluacin de su funcio-
namiento es de la mayor importancia
en un gran nmero de situaciones de
inters prctico. La determinacin
cuantitativa de la emisin de la fluo-
rescencia de la clorofila a, su anlisis
y la obtencin de los parmetros co-
rrespondientes, constituyen una for-
ma precisa, confiable y rpida, de ob-
tener informacin molecular que tie-
ne una expresin fisiolgica y que
puede tener mltiples aplicaciones
prcticas.
129
REB 27(4): 119-129, 2008 Fluorescencia de clorofila a
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