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Harper Bioquimica 14 Edicion OCR

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Bioquímica de Harper
Índice de Capítulos
Capítulo 1: Bioquímica y medicina Capítulo 2: Biomoléculas y métodos bioquímicos Capítulo 3: Agua y pH

Sección I

Estructura y funciones de proteínas y enzimas
Capitulo 4: Aminoácidos Capítulo 5: Péptidos Capítulo 6: Proteínas. Estructura y función Capítulo 7: Proteínas. Mioglobina y Hemoglobina Capítulo 8: Enzimas. Propiedades generales Capítulo 9: Enzimas. Cinética Capítulo 10: Enzimas. Mecanismos de acción Capítulo 11: Enzimas. Regulación de la actividad enzimática

Sección II

Bioenergética y el metabolismo de carbohidratos y lípidos
Capítulo 12: Bioenergenética. La función del ATP Capítulo 13: Oxidación biológica Capítulo 14: Cadena respiratoria y fosforilación oxidativa Capítulo 15: Carbohidratos de importancia fisiológica Capítulo 16: Lípidos de importancia fisiológica Capítulo 17: Panorama del metabolismo intermediario Capítulo 18: El ciclo del ácido cítrico. Catabolismo de la acetil-CoA Capítulo 19: Glucólisis y oxidación del piruvato Capítulo 20: Metabolismo del glucógeno Capítulo 21: Gluconeogénesis y control de la glucosa sanguínea Capítulo 22: Vía de la pentosa fosfato y otras vías del metabolismo de las hexosas Capítulo 23: Biosíntesis de ácidos grasos Capítulo 24: Oxidación de los ácidos grasos. Cetogénesis Capítulo 25: Metabolismo de ácidos grasos insaturados y de los eicosanoides Capítulo 26: Metabolismo de acilgliceroles y esfingolípidos Capítulo 27: Transporte y almacenamiento de lípidos Capítulo 28: Síntesis, transporte y excreción del colesterol Capítulo 29: Integración del metabolismo y el suministro de energéticos tisulares

Sección III

Metabolismo de proteínas y aminoácidos

Capítulo 30: Biosíntesis de aminoácidos no esenciales en la nutrición Capítulo 31: Catabolismo de proteínas y del nitrógeno de aminoácidos Capítulo 32: Catabolismo de los esqueletos de carbono de aminoácidos Capítulo 33: Conversión de aminoácidos en productos especializados Capítulo 34: Porfirinas y pigmentos biliares

Sección IV

Estructura, función y replicación de las macromoléculas informativas
Capítulo 35: Nucleótidos Capítulo 36: Metabolismo de los nucleótidos de purina y pirimidina Capítulo 37: Estructura y función de los ácidos nucleicos Capítulo 38: Organización y replicación del DNA Capítulo 39: Síntesis, procesamiento y metabolismo del RNA Capítulo 40: Síntesis de proteínas y el código genético Capítulo 41: Regulación de la expresión genética Capítulo 42: Tecnología del DNA recombinante

Sección V

Bioquímica de la comunicación extracelular e intracelular
Capítulo 44: Acción de las hormonas Capítulo 45: Hormonas de hipófisis e hipotálamo Capítulo 46: Hormonas tiroideas

Capítulo 43: Membranas. Estructura, ensamble y función

Capítulo 47: Hormonas que regulan el metabolismo del calcio Capítulo 48: Hormonas de la corteza suprarrenal Capítulo 49: Hormonas de la médula suprarrenal Capítulo 50: Hormonas de las gónadas Capítulo 51: Hormonas del páncreas y vías gastrointestinales

Sección VI

Tópicos especiales

Capítulo 52: Estructura y función de las vitaminas hidrosolubles Capítulo 53: Estructura y función de las vitaminas liposolubles Capítulo 54: Nutrición Capítulo 55: Digestión y absorción Capítulo 56: Glucoproteínas Capítulo 57: Matriz extracelular Capítulo 58: Músculo Capítulo 59: Proteínas plasmáticas, inmunoglobulinas y coagulación sanguínea Capítulo 60: Eritrocitos y leucocitos Capítulo 61: Metabolismo de xenobióticos Capítulo 62: Cáncer, oncogenes y factores de crecimiento

Bioquímica y medicina
Roberf K. Murray, MD, PhD

INTRODUCCIÓN
La bioquirnica es la ciencia que estudia las diversas moliculas que ce presentan en las células y organismos vivos, asi como las reacciones quimicas que tienen lugar en los mismos. Una comprensibn más completa de todas 1% manifestaciones de la vida, demanda el conocimiento de la bioquímica. AdemBs, los estudiantes de que adquieren una base siilida de la bioquimica estarhn en una posición firme para enfrentarse, en la práctica y la investigación, a los dos intereses centrales de las ciencias de la salud: 1 ) la comprensión y conservación de la salud y 2) la apreciación y tratamiento eficaz de la enfermedad.

La bioquímica es la química de la vida
La bioquimica puede definirse de manera más forma1
como la ciencia que se ocupa de la base química de la vida (del griego, bios: vida). La cblula es la unidad estructural de los sistemas vivientes. La concfderaci0n de este concepto conduce

a una definicion funcional de la bioquímica como la ciencia que se ocupa de los constituyentes químicos de las células vivas y de las reacciones y procesos que experimentan. Con esta definición, la bioquimica abarca extensas heac de la biología celular, la biología molecular y la genkitica moIecular.

El objetivo de la bioquímica es describir y explicar, en términos moleculares, todos los procesos químicos de las células vivas
El interés principal de la bioquimica es la comprensión completa a nivel rnolecular de todos los procesos

químicos relacionados con las células vivas. Para lograr este objetivo, los bioquimicos han necesitado aislar las numerosa moléculas de que se componen las cé1u]a1 determinar sus e s t ~ - ~ c t u Y a analizar la r forma en que funcionan. Para dar un e j e m ~ l o ~ 10s e~füerms numerosos bioquímicos Para comprender de la base mOlecular de la -proceso quc acompaiia de preferencia, pero no de manera exclusiva, a las células musculares- han emprendido la purificación de muchas moléculas, siniples y complejas, seguida por detallados estudios de esh-uctura-funcibn. A iraves de estos esfuerzos, se han encontrado algunas de los fundamentos muleculares de la contracción muscular. Un obietivo adicional de la bioqliímica es intentar la comprensión del origen de la vida; este fascinante tema aún se encuentra en la etapa embrionaria. El campo de la bioquimica es tan amplio como la vida misma. Dondequiera que hay vida, se prodiicm procesos quimicos. Los bioquimicos los estudian en microorganismos, vegetales, insectos, peces, aves, mamíferos y en el ser humano. Es lbgico que los estudiantes de ciencias biomédicas centren su interes en la bioquimica de los dos últimos grupos. No obstante, una apreciaci6n respecto a formas de vida menos complejas tiene a menudo relevancia directa con la bioquimica humana. Por ejemplo, las teorías contemporaneas sobre la regulación de las actividades de genes y enzima5 en el ser humano provienen de estiidios pioneros en pan enmohecido y bacterias. El campo del DNA recombinante surgió de estudios en bacterias y sus virus; su rapidez para la multiplicacibn y la facilidad para extraer su material genético los hace adecuados para análisis y manipulaciones gentticas. El cor,ocimiento logrado por el estudio de genes virales causantes de ciertos tipos de cáncer en animales (oncogenes viraIes) ha permitido avanzar profundamente-en el modo en que la célula humana se torna cancerosa.

2

Bioquim icu d~ JIarper

(Capitulo I )

El: conocimiento de la bioquímica es esencial en todas las ciencias de la vida, incluyendo la medicina
Los fundamentos de la genética se apoyan en la bloquímica de los ácidos nucleicos; a su vez, los enfoques geneticos han dilucidado numerosas áreas de la bioquímica. La fisiologia, estudio de la función corporal, se traslapa casi por completo con la bioquimica. La inmunoIogía, por su parte, emplea numerosas técnicas bioquimicas y muchos de los aspectos inmunol0gicos han encontrado uso extenso eiitre bioquimicos. Asimismo, la farmacologia y la farmacia se apoyan en un co~iocimiento sblido dc bioquimica y Ilsiologia; en particular, la mayoría de los firmacos son metabolizados por reacciones catalizadas por enzimas y las comple,jas interacciones entre fármacos se comprenden mejor desdc el punto de vista bioquimico. También los venenos actúan por medio de rcaccjones o procesos bioquimicos y este es el terna de la toxicologia. Cada vez más se emplean enfoques bioquimicos en el estudio de aspectos básicos de la patología (estudio de la enfermedad}, como inflamación, lesión celular y cancer. Muchos profesionales en rnicrobiologia, 7001ogía y botanica emplean métodos bioquímicos casi de manera exclusiva. Estas relaciones 1 0 sorprenden, debido a que la vida como se conoce 1 dcpende de reacciones y procesos bioquirnicos. De hecho, han caído las viejas barreras entre las ciencias de la vida y la bioquirnica se toma cada vez mas su lenguaje común.

Una relación recíproca entre la bioquímica y la medicina ha estimulado adelantos mutuos
Como se estableciii al principio de este capítulo, las dos preocupaciones principales de los estudiosos de

las ciencias de la salud, en particular médicos, son la comprensión y mnservacibn de la salud y la comprensión y tratamiento eficaz de las enfcmedades. !,a hioquimica tiene un impacto tremendo en ambos. De hecho, la interrelación entre bioquimica y medicina es un amplio camino de doble sentido. Los estudios bioquimicos han ilurriinado numerosos aspectos de salud y enfermedad y, de manera inversa, cl estudio de éstas ha abierto areas nuevas en bioquimica. En la figura 1-1 se muestran algunos casos de esta via de doble dirección. Por ejemplo, fue necesario el conocimiento de la estructura y Ilinción de las proteinas para dilucidar la sencilla diferencia bioquimica entre la hcmoglnbina normal y la de las células falcifonnes. Por otra parte, el analisis de esta última ha conwibuido de mancra significativa a la comprensibn de la estructura y función dc la hemoglobina normal y de otras proteínas. Podrian citarsc ejemplos análogos del beneficio reciproco entre bioquimica y medicina para los demhs pares de conceptos mostrados en la figura 1 -1 . Otro ejemplo es el trabajo pionero de Garrod, mkdico inglCs, a principios de este siglo. Estudió pacientes con cierto número de trastornos relativamente raros (alcaptonuria. alhinismo, pentosuria y cistinuria; descritos en loc últimos capítulos) y estableció que su origen era genciico. Garrod designb a estas enfemcdades como errores congdnitos del metabolismo. Sus punros de vista proporcionaron una base importante para el desarrollo del campo de la genktica bioquímica humana. La relaciún entre medicina y bioquímica tiene implicaciones filosóficas importantes para la primera. Hasta donde el tratamiento medjco se asiente en el conocimiento de la bioquimica y otras ciencias básicas pertinentes (como fisiología, microbiologia y nutricibn), la práctica de la medicina tendrá una base racional que puede acomodar nuevos conocimientos. Esto contrasta con culros de saliid no ortodoxos, que a menudo se elevan a poco más que un mito sin fundamento intelectual alguno.

Actdos nucEelc05

Proteína

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I t
MEDICINA

Lípidos

Carbohidratos

geneticas

Anemia de células
falciforme5

Aterosclerosis

Diabetes

sacarina

Figura 1-1. Ejemplos de la via de doble dirección (interrelación) que existe entre la bioquímica y medicina. El conocimiento de los Compuestosmostradosen la porci6n superior del diagrama ha esclarecido las enfermedades mencionadas en la porcion inferior; de manera inversa, análisis de los trastornos mostrados abajo han despejado numerosas áreas de la bioquimica Debe aclararse que la anemia de cklulas falciformes es una enfermedad genetica y que tanto la aterosclerosiscomo la diabetes sacarina tienen componentes geneticos

Bioquímicuy medicina

3

LOS PROCESOS BIOQU~MICOS NORMALES SON LA BASE DE LA SALUD
La Organización Mundial de la Salud (OMS) define a la salud como un estado de "bienestar fisico, mental y social completo y no unicamente fa ausencia de enferrnedad o dolencia". Desde un punto de vista bioquimico estricto, puede considerarse a la salud como la situación en donde las miles de reaccioiies intra y extracelulares que tienen lugar en el cuerpo proceden a velocidades adecuadas a su supervivencia máxima en el estado fisialogico. Sin embargo, este es un concepto sumamente reduccionista; es necesario enfatizar que atender la salud de los pacientes no sólo requiere de un extenso conocimiento de los fundamentos biológicos sino tambien de principios sociales y psicolbgicos.

Cuadro 1-1. Principales causas de enfermedad. Tcd a s las cairsiisenunieradas actiian bajo tia dt! varios rnecanisnl o s bioquírnicos t la o t:n el cuerpo*
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Agcnt cs f i s i c o s - ~ r a i i a t i s m or n e c á n i c o ~ tcinper aturas extremas, cambios repentinos cn la prcsióri atmosférica, radiacibn, choque elkctrico Aeente quirnicos y famacos: Ciertos comnuestos tvxicoc,, agentes terapéutica: ; etcétera , Agente hiológicos: Vinis. ri ckettsias, b lngos, fo rmas superiores de p! :~rásilos . ~ 5 i i c n c i de o~igeno: a Falta de Tumrnlsrro sangulneo, deficiencia en la capacidad sanpiiinea para t~mspori :ar oxigeno, intouicaciiin de las enzimns oxidativas Gen6tica: Alteraciones congenita~ r,,, on ~ oiies ininuiioliigicas: Anafilaxia nd nunológic; 1 iilihrio nut riconal: DÍ:ficiencia r :S,

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La investigación bioquimica tiene impacto en la nutrición y la medicina preventiva
Un prerrequisito importante en la conservaci6n dc la salud es la ingestión óptima de cierto numero de compuestos qufmicos; de entre ellos los principales son vitaminas, varios aminoficidos, &cidos grasos, minerales y agua. Dado que el objeto de la bioquimica y la nutrición es precisamente el estudio de los diversos aspectos de estos compuestos, hay una selaci~n estrecha entre las dos ciencias. AdemBs, con la intenci6n de restringir 30s costos en aumento del cuidado médico, se enfatizan los esfiierzos sistemáticos para conservar la salud y anticiparse a la enfermedad, es decir, la medicina preventiva. Por tanto, cada vez tiende a considermsc m6s el aspecto nutricional, por ejemplo, en la prevención de aterosclerosis y c h c e r . El conocimiento de la nutricibn depende en alto grado de la bioquimica.

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Dtsequilibrio en docrino: 1 >eficiencias o excesos hurmonates -* i\dapiado con autori7acion ae KObblnS SL,Colram RS,Kizmm

8.

V Tlie Pafhologic Rasis ojDtseasr, 3rd ed. Saunders, 19R4

a Io Eargo del libro. N o obstante, aquí se presentan s61o siete ejemplos breves para ilustrar la envergadura del tema y estimular e1 interés del lector. I) Los seres humanos deben ingerir cierto numero de rnol&culasorgánicas comple,ja~ llamadas vitaminas para conservar la salud. Si en la dieta hay deficiencia de determinada vitamina, se comprometen las reacciones en que participan. Esta situación puede manifestarse como una enfermedad por deficiencia como escorbuto o raquitismo (resultado de Ingestidn insufíciente de vitamina C y D, respectivamente). Dilucidar la actividad de las vitaminas o sus derivados con acción biolbgica ha sido una inquietud constante de bioquimicos y nutri6logos desde el principio del siglo. Una vez que el estado patologico por deficiencia de una vitamina se estableció, es racional tratarla mediante la administracidn de la vitamina apropiada. 2) El hecho de que numerosos vegetales en África son deficientes en uno o más aminohcidos esenciales (es decir, aminoacidos que deben ingerirse con los alimentos para conservar la salud) ayuda a explicar la desnutrición debilitante (kwashiorkor) que padecen quienes dependen de esos vegetales como fuente principal de proteínas. El tratamiento de deficiencias de aminoácidos esenciales es racional pero, desafortunadamente, n o siempre es posible. Consiste en proporcionar una alimentacibn balanceada que contenga cantidades suficientes de tales aminoácidos.

Todas las enfermedades tienen una base bioquímica Las enfermedades son manifestaciones de anorrnatidades de molécu tas, reacciones quimicas o procesos. En el cuadro 1-1 se enumeran tos principales factores como causa de padecimientos en el ser humano y los animales. Todos ellos afectan a una o más reacciones quimicas criticas Q rnaleculas del cuerpo.

Los estudios bioquimicos contribuyen al diagnóstico, pronóstico y trataltiiento
Existe un caudal de información respecto al uso de la b i a q u i m i c a e n la prevención, d i a g n ó s t i c o y tratamiento de la enfermedad; muchos casos se citarhn

3) Los esquimales Tnuit de Gruenlandia consumen cantidades abundantes de aceites de pescado ricos en ciertos acidos grasos poliinsaturadosy se sabe que su concentración plasrnática de colesterol es baja, lo mismo que la frecuencia de aterosclerocis. Estas observaciones han estimulado el interés en el uso de esos Bcidos para reducir los valores plasrná~icos colesteral. de Las enfermedades por deficiencia vitamínica o de aminoácidos esenciales son ejemplos de desequi librios nutricionales (cuadro 1 -1 ). La aterosclerosis puedc considerar~eun desequilibrio de la nutricjon, pero tambikn intervienen otros factores (corno el genético). 4) El estado conocido como fcnilcetonuria si no se trata, puede cotiducir en la infancia a retraso mental grave. Desdc 1953, se conoce la base bioquimica de este trastorno, el cual está. detcrminado gencticarnente y se debe a la actividad escasa o nula de la enzima que convierte el aminoácido fenilalanina en tirosina. Esto, a su vez, eleva la concentración sanguínea de fenilalanina, lo que dafia al sistema nervioso central en desmollo. Cuando se descubrió la naturaleza del daAo bioquímico, se trató la enfermedad haciendo que los lactantes afectados ingirieran una alimentación pobre en fenilalanina. Una vez que se dispuso de pruebas bioquimicas selectivas para diagnosticar feni lcetonuria al nacimiento, pudo instituirse el tratamiento desde el principio en el niño afectado. 5 ) La fibrosis quistica es una enfermedad genMica común de las glindulas exocrinas y las glhndtilas sudoríparas ecrinas. Se caracteriza por secseciones anomalmente viscosas que obstruyen los conductos secretores del phncreas y los bronquiolos. Ademhs. los pacientes con esta afección muestran una concentración elevada de cloruro en el sudor. A menudo, las víctimas mueren a temprana edad por infecciones pulmonares. En 1989, se inform6 sohrc el aislamiento y la secuencia completa del gen causante de esta enfermedad. El gen normal codifica una proteína transrnembrana (regulador de la conductancia transmembrana en la fibrosis quísticaj formada de 1480 arninoacidos, la cual funciona como un conducto del cloruro. En 70% de los pacientes con la enfermedad se ha observado una deleción de tres bases en el gen, lo cual hace que en la proteina transmembrana falte el aminoacido 508, un residuo de fenilalanina. Se esth determinando la forma en que esta omisión altera la hnciún de la proteína transmembrana con produccion de moco demasiado denso. Este importante estudio facilitarii la identificacion de portadores del gen de la fibrosis quistica y se espera que conducirá a un tratamiento rnás racional dc la enfermedad que el existente hasta ahora, Por ejemplo, quizfi será posible desarrollar fhrrnacos que corrijan la anor-

malidad en la proteina transmembrana; de igual modo, podría introducirse un gen normal en las células pulmonares por manipulaciiin genética. Ida fenilcetonuria y la fibrosis quistica son ejemplos de enfermedades g e i a i c a s (cuadro 1-1 ). 6) El análisis del mecanismo de accihn de la toxina bacteriana que causa el cálera ha proporcionado infonacibn importante sobre el modo en que ocurren las manifestaciones clínicas de la enfermedad (diarrea copiosa y pérdida de sal y agua). 7) El hallazgo de que los mosquitos transmisores de parásitos (plasmodios) que causan el paludismo pueden desarrollar resistencia bioquímica a la acción de insecticidas, tiene consecuenciac importantes s o b r e los intentos para erradicar esta enfermedad. Este caso y el anterior, son ejemplos de enfermedades causadas por agentes bioliigicos (cuadro 1-1).

Muchos estudios bioquirnicos aclaran mecanismos patológicos y, a su ver, las enfermedades inspiran estudios en áreas especificas de la bioquímica
Las observaciones iniciales reali~adas el mhdico por inglés Archibald Garrod en un grupo pequeño de errores congknitos del metabolismo al principio del decenio de 1900, estimulb la investigación de las vias hiliqiiimicas afectadas en estas alteraciones. Los esfuerzos para comprender la base de la enfermedad genktica conocida como hipercolesterr)lemia familiar, que lleva a aterosclerosis grave a edad temprana, condujeron al notable progreso en el conocimiento de los receptores celulares de los mecanismos de captación ddel colesterol por las cÉlulas. Los estudios actuales de los onrogenes en células cancerosas han dirigido la atención a mecanismos moleculares que interv-ncn en el control de la inultiplicacibn celular normal. Estos y otros numerosos ejemplos posibles ilustran la forma en que el estudio de la enfermedad puede abrir areas enteras de la funci6n celular para la investigación bioquimica bhsica.

ESTE TEXTO AYUDARÁ A RELACIONAR CONOCIMIENTOS BIOQU¡MICOS CON PROBLEMAS CL~NICOS
En cl texto se encuentran dispersas, breves descripciones de los mecanismos bioquímicos en que sc basan muchas enfermedades. En particular, las capítulos 63, 64 y 65 se refieren a las bases bioquimicas de varias enfermedades importantes. En el apcndice se analizan brevemente algunos conceptos basicos para interprctar los resultados de las pruebas bioquimicas de labo-

Bioyuimicu y medicina

5

Cuadro 1-2. Algunas investigaciones bialhgicas y pruebas de laboratorio aplicadas al estudio de las enfermedadi
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1. Revelar, ;I ,, ,, u Au,,uu,,,L,,,ules y los mccanicmos dc la enfermedad 2. Sugerir tratamientos racionales de las enfi con base en las causas mencionadas antes ( 3. Ayudar al diagnóstico de enfermedades especirlcas 4 , Actuar colmo pruebas para deteccibn y dlagnóstid:O tcmpranci dc ciertas cnfemedades 5 . Ayudar ein la vigilancia de le. evolucifin (por qemp,lo 111 ,,,,,,,,,cien, empeoramiento. remisibn o recaid,, de ciertas en remidades 6. Ay udar a evaluar la respuesta dc las cnfcrmedad
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ratorio y se presenta una lista de las mas empleadas junto con el intervalo en el cual varian sus valores normales. El propbsito global es animar at lector a dar a SU ~0nocitTlient0de bioquimica U n USO ~ l i n i c 0 eficaz.

Las inve~tigaciones bioquimicas en relacion con
las enfermedades se resumen en el cuadro 1-2. En

varias secciones de este libro se presentan ejemplos de muchos de estos usos.

RESUMEN
La bioquimica es la ciencia que se ocupa del estudio de las diversas molkculas que componen las células y organismos vivos así c o n o de sus reacciones quimicas, Debido a que la vida depende de estas reacciones, la bioquimica se ha convertido en el lenguaje b;isico de todas las ciencias biológicas. bioquímica se interesa en la totalidad de las forma? vivientes, desde virus y bacterias, relativamente simples, hasta les cornpIejos seres humanos.

La bioquimica y la medicina tienen una relacion estrecha. La salud depende del equilibrio armonioso de [as reacciones bioquimicas que tienen lugar en cl ,,,mo,. y la enfermedad en biornold~ulas, reacciones bioquimicas o procesos biológicos, Los adelantos en el conocimiento bioquirnico han iluminado numerosas áreas de la medicina. De modo inverso, a menudo el estudio de las enfermedades ha revelado aspectos previamente no sospechados de la bioquimica. Con frecuencia, un enfoque bioquímico es fundamental para aclarar las caus& de Ias enfermedades e idear terapéuticas E uso racional de varias pruebas bioquimicas de E laboratorio es un componente integral del diagnhstico Y vigilmcia Un conocimiento sólido de la bioquimica y de otras disciplinas bQsicasrelacionadas es esencial para la practica racional de la medicina y ciencias de la salud afines. I
+sadaiporpa

REFERENCIAS
Garrod AE: Inhorn errors of metabolism (Croonian Lec-

tures). Lance[ 1908;2: 1.73, 142,2 14. Kornberg A: Basic rssearch: The lireline of medicine
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RiornoAéculas y métodos bioquímicos

Este capitulo tiene cinca objetivos. El primero se refiere a la camposici6n del cuerpo y a las principales clases de moléculas que se encuentran en 61. El estudio de estas mol&culasconfonnagrnn parte de este texto. La ctluIa es la principal unidad estructural y funcional de la biología. La mayor parte de las reacciones químicas dentro del cuerpo tienen lugar en las c6lulas. Por tanta, el segundo objetivo es dar una descripci6n concisa de los componentes de las c&lulas y de la forma en que pueden aislarse; los detalles de las funciones de estos componentes constituyen gran parte de la estructura del libro. El tercer objetivo concierne al hecho de que la biquimica es una ciencia experimental. Es importante comprender y apreciar el enfoque experimental y los mbtodos usados en bioquimica, para permitir que su estudio se convierta en un ejercicio rutinario del aprendizaje. Más aún, la bioquímica no es un cuerpo inmutable de conocimiento, sino un campo en evolución constante. Los adelantos, como en otras lireas de la bioquímica, dependen de la innovación en el enfoque experimental y tecnológico. El cuarto objetivo consiste en resumir de manera breve los principales logros obtenidos en bioquímica. La visibn concisa de la ciencia, que se presentad aquí, ayudará a impartir en el lector un sentido de la direccibn global del resto del texto. El quinto objetiva se dirige a destacar lo poco que conocemos en ciertas Areas, por ejemplo, sobre el desarrollo, la di ferenciacidn y funcibn cerebral, el cáncer y muchas otras enfermedades humanas. Quizá esto sirva de estimulo a algunos lectores para contribuir a la investigacibn de estas Areas.

EL CUERPO HUMANO SE COMPONE DE UNOS CUANTOS ELEMENTOS QUE COMBINADOS FORMAN UNA EXTENSA VARIEDAD DE MOLÉCULAS
Los principales elementos san carbono, hidrágeno, oxígeno y nitrógeno
Se ha determinado la composición elemental del cuerpo humano y en el cuadro 2-1 se muestran los principales resultados. El carbono, oxígeno, hidrbgeno y nitrógeno son los constituyentes principales de casi todas las biomol&culas.El fosfato es un componente de los Iicidos nucleicos as1 como de otras moléculas y tambikn se distribuye ampliamente en su forma ionizada en el cuerpo humana. Por su parte el calcio tiene una funci6n importante en innumerables procesos biolbgicos y sobre él esta enfocada buena parte de la investigacibn. Los elementos enumerados en la tercera columna desempefían diversas funciones. Muchos de ellos se manejan casi diariamente en la prhctica mkdica al atender a pacientes con desequilibrios electroliticos (K', Na', C1- y Mg2+},anemia por deficiencia de hierro (Fe2+) y enfermedades de la tiroides (1-1.

Las cinco principales biomolécufas complejas son DNA, RNA, proteínas, polisacaráridos y Iípidos complejos
Como se muestra en el cuadro 2-2, las principales biomol~culas complejas encontradas en las células y tejidos de los animales superiores (incluyendo al ser humano) son DNA, RNA, proteínas, polisacfiridos

8

Biuqriim ica de Hrrrper

Cuadro 2-1. Composición ekemental aproximada del cuerpo humano (con base en peso seco)*
-

Carbono

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Azufre

Ovigeno I lidrógeno N itrógcno
alcio F.cjsforo

-- 0.00005 * Reproducido con autorizacibn de West ES. l o d d WR. T?xzbook
ofRiochcmist~. e d . Macmillan, 1961. 3rd

ques estructurales de los Iipidos, aunque éstos no son polimeros de acidos grasos. Al DNA, RNA, proteinas y polisacaridos se les conoce como hiopolimeros debido a que esthn compuestos de unidades repetidas de sus bloques estructurales (los mon6meros). Las rnol~culasantes mencionadas constituyen esencialmente el "ingrediente vital" de este texto; la rnayor parte se ocupa de describir sus características bioquímicas y las de sus bloques estructurales. Por lo general se encuentran las mismas moleculas complejas en los organismos inferiores, pero pueden diferir de los que se muestran en el cuadro 2-2. Por ejemplo, las bacterias no contienen giucogeno o triaci!gliceroles, pero poseen otros polisacaridos y Iípidos.

y lipidos. Lac moiéculac complejas se construyen a partir de biomoMculas simples, tainbien enumeradas. Los bloques estructurales del DNA y el RNA (Ilarnados colectivamente ácidos nucleicoc) son los desoxinucleótidos y los ribonucle6tidos, respcctivamente. Por su parte, las bases estructurales de las protehas con los arninoitcidos, mientras que los polisacaridos estan constituidos por carbohidratos simples; en el caso del glucógeno (polisacárido principal de los tejidos humanos), el carbohidrato es la glucosa. Los ácidos grasos pueden considerarse como los bloCuadro 2-2. Biomol&culas orghnicas comptejas principales de células y tejidos. Los &cidos nucleicos, proteinas y plisadridos son biopolimems, constrriidm a partir de las bases estructurales mostradas. Por lo general, tos lipidos no son biopolimaros y no todos tienen ácidos grasos como bases estructurates -. -. .
. ..

Proteínas, I ípidos, carbohid ratos, agua y minerales son los principales componentes del cuerpo humano
Ya se mencionb cual es la composici6n elemental del cuerpo humano. Su composición quimica se muestra en el cuadro 2-3; proteina, grasa, carbohidrato, agua y minerales son los elementos principales. E1 agua coristituye la proporción mayor, aunque su cantidad varia ampliamente en los difcrentes tejidos. Su naturaleza polar y su propiedad de formar puentes de hidrogeno hacen al agua idealmente adecuada para su función como solvente en el cuerpo. En el capítulo 3 se presentan con mayor detalle las propiedades del agua.

LA CÉLULA ES LA UNIDAD BÁSICA DE LA BIOLOG~A
La célula fue reconocida como la unidad fundamental de la actividad biológica por Schleidcn y Schwann y por otros pioneros como Virchow en el sigloXIX. Sin embargo, en los aRos posteriores a la Segunda Guerra

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Cuadro 2-3. Composici6n química normal d Sn que pesa 65 kg". . . -

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branas y almaccnaje por tiempo prolongado dc energía como triacil-

Milierales * Reproducido con

4. I i 51 - i SD, Parsmore R,- s .- ' I ación de D avidson : autor17

1

aliccroles

Hrock JF: Iiuman ,l'uiri rion and Di ererrcs, 5th ed. Churchill Livingstone, 1973. El valor para el agua pucdc variar ampliamente entre los riircrentes tejidos, siendo tan bajo como 22 5% para e l hueso sin mtdula Además, el porcentaje dcf agua tiende a disminuir confunnc alimenta 13 grasa curpura)

Biomoléculas y métodos hioquímrcos * 9

Mundial, tres sucesos ayudaron al inicio de un periodo de actividad sin paralelo en la bioquimica y la biologia celular. Fueron: 1 ) la disponibilidad creciente del microscopio electrónico; 2) la introducci~n rnktodos de que permiten separar las células bajo condiciones relativamente poco agresivas de modo que se preserve su función: 3) el desarrollo y disponibilidad de una ultracentrifuga refrigerada de alta velocidad, capaz de generar fuerzas centrífugas suficientes para aislar los constituyentes de las celuias separadas sin sobrecalentarlos y, por tanto, sin desnaturali7arlos. El uso del microscopio electrónico reve16 muchos de los componentes ce!ularec que hasta entonces eran desconocidos o deficientemente observados, en tanto que la rotura de las células y la ultracentrifugación permitió su aislamiento y anhlisis in vitro.

Retículo endopllrsmico

h

Citoesqueleto

El hepatocito de rata muestra características comunes a muchas células eucariotas
En la figura 2-1 se muestra un diagrama de la estrucmra de una ckIuEa hepatica (hepatocito) de rata; es

probabEe que ésta sea la célula m8s estudiada desde el punto de vista bioquímico, en parte por su disponibilidad en cantidades relativamente grandes, por su facilidad para fraccionarse y por la diversidad de siis funciones. El hepatocito contiene todos los organelos principales que se encuentran en [as células eucariotas (cuadro 2 4 ) ; es decir, niicleo, mitocondrias. retículo endoplásmico, ribosomas libres, aparato de Golgi, lisosomas, peroxisornas, membrana plasrnatica y ciertos elementos citotsque2eticos.

Membrana plasmalica

Peruxisoma

citoso1

Lisosoma

Figura 2-1. Representacibn esquematica d e una d l u l a hep8tica d e rata, con sus organefos principales

Para disgregar células y aislar moléculas intracelulares y organelos subcelulares se usan técnicas físicas
Para estudiar con profundidad la funcidn de cualquier organelo, es necesario primero aislarlo en forma relativamente pura, sin contaminacion importante de otros organelos. El proceso habitual para conseguirlo se llama fraccionamiento subcelular y, por lo general, comprende tres procedimientos: extraccibn, homogeneización y centrifugaci6n. Gran parte de los trabajos iniciales en esta irea utilizaron higado de rata.

A. Extracción Como primer paso hacia el aislamiento de un organelo (o molécula) especifico, es necesario extraerlo de las cAulas en que se localiza. La rnayoria de los organelos y muchas ~iomoleculas bastante Ihbiles y propenson sos a perder sus actividades biolbgicas. De acuerdo a ello, deben extraerse en condiciones poco agresivas

(es decir, usando soiuciones acuosas y evitando sitiiaciones extremas de pH, presibn osmótica y temperaturas altas). En realidad, muchos de los psocedimientos para aislar organelos se efectria aproximadamente entre 0 y 40 "C (por ejemplo, en un cuarto frlo o utilizando materiales conservados en hielo). A la temperatura ambiente puede haber pérdida significativa de la actividad, en parte por la acción de varias enzima5 digestivas (proteasas, nucleasas, etcktera), liberadas cuando se rompen las cdlulas. Una solución comun para la extraccion de organelos consiste en sacarosa 0.25 moVL (Esosmótica), ajustada a un pH de 7.4 con un amortiguador de hcido cIorhidrico-TRIS (tris [hidmimetil] am jnomewno), 0.05 moW, que contiene iones K' y Mg2' a concentraciones casi fisiol~gicas; esta solución se a le conoce con las siglas STKM (del ingles, Sucrosu, Tris, Kulium y Magnesiurn). No todos los solventes usados para la extraccibn son tan suaves como el STKM ; por ejemplo, para extraer lipidos y ácidos nucleicos se emplean solventes orghnicos.

10

Bioquimica de Harper

(Cupitulo 2)

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biut&nico d ~ h i d r o g ~ n ~ a Alta contenido de RNA
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lo c A ( t r r g osforilaci b n oxidativa-ASitio de la sínitesis protteí! icibn del mRNA a pro-

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Aparato de Golgi

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ieshidrogenasa .. - Citosol* 1 En:zlmas-ae !a gtuco~isis, ". síntesis de:-hcidos & * Un organelo se puedc dcfinir como una entidad suba:eEulwquue está limiida oormembranav se aislarior ccntxifupaci6n a altas .. ..
necesario pnr lo menos, c ierto numerci de ciclos. fracciones de citoesqueleto se pi ieden recont xer por mii:roscopia el carxteristicñs que contiei1P"

Oxidasa del Qido iirica e No tien! marcadc + 'OS'

LoS rihosomas unidos a la mernbrama son un tanite de síntesis proteinica Siritesis de varios Iípidas Ox idación de n u m e ~ o s o s ~ e n ~ i 6 t i ( c ist o c m m o _ i ~ 4 ~ o ~ co io dc almacenaje de muchas hiilrolasas (e e alizan reacciones deg: radativas) . insporte dc molCculm dentro y tiuera dc las herencxa y comunicacibn interce Di:jtribucion intracelular de protein Reacciones de glucosilac:i6n Reacciones de sulfatación gradación iie ciertos ácidos gracos y amino iducción y degtadrtcíiin de peroxido de h d ! .-crofilamentos, microtiÚbulos, filamentos intl
u

D acuerdo a Ia definicihn, los r i b m a 5 , ei crioesqueieto y ei citosoi no son organclos. Sin embargo, aqui se les considera junto con e ellos dehido a que, por lo general. también se aislan p r centrifugacibn F'ueden ctasiiiicarse comcb entidades ci fracciones subcelulares Un organelo al sisl arse por un ciclo ii c ccetrifug aci6n diferencial rara vi2s: es puro; 1Jara obtener una fraccib n pura, habi tudmente eS
por análisis

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oforesis de

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B. Homogeneización
Para extraer un organela (o biomolkcu1a) de las c&lulas, primero es necesario romperlas bajo condiciones suaves. Los 6rganos (hígado, rifion, cerebro) y las células que contienen se pueden separar de manera conveniente mediante el proceso de homogeneizacibn; éste consiste en girar manualmente o por medio de un motor, un agitador dentro de un tubo de vidrio de dimensiones adecuadas que contiene los fragmentos desmenuzados del &gano en estudio con un medio hornogeneizante apropiado como STKM. La rotacibn controlada del agitador ejerce una fuerza mechica en las dtulas y las rompe l i h d o sus constituyentes en la sacarosa. Resulta una suspensión que contiene muchos organelos intactos, la cual se conoce como homogenado.

C. Centn'fugacidn
El subfraccionamiento del contenido de un homogenada por centrifugación diferencial ha sido una tkcnica de importancia capital en bioquimica. El mttodo

clásico utiliza una serie de tres pasos de centrifugación diferencial, con velocidades sucesivamente mayores (figura 2-2) y cada uno produce un sedimento y un sobrenadante. El sobrenadante de cada paso es centrifugado en el siguiente. Este prmedimiento proporciona tres sedimentos, que son las fracciones nuclear, rnitocondrial y rnicrosbmica. Ninguna de las fracciones está compuestade organelos absolutamente puros. Sin embargo, se ha establecido con precisión por el uso del microscopio electrbnico y por mediciones de enzimas "marcadoras" adecuadas y de componentes químicos (por ejemplo, DNA y RNA) que los constituyentes principales de cada 1 de las 3 fracciones son nucleos, mitocondrias y microsomas, respectivamente. Una enzima o un compuesto químico "marcador" es aquel que esta casi exclusivamente confmado a un organelo particular, corno la fosfatasa hcida en los lisosomas y el DNA en el núcleo (cuadro 2 4 ) . Por tanto, sirve para indicar la presencia o ausencia, en una fracción determinada, del organelo en el que esth contenido. La fraccibn microsbmica (mi-

Biomol~culus métodos biquimicos y

JI

Sobrenadante (1)

-

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Sobrenadante (3)

15 o00 g x 5

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min

Fraccibn
nuclear

Fraccibn microsbmica

Figura 2-2. Esquema de separacibn de fracciones cubceluTares por centrifugaeibn diferencial. fl tejido hornogeneuado (por ejemplo, hepfitico) se sujeta primero a centrifugacibn a bala velocidad para obtener la fraccidn nuclear (que contiene tanto núcleo como dlulas enteras) y el sobrenadante (1). Este ultimo se decanta y sujeta a centrifugacion a veloadad intermedia para producir la fraccibn mitocondr~af (que contiene rnitocondrias, lisosomas y peroxisomas) y el sobrenadante (2) este se decanta y sujeta a centrifugacibna alta velocidad para obtener la fracción microsórnica (que contiene una mezcla de ribosomas libres y reticuio endoplAsmico liso y rugoso) y una soiucibn final clara, el sobrenadante (3). Este último corresponde aproximadamente al citocol o savia celular. Modificando de varias maneras el mktodo, por lo general, es posible aislar mda organelo en forma casi pura

crosomas) contiene principalmente una mezcla de

reticulo endoplásrnico liso, retículo endopliismico rugoso (es decir, que tiene adheridos ribosomas) y rEbosornas libres. E! contenido del irltimo sobrenadante corresponde a la savia celular (citosol). Las modificaciones a este proceso bácico, que utilizan medios diferentes de homogeneizacibn o protocolos distintos de centrifugacion (por ejemplo, el uso de gradientes, continuos o discontinuos, de sacarosa), han pem itido el aislamiento, en fonna más o menos pura, de todos los organelos ilustrados en la figura 2-1 y enumerados en el cuadro 2 4 . El esquema descrito anteriormente es aplicable en tkrminos generales a la mayoría de los 6rganos y las dlulas; sin embargo, los fraccionamientos celulares de este tipo deben ser valorados con mediciones de enzimas o de compuestos químicos marcadores y por el rnjcroscopio electrónico, hasta que el procedimiento global pueda considerarse estandarizado. La importancia de los estudios d e fraccionamiento subcelular en el desarrollo de la bioquímica y la biologia celular, no se exagera por su enfoque experimental y amplio uso, constituye una parte fundamental en el estudio de las funciones de los organelos celulares. La infomaci6n de estas funciones, resumida en el cuadro 2 4 , representa uno de los mayores logros de la investigac i 6n bioquimica (vkase despubs).

El enfoque experimental tiene tres componentes
Los componentes principaEes del enfoque experimental son tres: 1) el aislamiento de biomoldculas y organelos (vdase Centrifugación, antes) contenidos en las células; 2) la deteminacibn de la estructura de las biomoléculas, y 3) el aniilisis, utiIizando diversas preparaciones, de la funcion y el metabolismo (es decir, sintesis y degradacibn) de las biornoltculas.

El enfoque experimental requiere del aislamiento de biomoléculas
Como en el caso de los organelos, conocer la funci6n de cualquier biomoidcula requiere que primero se le aisle en fonna pura. En el cuadro 2-5 se resumen los mktodos principales empleados para separar y purificar biomolkculas. Aquí no se detall&, pero algunos se explicarán de modo breve en otras partes del libro. Para purificar una biomol&culase necesita casi siempre una cornbinaci6n de mitodos hasta lograr la homogeneidad (la forma pura sin contarninacibn por cualquier otra biomolécula). Es importante apreciar que los adelantos en bioquimica dependen del desarrolIo de ttscnicas nuevas

C u a d r o 2 -5. Prin cipales nmbtodas risados p ara separar y purificar biamoléc:ulas. Mu chos de e 110s son adecu:ados paríi analiza t los comr)orientes i4 "e 1 -- -... 1 - v _ - ..-existen en ius extractos celulart.~ eii virus matcriales bioq uimicos. El uso en secuenciaI de varias d e estas tbcnicas permiitirA, por 1 general1, la purifíca0 cihn de In mmJaJ,,s ,a de las bilirliurrcuid~.Para maY ores deta lles respt: ~ f a cadla uno de los rnétodos d e investig,aci6n bioquimica, el lector d ebe dirigiirse sI los texto1 especiallimdos s . ..-

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CYuadro 2- 6. Principiales meto determinacibn de la1s estructi
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Fraccionarniento srli no (por ejemrnyilo, prec sulfato d :amonio) c Cromatogt-afia

En papel Por intercambio ibnrco (intercan Por afinidad En capa fina Gas-l1qu1 do En fase li quida a alt
Filtración itn gel Electroforr:sis

Anaiisis cielncntñl. .... ... Espectroscopia ultrnvioleta, visilsle, infrarr o,ja y de resonancia magnética nuclear (RMt'4 Uso de hidrólisis ácida o alcalina para degrasdar la hiomolecula balo estudio en sus const,,,,,,,,,, 1 so de una serie dc enz ¡mas de esplecificidad conocidapara 1 degradar la biornolrScula (por ejemplo, piroteasas, r1 ucleaqas o glucosidast 1s) ~spectrometria mas: de Mdtodos es[)ecificos para secuenciaci6n (por cjcmplo, de protcinas o de ácido: ; nucleicos;b Cristalografiia de rayos X m m

En papel Con alto vvltaje En agarosa En acetato de cclulosa En gel de almidiin En poliacrilamida Poliacrilamida y dot
I!ltracentrifugacibn

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sódico (S1

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de anliIisis, purificacibn y determinación de estmcturas. Por ejemplo, el campo de la bioquimica de los Iípidos avanzó con rapidez gracias a la introduccibn de la crornatografia en capa fina y gas-liquido. El anklisís de la membrana y de muchas proteínas era extremadamente dificil hasta la introducción de la electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (EGPASDS); el detergente dodecilsulfonato sódico permiti6 la "solubilización" para la electroforesis de muchas proteinas que antes no habían logrado disolverse. Asimismo, el desarrollo de métodos para la secuenciacihn y clonacion del DNA ha tenido un efecto revolucionario en el estudio de los ácidos nucleicos y de la biología en general.

biornoléculas. El lector con algunos conocimientos de química orghnica los encontrara familiares. Ciertas enzimas cuya especificidad se conoce, son medios muy poderosos para revelar estas caracteristicas estructurales. El perfeccionamiento en la resolución respaldado por los adelantos tebricos y tecnolbgicos, está convirtiendo cada vez más a la espectrometria de masa y a la de resonancia magnetita nuclear (RMN), en los métodos de elección rutinarios para estos analisic. Las estructuras de las cadenas extremadamente complejas de los carbohidratos contenidos en ciertas biomoléculas, como las glucoproteinas, se pueden ahora aclarar por la elevada resolucibn de la espectrometría RMN. Una infomacion m8s detallada se logra con la difraccibn de los rayos X y la cristalografia. Su uso fue decisivo para revelar las estructuras dctalIadas de varias proteínas, enzimas y la naturaleza de la doble hélice de DNA.

El enfoque experimental requiere análisis de la función y metabolismo de biomoléculas, utilizando varias preparaciones
La investigacihn bioquímica inicial en el ser humano y los animales se hizo con el anima1 intacto. Son ejemplos los estudios de la respiracibn y el destino de las sustancias ingeridas. Pronto se descubri6 que el animal íntegro erademasiado complejo para permitir dar respuestas definitivas a numerosas interrogantes. En concordancia, se hicieron preparaciones más sencillas in vitro, que eliminaron muchas de las complicaciones experimentadas con el animal intacto. El cuadro 2-7 resume los diversos tipos de preparaciones de que se dispone ahora para estudiar los procesos bioquimicos; la mayosia de tos conocimientos presentados en este texto se han obtenido gracias a su uso. El enlistado se

El enfoque experimental requiere la determinación de la estructura de biomole~ulas
Una vez que una biornoIecula ha sido purificada es necesario determinar su estnictura. De este modo puede hacerse una correlacion entre estnictura y función. En el cuadro 2 4 se enumeran los metodos principales en uso para analizar la estructura de las

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rueaen sc. 1. Bxtirpaci6n de un 6rgano (por ejemplo. hepatectomia) 2. Alteraciones en la alimentación (por qjemplo, ayuno-posprandial) 3. AdministraciOn de un fármaco (por ejemplo. fenobarbital) 4. Administracihn de una toxina (por qemplo, tetracloruro dc carbono) 5. uso de iin anirrial cori una enferrned:id especific:a (por cjernplo, diabc:tes sacarina) 6. Emp leo de tecn icas sofistjcadas corrio espectri3scopia R:MN y tam ografia po:r emisibn dc nositrones .. ' Los Cstiid~ub- - .-. ~ v c sur1 a rricnriuu iibiuiugicoh, pcru uueucri x r uiliciics CYCirricruretar debido achrc n i a la intcracción orgánich mediada por la circulacion ia . . . . -- - nervioso1 central - . En particular higado, ~oraz6n rifiiin son adecuado: y Este método .. -- permite el estudio de un organo aislado de la influencia dc otros o dcl sistema nervioso Especfalnnente se ha n usado cortes de tejido hephtict) Aislíi los cortes tisu1ares de otras influencias. pero lar; preparaciimes tiende o . . de alguna1s heras, cn parte debido al suministro inadecuado. . . . . . . -. . . . ac nutrientcs i . Aplicable en particular a lm células sanguínea, que pueden ser purificad 7.En m u c h a breas de la biología son indispensah-los culi-. -.de teji les - ivos . - . t . Asegura una prcparacibn qiie no contiene cklul;Ls .. ... :... .,. nur ui~hisisi ehrudiar sus ... 2. Pueden agregarse o removerse comnuestos esneciiiuis rnor eiemniri. v
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OrganeIos cetulares - aislados . -ente usadoS, por ejemplo, en cstudios de la funcibn mitocondrial Subfraccionamiento de organelos .... ... .... Aislamiento aci=. t= rc v irni uLi aiiálisis de cualquier reacciiin o vía quirnica pai ri~ación :metabulidi tos - y emirnas " . Clonacidn de genes qu~ t aislamiento del gen clonado es esencial para cstudtar los detalles de su estructura y rcgulaclbn: l It la enzimia o proteinla n la que 1 codifican r t ambitn iuede revel ar b secuencia de a m
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.3. Pucdc ser subfraccionado por centrifugacibn pa.ra pproduciir orgnnelos: celulares i .- -s, para estud i la~ func ~ b de mitricondrias, r*eticuIoencloplásmico n Ampliamente usados

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presenta en orden decreciente de complejidad. Igual que el uso de animal integro tiene desventajas, las demás preparaciones tambiéin tienen sus limitaciones. De los procesos usados in vitro pueden derivar resultados erroneos (artefactos); por ejemplo, E homoa geneizacién de las células puede liberar enzimas que digieran parcialmente a las moléculas celulares.

reacciones responsables de la síntesis de un com-

puesto complejo a partir de uno o miis compuestos simples o de la degradación de una sustancia hasta su producto final. La existencia de un proceso bioquimico complejo o de cienas vias metabhiicas puede inferirse de las observaciones a nivel del animal intacto. Por ejemplo, observaciones directas de nuestros congeneres indican que los músculos se contraen. Sabemos que la glucosa sirve como fuente de energia para el ser humano y otros animales; por tanto, podemos deducir que debe ser degradada (metabolizada) en el cuerpo para producir energia. Sin embargo, la comprensi6n total de la forma en que la glucosa se metaboliza en las cklulac humanas -su conocimiento está aún lejos de ser completo- se requieren anhlisis a diferentes niveles. Lafiqura2-3 muestravarios tipos de observaciones y anhlisis utilizados en un intento por comprender los procesos bioquimicos, como la degradación inicial de la glucosa para producir ener-

LAS ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO DE REACCIONES BIOQU~M~CAS COMPLEJAS SON Y EN MÚLTIPLES NIVELES
Gran parte de esta obra se dedica a los procesos bioquimicos complejos (por ejemplo, slntesis de proteinas y contracción muscular), incluyendo las vías rnetabólicas. Una vía metabhlica es una serie de

14

Bioquimiccr de Hurper

(Capituio 2)

gia (proceso conocido como glucblisis). El esquema de la figura 2-3 se aplica en un nivel general a todos los procesos bioquimicos principales por lo cual representa una estrategia global para diIucidarlos; cada uno de los procesos (glucblisis, oxidación de los Acidos grasos, etcétera) debcdn tenerse en mente al estudiar el texto, aunque no siempre encontrarán lugar todos los puntos mencionados. Algunos puntos importantes del cuadro 2-7 y de la figura 2-3 ameritan discusión. 1) A pesar de la posibilidad de artefactos, es absohtamente necesario aislar e identificar cada uno de los componentes de un proceso bioquimico en forma pura para comprenderlo a nivel molecular. Más adelante se encontrarán numerosos ejemplos de esto. 2) También es importante ~ o d e reconstituir in vitro el vroceso en estudio. mer diante el ensamblaje sistemático de sus componentes individuales. Si el proceso no se realiza al ser reensambladas sus partes, una explicacibn puede ser que algun componente critico ha escapado a la identificaci6n y, por tanto, no se ha afiadido. 3) Los adelantos tecnologicos recientes (por ejemplo, en espectroscopia RMN y en tomografia por emisión de positrones [TEP]) han permitido la detección de ciertas biomoléculas a nivel del &gano intacto y la vigilancia de Eos cambios en sus cantidades con e1 tiempo. Estos desarrollos indican que se esti haciendo posible efectuar anhlisis sofisticados de muchos procesos bioquímicos in vivo. 4) Cuando los resultados obtenidos con el uso de varios planteamientos a diferentes niveles son congruentes, entonces sejustifica concluir que se ha logrado un progreso real en la comprensión del proceso bioquímico en estudio. Si utilizando diversos enfoques, se obtienen incongruencias imporiantes, en toncesdekn inrestigme sus causas hastaobtener explicaciones racionales. 5 ) Las preparaciones y niveles de anhlisis delineados pueden utilizarse para estudiar alteraciones bioquimicas en animales con estados metabólicos alterados (como ayuno o ingestión de alimentos) o enfermedades especificas (por ejemplo, diabetes sacarina, o cincer). 6) Muchos de los mktodos y enfoques indicados pueden aplicarse a estudios de ctlulas o tejidos humanos normales o enfermos. Sin embargo, debe tenerse cuidado de obtener material fresco y prestar atención particular a las consideraciones tticas que se aplican a la experimentaci6n en el ser humano.

Deduccibn de la existencia del proceso bioquímico de la vla metabólica por las observaciones hechas a nivel del animal intacto

&
Anhlisis de sus mecanismos de control in vrtro

J
Anhlisis de sus mecanismos de mntrol in vivo

.1
AnBltsis de bc efectos de enfermedades específicas sobre di (por epmpio. errores cong8nitos del metahlismo. cáncer)

&
SU locallzaubn en uno o mas brganoc

1
Su localizacibn en uno o mAs organelos celulares o fracciones sub-

celulares Determinación del número de reacciones que intervienen en 81

3.

4
Purificación de sus susb-atos. productos, enzimas y uifactores individuales u otros componentes

&
Establecimientode los mecanismos de control utilizados en él

.1
Su reconstruccibn

L
Estudios del proceso o vla a nivel genbnm por los mktodos de la tecnología del DNA recombinante

Figura 23. Esquema de la estrategia general utilizada para analizar un proceso bioqulmim o una vía metabblica. Los planteamientos enumerados no necesrtan efectuarse obligadarnente en la secuencia precisa indicada aquí Sin embargo, por lo general mediante su uso se han dilucidado los detalles de los procesos o vías bioquimicos Por tanto, &te es el esquema que se aplica de modo común a M a s las vias rnetabblicas principales explicadas e n los capítulos siguientes

Los Esótopos radiactivos pesados han contribuido de manera importante en el ecclarecimienta de procesos bioquímicos

La introduccibn del uso de isbtopos en la bioquimica en el decenio de 1930 tuvo un impacto notable; en consecuencia, su uso merece discusibn especial. Antes de su empleo, era muy dificil "marcar" las biomo-

Itculas de modo que sus destinos metabblicos pudieran vigilarse de modo conveniente. Los estudios iniciales, en particular los de Schoenheimer y sus colaboradores, se aplicaron a la utilización de ciertos isótopos estables (por ejemplo, D2 y NI5)combinados con su identificación por espectrometría de masa, para dilucidar muchos problemas bioquimicos. Por ejemplo, pudieron sintetizarse varios arninoAcidos, azúcares y iicidos gsasos que contenian un isótopo estable adecuado y, entonces, administrarse a un animal o agregarse a una preparacibn in vitro para trazar su destino metabólico (por ejemplo, vidas medias y conversi611 a otras biomoltculas). Los compuestos marcados con is6topos estables se utilizaron para investigar muchos aspectos del metabolismo de proteinas, carbohidratos y lipidos. De estos estudios, se dedujo que el metabolismo es un proceso muy activo, en donde E mayoría de los compuestos en una cdlula a se estan sintetizando y degradando de manera continua, aunque a velocidades que difieren amplia-

mente. Schoenheimer llam6 a estos hallazgos "la
naturaleza d i n h i c a del metabolismo". La introducción subsiguiente de los is6topos radiactivos y de instrumentos capaces de medirlos también fue muy importante. En el cuadro 2 4 se muestran los isdtopos principales, estables y radiactivos, usados en los sistemas biológicos. El uso de los dos tipos de isótopas es decisivo para el desarrollo de cada irea de Ia bioquimica. La investigación de las biomoléculas complejas y simples, in vivo o ipi vim, se apoya fweftemente en su empleo. El gran avance logrado en la secuenciacib de los hcidos nucleicos y en la rnedici~n de cantidades extremadamente pequeflas de compuestos que se encuentran en los sistemas biolbgims se debe a la radioinmunovaloración que también utiliza isotopos.

LOGROS IMPORTANTES CARACTERIZAN LAS CONTRIBUCIONES DE L A BIOQU~MICA LA CITOLOG~A A Y A LA MEDICINA
Los siguientes piirrafos resumen los descubrimientos principales en el campo de la bioquimica, en particular en relacibn con la bioquimica humana. Gran parte de este texto desarrolla los temas que aquI se enumeran.

1) Se ha determinado la composición quimica global de c&lulas,tejidos y 6rganos; los compuestos principales se han aislado y sus estructuras se han
establecido.

2) Se comprenden, por la menos a un nivel general, las funciones de muchas biomoléculas simples, las
cuales se describirhn en los capitulas subsiguientes. Tambitn se han establecido las funciones de biomol&culas complejas. Es de capital interks el conocimiento actual de que el DNA es el material gendtico que transmite s información a un tipo de u RNA (RNA mensajero, o mRNA) y este RNA a su vez dicta la secuencia lineal de los aminoácidos en

las proteínas. E! flujo de 3 información del DNA a puede ser representado convenientemente como DNA +RNA -+ proteina. Sin embargo, se conocen excepciones importantes de algunos de los enunciados anteriores. El RNA es el material gendtico de ciertos virus. Además, en algunas circunstancias la información contenida en el RNA puede transcrjbirse al DNA; este proceso se conoce como transcripción inversa y es usado, por ejemplo, por el virus HIV-1 (virus de inrnunodeficiencia humana-1), causa posible del SIDA. 3) El desarrollo de la tecnología del DNA recornbinante constituye un logro fundamental. Esta tecnologla revolucion6 el estudio de la estructura y funcibn de los genes y también tuvo un impacto revolucionario en todos los campos de la biologia, incluyendo la medicina. 4) Se han aislado los principales organelos de las células animales y establecido sus funciones principales. 5) Se sabe que casi todas las reacciones que tienen lugar en las células son catalizadas por enzimas; muchas de estas han sido purificadas y estudiadas y se han descubierto las caracteristicas generales de sus mecanismos de acción. Aunque la mayoría de las enzirnas son proteinas, en la actualidad se ha establecido de manera firme que ciertas moldculas de RNA tambidn tienen actividad biocatalitica. 6) Se han delineado las vías membólicas que intervienen en la síntesis y degradacibn de numerosas biomolCculas simples y complejas. En general, se sabe que 1a vía de sintesis de un compuesto es distinta de su via de degradacion. 7) Se han esclarecida algunos aspectos de la regulacidn del metabolismo, 8) Se han reconocido las características generales de la forma en que las cClulas conservan y utiIizan la energia. 9) Se comprenden muchos aspectos de la esmctura y funcion de las diversas membranas encontradas en la ctlula; sus componentes principales son proteínas y lfpidos. 1(3 Se dispone de información importante a nivel general sobre el modo de accibn de las hormonas. 1 )Se han descubierto las bases bioqufmicas para un 1 número considerable de enfermedades.

g. Isatopo,S princip investigaici6n bioc
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QUEDA MUCHO POR APRENDER
Aunque es importante saber que es mucha la información que se ha acumulado, tiene igual relevanciaapreciar lo escaso del conocimiento en numerosas areas. Probablemente los dos problemas principales por resolver
respecto al establecimiento de sus bases bioquirnicas son el desarrollo, la diferenciacibn y la función cere-

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41:

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bral. Si bien está perfectamente asentada la naturaleza quimica del material genético, casi nada se sabe acerca de los mecanismos que activan y desactivan a los genes eucariotas durante el desarrollo. Comprender la regulación génica es tarnbitn un &ea clave en el aprendizaje de la forma en que las células se diferencian y toman cancerosas. El conocimiento de la división y el crecimiento celular -tanto normal como malignoy su regulaci6n es muy primitivo. Virtualmente nada se sabe can respecto a las bases bioquimicac de fenómenos neurolbgicos complejos como la conciencia y la memoria. Sólo se riene informacibn muy limitada de los mecanismos de la secrecion celular. A perar de cierto progreso, se desconocen los fundamentos moleculmes de la mayoria de las enfermedades genéticas principales, pero las tentativas proporcionadas por la tecnología del DNA recombinante sugieren que en los próximos afios se logrará un progreso notable en esta hrea. Es posible que en el año 2005 o antes se logre conocer la secuencia del genoma humano; la informacihn disponible gracias a este esfuerzo masivo tendrh un impacto tremendo sobre la biologia humana y la medicina.

pueden separarse por fraccionamiento subcelular y, de este modo, estudiar sus fiinciones en detalle. El avance de la bioquímica ha dependido del aislamiento de biomolkculas celulares. de la dcterminación de sus estructuras así como del an8lisis de su funcibn y metabolismo. Para investigar la estructura, funci6n y metabolismos d e las biomoléculas se han utilizado diferentes planteamientos, desde el anima! íntegro al gen aislado. En particular, el uso de isotopos. tanto estables como radiactivos, ha tenido tremenda importancia en el adelanto del conocimiento hjoquímico. La representacihn:

Transcripcibn

Traslación RNA-Proteina

DA N-

RESUMEN
El carbono, oxígeno, hidrógeno y nitrbgeno son los constituyentes principales de gran parte de las biomoléculas. Ademls el calcio, fbsforo, potasio, sodio, cloro, rnagnesio, hierro, manganeso, yodo y otros elementos tienen gran importancia biol6gica y medica. El agua, DNA, R N A , proteínas, polisacaridos y lipidos son las moléculas principales de células y tejidos. Las células son las unidades biolbgicas hndamentales. Contienen v e o s organelos que desempeiian numerosas funciones especializadas. Estos organelos

resume la fuerza propulsara de gran parte del esfuerzo contemporáneo en bíoquímica. No obstante, se han hecho muchos otros avances en el conocimiento de la bioquimica, como la apreciacibn de la ~omposicibn corporal y la comprensibn parcial de estructuras y funciones de enzimac, hormonas y membranas. Se han descubierto las bases bioquímicas y genéticas de numerosas enfermedades y la aplicación reciente de la tecnología del DNA recombinante ha acelerado enormemente el progreso en esta área. Sin embargo, aún es mucho lo que se desconoce; los retos principales para el futuro incluyen definir ("mapear") el genorna humano y proporcionar explicaciones moleculares de los mecanismos que intervienen en el desarrollo orghnico, la diferenciacibn celular y !a función cerebral. M

REFERENCIAS
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1994.

Victor W. Rodwell, PhD

Ld5 biomolecula~ polarcs orghicas e inorgánicas de 1% células vivienles existen y reaccionan de manera priniariri en un ambiente acuoso El agua, una molécula y notable esencial para la vida, solubiIi75~ modifica las características de biomoléculas coino hcidos nucleicos, protcinas y carbohidratos al formar puentes de hidr6geno con sil? grupos fi~nciotiales.Estas interacciones mridifican las propiedades de las biomoléculas y si15conformaciones en solucicin. ],os cambios le dan a las molkciilas ias propiedades esenciales para el ciclo de la vida. [,si$ biornoléculas -aun aquéllas relativamei1:e no pulares, tales como ciertos lipidos- tambiéti inodificw las propiedades del agua La comprensión de 3us mecanismos honieostáticos utilizados por los organismos para conservar un entorno intraceliilar relativamente constante debe considerar el pH y el amortiguarnierito en liquidos corporales y compartimienlos siibcelulares. Por ultimo, el comportamiento de disociación de los gmpos funcionales de biomol~culas soJuci6n acuosa a diversos valores en de pH e? critico cn la comprensióti de sus reacciones y propiedades tanto en células vivas corno en el laboratorio

IMPORTANCIA B I O M ~ D I C A
Ida homeostasis, conservaci6n de la cornposic~ón del rnedio interno que es esencial para la salud, incluye considerar la distribucihn dcl agua en el cuerpo y la preservaci~n del ptl así como de concentmciones clecirol iticas apjopiadas. Dos terceras partes del agua corporal total (55 a 65% del peso corporal eri varones y alrededor de 10% menos en mujeres) cs liquido intracelular. Del liquido extracelular remanente, el plasma sanguineo constituye cerca de 25 por ciento.

La regulaciiin del equilibrio hídrico depende de mecanismos hipcitaláinicos para controlar la sed, de la hormona aiitidiurdtica y de la retención o excrecion del agua por los riilones. 1.0s estados de depleción de agua y exceso de Iíqiiido corporal son bastante comunes. En inuchos casos se acompañan de deficiencia o exceso de sodio. Las causas de dealecibn hidrica son a una disminución de la ingestión (por ejemplo, en estados de coma) e increniento de la perdida (por ejemplo, perdida renal en la diabetes sacarina, cuthnea por sudaciún intensa y gastrointestinal eii diarrea intensa en lactantes y en ctilera). Las causas de exceso de agua corporal se deben al incremento en la ingertión (por ejemplo, excesiva administración de liquidos IV) y excrecibn escasa (por ejemplo, en insuficiencia renal grave). Ciertos niecanismos osrnóticos y no osmóticos protegen el agua y la htirneostasis osrn0tica del liquido extracelular. Tanto la conservacibn del agua por la atitidiuresis como la ingestihn de liquido por la sed, sirven para mantener la homeostasis. Incrcmentos tan pequefios como 2% en la osmolaridad del liquido r:xtraceluIar pueden provocar sed y Iiberacihn de liorniona antidiurética (ADH) en la hipáfi~is.Un mecanismc) algo menos sensible desencadena la Iiheración no osmólica de ADH y la sed, cuando disminuye 10nA volumen de liquido circulante extracelular. La el diabetes insípida nefrogeiia, de origen genético, se caracteriza por sed extrema, ingest icin abundante de agua e incapacidad para concentrar la orina o para responder a cambios sutiles en la osmolaridad de liqiiido extracelular; esto se dehc a la incapacidad de los osmorreceptores de ADH en los túbulos renales para responder a la ADH. La conservación del liquido extracelular dcntto de un p1-E entre 7.35 y 7.45, cn donde el sistema amortiguador de bicarbonato tiene una funcihn importante, es cscncial para la salud. Las alteraciones del equilibrio acidobásico se diagnostican en el labora-

torio clínico por medicibn del pH de la sangre arteria1 y el contenido de COZde la sangre venosa. Las causas de la acidosis (pH sangutneo < 7.35) incluyen cetoacidosis díabdtica y acidosis 1Actica; m e t a que las de inrs la alcalosis (gH sanguineo > 7.45) comprenden el vbmito de contenido ácido gástrico o el tratamiento con ciertos diun5ticos. Un diagnóstico preciso y un rápido tratamiento del desequilibrio hidrico y de las alteraciones acidobiisicas se apoyan en gran medida en la comprensi6n de los conceptos considerados en este capitulo.

de hidrógeno escasos en electrones forman una regi6n de carga positiva local. El término "dipoEoV se refiere a moléculas como el agua que tienen carga electrica (electrones) distribuida en forma desigual alrededor de su estructura.

El amoniaco también es dipolar y tetraédrico
En el amoniaco, los angulos de enlace entre hidrbgenos (107 grados) se aproximan al ángulo del tetraedro aun miis que en el agua (figura 3-2). Muchos compuestos químicos son dipolos. Entre ellos se Incluyen alcoholes, fosfollpidos, aminohcidos y hcidos nucleicos.

EL AGUA ES UN SOLVENTE BIOLÓGICO IDEAL El agua es una molécula tetraédrica ligeramente asimétrica
La molCcula del agua es un tetraedro irregular con oxígeno en el cenúo (figura3-1). Los dos enlaces con hidrbgeno se dirigen hacia dos vértices del tetraedro, en tanto que los electrones no compartidos del oxigeno en el orbital 2sp3 híbrido ocupan los dos vertices restantes. El ángulo entre los dos Atomos de hidrogeno (105 grados) es algo menor que el Angulo del tetraedro (109.5 grados), formando una figura geomdtrica ligeramente asimktrica.

LAS MOLÉCULAS DE AGUA FORMAN PUENTES DE HIDRÓGENO
Los puentes de hidrogeno confieren una estructura macromolecular
Debido a su caríicter dipolar, las moléculas de agua pueden asumir conf~rtmaciones ordenadas (considerese un copo de nieve). Al igual que el hielo, el agua liquida muestra una estructura rnacromolecular ankloga a la disposicibn ggeom&tricade las molkculas de agua en el hielo. La propiedad de las moltculas de agua de unirse unas con otras tanto en estado líquido como sblido surge del carhcter dipolar del agua. Se conserva como liquido más que como sblido debido a la naturdeza transitoria de estos complejos macromoleculares (la vida media de asociacibn-disociacidn de las moléculas de agua es de alrededor de un microsegundo). En estado sdlido, cada moltcula de agua se une con otras cuatro. En estado liquido, el número es algo menor (mlis o menos 3.5). Con excepcibn de

Las rnoléculas de agua forman dipolos
Debido a la estructura tetraédrica asimktrica, la carga eléctrica no se distribuye de manera uniforme alrededor de la moltcula de agua. El lado de1 oxigeno opuesto a los dos hidrbgenos muestra cierta riqueza de electrones, en tanto que del otro lado, los núcleos

Figura 3-1. Estructura tetrabdrica del agua

Flgura 3-2. Estructura tetraMrica del amoniaw

Agua y pH

a

19

la naturaleza transitoria de las interacciones intermoleculares en el agua liquida, ksta se parece al hielo en su estructura macromolecular mSis de lo que en un principio se imaginaba. El cariicter dipolar de las moldculas de agua favorece los enlaces mutuos en conformaciones ordenadas con una geometría precisa dictada por la configuracibn interna de cada molécula de agua (figura 3-3). La interacción electrostAtica entre el nijcleo de hidrdgeno de una moldcula de agua y el par de ekctrones no compartidos de otra se denomina puente de hidrógeno. Comparados con enlaces covalentes, los puentes de hidriigeno son bastante debiles. Romper un enlace de hidrógeno en agua Iíquida requiere alrededor de 4.5 kcal de energía por mot -más o menos 4% de la energía que se requiere para romper el enlace O-H del agua ( 1 I O kcal/mol).
Los puentes de hidrógeno estabiliran proteínas y ácidos nucleicos
En tanto que el metano (peso molecular 16) y el amoniaco (peso molecular 17) son gases a la temperatura ambiente, e l agua (peso molecular 18) es un liquido. ¿Por quc es ast? L a respuesta se apoya en la capacidad del agua para formar puentes de hidrogeno, lo cual explica tambien su viscosidad y su tensibn superficial relativamente altas. La propiedad del agua de servir como solvente para iones y numerosas mol&culasorghnicas se debe a su carácter bipolar y a su capacidad para formar puentes de hidrhgeno. Las molCculas que pueden formar puentes de hidrógeno con el agua (por ejemplo, compuestos con radicales 4 N o S H , aminas,

esleres, aldehidos y cetonas) se sotvatan con facilidad lo que por su solubilidad en agua aumenta. Así, las

proteinas solubles están recubiertas con una capa de agua formada por intercambio de enlaces de hidrbgeno intermoleculares superfjciales por puentes de hidrógeno intramoleculares del agua, lo que incrementa la solubilidad. El carácter dipolar del agua afecta profundamente sus interacciones con las biomoltculas, En el ambiente acuoso de las cClulas vivientes se producen muchas interacciones entre cargas y grupos polares de l s biomoléculas. El DNA se pliega a de modo que expone su azúcar y sus grupos fosfato polares a las moiéculas de agua. De manera similar, residuos polares de proteinas se presentan primariamente en la superficie biopolímera donde participan extensamente en interacciones con las moléculas de agua. La figura 3 4 ilustra la formacibn de puentes de hidrógeno entre el agua y grupos funcionales repreN6tese que los alcoholes, sentativos de biomol~culas. del mismo modo que el agua, pueden participar como donadores y como aceptores de hidrógeno en la formación de puentes de hidrdgeno con agua o con otras biomoltsculas. Grupos apolares como aquellos presentes en hidrocarburos no tienen capacidad para formar uniones hidrbgeno y, por tanto, son insolubles en agua. No obstante, estos grupos no polares pueden afectar la estructura hidrica. Cuando se añaden el agua, las moléculas apolares forman gotas esfericas con una supeficie mínima expuesta al agua; este fenbmeno se ilustra con la tendencia del aceite de olivo en agua fria para formar una sola gran masa flotante. La reduccibn a mlnimo de la superficie apolar expuesta al agua es E un proceso gobernado entrópicamente. La presencia de moltculas apolares reduce el numero de posibles orientaciones (grados de libertad) de las rnol~culas

Figura 3 3 . Izquierda: Reunibn de dos mol&culasdipolares de agua. La línea punteada representa un puente de hidrógeno. Nbtese que una mol8wla dada de agua puede actuar como donador o como aceptor de hidrbgeno, o ambas cosas a la vez Derecha: Unldn de una rnol6cula central de agua con otras cuatro mol6culas mediante puentes de hidrógeno. Esta estructura es típica deT hielo y, en menor grado, del agua líquida.

Figura 3-4. Fomacibn de puentes de hidrbgeno entre un alcohol y agua, entre dos molbculas de etanol y entre el oxigeno carbonilo de un pbptido y el hidrbgeno del grupo amino de otro pkptido adyacente.

'

adyacentes al agua por lo que se acompafía de un incremento en la entropía. La reducción al minimo del área de la superficie apolar expuesta permite el m k i m o grado de libertad (por ejemplo, desorden máximo) de las mo!éculas de agua cercanas y, por tanto, reduce al mínimo el incremento en entropía. En el agua. los hidrocarburos forman estructuras clatrato rígidas (semejante a cajas). De manera similar, en el ambiente acuoso de las ctlulas vivientes, las partes no polares de los biopolímeros tienden a situarse dentro de su estructura. minimiírando asi su contacto con el agua.

109 moléculas de agua. N o obstante, los iones hídr0geno y oxhidrilo contribuyen de modo significativo a las propiedades del agua. La disociacion del agua,

Las moléculas de agua presentan una tendencia ligera a disociarse, lo cual es fisiolciqicarnente importante
La propiedad del agua de ioni~arse, aunque de modo ligero, tiene importancia capital para la vida sobre la tierra. Dado que el agua puede actuar como un hcido o como una base, es posible representar su ionizacibn como una transferencia protónica intermolecular, que foma un ion hidronio (I.I,O&) un ion hidr6xido (OH-): y

donde los t6rminos entre paréntesis representan concentraciones molares de iones hidrbgeno, iones oxhidrilo y rnolkculas de agua sin disociar*, rnlentras que la K es la constante de disociación. Para calcular este valor, recuérdese que una molkula de agua pesa 1& g. Por tanto, un litro (1 000 g) de agua contiene 1000 + I g = 55.56 moles. Asi, la concentración del agua pura es 55.56 molar. Ya que la probabilidad de que un hidrbgeno en agua pura exista como ion H' es de 1 .S x 1 Omy, la concentración molar de iones H' (e de iones OH-)en agua pura se calcula multiplicando la probabi tidad, 1.8 x 1 Q4, por la concentracion molar del agua, 55.56 moIL. Este resultado es 1 x 10" rnoYL. Ahora puede calcularse la K para el agua:

., En realidad, el protbn transferido est6 asociado con un racimo de: mol$culas de agua y existe en solucion, no siilo como H30- sino como algo semejante a HrOz' o H703'. Aunque para propósitos prhcticos este protbn ' al parecer 'Vesnudo" se escribe casi siempre como "H'",no debe olvidarse que de hecho esta fuertemente hidratado. Ya que los iones se recombinan de manera continua para formar rnolécu2as de agua y viceversa, no puede definirse si un hidrógeno o un oxigeno deterrninado tiene el estado de ion o de una parte de una moiécula de agua En un instante están como ion; un momento después como una parte de una mol6cula. Por fortuna, no es necesario considerar iones o molkculas individuales. Dado que 1 g de agua contiene 3.46 x moléculas, su ionización puede describirse por estadística. Es suficiente conocer la probabilidad de que un hidrbgeno estC presente como ion o como parte de una molécula de agua. Establecer que la probabilidad de que un hidrbgeno exista como un ion es 0.01 significa que un átomo de hidrhgeno tiene una oportunidad en 100 de estar como ion y 99 posibilidades en 100 de estar como parte de una rno4&culade agua. La probabilidad real de que un Atorno de hidrhgeno en agua pura exista coma ion hidr6geno es alrededor de 0.0000000018 o 1.S x 104. En consecuencia, la probabilidad de estar como parte de una rnotecula es casi la unidad. Definido de otra manera, por cada ion hidrbgeno y cada ion oxhidrilo en agua pura, hay 1.S bi tlones o 1 .X x

La elevada concentración de agua molecular (55.56 moYL) no se afecta de manera significativa por la disociacibn. Por tanto, resulta conveniente considerarla en esencia como una constante, que luego puede incorporarse a la constante de disociación, K, para crear una nueva constante, K,, designada el producto ibnico para el agua. La relación entre K y K se , muestra a continuación:

Nótese que las dimensiones de K son moles por litro y las de K, molesZpor litro2.Como su nombre sugiere, el producto iónico, K,, es en cifras igual al producto de las concentraciones rnolares de H ' y OH-:

* Estrictamente hablando, los tCrtninos entre parkntesis reprcsentan la actividad molar en lugar de la concentración
molar.
m

A 25 OC,K = (1 0-'j2 = I O' (molJL)'. A temperaturas , -' que a menores a 25 O C , K, es menor de 10-'"mientras superiores a 25 O C , es mayor de 1 O-". Por ejemplo, a la temperatura del cuerpo humano (37 "C),la concentración de iones H' en agua pura es algo mayor de 1 mol/L. Dentro de las lim itaciunes establecidas por el efecto de la temperatura, K, = lW4 (mol/L)' para todas las soluciones acuosas, incluso las que contienen acidos o bases. Esta constante se usarii en el cálculo de valores de pH para soluciones ácidas y alcalinas.

Los siguientes ejemplos ilustran el modo de calcular el pH de soluciones ácidas y alcalinas. Ejemplo: cuál es el pH de una solución cuya concentracibn de ion hidrógeno es 3.2 x 1O-' mol/L?
PH = - 109[H+] = log (3.2 x lo4) = - log (3.2) - log (104) = - 0.5 + 4.0 = 3.5

-

EL pH ES EL LOGARlTMO NEGATIVO DE LA CONCENTRACI~N DEL ION HIDR~GENO
El término pH fue introdiicido en 1909 por Sorensen. quien lo definió como el logaritrno negativo de l a concentraci~n iones hidrúgeno: de
pH = - log [H']

Ejemplo: ¿Cuál es el pH de una colucihn cuya concentracion de ion oxhidrilo es 4.0 x 1O4 mol/L? Para abordar este problema, hay que definir una cantidad pOH, que sea igual a -1og [OH-] y que puede derivarse de la definiciiin de Kw:

por tanto:

Esta definición, aunque no es rigurosa*, es adecuada para la mayor parte de los estudios bioquimicos. Para calcular el pH de una solucihn se debe: 1) Calcular la concentración del ion hidrdgeno, 2) Calcular el logaritmo de base 10 de ['. w] 3) El pH es el negativo del valor encontrado en el paso 2. Por ejemplo, para agua pura a 25 O C :
pH = -lag [HJ = - log

Para resolver el problema bajo estc enfoque:

W+l.

= - (-7) = 7.0

Ahora:

],os valores de pH bajos corresponden a concentraciones elevadas de H- y los valores de pH altos a concentraciones bajas de H'. Los ácidos son donadores de protones y las bases son aceptores de pmtones. Sin embargo, se hace una distinción entre ácidos fuertes (por ejemplo, HCI, H:SOd), que se disocian completamente aun en soluciones muy ácidas (pH bajo) y los iicidos débiles, que se disocian solo de manera parcial en selucíones bcidas. Una distinción semejante se hace entre bases fuertes (por ejemplo, KOH, NaOH) y bases debiles (por ejemplo, Ca[OH]:). S610 las bases ruerics sc disocian a pH alto. Muchas sustancias bioquimicas son Bcidos ddbiles. Las excepciones son tos intermediarios fosforilados, que poseen el grupo acido fosfórico primario fuertemente acídico.

Ejemplo: ¿Cuales son los valores del pH de a) 2.0 x 1OA2mol/L de KOH y de b) 2.0 x 1 Oa m o l k de KOH? Los oxhidrilos proceden de dos fuentes: KOH y agua. Dado que el pH esta determinado por el [HA] (y totai pOH por el [OH-] total), es preciso considerar los dos orígenes. En el primer caso, la contribucion del agua al [OH-] total es despreciable. No puede decirse lo mismo en el segundo caso

Molaridad di:KOH

[OH-] KC)H de
[OH-1 del agua

2.0 x . -

* pH = -log (actividad dcl H +).

(Capitulo 3)

Una vez que se ha comprendido el significado de la contribucihn del agua, el pM puede calcularse como se describid. En los ejemplos anteriores, se asurni6 que la base Fuerte KOH estaba completamente disociada en la solución y que, por tanto, la concentracion molar de iones OH-era igual a la concentración molar de KOH. Esta aseveración es válida para soluciones relativamente diluidas de bases o ácidos fuertes, pero no para soluciones de acidos o bases dbbiles. Dado que estos electrólitos dkbiles se disocian sólo un poco en soluci6n, se debe calcular la concentracidn de H (o ' de [OH-1) producida por una molaridad dada del hcido (o base) usando la constante de disociación antes de calcular [H'] total (o [OH-] total) y, posteriormente, calcular el pH.

Las potencias relativas de ácidos y bases dkbiles se expresan de manera cuantitativa como sus constantes de disociacibn, que expresan su tendencia a ionizarse. A continuacibn se muestran las expresiones de la constante de disociacidn (K) para dos ácidos débiles representativos, R-LOOH y R-NHJ-.

Dado que los valores numéricos de K para hcidos débiles son exponentes negativos, es conveniente cxpresar a K como pK, donde:

Los grupos funcionales que son ácidos débiles tienen un gran significado fisiológico
Numerosos compuestos bioqulmicos poseen grupos funcionales que son ácidos o bases dkbiles. En todas las proteínas y ácidos nucleicos existen uno o más de estos: carboxilos, aminos o fosfatos derivados de la disociación secundaria de esteres de fosfato; tambihn los hay en la rnayoria de las coenzimas y los metabolitos intermediarios. Por tanto, el comportamiento de disociacibn (equilibrios protónicos) de grupos funcionales débiles, hcidos o bhsicos, es fundamental -para comprender la influencia del pH intracelular en la estructiira y actividad bioquimica de estos compuestos. Su sepmtci&ne identificación en los laboratorios clinicos y de investigacidn se facilita tambidn cuando se conoce el comportamiento de disociacibn de sus grupos funcionales. A la forma protonada de un hcido (por ejemplo, HA o RNH?') se le designa como el hcide y a la forma no protonada (por ejemplo, A- o RNH?}, base conjugada. De igual modo, es posible referirse a una base (por e.jemplo, A-o RNH2) y su hcido conjugado (HA o RNH3'); la palabra proviene del latln, cuniungre: reunirse). Los hcidos débiles representativos (izquierda), sus bases conjugadas (centro) y tos valores de pK (derecha) incluyen lo siguiente:

Nótese que la relacibn de pK con respecto a K es igual a la de pH con la concentracion de H'. El cuadro 3-1 enumera valores de K y pK ilustrativos para un ácido monocarboxílico, dicarboxílico y tricarboxílico. Observese que los grupos hcidos más fuertes tienen los valores de pK mas bajos. De las ecuaciones anteriores que relacionan K a [ ' y a las concentraciones de un ácido no disociado H] y su base conjugada, nbtese que:

o cuando:

entonces,

En otras palabras, cuando las especies asociada (protonada) y disociada (base conjugada) están presentes

C u a d r o 3-1. Constantes de disociacibn y valores de1 pK para ácidos carhoxllicos r e ~ r e s e n t a t k o s

-

.--Acktico

A

Glutdrico
Citrico

(primero) 8.40 x 1 O4 (segundo) 1.80 x 1

3.08

Agua y pH

23

en concentraciones iguales, la concentración prevalente de ion hidrógeno [H'] numh-icarnente iguat a la es constante de disociacion, K. Si se obtienen los logaritmos de los dos lados de la ecuacibn anterior y la ecuación completa se multiplica por -1, las expresiones serfan las siguientes:

Se multiplica todo por -1 :

- 109 [HT = - lag K - toa I 4 H
[A7

- log K = - iog [HT
Ahora, -log K se defínib como pK y -1og [H'] es la definicibn de pH. La ecuación puede quedar como:

K = [H']

Se sustituye pM y pK en lugar de -log [Ht] y -lag K, respectivamente; luego:

es decir, el pK de un grupo 4cido es el pH al cual Ias especies protonada y no protonada esthn presentesen la misma concentración. El pK de un &ido puede determinarse de modo experimental agregando 0.5 equivalentes de iilcali por cada equivalente de acido. El pH resultante seri igual al pK del ácido.

Para eliminar el signo negativo se invierte el ÚItirno

El comportamiento de ácidos dkbiles y de amertiguadores se expresan par la ecuación de Henderson-Hasselbalch
El pH de una solucihn que contiene un Bcido débil se relaciona con la constante de disociaci6n de dicho acido, como se mosirb antes para el agua como Acido débil. La relación puede establecerse en la forma convenientede la ecuaci6n de Henderson-Hasselbalch, que se desarrolla desputs. Un acido ddbil, HA, se ioniza de la manera siguiente: HA = H+ + A-

La ecuaci6n de Henderson-Hasselbalch ha probado ser una expresión de gran valor predictivo en equilibrios protonicos. Por ejemplo:

1) Cuando un hcido se ha neutralizado exactamente a la mitad [ A 7 = [HA]. En esta situacibn,
1 [HAI pH = pK + log f l = p ~ + ~ o g ~ = p ~ +

Por tanto, con 50% de neutralizacibn, pH PK.
2) Cuando la proporci6n [A-JI[HA] = 100:1,

=

La constante de equilibrio para esta disociacibn se escribe:

3) Cuando la proporción [A-]/[HA]

=

1 : 10,

Se multiplican los dos términos entre si:
pki = pK

+

log %o = PK

+ (-1)

Se dividen ambos miembros entre [A-]:

Se obtiene el logaritmo de toda la ecuacibn:
log [H7 = log K

Si la ecuación se valora en varias proporciones de [A-]/[HA] entre los limites 103 y 1O-? y los valores de pH obtenidos se grafican, el resultado describe la curva de titulación para un a ácido débil (figura 3-5).

(E)

y

Las soluciones de ácidos debiles sus sales amortiguan e pH l
Las sofuciones de ácidos dkbiles y sus bases conjugadas (o de bases dtbiles y sus k i d o s conjugados)

24

Bioquinaica de Harper

Figura 3-5. Forma general de una curva de tlulacibn calculada con la ecuación de Hende~on-Hasselbalch.

Obskwese que el cambio de pH por miliequivatente de OH- agregado varía de modo notable dependiendo del pH iniciai. A valores de pH próximos al pK, la soluciOn resiste los cambios con mayor eficacia y se dice que ejerce un efecto amortiguador. Las soluciones de ácidos débiles y sus bases conjugadas amortiguan mejor en valores de pH que oscilan alrededor de pK k 2.0 unidades de pH. Ecto significa q u e para amortiguar una solución a pH X, deberfi usarse un Acido o una base débil cuyo pK no se separe mas de 2.0 unidades de pIJ del pH X. En la figura 3-6 se muestra la carga neta en una rnoltcula del ácido como funcihn del pH. Una carga fraccionaria de -0,s no significa que una molécula individual posea una carga fraccionaria sino que 0.5 es la probabilidad estadística de que una rnolkcula dada tenga una carga negativa. La consideración de la carga neta de macromoléculas como funcibn del pH constituye Ia base para numerosas tkcnicas de separación, incluyendo la separacibn electroforética de aminohcidos, proteinas plasmhticas y hemoglobinas anormales.

exhiben la propiedad de amortiguar -tendencia de una solrici6n para resistir con inayor eficacia a un cambio en el pH después de la ztdicibn de un Cicido o una base fuertes que un volumen igual de agua. Los amortiguadores fisiol6gicos importantes incluyen bicarbonato (HCOi/H2C0i), ortofosfato inorgánico ( H ? P O ~ - tPQ4C2) y proteínas intracelulares. Los '/~ amortiguadores no fisiolbgicos usados en experimentacibn bioquirnica comprenden al TRIS (pK S.2) y al HEPES (pK 7.6). El efecto de amortiguador se observa mejor por titulacibn de un hcido o base débil utilizando rin potenciómetro (medidor de pH). De manera alterna, es posible calcular el desplazamiento del pH que acompaiia a la adición de Acido o de base a una solución amortiguada, En el ejemplo, el amortiguador (mezcla de un ácido débil. pK = a 5.0 y su base conjugada se encuentra inicialmente en 1 de los 4 valores de pH indicados. Se calculará el desplazamiento del pH que resulta cuando se agrega O. 1 mEq de KOH a 1 mEq de cadauna de estas soIuciones:

RESUMEN
El agua, que en !os estados liquido y sdlido existe como racimos rnoleculares unidos por hidrógenos, forma puentes tanto con sus propias rnol~culas como con otros donadores o aceptores de protones. La tensión superficial, viscosidad, estado líquido a temperatura ambiente y potencia solvente del agua se deben a su capacidad para formar puentes de hidrógeno. Los compuestos que contienen O, N o S son solvatados por el agua, ya que tienen la propiedad de servir como aceptores o donadores de hidrdgeno para formar puen-

5.37 5.60 5.86 0.88 0.70 0.80 0.50 0.12 0.30 0.20 0.50 [HAI~nicia~ 7.33 2.33 4.00 i.00 ([A-]l[HA])inlclal La adición de O.T meq de KOH produce 0.98 0.80 0.90 0.60 [A-lfinai 0.20 0.10 0.02 0.40 [HAlfinai 49.00 4.00 9.00 1.50 ([A-[4HA])fina1 log ([A-]I[HA])n,,t 0.176 0.602 0.95 1.69 pHfinal " 5.18-_-5:60 5-95 6.69

pH inicial

5.00

[A-]inicial

L~PH

0.18---"6 0 0 .

.

. ..

-

Figura 3 4 . Curva de titulación para un ácido del tipo HA El el punto (m) ~ndica pK 5.0.

tes con el agua. Las proteínas y otras rnacromoteculas se estabili~an intercambio de eniaces de hidrbgeno por intermoleculares superficiales con los enlaces de hidrtigeno del agua. E1 agua modifica las propiedades de biomolkculas como las proteinas y los hcidos nucleicos que poseen gmpos funcionales polares y no polares. Las fuerzas entrópicas indican que las macrornoleculas en soluci6n acuosa se pliegan de modo que sus porciones polares entran en contacto con la interfasr acutisa, en tanto que sus porciones no polares se ocultan en el interior de la biomolCcula. El agua se disocia para formar iones hidrdxido y protones hidratados de modo masivo, los cuales de manera convenciona! se representan como protones desnudos (H'). El pH, logaritmo negativo de [H'], expresa la acidez relativa. Un pH bajo denota una solución ácida y uno alto una solución básica o alcalina.

Los bioqulmicos consideran tanto a los hcidos carboxilicos (como el R X O O H ) como a las aminas (por ejemplo. R-NH,') como bcidos, y nombran a los aceptores protónicos correspondientes ( R - 4 0 0 - y R-NH2), las bases conjugadas de estos ácidos. Estos ácidos débiles desernpeíian actividades claves en el metabolismo. Su potencia heida se expresa de manera cuantitativa con el simbola pK, el cual es el logaritmo negativo de su constante de disociación. Los ácidos relativamente fuertes tienen pK bajo mientras que en los relativamente débiles es alto. Los amortiguadores resisten los cambios en el pH cuando se producen o consumen protones. La capacidad amortiguadora máxima a IT I unidad de pH en cualquier región de pK. Entre los amortiguadores fisiológicos importantes se encuentran el bicarbonato, e[ ortofosfato y las proteínas.

REFERENCIAS
Segel 1M: Riocochemicnl Calculations. Wiley, 1968

Estructura y funciones

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 . . Capítulo S.Yéptidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 Capitulo 6 . Proteínas: estructura y función . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Capítulo 7 .Proteínas: mio~lobina hemoglobina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 y Capitulo 8. Enzimas: propiedades generales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Capitulo 9. Enzirnas: cinética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .91 Capitulo 10.Enzirnas: mecanismos de acción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .111 Capitulo 11.Emzimas: regulacióln de actividades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
Capítulo 4 Aminoácidos

Victor W Rodwell, PhD

Una de las múltiples funciones de los arninohcidos en las ~Clulasvivientes es la de servir como unidades monómeraq a partir de las cuales se sinteticen cadenas pEipéptidicas de proteinas. La mayoría de las proteinas contienen. cn proporciones diferentes, los mismos 20 1,-al fa-am inokidos. Muchas protcinas específicas contienen además aminoicidos 1.-alfa derivados de algunos de los 20 aminoacidos basicos mediante procesos que tienen lugar después de la fbrtnacibn del esqueleto fundamental del polipéptido. Estos aminohcidos "poco habituales" satisfacen funciones altamente específicas de la proteína en cuestidn. El tipo de aminoácido, el orden en que se unen y su relación espacia1 mutua estableceii las estructuras tridimensionales y las propiedades biológicas de proteínas simples y son determinantes importantes de la estructura 4 fiinción de proteinas complejas que contienen aderntis de aininoácidos, hem, carbohidratos, Iípidos, ácidos nucleicos, etcktcra. Este capítuIo estudia las estructuras, propiedades fisicas, estereoquim ica, reacciones químicas y equilibrios iOnicos de los L-alfaaminoacidos presentes en las proteínas.

trastornos graves. Varias enfermedades genéticas. Telativamente raras, del catabolismo de arninoácidos (como la fenilcetonuria y la enfermedad dc la orina de jarabe de rnaple) producen, si no se tratan, retraso mental y muerte temprana. Otros padecimientos genkticos pueden deberse a la alteración de la capacidad para transportar aminoácidos específicos a las células. Dado que estos defectos de transporte por lo común causan una excreción urinaria exagerada de uno a más amino8cidos, a menudo se designan como aminoacidurias. Además de sus actividades como proteinas, los 1,-arninoacidos y sus derivados participan en runciones intraceIuIares tan diversas como Ia transmisión nerviosa, la regulación del desarro110 celular y en la biosintesis de porfirinas, purínas, pirimidinas y de urea. IdosI .-arninohcidos de pkptidos de peso moIecular bajo actúan como hormonas y tanto los aminoicidos ri como los l. esthn presentes en 10% antihioticos polipeptidos elaborados por microorganismos.

PROPIEDADES DE LOS

AMINOACIDOS

El código genético específica 20 L - a l f a - a m i n o á c i d o s
La alimentación humana debe coniencr cantidades adecuadas de 1 0 1,-alfa-aminoácidos esenciales, ya que, ni el ser humano ni los demás animales superiores pueden sintetizarlos en las proporciones necesarias para mantener el crecimiento infantiI o conservar la salud en los adultos. En forma de proteinas, los aminoAcidos realizin una multitud de funciones estructurales, hormonales y cataliticas esenciales para la vida. Por tanto, no sorprende que defectos genttícos en el metabolismo de los aminoacidos puedan conducir a Aunque existen más de 300 arninoácidosdiferentes en la naturaleza, sólo un subconjunta de 20 constituye las unidades monomericas a partir de las cuales se construye el esqueleto básico de las proteínas polipeptidicsts. Un cbdigo genetico de tres letras no repetidas podría incluir más de 20 arninoacidos, pero la redundancia en el código genetico universal limita los codones de arninohcidos disponibles a los 20 arnino8cidos L-alfa que se presentan en e1 cuadro 4-1. Por consiguiente, todas las proteinas contienen diferentes pro-

30

Bioquimic.a de Harper

(cupí6ul 4) o

r i i s d rn 4-1.r.-alfa-~m~no"ácidos presentes
- - -- -

en las proteina~i --

I

iula estrur

Alanina

Lc---.:-'.

I,eu [l

'
i

.

-

-

- .

I--. 2.3
2

m

I -..---- 9.8

Con crdcnas laterales que tienen grupos bidroxila [OH)

1 ;
I

Se?-

Scr FS'

nI

I

CkI2&.
OH

!
Treonina Tre 1 7

I

.NHI

l

i
2.1

~m~-CH-ch'1

I

9.1

Casi 13

.

Tir
Con cadenas laterales que contienen 4tomnr de azufr*

ci:

Cis [C

CH,-CH-

8.3

i
A

~n,-CH2-W S I

-. - -- Con cadenas laterales que contienen grupos hcidos o sus amidas I
A--

Metionina -

~

"

e [I t

2
1.u

,Y.Y

ÁCido asphrtil

o [

I

Asparagina

Asn

Ac ido gIuiárnico Glu [E

Glutamina

A -

1 :on cadenais IatcralejI que conti
NombriLI_- Silmbolo

-

u

Cuadro 4-f. t-milfa-Aminohcidos presentes en las proteínas (continuación) ---.*u..--. -A

'

.

"

A-----A

-."..".

1 A r e m1

1
1 istidina iue contiei

1

Lis 1

Fistidina

icos 1 VCase desputs

F

Tirosina

rolina

porciones de estos 20 L-alfa-aminoAcidos. Sin embargo, ciertas proteínas contienen, además, aminohcidos L-alfa "poco habituales" originados en algunos de los 20 aminoácidos básicos mediante un procesamiento postraslacional (o sea, un proceso que tiene lugar despues de la fomaci6n de un esqueleto de polipép tidos). Un ejemplo frecuente es la cistina, que se produce por oxidacibn a partir de los grupos S H de dos cistefnas para convertirse en una unibn -S-S(disulfuro). Otros aminoficidos modificados menos comunes o "poco habituales" tambidn cumplen funciones muy especificas en las proteínas donde se encuentran. Algunos casos de modificaciones postraslacionales son la metitación, la formilaci6n, la acetilacibn, la psenilacidn, la carboxilacibn y la fosforilacibn (capítulo 40).

En las proteínas sólo existen L-alfa-aminoácidos
Los aminohcidos contienen grupos funcionales amino y carboxilo. En un alfa-aminoAcido, ambos esthn unidos al mismo atomo de carbono (figura 4-1).

R-CI

NH,

COOH

R

o

Flgura 4-1. Dos representacionesde un alfa-aminoAcido.

(Capífulo 4)

Se dice que un átomo de carbono que tiene cuatro sustituyentes diferentes es un carbono quiral. Con excepcion de la glicina, para la cual R es un átomo de hidrógeno (figura 4-l), los cuatro grupos unidos al átomo de carbono alfa de los aminoácidoc son diferentes. Esta orientación tetraedrica de cuatro grupos distintos alrededor del carbono alfa le confiere actividad óptica (la capacidad de rotar el plano de la luz polarizada) a 10s aminoácidos. A~inque las proteien nas se han encontrado algunos aminoácidos dextrorrotatorios y algunos levorrotatorios a pI.1 7.0, todos tienen las configuraciones absolutas del bgliceraldehido por lo cual son L-alfa-aminoacidos. Dado que los u-aminoicidos existen en la naturaleza e inclusive en antibióticos polipeptldicos, ¿por q u e se encuentran sOlo L-aminoácidos en las proteínas? Los autores proponen la hipbtesis dc quc los L - a m i n o a c i d o s f u e r o n s e l e c c i o n a d o s por un fenómeno, en cierta manera fortuito, que tuvo lugar a muy temprano durante la evolución de E vida.

Figura 4-2. Estructura ionicamente correcta para un aminoacido a pH fisiológico o cerca de el (A). La estructura sin carga que se muestra en (B) no puede existir a ningún pH, pero es posible usarla por conveniencia cuando se describe la quimica de los aminoacidos

un grupo carboxilo estará presente como ion carboxi-

lato (R-COO-). Sin embargo, por conveniencia se utiliza la representación i para numerosas ecuaciones 3 en las que no intervienen los equilibrios protbnicos.

Los aminoácidos pueden tener carga neta positiva, negativa o cero
Los aminoácidos portan por lo menos dos grupos Bcidos débiles ionizables, un -COOH y un -NHq'. En solucibn, dos formas de estos grupos, una con carga y otra sin carga. existen en equilibrio protónico:
R-COOH R-NH3'

Las fuenas relativas de los icidos débiles se expresan en términos de su pK,
Las fuer7as relativas de los icidos dhbilec son expresadas en tkrminm de sus constantes de disociaci6n de ácidos, K,, o de su pK., que es simplemente el log negativo de la constante de disociación, esto es.

-

R-COO-

+ H'
El cuadro 4-1 enumera los valores de pK para los grupos funcionales presentes en los 20 arninohcidos de las proteinas. Por conveniencia, el subindice a en K, y pK, queda implicito, pero se omitirá de aquí en adelante. La figura 4-3 iIustra Ias formas protonadas de los grupos R imidazol de la histidina y el grupo R guanidino de la arginina. Ambos existen como híbri-

e R-NH2

+H '

R-COOH y R-NHit representan los miembros protonados o acídicos en estos equilibrios. El R-COOy el R-NH2 son las bases conjugadas (es decir, los aceptores dc protones} de los ácidos correspondientes. Aunque el R X O O H y el R-NHj' son Acidos dhhiles, el R-COOH es un acido con mayor fuerza que el R-NH]'. Al pH de1 plasma sanguíneo o del liquido intracelular (7.4 y 7.1, respectivamente), los grupos carboxilos existen casi enteramente como iones carboxilato, R--COO-. A estos valores de pH, la mayoría de los grupos amino estfin predominantemente en la f o m a proíonada, R-NH?'. Las especies ionicas prevalentes de los aminoácidos en la sangre y en la mayoria de los tejidos, deberán representarse como se muestra en la figura 4-2A. La estructura E3 (figura 4-2) no puede existir a ningún pH. En un pH suficientemente bajo para ionizar al grupo carboxilo, el grupo amino con el Bcido r h débil tambien se protonaría. A un pH n dos unidades por debajo de su pK,, un hcido estarh protonado aproxiniadamente 99 por ciento. Si el pH se eleva de manera gradual, el protbn del ácido carboxílico se perderh mucho tiempo antes que el del R-NH3'. A cualquier pH bastante alto para que predomine [a base conjugada sin carga del grupo amino,

NH

I C - NH,

!I

-

NM

1 0
C=NHi,

=

NH

i. :o
1:

I
N'%

G~NH,
NH2

ONH,

Figura 43. Hlbridos de resonancia de las formas protonadas de los grupos R de histidina y arginina.

dos de resonancia, por lo que se pueden representar como se muestra a la derecha, con la carga positiva distribuida entre ambos nitrógenos (histidina) o sobre P los tres nitrogenos (arginina). La carga neta (la suma algebraica de todos los gnipos con cargas positivas y negativas que se encuentran presentes en la moléculaj de un aminoacido depende del pH o de la concentraci6n de protones de la solucihn en que se encuentren. La capacidad de alterar la carga de los aminoáicidos o de sus derivados por manipuIacíón del pH facilita la separación fisica de aminoácidos, péptidos y proteínas.

En este ejemplo.

Este procedimiento es uti! para todos los aminoácidos con grupos disociables adicionales, como la lisina o la histidina. Qespuks de escribir las fórmulas para todas las especies cargadas posibles de los arninoacidos lisina y arginina, se observa que:

A su pH isoelectrico (pl), un aminoácido tiene una carga neta de cero
Para un aminohcido aIifático como la alanina, la especie isoeléctrica es la forma que se muestra en la figura 4 4 . El pH isoeléctrico es el pH que esta en medio de los valores de pK de ambos lados de la especie isoeléctrica. Para un aminohcido con s61o dos grupos disociables, no puede haber ambigüedad posible, como se muestra abajo en el cálculo del p l para la alanina. Dado que p K l (R-COOH) = 2.35 y pKz(R-NH,') = 9.69, el pH isoeléctrico (pl) de la alanina es:

El calculo del pl para un compuesto con más de dos grupos disociables tiene una posibilidad mayor de m o r . Por ejemplo, considerando la figura 4-5, ¿cuál podria ser el pH isoeléctrico (p1) para el Acido aspartico? Primero, se escriben todas las estructuras ibnicas posibles para un cornpiiesto en el orden en el cual se presentan cuando se va de una solución fuertemente acida a una solución alcalina (por ejemplo, para el ácido aspártico en la figura 4-5). A continuación, se identifica la representaci6n isoibnica, zwitterionica o neutra (como en la figura 4-58). El pI es el pH que esta en medio de los vaiores de pK de ambos lados de las especies isoiónica.

Para la Iisina, el pl es 9.7; para la arginina es 10.8. El ectiidiantc deberli determinar el pl para la histidina. Determinar por inspección de las estructuras cargadas, los valores de pK a ambos lados del zwitterion, no se limita a los aminoicidos. Puede ser aplicado al cálculo de la carga de una molécula con cualquier numero de grupos disociables. [,a capacidad de realizar cálculos de este tipo es valiosa en el laboratorio clínico para predecir la movilidad de los compuestos en los campos elkctricos y para seleccionar Iris arnortiguadores apropiados para Ias separaciones. Por ejemplo, un amortiguador a pH 7.0 podria separar dos moleculas con un pl de 6 y S, respectivamente, debido a que la molécula con pl = 6 tendrfi una carga negativa neta mayor a pH 7.0 que la molécula con pl = 8. Consideraciones análogas se aplican a la comprensión de separaciones sobre soportes ibnicos como las de polimeros con carga positiva o negativa (por ejemplo, celulosa DEAE o resina 1 Dowex).

La solubilidad y el punto de fusión de los aminoácidos reflejan su carácter iónico
Dado que los aminoácidos poseen múltiples grupos con carga, se solvatan con facilidad y, por tanto, son solubles en solventes polares como agua y etanol, pero insoluhles en solventes no polares como benceno, hexano y &ter.Sus elevados puntos de fusidn (> 200 "C) reflejan la gran cantidad de energía necesaria para romper las fuerzas iónicas que estabilimn la red cristalina.

O

II

Fiqura 4-4. Estructura isoeléctrica o "zwttteri6nica" de la alanina Aunque tiene carga, el zwitterlbn Presenta una carga neta igual a cero y por consiguiente no emigra en u n campo elkctrico de corriente directa.

LOS AMINOAGIDOS PUEDEN CLASIFICARSE POR LAS POLARIDADES DE SUS GRUPOS R
dividirse en dos Los aminoficidos proteinicos amplios grupos de acuerdo a la polaridad o no polari-

34

Bioquimica de Hurper

(Capítulo 4)

En actdo fuerte (menor de pH 1); carganeta=+ 1

Aproximadamente pH 3: carga neta = O

Aproximadamente pH6a8 carga neta = -1

En hlcali fuerte (arriba de p i1); W carga neta = -2

Figura 4-5. Equilibrio protbnico del Bcido asplrtico.

dad de los grupos R adheridos a los átomos de carbono alfa (cuadro 4-2). Las abreviaturas de una sola letra (cuadro 4-1) se emplean para representar secuencias extremadamente largas de arninoacidos (por ejemplo, para anotar la secuencia completa de aminoacidos en una proteína). Los aminoácidos que se encuentran en estados libre o combinado (pero no en proteinas} desempefían funciones importantes en los procesos metabólícos. Por ejemplo, la ornitina, la cimilina y el arginosuccinato participan en la formación de la urea. Hay mas de 20 u-aminohcidos en la naturaleza, los cuales incluyen D-alanina y D-glutamato de las paredes celulares de ciertas bacterias y varios D-aminoácidos de antibióticos.

LOS GRUPOS ALFA-R DETERMINAN LAS PROPIEDADES DE CADA AMINOACIDO
La glicina, el más pequefio de los aminoácidos, puede encajar en regiones de la estructura tridimensional de las proteinas inaccesibles para otros aminoácidos y se

Cuadro 6 2 . Ctasificaci6n de los alf fa-aminohcidos

presentes en las proteinas con base en su relativa liidrofilicidad (tendencia a asociarse con el agua) o hi dad (tcnd encia a asociarse a I qte no polar en lugar de agua) .
-

- FIidrbfotLis.A lanina F :niIalanina r 1solcucina

l

-

"

"

-

"~

. .. . .

-

- .

1' w : 3 . . c E , . -

Lc M PI Ti Triptófano Valina

do aspártic o Áci do glutamico ,inina imagina Cisi:eina Glic:ina G lutamina

Histiclina
Cisinia
Serin. -reora 1 iína

encuentra en regiones donde tos pdptidos se doblan en forma aguda. Los grupos R alifáticos de alanina, valina, leucina e isoleucina y los gmpos R aromáticos de fenilalanina, tirosina y triptdfano son hidrof6bicos, propiedad que tiene consecuencias importantes para el ordenamiento de !as moldculas de agua de las proteinas que estan en la vecindad inmediata. Es tlpica la presencia de estos aminohcidos en el interior de proteinas citosólicas. Los grupos R con carga, de los aminoácidos básicos y acidicos, estabilizan las conformaciones proteínicas especificaspor intermedio de la formación de enlaces salinos. Por ejemplo, la rotura y reconsúucciSn de enlaces salinos que acompafla a la oxigenación y desoxigenación de la hemoglobina (capitulo 7). Además, los aminokidos con grupos Rde cargapositiva o negativa funcionan en los sistemas de "transmisibn de carga" que las transportan a distancias considerables durante la catálisis enzimática. Por último, la histidina tiene funciones unicas en la catalisis enzimática, debido a que el pK de su protón imidazblico le permite, a pH 7.0, funcionar alternativamente como base o como acido catalitico. El grupo alcohol primario de la serina y el grupo tioalcohot primario (-SI+) de la cistelna son nucleófi los excelentes y pueden funcionar como tales en muchos procesos de la catklisis enzimhtica. Aunque el alcohol secundario de la treonina es tambitn un buen nucleófilo, no se sabe que se comporte como taI en la catálisis. Además de su papel catalitico, el grupo 4 H de la serina y de la tirosina actúa en la regulación de la actividad de ciertas enzirnas cuya acción catatitica depende del estado de fosforilación de residuos seril o tirosil especificas. Los arninohcidos no absorkn la luz visible (es decir, son incoloros) y, con excepcibn de los arninoficidos aromaticos triptófano, tirosina, fenilalanina e histidina, tampoco absorben la luz ultravioleta de una longitud de onda mayor de 240 nm. Varios aminoAcidos, particularmente el triptdfano, absorben luz ultravioleta de longitud de onda de alta frecuencia (250 a 290 nm) (figura 4 4 ) . Aunque el triptofano es relativamente

dos también reaccionan, pero con mayor lentitud que un alfa-aminoácido. La prolina y la 4- hidroxiprolina producen un color amarillo con ninhidrina. La fluorescamina (figura 4 - 9 , un reactivo aun más sensible, puede detectar nanogramos de un aminohcido. Igual que la ninhidrina, S fluorescamina a f u m a un complejo con arninas de otros compuestos además de los arninoácidos.

VARIAS TÉCNICASAISLAN LOS AMINOACIDOS
Crornatog rafía
240
260
Longitud de onda (nm)

280

Figura 4 4 . Espectrode absorcidn ultravioleta del triptbfano, tirosina y fenilalanina.

poco común en la mayoria de las proteínas, contribuye de manera importante a la capacidad de muchas de ellas, para absorber h z en la región de los 280 nm.

En todas las separaciones cromatográficas, las moldculas son separadas dentro de una fase estacionaria y una rnbvil. La separacion depende de la tendencia !elativa de tas moléculas en la mezcla para asociarse con mayor fuerza a una o a otra fase. Aunque estas tkcnicas de separacidn se describen principalmente en reIaci6n con aminoácidos, su uso de ninguna manera está restringido a estas moléculas.

Cromatografía en papel

LA NlNHlDRlNA O LA FLUORESCAMINA DETECTA LOS AMINOACIDOS

La ninhidrina (figura 4-7) descarboxila por oxidación los alfa-aminohcidos a Coz, NN3 y un aldehido con un htomo de carbono menos que el arninoficido precursor. Luego, la ninhidrina reducida reacciona con el amoniaco liberado, formando un complejri azul que absorbe al rnkirno la luz a una longitud de onda de 570 nm. Este color azul es la base de una prueba cuantitativa para alfa-aminohcidos que puede detectar cantidades de aminoAcidos tan pequeflas como 1 pg. Otras arninas distintas a los alfa-aminoicidos también reaccionan con ninhidrina dando un color azul, pero sin liberar Coz. tanto, la formación de COZindica Por E presencia de un alfa-aminohcido. El NH, y los péptia

Para la cromatografia en papel, se coloca una gota de solucibn que contenga uno o mas aminokidos a unos 5 cm del borde de una tira de papel filtro. La tira se coloca en un vaso cerrado donde su extremo entra en contacto CUII un solvente, generalmente un alcohol de bajo peso molecular en solución saturada con agua que contiene un ficido o una base. Despds de la migración del solvente sobre el papel, se seca la tira, se trata con ninhidrina en acetona y se calienta un poco; entonces las posiciones de los arninoácidos aparecen como puntos de color purpura (figura 4-9). Los aminoácidos con grandes cadenas laterales no polares (Leu, Ile, Fen, Tri, Val, Met, Tir) emigran m& que los que tienen cadenas laterales mas cortas no polares (Pro, Ala) o cadenas laterales polares (TE, Glu, Ser, Arg, Asp, His, Lis, Cis) (figura 4-9). Esto

Figura 4-7. Ninhidrina.

Figura 4-8. Fluorescamina.

(Capítulo 4)

sentidode rnigracibn
del solvente

1
*
)

1

-origen

Cis

fases liquidas: una estacionaria y otra móvil de polaridad diferente, conforme la fase móvil pasa sobre [a estacionaria. La separacidn se produce por la diferencia de solubilidad de los componentes en las fases estacionaria y móvil. En la CCFP nonnal, la fase ectacionana es el componente más polar. El solvente desarrollado contiene ambos elementos: polares y débilmente no polares, típicamente agua, un alcohol de 4 o de 5 carbones y
un Acido débil o una base débil como ácido acético o arnoniaco. Conforme se desplaza sobre la placa de apoyo, el solvente cambia de composición debido a los elementos más polares que acornpairan a los grupos - O H polares de la celulosa. Por tanto, el solvente que avanza paulatinamente se convierte en más no polar. Los componentes más no polares de una mczcIa se desplazan mLs lejos que los componentes mas polares de igual tamafio. Por ejemplo, el glutamato y la lisina se retardan, en tanto que la leucina y la valina migran junto con el solvente. En la CCFP en "fase reversa", tanto las polaridades de las fases como las movilidades de los componentes de la mezcla se revierten respecto a la CCFP normal. La fase móvil suministra la fase polar. La fase estacionaria, por lo común celulosa recubierta con un líquido no polar como el aceite de silicon, suministra la fase más no polar. En contraste con la CCFP normal, los componentes polares rnigran con el solvente en tanto que se retrasa el desplazamiento de los componentes menos polares. En la CCF de absorción (CCFA), la separacidn se basa en un principio totalmente diferente. La resolucibn implica absorber los componentes de la mezcla en gel de sílice que se calienta para expulsar toda el agua fija. La fase móvil, típicamente una mezcla simple o binaria de calventes organices, desplaza los compuestos absorbidos compitiendo por los sitios de unibn sobre el gel de sltice. Primero se desplazan los componentes unidos con menor firmeza y asf se logra la resolucibn.

-Iir
Met

4
Tri
'

Figura 4-9. ldentificacibnde los aminoAcidos presentes en las proteínas DespuBc de crornatwrafia descendiente en papel, en A-butanol. ;ícido acético. agua, las manchas fueron vistas al añadir ninhidrina

refleja la mayor solubilidad relativa de las moltculas polares en la fase estacionaria hidr6fila y de las moI&culas no polares en solventes orgánicos. Para una serie no polar (Gli, Ala, Val, Leu), a mayor longitud de !a cadena lateral no polar se incrementa su caracter no polar lo cual aumenta su movilidad. La relacibn entre la distancia recorrida por un aminohcido con la distancia que viaja ei solvente, medidas ambas desde el sitio marcado para la aplicacibn de la rne7cla de arninoácidos, se designa como valor RF (movilidad relativa con el solvente) de ese aminohcido. Los valores RFpara un aminohcido dado varían de acuerdo con las condiciones experimentales, por ejemplo, según solvente usado. Aunque es posible identificar es tentativamente un aminohcido s61o por su valor RF, preferible hacer la cromatografia estandar de aminoácidos conocidos de manera simultáneacon la mezcla desconocida. Luego, la movilidad puede expresarse en relacion a la de uo esthndar (es decir, como RI,m8s que como Rf). Las movilidades expresadas como relativas a un estAndar varían menos que los valores Rf de un experimento a otro.

Cromatografía de intercam bia ionico
El anhlisis de los residuos de aminolicidos despuks de la hidrólisis de un polipéptido, por la general involucra a la crornatografía automatizada d e intercambio i6nico. La separación, identificación y cuantiticación completas requieren menos de tres horas. EI procedimiento de Moore y Stein utiliza una columna corta y una larga las cuales contienen la forma ionizada de Na" de una resina de poliestireno sulfonatada. Cuando e ácido hidrolizado a pH 2 se apZica a las columnas, 3 los arninoácidos se unen mediante el intercambio de cationes con el catión Na'. Las columnas se eluyen despues con citrato de sodio bajo condiciones prede-

Cromatografía en capa fina
Hay dos tipos distintos de cromatografia en capa fina (CCF): CCF de partición (CCFP) y CCF de absorción (CCFA). En Ia CCF de partfcion, la resolucibn implica

particihn de los elementos de una mezcla entrz dos

Aminoácidos

* 37

terminadas de pH y temperatura. El material eluido se hace reaccionar con la solucibn de ninhidrina y las densidades de la coloración se miden en un colorimetro de flujo. Los datos aparecen en un tubo de sayos catbdicos con integración relacionada con cornputadora de las áreas pico (figura 4-1 0 . )

Electroforesic de alto voltaje (EAV)
Las separaciones de aminoacidos, polipkptidos y otros anfhlitos (moléculas cuya carga neta depende del pH del entorno) en un campo el6ctrico de corriente directa tienen extensa aplicación en bioquimica. Para los aminoCicidos. las hojas de papel o capas finas de celulosa en polvo son las que se usan Con mayor frecuencia como soportes inertes. Para poliptptidos grandes o proteínas, se emplea gel de poliacrilamida con enlaces cruzados. Para oligcimeros de nuclehtidos se utilizan soportes de agarosa y poliacrilarnida. Las separaciones dependen de la carga neta del anfólito y del peso molecular de los compuestos que seran separados. Para molécuIas con carga idéntica, la de peso molecular más bajo emigra más lejos. Sin embargo, la carga neta es el factor mas importante que determina la separación. Esta técnica es htil para aminohcidos, polipeptidos de peso molecular bajo, ciertas proteínas, nucleótidos y fosfoazúcares. Las muestras se aplican a! soporte, que a continuación se humedece en una solución amortiguadora de un pH apropiado y se pone en contacto con reservorios de amortiguador

mediante tiras de papel. El papel puede cubrirse con una placa de vidrio o sumergirse en un hidrocarburo refrigerante. Al aplicar lacorriente, las mol&culascon carga negativa neta al pH seIeccionado, emigran hacia el Iinodo y aquellas con carga positiva neta, hacia el chtodo. Para visualizar la separacidn, el electroferograma ya seco es tratado con ninhidrina (aminohcidos, péptidos) o expuesto a la liiz ultravioleta (nuclebtidos). La elección de pH es dictada por los valores de pK de los grupos que se disocian en las rnol&culasde la mezcla.

LOS GRUPOS FUNCIONALES DETERMINAN LAS REACCIONES Q U ~ M ~ C A S LOS AMINOACIDOS DE
Los grupos funcionales que poseen los aminoácidos gobiernan las reacciones quimicas en las que participan, las funciones Bcidas alfa-amino y alfa-carboxílica y los grupos Funcionales presentes en los grupos R. Cada grupo funcional puede participar en todas sus reacciones químicas características. Estas reacciones incluyen para los grupos del Iicido carboxílico, la ionización y ia formación de &teres. amidas y anhidridos ficidos. Estas reacciones incluyen la ionizaciiin, la acilacibn y la esteri ficacibn d e grupos amino, oxidacibn y alquilación de grupos -SH, y esterificacibn de grupos -OH, etcétera.

Figura 4-10. Anhlisis automatizado de los aminoácidos presentes en un hidrolizado de proteínas. Los arninoacidos se adsorben en una resina intercambiadora de cationes en una base de poliestireno, Dowex 50, se eluyeron con amortiguadores del pH indicado, se sometieron a reaccidn Con ninhidrina y se registr6 la absorbencia a 570 y 440 nrn (para detectar prolina). Las hreas máximas son proporcionales a la canttdad existente de cada aminoácido. Una columna corta (A) determina arninoAciUoc bastms a pH 5.28. La elución de una columna mBc larga (B) a pH 3.25 y 4.25, identifica los amino8cidos restantes. El aminohcido no proteinico norleucina sirve como estBndar intenso

38

Bioquímica de Hurper

comprender la conversion previa en un cloruro de acido. En los procesos biolbgicos, la activación comprende una condensación inicial con ATP con la formacibn de un am inoaciladenilato.

RESUMEN
Sblo los L-alfa-aminoácidos forman las protelnas, aunque en la naturaleza existen o-aminoácidos y no al fa-aminoácidos. Todos los aminoácidos poseen por lo menos dos grupos funcionales acidos débiles, RNHH y R-CQOH, que, para los arninoacidos protelnicos, residen en el átomo de carbono alfa. Adernas, estos y otros grupos funcionares hcidos ddbiles ( 4 H , -SH, guanidino, imidazol) determinan que la carga neta en un aminoácido varíe con el pH. Por tanto, los arninoacidos son anfhlitos cuya carga neta a un pH dado depende de los valores de pK, de sus grupos funcionales. El pI es el pI4 en el que un amínohcido tiene e una carga neta igual a cero y por ende no s mueve en un campo elkctric~ corriente directa. de AdernBs de determinar las relaciones de carga y las clases de reacciones qulmicas que un aminohcido experimentará (por lo cual la formación del enlace peptidico es de suma importancia}, los grupos R y sus funcionalidades definen las funciones bioauimicas únicas para cada aminohcido. Las funcionalidades del grupo R proporcionan también una base para clasificar a los aminoácidos como básicos, ácidos, aramhticos, alifáticos y con contenido de azufre. Después de la separacion de mezclas de aminohcidos por particihn o cromatografia de intercambio iónico, estos compuestos pueden detectarse y cuantificarse por su reaccibn con ninhidrina. E

Figura 4-1 1. Aminoicidos unidos por un enlace peptídim (porei6n sombreada).

LA REACCION MAS IMPORTANTE DE LOS AMINOACIQOS ES LA FORMACIÓN DEL ENLACE PEPTIDICO
En principio, la formacion del enlace peptídico comprende la eliminacion de un m01 de agua entre el grupo aIfa-amino de un aminoácido y el grupo alfa carboxilo de un segundo aminoácido (figura4-11). N o obstante, esta reacción no procede en esta direccibn, ya que la constante de equilibrio favorece con firmeza la hidrólisic del enlace peptídico. Para sintetizar la unibn entre dos aminohcidos, primero debe activarse el grupo carboxilo. Desde el punto de vistaquimico, esto puede

REFERENCIAS
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Rattenbury 1981.

JM: Amrno Acid

Analysis. Halstcad Press,

Péptidos
. .

Vicior W. Rodwell, PhD

La polimerización de los L-alfa-aminoácidos por enlaces peptidicos constituye el marco estructural para las proteínas. Este capitulo describe las características de estos enlaces, las propiedades de los péptidos, los m&todos para deteminar la estructura primaria de los mismos y de las proteínas así como las tdcnicas para la sintesis de péptidos.

LOS L-ALFA-AMINOACIDOSSE UNEN MEDIANTE ENLACES PEPT~DICOS PARA FORMAR LOS PEPTIDOS
En la figura 5-1 se muestra un tripkpcido constituido por alanina, cisteina y valina. Advierta que un tripdptido es aquél formado con tres residuos. no con tres enlaces peptidicos. Por convencion, las estructuras peptidicas se escriben con el residuo amino-terminal (el residuo con un gmpo de alfa amino libre) a ta izquierda y con el residuo carboxiío terminal (et residuo con un gmpo alfacarboxiIo libre) a laderecha. Este péptido tiene un solo grupo alfa amino libre y un solo grupo a3fa carboxilo libre. Sin embargo, en algunos péptidos, los grupos terminales arnino o carboxilo pueden derivarse (por ejemplo, una amina N-fomilo o una amida del gmpo carboxilo) y por tanto no están libres.

Idos pdptidos tienen un enorme inteds biornédico, en particular para endocrinologia. Muchas de las hormonas son péptidos y pueden suminislrarse a los pacientes para corregir deficiencias (como la administración de insulina a pacientes con diabetes sacarina). Ciertos antibibticos son peptidos (por ejemplo, la valinomicina y la gsamicidina A), igual que algunos agentes antitumorales (como la bleomicina). Por su parte, el dipéptido aspartame se utiliza como edulcorante en muchas bebidas. La dpida síntesis quirnica y la tecnologia de recombinacibn del DNA facilitan la producción de cantidades sustanciales de hormonas peptídicas que en el cuerpo existen solo en concentraciones rninimas, por lo cual son dificiles de aislar en cantidad suficiente para usarse en teraptutica. La misma tecnologia permite la slntesis de otras péptidos, también disponibles de fuentes naturales, pero solo en cantidades pequeilas (es e caso de ciertos E peptidos y proteínas viralec), para usarse en vacunas.

Alanil

Cisteinil

Valloa

Figura 5-1. Fbrmula estructural de un tripkptido. Los enlaces peptídicos están sombreados para enfatizarlos.

Las estructuras de los péptidos son fáciles de representar
Por conveniencia, los peptidos se representan con su terminal amino a la izquierda y la terminal carboxilo a la derecha de la página. Para mostrar las estructuras de los péptidos, primero se dibuja la cadena principal o esqueleto y en seguida se agregan los grupos R apropiados. Escriba un zig-zag formado a partir de la secuencia de Atomos que se repite en el esqueleto o cadena principal: alfa-nitrbgeno, alfa-carbono, carbiin carbonilo.

alanilo, aspartilo, tirosilo). Los ptptidos reciben su nombre como derivados de la terminal carboxilo del residuo aminoacilo. Por ejemplo, el tmapéptido LisLeu-Tir-Gln se denomina como derivado de la glutamina y se le llama lisil-leucil-tirosil-glutamina. La terminación -ina en la glutmina indica que su grupo atfa-carboxilo no participa en la formación del enlace del péptido.

La estructura primaria afecta la actividad biológica
La mutación del DNA que altera codones puede producir la inserción de grupos aminoacilo inapropiados en un polipkptido o proteina. Aunque a menudo no tiene el mayor efecto biolbgico, en ocasiones incluso una sola sustitución puede reducir o abolir la actividad bioE6gica con efectos resultantes leves (es el caso de la intolerancia al alcohol en muchos asihtiticos) o mhs serios {como la enfermedad de ckluIas falciformes). Muchos errores metab6licos hereditarios comprenden un cambio sencillo de este tipo. Ai respeczo. b s nuevos mdtodos para determinar la estructura proteinica y del DNA han incrementado de manera notable la comprensión de la bioquimica de numerosas enfermedades metabolicas hereditarias.

Después, se completan las terminales atnino y carboxilo, se agrega un hidrogeno a cada uno de los alfacarbonos y a cada nitrógeno del pbptido; ademhs se añade oxígeno a los carbonos carbonilos.

Para dar nombre a los aminoácidos existentes en los péptidos se utilizan abreviaturas
Por ultimo, se incluyen los grupos R apropiados (con sombra) a cada átomo de alfa-carbono.

l C /c\ /N\ \ / COQN C

Se utilizan las abreviaturas de 3 y de 1 letras de los aminolicidos (cuadro 4-1) para representar las esmcturas primarias (figura 5-2). Las abreviaturas de tres letras ligadas por líneas rectas, qresentan una estructura primaria conocida e inequlvoca. Estas líneas se omiten para las abreviaturas de una sola l&a. Cuando hay
incertidumbre acerca del orden preciso de una porción de un polipkptido, los residuos en duda se encierran en parentesis y separados por comas (figura 5-3).

/ c\
/ Ci-h

H

O

l

H/C\cY I

Numerosos péptidos tienen actividad fisielogica La secuencia de aminoácidos determina la estructura primaria de un péptido
Cuando el número, estructura y orden de todos los residuos de aminoácidos en un polipéptido se conocen, su estructura primaria ha sido determinada. Los aminoácidos cuyos grupos alfa-carboxilo participan en la formacibn de los enjaces del péptido se designan "residuos aminoacilo". Estos se denominan mediante la sustitucibn de las terminaciones -ato o -ina de los arninohcidos libres, por la terminación -ilo (como

Las cklulas animales, vegetales y bacterianas contienen diversos polipkptidos de peso molecular bajo

Glu-Ala-Lis-Gli-Tir-Ala

E A K G Y A
Figura 5-2. Representacibn de 3 y 1 letra de un hexapbptido.

Figura 53. Heptapeptido que contiene una regidn de estruci tura primaria incierta (en el parbntesis)

(3 a 100 residuos aminoacilos) que tienen actividad fisioldgica importante. Algunos, incluyendo la mayoría de las hormonas polipeptidicas de tos marniferos, contienen solo enlaces peptidicos formados entre los grupos alfa-amino y alfa-carboxilo de los L-aifa-aminohcidos de las protelnas. Sin embargo, en los polipéptidos también pueden existir aminoacidos o derivados de aminohcidos proteinicas adicionales. El glutatihn (figura 541,en el cual el glutamato amino-terminal estB enlazado a la cisteína por un enlace alfa no peptidico, es requerido por varias enzimas. El glutatión y la enzima glutatibn reductasa participan en la forrnacibn de los puentes disulfuro correctos de numerosas hormonas proteinicas y polipeptidicas así como tarnbidn en el metabolismo de los xenobióticos (capitulo 6 1). Los antibióticos polipeptidicos elaborados por hongos contienen aminohcidos D y L así como otros no presentes en las proteinas. Ejemplos son la tirocidina y la gramicidina S, polipkptidos clcIicos que contienen n-fenilalanina y e[ aminohcido no proteinico ornitina. La hormona liberadora de tirotropina (TRH, del inglds, flyrotropin-releming hormone} (figura 5-5) ejemplifica otra variante más. El glutamato amino-termina1 experimenta ciclizaci6n a hcido pirogluthmico y el carboxilo del propilo carboxilo terminal se arnida. Un polipéprido de mamífero puede contener más de w +pido con actividad fisiol6gicapotente. Denm de n la estructura primaria de la beta-lipotropina (hormona hipofisaria que estimula la liberación de hcidos grasos del tejido adiposo) hay secuencias de aminohcjdos que son comunes a otras hormonas polipep-

Flgura 5-5. TRH (pir~lutamilhistidiIprolinamida).

tidicas con actividades fisioldgicas diversas (figura 54). El poli@ptido grande es un precursor de los poIipkptidos menores.

Los peptidoc con polielectrólitos
El enlace peptidico (mida) no estA cargado a cualquier pH de interés fisiolligico. Por tanto, la forrnacibn de péptidos a partir de arninohcidos a pH de 7.4 se acompafia de una pérdida neta de una carga positiva y una negativa, por cada en!ace peptidico formado. No obstante, a pH 5siolbgico los peptidos son maléculas con carga debido a sus grupos R ácidos o básicos.

El enlace peptidico tiene carácter de enlace doble parcial
Aunque los péptidos se representan con un enlace sencillo que conecta los htomos alfa-carboxilo y alfanitrdgeno, este enlace tiene en realidad un caracter de doble ligadura parcial (figura 5-7). No posee libertad de rotación alrededor de[ enlace que conecta a los htomos C y N. En consecuencia, los cuatro iitornos mostrados en la figura 5-7yacen en el mismo plano, esto es, son coplanares. Esta semirrigidez tiene consecuencias importantes para órdenes de estructura proteínica superiores al primer nivel. Por el contrario, hay plena libertad de rotacibn alrededor de los enlaces remanentes del esqueleto polipeptidico. En la figura 5-8, que resume estos conceptos, los enlaces que tienen rotación libre estan circundados por flechas y los átomos coplanares se han sombreado.

O II

CH,
I
II

H 1 I COO -

7%
I

/C\N/CH\C/N\CH, CHz 1 I

Las fuenas no covalentes restringen
O

H

la conformación de los péptidos
Un polipkptido puede tener un gran número de conformaciones (disposiciones espaciales). Sin embargo, en solución tiende a predominar un número mucho menor de conformaciones. Estas conformaciones favorecidas resultan de factores como bloqueo espacial,

H-C-NH~+
COO -

Figura 6 4 . Glutatibn (gamma-giutarnilcisteinil-glicha).Obsérvese el enlace ara no peptldiw que une a la Glu con Cis

42

a

Biogulmica de H a r ~ e r

(Capitulo 5)

Metioninaencefalina

Figura 54. Estructura primaria de la beta-lipotropina. Los residuos 41 a 58 son la hormona estimulante de los melanocitoc (0-MSH). Los residuos 61 a 91 mntienen las estructuras primarias de las endorfinas sefíaladas.

interacciones coulómbicas, puentes de hidrhgeno e interacciones hidrbfobas. T m t o para que las proteinas, como para que los poli@ptidos (capítulo 6) tengan actividad fisiológica se reqviercn ~onformaciones específicas.

El m g o de variacibn de los residuos no consewados de una proteína entre especies indica la divergencia de

SECUENCIACI~N PROTE~NICA: DETERMINACION DE LA ESTRUCTURA PRIMARIA

La comparación de las secuencias de
los peptidos muestra residuos clave e interrelaciones filogenéticas
La comparacibn de las estructuras primarias de una proteína determinada entre organismos con reIacibn distante, proporciona indicios vitales respecto al modo en que una proteína puede servir como componente del citoesqueleto, transportador de electrones o catalizador.

Ffgun 5-7. La estabilrzacibn por resonancia del enlace peptidico le confiere un cardcter de doble enlace parcial, de ahi la rigidez en el enlace C-N.

Ftgura 5 4 . Dimensionesde una cadena polipeptidica completamente extendidas. Los cuatro $tomos que se encuentran en las áreas sombreadas, las cuales son coplanares, comprenden al enlace polipeptidico Los átomos en las áreas no sombreadas son los átomos alfa carbono, alfa hidrbgeno y el grupo alfa R de un aminofiado en particular. La libre rotacibn puede producirse alrededor de los enlaces que unen el alfa carbono con el alfa nitrbgeno y las funciones del alfa carbonilo (flechas azules). La cadena de polipéptido extendida es asi una estructura semirrigida con dos teroeras partes de los Btomos de la estructura unidos en una relación planar fijada La distancia entre los Btomos alfa carbono adyacentes es de 0.36 nm (3.6 A) También se muestra la distancia interatbmica y los Angulos de enlace, los cuales no son equivalentes (Redibujada y reproducida con autoriracibn de Pauling L, Corey LP. Branson HR, The structure o€ proteins Two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide chain. Proc Natl Acad Sci USA 1957;37:205.)

las mismas durante la evolucibn. Las relaciones evolutivas estrechas se vinculan con un alto grado de semejanza de las secuencias. mientras que las relaciones mas distantes corresponden a más diferencias en las secuencias. Esta interrelacibn, que primero se documentb en el iibicuo residuo 104 a 1 11 del polipeptido transportador de electrones citocromo c, se mantiene como verdadera en un número cada vez mayor de proteinas.

Sanger fue el primero en secuenciar un polipéptido
Casi cuatro ddcadas han transcurrido desde que Sanger detenni116 la estructura primaria completa de la hormona polipeptidica insulina. La idea de Sanger h e separar primero las dos cadenas polipeptídicas, A y 0, de la insulina y entonces convertirlas, mediante separación enzimhtica especifica, en péptidos más pequeílos que contuvieran regiones de secuencia sobrepuesta. Utilizando el reactivo l -fluoro-2,4-dinitrobenceno (figura 5-9), entonces removio e identificó, uno en cada ocasibn, los residuos aminoterminales de los aminokcidos de estos pkptidos. Por medio de la comparación de las secuencias de péptidos sobrepuestas. fue capaz de deducir una estructura primaria inequívoca para ambas cadenas, A y B. Las siguientes dos tkcnicas han revolucionado la determinación de las estructuras primarias de los polipkptidos (proteínas). La primera fue la introducci6n por Edman, en 1967, de un procedimiento para la separacion e identificación automfitica de residuos ítmino terminales de aminoácidos asi como sus derivados feniltiohidantoinicos. La segunda fue la introducción independiente por Sanger y por Maxm y Gilbert de tkcnicas para la secuenciación rápida del DNA. En la actualidad, la estrategia óptima consiste en utili7ar ambas técnicas de manera simulthnea.

Los peptidos se purifican antes

del análisis
Los datos de secuenciacion de los pdptidos serlan ininterpretables a menos que la homogeneidad peptídica. valorada por EGPASDS. excediera de 95 por ciento. Por tanto, los pkptidos deben purificarse primero mediante tkcnicas convencionales de purificacibn de proteínas (capitulo 8. )

Por lo general primero se determina la composición de los aminoácidos
1,a determinación de los aminoácidos que componen un péptído, por lo general, se lleva a cabo antes de iniciar la secuenciacion, para identificar los posibles escollos y, de manera subsiguiente verificar los datos de secuenciacidn. Primero se rompen los enlaces peptldicos que unen a los aminohcidos por hidrólisis. Luego, los aminoicidos liberados se separan e identifican por LLAR o cromatografia de intercambio i6nico. Ningun procedimiento hidroliza pkpcidos de manera total sin algunas pdrdidas. El mdtodo de: eIeccibn es la hidrdlisis de muestras repetidas en HCI 6N a 110 "C en tubos de vidrio sellados al vacío por 24, 48,72 y 96 horas. Esto destruye todos los Tri y Cis, y si estan presentes iones rnetblicos, se pierde algo de Met y Tir. I,a recuperacibn de Ser y Tre es incompleta. Los enlaces Val-Val, Ile-[le, Val-Ile e Ile-Val, son muy resistentes a la hidrdlisis, en tanto que Gln y Asn son desarninados a GIu y d s p . ¿Cómo se superan estas dificultades? Antes de la hidrdlisis, la Cis se convierte en hcido cisteico, un derivado ácido estable. El Tri se mide desputs de la hidrdlisis bhsica, proceso que destruye a la Ser, Tre, Arg y Cis. Los datos de Ser y Tre se extrapolan al tiempo cero de la hidrdlisis. La Val y la t e u se determinan de datos obtenidos a las 96 horas. Sobre los hcidos dicarboxilicos y sus arnidas se informan de manera colectiva como "Glx" o "Asx". Por ultimo, dado que las proporciones relativas de cada aminohcido deben expresarse en números enteros, las fracciones decimales se redondean al nhrnero entero más próximo.

Las estructuras primarias de los polipéptidos se determinan por la técnica automatizada de Edman
Dado que numerosas protelnas están constituidas por más de una cadena polipeptidica ligada por fuerzas no covalentes o pos puentes disulfuro, es posible que el primer paso sea disociar y separar las cadenas poli-

Figura 5-9. Reacción de un arnino~cidocon 1-fluoro-2,4dinitrobsnmno (reactivo de Sanger). El reactivo recibe ese nombre en honor del bioqulmico Frederick Sanger, laureado con el premio Nobel en 1958. quien lo us6 para determinar la estructura primarta de la insulina.

peptídicas individuales. Los agentes desnaturalizantes como ta urea o el clorhidrato de guanidina destruyen los puentes de hidrógeno, y disocian polipéptidos unidos de modo no covalente. Por su parte, los agentes oxídantes y reductores rompen los puentes disulfuro (figura 5-1 0). Entonces los polipCptidos son separados pos cromatografia.

anhidrido citracbnico (una reacción reversible) para cambiar su carga de positiva a negativa, ahora la tripsina se separa solo despues de Arg. La obtención de residuos de arginina es menos útil, debido a la abundancia relativa de residuos de lisina. No obstante, resulta de utilidad en la divisihn subsecuente de fraprnentos obtenidos con CNBr.

Los polipéptidos largos se fraccionan antes de su secuenciación
[,os instrumentos automáticos mas eficaces para Ia obtencibn de secuencias (secuenciadores) operan sobre polipéptidos de 20 a 60 residuos de longitud. Por tanto, es deseable una partición especifica y completa en sitios relativamente raros. Los reactivos siguientes cumplen con este requerimiento.

C. o-Yodosobenceno
El o-yodosobenceno fracciona los relativamente escasos residuos de Trí-X. No se requiere una proteccibn previa de los demas residuos.

D. Hidroxiiamina La hidrox i larn ina separa los enlaces comparativamente raros de Asn-Gli, aunque por 1 general no 0
da resultados cuantitativos.

A. Bromuro de cianógeno (CNBr)
Inicialmente, los residuos de cisteina son modificados con ácido yodoacético. Despuks, el CNBr rompe en el lado COOH de la Met. Puesto que la metionina es comparativamente escasa en los polipéptidos, por lo general se producen fragmentos peptidicos dentro de los limites de tamafio deseado.

E. Proteasa V8
La proteasa V8 de Staphylococcus aureus separa los residuos Glu-X-pdptido con preferencia por condiciones en que X es hidrdfobo. La uni6n Glu-Lis resiste el fraccionamiento. Esta reaccibn es útil para la degadacibn subsecuente de fragmentos obtenidos con bromuro de cianógeno.

B. Tripsina
La tripsina rompe el lado COOH de los residuos Lis

y Arg. Si los residuos de lisina son obtenidos con

F. Hidróiisis con ácidos moderadamente débiles
Esta separa el enlace raro ~sp-!+o.

La secuenciación requiere de múltiples digestiones
Las 2 o 3 digestiones del polipdptido original, normalmente en Me[, Tri, Arg y Asn-Gli, combinadas con subdigestiones apropiadas de los fragmentos resultantes, por lo general permitir& la determinacibn de la estructura primaria completa del polipeptido. Exceptuando algunas dificultades extraordinarias en la purificacibn de los fragmentos, kstapuede efectuarse con unos pocos micromoles del polipéptido.

LAS MEZCLAS DE PÉPTIDOS DEBEN SEPARARSE ANTES DE LA SECUENCIACI~N
La purificación de fragmentos se logra principalmente por filt~aci6nen gel en iicido acético o fbmico por cromatografia liquida de alto rendimiento de fase invertida (CLAR) o por cromatografía de intercambio i6nico en fosfocelulosa o en sulfofenil-Sephadex en soluciones de k i d o fosfbrico.

Figura 5-10. Separacibn oxidativa de cadenas polipeptldicas adyacentes enlazadas por puentes disulfuro (sombreado) por Bcido perfbrmrco (lzqulerda) o la separacidn reductiva con beta-mercaptoetanal (derecha) forman dos pbptidos que incorporan residuos de Acido eisteico o de cisteinilo, respectivamente.

A. Cromatografia de intercambio iónico y electroforesis de alto voltaje (EA
Estas técnicas (capitulo 4), que separan con base en la carga, se adican a polipkptidos de peso molecular bajo y también a aminoácidos. El valor de pK para el grupo carboxilo-terminal del hcido alfa-carboxilico de un polipéptido es más alto que el del grupo alfacarboxilo en el aminoAcido correspondiente (es decir, el COOH peptídico es un hcido mas dkbil). De m a n e p inversa, el grupo amino-terminal es un ácido rnhs fuerte (tiene un pK menor) que el aminoacido del cual proviene.

someten a etectroforesic en presencia del compuesto desnaturalizante dodecilsulfato sbdico (SDS). Ea molécula con carga negativa CH3-(CH2)ii-S012recubre a los pkptidos en la proporcibn aproximada de un SDS por cada dos enlaces peptidicos. Esto "sumerge*' la carga original de la proteina, volviendola fuertemente negativa. Así, las separaciones subsiguientes se basan de manera primaria en el tamaflo molecular. El EGPA-SDS se usa de manera extensa para determinar los pesos moleculares de péptidos por comparación de sus movilidades con la de esthdares de pesos moleculares conocidos.

B. Filtracibn en gel
La secuenciación automatizada utiliza cantidades pequeiias de polipéptidos grandestde30 a 100 residuos). Sin embargo, muchos polipkptidos de peso molecular alto desnaturalizados pueden ser insofubles debido a la exposicibn de residuos hidrófobos antes escondidos durante la desnaturalimciiin. Aunque la insolubilidad puede resolverse con urea, alcoholes, hcidos orgánicos o bases, estos restringen el uso subsiguiente de tCcnicas de intercambio ibnico para la purificacibn de péptidos. Sin embargo, la filtración en gel de ptptidos hidrbfobos grandes puede llevarse a cabo entre hcido formico o acético, I y 4 molar. Esta tkcnica separa moliculas de tamaflos diferentes con base en su exclusión o inclusión en los poros de un filtro molccular como Sephadex.

Para la secuenciación se utiliza la reacción de Edman
La secuenciación automatizada utiliza el reactivo de Edman, fenilisotiocianato. La reaccion de secuencia (figura 5-1 1) libera el aminohcido arnino-terminal como un derivado de la feniltiohidantoina, el cual se identifica mediante C LAR. E! prbximo arninoálcido por secuenciar entonces se deriva y se elimina; luego se repite el proceso. Una secuencia de 30 a 40, o, en ocasiones, 60 a 80, residuos aminoácidos se determina en una operación continua. Las reacciones de Edman se llevan a cabo en una pelicula delgada sobre la pared de una cámara de reaccibn giratoria o en una matriz s61ida a la cual el carboxilo terminal del pdptido se ha acoplado de manera covalente. La secuenciación en fase gaseosa, una técnica en fase sblida, emplea reactivos gaseosos y facilita la remoción de productos gaseosos. Los metodos de secuenciacibn en fase sólida son aplicables a cantidades muy pequefias de péptidos, en algunos de hasta 1 pg.

C. CLAR de fase invedida
Una tdcnica potente para la purificación de péptidos no polares de peso molecular grande es la cromatografia líquida de alto rendimiento en material no polar con elucibn mediante solventes polares (CLAR de fase invertida). La filtracibn en gel y la CLAR de fase invertida se emplean juntas para purificar las mezclas complejas de péptidos obtenidas por digestibn parciai de proteinas.

Deben secuenciarse varios péptidos sobrepuestos
Conocer la secuencia de todos los peptidos CNBr de una proteina no proporciona, por si mismo, su estructura primaria completa ya que no se sabe el orden en que estos péptidos se encuentran en la proteína. Para deducir una estructura primaria inequívoca tambikn deben prepararse y cecuenciarse péptidos adicionales cuyas teminaies m i n o y carboxilo se sobrepongan con los de los peptidos CNBr. Estos ptrptidos adicionales se producen por tecnicas (por ejemplo, digestion con quimiotripsina) que dividen la proteina en otros lugares distintos aresiduos Met. Luego, L deduccibn de a una estructura primaria inequivoca por comparación de secuencias peptidicas se efectiia por un proceso aniilogo al ensamblaje de un rompecabezas (figura 5-12). Para localizar los puentes disulfuro, los péptidos de protelna sin tratar y de proteina reducida u oxidada

D. EA V en filtros moleculares
La filtracirin molecular puede usarse junto con la separacibn por carga para facilitar la particibn. Aunque es posible emplear almidbn y agarosa, el soporte mhs común es un polimero de enlaces cruzados de acrilarnida (CHi=CN-CONH2). Para la electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA), las soluciones de proteínas se vacian en tubos o se aplican en placas que contienen un amortiguador de poliacrilamida can 2 a 10% de enlaces cruzados por inclusibn de bisacrilamida de metileno (bis) (CHZ=CH-CONH~)~-CH~ o reactivos con enlaces cruzados similares. Luego se aplica corriente directa. La visualizacián se logra por tincibn con azul de Coornassie o Ag". Una variante popular es la EGPA bajo condiciones de desnaturalizacihn. Las proteinas se hierven y a continuacibn se

46

0

Bioquímica de H q e r

(Capítulo 5j

Fenilisotrocianato(reactivode Edrnan)
y un peptido

Pomi6n

C-terminal del peptido X

Porcibn

N-terminal
del pbptido Y

Figura 5-32. Uso del peptido Z sobrepuesto para deducir que los pépttdos X y Y ectbn presentes en la proteina original enelom'enX~Y,noYtX.

La secuenciación de péptidos y de DNA son técnicas complementarias
Aunque la simplicidad y velocidad de la técnica de secuenciacibn del DNA (capítulo 42) ha revolucionado la forma en que se determinan las estructuras peptidicas; la secuenciación de péptidos y DNA son tecnicas complementarias más que mutuamente exclusivas, cada una con ciertas ventajas. En tanto que las estructuras primarias de las proteínas se pueden deducir mediante la secuenciación de los genes que Eas codifican, la secuenciacibn directa de las proteínas continúa siendo esencial para el anhlisis de su estructura. La secuenciación del DNA no puede mostrar la posición de los puentes disulfuro o la presencia de otras muchas modificaciones postraslacionales. Los codones triples y tas moléculas apropiadas de tRNA solo se encuentran disponibles para Eos 20 arninoacidos más comunes. Por tanto, la secuenciacjbn del DNA no puede revelar la presencia de propilo, hidroxilisil o un hutsped metilado, isoprentilado, fosforitado, esterifjcado u otros residuos aminoacilo postraslacionales modificados que efecttian funciones esenciales en proteinas especificas. Así, la técnica de Edman continuarii siendo fundamental para demostrar la determinación esrruct~ralde pkptidos y proteínas. Aunque la secuenciacibn de péptidos no presenta estas desventajas, muchos de ellos experimentan una o más modificaciones postraslación por procesamiento proteolítico. Por tanto, la secuenciacibn de DNA es una ayuda valiosa para detectar prepéptidos y prepropkptidos Ilibiles importantes en la cathlisis (capitulo 10) o en la sefializacibn de péptidos dirigidos a organelos subcelulares específicos.

metano

Una feniltiohidantolna y un peptido mds corto en un residuo

Figura 5-71. Reaccidn de Edman. El fenilisotiocianato reacciona con el amino-terminal de un residuo de un peptido para dar acido feniltiohidantotw El tratamiento con acido en un solvente hidroxilim libera una feniltiohidantoína la cual es identificada posteriormente mediante su movilidad crornatogrhfica y un phptido mas corto en un residuo. Entonces el proceso se repite

se separan por cromatografía bidimensional o por electroforesis y cromatografía (huellas dactilares). La visualizacidn con ninhidrina revela los piptidos mhs escasos en la digestión de protelna sin tratar y un pkptido adicional en la digestibn de proteina tratada. Con el conocimiento de la estructura primaria de estos péptidos, es posible inferir las posiciones de los puentes disulfuro.

La espectometria de masas puede utilizarse para secuenciar péptidos
El bombardeo rápido de fitomos (BRA) unido a la espectrometria de masas (EM), en dos espectrómetros

de masa integrados. proporciona un camino alternativo para secuenciar péptidos con longitud de alrededor de 25 residuos. El bombardeo rápido por átomos de argon o xenbn, de los htomos de un péptido disuelto en glicerol forma un ibn pkptido con carga positiva. El primer espectt-ografo de masa limpia el ion gkptido de iones contaminantes, y luego lo transfiere a una celdilta en donde colisiona con atomos de helio. Debido a la energía que absorbe, el ion pkptido se fragmenta a partir de sus dos terminales con lo cual forma mliltiples iones de tamafío decreciente.Entoncw, en el segundo espectrómetro de masa se determina la masa molecular de estos fragmentos del ion. La comparacion de los iones de acuerdo con los incrementos sucesivos de masa, permite la identificación de todos los fragmentes aminoacilo y de la secuencia del péptido completo. La tkcnica BRA dirigida por computadora es muy rápida, no requiere pkptidos altamente purificados, identifica residuos modificados por traslacibn y, a diferencia de la tdcnica de Edman, puede cecuenciar péptidos cuyas terminales amino están bloqueadas (por ejemplo, aciladas). En comparación con los secuenciadores avanzados de Edman, las principales desventajas del BRA-EM son su alto costo y menor sensibilidad.

LOS PÉPTIDOS PUEDEN SINTETIZARSE MEDIANTE TECNICAS AUTOMATIZADAS
Las péptidos que se obtienen mediante síntesis qulmica sirven como fArmacos o aditivos alimentarios. La capacidad para sintetizar conjuntos de peptidos similares, cuyas estnicturas primarias difieren sblo un poco, permite profundim en el conocimiento de la relacibn entre la estructura del péptido y la actividad bioldgica. La qufmica básica de la sintesis de los péptidos, desarrollada a fines del decenio de 1800 por el químico a l e m h Emil Fisisher, proporciona los elementos para la activaci6n de los grupos carboxilo y para la adición y eliminación de los grupos bloqueados, que evita reacciones colaterales indeseables. Muchos aAos despues, las tkcnicas de sintesis de los pbptidos fueron evolucionados por Bmce MerrifieEd (Premio Nobel 19841, quien desarrollb la síntesis en fase dlida. La tdcnica automeica de síntesis de Merrifield que produce ptptidos largos sintkticos en periodos cortos, inicib un renacimiento en la química de los péptidos.
Figura 5-13, Representaubn sirnbblica de la sintesis de un dipéptido genérico por la técnica de fase s6Fida iniciada por MernReld Véase el texto para explicación de los simbolos.

la termina carboxito del residuo aminoacilo), rnediante la tkcnica en fase s6lida de Merrifield y resume las reacciones que se requieren para sintetizar un ptptido de cualquier tamaño deseado. Estos pasos son como sigue:

1) Proteger las terminales amino del aminohcido A (en blanco) y del arninoiicido B (en negro) con el grupo t-butiloxicnrboniIo (t-BOC) (m):

Síntesis de peptidos en fase sólida La figura 5-1 3-muestra sintesic de un dipéptido A-B la representativo (en el cual A es la terminal m i n o y E

famando t-BOC-A y t-BOC-B. 2) Activar el gmpo carboxilo de t-BOC-B con diciclohexilcarbodiimida (DCC) (b):

48

Bioquimica de Hurper

(Capítulo 5)

3) Hacer reaccionar al grupo carboxilo del aminoácido A (que se convertírh en el residuo carboxilo4)
terminal del peptido) con una resina activada de poliestireno insoluble @I Eliminar al grupo protector de r-BOC-A con ácido tnfluoroac&tico(TFA, F 3 C 4 0 0 N )a la temperatura ambiente. (Nota: En la prhctica, es posible omitir los pasos 3 y 4 puesto que ya se dispone en el comercio de resinas con cualquier aminoácido f-BOC conectado por un enlace éster a una moltcula "enlazadora" de fenilacetamidometilo, PAM, del inglks, p h e ~ lucetamidometkyí),adherida al pol iest ireno. Condensar el grupo carboxilo activado de t-BOCR con el grupo amino libre del inmovilizado A. Eliminar el grupo protector (d-BOC) con TFA (véase paso 4). Liberar el dipéptido A-13 de la particula de resina por tratamiento a -2 "C con hcido hidroflubico (HF) en diclorometano.

5)

6)
7)

Los logros iniciales de la técnica de Merrifield fueron la síntesis de las cadenas A y B de inculina y de la enzima pancrektica ribonucleasa. Mejoras subsecuentes han reducido el tiempo para la sintesis y han incrementado el rendimiento de manera significativa. Esto ha abierto el campo para producir vacunas y hormonas polipeptldicas y aun puede pensarse en tratar errores congénitos del metabolismo seleccionados.

RESUMEN
Los pkptidos, formados por la pérdida de agua entre los grupos carboxilo y amino de los aminohcidos, se designan de acuerdo al numero de aminoicidos presentes. Sus estructuras primarias (orden de aminoácidos listados desde la amino-terminal) determinan la actividad biológica y las conformaciones. Los péptidos

pequefios pueden contener enlaces diferentes a alfa-peptidilo y aminolcidos poco comunes. Como poiielectrblitos, los pkptidos se separan por crornatografia de intercambio iónico y técnicas electrofor&ticas. El carácter de doble ligadura parcial del enlace que une al carbono del COOH y al N de un péptido, hace que cuatro Iitomos del enlace peptidiw sean coplanares. Esto limita el numero de conformaciones peptidicas posibles. En solucibn. estas conformaciones son restringidas aún m8s por fuerzas no covalentes. Despuks de la hidrblisis Acida es posible deteminar la composición de los péptidos purificados, pero se requiere correccihn por perdida de ciertos aminolcidos. La determinacibn de la estructura primaria emplea tkcnicas de Edman automatizadas, que pueden realizar la secuenciacibn en cantidades tan pequefias de hasta microgramos de phptido purificado. Primero se oxidan o reducen los enlaces disuffuro. Las péptidos grandes se escinden en sitios raros con reactivos como CNBry los pkptidos resultantes se purifican por filtración en gel y CLAR. Luego pueden enlazarse por su terminal carboxilo a un soporte sólido para facilitar la secuenciacibn.Lar operaciones automáticas subsiguientes comprenden quimica de líquidos o reactivos y productos gaseosos que facilitan la recuperación y purificacibn de la muestra. Por lo general pueden secuenciarse hasta 40 residuos mino-tem inales sucesivos. Para definir el orden de ensamblaje de los ptptidos secuenciados en el polipéptido original. se determina la secuencia de péptidos sobrepuestos generados por diferentes ttcnicas de partición. De manera alterna, los enlaces entre péptidos pueden inferirse de la secuencia de DNA del gen apropiado. Por tanto, las tkcnicas de secuenciacion de DNA y péptidos son complementarias, no mutuamente excluyentes. Ademis, las tkcnicas automáticas permiten la síntesis inequívoca de pdptidos de estructura primaria conocida y actividad biol6gica completa..

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Proteínas: estructura y función
Victor W Rodwell, PhD

dc vilaminas, oxígeno y bióxido de carbono, ademAs de

Las características comunes a todas las proteinas incluyen restricciones en su conformación por enlaces covalentes y no covalentes. En este capítulo 5e analizan las estructuras secundaria, terciaria y cuatemarfa de las proteínas. con énfasis en las fuerzas que estabilizan estos ordenes m& elevados de estructum y los metodos físico5 empleados para examinarlos. Los principales temas iiicluyeii hdlice alfa, hoja beta, giro beta y asa; el modo en que estas estructuras características secundarias Sorman dominios y estructuras terciarias; así como el ensamblado de polipiptidos en subunidades de proteinas multiméricas. Además, se examinan las vias propuestas para que las proteíiias se plieguen y el papel de las chaperoninas {proteinas acornpafiantes)y de otras proteinas accesorias que facilitan el rápido y correcto plegamiento in vnJo Las ~amcterísticn~ y comentarios mencionados antes generalmente son validos para todas aunque algunas proteinas especificas pueden mostrar estructuras secundarias y terciarias peculiares que Ies confieren propiedades para cumplir funciones biologicas también especifica. Se ilustra la estrecha vinciilacilin entre estructura y funci6n biolhgica de estas rnolt5culas mediante dos proteinas fibrosas que tienen funciones estructurales: la fibroina de la seda y el colageno. Los capitulos subsecuentes amplian esta estrecha reIaci6n al estudiar las proteinar globulares mioglobina y hemoglobiiia así como las proteínas catalíticas conocidas como eiizimas.

llevar a cabo actividades estructurales, cineticas, cataliiicas y de señalización. Por tanto, no deben sorprender las terribles consecuencias que pueden surgir de mutaciones en genes que codifican proteínas o en regiones de DNA que controlan la expresibn genktica Asimismo, pueden derivar consecuencias igualmente desastrosas de la deficiencia de cofictores csenciales para la maduración de una proteína. El sindrome de EhlersDanlos ilustra defectos geneticos en la rnaduraciOn proteínica y el escorbuto la deficiencia de un coiactor esencial para esta maduracion.

LAS PROTE~NAS CLASIFICAN SE EN NUMEROSAS FORMAS
Si bien no existe un sistema universal, las proteínas pueden clasificarse con base en su solubilidad, forma, función biolbgica o estructura tridimensional. Un sistema de uso limitado en bioquimica clinica las clasifica como "albiiminas", "globulinas". "historias", etcétera, dependiendo de su solubilidad en soluciones salinas acuosas. Tambikn pueden clasificarse bashndose en su fonna global. Así, las proteinas globulares (por ejemplo, numerosas enzirnas) tienen cadenas polipeptidicas enrolladas, plegadas cn forma compacta y proporciones axiles (proporciones dc longitud a anchura) menores de 10 y que iio exceden de 3 a 4 por lo general. Las proteinas fibrosas tienen proporciones axiles mayores de 10 Las proteinas pueden clasiticarse según sus funciones bioIogicas en: cnzimar (deshidrogenasas, cinasas), proteinas de alrnacenainiento (ferritina, mioglobina), reguladoras (proteínas unidas a DNA, hormonas peptídicas), estructurales (colligeno, proteoglucanos), protectoras (factores de coagulación sanguínea, inrnu-

IMPORTANCIA BIOMEDICA
Los millares de proteínas presentes en el cuerpo humano realizan funciones demasiado numerosas para enumerarlas. Entre ellas están: servir como portadores

52

Bioquírnicu de Harper

(Capitulo ti)

noglobulinas), de transporte (hemoglobina, Iipoproteinas plasnihticas) y contráctiles o dotadas de motilidad (actina. tubilina). Sistemas especialiados de clasificacibn distinguen ciertas proteinas complejas de interés médico elevado. De este inodo, las lipoproteinas plasmhticas se denominan de "origen", lipoproteinas alfa,, alfaz o beta de acuerdo con su movilidad elemforéticaap1-I 8.6;o como quilomicrones, VLDI,, 1-DL, HDL o VHDL basándose en sus propiedades de sedimentación en una ultracentri fugación (figura 6- 1 ). Las lipoproteínas puedcn clasi ficarse tam bien por deteminacibn inmunol0gica dc las apopruteinas presentes (A, B, C, D, E, F). Asimismo. las semejanzas en la estructura tridimeiisional. reveladas principa2rnente por cristalografia con rayos X. proporcionan una base potencialmente valiosa para la clasificación de proteinas. Por ejemplo, las proteinas qiie unen nuclcótidos comparten un dominio fijador de nucleiitido de estructura terciaria.

unen e incluye la uhlcacidn de los enlaces bisulhro. La estructura primaria se determina por métodos descritos para polipkptidos en el capítulo S. El nbrnero de las secuencias conocidas de proteínas es tan grande y crece con tal rapidez que, en la actualidad, en vez de disponer de formas impresas, los datos de las secuencias se depositan en bases de datos electrhnicac de secuencias de proteinas a las cuales se puede tencr acceso a través de Internet. Las bases de datos importantes continuamente actualizadas inc lu yen EM R L (Europeun Molecu~ur 13ioloa Laboraiory Oaia I,ibrary), GenBank (Genefic Sequence Dafabank), y PIK (Protein fdenllficdron Resource S~quence Dufuhuse).

ESTRUCTURA SECUNDARIA
Configuración y conformación
El tkrtnino "configuracion" se refiere a las relaciones gcométricas entre un conjunto dado de htomos, La interconversión de alternativas diferentes de configuracibn (por ejemplo, !a conversión de 0- a L-alanina) sulo se puede logmr rompiendo y restableciendo uniones covalentes. fl importante término similar "conformación " se refiere a la arquitectura tridirnensional de una proteína. las relaciones espaciales de todos los itomos entre sí. La interconversión de estructuras conformadas no implica la rotura de uniones covalentcs sino la rotura y restablecimiento de fuerzas no covalentes (puentes de hidrógeno, puentes salinos, interacciones hidr~fobas) que estabilizan una conformaci6n dada Incluso después de excluir las ~onfonnaciones las que interacciones estcricas impiden, la rotación libre alrededor de las dos terceras partes de las uniones covalentes dc la cadena principal de un polipéptido (figura 5-81 permite clasificar por etapas un gran númcro de conformaciones posibles para una proteína d e t e n i nada. Sin embargo, para una cierta proteina s61o un pequefío número de posibles conformaciones tienen significacibn biolbgica.

ESTRUCTURA PRIMARIA
La estructura primaria de la cadena polipeptidica de una proteína es el orden en el cual los aminoacidos se

Diferentes fuenas que estabilizan las estructuras proteínicas
Tama Ao
Más graride

Figura 6-1. Magnitud y densidad de distribucibn de las lipoproteínas (CHYLO. quilomicrones; VLDL, lrpoproteinas de muy baja densidad, LDL. Iipoproteinas de baja densidad, HDL, lipoproteínas de alta densidad; Lp [a], Iipoproteina [a]) (Reproducida con autorizacibn de Segrest JP y colaboradores The amphipathic alfa-helix A rnultrfundionalstructural motrf in plasma Itpoproteins Adv Protein Chem 1995;45 303)

Varías interacciones no covalentcs que individualmente son dgbiles, pero formidables en número. estabilizan la conformacion de una proteina. Estas fuenas incluyen puentes de hidrhgeno, interacciones hidrófobas, interde acciones electrostáticas y f u e r m ~ van der Waals.

Puentes de hidrógeno
En la superficie de las proteinas globulares por lo general se encuentran residuos con grupos R polares,

Proteinus: esfrucfura función y

53

los cuales forman puentes de hidrógeno principalmente con moléculas de agua. Por otra parte, los residuos aminoacilo del esqueleto carbhnico forman puentes de hidrogeno entre si.

repulsión es mínima se denomina distancia de contacto van der Waals. Los átomos tienen un radio van der Waals característico y la distancia de contacto óptima entre dos es la suma de sus radios van der Waals.

Interacciones hidrófobas
Las interacciones hidrófobas implican a los grupos R no polares de los residuos arninoacilo que en las proteínas globulares típicas residen en el interior de E proteína. La a formación de interacciones hidrhfobas es "conducida por la entropia". Una forma esférica regular reduce al mínimo el área de supedcie. [,a concentracibnde residuos no polares en el interior de la proteína disminuye cI número de residuos superficiales e incrementa al m b u n o la oportunidad para que la pelicula superficial de moldculas de agua formen puentes dc hidrhgeno entre si, uii proceso relacionado con un incremeiito de la entropia. Por cI contrario, el ambiente no polar dc las membranas biológicas favorece a los residuos hidrófobos de la superficie. cuyos grupos R no polares participan en interacciones hidrlirobas con las cadenas laterales alquil de los ésteres acilgrasos de las bicapas de la membrana.

Uniones peptídicas que restringen las posibles conformaciones secundarias
La rotacidn solo es posible alrededor de 2 de las 3 uniones covalentes que forman el esqueleto polipeptidico de las proteínas. El carhcter de doble unión parcial de la ligadura que unc el grupo carbonilo al nitrógeno alfa de la uniiin peptidíca restringe de manera significativa las confomaciones posibles de los átomos que la constituyen, la cual debe ser coplanar (figura 5-8). La rotación sólo puede darse alrededor de las unioncs entre e carbón alfa (Cm) carbbn carbonilo (C,) y al E al se nitrogeno. El ángulo alrededor de la unión C,-N denomina ángulo fi (m) y el que se encuentra alrededor de la unión C,-C, es el ingulo psi (Y). No e s t h permitidas las combinaciones de los IinguEos fi-psf qiie produ7can impedimento estérico entre los Atomos no s unidos. Cuando se especifican todos los ~ g u l o fi y psi, se conoce la conforrnaci6n de la totalidad de Atomos de la cadena principal o esqueleto de u n polipéptido. Por tanto, el anhlisis de los datos crista1ogr;ificos empieza con la deteminacilin de los principales ángulos fi y psi de la cadena. G.N. Ramachandran fue el primero en emplear una grhfica de los Angulos fi contra los ángulos psi para ilustrar tanto los valores permitidos como los numerosos, no permitidos (figura 6 - 1Las combina12. ciones estéricamente permitidas caracterizan a la Ii&licealfa y a la hoja plegada beta y a la helice triple de colágeno w a l i ~ a d a más adelante.

Interaccionec electrostáticas
Las interacciones eiectrosthticac o puentes salinos se forman entre grupos con carga opuesta, como los gmpos terminales amino y carboxilo de los péptidos y los grupos R cagados de los residuos aminoacilos. Aunque todos los gmpos con carga forma1 tienden a localizarse sobre la supesficie las proteínas globulares, hay excepciones, pues existen grupos polares específicos ejecut a n t e ~de funciones biológicas indispensables, los cuales es posible que residan en hendiduras quc penetran hasta el interior de la proteína. 13uesto que los residuos polares también pueden participar en interacciones ihnicas, la presencia de sales como KCI puede disminuir de manera significativa las interacciones iónicas entre los residuos de la superfície.

Las conformaciones regulares e irregulares caracterizan a la estructura secundaria
La conformacibn de los esqueletos polipeptidicos de las proteínas constituye su estructura secundaria. Al principio, la existencia de una estructura secundaria se propuso con bases exclusivamente teoricas, pero despuks los analisis cristalográficos de rayos X las confirmaron ampliamente. Los tipos de estructura secundaria esthn limitados por el carlicter de doble uni6n parcial de la unibn peptídica (figuras 5-7 y 5-8) y por el tarnaiio y la forma de los grupos R arninoácidos. Las estructuras secundarias incluyen, ademas de Ias unidades hélices alfa regulares repetitivas, las hojas beta y las incurvaciones beta con formaciones irregulares denominadas asas o bobinas.

Interacciones de las fuerzas de van der Waals
Las fuerzas de van der Waals, que son sumamente dkbiles y sblo actúan a distancias extremadamente cortas, incluyen componentes de airaccihn y de repulsión. Las fuerzas de atraccibn implican interacción enve dipolos inducidos formados por las occilaciones instanthneas en la distribucion de electrones en los htomos cercanos. Las fuerzas repulsivas entran en juego cuando dos Atomos se aproximan tanto que sus orbitales electrónicoc se superponen. La distancia a la cual la fuerza de atracciciii es rnAxima y la fuerza de

Waals que pueden formar y estabilizar un tipo determinado de hdice. Las helices alfa tienen ángulos favorables fi y psi y un patrbn de uniones de hidriigeno que les conficre la máxima estabilidad. Las hklices alfa de proteínas contienen, en todas partes, de 4 a 50 residuos (en promedio cerca de 12 residuos). Los parametros relevantes de una helice-alfa (figura 6-3) son n = 3.6 residuos por vuelta y p = 0.54 nm (5.4 A). La distancia a 10 largo del eje de la hélice que separa htornos equivalentes en las cadenas principales, de los residuos adyacentes es de O. 15 nrn (1.5 A). Los grupos Rarninoacil se dirigen hacia afuera del eje de la hClice (figuras 6 4 y 6-51, lo cual reduce al mínimo la interferencia esterica.

Las uniones de hidrógeno y las f u e n a s de van der Waals estabilizan las hélices alfa

Q
Figura 6-2. GrBfica de Ramachandrande 10s ángulac fi y pci de la cadena principal para 1000recidvos no giicina aproximadamente, en ocho proteinas cuyas estructuras fueron resueltas a resolución alta. Los puntos representan las mmbinaciones pemitidas y los espacios las combinaciones prohibidas de Bngulos fi-psi (Reproducida con autorización de Richardson JS. The anatomy and taxonomy of protein structures Adv Protein Chem 1981,34 167.)

Puesto que la hélice alfa es la confomacibn de menor Y más estable para una cadena de P ~ ~ ~ se forma de manera espontánea. La estabilidad de las

P

La hélice alfa
Cuando se gira el esqueleto de iin polipeptido por una magnitud igual alrededor de cada carbón alfa, se forma una bobina o hélice. Los diferentes tipoc de hélices

formados cuando los giroc tienen dirección y extensibn diferentes se describen según el número (n) de residuos aminohcidos por vuelta y el paso Ip) o distancia por vuelta que la hélice se eleva alrededor de su eje. Las hélices polipeptidicas están formadas por aminoácidos quiraIes (estrwcturas que no pueden superponer su imagen en espejo, como las manos) y por tanto muestran quiralismo -o sea, son hélices con giros hacia E derecha o hacia la izquierda. Para visualizar a una hElice derecha, se debe mantener la mano derecha con la palma hacia arriba, los dedos ligeramente curvados y el pulgar apuntando alejándose de uno mismo. El pulgar sefiala en la dirección del carboxilo terminal del polipeptido de hélice derecha, el cual avanza en la dirección de los dedos curvados. Aunque los polipéptidos sinteticos de D-aminoácidos pueden furmar hélices izquierdas, la interferencia estérica de los grupos R de los residuos L-arninoacilos determina que las hélices izquierdas no pueden tener lugar en las proteinas. Idos tipos de hilices polipeptidicas presentes en las proteinas, además están limitadas por factores cstéricos adicionales y por el numero de posibles puentes de hidrógeno e interacciones de van der

------ - -

0 54-nm paso (3 6 residuos)

I

- --

1

1
1 n - -0 -5- m- -

t

Figura 6-3. Orientacibn de átomos de la cadena principal de

u n peptido alrededor del eje de una h8lice alfa

Figura 6 6 . Vista superior del eje de una hélice alfa Las cadenas laterales (R) están en el exterior de la hélice Los radios de van der Waals de los Atomos son mas grandes que los mostrados aqui; por tanto. casi no hay espacio libre en el interior de la hélice (Ligeramente modificada y reproducida con autorizacion de Stryer L Biochernistry, 2a ed Freeman, 1981. Copyright 1995 por W H Freeman y Cia.)

mente encaja en la primera vuelta de una hélice alfa En otro puiito produce una incurvación. Sin embargo, n o todas las incurvaciones en las hélices alfa son causadas por residuos prolilo. Las curvaturas también tienen lugar con frecuencia eii los residuos GIi.
Figura 6-4. Puentes de hidrógeno (puntos) formados entre Alomos de H y O estabilizan un polipeptido en una conformación alfa helicoidal (Reimpreso con autorización de Haggrs GH y colaboradores Introducfronto Molecular Brology Wiley, 1964 )

Las hélices alfa pueden ser anfipáticas
Aunque por lo común, las hClices alfa se encuentran en la superficie dc las proteinas, también pueden estar total o parcialmente integradas en el interior de una proteína La hélicc antipática, un caso especial en el cual los residuos alternan entre hidroSbbicos e hidrofilicos casi cada 3 o 4 residuos (figura 6 4 ) , tienc lugar donde las helices alfa forman interfase con un ambientc al mismo tiempo polar y no polar. Aiiinisrno, las hélices anfipáticas sc presentan en las lipoproteinas plasrnaticas y en ciertas hormonas polipí.ptjdas, venenos, antibihticos, glucoproteinas del virus de la inrnunodeficiencia humana y en proteínas cinasa reguladas por calmodulina.

hélices alfa se debe principalmente a la formación del máximo número posible de puentes de hidrúgeno. Los nitrógenos peptidicos actúan como donadores de hidrhgcno, y el oxigeno del carbonilo del cuarto residiio en linea posterior cn un sentido estructural primario actúa corno aceptador de hidrógeno (figura 6-4). Estos puentes de hidrógeno tienen una distancia N-a-O practicamente óptima dc 20 nm (2.8 A). Las interacciones van der Waals tambitn confieren mayor estabilidad, pues los átomos firmemente empaquetados en el núcleo de una hélice alfa están en contacto van der Waals con otros a través del eje de la helice alfa.

Los aminoácidos de diferentes regiones forman hojas beta
La segunda conforn~aciónregular, presente en la mayor parte de las proteinas, es la hoja plegada-beta. Se le llama beta porque fue la segunda estructura regular descrita. Por su parte, el término "110,ja plegada" describe su aspecto cuando se le obscrva con el borde hacia arriba. Los carbones alfa y sus grupos R relacionados alternati entre un plano ligeramente arriba

La prolina puede doblar una hélice alfa
En las hélices alfa son residuosmas comunes Ala, Glu, Leu y Met que Gli, Pro, Ser, o Tir. Sin embargo, esta tendencia no es util para proncisticos cstructuraIes. Puesto que el nitrbieno pcptidico de un residuo proilo, no puede I'orrnar un pucn te tle tiidrógeno, la psoliaa sola-

56

Bioquimica de Hurper

(Capítulo 6)

Figura 6-6, Representaciónespiral de aminoAcrdos en una hélrce alfa anfipLtica. Las hkiicec de las apolipoproteínas plasrn$ticas son anfrpSticas: es decir, una cara es polar y la otra no polar. Los residuos están gratificados con 100" de separación (360°13.6 residuos = 100" por residuo) mirando hacia abajo del eje de la hblice Los círculos negros representan residuos no polares y los circulos blancos, residuos polares.

Figura 6-7. Modelo de una hoja plegada beta antiparalela. Tiras adyacentes corren en direccionesopuestas (veanse las flechas) Los grupos R se localizan arriba y abajo del plano de la hoja. Nbtese que los carbonos alfa sucesivos se localizan justo arriba y abajo de este plano, dando un efecto plegado. Los puentes de hidrogeno agrupados por pares estabilizan la conformación de hoja beta En hojas plegadas paralelas (no mostradas), las cadenas adyacentes corren en la misma dirección.

y otro ligeramente abajo de la cadena principal del polipeptido (figura 6-71, Como las hklices alfa, las hojas beta tienen aningulos fi y psi repetitivos, estabilizados con el máximo número posible de uniones de hidrogeno. Los polipéptidos se alinean a lo largo, uno d e t r h de otro, y estan estabilizados por puentes de hidrógeno que se forman entre los hidrbgenos de los pbptidos nitrogenados y los de los carbonilos oxigenados de tiras adyacentes. Sin embargo, aunque las hklíces alfa contienen residuos adyacentes en un sentido estructural primario, las hojas beta implican t~amos de 5 a 10 arninoacidos de diferentes regiones estructurales primarias. A diferencia de las helices alfa compactas, el esqueleto peptidico de una hoja beta esti casi por completo extendido.

cuentran ubicadas de manera estrecha y amplia, pares alternos de puentes de hidrdgeno. Los puentes de hidrogeno que estabilizan cordones paralelos están regularmente espaciados pero angulados transversalmente a travks de las tiras. Casi todo los cordones de láminas beta están girados en el sentido de la mano derecha. Estos cordones girados de I h i n a s beta forman el núcleo central de muchas proteinas globulares. Una lámina beta puede estar conformada pw 2 a 15 cordones y son comunes las regiones donde hay laminas mixtas paralelas y antiparalelas. Qui7.á por SU estabilidad algo menor, las lhminas beta paralelas de cinco cordones son un poco más raras.

Las regiones en asa forman sitios de unión de antígenos

Las hojas beta plegadas pueden ser paralelas o antiparalelas
La figura 6-7 ilustra tiras antiparalelas de laminas beta plegadas. Las cadenas adyacentes de polipkptidos de una lámina antiparalela proceden en direcciones opuestas; aquellas de láminas paralelas, en E misma a direcciiin. Todos los posibles puentes de hidrbgeno se forman excepto para las tiras de los flancos (figura 6-81. Para estabilizar las hojas antiparalelas se en-

M s o menos la mitad de los residuos en una proteína á globular típica se presentan en forma de h6Iices alfa o hojas beta. El recto reside en conformaciones "asa" o "bobina" que, aunque ordenadas de manera irregular no tienen menor importancia biolligica que las esiructuras secundarias regularmente ordenadas. Las asas o bobinas no se deben confundir con "bobinas al m", un término que describe las conformaciones desordenadas y con menos importanciabiológica de las proteinas desnaturalizadas. Regiones en asa de tamaiio y forma variables constituyen una de las principales carac-

Estas vueltas invertidas o incuracioncs beta, afectan cuatro residuos unidos por puentes de hidrbgeno era varias formas y se presentan de manera primaria en la superficie de las proteínas.

Las proteinas pueden contener regiones desordenadas
Nonecesariamente todos los residuos se presentan como estructuras con ordenamiento secundario. Hay regiones especificas en muchas proteinas que tienen abundantes confomaciones en solucion, por lo que se presentan en verdad desordenadas Los ejemplos incluyen los grupos U largos de los residuos Lis y porciones de los amino o carboxilo terminales de muchos polipéptidos. Este desorden significa flexibilidad y puede decempefíar un papel biológico vital. Por otra parte, muchas regiones desordenadas pueden llegar a ser ordenadas cuando se les une un ligando especifico. Un caso común es la estabilizacibn de las regiones desordenadas de los centros cataliticos de muchas enzimtls cuando se unen a un ligando.
Figura 6 4 . Distancia y ángulos de unibn de los puentes de hidrógeno entre hojas beta plegadas paralelas y antiparalelas Las flechas indican la dirección de cada tira. Los Atomos de nitrágeno alfa donadores de hidrógeno se muestran con eirculos azules. Para mayor claridad en la presentacidn, se omitieron los grupos R y los hidrógenos alfa. Arriba: Hojas beta antiparalelas. Los pares de puentes de hidrógeno alternan entre pares muy próximos y pares muy separados y esthn orientados en dirección perpendicular aproximada al esqueleto polipeptldico. Abajo: Hoja beta paralela Los puentes de hidrbgano están regularmente espaciados, pero oblicuos en direcciones alternas.

ESTRUCTURA TERCIARIA

Los diagramas esquemáticos simplifican la esttuctura de las proteínas
El alto contenido de informacibn de los diagramas o modelos en donde se incluyen todos los atomos de una proteína, dificulta el estudio de las características totales de la estructura proteinica. En consecuencia, empleamos representaciones simplificadas de manera convencional para exhibir las caracteristicas estructurales. Los símbolos qtie se emplean son cilindros para hélices alfa, flechas anchas para tiras beta y cordones semejantes a listones para las demas estructuras como asas y hojas beta.

teristicas de superficie de las proteinas. Cuando se exponen a solventes, ricos en residuos cargados y polares, pero que carecen de estructura regular secundaria, las asas en gancho u horquilla se conectan con las hojas beta adyacentes antiparalelas. Con Erecuencia, el sitio para interacciones ligando, regiones de asa de estructura primaria y longitud variables forman los sitios de unibn de antigenos en los anticuerpos.

Las estructuras secundarias pueden formar tipos supersecundarios
En muchas proteínas globulares, las formas estmcturales secundarias de una hClice alfa o de una hoja beta plegada forman tipos reconocibles "supercecundanas". La figura 6-9 ejemplifica varios tipos supersecundarias: beta-alfa-beta, dos tiras de hoja beta conectados por una hdlice alfa; la horquilla o gancho beta, compuesta de hojas antiparalelas beta conectadas por una region corta de asa; y el motivo o figura "llave griega", asi denominada porque recuerda un motivo decorativo de un vaso griego antiguo. Las repeticiones de estas figuras supersecundarias pueden

Las proteinas globulares contienen
giros beta
El cwActer compacto de las proteinas globulares se debe a mAs o menos 20 tramos rectos de residuos unidos por regiones de polisacáridos que bruscamente cambian de direccibn. Las tiras de hojas beta están conectadas por regiones de poliptptidos que, si son lo bastante largos, con frecuencia contienen hélices alfa.

58

Uinqzdímica de Hut-per

(Capitulo 6 )

maneras en las cuales las proteínas plegadas pueden reunir aminoácidos separados en un sentido estriictural primario y los enlaces que estabilizan estas confbrmacicincs.

Los polipeptidos grandes tienen dominios distintos
Figura 6-9. Figuras supersecundarias Las hélices alfa y hojas plegadas beta de numerosas proteínas globulares estan ordenadas en untdades repetidas como las figuras supersecundarias d e clave griega (izquierda) o ~eta-alfabeta (derecha)

entonces formar estructuras como las unidades regularmente repetitivas beta-alfa-beta de toda una proteína (figura 6-1 0). El teririino "estructura terciaria" se refiere a las relaciones espaciales entre los elementos estructurales secundarios, [,as estructuras secundarias y s u p e r w cundarias de una proteina grande casi siempre están organizadas coma dominios -unidades compactas conectadas por el esqueleto polipeptidico. Por lo gcneral, el plegamiento de un polipéptido dentro de un dominio se prodiice dc mancra indcpcndienic del plcgamierito en otrni domiiiicis. Idas cstructiiras terciarias describen las relaciones entre estos dominios, las

La estructiira seciindaria-terciaria, en particular de lor polipeptidos grandes, se puede organizar en unidadcs relativamente independientes. pero estmcturaimente conectadas llamadas dominios, Ios cuales con frecuencia ejecutan funciones discretas tales como la unibn con ligandos específicos. Por su parte, los lipandos pucdcn cntrar en contacto con residuos formados de modo exclusivo por un solo dominio. Alternativamente. un ligando puede establecer contacto con residuos de más de un dominio y así residir rn la interfase entre los dominios. Por otro Eado, en las proteina~multimericas, los residuos de los dominios de diferente? subunidades pueden enlazarse con ligandos como las coenzimas en las interfases con subunidades cuyas superficies de contacto se derivan de residuos proccdentes de suburiidades diferentes.

Los enlaces electrostáticos unen los residuos de superficie
Los enlaces salinos (electrosthticos) unen grupos R con carga opuesta de residuos y grupos al fa con carga de residuos terminales C y N. Por ejemplo, el grupa R de Lis (a pH fisiolhgico, carga neta + 1 ) y de aspartato o glutamato (carga neta -1 ), puede interactuar por fuerzas electrostáticas para estabilizar proteínas.

Las uniones de disulfuro confieren estabilidad adicional
Además de los enlaces pcptidicoc, se pueden formar ~inii~nch (IisuIfu ni covalentes entre residuos de cfsteína presentes en el mismo o cn un polipéptido diferente. Estas uniones disulfuro confieren estabilidad adicional a la conformación especifica de proteínas tales como enzirnas (como la ribonucleasa) y proteínas estmcturales (ES el caso de la queratina).

lnteaacciones hidrofobas enlazan residuos interiores

Las cadenas laterales no polares de los aminoicidos
Figura 6-1 0. Estructura terciaria. Triosa fosfato isornerasa, mostrada en una vista de frente, está constituida por cuatro beta-alfa-beta consecutivasen los dos sentidos estruciurales primario y terciario (Cortesia de 3 Richardson ) confluyen en el interior de las protelnas globulares. Estas uniones son individualmente muy debiles y no son estequiom&tricas. Su gran numero, sin embargo, determina su importancia para mantener la estructura de la proteina.

Proteínas: esfructura yfunción

59

La cristalografía con rayos X muestra la estructura secundaria y terciaria
Los rayos X dirigidos a un cristal de proteína y de un derivado que contiene un metal pesado agregado, son dispersados en patrones que dependen de Ias densidades electrbnicac en diferentes partes de la proteína. Idos datos, obtenidos de placas rotográficas o detectores de área unidos a computadoras, se analizan por mitodos matemhticoc, se traducen a mapas de densidad electrónica y se emplean para construir modelos tridimensionalcs generados por computación. Aunque consume tiempo, es costosa y requiere personal adiestrado, la cristalografía con rayos X ha revelado vistas tridimensionaIes detalladas de mhs dc 1000 proteinas. Sus contribucio~ies la comprensión de la estructura proa teínica apenas pueden sobreenfatizarse. Las imágenes por resonancia magnética ORM), se han usado para resolver la estructura tridimensional de ciertas proteínas pequcfías y parece que es prometedora para aplicarse a proteinas de mayor tamaño.

Las proteinas compuestas de 2 o 4 siibunidades sc denominan proteínas bimiricas o tetramtricas, respectivamente. Las hornodimeras, hornotetrámeras, etcétera, consisten en subunidades identicas; mientras que las IieterooligomCricas, de subunidades distintac. Las subunidades diferentes de proteinas heterooligoméricas ejecutan de manera tipica funciones discretas. Una subunidad o un conjunto de subunidades idénticas, puede efectuar una funcion catalítica; en tanto que otro conjunto de subunidades, se encargaria del reconocimiento de ligando0 tendría un papel regulador. Las diferentes orientaciones en el espacio de las subunidades les confiere propiedades diferentes en relación con el oligómero y permite a las proteínas multimkricas desempefiar papeles peculiares en la regulación intracelular.

Los desnaturalizantes de proteínas destruyen su estructura secundaria, terciaria y cuaternaria
Los reactivos como la urca, el dodecilsulfato de sodio (SDS), los bcidos ddbiles (H') y las bases débiles (OH-), rompen los puentes de hidrógeno, enlaces hidrbfobos y electrostáticos {peso no los enlaces peptidicos ni los puentes disulfuro). Por tanto, destruyen todos los 6rdenes de las proteinas, excepto su estruchrra primaria, y anulan su actividad biológica (figura 6-1 1)

Las bases de datos y los programas de computación perfeccionados facilitan el estudio y la manipulación de la estructura de las proteínas
Un resumen coordinado de todor los Atomas de las proteínas cuyas estructuras se han determinado mediante cristalografia con rayos X es accesible a travCs de Intemet procedente de bases de datos eIectr0nicas. Estas coordinaciones pueden cargarse y enlazarse con programas de compuración perfeccionados -muchos del dominio públicc- que permiten generar y manipular modelos sobre la pantalla, girarlos en todas dirccciones, añadir o sustraer radicales, dominios o ligandos, cambiar ángulos de unión, etcétera en muchos casos utilizando simplemente una computadora personal Pentium.

Los métodos físicos determinan el peco
molecular y la estructura cuatemaria
La determinacion de la estructura cuaternaria de las proteínas oligoméricas comprende la identificación del número y clase de protómeros presentes, su orientación mutua y las interacciones que los unen. Si se prueba que los oligómeros no experimenten desnaturalizacion durante el procedimiento usado para determinar el peso molecular (PM), numerosos métodos pueden dar información de esta propiedad. Estas mismas técnicas pueden utilizarse para determinar el PM de los protómeros si primero se desnaturaliza el oligómero.

ESTRUCTURA CUATERNARIA Las proteínas oligoméricas tienen cadenas polipeptidicas múltiples
Se dice que las protehas que contienen dos o mas cadenas de polipbptidos unidos por fuerzas no covalentes muestran una estructura cuaternaria. En estas proteinas multiméricas, las cadenas polipeptidicas individuales se llaman protómeros o subunidades. Los puentes de hidrbgeno y las uniones electrostaticas formadas entre los residuos de superficie en unidades adyacentes estabilizan la unibn de las subunidades.

Enzima activa (nativa)

Enzima inactiva (desnaturalizada)

u

Figura 6-1 l. Representaeibn de la desnaturalizacibn de un iprotbmero.

A. Ultracentri fugaclon analítica
Este procedimicnto. desarrollado por Svederg. mide E velocidad a la cual una proteina se scdimenta en un a campo gravitacional de alrededor de 10' x R. Esta tkcnica física, excelente para la determinación de pesos moleculares. ha sido reemplazada en años recientes por métodos menos complejos.

CÓMOSE PLIEGAN LAS PROTE~NAS
¿Cómo puede un polipkptido plegarse en sus estados fisiolbgicos nativos en una fraccibn de segundo? Todavía no hay respuestas definitivas disponibles por lo que esta pregunta sigue siendo objeto de investigacihn activa. Sin embargo, pueden observarse algunos principios generales. El pIegamiento no puede proceder a traves de un enfoque "de búsqueda al azar"',es decir, que implique la exploracibn de todas las conformaciones posibles en la ruta hacia su estado nativo. Aun para polipéptidos comparativamente pequeños, jel plegamiento a travts de una via de búsqueda al azar requeriría no segundos sino un periodo mayor que el estimado para la edad del universo! Es claro que el plegamiento debe ser un proceso más altamente dirigido que implica vias intermedias muy conocidas entre el estado presentc y el estado fisiolbgico normal.

B. Centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa
Esta tecnica, análoga a la anterior, se aplica mejor a proteinas globulares. Las proteinas esthndares y las desconocidas se estratifican en un gradiente de sacarosa amortiguada de 5 a 20%, preparada por congeIación-descongelaci6n repetida de sacarosa a 20 por ciento. Después de centrifugar toda la noche a 10' x g, el contenido del tubo se retira en fracciones y se analiza la proteína contenida en cada fracción. La movilidad de la proteina desconocida se expresa en relación con la de estandares de PM conocido, luego se computa y se calcula su PM

Principios generales
Con base en el conocimiento actual, el plegamiento de los polipéptidos y de las proteínas multimGricas parece invoIucrar las siguientes etapas. Primero se forman tramos cortos de estnictura secundaria -re,oiones de hCIices alfa, hojas beta, giros beta, etcétera. La difusión dirigida hace crecer estos tramos cortos y conduce en últiino termino a un dominio. En las proteinas de múltiples dominios, los dominios plegados se reunen para formar el denominado "glbbulo fundido" que tiene una estnictura secundaria extensa pero muy poca estructura terciaria ordenada. Los cambios de conformación exitosos convierten el gl6bulo fundido en una forma compacta con una estructura terciariaordenada. Por su parte los cambios menores de la conformación entonces, conducen a una estructura polipéptida original. Para las proteinas monomeras, el proceso de plegamiento ya en este momento es completo, mientms que, para proteínas con estructura cuaternaria, estos polipéptidos ordenados sirven como subunidades que se reúnen para formar multimeros.

C. Filtración en gel
Coliimnas de Sephadex o matrices semejantes, que tienen "poros" de tamaño promedio definido, se calibran usando proteinas de PM conocido. Luego, el PM de una proteina desconocida se calcula de su posicibn en la elucidn, relativa a estos estándares. Puede haber errores importantes si la proteina es muy asimétrica o interactúa fuertemente con el material del que se ha manufacturado el filtro molecuIar.

D. Electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA)
Proteínas desconocidas y esihndar se separan por electroforesis en gelcs de acrilamida con 5 a 15% de enlaces cruzados de diversa porosidad, que luego se tifien para la visualizacibn de la proteína usando colorante azul de Coomassie o Ag'. Para utilizar la tkcnica de EGPA-SDS, las proteinas oligomtricas se desnaturalizan primero hirviéndolas en presencia de betamercaptoetanol y el detergente ionico con carganegativa dodecilsulfato sbdico (SDS). Las proteinas desnaturalizadas, que quedan recubiertas con SDS en su totalidad y por tanto con carga negativa, se separan con base en su tamafio (no en su carga) por EGPA-SDS en geles que contienen SDS,

Las proteínas desnaturalizadas pueden volver a naturalizarse
Muchas proteinas desnaturalizadas se vuelven a plecon gar esponthneamente in v~tro el restablecimiento subsecuente de su actividad biológica. Esto condujo a Anfinsen a concluir que la estructura primaria de los poliptptidos era en si misma suficiente para dirigir y orientar los plegarnientos de las protehas. Sin emtoma horas, lo cual es bargo, el repliegue espontán~o mucho más de lo necesario para explicar el plegamiento de las proreinas in vitro. La conclusilin de Anfisen de que P estructura primaria dirige el plea

E. El microscopio electrónico visualiza complejos macromoleculares
El microscopio electrbnico, que puede amplificar hasta 100 000 diiimetros, permite observar particulas virales, complejos~enzim~ticos, protelnas oligoméricns y oligbmeros de PM elevado.

Proreinas: estructura y función

61

gamiento in vrvo todavía es vhlida, pero requiere modificaciones para incorporar la participacidn de las proteínas accesorias, las cuales aceleran el proceso de plegamiento y lo guían a lo largo de vías específicas. Estas proteinas incluyen las disulfuro isomerasa, proli-cis-frans-isomerasa las chaperoninas. y

Proteina dicu lfuro isomerasa

[ a uniones disulfuro (-S-S-, ,s o cistina) se fonrian bajo condiciones de oxidacidn dentro y entre los polipkptidos y estabilizan tanto la estructura secundaria como la terciaria. Un residuo cisteinil dado puede, sin embargo, formar muchos pares de enlaces, disulfuro diferentes, los cuales sólo uno es apropiado para el plegamiento biológico correcto. La proteina enzimática disulfuro isomerasa facilita el "barajeo" de las uniones -S-Sporque acelera el Indice al cual los disulfuros sufren intercambio neto y, por tanto, aumenta la velocidad de todo el proceso de plegamiento.
Prolil cís-trans isomerasa
La configuraci6n de las uniones pdptido X-pro de los poIipéptidos recibn sintentizados es trans, pero mQs de 10% de las uniones X-pro de las proteinas maduras tienen coiifiguración cts. La enzima isomerasa prolil cis-fruns caializa esta isomerizacihn y, por tanto, facilita el proceso de plegamiento (figura 6-12).

cual se pueden acomodar polip&ptidosgrandes. Las chaperoninas favorecen la? vías que inhiben las interacciones inapropiadas entre superficies complementarias y facilitan las apropiadas. Sin embargo, todavia no se comprende bien el mecanismo mediante el cual las chaperoninas logran esto. Las chaperonhas incluyen las proteínas Hsp60 de choque tkrmino elaborada por las bacterias o los cloroplastos en respuesta a una elevación termica, la cual revierte la desnaturalizacidn y agregacibn de las proteínas que se produce a temperaturas elevadas. Las 14 subunidades idénticas de las proteínas HsplO y Hsp60, GroES y GroEL de E. coli y Cpn 10 y Cpn60 de ¡os cloroplastos-forman parejas de anillos de siete subunidades que rodean una espaciosa cavidad central en la cual se pueden acomodar polipéptidos grandes. Este ambiente protector contrarresta la tendencia de las regiones hidrrifobas expuestas a solventes de los polipCptidos parcialmente pegados o desnaturalizados a autorseunirse y formar agregados insolubles.

LA FORMA DETERMINA LA FUNCIÓN
El examen minucioso de proteínas representativas ilustra no sblo las estructuras únicas que han evolucionado para cumplir con funciones biologicas especificas sino también el estrecho nexo entre estructura proteinica y funcion biológica. La mayoría de las proteinas fibrosas desempefían funciones estructurales en piel, cejido conjuntiva o fibras como cabellos, seda o lana. Las secuencias atipicas de aminohcidos en las proteínas fibrosas definen estruchiras secundarias-terciarias especificas que confieren propiedades mecánica específicas.

Chaperonas maleculares
Las chaperonas moleculares de bacterias, mitocondrias y cloroplastos son proteínas grandes de múltiples subunidades que aceleran el proceso de plegamiento porque suminism un ambiente protegido cuando los p lipéptidos se pliegan en sus conformaciones nativas para formar estructuras cuaternarias. Las chaperoninas incluyen las proteinas de choque térmico cuya estructura consta de dos anillos de subunidades idknticas dispuestas alrededor de un espacio central en el

Las fueizas hidrófobas estabilizan la hoja beta de la fibroína de la seda
La fibroína de la seda, una proteína de un insecto, ilustra la estabilizacibn de una estructura secundaria por medio de fuerzas diferentes de los puentes de hidrbgeno. La composición de los aminoAcidos de la fibroina consiste casi por completo (85%) de residuos Gli que alternan con residuos Ala o Ser. Las cadenas plipeptidicas de Eibroina forman arreglos de hojas beta antiparalelas, en las cuales los gmpos R de residuos Gli (hidrbgeno} se extienden desde una superficie y los grupos R de Ala o Ser de la o m . Estos arreglos esthn estabilizados exclusivamente por interacciones hidrófobas enee los gmpos Rde Gli sobre una superficie y entre los grupos R de Gli o Ser de la otra. Pequetras cantidades de residuos como Val o Tir con gmpos R voluminosos aparecen con periodicidad e interrumpen las regiones de hojas beta y le confieren un poco

Figura 6-1 t. lsornerizaeibn del enlace peptídiw prolil N-alfa1 de una configuración cis a una trans relacionada can el esqueleto del polipbptido.

(Capitulo 6)

de flexibilidad. Regiones largas de fibroina estrechamente empaquetada, casi completamente extendidas en hojas antiparatelas beta resisten el estiramiento. pero todavía son muy flexibles debido al caracter no direccional de las fuerzas hidrófobas estabilizantes.

Cada tercer residuo es glicina
La figura estructural primaria de la colagena madura es (Gli-X-ProtHip),,. Cada tercer residuo es glicina, el único residuo con un grupo R lo bastante pequeño para encajarse dentro del núcleo central de la superhdlice. Cada glicina está precedida por un residuo prolil o hidroxiprolil. La repulsibn mutua entre los residuos prolil obliga al polipeptido a formar una hklice extendida con giro a la izquierda. Los residuos prolil e hidroxiproli1 son inflexibles en su conformaciún y confieren rigidez.

Estructura secundaria de las proteinas fibrosas
La esrructura secundaria de las proteínas fibrosas, incluyendo las de la piel, tendbn, hueso y músculo que tienen funciones esmcturales protectoras y de motilidad, muestran caracteristiczs estructurales que contrastan notablemente con las de las proteínas globulares. A continuación se analiza la estructura secundaria de la proteina mas abundante de los mamíferos, la colhgena.

Muchas modificaciones postraslacionales caracterizan la maduración de la procolagena
A diferencia de las superhelices de la colágena madura, las terminales carboxiI y m i n o del precursor de la mlágena procolagena tienen una composicibn de aminoácidos típica de una proteina globular. Durante la maduración de la procolhgena, estas extensiones terminales carboxilo y amino se retiran medianteproteólisis selectiva. Las modificaciones adicionales postraslacionales implican hidroxilacibn, oxidación, condensación de aldol, reducci6n y glucosiIación. La hidroxilacion de los residuos prolil y lisil es catalizadapor laproIiIhidroxiIasa y Iisilhidroxilasa, enzimas que requieren ácido ascorbico (vitamina C). Entonces, los residuos hidrosilil específicos son glucosilados por las transferasas galactosil y glucosil.

La colágena ejemplifica diversas relaciones entre estructura y función
Las colagenas, que comprenden casi 25% del total de las proteinas de un mamífero, ilustran de manera notable las diversas relaciones entre estructura y función que caracterizan a las proteinas Eibrosas de tos vertebrados. La colagena de los tendones forma estructuras muy asimdtricas de fuerza tensil elevada; mientras que de la piel forma tramos laxos y fibras flexibles. Por su parte, la colagena de las regiones d u r a de los dientes y de [os huesos contiene hidroxiapatita, un polimero de fosfato de calcio. Finalmente, en la córnea del ojo está ordenada de manera casi cristalina y es transparente.

Los enlaces covalentes cruzados estabilizan las fibras de la colagena
Las cadenas de tropocolAgena se reúnen para formar rnicrofibrillas de coIhgena. Al principio, las estabilizan puentes de hidrógeno dentro de la cadena y despuks, por enlaces covalentes formados entre y en el interior de las hdlices. Este proceso implica la participación de la enzima oxidasa lisil que requiere cobre, la cual convierte los grupos no alfa amino a de los residuos Iisil e hidroxil en aldehidos. A continuación estos aldehidos sufren una condensación aldol o se condensan con los grupos amino no alfa de la lisina o la hidroxilisina para formar bases Schiff. La reduccibn subsecuente foma enlaces covalentes cruzados estables que confieren una gran fuerza tensil.

La tropocolágena es una molécula de triple hélice rica en Gli, Pro y Hip
La tropocolágena consiste en tres cadenas de polipéptidos con 1000 residuos aproximadamente, organizadas como una Iidlice no alfa izquierda que tiene alrededor de tres residuos por giro. Tres hklices izquierdas se giran para formar una triple hdlice derecha o una superespiral, estabilizada con puentes de hidrdgeno formados entre (no dentro, como en la hdlice alfa) las cadenas individuales de polip6ptidos (figura 57-1). Esta triple superespiral helicoidal es sumamente fuerte. La superespiral resiste la distorsión debido a que sus tres polipéptidos están en espirales con direcciones opuestas, un principio que también se usa en los cables de acero para suspender puentes. Las fibras de colhgena maduras altamente asimbtricas miden 1.5 nm por casi 300 nm, lo cual refleja su conformacibn extendida estable.

Trastornos nutricionales y genéticos que pueden involucrar estructuras secundarias deficientes La importancia mddica de la estructura secundaria estable está ampliamente documentada por los trastor-

Proteinm. estructuru y función

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nos de la biosintesis y maduracibn de la tropocolhgena. En la insuficiencia grave de vitamina C, las hidroxilasas prolil y iisil son inactivas, y la tropocolágena no puede sufrir las reacciones para f o m a r enlaces covalentes cruzados. Como consecuencia se produce el escorbuto, una enfermedad nutricional caracterizada clínicamente por sangrado dc las encías, deticiente cicatrización de las heridas y, en último término, la muerte. De mancra similar, la enfermedad de Menkes que se distingue por el pelo ensortijado y retardo del crecimiento. refleja una defíciencia en la dieta respecto a la IisiIoxidasa que requiere cnbrc. Los trastornos geneticos de la biosintesis de la colágena incluyen varias formas de osteogénesis imperfecta que, en clinica, se caracteriza por la fragilidad de los huesos, Además, pueden producirse formas geneticamente distinhs de la enfermedad, causadas por defectos en diferentes genes de la biosintesis de coIágena. De manera similar, varios tipos del sindrome de Ehlers-Ilanlos se distinguen clinicamente por articulaciones desplazadas y anomalias de la piel que muestran defectos eii los genes que codifican procolágeiiaalfa,. procoihgcna N-peptidasa, o l isi l hidroxilasa (capitulo 57)

RESUMEN
Las caracterlsticas estructurales de las protehas se consideran bajo cuatro órdenes: primario, secundario, terciario y cuaternario (para proteínas oligoméricas'). La estructura primaria, secuencia de aminoácidos y ubicación única de cualquier puente disulfuro, está codificada en los genes. Las estructuras secundaria y terciaria, que conciernen a conformaciones proteíni-

cas permitidas por los enlaces peptídicos, son dictadas Dor la estructura nrimaria. La estructura secundaria hescribe el plegaAiento de cadenas polipeptidicas en figuras unidas por pucntes de hidrbgeno rnuftiples como helice alfa y hoja plegada beta. Luego, combinaciones de estos motivos pueden f o m a r estructura^ supersecundarias (por ejemplo, beta-alfa-bcta). La estructura terciaria se refiere a las relaciones entre dominios estructurales secundarios v entre residuos bastante alejados desde el punín de vista de su estructura primaria. La estructura cuaternaria, presente sólo en proteinas que tienen dos o m& cadenas polipep~ídicas (proteínas oligomdricas), describe puntos de coniacto y otras relaciones entre estos polipéptidos o subunidades. En tanto que, la estructura primaria contiene enlaces covalentes. las iirdenes su~eriores estabi lise zan sólo por fuer7as dbbiles que incluyen puentcs de hidrhgena múltiples, enlaces salinos (electrostáticos) entre residuos de superficie y relación, no estequiometrica de grupos R hidrofobos en el interior de las proteínas. Los reactivos que rompen enlaces no covalentes (por ejemplo, urea o SDS) destruyen las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria con perdida concomitante de la actividad biolhgicn (desnaii~alizacion). técniLas cas físicas para estiidio de órdenes superiores de estructura proteinica incluyen cristalografía con rayos X (estructura secundaria v terciaria) mhs ultracetitrifugación, filtracf~nen gel y electroforesis en gel (estructura cuaternarial. El estrecho nexo entre la estructura proteinica y la función biológica se ilustra con dos proteínas fibrosas: fibroina dc la seda y colágena. Las enfennedades relacionadas con defectos en la maduración de la colagena comprenden al síndrome de Ehlers-Danlos y el escorbuto (enfermedad por deficiencia de vitamina C).

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Bioquím~ca Harper de

(Cupi!ulo 6)

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Proteínas: miogIobina y hemoglobina
Víctor W. Rodweii, PhD

Como ejemplo de la relación estructura-función proteinica, este capitulo estudia la rnioglobina y la hemoglobina, proteinas importantes por derecho propio y porque en ellas puede apreciarse cómo las estructuras de las proteinas conforman o determinan sus funciones bioldgicas.

EL HEM Y EL HIERRO FERROSO CONFIEREN LA PROPIEDAD DE ALMACENAR Y TRANSPORTAR OX~GENO
La mioglobina y la hemoglobina poseen coma grupo prostdtico un tetrapirrol cicIico, el hem. La extensa red de enlaces dobles conjugados del hem absorbe luz en el extremo bajo del espectro visible, por lo que su color es rojo intenso. Los tetrapimoles constan de cuaao mol~culas girrol (figura 7-1) enlazadas en un anillo de planar por cuatro puentes al fa-metileno. Los sustituyentes beta deteminan si un tetrapirrol es hem o un compuesto analogo. En el hern, los grupos son metilo (M), vinilo (V) y propionato (Pr) y siguen el orden M, V, M, V, M, Pr, Pr, M (figura 7-2). En el centro de este anillo planar, hay un titorno de hierro ferroso ( ~ e ~ ' ) Otras proteinas con grupos prostt5ticos tetrapi. rrdlicos (y sus iones methlicos relacionados) incluyen los citocromos (Fe2' y Fe3'), las enzima catalasa y triptófano pirrolasa y la clorofila (Mg2*).En los citocromos, la oxidación y la reducción del htorno de hierro son esenciales para su funci6n bioldgica. Por el contrario, la oxidación del Fe2'de mioglobina y hemoglobina destruye su actividad biológica.

IMPORTANCIA BIOMÉDICA
Las proteínas hemicas intervienen en el transporte y fijacibn de oxígeno, en el transporte de electrones y en la fotosintesis. El estudio detallado de la hemorrlobina y la mioglobina ejemplifica aspectos estructuraIes comunes a muchas proteinas. En un sentido, su mayor significado médico consiste en que su conocimiento muestra, de manera elocuente, las relaciones estructurafuncibn de las proteínas. Ademiis, este conocimiento permite reconocer la base rnolecular de enfermedades genéticas como la enfermedad de cklulas falciformes (que resulta de la alteracibn de las propiedades de superficie de la cubunidad beta de la hemoglobina) y tas talasemias (enfermedades hemoiiticas familiares crbnicas, caracterizadas por defectos en la síntesis de la hemoglobina). El cianuro y el mon6xido de carbono son tbxicos debido a que interrumpen la función fisiolbgica de las proteinas hdrnicas, citocromo oxidasa y hemoglobina, respectivamente. Por último, la estabilizacEbn de la eshuctura cuatemariade la desoxihemoglobina por el 2,3-bisfosfoglicerato (BPG, del inglés, 2,3bisphosphoglicerafe) esencial para comprender los es mecanismos del mal de montafía y de la adaptacihn a las grandes altitudes.

-

Figura 7-1. Pirrol. Los carbonos alfa estdn unidos por puentes metileno en un tetrapirrol. Los carbonos beta sostienen a los sustituyentes característicos de un tetrapirrol específico, como el hern

66

Rioquímica de Harper

(Capitulo 7)

Figura 7-2. Hem Los carbonos de los anillos pirrolicos y de los puentes de metileno son coplanares y el átomo de hierro (Fez+) esta casi en el misma plano. La quinta y la sexta posiciones de coordinacbn del Fe2+con perpendiculares y directamente arriba y abajo del plano del anillo hemico. Obsérvese la naturaleza de los grupos sustitvyentes en los carbonos beta de los anillos pirrblicos, el Btorno central de hierro y la ubicación del lado polar del anlllo hemica (casi a las siete horas del reloj) que se enfrenta a la superficie de la molécula de mioglabina.

La oxirnioglobina almacena oxígeno
La mioglobina del tejido muscular rojo almacena oxlgeno. Bajo condiciones de escasez (por ejemplo, en el ejercicio extenuante), el oxigeno almacenado se libera para usarse en las mitocondrias musculares para la síntesis de ATP dependiente de oxígeno.

embargo, su conformación es atipica. Para facilitar la referencia a regiones particulares de estructura secundaria o terciaria de un polipéptido, a cada hélice alfa, hoja beta o asa se le asigna un nhmero o letra a partir de la terminal amino del polipeptido. Aproximadamente 75% de sus residuos se distribuyen en ocho hhlices alfa (giro a la derecha) de 7 a 20 aminohcidos de longitud. Comenzando por la terminal amino, se denominan hklíces de la A a la H.Las regiones interRelicales se identifican con las letras de las dos hhlices que conectan. Los residuos individuales se designan por la letra de la hdlice en la que residen y un nrjmero que indica su distancia desde [a terminal amino de esa hélice. Por ejemplo, "His FX" se refiere al m v o residuo en la hClíce F e identifica a un residuo histidilo. Los residuos que en la esttuctum primaria se encuentran bastante alejados (por ejemplo, en hélices diferentes) pueden, no obstante, estar en sentido espacial muy juntos, por ejempIo, los residuos histidilo Fg (proximal) y E7 (dista]) (figura 7-3). La estructura secundaria y terciaria de la rnioglobina en solución es muy semejante a la de larnioglobina cristalizada. Exhiben virtualmente el mismo espectro de absorción; la cristalina fija oxígeno y la cantidad de hélice alfa en una solucibn (calculada por la dispersión óptica rotatoria y dicroísmo circular) se aproxima bastante a la mostrada por el análisis cristalográfico con rayos X.

Con dos excepciones, los residuos polares están en la superficie de la rnioglobina
L a mioglobina, cadena polipeptfdica sencilla con peso moIecular de 17 000, no es excepcional respecto a sus 153 residuos aminoacídicos. Sin embargo, en su distribución espacial hay diferencias evidentes.La superficie es polar y el interior no polar, patrón típico de las proreinas globulares. Los residuos con regiones polares y no polares (por ejemplo, Tre, Tri y Tir) orientan sus partes no polares hacia el interior. Sin contar los dos residuos histidilos que funcionan en lafijacion del oxlgeno, el interior de la mioglobina s61o contiene residuos no polares (por e,jemplo, Leu, Val, Fen y Met).

La mioglobina es rica en hélices alfa
La mioglobina es una molecula compacta, toscamente esférica, que mide 4.5 x 3.5 x 2.5 nm (figura 7-3). Sin

Figura 7 3 . Modelo de mioglobina de baja resolucibn S610 se muestran los Btomos de carbono alfa. Las regiones donde se localizan las hklices alfa se designan con las letras que van de la A hasta la H. (Basada en Dickerson RE en: The Proteins, 2nd ed vol. 2 Neurath H [Editor]. Academic Press, 1964 Reproducida con autorización )

Proteínw: miog/obinuy hemoglobina

67

En presencia del hem, la estructura primaria de la apomiogiobína determina un plegamiento proteínico correcto
Cuando la apomioglobina (mioglobina sin el grupo hem) es preparada reduciendo el pH a 3.5, su contenido de h&licealfa decrece de manera notable. La adicibn subsecuente de urea elimina todo el contenido de hklices atfa. Si se retira la urea por diálisis y se agrega hem. el contenido completo de hélice alfa se recupera y la adiciirn de Fe2' restablece su actividad biolbgica (fijaci6nde oxigeno) integra. Por tanto, la infomacidn estnictural primaria contenida en la apomioglobina puede. en presencia del hern, especificar el plegamiento de la proteina a su conformacibn nativa con actividad biológica. Como se explic6 en el capítulo 6. este importante concepto se extiende a otras proteinas: la estructura primaria de una proteina dirige su conformacibn secundaria y terciaria.

His proximal (Fa)

P,

4 '
HISdista1 (ET)

Las histidinas F8 y E7 llevan a cabo funciones únicas en la fijación de oxígeno
El hern de la mioglobina, que se encuentra en un surco entre las hélices E y F (figura 7-3), se orienta con sus propionatos polares en la superficie. El resto se proyecta hacia el interior de la rnolkcula de mioglobina en donde, con excepcidn de His E7 y de His FS, los residuos circundantes son no polares. La quinta posici6n de coordinacion del átomo de hierro se une al nitrógeno de un anillo de la histidina proximal, His F8 (figura 7 4 ) . Aunque no estit enlazada a la sexta posicion de coordinacidn del hierro, la histidina distal (His E7) permanece en el lado del aniilo hdrnico al otro lado de His F8 (figura 7-4).

Figura 7 4 . Adicidn del oxlgeno al hierro hemico en la oxigenacibn Tambien se muestran las cadenas imidazólicas laterales de los dos resrduos importantes de histidina de la globina que se adhieren al hierro del hem (Reproducida con autoruacion de Harper HA y colaboradores Phys~ologische ChemEe. Springer-Verlag, 1975 )

La apomioglobina proporciona
un ambiente adverso para el hierro hernico
Cuando el oxigeno se une a la rnioglobina, el enlace entre este y Fe2' es perpendicular al plano del anillo hemico. Un segundo átomo de oxigeno se une en un dngulo de 121" con respecto al plano del hern y orientado alejándose de la h istidina dista1 (figura 7-51,

El hierro se mueve hacia el plano del hern cuando se fija el oxígeno
En la rnioglobina no oxigenada, el hierro del hern se encuentra aproximadamente a 0.03 nm (0.3 A) fuera del plano del anillo en direccidn a His F8. En la mioglobina oxigenada, un htorno de oxigeno ocupa la sexta posicion de coordinaci6n del iitorno de hierro y entonces &te se desplaza a 0.01 nm (0.1 A) fuera del plano del hem. Por tanto, la oxigenacibn de la rnioglobina va acornpaflada por el movimiento del átomo de hierro, y el consecuente desplazamiento de His FB y los residuos aminoacldicos enlazados por covalencia a CI, hacia el plano del anillo. Este movimiento produce una nueva conformacibn de ciertas porciones de la proteina.

Figura 7-6. Anguios pceferidos para el enlace del oxfgeno y el rnonbxido de carbono al átomo de hierro del hern libre [línea gruesa)

El mon6xido de carbono (CO) se une al hem aislado con una afinidad aproximadamente de 25 000 veces mayor que la del oxigeno. Si la amibsfera contiene restos de CO y el catabolismo normal del propio hern produce cantidades pequefias de este gas, ¿por qué entonces no es el CO (en lugar del Oz) e[ que ocupa la sexta posicidn de coordinacibn del hierro hémico de la mioglobina? La respuesta se encuentra en el ambiente adverso del hem en la mioglobina. La orientacihn preferida del CO para enlazarse al hierro hkmico es con los tres átomos (Fe, C, O) en posición perpendicular respecto al anillo hémico (figura 7-5). Aunque esta orientacion es posible para el hem aislado. en la mioglobina la histidina dista! obstaculiza esttricamente a los enlaces de CO en este Angulo (figura 7 6 ) . Esto obliga al CO a unirse en una configuracibn menos favorabte y reduce la fuerza de la unión hem-CO en más de dos órdenes de magnitud, aproximadamente 200 veces la fuerza del enlace hem02. obstante, por lo común, una pequeila cantidad NO (m8s o menos 1%) de la mioglobina está presente en forma de mioglobina-CO.

como PO2 o presión parcial de oxigeno) en et entorno

inmediato del hierro h&rtico. Ea relacion entre PO? y la cantidad de oxlgeno unido puede graficarse como una curva de saturacibn de oxigeno (disociacidn del oxígeno). Para la mioglobina, la forma de la isotenna de absorción de oxígeno es hiperbblica (figura 7-7). Dado que la PO2 en el lecho capilar pulmonar es de 100 mm Hg, la miaglobina podria retener oxigeno de manera eficaz en los pulmones. Sin embargo, la POz de la sangre venosa es de 40 mm Hg y la del músculo activo aproximadamente de 20 mm Hg. Puesto que la mioglobina no puede liberar una fracción grande de su oxigeno unido aún a 20 rnm Hg, no sirve como un vehículo eficaz para el transporte del oxigeno de los pulmones a los tejidos perifkricos. No obstante, en la privacibn de oxigeno que acompaflñ al ejercicio físico extenuante, la PO2 del tejido muscular puede disminuir hasta 5 mrn Hg. A esta presión, la mioglobina cede con facilidad su oxigeno pare la síntesis oxidativa de ATP por las rnitocondrias musculares.

LAS CURVAS DE DISOCIACIÓN DEL OX~GENO PARA LA MIOGLOBINA Y LA HEMOGLOBINA EXPLICAN SUS FUNCIONES FISIOLQGSCAS
¿Por que la mioglobina es inadecuada como proteina transportadora de oxígeno, pero eficaz para almacenarlo? La cantidad de oxigeno unido a la rnioglobina (expresada como "porcentaje de saturacibn ") depende de la concentracibn de oxigeno (expresada

LA HEMOGLOBINA TRANSPORTA 0 2 , COZ Y PROTONES
La hemoglobina de los eritrocitos de los vertebrados llevan a cabo dos funciones biolbgicas principales: 1) transportar el 0 2 del aparato respiratorio a los tejidos perifericos y 2) transportar el C01 y los protones, desde los tejidos perifericos hasta los pulmones para ser excretados. Aunque la bioquímica comparativa de las hemaglobinas de los vertebrados constituye un campo fascinante, aqui sólo se describirkn las hemoglobina~ humanas.

Figura 7 4 . Anguios para el enlace del oxigeno y e l rnonbxido de carbono al hierro hérnico de la mioglobina La histidina distal E7 obstaculiza el enlace del CO en su Angulo preferido (1 80 O) respecto al plano del anillo hbmico.

Flgura 7-7. Curva de fijecibn de oxlgeno para la mioglobina Obsérvese la relacibn entre el porcentaje de saturacidn y las presiones pardaks representativasen pulmones(lO0 mm Hg), tejidos (20mm Hg) y el músculo en trabajo activo (5 mm Hg).

LAS PROPIEDADES ALOSTÉRICAS DE LAS HEMOGLOBINAS SON CONSECUENCIA DE SUS ESTRUCTURAS CUATERNARIAS
Las propiedades de cada hemoglobina son consecuencia inherente de su estructura cuaternaria, así como de la secundaria y la terciaria. La estructura cuaternaria
Z da a la hemoglobina propiedades adicionaIes sore prendentes (no existentes en la mioglobina) que la adaptan a su función biologica única y le permiten una regulacibn precisa de sus actividades. Ademas las propiedades alostéricas (del griego, allos: otros, steros: espacio} de la hemoglobina proporcionan un modelo para comprender otras proteínas alostericas.

La oxigenación de la hemoglobina se acompaña por cambios en la conformación de la apoproteína
La hemoglobina fija cuatro rnol~culas oxlgeno por de tetrhmero (uno por cada subunidad hdmica), y sus curvas de saturacibn de oxigeno son sigmoideas (figura 7-8). Por tanto, la facilidad con la que el Ozse une a la hemoglobina depende de la presencia de otras moléculas de 0 2 en el mismo tetrámero. Si ya existe oxigeno unido, la fijacibn de subsiguientes moltculas del mismo tiene lugar con mayor facilidad. Por tanto, la hemoglobina muestra una cinética cooperativa de fijacibn, propiedad que le permite retener una cantidad máxima de oxígeno en los pulmones y ceder una cantidad, también rnkirna, con la POz baja que prevalece en los tejidos perifdrjcos. Por ejemplo, compdrense estas cantidades a la PO2 de los pulmones humanos (100 mrn Hg) y de tos tejidos (20 mm Hg) con las de la rnioglobina (figura 7-8).

A diferencia de la mioglobina, Z hemoglobina es una proteína a tetramérica
Las hemoglobinas son protcinas tetramdricas, compuestas de pares de polipbptidos diferentes (denominados alfa, beta, garnrna, delta, S, etcétera). Aunque semejantes en longitud global, los polipdptidos alfa (14 1 residuos) y beta (146 residuos) de la hemoglobina A (HbA) son codificados por genes diferentes y tienen estructuras primarias distintas. No asi, las estructuras primarias de las cadenas beta, delta y g a m a de las hemoglobinas humanas tienen estructuras primarias altamente conservadas. Las estructuras tekarnéricas de 1a.shemoglobinas comunes son: H1iA @emoglobina normal del adulto) = alfazbeta2, HbF memoglobina fetal) = alfaz,gammaz(a2,&), pernoHbS globina de c&lulasfalciformes) = alfa2S2, HbAz (una y hemoglobina menor del adulto) = alfaz, deltaz (azSz.).

La P50 compara las afinidades relativas de diferentes hemoglobinas para el oxigeno
La PW es la presibn parcial de oxfgeno que satura la mitad de una moltcula de hemoglobina. Dependiendo del organismo, la Psopuede variar ampliamente, aun-

100

.g so
'O

c 90

5 - 70

La mioglobina y las su bunidades beta de hemoglobina comparten estructuras secundarias y terciarias casi idénticas
A pesar de las diferencias en el tipo y niimero de aminoácidos presentes en la mioglobina y en el polipéptido beta de HbA, exhiben estructuras secundarias y terciarias casi idrlnticas. Esta semejanza que se extiende a la ubicacibn del hem y de las ocho regiones helicoidales, es consecuencia en parte de la presencia de aminohcidos de propiedades análogas en puntos equivalentes en las estructuras primarias de ambos. Ademh, el polipéptido beta es muy semejante a la rnioglobina a pesar de la presencia de siete hélices en lugar de ocho. Igual que en la rnioglobina, los residuos hidrofobos son internos y (de nuevo con excepci6n de los dos residuos His por subunidad), tos residuos hidrbfílos son características de la superficie en las subunidades alfa y beta de la HbA.

2 60
,50

P a,

p 40
30

20

'lo
' 0

20

40

00

80

100

120

140

Presidn gaseosa del oxígeno (mrn Hg)

Flgura 7-8. Curvas defijacibn del oxígeno de la hemoglobina y la mioglobina. La tensión artenal de oxigeno es aproximadamente de 100 mm Hg, la tensión de oxígeno de la sangre venosa mezdada es de más o menos 40 rnm Hg, la tensibn caprlar (músculo activo) del oxígeno es de 20 mm Hg y la tensibn de oxígeno minirna requerida por las enzimac citocrómicas es de 5 mm Hg. La agrupacibn de cadenas en una estructura tetramkrica (hemoglobina) permite una cesibn mayor de oxígeno que la que sería posible mn cadenas sencillas. (Modificada con autorizacidn de Stanbury JB, Wyngaarden JB, Fredrrckson DS [editors]: The Metabolic Basis of lnhented Disease, 4th ed McGraw-Hill, f 978 )

70

Bioquimica de Harper

(Capiau/o 7)

que en todos los casos es superior a la PO?en !os tejidos periféricos del organismo en cuestihn. La hemoglobina fetal humana (H bl: del inglés, human~iaI hemoglohin) proporciona un ejemplo representativo. Para H bA, Pro = 26 mm Hg; para HbF, Pru= 20 mm Hg. Esta diferencia permite a la HbF extraer oxígeno de la HbA de la sange placentaria, Sin embargo, dcspuks del parto la HbF es inadecuada, ya que su elevada afinidad por el oxígeno la obliga a ceder menos O2a los tejidos. Al principio, el feto humano no sintetiza cadenas alfa ni beta sino reta y epsilon. Al final del primer trimestre, alfa ha reemplazado a las subunidades zeta y a 10s pCptidos Cpsílon. Asi, la hemoglobina F, que es la hemoglobina de Ia vida fetal tardía, tiene la camposici6n alFa: gammaz. Las cadenas beta, cuya sintcsis comienza en el tercer trimestre, no reemplala en su totalidad a gamrna hasta algunas semanas despues del nacimiento.

1
Forma T

wi

Forma R

Figura 7-10. Durante la trancicibn de la forma T a la R de la a hemoglobina se produce F rotacibn da un par de subunidades rigidas (alfaZlbeta2) de 15 grados en relación con el otro par de subunidades rígidas (alfallbetal) El eje de rotacibn es excéntrico y además, el par alfa2lbeta2 derjva un poca hacia el eje. En el diagrama, el par aifallbetal no ect6 sombreado y se conserva f ~ oen tantu que el par sombreado , alfa2lbeta2 gira y se desplaza.

Grandes cambios de conformación acompañan la oxigenación de la hemoglobina
La unión del oxígeno ocasiona la rotura de los enlaces salinos entre carboxilo de las cuatro subunidades (figura 7-9). La fijación subsecuente de O2se facilita ya que se requiere la rotura de un número menor de enlaces salinos. Estos cambios alteran lambidn de manera profunda las estructuras secundaria, terciaria y cuaternariade la hemoglobina. Un par de unidades alfdheta gira con respecto al otro par alfabeta, haciendo compacto al tetramero e incrementando Ia afinidad de los hemes por el O: (figuras 7-1 0 y 7-1 1 ). L a estructura cuaternaria de la hemoglobina parcialmente oxigenada se describe como el estado T (tenso) y el de la hemoglobina oxigenada (HbOz)

DESOXI (forma T)

0x1
(forma R)

His
94

Asn G41102)

COO 4

/ n=

ASP

NH,'

II,

Figura 1-9. Enlaces salinos entre las diferentes subunidades de la desoxihemoglobina Estas interaccioneselectrastáticas no covalentec son interrumprdas por la oxigenación (Ligeramente modtficada y reproducida con autorización de Stryer L. Brachemistry, 2nd ed Freernan, 1981.)

Figura 7-1 1. Cambios en el contado alfailbeta2 en la oxigenacion Et contacto se cierra de un Area en forma de cola de paloma a otra, comprende el cambio de un puente de hidrbgeno a otro distinto Los dernac enlaces son no polares (Reproducida con autorización de Perutz MF: Molecular pathology of human hemoglobin Stereochernical interpretation of abnormal oxygen affinities Nature 1971.232,408 )

como el estado R (relajado) (figura 7-12). La R y T se utilizan tambikn para describir las estructuras cuaternarias de las enzirnas alostkricas, donde el estado T tiene afinidad menor por el susírato.

bamato y liberando protones que contribuyen al efecto Bohr.
CO~+H~-NH;=ZH'+

H ~b4-COO-

La oxigenación de la hemoglobina se acornpaiia de cambios de conformación en la vecindad del grupo hern
En la oxigenación, los Qtomosde hierro de la desoxihemoglobina (que se encuentran alrededor de 0.06 nm fuera del plano del anillo hérnico) se mueven hacia este plano (figura 7-13). Este movimiento se tsansmite a la histidina proximal (Fg), que avanza hacia el plano del anillo y arrastra consigo a residuos adheridos a His F8.

Después de la liberación de oxígeno a los tejidos, la hemoglobina transporta COZy protones a los pulmones
Además de llevar el oxigeno de los pulmones a los tejidos periféricos, la hemoglobina facilita el transporte del COz de los tejidos a los pulmones para ser exhalado. La hemoglobina puede un irse directamente al COI cuando cede su O? y aproximadamente 15% del CO1 acarreado por Ia sangre es transportado asi. El bióxido de carbono reacciona con los grupos amino terminales de la hemoglobina, formando un car-

La conversión del amino terminal de una carga positiva a una negativa favorece la formacibn de un puente salino entre las cadenas alfa y beta, situación tipica del estado "desoxi". En los pulmones, la oxigenacibn de la hemoglobina se acompafía de la expulsi6n y la subsiguiente exhalación de COZ. Cuando la sangre recibe el Coa, laanhidrasa carbónica de Ios eritrocito5 cataliza Ia formación de ácido carbonico (figura 7-14). Este se disociacon rapidez en bicarbonato y un protón. Para evitar que se aumente la acidez en la sangre, debe existir un sistema amortiguador que absorba el exceso de protones. La hemoglobina retiene dos prorones por cada cuatro rnoltculas de oxigeno que pierde y de este modo aumenta la capacidad amortiguadora de la sangre (figura 7-15), En los pulmones, el proceso se invierte, es decir, conforme el oxígeno se une a la desoxihemoglobina, los protones se liberan y se unen al bicarbonato formando hcido carbónico. Con ayuda de la anhidma carbbnica, el hcido carb6nico forma Coz, que es exhalado. Por tanto, la fijacibn de! oxigeno obliga la expulsibn del COz. Este fenbmeno reversible se llama efecto Bohr: este efecto se acompafía por una desviacibn de la curva de oxigenacibn hacia la derecha, es decir, la hemoglobina se encuentra menos saturada a una presión parclal de oxígeno dada. El efecto Bohr es una propiedad de la hemoglobina tetramérica y depende de la interaccibn hem-hem o de efectos cooperativos. La mioglobina no muestra tal efecto.

m

Estructura T

Estructura R

Figura 7-12. La Iransicibn de la estructura T a la estructura R es mfis probable conforme se oxigena cada 1 d e los 4 grupos hem de una hemoglobina tetrhmera En este modelo, los puentes salinos (lineas delgadas) que enlazan las sribunidades en la estructura T, se rompen progresivamente al unirse al oxigeno y aún aquellos enlaces salinos que no se han roto se debilitan cada vez m i s (lineas onduladas) La transicibn de T a R no tiene lugar sino decpu6s de q u e se han filado cierto numero de rnolewlas de oxigeno, pero se vuelve rnhs probable con cada oxígeno sucesivo que se une. La transición entre las dos estructuras es modificada por varios factores, incluyendo protones, bióxido de carbono, cloro y BPG. Mientras mayor sea su mncentracion, más oxígeno debe unirse para desencadenar la transiudn Aquí no se muestran mol&culac totalmente oxigenadas en la estructura T ni totalmente desoxigenadas en su forma R, debido a que son demasiado inestables para existir en cantidad significativa. (Modificada y redibujada Con autorizacidn de Perutz MF Hemoglobin structure and respiratory transport Sci Am [Dec] 1978:239,92 )

(Capítulo 7)

Histidina Fa

ZCO, + 2HzO
2HXOs

1l 3 z
Il

Repulsibn

41
Plano de la porñrina

2HCO3-

+ 2H

+

4%

x;;:>-03
TEJIDOS FERIFERICOS
(Amortiguador)

2HzCOa

PULMONES

Generado por el dcb de Krebs

/'

Figura 7-13. El Btomo de hierro se mueve en el plano del hem durante la oxigenacibn La histidina F8 y sus residuos relacionadosson arrastrados con el fitomo de hierro. (Ligeramente modificada y reproducida con autorizacibn de Stryer L Biochemistry. 2nd ed Freeman 1981.

Los protones que causan el efecto Bohr se generan por rotura de enlaces salinos durante la fijación del oxígeno
Los protones que ocasionan el efecto Bohr, son generados por la rotura de puentes salinos durante la fijacibn del oxigeno a la estructura T. Estos protones, liberados de los itomos de nitrógeno de los residuos HC3 (His 146) de la cadena beta, conducen al bicarbonato hacia el acido carbbnico, el cual es liberado como C 0 2en la sangre alveolar (figura 7-1 5). Por otro lado, en la cesibn del oxigeno E estructura T y los a puentes salinos se regeneran, y tos protones se unen a los residuos HC3 de la cadena k t a . Por tanto, la presen~iade protones en los tejidos periféricos favorece la formación de puentes salinos en la residuo His terminales de las subunidades beta. La regene-

Figura 7-15. Efecto Bohr El bibxido de carbono generado en los tejtdos periféricosse combina con el agua para formar Audo carbbnico el cual se disocia en iones bicarbonato y protones. La hemoglobina desoxigenada actúa como un amortiguador al fijar protones y liberarlos en los pulmones Aqui, la unibn del oxígeno a la hemoclobina desaloja a los protones; estos se combinan con el ion bicarbonato y regeneran al ácido mrbbnico el cual, cuando es dechidratadopor la anhtdrasa carbbnica, produce bibxido de carbono, que es exhalado desde los pulmones.

ración de los enlaces salinos propicia la liberacibn del O2 de la hemoglobina oxigenada (forma R). En resumen, un incremento en los protones estimula la liberacibn de oxígeno, en tanto que un incremento en el oxlgeno provoca la liberacibn de protones. El primer fenbmeno puede representarse en una curva de disociacibn del oxigeno por un desplazamiento a la derecha al aumentar la concentración de iones hidrbgeno (protones).

El 2,3-bicfosfoglicerato (BPG) estabiliza la estructura T de la hemoglobina
En los tejidos perifericos, una escasez de oxigeno acumula el 2,3-difosfoglicerato (BPG)(figura 7-1 6). Este compuesto se forma a partir del intermediario de la vla glucolitica, 1,3-bisfosfoglicerato. Una molécula de BPG se une a cada tetrámero de la hemoglobina en una cavidad formada por residuos de las cuatro subunidades. La cavidad central es de tamaño suficiente para el BPG sblo cuando el espacio entre las hélices H de las cadenas beta es de una anchura adecuada, es decir cuando la molécula de hemoglo-

Figura 7-14. Formacibn de á d o carbónico, mtatizada por F anhidrasa carbbnica eritroutaria y disociacibn del áudo a carbbnico a ion bicarbonato y un protbn.

Proteinas: miogioblna y hemoglobina

73

Figura 7-16. Estructura del 2,3-bisfosfoglicerato(BPG).

BPG tiene un efecto menos profundo en la estabilización de la HbF y es causa de que esta parezca tener una mayor afinidad por el oxigeno que la hemoglobina del adulto. El desencadenante de la transicibn entre R y T de la hemoglobina es el movimiento del hierro dentro y fuera del plano del anillo de porfirina. Tanto los factores espaciales como los electrostáticos median ese desencadenamiento. Asi, un cambio minimo en la posición de Fe2' en relacibn al anillo de porfirina induce variaciones significativas de las confonnaciones de la hemoglobina y afecta de manera decisiva su función biolbgica en respuesta a una sena1 ambiental.

bina esta en la forma T. El BPG es unido mediante puentes salinos entre sus Sitornos de oxigeno y las dos cadenas beta a travks de sus grupos m i n o arnino-termina1 (Val NAl ), Lis EF6 y His H21 (figura 7-17). Por tanto, el BPG estabiliza la forma T o desoxigenada de la hemoglobina por medio de enlaces cruzados con las cadenas beta y por contribuir con puentes salinos adicionales, que deben romperse antes de que se produzca la f o m a R. El BPG se une de manera más dtsbil a la hemoglobina fetal que a la hemoglobina del adulto debido a que el residuo H21 de las cadenas gamma de la hemoglobina fetal es Ser en lugar de His y no puede formar un puente salino con BPG. Por lo anterior el

SE HAN IDENTIFICADO VARIOS CIENTOS DE HEMOGLOBINAS HUMANAS MUTANTES
Las mutaciones en los genes que codifican las cadenas alfa y beta tienen potencial para afectar la functdn bioldgica de la hemoglobina. De los varios cientos de hemoglobinas humanas mutantes conocidas (lamayoría son muy raras y benignas), en seguida se descriixn algunas, cuya función biológica esti alterada. Cuando la alteracibn de la funcibn biolbgica se debe a una rnutacidn en la hemoglobina, el trastorno se conoce como una hemoglobinopatia.

En la hemoglobina M, Tir reemplaza a His F8
El hierro hdmico se estabiliza en el estado Fe", ya que forma un complejo i6nico firme con el anión fenolato de Tir, Larnetahemoglobinemia, donde el ion hierro del hem está en estado férrico en lugar de ferroso, puede ser adquirida (por ejemplo, con la oxidacirin de Fe2' a Fe3+por compuestos tales como las sulfonamidas), hereditaria (debido a la presencia de HbM) o causada por la disminuci6n de Ia actividad de la rnetahemoglobina reductasa, enzima que reduce el Fe" de MetHb a Fe2+.Puesto que la metahemoglobina no fija 01, no puede participar en el transporte de oxlgeno. En las variantes de la cadena alfa de la hemoglobina M, el equilibrio R-T favorece a la forma T. La afinidad por el oxigeno esta disminuida y no hay efecto Bohr. La cadena beta de estas variantes presenta cambio R-T y, por tanto, se produce el efecto Boht. Las mutaciones (por ejemplo, la hemoglobina Figura 7-17. Modo de enlace del 2-3-bisfosfoglieeratoa la Chesapeake} que favorecen la f o m a R muestran una deaoxihemoglobina humana. El BPG interactba con tres afinidad creciente por el oxigeno, por lo cual no lo grupos d e carga positiva en cada cadena k t a (Basada en Arnone A: X-ray diffraction study o binding o 2,341phospho- ceden en suficiente cantidad a los tejidos periftricos. f f glycerate to human deoxyhemoglobin Nature 1972;237.146. La hipoxia tisuIar que se produce lleva a policiternia (incremento en el número de eritrocitos). Reproducida con autorizacibn.)

En ia hemoglobina S, un residuo valil reemplaza al glutamato beta-6
En la hemoglobina S, Val reemplaza a Glu A2 (6)P, es decir. el residuo 6 de la cadena beta localizado en la superficie de la hemoglobina, expuesta al agua. Esta sustitución reemplaza el residuo polar glutamato por uno no polar y da lugar a una "zona adherente" en la superficie de la cadena beta. Esta zona existe en las formas oxigenada y desoxigenada de la hemoglobina S pero no en la hemoglobina A. En la superficie de la hemoglobina S desoxigenada hay un complemento para la zona adherente, pero en la hemoglobina S oxigenada este sitio complementario esta enrnascarado (figura 7-1 8).

Aunque la desoxihemoglobina A contiene los sitios receptores para ia zona adherente que existe en las hemoglobinas S, oxigenada y desoxigenada (figura 7-1 S), la uni6n de la hemoglobina S adherente a la desoxihernoglobina A no puede extender el polimero, ya que esta iiltírna no tiene zona adherente para promover a su vez la unibn de otra molCcula de hemoglobina. Por tanto, la uni6n de la desoxihemoglobina A a la forma R o a la forma T de la hemoglobina S terminará la polimerizacibn. EI polimero forma una fibra helicoidal torcida, cuya seccion cruzada contiene 14 moléculas de HbS (figura 7-1 9). Estas fibras tubulares distorsionan al eritrocito de modo que toma la forma de una hoz (figura 7-20) y son vulnerables a lisis cuando penetran a los intersticios de los sinusoides esplknicos.

La desoxihernoglobina S puede formar una estructura fibrosa que distorsiona los eritrocitoc
Cuando la hemoglobina S está desoxigenada, su zona

adherente puede unirse a la zona complementaria de otra molécula S desoxigenada. Esta union hace que la hemogiobina S desoxigenada se polimerice, formando precipitados fibrosos largos que se extienden a través del eritrocito y lo distorsionan mecfinicamente causando lisis y mtiltiples efectos cllnicos secundarios. Asl, si [a hemoglobina S pudiera conservarse en su estado oxigenado, o si la concentracidn de la Forma desoxigenada lograra mantenerse en un mínimo, no se formarían estos polímeros y se evitaria la aparición de "células falciformes". Es evidente que la forma T de la hemoglobina S es la que se polimeriza.

1) Mioglohinuria: Despues de lesiones multiples, [a mioglobina liberada de las fibras muscuIares rotas aparece en la orina, colorehndola de rojo oscuro. Aunque después de un infarto del mimardio es Q O S ~ ble detectar la mioglobina en el plasma, el andlisis de las enzimas skricas (capitulo 8) proporciona un indice m& sensible del daflo miocárdico. 2) Anemias: Las anemias comunes (reducciones en la cantidad de eritrocitos o de hemoglobina en la sangre) se deben al deterioro de la slntesis de hemoglobina (por ejemplo, en deficiencia de hierro; capítulo 59) o a la produccibn alterada de eritrocitos (es el caso de la deficiencia de ácido fólico o vitamina Biz; capitulo 52). El diagnbstico de las

0 x 1A

Desoxi A

Oxi S

Desoxi S

Desoxi A

Desoxi S

Flgura 7-18. Representacidn de la zona adherente (A) en la hemoglobina S y su "receptor" ( A ) en las desoxihemoglobinas A y S Las superficies complementarias permiten que la desoxihernoglobina S po/irnerice en una estructura fibrosa, pero la presencia de la desoxihernoglobina A termina la polimerizacibn debido a que no posee zona adherente. (Modificada y reproducida con autorizaubn de Stryar L. Biochemrstry, 2nd ed Freernan, 1981.)

Proteínas: miog/ubina y hemoglobina

75

3) Hemoglobinopatias: En tanto que la mutación de ciertos residuos crlticos de la hcmogIobina (como las histidinas E7 o F8) tiene consecuencias graves. es posible que la rnutacidn de muchos residuos
superficiales, alejados del sitio de fijacion del hem, no se traduzca en anormalidades clinicas. Una excepcE6n notable es la anemia de cklulas falciformes, en donde todos los signos y sintomas (por ejemplo, crisis de céluEas Fatciformes y trombosis) provienen de la mutación de un solo residuo polar por uno no polar. 4) Hemoglobina glucosilada (HbAlr): Cuando la glucosa sanguínea entra a los eritrocitos, la hemoglobina es glucosilada de manera no enzimatica y su hidroxilo anomérico deriva los grupos amino presentes en los residuos lisil y en las terminales amino. La HbAic, puede separarse de HbA por cromatografía de intercambio ionico o electroforesis. La fraccibn de hemoglobina glucosilada, normalmente alrededor de 5%, es proporcional a la concentracibn de glucosa en la sangre. Por tanto, la medicibn de HbAic proporciona Pnfomaci6n util para el manejo de la diabetes sacarina. Dado que la vida media de un eritrocito es de 60 dias, la concentración de HbA i c refleja la concentración sanguínea promedio de glucosa en el periodo de 6 a 8 semanas precedentes. Asi, una HbA icelevada, que indica control deficiente de la glucosa sanguinea, puede guiar al mkdico en la seleccibn del tratamiento apropiado (por ejemplo, un control m i s riguroso de la alimentación o una dosificacibn mayor de insulina).

Figura 7-19. Reprecentacidn de la estructura helimidal propuesta de una fibra de desoxthamoglobina S agregada En este modelo, las esferas representan moléculas inviduales de HbS (Reproducida con autorizacibnde Maught II: A new understanding of sickle cell emerges Scienoe 1981,211 265 Copyright Q 1981 by the Arnerican Association for tha Advancement of Science )

anemias comienza con la deteminacidn espectrofotométrica de la concentración de hemoglobina sanguinea. Las talasemias y el uso de probadores de DNA para su diagnóstico se consideran en los capitulas 8 y 42.

Figura 7-20. Micrografla electrdnica de barrido de un eritrocito normal (A) y uno falciforme {B). cambio en la mol6cula de El globina beta que causa esta alteracibn estructural, es consecuencia de la mutacibn de una sola base en el DNA Ttmina (T) por adenina (A), lo cual conduce a la sustitucidn de un residuo de valrna por uno de glutamina en la malécula de globina beta

Las talasemias se originan de la síntesis reducida de cadenas alfa o beta
En las talasemias, la síntesis de las cadenas alfa (alfatalasemias} o beta (beta-tarasemias) de la hemoglobina estA disminuida. La consecuencia es una anemia que puede ser muy grave (capítulo 42).

RESUMEN
Las proteínas globulares compactas, mioglobina (Mb) y hemoglobina (Hb), funcionan en el almacenaje y transporte de oxigeno. respectivamente. La ~b &S monomerica; Hb es un tetrhmero de dos tipos de subunidades (alfazbetaz en la hemoglobina del adulto, H1iA). La Mb y la subunidad beca de Hb, rica en hélices aIfa, comparten una estructura secundaria y terciaria vimialmente idtnticas (no así la Los residuos de arninoAcidos de sus seis (A a H) regiones helicoidales se denominan (por ejemplo) "His P8" -la histidina que es el octavo residuo en la hClice F o sexta. El grupo prostktico hem de Mb y I-Ib es un tetrapirrol ciclico, planar en esencia, un poco plegado, con un Fe" central. Cuando el grupo hem se agrega a una apomioglobina desnaturalizada (Mb sin hem), ésta se pliega de nuevo en su confomación nativa. Por tanto, la información estructural primaria impEicita en apoMb (y por extensidn, en otras proteínas) basta para definir la estructura secundaria y terciaria. El Fe2' del hem se une a los cuatro átomos de nitrogeno del hem y a los dos ligandos adicionales localizados arriba y abajo del plano del hem. Un ligando es la histidina FX. En la oxiMb y oxiHb, el sexto ligando es 02.En una intoxicacibn con monhxido de carbono, el sexto ligando es CO el cual, a pesar del obsthculo espacial por la presencia de His F7, se une con más fuerza al hierro que el 02. Las curvas de saturación muestran la captacibn y liberacirln del oxigeno. La curva de Mb es hiperbblica,

en tanto que con Wb es sigmoidea. Esta ultima forma es critica para una mol6cula transportadora de Oz que debe saturarse con oxígeno en los pulmones y liberarlo al m k i m o en los tejidos. Las afinidades relativas de las diferentes hemoglobinas se expresan como Pso, que es la presi6n parcial de O?a la cual se saturan la mitad de hemoglobinas con oxígeno. Las hernoglobinas se saturan a las presiones parciales de sus respectivos órganos respiratorios (por ejemplo, HbF se satura con la PO1 de la placenta). Los residuos His proximal (F8) y dista1 (E7) descansan en sitios opuestos del anillo hémico. Durante la oxigenacion, Fe2', His F8 y Pos residuos adyacentes se mueven hacia el anillo htmico. Por tanto, [a oxigenacidn de Hb se acompafía de cambies notorios en la conformación. La adición de Oza desoxiHb destruye los en taces salinos entre subunidades y dentro de ellas, volviendo laxa la estructura cuaternaria y facilitando la fijación de moliculas adicionales de oxigeno. En la cavidad central de la desoxiHb, el compuesto 2,3-bisfosfoglicerato (RPG) forma enlaces salinos con las subunidades beta, que estabilizan aún m8s la desoxiHb. Durante la oxigenacirln, la cavidad central se c o n h e , el BPG es expulsado y la estructura cuaternaria de nuevo queda laxa. La Hb tiene también la funcibn de transportar COI y protones desde los tejidos al pulmbn. La liberación de oxigeno de ra oxiHb (HbO2) a los tejidos se acornpaiía de captacibn de protones debido a la disminucirln del valor de pK. de un residuo His. Entre los cientos de mutantes de Hb (en gran parte benignos) se destaca la hemoglobina de las células falciformes (HbS), en la cual Val reemplaza a Glu beta6 de HbA. Esto crea una "zona adherente" que tiene un complemento sobre la desoxiHb (pero no en oxi Hb). En concentraciones bajas de oxigeno, desoxiHbS polimeriza, forma fibras y distorsiona los eritrocitos dándoles formas de hoz. Las talasemias al fa y beta son anemias causadas por disminución en la produccibn de subunidades alfa y beta de HbA, respectivamente.

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REFERENCIAS
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Enzirnas: propiedades generales

Los temas considerados en este capitulo incluyen las clases de reacciones catalizadas por enzirnas, la participacibn de coenzimas en reacciones de transfemcia de grupo catalizadas por enzima y aspectos de la especificidad enzimiitica. Asimismo, se introducen los m ttodos para purificación, análisis y deteminacibn de la distribucilin intracetular de enzimas. Luego se describen las isoenzimas, el. diagnbstico y el significado pronóstico de las enzirnas dricas, concluyendo con el uso de endonucleasas restrictivas en el diagnostico de enfermedades geneticas.

Despues del daflo tisular grave (por ejemplo, infarto del miocardio o pulmonar, trituracidn de un miembro) o posterior a la multiplicación celular descontrolada (como en el carcinoma prostktico), las enzimas propias de los tejidos específicos pasan a la sangre. Por tanto, la determinación de estas enzirnas intracelulares en el suero sanguineo proporciona a los m6dicos inforrnacidn valiosa para el diagnbstico y pronóstico.

LAS ENZIMAS SE CLASIFICAN POR TIPO DE REACCIÓN Y MECANISMO
Hace un siglo s61o se conocían algunas enzimas, muchas de las cuales catalizaban la hidrbtisis de en-

IMPORTANCIA BIOMÉDICA
Sin enzimas no sería posible la vida que conocemos. Igual que [a biocatálisis que regula [a velocidad a la cual tienen lugar los procesos fisiológicos, las enzimas llevan a cabo funciones capitales relacionadas con la salud y la enfemedad. Mientras que en estado de salud todos los -esos fisiológicos se llevan a cabo de una manera ordenada, regulada y se conserva la homeostasia, durante los estados patoldgicos, esta última puede ser perturbada de manera profunda. Por ejemplo, el dafío tisular grave que caracteriza a la cirrosis hepfitica puede deteriorar de modo notable la propiedad de las células para producir enzimas que catalizan procesos metabólicos claves como la sintesis de urea. La incapacidad celular para convertir el arnoniaco tbxico a urea no tóxica es seguida por intoxicacibn con amoniaco y, por último, coma hephtico. Un conjunto de enfermedades genbticas raras, pero con frecuencia debilitaiites y a menudo mortales, proporciona otros ejemplos impresionantes de las drásticas consecuencias fisiolbgicas del deterioro de la actividad enzirnhtica, incfusive de una sola enzima.

laces covalentes. Em enzimas se identificaban por la s adición del sufijo -asa al nombre de la sustancia o sustrato que hidrolizaban. De este modo, las lipasas hidrolizaban grasas (lipos, en griego); las amilasas, alrnidbn (amylon, en griego) y las proteasas, proteinas. Aunque hasta hoy persisten numerosos vestigios de esta terminología, demostr6 ser inadecuada cuando se descubrieron varias enzimas que catalizaban reacciones diferentes del mismo sustrato; por ejemplo, oxidacibn o reducción de la función alcohol de un azúcar. Aunque el sufijo -asa sigue en uso, en la actualidad los nombres de las enzirnas enfatizan el tipo de reaccidn catalizada. Por ejemplo, las deshidrogenasas catalizan la eliminacibn de hidrógeno y 1% transferasas, reacciones de transferencia de grupo. Con el descubrimiento de m&- y mhs enzimas, surgieron ambigtiedades inevitables y con frecuencia no estaba claro cukl era la enzima que un investigador deseaba estudiar. Para remediar esta deficiencia, la Uni6n Internacional de Bioquirnica (IIJB, del inglis, Internotional Union o Biochemistry) adoptó un f sistema complejo, pero inequivoco, de la nomenclatura

enzimhtica basado en el mecanismo de reacción. Aunque su claridad y carencia de ambigüedad recomiendan a[ sistema de nomenclatura IUB para trabajos de invcstigación, nombres mis ambiguos, pero afortunadamente: bastante mhs cortos persisten en libros de texto y en el laboratorio clínico. Por esta razón, a continuación se presentan sólo principios generales del sistema IUR:
1) Las reacciones y las enzimas que las catalizan se dividen en seis cIases principales, cada una con 4 a 13 subclases. 2) El nombre de la enzima tiene dos partes. La primera es el nombre del o de los sustratos; Ia segunda, con terminación -asa, indica el tipo de reacción catalizada. 3) Infonnacion adicional, si es necesario aclarar la reacción, puede seguir en paréntesis, Por ejemplo, la enzima que cataliza ],-malato + NAD' = pinivato + COI + NADH t , S/ ' H denomina como 1.1.1.37 ~-malato:NAD oxidorreductasa (descarboxi lante). 4) Cada enzima tiene un número clave (E.C.) que caracteriza al tipo de reaccibn segun la clase (primer digito), subclase (segundo digito) y sub-subdase (tercer digito). El cuarto digito es para la enzima especifica. AsC, E.C. 2.7.1.1 denota la clase 2 (una transferasa}, subclase 7 (transferencia de fosfato), sub-subclase 1 (una función alcohol como aceptor de fosfato). El último digito denota a la enzima hexocinasa o ATP:D-hexosa-6-fosfotransferasa, enzima que cataliza la transferencia de fosfato desde el ATP al grupo hidroxilo del carbono 6 de la glucosa.

IUB). Las reacciones liticas que comprenden reacciones hidroliticas catali~adas enzimas digestivas no por necesitan de coenzimas.

Las coenzimas pueden considerarse como segundo sustrato
Puede ser útil considerar a la coenzima como un segundo sustrato por dos razones. En primer lugar, los cambios químicos en la cOenzima compensan exactamente a los que se realizan en el sustrato. Por ejemplo, en las reacciones de oxidorreducci6n (deshidrogenasa), cuando una rnolecula de sustrato es oxidada, una rnoIkcula de coenzima es reducida (figura 8-1). Una segunda raz6n para dar igual tiifasis a las reacciones de la coenzima es que este aspecto de lareacción es el que puede tener el mayor significado fisioPogico fundamental. Un caso es la importancia de la capacidad det músculo que trabaja en condiciones anaerobias para convertir el piruvato en lactato no reside en el piruvato ni en el lactato. La reacción sirve solamente para oxidar la coenzima reducida NADH a NAD'. Sin N A D ' la glucólisis no puede continuar y 3 sintesis anaerobia de ATP (y por tanto, el trabajo) a tiene que cesar. En condiciones anaerobias, la reduccion del piruvato en lactato reoxida al NADH y permite la sintesis de ATP. Otras reacciones pueden servir iguaImente bien. Por ejemplo, en las bacterias o Fevaduras que crecen en un medio anaerobio, algunos metabolitos derivados del piruvato son utilizados como oxidantes para el NADH y ellos mismos son reducidos (cuadro 8-1).

Las coenzimas funcionan como reactivos en la transferencia de grupos Las reacciones bioquímicas de transferencia de grupo del tipo

MUCHAS ENZIMAS NECESITAN UNA COENZIMA
Muchas enzimas que catalizan la transferencia de grupos y otras reacciones necesitan, ademb de su sustrato, una segunda mol~culaorghnica conocida como coenzima, sin la cual son inactivas. Para distinguirlas de iones methlicos activadores y de las enzimas mismas, las coenzimas se definen como compuestos orgánicos termoestables, de peso molecular bajo, necesarias para ta actividad de las enzimas. La mayoda de las coenzimas se unen a las enzimas por fuerzas no covalentes. Las que forman enlaces covalentes con las enzirnas se denominan tambikn grupos prostkticos. Entre las reacciones que necesitan coenzimas están las oxidorreducciones, las reacciones de transferencia de grupo e isomerizacibn y las reacciones que forman enlaces covalentes (claves 1, 2, 5 y 6 de la

, c-Lactato

o

NAD"

x

O
piruvato

NADH + H+

Flgura 8-1. El NAD+ actúa como cosustrato en la reaccibn de la lactato deshidrogenasa

Enzimas: propiedades generales

79

-

Cuadro 8-1. Mecanismos para l a regeneración obia de iu A n+

-

Para la transferencia de grupos distintos del hidrógeno: Fosfatos de azucares. COA-SH. Pirofosfato de tiamina. 4 Fosfato de piridoxal. i Coenzimas del folato. * Biotina. Coenzimas de cobalamina (R 12). * Ácido lipoico. Para la transferencia del hidrbgeno:

-

ia viviente-

Pir
:ctaldehido
.. a, ,L .

u, ,

-

dihidroxini

L
IVIUSLU

la. bacterias

lácrica: Levadiira

Frr

ias lietert

en la cual un grupo funcional, G, es transferido de una moIecula donadora, D - G , a una moltcula aceptora. A, por lo gencral comprende la participaci~nde una coenzima como ultimo aceptor (por ejemplo, las reaccicne? de deshidrogenación) o como portador intermediario del grupo (como las reacciones de transaminacion). El esquema siguiente muestra el ultimo concepto.

NAD+, NADP+ FMN, FAD. Ácido lipoico. Coenzima Q.

Muchas coenzimas derivan de vitaminas B y del monofosfato de adenosina

Aunque esto sugiere la fomacion de un complejo sencillo C o E 4 , durante el curso de la reacción global, pueden intervenir varios complejos intermediarios C o E 4 en una reacción particular (como la transaminacibn). Cuando eI grupo transferido es el hidrhgeno, se acostumbra representar s61o la "mitad izquierda de la reaccion ":

Las vitaminas i forman parte de la estructura de 3 numerosas coenzimas. Las nicotinamida, tiamina, siboflavina y iicido pantoténico son constituytntes esenciales de las coenzirnas para las oxidaciones y las reducciones bioIógicas mientras que las coenzimas Bcido fhlico y cobamida funcionan en el metabolismo de compuestos de un solo carbono. Numerosas coenzimas contienen adenina, ribosa y fosfato y se derivan del monofosfato de adenosina (AMP. del tos inglés, adenmine monopho.~phate). ejemplos incluyen NAD' y NADP' (tlgura 8-2).
Las enzimas son catalizadores estereoespecificos

Que esto representa en realidad sólo un caso especial de la transferencia general de grupos puede apreciarse mejor en tkrminos de las reacciones que tienen lugar en las células intactas (cuadro 8-1 ). Se pueden representar de la siguiente manera:

Casi todos los sustratos forman por lo menos tres enlaces con las enzirnas. Esta "adherencia en tres puntos" puede conferir asimetría a una moldcula por
otro lado cimCtrica. La figura 8-3 muestra una molécula de sustrato, representada como un átomo de carbono que tiene tres grupos diferentes, pr6ximos a adherirse en tres puntos a un sitio de la enzima. Si el sitio puede ser alcanzado sblo desde un lado y únicamente los fitomoc compIementarios y los sitios pueden interactuar (ambas suposiciones válidas para las enzimas reales), la molécula se unira sólo en una forma. La reaccibn misma puede estar confinada a los Atomos unidos en los sitios 1 y 2 aun cuando los htomos 1 y 4 sean idénticos. Girando mentalmente la moldcula de sustrato en el espacio, nótese que puede adherirse en tres puntos a un costado del sitio planar con una sola orientaci6n. En consecuencia, los Atomos 1 y 4, aunque sean idénticos, vienen a ser distintos

Las coenzimas pueden clasificarse de acuerdo al grupo cuya transferencia facilitan
BacBndose en este concepto, podrían clasificarse las coenzirnas del siguiente modo:

80

Bioquimica de Harper

MUCHAS ENZlMAS CATALIZAN UNA REACCION O UN TIPO DE REACCION ESPEC~F ICA
L a capacidad de una enzima para catalizar una reacción específica y esencialmente ninguna otra, es qui7A su propiedad miis significativa. De este modo, las velocidades de procesos metabólicosespecificas pueden regularse por cambios en la eficiencia catalitica de enzimas específicas. Sin embargo, la mayoría de las enzima~ catalizm el mismo tipo de reacción (transferencia de fosfato, oxidación-reduccióin, etcdtera) con un pequeflo numero de sustratos relacionados estructuralmente. Las reacciones con otros sustratos alternativos tienden a efectuarse si ellos se encuentran en altas concentraciones. Que todas las reacciones posibles ocurran en el microorganismo vivo depende de la concentracibn relativa de sustratos alternativos en las células y de la afinidad relativa de la enzima para esos sustratos.

Las enzimas muestran especificidad óptica
Figura 8-2. NAD(P)+. En NAD', -R
0~03"'.

= H; en NADP*, R =

cuando el sustrato esta adherido a la enzima. Por tanto, un cambio químico puede afectar e1 &tomo 1 (pero no el Btomo 4) o viceversa. S bien los sitios activos de i las enzimas no son las supeficies planas que se muestran en la figura 8-3, la figura no puede mostrar la causa de que la reducción catalizada por la enzima del piruvato sin actividad bpticaproduzca L-lactato en vez de D, L-lactato

Excepto las epimerasas (racernasas), que.catalizan la interconversión de 10s idmeros bpticos, las enzimas por lo general muestran una especificidad bptica absoluta por lo menos para una porción de la rnoldcula de sustrato. Asi, las enzirnas de la via glucolitica y de la oxidativa directa catalizan la interconversibn de los D- pero no de los L-fosfoanjcares. Con unas cuantas excepciones (por ejemplo, la D-aminoacidooxidasa del riilon), la pn mayoría de las enzirnac de los a marniferos actúan sobre los L-isbmeros de los aminohcidos. L a especificidad 6ptica se puede extender a una del porción de la mol~cula sustrato o a su totalidad. Las glucosidasas proporcionan ejemplos de ambos casos. Estas enzimas catalizan la hidrblisis de las uniones glucosidicas entre aziicares y alcoholes, y son altamente especificas para la porcibn azúcar y para la uni6n (alfa o beta), pero relativamente inespecíficas para la porcion alcohólica o aglicona. Las enzimas presentan un alta especificidad para el tipo de reacciiin que catalizan
Las enzimas líticas actúan sobre grupos de compuestos quimicos particulares, por ejemplo, glucosidas% sobre glucbsidos, pepsina y tripsina sobre los enlaces peptidicos y las esterasas sobe los ksteres. Un p a n numero de sustratos pueden ser atacados reduciendo asi, el número de enzirnas digestivas que de otro modo serian requeridas. Numerosas proteasas

Sitio enzimatim

Sustrato

Figura 8 3 . Representación de la adherencia en tres puntos de un sustrato a un sitio activo planar da una enzima.

Enzimm: propied~des generales

81

catalizan tarnbidn la hidrólisis de los tsteres. En tanto que esto es probablemente de importancia fisioldgica limitada, el uso de ésteres como sustratos sinttticos ha sido importante en el estudio del mecanismo de accion de las proteasas. Ciertas enzimas líticas presentan alta especiftcidad. La quimiotripsina hidroliza los enlaces peptidicos en tos cuales el grupo carboxilo es apostado por los aminohcido~ aromhticos fenilalanina, tirosina o triptbfano. Las carboxipeptidasas y las aminopeptidasas desdoblan los aminoácidos I por 1 de la terminal carboxilo o de la amino de [as cadenas polipeptldicas, respectivamente. Aunque algunas oxidorreductasas funcionan igualmente bien, ya sea con NAD' o con NADP' como aceptores de electrones, la mayor parte de ellas usan exclusivamente uno o el otro. En general, las oxidorreductasas funcionales en los procesos biosintéticos de los sistemas de mamlferos (por ejemplo, en la síntesis de ácidos grasos o de esteroles) utilizan NADPH como reductor, mientras que las funcionales en los procesos de degradación (por ejemplo, la glucólisis, la oxidacibn de [os hcidos grasos) utilizan NADkomo oxidante.

o del NADPH (pero no del NAD' o del NADP') para absorber la luz a una longitud de onda de 340 nm (figura 8-41. La oxidación de NADH en NAD' se acompaíia de una disminucibn de la densidad bptica (DO) a 340 nm,proporcional a la cantidad de NAD que se oxida. De igual manera, cuando el NAD' se reduce, la DO aumenta en proporcion a la cantidad de NADH que se produce. Este cambio de DO, se puede utilizar para el anhlisis cuantitativo de cualquier NAD' o NADP' dependientes de deshidrogenasa, tal como sigue. Para una deshidrogenasa que cataliza la oxidación de NADH, mediante su s u s ~ oxidado, la veo locidad de decrecimiento de DO a 340 nm es directamente proporcional a la concentracibn enzimática.Por tanto, la medicibn de la velocidad de decrecimiento en DO a 340 nrn permite deducir la cantidad de enzima, expresada en unidades de actividad, presente en una muestra biológica dada como suero o extracto de tejido.

Muchas enzirnas pueden analizarse por acoplamiento de una reacción a una deshidrogenasa

LA ACTIVIDAD CATAL~TICA DE UNA ENZIMA FACILITA SU IDENTIFICACI~N
Las pequeiías cantidades de enzimas presentes en la célula obstaculizan la rnedicidn de la cantidad de una
enzima en liquidos o extractos de tejidos. Por fortuna, la actividad catitalitica de una enzima provee un dispositivo sensible y especifico para su propia medición. Para medir la cantidad de una enzima en una muestra de extracto tisular o de algún liquido biológico, se establece la velocidad de la reacción catalizada por ella. En circunstancias apropiadas, la velocidad medida es proporcional a la cantidad de enzima presente. Dado que es dificil determinar el número de mol&culaso la masa de enzima presente, los resultados se expresan en unidades enzimáticas. Las cantidades relativas de la enzima se pueden entonces comparar en diferentes extractos. Tales unidades se expresan mejor en micromoles (prnol; 1Q4 mot), nanomoles (nmol; lo4 rnol) o picomoles (pmol; 10-'' mol) de sustrato reaccionante o de producto formada por minuto. Las unidades internacionales enzimáticas correspondientes son pU,nU y pU.

En el ejemplo anterior se midi6 la velocidad de formaci6n de un producto (NADH} para determinar ta
actividad enzimatica. TambEen es posible analizar la ac-

tividad de otras enzimas diferentes de las deshidrogenasas por la medicibn de la velocidad de aparición

1 1 200

1

I

1

233

300 350 Longitud de onda (nm)

600

Las deshidragenasas que dependen de NAO' puede analizarse a 340 nm
En las reacciones que interviene el NAD' o el NADP' (deshidrogenasas) se utiliza la propiedad del NADH

Figura 8 4 ,Espectros de absorcibn del NADt y del NADH. Las densidades corresponden a una solucibn de 44 m g k en una celdilla de 1 m de paso de luz. El NADP* y el NADPH tlenen espectros semejantes a los de NAD* y NADH, respectivamente.

82

Rioquimicu de Harper

(Capitulo 8)

Glucosa

[HEXC)CINASAI

Gluwsa 6-fosfato

1

ATP, ~ g " ADP, h2+

mecanismos reguladores que operan a nivel de la catálisis, derivan en gran medida de los estudios de enzima purificadas. La información fidedigna referente a la cinética, cofactores, sitios activos, estructura y mecanismo de acción tam bien nccesita cnzinias altamente purificadas.

GLUCO-SA6-FOSFATO DESHIDROGENASA

La purificación incrementa la actividad especifica
NADPH + H'

Figura 8-5. Andlisis acoplado para la actividad de la hexocinasa La reaccibn se acopla a la catalizada por la glucosa-6fosfato deshidrogenasa. Todos los reactivos, glucosa6-focfato deshidrogenasa, glumsa, ATP, y NADP*. se agregan en exceso. Entonces, la cantidad de hexocinasa presente determina la velocidad de la reacción acoplada global y. por tanto, la velocrdad de formación del NADPH, la cual puede ser medida a 340 nrn

de uii produclo (o, de modo menos común, la velocidad dc desaparición de un sustrato). Las propiedades fisictiquimicac del producto o sustrato determinan el mEtodo especifico seleccionado para la cuaníificacihn. A menudo es conveniente "acoplar" el producto de una reacción a una deshidrogenasapara la cual este producto representa un sustrato (figura 8-5).

El objetivo de la purificacihn de la enziina es aislar una proteina enzimhtica especifica dc un cxtracio crudo de celulas que contienen muchos otros compcinentes. Idas moléculas pequeiias pueden eliininarse por dialisis o por filtracidn en gel, los Licidos nucleicos por precipitacihn con el antibiótico estreptomicina, etcktera. El problema es separar la enzima deseada de una me7cla de cientos de proteínas quirnica y fisicamente semejantes. En el cuadro &-2 se muestra el progreso de la puri~~cación tipica de una enzima hepática con una recupcraci6n adecuada y una purificación de 490 veces. Nótese la forma en que se calcuEan la actividad especifica y la recuperacibn de la actividad inicial El objetivoes lograr la actividad especiiica máxima ( m i dades de enzima por miligramo de proteína) coi1 la mayor recuperación posible de la actividad inicial.

ES ESENCIAL DISPONER DE ENZlMAS PURAS PARA COMPRENDER SU ESTRUCTURA, SU FUNCIÓN,~ SU MECANISMO DE REACCION Y SU REGWLACION
E:l conocimiento de las reaccionecy los intermediarios quimicus en las vias meiabólicas así como de los

Para la purificación se emplean crornatografía de intercambio ionico y cromatografía con soportes de exclusion de tamaño
Los procedimientos de purificacibn clásicos útiles incluyen la precipitacilin con concentraciones salinas variables (por lo general con sulfato de sodio o de amonio) o solventes (acetato o etanol), la dcsnaturalizacidn diferencial por calor o pH, Ia centrifugación diferencial, la filtracihn en gel y la electroforesis. La absorción celcctiva y la elucion de las proteínas en

Cuai
accibn dc ia

iesumen de un esqluemn típico de pu rificación de una e

1 Actividad
~ii~irria

1
-

iteina tota

Hornogene izado criidc Liquido sol~rcnadante I'recipitado con (NIld Precipitado con acetorl a 20 a 350/u Fracciones 80 a 1 1 0 e ri, columna DBAE I'recipitado con (NH4)?SO443 a 4 8% Prirneroc cristales Recristalixacion 49 O00 . -* mlJ = milienzima: milimolcs de sustrato que cambian por minu
A,.A
"A--""

(mCJ)* 100 00(. 98 995 90 OOC .,.

(mrr)

L ~ U

29

1

20 12

. .. - - -

49

celulosa de intercambio aniónico, dietilarninoetilcelulosa (DEAE del ingles, diefhyIunainoe/hyoy en !a de intercambio catiónico carboximetilcclulosa (CMC. dcl inglds, carhox,vmeih~~/celJul~ tambien han sido extremadamente utiles para la purificación extensa y ripida de proteínas. Por ejemplo. un extracto acuoso de tejido hepático se ajusta a pH 7.5, valor en el cual la mayoría de las proteínas tienen una carga negativa neta. Luego, se adiciona la mezcla de proteínas solubles a una oolurnna de celulosa D E A E amortiguada a pH 7.5, valor al cual llt;,AE tiene carga positiva. Las proteínas con carga negativa sc Lincn a DEAE por interacción de cargas opuestas, eii tanto que las proieínas sin carga o con carga positiva fluyen libremente a traves de la columna. Luego, la coliimna se eluye, por lo común usando iin gradiente de NaCl que va de concentración ba,ja a alta, disuelto en amortiguador con pH 7.5. Dado que CI-compite con las proteínas por sitios de fijación cn cl soporte con carga positiva, éstas se eluyen de manera selectiva, primero las que se enlazan débilmente y, al último, las de enlace fuerte. Separaciones proteínicas an5logac emplean un soporte crin cargia negativa como carboximetiIceIulosa o fosfocelulosa a un p l l algo menor, para asegurar que ias proteínas tcngaii una carga m i s positiva Las separaciones de proteínas también pueden lograrsc sobre nrateriales porosos conocidos como -'filtros moleculares". Cuando una mezcla de proteínas fluye a través de una columna que contiene un filtro molecular, las proteinac pequeñas se distribuyen cn Iris espacios entre las partículas y en los espacios internos o poros del soporte. Conforme urja me7.cla de proteínas de diferentes tarnafios fluye al través de la columna, la movilidad de las protefnas pequeflas se retarda en relación con proteínas demasiado grandcs para pasar estos poros. Asi, las proteinas grandcs salen de la columna antes que las menores. E1 perfil de la clución presenta un patrón graduado que va desde las proteinas mas grandes hasta las pequefias. Sin embargo, los filtros rnoleculares tienen capacidad limitada y eil general sOlo se usan después de haber logrado una piirificación previa por otras técnicas.

la proteína indeseada fluye a lo largo de la columna y descarta. La proteina deseada se eluye del Iigando inmovilizado, por lo general con una concentración elevada de sal o de la Coma soluble dcl ligando. Las pusificaciones logradas por las técnicas de cromatngrafia por afinidad son iinpresioriantes. a menudo sucesiba de superando las posibles por la aplicaci~n numerosas técnicas clásicas. Los ligandos favorecidos son derivados dc sustratos y coenzimas adheridos por covalencia a un soporte como Sephadex. en general por niedio de utia mtilécula enla7~dora 3 a 8 carbonos de longitud de n Sin embargo, la introducción de H "ligando" hidrbfobo complica la scparacihn, al agregar a la cromatrigrafia ese elem~ntohidrdfoha (vCase después), Entre Ins ejemplos de aplicación exitosa de la cromatograt'ía por aiinidad se incluyen la purificación de muchas dcshidrogenasas diferentes sobre soportes dc afinidad de NAD'. Dado que numerosas deshidrogcnasas puedcn fijarse y ser eluidas juntas cuando la columna es tratada con NAD' soluble, el emplco subsiguiente de sustsato (mas que de coenzima) a los soportes afínes o la elución con una "mezcla ternaría abortiva" de un producto y un sustrato han probado tener éxito en muchos casos.
5e

La crornatografía de ligando colorante y ligando hidrófobo son técnicas análogas de cromatografia por afinidad
La crornatografia de Iigando colorante en soportes a como Sepharose azul, verde o rojo y E cromatografia de ligando hidrofobo como octil o fenil-Sepharose son técnicas con relación estrecha con la crornatografía pos afinidad. La primera emplea como ligando inmovilizado a un colorante organice que sirve como análogo del sustrato, coenzima a efecror alostCrico. En general, la elución se logra usando gradientes salinus. En la cromatografía de ligando hidrlifobo, un hidrocarburo alquil o aril se adhiere a un soporte como Sephadex. La retención de proteínas en estos soportes comprende interaccioncc hidrofbbicac entre la cadena alquil y ias regiones hidrófobas de la proteina. Las proteínas se adicionan a soluciones que contienen una concentración alta de una sal (por ejemplo, [NH4]2S04)y se eluyen con gradientes decrecientes de la misma sal.

Los soportes de cromatografía por afinidad sirven para identificar regiones específicas de las enzimas
L,a característica sobresaliente de la cromatografia por afinidad es sil capacidad para remover selectivamente de una mezcla proteínica compleja, una protcína particular o un pequeiio número de ellas. La técnica emplea un ligando inmovilizado que interactúai cspecificamente con la enzima cuya purificacilin se desea. Cuando la mezcla proteínica se expone a este ligando inmovilizado, las iinicas proteinas que se unen son las que interactúan fuertemente con él. Por su parte

La tecnología del DNA recombinante puede ser una fuente abundante de enzimas
Hasta fechas relativaniente recientes, los únicos materiales iniciales disponibles para preparar enzimas purificadas eran las células de animales, plantas o

84

Bioquímica de Harper

(Capitulo 8)

bacterias, en Ias cuales se encuentran dichas enzimas. La cantidad existente de una enzima dada en muchos casos era muy pequefía, lo que imponía un límite máximo z la cantidad de enzima purificada que se podía obtener con un costo razonable. Esta situación se ha modificado en gran medida por la tecnología del DNA recombinante, ya que [os genes que codifican muchas enzimas se han donado y secuenciado y pueden colocarse en un vector de expresibn derivado de pllismido o fago, bajo el control de un promotor fuerte. Estos vectores se trasladan al interior de d l u las, ya sea de Escherichia coli, levaduras o de cultivos de mamíferos. En presencia de un inductor apropiado, la maquinaria de síntesis proteinica de la célula huésped se [leva a la shtesis de E enzima deseada. La a purificación subsecuente se facilita tanto por las cantidades relativamente grandes de la enzima recombinante como por el hecho de que, al provenir de una forma de vida diferente a la del hubsped puede diferir en grado significativo de las propiedades de las proteínas de éste, como serfa E estabilidad al calor. Las a levaduras varían desde pocos, hasta cientos de miligramos de proteína homogCnea por litro de celdas de Escherichia coli, cantidades adecuadas para los amplios estudios de cristalografía de rayos X y otros anklisis fisicos necesarios para deteminar la estructura tridimensional.

hcido cíirico están en las mitocondnas. La distribución de las enzimas entre !3s organelos subcelulares puede estudiarse despues de fraccionar los hornogeneizados de células mediante ultracentrifugación. Entonces, se examina el contenido enzimátiw de cada fraccidn. La localizaci6n de una enzima particular en un tejido o cdlula, en estado relativamente inalterado, se puede lograr frecuentemente por procedimientos histoquimicos (histoenzimologia}. Cortes delgados de tejido congelado (2 a 10 pm)son tratados con un sustrato para una enzima particular. En las regiones donde se encuentra la enzima se forma el producto de la reacción catalizada por ella. Si el producto es colorido e insofuble, permanece en el sitio de formaci6n y sirve como un indice para la localizaci6n de la enzima. La histoenzimologia proporciona una imagen grhfica y relativamente fisiológica de los patrones de distribucibn enzimática.

LAS ISOZIMAS SON FORMAS F~SICAMENTE DISTINTAS CON LA MISMA ACTIVIDAD CATALITICA
Cuando se aplicaron las tdcnicas de purificación de enzirnas a la malato dechidrogenasa de diversas fuentes (por ejemplo, hfgado de rata y Escherichia coli), pronto se obsenib que, si bien la malato deshidrogenasa de hlgado de rata y la de E. coli, catalizan la misma reaccidn, sus propiedades físicas y quimicas exhibían numerosas diferencias importantes. Pueden existir formas físicamente distintas con la misma actividad catalitica en diferentes tejidos del mismo organismo, en distintos tipos celulares, en compartimientos subcelulares o en pr-otas como E coli Este descubrimiento fue una consecuencia de aplicar los procedimientos de separacidn electroforktica a la separaci6n de entidades electroforéticamente distintas de una actividad enzimktica particular. Mientras que el ttmino "isozima" (isoenzirna) podría utilizarse para englobar a todos los ejemplos anteriores de formas fisicarnente distintas con una actividad catalftica dada, en la prhctica, en especial en la medicina clínica, la "isozima" tiene un significado más restringido, es decir, las formas distintas y físicamente separables de una enzima dada, presentes en tipos celulares diferentes o en compartimientossubcelulares de un ser humano. Las isozimas son comunes en los sueros y los tejidos de todos los vertebrados, insectos, vegetales y microorganisrnos unicelulares. Tanto la clase como el número de enzima involucradas es igualmente diverso. Se han localimdo isozimas de numerosas deshidrogenasas, oxidasas, tramaminasas, fosfatasas, transfosforilasas y proteasas. Tejidos diferentes pueden contener isozimas distintas y tstas a su vez diferir en su afinidad por los sustratos.

La electroforesis en gel de po!iacrjlamida detecta contarninantec
La homogeneidad de las proteínas se valora mejor por electroforesis en gel de poiiacrilamida (EGPA) bajo diversas condiciones. La EGPA unidimensional de la proteina original revelará, si se aplica suficiente muestra, la presencia de contaminantes protelnicos mayores y menores. En la EGPA bidimensional (O'Farrell), la primera dimensibn separa a las proteinas desnaturalizadas con base en sus valores pI, equilibrindolos en un campo eldctrico que contiene urea y se mantiene un gradiente de pH por los anfblitos polimerizados. Entonces, la segunda dimensibn separa a las protefnas, despuds de su tratamiento con SDS, con base en los tamailos moleculares de sus unidades protoméricas.

LAS EN2IMAS PUEDEN ENCONTRARSE EN ORGANELOS ESPEC~FICOS
El ordenamiento espacial y la compartimentaiizacibn de enzimas, sustratos y cofactores dentro de las c&lulas son de importancia cardinal. Por ejemplo, en las cklulas hepáticas, las enzimas de la gluc6lisis están localizadas en el citoplasma, en tanto que [as del ciclo del

Enzimas . propiedades generoles

85

La capacidad para separar e identificar isozimas tiene valor diagnóstico
El interds mCdico en las isotimas fue estimulado por el descubrimiento de que tos sueros humanos contenían varias isozimas de la lactato deshidrogenasa y quesus proporciones relativascambian significativamente en ciertos estados patol~gicos. Posteriormente, se han descrito numerosos ejemplos adicionales de cambios en las proporciones de isozimas como consecuencia de una enfermedad. Las isozimas de la lactato deshidrogenasa del suero pueden demostrarsesometiendo una muestm de suero a laelectroforesis, usualmente a pH 8.6,usando un gel de almidon, agar o poliacrilamida como soporte. Las isozimas tienen diferentes cargas a este pH y emigran a cinco regiones distintas del electroferograrna. Luego, se localizan por medio de su capacidad para catalizar la reducción de un colorante incoloro a su forma colotida e insoluble. Una mezcla tipica para anhlisis de deshidrogenasa contiene NADA, sustrato reducido, la forma un oxidada de un colorante redox como nitroaml de tetrazolio (NBT, del ingles, litro blue lelrmolrum) intermediario necesario para la transferencia de eIectrones de NADH a NBT, amortiguador e iones activantes segun sea necesario. La figura 8 4 ilustra la aplicacibn de este tipo de anklisis para visualizar y cuantificar isozimas de lactato deshidrogenasa shica (LDH, del inglks, lactnle dehydrogenuse) en el laboratorio clínico. La lactato deshidrogenasa cataliza la transferencia de dos electrones y un ion hidrbgeno del lactato al NAD' (figura 8-1). La reaccibn procede a una velocidad mensurable s61o en presenciade la lactato deshidrogenasa. Cuando la mezcla se rocía sobre el electroferograma y se incuba a 37 "C,tienen lugar las reacciones coordinadas de transferencia de electrones s61o en aquellas regiones donde se encuentra la lactato deshidrogenasa (figura 8 4 ) . Las intensidades relativas de las bandas pueden ser cuantificadas por un foriimetra de barrido (figura 8-7). La isozima mas negativa, se denomina 1

(Lactato)

sH2 WCTATO S k D E S H IDROGENASAJ

(Pjruvatc)

FMS reducido

~~C'oxidado

NBT oxidado (incoloro)

(azul)

Flgura 8 4 . Reacciones acopladas para la demostración de la actividad de la lactato deshidrogenasa en un etectroferograma. (NBT nttroazuF de tetrazoilo, PMS, metoculfato de fenacina.)

Las isozimas de la laciato dcshidrtigeiiasa difieren en el orden de la estructura cuaternaria. La molécula oligomérica de la lactato deshidrogenasa activa (peso molecular de 130 000) consiste en cuatro protomeros de dos tipos. E-1 y M (peso molecular aproximado de 34 000). Sólo la molécula tetramirica posee actividad catalitica. Si cl urden no e i iinportante, estos prothmeros pueden Fer combinado'; de cinco maneras diferentes como se muestra en seguida:

HHHH
HHHM HHMM HMMM MMMM

Las isozimas son productos de genes estrechamente relacionados

Las enzimas oiigoméricas con varios protómeros
disimiles pueden existir en diversas formas. Con frezuencia, un tejido produce un protornero de manera predominante y otro tejido sintetiza un prothmero diferente. Si es posible que Cstos se combinen de varios modos para construir una enzima activa (por ejemplo, un tetrhmero), se dice que se han formado isozimas de esa actividad enzirnática. Este fenómeno se representa despues mediante una enzima de importancia en el diagnóstico: la deshidrogenasa Ifictica.

Market ha usado condiciones que se sabe disgregan y reforman la estructura cuatemaria para esclarecer las relaciones entre las isozimas de la lactato deshidrogenasa i,, o de la lactato deshidrogenasa Is. La separacidn y reconstitución no produce nuevas isozímas las cuales, por tanto, consisten en un solo tipo de protómeso. Cuando una mezcla de lactato deshidrogenasa I l y lactato deshidrogenasa 1s son sujetas al mismo tratamiento, tarnbikn se producen las lactato deshidrogenasas Iz, 1, e 14. Las proporciones aproximadas de las isozimas encontradas son las que resultarian si la relacibn fuera: lsazirna lactato

deshidrogenasa 11
12
13

14

Subunidades HHHH HHHM HHMM HMMM

15

MMMM

86

Bioquimica de Harper

(CapifuJo 81

NORMAL

Figura 8-7. Patrones normal y patolbgioode las isozimas de la laetato deshidrogenasa(LDH) en suero humano. Las isozimas de LDH del suero fueron separadasen acetatode celulosa a pH 8.6 y tenidas en busca d e la presencia d e enzimas. El fotbmetro de rastreo muestra la produccibn de las isozimas El patrbn A es suero de un pauente con infarto del rniocardio, B es suero normat y C de un paciente con enfermedad hsphtica. (Cortesía del Dr. Melvin Black y Mr. Hugh Miller, St Luke's Hospital, San Francisco.)

La sfntesis de subunidades H y M es controlada por distintos Iocr geneticos que estiin expresados de manera diferencial en diversos tejidos, por ejemplo, el coraz6n y el mUsculo esquel&ico.
EL ANALISIS CUANTITATIVO DE CIERTAS ENZIMAS PLASMÁTICAS TIENE SIGNIFICADO DIAGNOSTICO Ciertas enzimas, proenzimas y sus sustratos se encuentran siempre en la circulacibn de las personas normales y realizan una funcibn fisiológica en la sangre. Algunas de estas enzimas plasmhticas funcionales son la lipoproteinlipasa, la seudocolinesterasa y las proenzimas de la coagulacibn sanguinea y de la disolución del cohgulo. Generalmente son sintetizadas en el hlgado, pero tarnbikn se encuentran en la sangre a concentraciones equivalentes o mayores que en los tejidos. Como lo dice su nombre, las enzimas plasmáticas no funcionales no desempeiian ninguna funcibn conocida en la sangre. Los sustratos de ellas con frecuencia faltan en el plasma y las propias enzimas se encuentran en la sangre de personas normales en

valores hasta de un mil1611 de veces inferiores a los de los tejidos. Su presencia en el plasma en cifras mayores que tos valores normales sugiere una velocidad aumentada de destruccibn tisular. Por tanto, la medicion de estos valores de enzimas plasmhticas no funcionales puede constituir para el médico una prueba valiosa de diagnóstico y pronóstico clínico. Las enzimas plasrnhcicas no funcionafes comprenden a las que existen en las secreciones exocrinac v a las enzimas intracelulares verdaderas. Las enzimas exocrinas, amilasa pancsektica, lipasa, fosfatasa biliar alcalina y fosfazasa ácida prostática, difunden en forma pasiva al plasma. Las enzimas intracelu lares verdadea ras estiin normalmente ausentes de E circulacion.

La destrucción normal de c&lulas conduce a la presencia en plasma de concentraciones bajas de enzimas no funcionaIes
Los valores bajos de enzima no funcionales que se encuentran por lo general en el plasma, aparentemente proceden de la desmiccibn rutinaria normal de los eritrocitos, leucocitos y otras cdlulas. Con la muerte acelerada de las c~lulas, enzimas solubles entran las

Enzimas. propiedades generales

* 87

en la circulación. Aunque los valores elevados de enzirnas plasmiiticas se interpretan generalmente como prueba de necrosis celular, el ejercicio intenso tambikn libera cantidades importantes de enzimas musculares.

LAS ENDONUCLEASAS RESTRICTIVAS FACILITAN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS
El diagnbstico de las enfermedades genéticas ha recibido un impulso tremendo con la tecnología del DNA recombinante. Aunque desde hace tiempo se sabe que todas las enfermedades moleculares son consecuencia de una alteracibn del DNA, las técnicas para el examen directo de las secuencias del DNA s610 se han desarrollado en épocas recientes. El desarrollo de pruebas de hibridización para fragmentos de DNA ha conducido a técnicas de sensibilidad suficiente para investigar, desde antes del nacimiento, los trastornos hereditarios p r mapeo de enzirnasde mtricci6n det DN A derivado de las cklulas fetales en el líquido amnibtico. Las pruebas para el DNA pueden, en principio, ser preparadas para el diagnástico de la mayoría de las enfermedades gendticas. Por ejemplo, para la detección prenatal de talasemias (que se caracterizan por un defecto en la sintesis de las subunidades de la hemoglobina; capitulo 7), una prueba preparada contra una porcidn del gen para una subunidad de una hemoglcbina normal puede detectar un fmgmento de rwtnccibn acortado o inexistente, el cual proviene de unasupresidn en ese gen, como sucede en atgunas alfa talasemias y en ciertos tipos poco frecuentes de beta y beta, delta talasemias. De manera alternativa, se ha preparado un detector o probador de cDNA sintktico que se hibridiza a la secuencia de una beta-globina que contiene una rnutacidn sin sentido, presente en ciertas beta-talasemias, pero no en el gen normal de la beta-globina. La ausencia del inhibidor de la proteasa plasmática alfa,-antilipsina se ha relacionado con el enfisema y con la cirrosis hephtica infantil. La presencia de una alfa,-antitripsina inactiva se ha identificado por un probador construido contra el alelo inactivo que contiene una mutacián en un punto en el gen para la alfai-antitripsina. Los detectores de hibridizacidn tambitn pueden utilizarse para averiguar alteraciones genkticas que conducen a la pdrdida del sitio de una endonueleasa de restriccibn (capitulo 42). Por ejemplo, la mutación en un punto del coddn Glu (GAG) al codbn Y al (GTG) tipica de la enfermedad de c6lulas falcifonnes puede detectarse en el gen de la beta-globina en las células contenidas en cantidades tan pequeiías de hasta 10 mL de liquido amniótico usando la endonucleasa de restriccion MstII o SauI.

Las enzimas plasmáticas no funcionales ayudan en el diagnóstico y pronóstico
Por mucho tiempo, la práctica profesional médica ha usada la cuantificacibn de ciertas enzimas plasmaticas no funcionales. Esta valiosa inforrnacidn para el diagnóstico y el pronóstico se obtiene muchas veces con equipos totalmente automáticos. El cuadro 8-3 contiene una lista de lar enzimas principales utilizadas en el campo de la enzimologla para diagnóstico. En el Apendice se incluye la escala de valores normales de las principales enzimas usadas con propositos de diagnostico.

Cuadra 8-3. Principales enzimas séricas utitizadas en el diagnóstico clinico. Muchas de kstas no son cas para la enferm ncionada

A

.

,-.-A-

Enzinna sérica
A,minotrans! ferasas

I Usa

--

uiirriuiriicu uriiiciuaI

Aspartat o aminoti ,* rerasa (rtST o SGOTI Alanina aminotr ferasa (A LT o SGR

1 Infariu uei ~ n i u

."...

.,. ,

-,,,,,-M

-,

. .. ..

:reat~tisaguda

--

'eruloplasn ina i

hepatote nticu
:rrnedad Ij c

-"

Creatinacine

stornos m usculares e infarto del mi0cardio

F
-

iíio

Carcinoma rnr la prhstata

de

Eosfatasa alcalina (isozi- Varias enfermedades bseas, tras'tornos he1 1smas)
-

trucitivos

he-

y-Glutamil t k m 1 3 p ~ C l ~1 ,Varias entermcdades ~~a

--

L actato d e . . (isozirnas) Lipasa

nasa Infarto del miocardio

LA DIGESTIQN RESTRICTIVA DE PROBADORES PUEDE REVELAR GENES H O M ~ L O G O S CON DIFERENTES SECUENCIAS DE BASES
Los detectores de DNA tambibn pueden usarse para encontrar secuencias de DN A íntimamente enlazadas

-Pancreatitis aguda
--

al gen que interesa, pero en realidad no dentro de 4. Los análisis pueden extenderse a la identificacibn de variaciones específicas de cromosomas (diferencias en la secuencia entre cromosomas hom6logos). La digestión del DNA con una endonucleasa de restricci6n genera diferentes mapas (patrones de fragmentos de DNA) de genes hornúlogos que contienen secuencias diferentes de bases. Este fenómeno se denomina "polilimorfismo d e la Longitud del fragmento de restriccibn" (PLFR). En una enfermedad genética ligada a un polimorfismo de la longitud de restriccibn, el portador de la enfermedad poseerá un cromosoma con un gen n o m a l y uno con un gen defectuoso. Cuando los fragmentos de restriccibn se analizan y sondean, se detectan dos bandas de hibndizacibn (que es distinto a una sola banda cuando ambos genes son idénticos). Los descendientes que heredan el cromosoma portador del defecto exhiben una sola banda de hibridizacibn que difiere de la producida por cromosornas normales. El fenbmeno de PLFR relacionado se ha aplicado al anhlisis de rasgo de las cdlulas falcifomes (bastsándose en un PLFR I-lpal relacionado) y de la beta-talasemia (ligada a un PLFR HindIII y BamHII. Se h a desarrollado una exploracibn basada en los PLFR para identificar la fenilcetonuria infantil (capítulo 32): Sin embargo, debe notarse que este enfbque general no es infalible, puesto que el PLFR no causa la enfermedad sino que simplemente se localiza cerca del gen defectuoso. Al parecer, la importancia firtura del PLFR radica en que es punto de partida para la identificacion del gen de las enfemidades relacionadas. Este enfoque que se ha empleado recientemente en la búsqueda de los fenómenos mutacionales que intervienen en la formación de los retinoblastomas y la enfermedad de Huntington. En el capitulo 42 se encuentran más ejemplos de los usos de las enzimas de restriccibn para diagnóstico.

vienen de manera clave en procesos de separacidn de intrones esenciales para la conversián de premRNA a m RNA maduro (capítulo 39).

RESUMEN
Las enzimas son catalizadores protelnicos que regulan la velocidad a la cual se realizan los procesos fisiolbgicos. En consecuencia, las deficiencias en la función enzim htica con frecuencia causan patología. Las enzimas que catalizan reacciones que comprenden trasferencia de grupo, isomerimción, oxidomducción o sintesis de enlaces covalentes necesitan un cosustrato conocido como coenzima. Dado que numerosas coenzimas son derivados de la vitamina B, las deficiencias vitamínicas pueden afectar de modo adverso la funci6n enzimiitica y, por ende, la homeostasia. Varias coenzimas también contienen e[ nudebtido AMP. La mayoría de las enzimas tienen especificidad elevada por sus sustratos, coenzirnas y tipo de reaccion catalizada. Sin embargo, algunas proteasas tambiéri escinden esteres. Las enzimas que actúan sobre sustratos de peso molecular bajo, tambikn pueden reacciona. con análogos de sustratos, pero en general a velocidades bajas. La medicihn de la actividad enzimática es fundamental pam la cuantificacián de enzimas en investigacibn o en e3 laboratorio clínico. La actividad de deshidrogenasas dependientes de NAD(P)' s e analiza en espectrofotrimetro a través de la medición del cambio en la absorcion a 340 nrn que acompafla a la oxidacibn o reducción de NAD(P)+/NAD(P)H. Acoplar otras enzimas a las deshidrogenasas puede facilitar su análisis. En la investigacidn de su estructura, mecanismo de accián y regulacibn de su actividad, las enzimas deben purificarse a una homogeneidad mayor de 95 por ciento. Las tdcnicac para purificar enzimas incluyen precipitación selectiva por sales o solventes orgánicos y cromatografía en soportes de intercambio idnico, fi ttracibn en gel, afinidad por sustrato o interaccibn ligando colorante o ligando hidrbfobo, La capacidad para explotar tdcnicas de QNA secombinante en la expresión de enzimas en hutspedes utiles ha revolucionado la puriftcacibn de enzimas al proporcionar cantidades grandes de enzimas que en la mayorÍa de tos casos ya pueden purificarse hasta la homogeneidad. El progreso de una purificación se valora con la medición del incremento en la actividad especifica de la enzima (actividad por unidad de masa) y su homogeneidad final mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA). La localizacibn intracelular precisa de enzimas se infiere por medio de tbcnicas de histoquimica y fraccionamiento celular acopladas con análisis enzimático de cortes de tejido o de fracciones de hornogeneizados celulares. En todas las formas de vida y tejidos existen isozimas, que son formas fisi-

RNA CATALITICOS
Aunque es evidente que no son proteinas, ciertos ácidos ribonucleicos (RNA) presentan actividad catalitica altamente específica de sustrato. Estos RNA, que cumplen con todos los criterios clhsicos de la definicibn de enzirnas, se conocen como ribozimas. Aunque los sitios de accibn de las ribozimas se limitan a los enlaces fosfodiésteres de RNA, la especificidad de su acci6n se compara plenamente con la de las enzimas clksicas. Las ribozimas catalizan la trunsesterificacibn y, en iiltirna instancia, la hidrólisis, de los enlaces fosfodidcttres en moléculas de RNA. Estas reacciones son facilitadas por grupos libres --OH, por ejemplo, en residuos de guanosil. Las ribozimas inter-

Enzrmas: propiedades generales

89

misma actividad catatítica. Patrones distintivos de isozimas de enzimas skricas no funcionales revelan daíio de tejidos humanos específicos y proporcionan informacibn valiosa para el diagnóstico y el pronostico. Por Ultimo, la propiedad de las endonucleasas restrictivas para detectar cambios sutiles en la estructura de los gcnes permite al médico el diagnhstico de enfermedades genkticas donde las mucamente distintas con la

taciones conducen a sintesis de enzimas defectuosas o no funcionales. Aunque casi todas las enzirnas son proteínas, se conocen RNA catalíticos, como las ribozimas que catalizan de manera muy especifica la hidrolisis de enlaces fosfodiéster en el RNA. Estas reacciones son importantes en fenómenos de procesamiento que incluyen la maduración de pre-mRNA.

REFERENCIAS
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Vicfor W Rodwell, PhD

Muchas caracterisiicas de la cinetica enzirnática provienen, por lógica, de conceptos propios de la cinbtica de reacciones químicas no catalizadas. Por tanto, este capitulo describe primero aspectos de la teoría de la velocidad de reaccidn, válidos para reacciones químicas en general y luego considera los factores exclusivos para reacciones cata1izadas por enzimas.

Todos los factores que afectan la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas (concentración de enzima y de sustrato, temperatura, pH y presencia de inhibidores) tienen interés en clínica. EI principio biológico principal del estado homeostático de buena salud requiere que la composición del medio interno corporal se conserve dentro de limites relativamente estrechos. Por tanto, la buena salud exige no sólo que se produzcan cientos de reacciones catalizadas por enzimas, sino que procedan a velocidades apropiadas. No lograrlo perturba el equilibrio horntostatíco de los tejidos, con profundas consecuencias potenciales. El medico debe comprender el modo en que el pH, la concentraci6n de enzimas y de sustrato así como los inhibidores influyen en las velocidades de esas reacciones. Algunos ejemplos escogidos ejemplifican sobre este puitto. La velocidad de ciertas reacciones catalizadas por enzirnas responde a las desviaciones sutiles del pH intracelular que caracterizan a la acidosis o alcalosis metabdlica. Además, dado que esta velocidad se eleva o baja en respuesta a las fluctuaciones correspondientes en temperatura, la fiebre y la hipotermia perturban

la homeostasia al modificar la velocidad de numerosas reacciones catalizadas por enzirnas. Sin embargo, eszos cambios mínimos pueden convertirse en ventaja para el mtdico. Por ejemplo, la disminucibn en la actividad de todas las enzimas que tiene lugar a temperatura corporal baja (hipotermia), puede explotarse para reducir la demanda rnetabolica global durante cirugia a coraz6n abierto o en el transporte de órganos para trasplante quirúrgico. Por su parte, la toxicologia y la farmacología aprovechan eI conocimiento de los factores que modifican la velocidad de reacciones enzimiticas. Los venenos metabiilicos como los mercuriales, el curare y los gases nerviosos ejercen su toxicidad mediante la inhibicibn de enzimas y en consecuencia toman lentas o anulan reaccionasmetaMlicas esenciales. Por ultimo, numerosos fármacos importantes en terapéutica actúan por reduccjon de las velocidades de reacciones metabblicas al competir con el sustrato natural por una enzima clave. A menudo estos medicamentos tienen una estructura anhloga a la del sustrato natural. Ejemplos son la lovastatina y la zidovudina (AZT), famacos usados para tratar la hipercolesterolemia y el SlDA, respectivamente. Ambos tienen efectos teraptuticos mediante la alteracion de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.

LAS REACCIONES PROCEDEN A TRAVÉS DE ESTADOS DE TRANSICIÓN
El concepto de estados de transicidn es fundamental para la comprensibn de las catfilisis de cualquier tipo, incluyendo la enzirnhtica. Por ejemplo, considkrese unareacción de desplazamiento donde un grupo L que

92

Bioqrcím ica de IJarpw

se desprende, adherido en uii principio a R, es desplazado por la entrada del grupo E:
E + R-L
=

E-R+

L

En realidad este desplazamiento pasa por un estado de transicion, E- R. L, cuya íormacibn y desinte. gración subsiguiente puede representarse con dos ''reacciones parciales". cada una con un cambio caracteristico en la energia libre:
E + R-L
E..R*.L
= E. .R. . L = E-R+ L

reaccionar; y 2) para cada reaccion química. hay una barrera energetica que debe superarse para que la reacción tenga lugar. Para que una colisibn termine en una reacción, las moléculas reactantes deben poseer energia suficiente para sobrepasar esta barrera energhtica. Por tanto, cualquier cosa que: a) eleve la energía cinética de las nioléculas reactantes, b) abata la barrera energktica para la reacción o c) incrernente la frecuencia de colisión, deberá aumentar la velocidad de reacción.

AGF

Temperatura
Elevar la temperatura incrementa el número de moléculas que pueden reaccionar, ya que aumenta la energia cincrica e incrementa la frecuencia de las colisioncs. Como se muestra en la figura 9-1, el numero de mol&culas cuya energia cindtica excede la barrera energktíca para la reaccion (barra vertical) aumenta cuando la temperatura sube desde un valor bajo (A) a travds de uno intermedio (B) a uno alto (C). Adernhs, cualquier elevación de temperatura, acelera el movimiento molecular y, por ende, la frecuencia de colisión. Los dos factores contribuyen al incremento en la velocidad de reacción que acompafia a un aumento dc temperatura. Sin embargo, este incremento de la velocidad de reacción no continua de manera indefinida, dado que finalmente se alcanza una temperatura a la cual las mol6culas reactantes ya no son estables. Esta temperatura limitante tiende a ser en extremo elevada para reactantes inorghtcos, modwadamente alta para gran parte de las rnolkculas orgánicas, pero bastante menor de 100 "C para la mayoría de las reacciones de interés biolbgico.

Gn

AGF y AGD son 10s cambios de energia libre que se producen en la formación y dcsintegracibn del estado de transicibn, respectivamente. E AG, cambio de Z energía libre relacionado con la reacción global, es a igual a la suma de las energías libres de E Iormacibn y degradación del estado de transicihn:

De la misma manera que en cualquier ecuación con dos tCrminos, no es posible inferir el signo o magnitud de AGF y AGn por observación del signo algcbraico y magnitud de AG. De otro modo, es iniposible, a partir de la concideracihn del cambio de energia libre en la reaccihn global, AG, inferir dato alguno respecto a los cambios de la energia libre relacionados con la f o m a ción y degradación de los estados de transición, Dado que la catalisis se relaciona de manera intima con AGF y AGn, se deduce que la termodinamica de la reacción global (AG) no puede proporcionar indicios del camino que una reacción sigue [es decir. su mecanismo). Esta es tarea de la cinética. Reacciones m i s complejas involucran varios y sucesivos estados de transición y proceden a travhs de una seric de reacciones parciales, cada una con un cambio de energia libre. Es importante observar que el cambio de energia libre para la reacción global, AG, es independiente del número de estados de transición. Esto se deriva del hecho de que AG es la suma algebraica de los cambios de energía libre para cada reacción parcial participante.

Concentración de reactantes
A concentraciones elevadas de reactantes, tanto la cantidad de mol&culas con energia suficiente para reaccionar como su frecuencia de colisión son altas. Esto es verdad, ya sea que todas o s61o una fraccion de las mol&culasposean energia suficiente para reac-

Barrera de energia

NUMEROSOS FACTORES MODIFICAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN
La teoria cinética o de colisión de la cindticaquimica, incorpora dos conceptos claves: 1) s61o las maltculas que chocan; es decir, que se acercan una de otra a distancias suficientes para formar enlaces, pueden

Figuta 3-1. Barrera energética para las reaeeiones químicas

cionar. Considtsrense reacciones que comprendan dos moléculas diferentes, A y R:

la expresidn apropiada de la velocidad es:
Velocidad a [AnBd

La reversibilidad se presenta por flechas dobles:
Duplicar la concentración de A o de 13 elevará la velocidad de reacción al doble, Dupticar la concentración de ambas. A y B, incrementarh cuatro veces la probabilidad de colision. Por tanto, la velocidad pe reacción aumenta al cuádruple. I,a velocidad de reaccihn es proporcional a las concentraciones de las moléculas reactantes. Los corchetes denotan concentraciones molaresk* cr sigriifica "proporcional a". La expresihn de la velocidad es:
Velocidad E [rnolbculas reactantes]

Esta expresión se lee: "ri moléculas de A y m moléculas de B están en equilibrio con A,B,,". El signo "proporcional a" (E) puede reemplazarse con un signo de igualdad mediante la inserción de una constante de proporcionalidad, k, característica de la reacci6n en estudio. Para el caso general

o
Velocidad s [A] [B] :

las expresiones para las velocidades de reacción hacia la derecha (velocidad I ) y la izquierda (velocidad -I) son:

Para la situaciiin representada por:

la expresihn de la velocidad es:
Velocldad m [A][B][B]

Cuando las velocidades de las reacciones hacia la derecha e iquierda son iguales, se dice que el sistema esta en equilibrio, es decir,

o
Velocidad or [A][B]~

luego Para el caso general donde n moléculas de A reaccionen con m rnoldculas de B:
ki[AIn[B]"' = k-~[AnBrn]

Y

la expresibn de la velocidad es:
Velocldad a [Aln[BIm

La proporción de ki a kise conoce como la constante de equilibrio, TG,. Deberh tenerse en mente las siguientes propiedades importantes de un sistema en equilibrio.
1) La constante de equilibrio es la proporción de las constantes de la velocidad de reacción, kik-1. 2) En el equilibrio, las velocidades (no las constantes de la velocidad} de las reacciones hacia la derecha y hacia Ia izquierda con iguales. 3) El equilibrio es un estado dinámico. Aunque en el equilibrio no existe un cambio neto en la concentracion de nioléculas reactantes o productos, A y B se están convirtiendo de manera continua a AnRm y viceversa. 4) La constante de equilibrio puede tener un valor numérico si se conocen las concentraciones de A, B y AnBm en el equilibrio.

K,, es una proporción de constantes de velocidad
Dado que todas las reacciones qulmicas son reversibles, para la reacci6n inversa donde A,B, forman n moléculas de A y m moléculas de B:

* Hablando de manera estricta, en lugar de concentraciones
debería decirse actividades molares.

94 a Bioauimica de Hur~er

AGO puede calcularse a parkir de K,,
La constante de equilibrio se relaciona con AG' de la siguiente manera:

R es la constante de los gases y T, la temperatura absoluta. Dado que estas se conocen, el conocimiento del valor numérico de K permite el chlculo del valor , para AGa. Si la constante de equilibrio es > 1, la reacción es espontánea; es decir, se favorece la reacci6n según se ha escrito (de izquierda a derecha). Si es < 1, tiene lugar lo contrario; es decir, es mas probable que la reacción proceda de derecha a izquierda. Sin embargo, nbtese que aunque la constante de equilibrio para una reacci6n indica la direccidn a la cual una seaccibn es espontánea, no indica si tendra lugar con rapidez. Esto es, no informa acerca de la magnitud de la barrera energttica para la reacci6n (es decir, AGF, vkase antes). Esto se debe a que K, determina a AGO, que previamente se demostrb concierne sólo a los estados inicial y final. Las velocidades de reacción
dependen de l a magnitud de la barrera energética, no de la magnitud de AGO. La mayoríade los factores que afectan la velocidad

enzimas disminuyen la barrera energéticaen una reaccibn. En consecuencia, una proporcibn mayor de moléculas de sustrato son capaces de reaccionar. Sin embargo, nbtese que si bien las enzimas afectan a AGr;, no modifican a AG. La AGn de la reacci6n global es igual estt catalizada o no por enzimas. Debido a que la constante de equilibrio para una reacción química es una funcibn del cambio de energia libre estandar para una reacciiin

se deduce que en las enzimas y otros catalizadores no tienen efecto sobre la constante de equilibrio para una reaccibn.

Las enzimas catalisan la formación o rotura de enlaces covalentes
Para la reacci6n de transferencia de grupo:

de las reacciones catalizadas por enzirnas lo hacen mediante el cambio de la concentraci6n local de reactantes.

un grupo, el G, es transferido de un donador, D 4 , a un aceptor, A. La reacción global comprende tanto la rotura del enlace D-G como la forrnacidn de un nuevo enlace A-G. Las reacciones de transferencia de grupo, catalizadas por enzimas, pueden representarse de la siguiente manera:

Esto enfatiza tres características importantes de las reacciones de transferencia de grupo, caializadas por enzirnas:

Las enzimas proporcionan estados de transición alteinoc
Igual que en toda catálisis verdadera, las enzimas se recuperan sin cambio después que la reaccibn termina. No obstante, durante el proceso, las enzimas participan de manera directa en la formación de estados de transición. De manera tipica, los estados de transicibn enzima-sustrato estan en niveles energeticos significativamente menores que los estados de transici6n cuando la misma reaccibn procede en ausencia de catalisis enzimhtica. Por tanto, un factor importante que contribuye a la capacidad de una enzima para acelerar la velocidad de una reacci6n dada es que el AGFpara formar un estado de transicidn enzima-sustrato sea bastante menor que el AGF para la reaccibn no catalizada correspondiente. De otra manera, Ias

1) Cada reaccibn parcial comprende tanto la rotura a como 3 formacibn de un enlace covalente. 2) La enzima es un reactante coeguivalente con D-G y con A. 3) Si bien en la reaccidn global la enzima actiia
de manera catalitica (es decir, se requiere 5610 en oligocantidades y puede recuperarse sin cambio cuando lareaccibn ha terminado), para cada reaccidn parcial, la enzima es un reactante estequiomktrico (esto es, se requiere en proporcibn molar 1: 1 con los demhs reactantes). Numerosas reacciones bioquímicas adicionales pueden considerarse casos especiaks de la transferencia de grupo en la cual D, A o ambas pueden estar ausentes. Por ejemplo, reacciones de isomerización (como la interconversión de glucosa 6-fosfato y glu-

Enzimus: cinética

9j

cosa 1-fosfato) podrían presentarse como reacciones en las cuales tanto D como A estan ausentes:

en términos de la constante de disociacibn, &, para el complejo R-C o la constante de equilibrio para la reacción:
R-C
R*C

Los complejos EnzS participan en la catálisis
Las representaciones anteriores todavia no son suficientes para enfatizar otra característica fundamental de las reacciones catalizadas por enzimas, la participacibn en la reacción global de dos o más fonnas intermediarias del complejo EnzS y la participación consecuente de u11 canjunto de varias reacciones parciales secuenciales. Una representación de una reacción de transferencia de grupo que enfatiza estas características podria ser:

Así, un valor bajo para Kd representa un complejo R - C fuerte. Una consecuencia importante es que cuando un reactivo se une a un catalizador, éste aumenta la concentracion del reactante en un Area localizada de la solución, por arriba de su concentracion en soluci6n libre. De este modo, ya no m m o s con una soluci6n quimica homogbnea, sino heterogknea. Si el catalizador para una reacción bimolecular (dos reactantes) se une a ambos, laconcentracibn local de cada uno aumenta en razún de un factor que depende de su afinidad individual (valor &) por el catalizador. Puesto que la velocidad de la reaccibn biomolecular global

en la cual EnzG, EnzG* y EnzG* * representan sucesivamente los complejos EnzS formados durante la reaccion global.

es, como se ve, proporcional a la concentracibn de 3 ambos, A y B, la fijación de los dos A y l por e! catalizador puede conducir a un incremento enorme (varias miles de veces) en la velocidad de la reacción
global.

Las enzirnas incrementan la proximidad del reactivo y la concentración local
Para que cualquiera de las reacciones anteriores tenga lugar, todos los reactantes deben encontrarse, uno del otro, a una distancia que posibilite la formacidn de enlaces (o su rotura). Para una solucibn quinrica homogenea, en ausencia de catalizadores, la concenación de las mol~culasreactantes es constante en toda la solución. Estacondición yano se cumple despuks de introducir un catalizador. Los catalizadores tienen sus propios dominios de superficie para unirse a las moIdculas reactantes. Aunque este enlace es un procese reversible, la constante global de equilibrio para la unión favorece fuertemente las formas enlazadas miis que las libres de mol6culas reactantes. De manera cualitativa, esto podria representarse asl:
Reactante + catarizador complejo reactante-catalizador

LA CATALISIS SE PRODUCE EN EL SITIO ACTIVO
Una propiedad esencial de las enzimas es su capacidad para fijar los reactantes la cual se acompafia de incremento en la soncenmación local de estos y, por ende, en la velocidad de la reaccihn. Las enzirnas son catalizadores extremadamente eficaces y muy selectivos. Para comprender estas propiedades distintivas de las enzimas, se ha introducido el concepto de sitio "activo" o "catalitico"*. El gran tamafío de las proteínas en relación con los sustratos condujo al concepto de que una region restringida de la enzima, el "sitio activo", se ocupaba de la catálisis. Inicialmente, era extremadamente enig-

* Aunque en muchos textos se establece una equivalencia
entre los sitios activos y los catalíticos de las enzimas, hay

Cuantitativamente, se podría expresar la fortaleza de la relación entre un reactante, R, y un catalizador, C,

sobre éstas, otros sitios "activos" que se relacionan con la regulación de la actividad enzimática m& que con la enzimologIa intermediaria del proceso cataIítico.

matico para los bioquimicos el porqug las enzimas cran tan grandes ciiando s6Io una porción de su estmctura parecía requerirse para unirse con el sustrato y para la catAlisis. Hoy en día, se reconoce que una porcion mucho mayor de la proteina actua reciprocamente con el sustrato que la que se suponia antes. Cuando aparece también la necesidad de sitios alostdricos de igual ramaiio ya no debe sorprender e! tamafio de las enzimas.

El modelo de un sitio catalitico rígido explica muchas de las propiedades de las enzirnas
El modelo de un sitio catalitico, propuesto por Emil Fischer, represenro la accion reciproca del sustrato y la enzima en tkrminos de la analogia de una "cerradura y Ilave". Este modelo dc cerradura y Ilave o modelo de plantilla rigida (figura 9-2), todavía es útil para entender ciertas propiedades de las enzimas, por ejemplo, la unión ordenada de dos o más sustratos (figura 9-3) o la cin6tica dc una curva de saturación del sustraio simple.

Figura 9-3. Representacibn de la absorcibn sucesiva de una uienzima (CoE) y de dos sustratos ($1 y $2) sobre una encima en término de la hipbtesis de la plantilla. Se supone que la coenzima porta un grupo esencial que se une al primer sustrato [Si), el cual a su vez es necesarbo para unir a S2

Los sustratos inducen un cambio de conformación en la enzima
1Jna caractcristica desafortunada del modelo de Ficher es que implica rigidez del sitio catalitico. Un modelo mis geneml es el del "ajiiste inducido" de Koshland, el cual ha recibido un considerable apoyo experimental. En elmodelo de Fischer se presume que el sitio catalitico esta prefigurado para adaptarse al sustrato. En el modelo de ajuste inducido, el sustrato induce un cambio en la conformación de la enzima. Esto aIlnea los residuos de aminoácidos y otros grupos de la enzima en ia orientación espacial correcta para la combinacion del sustrato, la cathlisis o ambas. En el ejemplo (figura 9 4 ) , los grupos hidrófobos [porción rayada) y los grupos cargados (área punteada) se encuentran implicados en la combinacibn del sustrato. Una fosfoserina (-P) y el -SH de un residuo de cisteina intervienen en la catálisis. Otros residuos, no implicados en proceso alguno, están representados

por los de lisina y metionina. En ausencia de sustrato. el grupo catalitlcci y el fijador de sustrato estíh separados por varios enlaces. Ida aproximación del sustrato induce un cambio en la conformacibn dc la proteína enzimatica, alineando los grupos correctamesite par.1 combinarse con el sustrato y para la catálisis. A1 mismo tiempo, las orientaciones espaciales de otras regiones tambikn están alteradas -la lisina y la metionina están ahora más juntas (tigura 9 4 ) . Los anhlogos del sustrato pueden causar algunos, pero no todos, los cambios en la confomacibn correctos (figura 9-5). Al adherirse el verdadero sustrato (A), todos los grupos (representados como circulos negros en todas las ilustraciones) son alineados correctamente. La adherencia de un análogo del sustrato que es demasiado "voluminoso'' (figura 9-5 B) o demasiado "delgadc" (figura 9-5C) induce una alineación incorrecta. Una caracteristica final es el sitio mostrado como una pequefia muesca a 12 derecha de la enzima. Tal vez se pueda imaginar una molécula reguladora uniéndose en este punto y "bajando" uno de los braz.0~ polipeptídicos que portan un grupo catat itico. Entonces puede producirse la uni6n del sustrato, pero no la catalisis. Como se puede observar en el modelo de ajuste inducido, los residuos qtie comprenden el sitio catalitico, pueder! estar niuy distantes entre si en la estructura primaria, pero especialmente cercanos cuando se considera la estructura tridimensional (terciaria).

Figura 9-2. Reprecentacidn de la fomacibn de un complejo EnzS de acuerdo con la hipdtesis de la plantilla de Fischer

Figura 9 4 . Representacibn bidimensional de un ajuste inducido por un cambio de conformación en la estructura de la proteina Obsérvenselas pastciones relativasde los residuos clave antes y despues de la unibn del custrato

cadena polipéptida de 129 residuos y tiene una profunda hendidura central que alberga un sitio catalitico con seis subsitios (figura 9 4 ) los cuares enla;ían

varios susrratos. Los residuos que originan la rotura del enlace se encuentran entre los sitios D y E, cerca de los grupos carhoxiIo de Asp 52 y Glu 35. Al parecer, Enz + S EnzS este último cede prolones al enIace acethlico de1 srisA B C @ato,en tanto que Asp 52 Con carga negativa estabiliza el ion c a r b ~ n desde el lado posterior. El sitio catalItico de la ribonucleasa también Figura 9 4 . Representación de cambios de c~nformacibn~en la protelna enrimatica cuando ocurre la unión can el sustrato radica dentro de una hendidura semejante a la anterior, a (A) a análogos inactivos del sustrato (B) y (C). (Según través de la cual se encuenmn His 12 e FIis 1 19, residuos Koshland.) que, segiin la evidencia química, soii el sitio catalitico.

Muchos residuos arninoacilo participan en el sitio activo
¿Qué partes de una enzima conforman y participan eii su sitio activo? EI sentido de esta pregunta se entiende mejor mediante el examen de las estructuras tridimensionales de un complejo terciario (tres componentes) formado por unaenzima y dos sustratos. Sin embargo, incluso en el estado de cristales, si estan presentes todos los siistratos se producira la catAlisis, lo cual complica Ia interpretacihn de los datos. Por tamo, se ha dei.,ostrado que es iitil el examen de la estructura de los denoiniiiados complqjoc terciarios abortivos compuestos de un sustrato y uti producto, o de complejos enzima-sustrato anhlogos al inhibidor. Estos complejos, que no pueden pasarse por alto, propercionan una estrecha aproximacibn al sitio activo durante el paso inicial de erilace con el sustrato en la c a t á l ~ s i s .Estos estudios muestran que muchos residuos aminoacilo esthn en contacto con sustratos o coenzimas unidos y, por tanto, constituyen parte del sitio activo. El tamaiio amplio y 61 carhcter tridimensional de los sitios activos determinan su visualizacibn 6ptima en las pantallas de computadoras mediante programas que permiten girar la estructura en todas las direcciones, verlas en tres dimensiones y acercar las partes que interesan. Las limitaciones de la hoja impresa tan solo permiten una representacibn iinperfecta de los sitios activos. Sin embargo, se pueden establecer algunas generalizaciones.

Los sitios activos de enzimas
multiméricas pueden encontrarse en subunidades de interface
Para ciertas enzimas que contienen multiples polipkptidos o subunidades, el sitio activo se encuentra en la interfase entre estas. Los residuos aminoacilo de ambos sustratos contribuycn al sitio activo, al servir para enlazar sustratos o para funcionar en la cathlisis. Uno de estos ejemplos es la enzima HMG-COA reductasa, que es la enziina limitante de la velocidad de colesterologenesis (figura 9-7).

Los residuos cataliticoc se conservan mucho
Ciertos arninoacidos, cn particular la cisteína y otros aminolicidos hidroxllicos, Cicídos o bhsicos tienen funciones claves en la catllisis. Estos residuos sirven como nucle6fi los, como catalimdores generales bhicos

Tri 63

'

Asn 46

Los sitios activos a menudo se localizan en hendiduras
Para las enzimas que consisten en una subunidad cnica, el sitio activo amenudo radica en una hendidura de la enzima. Un ejemplo es la lisozima, enzima presente en las lágrimas y en el moco nasal, la cual lisa las paredes celulares de muchas bacterias grarnpositivas trasmitidas por el aire. Está constituida por una soIa

Ser 36

h
F,

Arg114

Figura 9-6. Representacibn'bidimencionaldel sitio catalitico en la regibn hendida de la Ircozima De la A a la F representan
las fracciones glucosilo de un hexasadrido Algunos residuos en la región hendida se muestran junto con sus números en las secuencias en la Iisorima (Adaptado de Koshland )

98

Bioauim ica de Hurper

~Cu~íieclo 9)

generos. El cuadro 9-1 muestra esta conservacibn de la estructura primaria en los sitios cataliticos de en7imas hidroliticas relacionadas, pero diferentes. Por su parte, el cuadro 9-2 aclara la conservaci0n de "tipos" estructurales primarios a través de los gkneros para la enzima biosintética H M G X o A reductasa. No obstante, dado que un "tipo" estructural terciario puede construirse a partir de varias estructuras primarias diferentes, la estructura primariaglobal de las enzimas esta mucho menos conservada que la terciaria.

MULTIPLES FACTORES INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS
Figura 9-7. Estructurade una subunidad rjnica de HMG-COA reductasa de la bacteria Pseudomonasmevalonii La subunidad consta de dos dominios, el mAs pequeíio de los cuales (abajo izquierda) contiene un enlace nuclebtido doblado compuesto de hola beta y h6licec alfa Los residuos aminoacilo esun numerados para facilitar el trazo del polipéptido desde su terminal amino (N) hasta su teminal carboxilo (C). Observese que el polipéptido inicia en el dominio grande, entra al dominio pequeno y al final termina en el dominio grande (Rediseriada con autorizaubn de Lawrence CM, Rodwell VW, Stauffacher CV. Crystal structure of Pseudomonas mevalon~i HMG-COAreductase at 3 O angstrom resolution Science 1995:268 1758 )

Temperatura
Aunque la elevación de la temperatura incrementa la velocidad de una reaccihn cata1izada por enzimas, esto es verdad s610 dentro de limites estrictos de tempemtura (figura 9-81. Al principio, la velocidad de la reacci6n aumenta cuando latemperatura se eleva, debido al incremento en la energía cinktica de las moléculas reactantes. Sin embargo, al final, la energía cinetica de Ia enzima excede a la barrera energética para romper los enlaces dkbiles de hidr6geno e hidrdfobos que conservan su estructura secundaria-terciaria, A esta temperatura, predomina la desnaturalización con pérdida precipitada de la actividad cataiitica. Por tanto, las enzimas muestran una temperatura optima. No obstante, kste no es un parhmetro fundamental, ya que la temperatura óptima depende de la duración del analisis usado para determinarla, es decir, mientras mhs tiempo se conserve una enzima a una temperatura a la cual su estructura es apenas estable, mayor probabilidad tiene de experimentar desnaturalizacibn.

o acicidos o como aceptores de un grupo que esth experimentando transferencia. Es probable que, para todas las formas de una enzima que cataliza una reacción o una ciase de reaccibn dadas, el mecanismo de reaccidn sea idéntico sin importar el tejido o forma de vida original. En consecuencia, los aminoácidos que tienen funciones altamente especificas en la cathlisis y, hasta cierto grado, Ios aminoácidos adyacentes, tienden a mostrar una conservación elevada, inclusive entre

Cuadro 9-1. Swuenrrlaa de los aminohcidos en la vecindad de los sitios catalíticos de varias proteasas bovinas. Las regiones que se muestran son las situadas a cada lada de los residuos serilo S e histidilo J1l Sitio Ir'! -- '
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Cuadre 9--2. La estructura primaria de algunas regiones d, un sitio catalttico puede conservarse a e través de 1os generris. Se piensa que los aminokidos, mostiar~uaaurit rodeando al residuo elutan n n la catá tisis realiizada por la e A reduc,tasa. L( s residi10s i subrayados se desvian de E secuencia consensual a
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:ima de marniferos
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Ser humano C F

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alteraciones en la temperatura tienen escaso significado fisiológico, excepto cuando hay fiebre o hipotermia. Dado que el aumento en el nhrnero de moléculas con energia cinética suficiente para superar la barrera energktica, ofkce escasas opciones para los organismos homotkrmicos, entonces, ¿cómo incrementan sus velocidades de reaccibn? La respuesta se apoya en la propiedad de las enzimas de abatir las barreras energéticas para las reacciones y elevar las concentraciones locales de reactantes. Para casi todas las enzimas, las temperaturas 6ptimas son iguales o mayores a las de las células en las que se encuentran. Las de los microorganismos adaptados para crecer en aguas termales o en áreas oceánicas termales profundas muestran temperaturas bptimas prbxirnas al punto de ebullición del agua.

El factor por el cual la velocidad de un proceso biológico aumentacon un incremento de temperatura de 10 O C es el coeficiente de temperatura o Qio. La velocidad de numerosos procesos biolbgicos, como la contracci6n de un cosaz6n fuera de la cavidad toiricica, casi se duplica con una elevacibn de 10 "C en Ia temperatura (Qio = 2). La alteracidn en las velocidades de numerosas reacciones catalizadas por enzimas que acompaña a una elevacibn o caida de la temperatura corporal, constituye una caracteristica de supervivencia esencial para formas de vida como las lagartijas que no conservan constante su temperatura corporal. Por el contrario, organismos homottmicos como el ser humano toleran sblo alteraciones estrictamente limitadas en su temperatura. Por tanto, los cambios en la velocidad de reacción en el ser humano, debidos a

Cuando se mide la actividad enzimAtica a diversos pH, la hptima generalmente se observa entre los valores de 5.0 y 9.0. Sin embargo, unas cuantas enzimas, como la pepsina, son activadas a valores de pH muy alejados de estos límites. La fomia de las curvas de p - bptimo estii deterT1 minada por:

1) Desnaturalizaci6n de la enzima a valores de pH altos o bajos. 2) Alteraciones en el estado de carga de la enzima del sustrato o de ambos. Para la enzima, los cambios de carga pueden afectar la actividad, ya sea cambiando la estructura o la carga en un residuo que funciona para ligar el sustrato o en la catálisis. Para aclarar esto, considérese una enzima con carga negativa (Enz-) que reacciona con un sustrato cuya carga es positiva (SH*):

Temperatura dptime
I

A pH bajo, la Enz-adquiere protones y pierde su carga negativa:

A valores de pH altos, SH' se ioniza y pierde su carga positiva:

Figura 9-8. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de una reaocibn hipotetia catalizada por enzimas.

Puesto que, por definicibn para este ejemplo, las unicas formas que interaccionan son SH' y Enz-, los valores extremos de pH disminuirán las concentraciones efectivas de Enz- y SH', con lo cual se reduce la

100

Rioquímica de Harper

(Capítulo 99)

mSH*

X

m Enz

en la expresihn de la constan.te de equilibrio glohaI la [Enz] se cancela.

Figura 9-9. Efectos del pH cobre la actividad enzimhtica.

velocidad de reacción (figura 9-9). Solamente en el área som breada con rayas cruzadas, se encuentran Enz y S en el estado ibnico apropiado y sus concentraciones rnliximas están correctamente cargadas a pH X. Ademh, las enzimaspueden experimentar cambios de conformación con las variaciones del pH. Podría ser necesario un grupo cargado dista1 a la región donde el sustrato se ha fijado, para conservar una estructura activa terciaria o cuaternaria. Conforme cambia la carga en este grupo, la proteína puede desenrollarse, volverse más compacta o disociarse en protiimeros, todo lo cual conduce a la pérdida de la actividad. Dependiendo de la gravedad de estos cambios, la actividad puede ser restablecida o no cuando la enzima regresa a su pH bptimo.

Así, la concentración de la enzima no tiene efectas sobre la constante de equilibrio. Dicho de otra manera, puesto que las enzimas afectan a las velocidades y no a las constantes de velocidad, no pueden modificar a K,, que es una relacion de constantes de velocidad. Entonces, la K,, d e una reaccibn es la misma sin importar que se alcance el equilibrio con catálisis enzirnhtica o sin ella (recordar A G ~Las . enzirnas cambian la via de la reacci6n, pero no afectan las concentraciones de equilibrio inicial y final de los reactantes y productos, los cuales son los factores que determinan a K,, y AGO.

LA VELOCIDAD INICIAL ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA

La velocidad inicial de una reacción es la velocidad medida antes de que se haya formado suficiente producto para permitir que la reacción inversa ocurra. Además, la velocidad inicial de una reacción enzirnática es siempre proporcional a la concentracibn de la enzima. No obstante, obsdrvese que este enunciado se sostiene sole para velocidades in tiales.

Las enzimas no afectan las constantes de equilibrio
La enzima es un reactivo que se combina con el sustrato formando un complejo enzirna-sustrato, EnzS, que se descompone para formar un producto, P, y la enzima libre. En su f m a miis simple, esto
puede representarse como:

LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATOAFECTALA VElOClDAD DE LAS REACCIONES
En la explicación siguiente, las reacciones enzimáticas son tratadas como si tuvieran un solo sustrato y un producto unico. Aunque Cste es el caso de algunas reacciones catalizadas por enzirnas, la mayorla de ellas tienen dos o mas sustratos y productos. No obstante, esta consideración no invalida lo siguiente. Si se aumenta la concentracion del sustrato [S1 mientras que todas las demás condiciones se conservan constantes, la velocidad inicial medida, v, (la velocidad medida cuando m u y poco sustrato ha reaccionado), crece hasta un valor mfiximo, V,, y no ,, mas (figura 9-1 0 ) . La velocidad se incrementa al aumentar la concentracibn del sustrato hasta el punto donde se dice que la enzima estli "saturada" con el mismo. La velocidad inicial medida alcan7a un valor máximo y no es afectada por el incremento ulterior en la concentraci6n del sustrato, debido a que este está presente en

Aunque las expresiones de la velocidad para las reacciones hacia la derecha e izquierda y global incluyen el tCrmino [Enz],

velocidad^ = kl [Enz] [S]
Veloeidad.i = kl [Enz] [P]

Figura 9-10. Efecto de la ooncentracibn del suctrato sobre la velocidad de una reaacibn catalizada por enzimas.

un gran exceso molar con relación a la enzima. Por ejemplo, si una enzima de peso molecular de 100 000 actúa sobre un sustrato de peso molecular de 100 y ambos se encuentran a la concentración de 1 mg/mL; existen 1 O00 moles de sustrato por cada mol de enzima. Cifras mhs realistas serian:
[Enz] = 0.1 pglmL = 7 0 molar ~ [S] = 0.1 mglm L = 1o4 molar

Enz + S & EnzS (formación del complejo EnzS) no es infinitamente grande. En los puntos A o B al aumentar o disminuir [S], aumenta o disminuye la cantidad de Enz ligada con S como EnzS: de aquí que V I dependa de [S]. En C, esencialmente toda la enzima se encuentra combinada con el sustrato, de manera que un incremento ulterior en [S], aunque praduce un aumento en la frecuencia de las colisiones entre Enz y S, no puede causar incrementos en la velocidad de reacción, puesto que no existe enzima libre disponible para reaccionar. El caso B presenta una situacibn de mayor interés tebrico donde exactamente la mitad de las rnol&culas de enzima esthn "saturadas con" sustrato. De acuerdo con esto, la velocidad es la mitad dc la vclocidad rnbxima alcanzable { ,/ ) V2 a esa concentración particular de la enzima.

LAS ECUACIONES DE MICHAELIS-MENTEN DE HlLL REPRESENTAN LOS EFECTOS DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO
La ecuación de Michaelis-Menten
La concentraci6n del sustrato que produce la mitad de la velocidad mhxima, llamada valor K, o constante de Michaelis, se puede determinar experimentalmente graficando v, como funcibn de [S] (figura 9-10). La Km tiene las dimensiones de la concentracidn molar. Cuando [S] es aproximadamente igual a K,,, v, es muy sensible a los cambios en [S] y la enzima esta trabajando precisamente a la mitad de su vclocidad máxima. De hecho, muchas de las enzimas poseen

dando un exceso molar de lo6 de sustrato sobre la enzima. Incluso si [S] decreciera 100 veces, el sustrato todavia estaria presente en un exceso molar de 10 000 veces sobre la enzima. La situación en los puntos A, B y C de la figura 9-1 0 se aclara en la figura 9-1 1. En los puntos A y B solamente una porcihn de la enzima presente estl combinada con el sustrato, aun cuando haya muchas mhs molkculas de sustrato que de enzima. Esto se debe a que la constante de equilibrio para la reaccihn

Figura 4-11. Representacibn de una enzima a concentraciones bajas (A), altas (C) y a la wncentracibn Km del sustrato (6) Los puntos A, B y C corresponden a los de la figura 9-1 0

valores de Km que se aproximan a la concentraci6n fisioliigica de sus sustratos. L a expresión de Michaelis-Menten

Para determinar Kmy V,A, se usa una forma lineal de L ecuación a de Michaelis-Menten
Puesto que numerosas enzimas dan curvas de saturación que no permiten fácilmente la valoración de Vmex por tanto de Km),cuando la v, es graficada (y contra [S], es conveniente reordenar la expresión de Michaelis-Menten para simplificar la valoracihn de Km y V,,,. La ecuacihn de Michaelis-Menten puede ser invertida y factorizada como sigue:

describe el comportamiento de muchas enzimas de acuerdo a las variaciones de la concentracibn de sustrato. Ln dependencia de la velocidad inicial de una reacción catali7ada por enzirnas en [S] y en Kmpuede aclararse valorando la ecuaci6n Michaelis-Menten como sigue:
1 ) Cuando ISI es mucho menor que Km(punto A en las figuras 9-1 O y 9-1 1). Aííadiendo ahora

[S]a Kmen el denominador, cambia muy poco su valor, de modo que el término [S] puede ser eliminado dcI denominador. Dado que tanto Vmav como Km son constantes, se puede reemplazar su relación por una nueva constante, K:
yi

Invirtiendo:

, " ,v

F - vi = !! % = be l !? N
Km
Km

[S]

K m + [ I' S

K [S]

"aproximadamente igual a"]. En otras palabras, esto significa que cuando la concenlracihn del sustrato es considerablemente inferior a la requerida para producir la ,, miiad de la velocidad miixirna (el valor U) la velocidad inicial v,, depende de la concentraci6n del sustrato [S]. 2) Cuando [S]es mucho mayor que Km(punto C, figuras 9-10 y 9-1 1). Agregando ahora Km a [S] en el denominador, el valor de [S] cambia muy poco, por lo tanto el tCrmino Km se elimina del denominador.
[a significa

Simplificando:

~ s t es la ecuación de una linea recta: a

donde:

Esto establece que cuando la concentración del sustrato [S] excede con mucho el valor de Km,la velocidad inicial v,, es mhxima, Y,,. 3) Cuando [Si = Km (punto B, figuras 9-10 y 9-1 1).
VI

Si y, o 1/v, se grafican en función de x, o de l/[S], la interseccion en y, b, es IIV,,, y la pendiente, a, es K,/V,h. La interseccibn negativa en x puede ser valorada haciendo y = O. Entonces

= 'V d x [SI Km + [C] '

Vd = -x

[SI - - m h [ I V S Vrns! p] SI+ [S] 2 [SI - 2

Esto expresa que cuando la concentracion del sustrato es igual al valor de Km, la velocidad inicial vi es semimáxima. Tambikn indica la forma de evaluar a Km, esto es, de determinar de manera experimental la concentracion del sustrato donde la velocidad inicial es la mitad de la rnhxirna.

Esta gráfica es llamada gráfica del doble reciproco, por ejemplo, el reclproco de v,(l lv,) se grhfica contra el reciproco de [S] (l/[S]). El valor dc K,, puede: ser calculado a partir de la grhfica de Lineweawer-Burk o del doble reciproco (figura 9-1 2) usando la pendiente y la intersección en y o la interseccibn negativa en x. Puesto que el [S] está expresado en rnolaridad, las dimensiones de Km esthn en molaridad o moles por litro. La velocidad, v,, se puede expresar en cualquier tipo de unidad, puesto que Km es independiente de [Enzl. El

Kmpuede aproximarse a una constante de fijación
La afinidad de una enzima por su sustrato es igual al inverso de la constante de disociación, Kd, para el comple.jo enzima-sustrato, EnzS.

Figura 9-12. Gráfica de Lineweaver-Burk o de/ doble reciproco, l l v , contra [S] usado para valorar K y Vmh m

Esto es, mientras menor sea la tendencia del sustrato

y de la enzima para disociarse, mayor será la afinidad de la enzima por el sustrato. El valor Kmde una enzima para su sustrato puede
tratamienta por el doble recíproco requiere relativamente pocos puntos para definir Kmy es el método más utilizado para determinarla. De manera experimental, el uso de la grhfica de Lineweaver-Burk para valorar Km puede dar origen a una importancia no justificada de los datos reunidos a concentraciones bajas del sustrata. Éste cs el caso cuando las concentraciones del sustrato, seleccionadas para el estiidfo, difieren por un incremento constante. Este inconveniente puede superarse seleccionando las concentracioncs de sustratos, cuyos reciprocos difieren por incrementos constantes. Un enfoque alternativo a la evaluaci6n experimental de Km y V,,, es el de Eddie y Hofstee. La ecuación de Michaelis-Menten puede reordenarse a
servir también corno una medida de su Kd. Sin embargo, para que esto sea verdadero, debe ser válida una hipótesis incluida en la derivacidn de la expresión de Mfchaelis-Menten. La derivación supone que el primer paso de Izt reacción catalizada enzimáticamente

es rapido y siempre esta en equilibrio. En otras palabras. la velocidad de dicaciacion de EnzS a Enz + S debe ser mucho mhs rápida que su disociación a enzima + producto.

Para evaluar Kmy V,,,, se grafica v,l[S] (eje y) contra v, (eje x}. Entonces la interstccidn en y es V,,,/K, y la intersección en x es Vmk.La pendiente es -1 /Km. Aunque la gráfica de Lineweaver-Rruk y el enfoque de Eadie-Hofstee son útiles en los ejemplos escogidos, la determinación rigurosa de Km y V,, rcquiere de tratamiento estadistico. Los valores de K,, son de importancia prActica considerable. A una concentracion de sustrato de 100 veces K,,, la enzima actuará esencialmente a velocidad mhxima y por tanto la velocidad mhxima (V,,,) reflejara la cantidad de enzima activa presente. Por lo general, en el análisis de enzimas esta situación es deseable. El valor de Km indica la cantidad de sustrato que debe usarse para medir V,, Los tratamientos con ,,. el doble reciproca también tienen aplicacihn extensa en la cvaluacion de los inhibidorcs dc enzimas.

En la expresion de Michaelis-Menten,
v,= V,8,/2 es:
[S] =
- Km kl -

1 3

[S] que da

kr

+

k-1

pero cuando

k-, >>
entonces
kz + k-.r

k2

k-I

En estas condiciones, 1/K, = Kd = afinidad. Si kz es no a proximadamente igual a km,,entonces liK, subestima la afinidad, 1 /Kd.

104

Bioquímica de Harper

La ecuación de Hill
Ciertas enzimas y otras proteinas que -jan ligandos, como la hemoglobina, no muestran la cinética clásica de saturación de Michaelis-Menten. Cuando [S] ce grafica contra v,, la curva de saturacibn es sigmoide (figura 9-13). Esto indica, por lo general, el enlace cooperativo del sustrato a sitios múltiples. El enlace en un sitio afecta el enlace en otros como se describió en el capitulo 7 para la hemoglobina. Para la cinktica de saturacibn del sustrato sigmoide no son válidos los métodos dc evaluacibn gráficas de la concentración del sustrato que produce la mitad de la velocidad máxima, como se describib (no se producen rectas). Para valorar la sigmoide de T cinttica a de saturacibn se utiliza una representacidn gráfica de la ecuación de Hill, que originalmente se derivó para describir el enlace cooperativo de moléculas de oxígeno a la hemoglobina. Escrita de manera lineal, la ecuacihn - de Hitl es
log k'

mejor será el cooperativismo y, de este modo, será m& "sigmoide" la cinética de saturación. Si rr < 1, se dice que los sitios exhiben una cooperativismo negativo. A la mitad de la velocidad máxima (v, = V ) ,, / 2 v,J(Y,,, - v,)= 1, y por tanto, log v,/(V,, - v,) = O. De este modo, para determinar S r o (concenlracibn del sustrato que produce la mitad de la velocidad maxima), se traza una Ilnea perpendicular al eje de las x desde el punto donde log v,J(V,a, - v,) = 0.

EL ANALISIS CINETICO DISTINGUE ENTRE INHIBICIÓN COMPETlTlVA Y NO COMPETITIVA
Aunque de manera tebtica se distinguen los inhibidores de la actividad enzimática con base en si la inhibici~n se anula o no por el incremento de la concentraci6n del sustrato, numerosos inhibidores no muestran las propiedades ideales de inhibicibn competitiva o no competitiva puras que se describen despubs. Un criterio alternativo para la clasificación de inhibidores es su sitio de acción. Algunos se unen a la enzima en el mismo sitio que el sustrato (el sitio catalitico); otros lo hacen en alguna región alejada de &te (un sitio alostérico).

donde k' es una constante compleja. La ecuación afirma que cuando [S] es baja comparada con k', la velocidad de reacción aumenta a la enésima potencia de [S]. La figura 9-1 4 presenta una gráfica de Hill de datos cinéticos para una enzima con cinbtica de enlace cooperativo. Una grAfica de v,/V,,, -vi) contra log [S] proporciona una recta con pendiente = n, donde n es un pariirnetro empírico cuyo valor depende del número de sitios de enlace del sustrato y del numero y tipo de interacciones entre los sitios de enlace. Cuando n = 1, los sitios de union achian de modo independiente uno del otro. Si pl 1 1, los sitios son cooperativos; y cuanto mayor sea el valor de n, tanto

Los inhibidores competitivos típicos se asemejan al sustrato
La inhibicibn competitiva clásica tiene lugar en el sitio de unión del sustrato (catalitico). La estructura qulmica de un inhibidor (1) analogo del sustrato (S)

Figura 9-1 3. Sigrnoide de la cinética de saturacibn.

Figura 3-14. Evaluación grafica de la ecuacibn de Hill para determinar la concentracibn de sustratos que produce la mitad de velocidad mhxima. Este método se emplea cuando la curva de la cinbtica de saturacibn del sustrato es un sigmoide

por lo general es similar a la de este. Puede, por tanto, combinarse de manera reversible con la enzima, formando un complejo enzima-inhibidor (EnzI) en lugar de un complejo EnzS. Cuando tanto el sustrato como este tipo de inhibidor están presentes, compiten por los mismos sitios de unión sobre la superficie de la enzima. Un caso muy estudiado de inhibición competitiva es el del malonato (1) con el succinato (S) por la succinato deshidrogenasa. La succinato deshidrogenasa cataliza la formaci6n de fumarato mediante la remacibn de un htomo de hidrbgeno de cada htomo de carbono alfa del succinato (figura 9-1 5. ) El malonato (DOC-CT-iz-C003 puede combinarse con la deshidrogenasa formando un complejo EnzI. Este no puede ser deshidrogenado, puesta que no hay manera de quitar ni siquiera un atomo de hidrógeno del único atomo de carbono alfa del malonato sin formar un átomo de carbono pentavalente. La única reaccion que puede experimentar el complejo EnzI es la descomposicibn regresiva en enzima más inhibidor. Para la reaccibn reversible,
ki E R A + S $ Enz + I
k-i

se fija firmemente a la enzima (K, = una cifra pequefla). Ahora hay una cantidad escasa de enzima libre (Enz) disponible para combinarse con S para formar EnzS y finalmente Enz + P. Así, la velocidad de reaccibn (formación de P) sera lenta. Por razones anhlogas, una concentración igual de un inhibidor unido con menor fuerza (K, = un numero mayor) no hará disminuir la velocidad de la reaccibn de manera tan marcada. Supbngase que a una concentración fija de 1 se agrega más S. Esto aumenta la probabilidad de que Enz se combine con S, en lugar de hacerlo con 1. La proporcion de EnzS a EnzI y la velocidad de reacción se incrementan. A una concentracibn suficientemente elevada de S, la concentración relativa de EnzI desaparecerá. Si esto es asi, la velocidad de la reacción catalizada sera la misma que en ausencia del inhibidor (figura 9-1 6).

La gráfica del doble recíproco facilita la evaluación de los inhi bidores
La figura 9-1 6 representa un caso tipico de inhibición competitivamostrada gráficamente en la forma de una línea de Lineweaver-Burk. La velocidad de reacción (v,) a una concentración fija del inhibidor fue medida a diversas concentraciones de S. Las líneas trazadas a travds de los puntos experimentales coinciden en el eje de las y. Puesto que la jnterseccibn en y es lIV,,, esto dice que a una concentración infinitamente grande de S (l/S = O), v, es la misma que en ausencia del inhibidor. Sin embargo, la interseccibn sobre el eje de las x (que está relacionado a Km) varia con la concentración del inhibidor y se convierte en un número mayor (-1 K', es mayor que -1/K,) en presencia del inhibidor. Así, un inhibidor competitivo eleva la Km aparente (K',) para el sustrato; puesto

la constante de equilibrio Ki es:

La accibn de los inhibidores competitivos se puede entender en tkrminos de las siguientes reacciones:
Enzl (inactivo)+
Enz

Enz + P

EnzS (activa)

-+

Enz + P

La velocidad de formacibn del producto depende sOIo de la concentracibn de EnzS. Sup6ngase que el inhibidor

H H -C -COO
I
1

-

-0012C-H

--OOC-C-H

- 2H

H- C-COOII

Succinato

Fumarato

Figura 9-1 5. Reaeeibn del suminato deshidrogenasa.

Figura 9-16. GrAfica de Lineweaver-Burk de la inhibicidn cornpetiwa c l h s k . O b s é ~ e s e liberacibn de la inhibición a la concentración alta [S] (1I[S] baja).

106

nioquim ica de Har-p~r

Km es la concentración del sustraío a la cual la concentraci6n de enzima libre es igual a la concentración de enzima como EnzS, una cantidad sustancial de enzima libre estd disponible para combinarse con el inhibidor. Para la inhibicion competitiva simple, la intersección sobre el eje de las x es:
que

tran en la figura 9-1 7 son los que se obtienen cuando l l v , es graficado contra 1 /[S], en presencia y en ausencia de inhibidor. Se supone que no ha habido ninguna alteracion importante en la conformacibn del sitio activo cuando está unido 1.

Inhibidores irreversibles "envenenan" a las enzimas
Unagran variedad de "venenos'knzimáticos tales como la yodoacetarnida, los iones de metales pesados (Ag', 1-Ig2'), agentes oxidantes, etcétera, reducen la actividad enzimhtica. Puesto que estos inhibidores no tienen semejanza estructural con el sustrato, un incremento en la concentración de éste, en general, es ineficaz para suprimir esta inhibicr~n. embargo, la presencia de Sin uno o más sustratos o productos pueden proteger a la enzima contra la inactivacion. Un análisis cinetico del tipo anteriormente tratado puede no distinguir entre venenos enzirnáticos e inhibidores no competitivos reversibles verdaderos. La inhibicidn reversible no competitiva cs, en todo caso, rara. Por desgracia, esto no se aprecia siempre, ya que tanto la inhibicihn no competitiva reversible, como la irreversible, muestran cinética serne.jantc.

El valor de Kmpuede ser evaluado en ausencia de 1, y K, también puede serlo usando Ia ecuación anterior. Si el nbmero de moles de 1 agregado es mucho mayor que el numero de moles de enzima presente [1] puede ser generalmente tomado como la concentracián agregada (conocida) der in hi bidor. Los valores de K,, para una serie de inhibidores análogos al susirato (competitivos), indican cuales son los mas eficaces. A una concentración baja, con los valores más bajos dc K, produciran el mayor grado de inhibición. Muchos medicamentos eficaces en clíiiica actúan corno inhibidores competitivos de actividades enzimkticas importantes en las células microbianas y animales,

Los inhibidores no competitivos reversibles reducen Vmax pero no afectan a K m
En la inhibicibn no competitiva no hay competencia entre S e 1. Usualmente el inhibidor no muestra analogía estructural con S o esta es muy escasa y puede asumirse que se une a un espacio diferente en la enzima. Los inhibidores reversibles no competitivos disminuyen la velocidad rnfixima alcanzable con una cantidad dada de enzima (reducen V,,) pero por lo general no afectan a K,,. Puesto que S e I se pueden combinar en diferentes sitios es posibje la formacibn d e complejos En21 y EnzIS. Ya que EnzlS puede descompanerse para formar el producto a una velocidad menor que la de EnzS, la reaccihn puede retrasarse pero no impedirse Es posible que se presenten las siguientes reacciones de competencia:

La mayoría de las reacciones implica a dos o mas sustratos
Ida exposición anterior de las reacciones enzimhlicas catalizadas considera 3610 las reacciones que involucran sustratos y productos únicos. Sin embargo, la mayoria de las reacciones bioquímicas implican dos o más sustratos y productos. Aunque el análisis detallado de la cinCtíca de los mecanismos de las reacciones de rnultisustrato esta m& allá dcl asunto de este capítulo, a continuación se comentan las reacciones de dos sustratos y de dos productos, denominadas "Bi Bi".

Si S tiene igual afinidad par Enz y por En21 (1no afecta la afinidad de Enz por S), los resultados que se mues-

Figura 9-17. Gráfica de Lineweaver-Burk para inhibición reversible no competitiva.

Términos especiales describen las reacciones enzimáticas complejas
Los siguientes términos convencionalec se emplean pasa caracterizar reacciones compIe,jas catalizadas por enzirnas. Idossustratos se denominan A. B, C y D de acuerdo al orden en que se agregan a la enzima. Dc igual manera. los productos se designan P, Q, R y S de acuerdo al o r d ~ n que se separan de la enzima. en Los diferentes tipos de la enzima se denominan E, F y G, en las cuales la E corresponde a la enzima libre. y Los términos Uni ( 1 ), Bi ( 2 ) , Ter (3, Cuater (4) denotan el número de reactantes y productos. Aun cuando muchas reacciones catalizadas por enzimas involucran mis reactantes y productos (por e.jernplo, reacciones Bi Ter), aquí sblo se consideran las reacciones Bi Bi, es decir, aquellas que tienen dos sustraios y dos productos.
E EA EAB-EPQ

t

EQ

t

E

P

B

a
FB-EQ

E

EA-FP

t

F

t

E

Reacciones en secuencia o de desplazamiento unico
En las reaccioncs en secuencia todos los sustratos deben combinarse con la enzima antes de liberar cualquier producto. Estas tambikn se denominan reacciones de desplazamiento unico porque el grupo sujeto a transferencia (G) se pasa directamente desde el sustrato donador A-G al sustrato aceptor B. Dependiendo del modo en el cual los sustratos se agregan a la enzima, se distingue entre reacciones en orden aleatorio y reacciones en orden compulsorio. En las primeras, cualquier sustrato puede agregarse primero para formar ya sea E-A o E-8, mientras que en las segundas solo A puede reaccionar con E, en tanto que B reacciona c61o con el complejo E-A (figura 9-1 8). Una explicación para un orden compulsorio en la adicibn de sustratos es que agregar A induce un cambio en la conformación que alinea residuos escnciales para el enlace de B.

Figura 9-18. Reprecentaci6n de tres clases de mecanismos de reacuones Bi Bi Las líneas representan la enzima y las

flechas la adición de sustrato y desprendimiento de productos Arriba: Un mecanismo Bi 61 ordenado, característico de muchas oxidorreductasas dependientes de NAD(P) Centro: Una reacción BI Bi aleatoria, típica de algunas deshidrogenasas y cinasas. Abajo: Una reacción de ping pong, propia de l a s arninotransferasas (transaminasas) y de la quimiotripsina

zan para distinguir entre diferentes mecanismos. Aunque Ios t&rminocen estas ecuaciones cinéticas son m& numerosos, son análogos a los de la ecuación de sustrato único de Michaelis-Menten; incluyen: 1) V,,, velocidad de reacción media cuando están presentes tanto A como B en concentraciones saturadas; 2) las concentraciones de A y B que dan como resultado la mitad de la velocidad m k i r n a cuando el otro sustrato esth presente en concentracion saturada, y 3 ) las constantes de disociación para el desprendimiento de A y B de la enzima.

Reacciones en ping pong
El tkrmino ping pong se aplica a mecanismos en los cuales uno o más productos se desprenden de la enzima antes de la adicibn de todos los sustratos. Las reacciones Bi Ri ping-pong son reacciones de doble desplazamiento porque el grupo sujeto a transferencia ( G ) primero es desplazado de A 4 por E y a continuación de E-G por B, con formación del producto Q-G.

Las gráficas de doble reciproco diferencian entre los mecanismos ping pong y los secuenciales
Para distinguir entre diversos tipos de mecanismos, se mide la dependencia de la velocidad inicial en la concentracihn del sustrato A en varias series de concentraciones diferentes (pero constantes) del sustrato B. Los datos se obtienen ahora considerando B coma el sustrato variable y A como el sustrato constante. Los patrones de las lineas cuando 10s datos se representan mediante grhficas del doble recíproco muestran el tipo de mecanismo. Por ejemplo, las lineas paralelas indican un mecanismo Bi Bi ping pong, y las lintas que se intersectan en el cuadrante negativo, un mecanismo Bi Bi ordenado.

t o s datos cineticos sirven para distinguir los tipos de mecanismos

Los datos sobre el estado de reposo cinbtico y las ecuaciones apropiadas respecto a la velocidad se utili-

108

Bioquímica de Harper

Los estudios sobre inhibición de producto se utilizan para completar estos anhlisis cintticos y para distinguir entre mecanismos Bi Bi ordenados y Bi Bi aleatorios. Por qjemplo, en una reacción Bi Bi de equilibrio m i d o , cualquier producto es un inhibidor competitivo de A con [B] constante y de B con [A] constante. 1,os patrones mfis complejos de inhibiciOn de las reacciones B i Bi ordenadas involucran patrones de inhibición tanto competitivos como mixtos, dependiendo del producto que se estudie, de3 sustrato que varia y del que permanece constante.

RESUMEN
La temperatura, el pH, la concentración enzimática y de sustrato y los inhibidores alteran las velocidades de las reacciones catalizadas por entimas, con importantes implicaciones en la salud y la enfermedad. Las enzimas alteran las velocidades de reaccidn por medio de: 1) abatir la energía de activacidn para formar estados de transición, 2) servir como plantillas para incrementar las concentraciones tocales de sustrato y 3) proporcionar aminoicidos cuyos grupos funcionales cumplan con funciones especificas en la catiilisis. Aunque las enzimas modifican de manera profunda las velocidades de las reacciones, no afectan las constantes de equilibrio ni los cambios globales en la energía libre de esas reacciones. La catAlisis enzimática comprende estados de trancicibn de menor energía que los correspondientes en reacciones no catalizadas. De este modo, disminuye la barrera energetica para la reacci6n. La fíjaci6n y catalisis del sustrato se produce en el sitio activo (catalitico), región tridimensional de una enxima que, además de residuos de aminoacidos, puede contener coenzimas o iones metálicos. Los sitios activos con frecuencia radican en hendiduras en las enzimas o en la interfase entre subunidades de enzimas multimericas. Cuando los sustratos se aproximan, los sitios cataliticos experimentan cambios de conformación que pueden propagarse mhs allá del sitio catalitico (recukrdese la fijaci6n de 01 la hemoa globina). Estos cambios de conformaci6n inducidos por el sustrato pueden crear bolsas para su retenci6n y alinear residuos clave para la catálisis. Cuando la temperahira de una enzima se eleva, la velocidad de reaccion aumenta, pero sblo hasta que el nivel de la energia cinetica de la enzima excede a la de rotura de las ddbiles fuerzas no covalentes que mantienen su estructura secundaria y terciaria nativa. En este punto, la actividad decrece en forma precipitada. Cambios de temperatura mAs moderados también afectan la velocidad de reacciones catalizadas por enzimas in vivo, aunque a un grado estrictamente

limitado en organismos homotérmicos, como el ser humano. Los cambios moderados del pH (es decir, en Ia regibn de pH 5 a 9) afectan la actividad enzimktica al alterar la carga de grupos R bcidos o bhsicos dkbites de los arninoácidos que actúan en la caaisis, fijación de sustrato o conformaci6n del sitio catalltico. Las variaciones de pH t a m b i h pueden alterar la carga elkctrica de los sustratos. Por tanto, las enzimas tienen valores de pH a los cuales muestran actividad 6ptima (pI-l óptimo). Los extremos de pH desnaturalizan las enzimas al protonizar o desprotonizar residuos de arninoácidos acidicos o alcalinos, de modo que ya no pueden formar los enlaces salinos que conservan la estructura secundaria y terciaria de la enzima. En casi todas las situaciones de ínter&s fisio16gic0, la concentraci6n molar de una enzima [E] es de un orden de magnitud menorque laconcentración molar de su sustrato [S]. Dado que se dispone de abundante sustrato para reaccionar con la enzima libre, cualquier incremento o decremento en la concentración de la enzima va acornpaflado de un aumento o disminucidn en la velocidad de reacción. Sin embargo, los cambios en la concentraci6n del sustrato [S] afectan la velocidad de reacción sbIo cuando alrededor hay suficiente enzima libre para reaccionar. Cuando toda la enzima está unida como complejo EnzS (condiciones de V,,,), incrementos mayores de [S] ya no aumentan la velocidad de la reaccihn. Ida ecuacidn de MichaelisMenten describe los efectos de la concentracihn del sustrato sobre la actividad de numerosas enzimas. La constante de Michaelis (Km) la concentracihn de es sustrato que produce la mitad de lavelocidad de reaccibn mhxima (V,,,/2; la mitad de la enzima se encuentra como EnzS). Los valores de Km tienen dimensiones de molaridad y se determinan mediante grhficas. Para una gráfica de doble recipraco de 1 /v, contra I/[S], la intercepcidn en el eje horizontal es - 1 K y en el eje de Ins y es lIV,,,. El efecto de [S] sobre las velocidades de reacciones catalizadas por enzimas alostkricas es descritopor laecuacibn de Hill. Lamayoriade las reacciones c a t a l i d a s por enzimas implican dos o más sustratos o productos. Los criterios para establecer las diferentes clases de reacciones Bi Bi (reacciones que involucran dos sustratos y dos productos) son si el sustrato se enlaza en secuencia o al azar y si el producto se libera antes de que se una la totalidad del sustrato (reacciones ping p o n d . Los anhlogos de sustrato que se unen de manera reversible al sitio catalitico y actúan como inhibfdores competitivos de las enzima, incluyen muchos f h a cos de valor en medicina. La mayoria de los compuestos quimicos con poca o nula semejanza estructural con sustratos y que se unen al sitio catalitico o a algún otro, actúan como inhibidores no competitivos de la actividad enzimhtica. De manera breve, los inhibidores competitivos decrecen la Km,pero no tienen efecto sobre

Vmb, tanto que los inhibidores no competitivos en decrecen V sin afectar a Km. , Estos inhibidores pueden distinguirse por la medicion de la actividad enzimática a varias concentraciones de sustrato en presencia o ausencia del inhibidor. Luego, los dos conjuntos de datos se grafican como l/v,, contra lI[S]. En la inhibicibn competitiva clfisica, las dos líneas se intersec-

tan en el eje y (es decir, V,,, no cambia), pero la intercepcibn (-IJK,) disminuye por la presencia de inhibidor (es decir, en apariencia Kmha disminuido). En la inhibicidn no competitiva, la intercepción en y (l/V,,) aumenta en presencia del inhibidor (es decir, V,b disminuye), pero la intercepcibn en x no se modifica. I

-

-

REFERENCIAS
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Suckling CJ: Eníyme Chemzstv Chapman & Hall, 1990. Syrnons RH: Small catalytic RNAs. Annu Rcv Biochem 1992,61:641. Walsh CT: Suicide substrates, rnechanism4ased enzyme inactivators: Recent developments. Annu Rev Biochem 1984;53:493. Vtase tambikn las referencias del capitula T.

Enzimas: mecanismos de acción
Victor W. Rodwell, PhD

INTRODUCCION
Los mecanismos de la catAlisis enzimática reflejan muy de cerca 10s mecanismos de las reacciones químicas. Sin embargo, en contraste con la catálisis inorgánica o la orgánica más sencilla, las enzimas muestran un orden en extremo alto de especificidad al sustrato y una enorme eficiencia catalítica; esto es consecuencia del prolongado desarrollo evolutivo de sitios adaptados a la perfección pasa la cathlisis rripida y selectiva de reacciones individuales. Los caminos o vías por los cuales las enzimas convierten los sustratos en productos involucran una sucesión de intermediarios, mas que uno solo entre la enzima y el sustrato. El propósito final de los estudios de estos mecanismos es entender, a nivel molecular. por qud las cnzimas son catalizadores eficientes y específicos. Este objetivo todavía lejos de alcanzarse, requiere de: la identificacion de la etapa o fase limitante de la velocidad en la reaccibn global; la caracterización de todos Tos intermediarias enlamdos en la enzima; la identificación de los iones metálicos o grupos funcionales en los residuos de aminohcidos, coenzimas o grupos prosteticos que participan en el enlace de sustratos, productos e intermediarios en el sitio activo; y, de ellos, identificación del participante directo en la cathlisis. Por anaIogia con el estudio de los intcrmediarios en las vías del metabolismo intermedio, el de los intermediarios enlazados a las enzimas que se forman durante la cathlisis, se denomina con toda propiedad "enzimología intermediaria". En este capitulo los principales comportamientos de la catálisis enzimática se ejemplifican Gon la enzima quimotripsina, una proteína comparativamente sencilla que no contiene coenzimas, grupos prostéticos ni iones metAl3cos.

IMPORTANCIA BIOMÉDICA
Los fenbmenos moleculares que acompafian la conversibn de sustratos a productos constituyen el tema del mecanismo de acción enzimática. Estos estudios conducen a un enfoque racional para la terapéutica y la preparaciiin de medicamentos - á r e a s dc gran potencial de desarrollo en un futuro inmediato. La informacihn estructural de alta resolucion obtenida por cristalografía con rayos X, combinada con la información mecanicista, facilita ahora la preparación de farmacos que inhiben enzimas especlf'ícas como H M G X o A reductasa, la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis del ~olesterol. Asimismo, los estudios de los mecanismos sugieren ciimo puede usarsc la tecnologia del DNA recombinante y la mutagenesis dirigida a un sitio, con el fin de modificar la especificidad enzimática o la eficiencia catalítica. En ultimo caso, estas técnicas facilitarán el diseflo y la introducción en seres humanos de enzimas con las propiedades especificas deseadas.

LA "ENZIMOLOG~A INTERMEDIARIA" DE LA QUHMOTRIPSINA MUESTRA LAS C A R A C T E R ~ T I C A S GENERALES DE LA CATÁLISIS ENZIMATICA
La quimotripsina cataliza la hidrolisis de los enlaces peptidices en los que el grupo carboxilo es cedido por un aminohcido aromático (Fen, Tir, o Tri) o por uno con un grupo R voluminoso no polar (Met). Igual que muchas otras proteasas, la quimotripsina cataliza también la hidrólisis de ciertos ésteres. Aunque la propiedad de la quirnotipsinapara catalizar la hidriilisis de ésteres no tiene importancia fisiolbgica, si facilita el estudio del mecanismo catalitico.

D

O

5 e Z
Flgura 10-1. pNttrofenilacetato (PNPA)
Tiempo (mseg)

1
, Fase de "estallido'

Fase de equilibrio

El sustrato sintttico p-nitrofenilacetato (figura 10-1) facilita el análisis colorimétrico de la actividad de la quimotripsina, debido a que su hidrólisis libera p-nitrofenol. En un medio alcalino, Cste se convierte en el anión amarillo p-nitrofenilato.

Figura 10-2. CinBtica de liberación del anión p-nrtrofenilato cuando la quimotripsina hidroliza al p-nitrofenrlacetato en un aparato de flujo interrumpido. En esta grfifica, el "fenol liberado" se calwfb a partir de la densidad bptica del anión p-nitrofenilato.

LA CINÉTICA DE FLUJO INTERRUMPIDO REVELA LA "ENZIMOLOG~A INTERMEDIARIA" DE LA QUlMOTRlPSlNA
La cinética de la hidrólisis del p-nitrofenilacetato por la quimotripsina puede estudiarse en un aparato de "flujo interrumpido". Estos experimentos utilizan cantidades equivalentes de sustrato (mas o menos cantidades equimolares de enzima y sustrato) y ponderan los fenómenos que tienen lugar en los primeros milisegundos desputs de hacer la mezcla. EI aparato tiene dos jeringas: una para la quimotripsina y la otra para el p-nitrofenilacetato. La mezcla instantanea de la enzima y el sustrato se logra con un dispositivo mecanice que expele con rapidez y de manera simulthnea, el contenido de ambas jeringas en un tubo angosto que pasa a cravts de un espectrofot6metro. La densidad 6ptica como función del tiempo despuds de la mezcla, se registra en un tubo de rayos catbdicos.

Ilido", caracterizada por el desprendimiento mhs rApido del anión p-nitrofenilato y 2) una liberaci6n mhs lenta, subsiguiente, del mismo. El carhcter bifhico de la liberacibn del anión p-nitrofeniEato se comprende en tkrminos de los pasos sucesivos de la catdlisis mostrados en la figura 10-3.

La etapa lenta es la hidrólisis del complejo quimotripsina-acetato (CF-Ac)
Una vez que toda la quimocsipsina disponible forma
parte del complejo CT-Ac, ya no puede haber más desprendimiento dep-nitrofenilato hasta que se libera quirnotripsina mediante la remocibn hidrolitica lenta del ani6n acetato procedente del complejo CT-AC (figura 10-3). La fase de "estallido" (figura 10-2) corresponde a la conversion de toda la quimotripsina libre disponible en el complejo CT-Ac, con liberaci6n simultánea del ani6n p-nitrofenilato. El p-nitrofenilato (feno[PNPA del ingl~s~p-nifropknylafe) ~ + despds ~ de la fase de "estallido" es consecuencia de la formación lenta de quimotripsina libre por hidrbtisis del cornplejo CT-Ac. Esta quimotripsina libre queda entonces disponible para la formación posterior de complejos

La liberación del anión p-nitrofenilato es bifasica
La liberacihn del anión p-nitrofenilato tiene lugar en dos fases distintas (figura 10-2): 1) una fase de "esta-

~

CT + PNPA

- tCT-& ucT
CT-PNPA

Rapida

RBpida

Lenta

Flgura 1 0 3 . Pasos intermedios en la cathlicis de la hidrblisis del p-nitrofenifacetato por la quimotripsina (CT, quirnotripsina, PNPA,p-nitrofenilacetato; CT-PNPA,complejo quimotripcina-pnitrofenilacetata;CT-Ac, complejo quimotripsina-acetato;fenol, anrbn pnitrofenilato, A F , anibn acetato.) La formación de los complejos CT-PNPA y CT-Ac es rápida en relacibn a la hidrblisis del complejo CT-Ac.

Enzirnas: mecanismos de acci&

1 13

CT-PNPA y CT-Ac con iiberacibn concurrente del PNPA. En realidad, la magnitud de la fase de "estallido'' (es decir, los moles dep-nitrofenilato liberados) es directamente proporcional al número de moles de quimotripsina presentes inicialmente.

His

' Sus- (es decir. Ac-)

La señina 195 tiene una funcibn clave en la catálisis
El grupo acil del intermediario acil-CT está enlaza'do a un residuo seril altamente reactivo -serina 195de la quimotripsina. La elevada reactividad de la Ser 195 se demuestran por su capacidad (aunque no por la de los 27 residuos seril restantes de la quimotripsina) para reaccionar con el diisopropilfosfofluorjdato ( D 1 P F , d e 1 in g Id S, diisopropylphosphoJuuridate) (figura 10-4). Reacciones análogas tienen lugar con otras proteasas de serina. La fomacihn de derivados de la Ser 195 inactiva a la quimotripsina. Muchas otras proteasas son inactivadas por el DiPF mediante un mecanismo analogo. Estas se conocen como "serina proteasas".

-C-O-H-

- .N

N-H

A

O-

Ser

Figura 10-5. Operacibn de la lanzadera de protones de la quimotripsina durante la acilacibn de Ser 195 por e sustrate l (Sus3

Durante la desacilacion del intermediario acil-Ser

195, los protones se mueveii en direccidn contraria. Se cree que una serie análoga de desplazamiento de
protones acompaña la hidrblisis de un sustrato fisio16gico de la quimotripsina, como la es un pCptido. Al igual que muchas proteasas, la quimotripsina se libera desde los ribosomas como precursor de la enzima sin actividad catalitica denominado preenzima o cirnógeno. Tal como se explicara en el capitulo 1 1, la conversibn de la preenzima quimotripsinbgeno en la enzima activa quimotripsina implica una serie de fenomenos proteoliticos selectivos cuyo resultado final es la formación del sitio activo y el alineamiento del sistema relevador de carga responsable de la catálisis.

Un sistema relevador de carga funciona como una lanzadera de protones durante la catá!isis
Este proceso utiliza tres residuos aminoacil que están bastante separados respecto a su estructura primaria, aunque a distancia suficiente para formar enlaces entre si, en el sentido de la estructura terciaria. Estos residuos son Asp 102, His 57 y Ser 195. Aunque la mayoría de los residuos cargados de la quimotripsina estan en la superficie de la molkcula, los que pertenecen n la "lanzadera" estan "enterrados" en el interior no polar de la mol~cula. tres residuos se encuentm Los alineados en e! orden Asp 102-His 57-Ser 195. Recuérdese que Ser 195 es el residuo acilado durante la catalisis por quirnotripsina. La aproximacibn del ani6n acetato (derivado del pnitrofenilacetato) al Btomo de oxígeno del grupo R de la Ser 195 desencadena el desplazamiento secuencia! de protones que se mueven como "lanzadera" de Ser 195 a travhs de His 57 a Asp 102 (figura 10-5).

Catálisis mediante fructssa-2,6-bifosfatasa
La fructosa-2,6-bifosfatasa es una fosfohidrolasa (capitulo 21) que cataliza la remocibn mediante hidrdlisis del fosfato del carbono 2 de la fructosa2,6-bifosfato. La figura 10-6 muestra la funcibn de siete residuos de sitios activos en la catilisis efectuada por esta fosfohidrolasa. Igual que en la catálisis que producen las proteasas de serina, ésta implica una "triada catalitica", aunque una parte de ella consta de dos His y un residuo Glu. También se muestra la estabilizacibn por residuos de Arg y Lis con carga positiva, de la fuerte carga negativa del sustrato.

.O l
Enz-CH,OH+

' f

F-P=O 4

S"'

Y
o
I I

Enz-CH,-O-P=O

A

DIPF

A

LAS COENZIMAS PARTICIPAN DIRECTAMENTE EN LA CATALISIS ENZIMÁTICA
La participación directa de las coenzimas para las enzimas conocidas como arninotransferasas, o, con mayor frecuencia, como transaminasas se explican en

Figura 1 0 4 . Reaccibn del hidroxilo primario de la Ser 195 de quimotripsina con el diisopropilfosfofluoridato (DIPF).

transaminacas implica los mecanismos de ping pong que se expusieron en el capitulo 9, con liberacion de un producto antes de agregar el segundo sustrato (figura 10-7).

E Fru-2,6-P,

E-P Fru-6-P

LOS RESIDUOS EN EL SITIO CATAL~TICO PUEDEN ACTUAR COMO CATALIZADORES ~ci~oaÁsicos
Una vez que el sustrato se ha unido al sitio catalítice, los grupos funcionales cargados {o con posibilidad de tener carga) de las cadenas laterales de residuos aminoacil cercanos, pueden participar en la catálisis al funcionar como catalizadores Acidos o bhsicos, Existen dos amplias categorías de catllisis acidobásica efectuada por enzimas: la catálisis Acida (o blsica) general y especifica. Por otro lado, aunque las reacciones cuyas velocidades varían en respuesta a los cambios en la concentraci6n de M' o II3O1son independientes de las concentraciones de otros hcidos o bases presentes en la soluci6n, se dice que están Sujetas a catálisis ácida específica o bhsica especifica. Por su parte, se dice que las reacciones con velocidades sensibles a todos los ácidos (donadores de protones) o a todas las bases (aceptores de protones}en Ia solucibn,astán sujetas a catálisis hcida general o básica general.

Arg

307

His

392
*rg 257
HIS asa

E-P H,O

EmP,

Catálisis por fructosa-2,6-bifosfatasa. (1) La mrga negativa cuádruple del sustrato unido se estabiltza por las interacciones d e carga a carga con brg 257. Arg 307, Arg 352 y LIS 356. Uno d e los integrantes de la trfada catalitica, Glu 327, estabiliza la carga positiva d e His 392 (2) L a nucleofilica His 392 ataca al carbono 2 del grupo fosforilo, y transfiere el fosfato a His 258 con formación d e un fosfate intermedio Se desprende fructosa 6-fosfato d e la enzima (3) Un segundo ataque nucleofilico por una rnol&culade agua. posiblemente asistida por Glu 327 que actua como base, forma fosfato inorgánico. (4) Se desprende ortofosfato inorg8nim desde Arg 257 y Arg 307 (Reproducida con autorizaci6n de Pilkic SJ et al ,6-Phosphofructo-2-kinaselfrucose-2,6-bisphosphatase. A rnetabotic signaling enzyrne Annu Rev Biochem 1995,64:799 )
Figura 1 0 4 .

Las variaciones del pH y de las concentraciones de amortiguador establece la diferencia entre catálisis acidobásica general y la especifica
Si la velocidad de la reacci6n cambia como una función del pH a concentracion constante de amortiguador, se dice que es catálisis básica específica (cuando el pH es superior a 7) o catalisisiicida específica (con pH menor a7). Si seeleva lavelocidad de lareacci6n apH constante con los incrementos en la concentración del amortiguador, sediceque esthsujetaa catálisis bhsica general (cuando el pH es mayor de 7) o cathIisis hcida general (con pH inferior a 7).

seguida. Las transaminasas catalizan el intercambio de grupos alfa amino de los aminoacidos por grupos alfa 0x0 de los alfa oxoacidos del piruvato, oxnlacetato o aIh cetoglutarata; estas reacciones son fundamentales para la biosintesis y el catabolismo de los aminoácidos (capitulas 30 y 3 1). Lo mismo que muchas reacciones que requieren coenzimas, la catálisis por medio de las

E-cHo

dHc 0E

N ,

'

\ /CHzNHaLE-CH2~H2

\

-E

\

E-cHo
Giu

A I ~

Pir

KG

Figura 10-7. Mecanismode ping pong de la transaminacibn. E-CHO y E-CH2NH2 representan los complejosenzima-fosfato de piridoxal y enzima-focfato de piridoxamina. respectwamente. (Ala, alanina; Pir. piruvato; KG, alfa-cetoglutarato, Glu,

glutamato.)

Como ejemplo de catálisis ácida especifica, considérese la conversihn de un sustrato (S) a un producto (P). El proceso tiene dos pasos, una transferencia de protones rápida y reversible,

seguida por un pasa más lento y, por tanto, determinante de la velocidad, de reordenamiento del sustrato protonado a producto:

El aumento de la concentracibn del ion hidronio [ H d 3 + jincrementa la velocidad de la reacción aI elevar la concentraci6n de SH', el acido conjugado del sustrato. que es a su vez el sustrato para el paso determinante de la velocidad en la reacción global. Expresado de manera matemhtica,
Velocidad
=

dlpl
dt

=

WH 7

donde P = producto, t = tiempo, k = constante especifica de la velocidad y [SH '1 = concentracion del acido conjugado del sustrato. Dado que la concentraci~n SH' depende de las de concentraciones de S y de &O', la expresibn general de la velocidad para las reacciones catalizadas ácido especificas es:

Nótese que un requisito de la catálisis hcida especifica es que la expresión de la velocidad contenga $610 términos para S y para h O + . Ademas, considbese que, en adicibn a la catlilisis ácida especifica descrita antes, hay también catalisis por el ian irnidazolio de un amortiguador imidazblico. Puesto que el imidazol es un ácido débil (pK, aproximadamente 7), es un donador de protones malo; por eso la reacción

canismo de accibn de las enzimas. Destaca entre ellas la posibilidad de alterar a voluntad Ia secuencia de bases de nucleótidos de los genes y expresar las proteínas en huespedes unicelulases como células de mamíferos cultivadas o la bacteria EScherichia col[ En combinaci6n con estudios de la estmctura tridirnensional en solución por cristalografía con rayos X 'y con investigaciones cinkticas clasicas, estas tdcnicas moleculares proporcionan nuevas perspectivas sobre los mecanismos de accibn de las enzirnas. Cuando los datos físicos y cinhticos indican que un residuo aminoacídico dado desempefia una funcibn especifica en la catiilisis (es decir, que sirve como una base general o como un reactivo de transferencia de grupo), la posibilidad puede ser respaldada mediante el cambio del aminoacido por otro incapaz de ejecutar Ia funcián postulada. En algunos casos, esto puede lograrse con la modificaci6n química de la enzima. Sin embargo, un enfoque mhs general consiste en emplear la mutagenesis dirigida a un sitio para modificar el gen que codifica la enzima, luego expresarlo y caracterizar la enzima mutante. Por la alteración de la secuencia de bases de un codón especifico, la mutagknesic dirigida a un sitio, puede reemplazar un aminoácido dado por cualquier aminohcido proteínico deseado. Asimismo, la mutagénesis dirigida a un sitio puede producir numerosas mutantes en un punto. Un oligonuclebtido corto (es decir, un mer-F 9) que codifica un aminohcido mutante, generado por síntesis automatizada, es templado in vjtro al gen original aislado. Luego se produce un gen mutante por adición de DNA polisomerasa, DNA ligasa y trifosfatos de ribonucle6tidos. A continuación, ese gen se traslada a un vector para expresion detrfis de un promotor potente, se expresa y la enzima mutante que se obtiene es purificada para examinar SLIS propiedades.

LOS IONES METALICOS PUEDEN
FACILITAR LA FIJACIÓN Y LA CATÁLISIS DEL SUSTRATO
Mfis de 25% de las e n z i m a contienen iones metálicos firmemente unidos o los necesitan para su actividad. Las funciones de éstos se estudia por medio de la cristalografía con rayos X, e imágenes de resonancia rnagnktica (IRM), y resonancia del spin del electrón (RSE). Junto con el conocimiento de la formación y [a degradaci~nde los complejos metAlicos y de las reacciones dentro de las esferas de coerdinacion de los iones methlicos, proporcionan una perspectiva de sus funciones en la cathlisis enzimática, las cuales se considerarAn más tarde. Las rnetaloenzimas contienen una cantidad definida de un ion methlico funcional que es retenido

es lenta y determina la velocidad para la reacción global. Nótese que el paso rhpido y el lento estan invertidos cuando el mecanismo cambia de catfilisis Bcida especifica a general. Las expresiones de velocidad para la cathlisis hcida general con frecuencia son complejas por lo cual no se describen aquí.

LA MUTAGENESIS DlRlGlDA A UN SITIO PROPORClONA NUEVAS PERSPECTIVAS
Las técnicas de la biologia molecular proporcionan herramientas poderosas para la investigacion del me-

116

e

Binguímicade Harper

(Capíf u10 J O )

durante !a purificación. Las enzimas activadas por metales se unen con &.tos de manera menos firme, pero los necesitan para ser activas. Por tanto, la distinci6n entre rnetaloenzimas y enzimas activadas por metal radica en la afinidad de una enzima particular por su ion metálico. Los mecanismos que emplean los iones metAlicos para desempefiar sus funciones parecen ser semejantes en las metaloenzimas y en las enzirnas activadas por metal.

methtico en la piruvatocinasa mantiene un sustrato (ATP) en su lugar y lo activa.

Piruvatocinasa-

ATP
Creatlna

\

En la catálisis funcionan complejos ternarios con metales
Para los complejos temario5 (de tres componentes) del sitio catalítico (Enz), un ion metálico (M) y el sustrato (S) que presentan estequiometría 1 : 1 : 1, son posibles cuatro disposiciones:

B. Complejos cuyo puente es el sustrato (EnaSAfJ
Al parecer, la fomaci6n de complejos ternarios de trifosfatos de nucleósido y enzima, metal y sustrato con puentes de sustrato, se atribuye al desplazamiento del HzO desde la esfera de coordinacibn del metal por el ATP:
A T P ~+ M ( H ~ o ) ~ ~ATP' '
M ( H ~ O )+ 3H20 ~~'

Complejo con puente de sustrato

Complejo con puente

enzimatico Las enzimas entonces se enlazan, formando el complejo ternario:

Complejo can puente metálico cíclico

Complejo con puente metálico simple

Para las enzimas activadas por metal, las cuatro disposiciones son posibles, mientras que las rnetaloenzimas no pueden formar el complejo EnzSM, debido a que retienen al metal a travds de la purificacidn (es decir, ya son un complejo BnzM). Pueden enunciarse tres generalizaciones: 1) la mayoria, pero no todas las cinasas (ATP:fosfotransferasas) forman complejos con puente de sustrato del tip Enz-nuclebtido-M. 2) Las fosfotransferasas, que utilimn pinivato o fosfoenolpiruvato como sustrato, las enzimas que catalimn otras reacciones del fosfoenolpiruvato y las carboxilasas, forman complejos con puente rnethlico. 3) Una enzima dada puede formar un tipo de puente en el complejo con un sustrato y uno de tipo diferente con otro.

En las reacciones de las fosfotransferasas, los iones met8licos se consideran como activadores de los átomos de fbsforo que ast forman un complejo rigido pol ifosfato-aden ina, de conformación apropiada en el complejo cuaternario activo. C. Complejos con puente metálico

A. Complejos con puente enzimáfico
(MEnzS) Se presume que los metales en los complejos con
puente enzimático tienen funciones estructurales en el mantenimiento de la conformacibn activa (por ejemplo, la glutamina sintetasa) o forman un puente metiilico hacia el sustrato (por ejemplo, la piruvatocinasa). Ademhs de su función estructural, se cree que el ion

Los datos cristalogrhficos y de secuenciación han establecido que un residuo His interviene en la fijación del metal al sitio activo de muchas proteinas (por ejemplo, carboxipeptidasa A, citocromo c, mbredoxina, rnetamioglobina y metahemogfobina; capitulo 7). Para los complejos binarioc (dos componentes) E n N , el paso limitante de la velocidad es en muchos casos la separación del agua de la esfera de coordinación del ion methlico. En muchas peptidasas, la activación por los iones metklicos es un proceso lento que requiere muchas horas. Es probable que la reacciOn lenta sea et reordenamiento confomacional del compIejo binario EnzM para llegar a la forma activa, por ejemplo:

Enzimas - mecanismos de acciún

117

Unibn del metal:
Rhplda

Enz + M(Hfl)s -+ Enz-M{H20)6.,

+

nH20

Reordenamiento a una conformacibn activa (Enz'):
Lenta

un ion metklico puede "enmascarar" a un nuclebfilo y así prevenir una probable reaccibn secundaria. Finalmente, el control estereoquimico del curso de una reacción catalizada por enzimas, puede lograrse con la propiedad de la esfera de coordinacibn del metal para actuar como un molde tridimensiona! para mantener los grupos reactivos en una orientación espacial especifica (cuadro 10-1).

En~-M(Hz0)6.~ +

E l i f4 ! A ( H 2 0 ) ~ . ~

Sin embargo, en las metaloenzimas el compleio ternario con puente metfilico debe formarse mediante Ia combinación del sustrato (S) con el complejo binario EnzM :

RESUMEN
La quimotripsina proteasa (CT) ejempIifica numerosas características generales de la catalisis enzimática, las cuales incluyen la formación de intermediarios unidos a enzima (CT-PNPA y CT-Ac), la naturaleza escalonada del proceso (tres reacciones parciales}, el carácter limitante de la velocidad de una reaccibn parcial sencilla (hidrdlisis de CT-Ac) y Ia liberacihn en secuencia de productos (fenol seguida por acetato). Idas funciones.de aminohcidos p&iculares en el sitio catalitico se mostraron por la función de un residuo Ser (SeriYs)como aceptor de un grupo (Ac-) que es transferido a agua y por las funciones de los residuos Ser, 1-Iis y Asp específicos en la formación d e un sistema relevados de carga. Además, este sistema relevador de carga ejemplifica quc los residuos adicionales bastante separados en el sentido de una estructura primaria (Ser 195, His 57 y Asp 102)

Enz-iUi

+ S k Enz-M4

o Enz

/

'I .
S

'

Los iones metálicos desempeñan múltiples funciones en la catálisis

1-0siones methlicos pueden participar en cada 1 de los 4 mecanismos con los que se sabe las enzimas aceleran la velocidad de las reacciones qufmicas: 1) catálisis acidobásica general, 2) catáIisis covalente, 3) aproximación de los reactantes y 4) induccion de rigidez o tension en la enzima o el sustrato. Además del hierro Cuadro 10-1. Ejemplos escogidos de funciones dc? y el manganeso que funcionan en las proteínas hémilos iones me. el mecani IS cas, los iones metálicos que intervienen más común:nzimas* mente en la catálisis enzimática son ~ g ~~ ' ,n " y ~ a ? 'aunque otros iones metálicos (por ejemplo, K') , Funcion uei iuii irieiaiicu son importantes para la actividad de ciertas enzirnas. IIisnaina riesarninasa Los iones metblicos, al igual que los protones, son Cinasas, liasas, pirii- descarboxilasa I valo ácidos de Lewis (etectr6filos) y pueden compartir un par de electrones para formar un enlace sigma. Ar rbbnica i Activaciiin de un nuclebfilo Ademhs, pueden ser considerados "superácidos", dado En ~rnldicas El meta! actiia como un nucieóque existen en soluci6n neutra, frecuentemente tienen una carga positiva > 1 y pueden formar enlaces pi. Pi ruvato cal-boxilasa, Asimismo (a diferencia de los protones), los metales carboxiplcptidasa, pueden servir como plantillas tridirnensionaies para la alcohol dr:shidrogeorientación de los grupos bhsicos en la enzima o el nasa sustrato. IWeinas ftmtm sin,,,,, . Donación nes pi (n) -- ,,,,,,,,,,,, ,, k m Por otro lado, los iones metálicos pueden aceptar Piruvato cinasa, pirue y orienia electrones a travhs de los enlaces sigma o pi para vato carlioxilasa, activar electrófilos o nucleófilos (catálisis acidobksica adeni latoci -- . general). Mediante la donaci6n de electrones, los Fosfotrancf crasa, Dnsionales metales pueden activar a los nuclebfilos o actuar como xilosa isi3rnerasa, nucleófi~osellos mismos. La esfera de coordinación . . i1 hemoproteirids -de un metal puede atraer a la enzima y al sustrato * Adaptado de Mildvan AS Meials in enzyme cat;alysis Vol 2. (aproximación) o crear una distorsión que produce Pagc 456 in The Enzymes Boyer P U, Lardy H , Myrhack K quelatos en una o en otro (rigidez o tensión). Ademas, (editors) Academrc Press 1970

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118 * Rioquimica de Hurper

{Capitulo 10)

pueden formar porciones contiguas del sitio catalítico de una enzima. La proteblisis selectiva de la preprotefna quimotripsinbgeno inactiva crea el sitio activo de la quimotripsina y lleva los tres residuos que conforman el sistema relevador de carga a una distancia, uno de otro, que permita formar enlaces. Durante la catllisis, los residuos del sitio catalitico pueden actuar como ácidos (Glu, Asp) o bases (His. Arp, Lis) generales. La adicion de sustratos y la liberación de productos pueden proceder en

forma ordenada o de una manera aleatoria. Bajo un mecanismo de ping pong (por ejemplo, transaminación), la reaccibn avanza a travks de los fenómenos alternos de adicibn de sustrato y liberacibn de producto. Los iones methlicos facilitan la fijación del sustrato y la catálisis mediante la creacibn de varias clases de complejos puente, constítuidoc por enzima, metal y sustrato. Los iones met8licos pueden actuar como catalizadores acidos generales o facilitar la aproximaci6n de los reactantes.

REFERENCIAS
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Enzirnas: regulación de actividades Victor W. Rodwell, PhD

de un medicamento provoca cambios significativos en el metabolismo de otro (capitulo 61). En este capitulo, algunos ejempIos escogidos muestran los mecanismo^ que regulan los procesos metabólicos mediante la cantidad o eficiencia catalítica de las cnzimas. La intención es establecer las características de los patrones globales de regulación. En todo el libro se hace referencia a otros muchos ejemplos espectficos para mostrar las diversas caracterís-ticas de la regulación metabólica.

LA R E G U L A C I ~ W DEL METABOLISMO LOGRA LA HOMEOSTASIA
El concepto de regulación homeostática del medio interno emitido por Claude Bernard a finales del siglo XIX hizo hincapie en la facultad de los animales para mantener constante su medio intracelular a pesar dc los cambios en el exterior. Este concepto impIica que todas las reacciones necesarias catalizadas por enzimas se efectúan a velocidades que responden a cambios tanto en el medio interno como en el externo. Una cCIula u organismo pueden considerarse enfermos cuando no responden o lo hacen inadecuada o incorrectamente a una seiial interna o a un esmés externo. El conocimiento de los factores que afectan las velocidades de las reacciones catalizadas por enzirnas, es esencial para entender el mecanismo de la homeostasia en las células normales y para comprender la base molecular de la enfermedad.

IMPORTANCIA BIOMEDICA
¿De qué manera Ias células y ios organismos íntegros regulan y coordinan el metabolismo global? Esta pregunta interesa a los trahaiadores en áreas de las ciencias biornkdicas tan diversas como chncer, cardiopatias, envejecimiento, fisiologia microbiana, diferenciación, rnetakorfosis, accihn h-onal y de Fármacos. En todas estas áreas, se han encontrado ejemplos importantes de regulaciiin n o m a l o anormal. Por ejemplo, muchas celulas canmrosas exhikn anormalidadesen Ia regulación de su complemento enzimático (carecen de induccion o de represiOn); caso que ejemplifica la conclusi6n ya establecida, de qtic las alteraciones del control qenktico son fen6menoS fundamentales en las c&lulascañcerosas. De nuevo, ciertos virus onctjgenos contienen un gen que codifica para una tirosina proteincinma. Cuando esta cinasa actúa en las células del hugsped, puede fosforilarmuchas proteínas y enzirnas que normalmente no lo estAn y, por tanto, conducir a cambios importantes en el fenotipo celular. Al parecer, un cambio de esta naturaleza es la base de ciertos tipos de transformacibn oncogenica vira!. La accibn de los famiacos proporciona otro ejemplo importante que comprende la regulación enzimática, pues la induccidn enzimática es una causa bioquimica importante en las interacciones medícamentosas, situaciones en las que la administracibn

El flujo de metabolitos tiende a ser unidireccional
Todas las reacciones quirnicas, incluyendo las catalizadas pos enzimas, son en cierto grado reversibles*. Dentro de la celula viva, sin embargo, es posible que no se produzca la reversibilidad porque los productos

* Una reacciiin fácilmente reversible tiene un pequeao valor
numérico de AG, micntras que una con un valor negativo grande para AG podría llamarse "realmentc irreveriihle" cn casi todas las siiuacioncs bioquimicas.

120

Bioquimica de Harper

(Capibulo I 1)

de reacciiin son removidos con rapidez mediante reacciones adicionales catalizadas por enzimas. El flujo de metabolitos en una celulavivaes análogo al flujo de agua en un acueducto el cual aunque es capaz de transportar agua en ambas direcciones, en la prhctica el fiujo es unidireccional. El flujo de metabotitos en la d l u l a también lo es en gran parte. El equilibrio verdadero, lejos de ser característico de la vida, se alcanza s61o a la muerte de la célula. La célula viva es un sistema dinámico estacionario conservado por un flujo unidiseccional de metabolitos (figura 1 1-1). En las cklulas maduras, las concentraciones medias de los metabolitos permanecen relativamente constantes durante periodos considerables*. La flexibilidad del sistema estacionario s e manifiesta en los delicados desplazamientos y equilibrios mediante los cuales los microorganismos conservan constante el medio intemo, a pesar de Ias amplias variaciones en alimentaciiin, ingestibn de minerales y agua, rendimiento de trabajo o temperatura externa.

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grandes

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Figura 11-1. Una oélula ideal en estado de estabilidad. Obsérvese que el flujo de rnetabolitos es unidireccional.

Las velocidades de reacción
responden a las necesidades fisio~ogicas cambiantes
Para que la vida proceda de una manera ordenada, debe regularse el flujo de metabolitos a travks de las vías anabólica y catabólica. Es preciso que todos los fenómenos quimicos necesarios tengan lugar a velocidades congruentes con los requerimientos del organismo en relacidn con su medio. La produccidn de ATP, la sintesis de precursores macromoleculares, el transporte, la secreción y la resorción tubular, deben responder todos a cambios suti les del medio celular, del brgano y del animal integro. Se necesita que estos procesos sean coordinados y, además, respondan a cambios a corto plazo del medio externo (por ejemplo, la adicibn o la eliminaci6n de un nutriente), ncl como a sucesos intracelularcs periddicos (por ejemplo, la replicación del DNA). I-lasta ahora, los detalles moleculares de la regulacibn son mejor comprendidos en las bacterias, las cuales carecen de las complejidades del control hormonal o neurológico y en las cuales los estudios genéticos pueden llevarse a cabo con facilidad para analizar los acontecimientos moleculares. Sin embargo, nuestra comprensihn de la regulacibn rnolecular en la célula animal está en un estado de rhpida expansibn. En tanto que la regulacion metab6lica en los mamíferos difiere de modo signifi-

cativo, de los fenómenos superficialmente semejantes de las bacterias, la regulacibn de los procesos metab6licos en &as ser6 el ejemplo a discutir debido a que proporciona un marco conceptual de referencia para considerar la regulación en el ser humano

TRES MECANISMOS GENERALES REGULAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTI~A
El flujo neto de carbono de una reacción catalizada enzirnAticamente podria ser influido: 3 ) cambiando la cantidad absoluta de enzima presente, 2) alterando el tamaiio del conjunto de reactantes distintos de la enzima y 3 ) alterando la eficacia catslitica de la enzima. Las tres opciones son utili~adasen casi todas las formas de vida.

Las velocidades de síntesis y degradación determinan la cantidad de enzima
La cantidad absoluta de una enzima presente esta determinada por su velocidad de sintesis (k,) y por Ia velocidad de su degradación (, (figura 1 1-2). La b} cantidad de una enzima dentro de una celula puede

Enzima

Aminoácidos

* Sin emhargo, si ocurren osciiaciones de corta duración en
las concentraciones del meiaholito y de la enzima y tienen gran importancia fisiológica.

Figura 11-2. La cantidad de enzima se determina por el balance neto entre la sintesic de la enzima su degradación Las K, y Kdegson las mnstantes de velocidad para el proceso completo de sintesis y degradacibn, respectivamente

Enztmar: regulación de uctividudes

121

elevarse ya sea por un incremento en su velocidad de síntesis (incremento de k,), por una disminución en su ,, velocidad de degradacibn (disminucion de h) o por ambos. De manera semejante, una cantidad menor de enzima puede resultar de una disminucihn de k,, de un incremento en kdq, O deambos procesos. En el ser humano se encuentran ejemplos de cambios tanto en k, como + en k . En todas las formas de vida, la síntesis de enzimas a partir de los aminoAcidos y su degradacibn hasta aminohcidos son procesos distintos catalimdos por conjuntos de enzimas por completo diferentes. La regulación independiente de la sintesis y de la degradacihn de las enzimas se logra asl, fhcilmente (figura 11-2).

Los productos finales reprimen la síntesis de enzimas
La presencia de un metabolito biosintktico en el medio de crecimiento bacteriano, puede reducir la nueva síntesis del mismo por medio de la represión. Tanto en la induccion como la represión participan elementos cis, secuencias especificas de DNA ubicadas en la parte superior de la cascada de genes que codifican una enzima dada, y proteínas reguladoras trunTactuantes. Además, metabolitos especificos sirven corno correpresores o coinductores que al enlazarse a proteínas transactuantes, lo mismo fortalecen que debilitan su integracihn con un elemento cis. Por tanto, los valores intracelulares altos de un metabolito como una purina o un aminoácido pueden interrumpir la síntesis de las enzimas que participan en su propia biosíntesis. Por ejemplo, en Salrnonelh typhirnurrum, la adición de histidina reprime la síntesis de todas las enzimas que intervienen en su biosíntesis, mientras que la adicibn de leucina reprime la síntesis de las tres primeras enzimas peculiares para su biosíntesis. Despues de la eliminación o del agotamiento de un intermediario biosintético esencial del medio, de nuevo se produce la biosintesis enzirnitica. Esto constituye lo que se denomina dessepresión. Los ejemplos anteriores muestran la represibn por retroalimentación con el. producto, típica de Ias vias biosinttticas de las bacterias. Por otro lado, la represión por catabolito es un fenómeno relacionado que se refiere a la facultad de un intermediario en una sucesi6n de reacciones catabólicas catalizadas por enzimas para reprimir la sintesis de las enzimas catab0Iicas. Este efecto fue observado primero en cultivos de E. coli creciendo en una Euente de carbono (X) distinta de la glucosa. Se not6 que la adición de glucosa reprimía la síntesis de las enzimas encargadas de1 catabolismo de X y este fenómeno fue inicialmente llamado el "efecto de la glucosa*'. Puesto que otros nutrientes oxidables diferentes a este carbohidrato producen efectos semejantes, se ndopt6 el tdrrnino represidn por catabolito, la cual es mediada por el cAMP. Los mecanismos moleculares de la inducción, la represion y la desrepresidn se dcscribirhn en el capitulo 4 1.

Los inductores pueden estimular la síntesis de enzirnas
Las celulas pueden sintetizar enzimas especificas en respuesta a la presencia de inductores especificos de peso molecular bajo. Por ejemplo, Escherichia colr cultivada en glucosa no cataboli~ara lactosa debido la a la falta de la enzima beta galactosidasa, que hidroliza la lactosa a galactosa y glucosa, Si al medio de cultivo se agrega lactosa o algunos otros beta galactosidos, hay inducción de síntesis de beta gaIactosidasa y entonces el cultivo puede catabolizar la Iactosa. Aunque muchos inductores son sustratos para la enzima que inducen, ciertos compuestos estmcturalmente semejantes al sustrato pueden ser inductores, pero no sustratos; se les llama inductores gratuitos. A la inversa, un compuesto puede ser un sustrato, pero no un inductor. Frecuentemente, un inductor estimula a varias enzirnas de una ruta catabdlica(por ejemplo, tanto la beta galactosidopemeasa como la beta galactosidasa son inducidas por lactosa). Las enzimas cuya concentraci6n en una ctIula es independiente de un inductor agregado se denominan enzimas constitutivas. Una enzima particular puede ser constitutiva en una cepa, inducible en otra, y ausente en una tercera. Las células capaces de ser inducidas por una enzima particular, por lo general contienen una cantidad basa1 pequefía medible de esta enzima, aun en ausencia del inductor agregado. La herencia gendtica de la ctlula determina así, tanto la naturaleza como la magnitud de la respuesta al inductor. t o s términos "constitutiva'" e "inducible" son, por tanto, términos relativos, como "caliente" o "frio", que representan los extremos de un amplio espectro de respuestas. La induccibn enzimhtica tambitn existe en las células eucariotas. Ejemplos de enzimas inducibles en los animales son la triptbfano pirrolasa, la treonina deshidrogenasa, la tirosina alfa cetoglutaratotransaminasa, la invertasa, las enzimas del ciclo de la u la HMG-COA reductasa y el citocromo P450.

EL RECAMBIO DE PROTE~NAS TIENE LUGAR EN TODAS LAS FORMAS DE VIDA
Los procesos combinados de síntesis y degradacibn
de [as enzimas constituyen el recambio enzimático reconocido como una propiedad característica de las c&IuIasde los tiamíferos, mucho tiempo antes de que

se mostrara que también tenia lugar en las bacterias. La existencia del recambio de proteínas en el ser humano se dedujo de experimentos dietkticos hace bastante más de un siglo, aunque fue hasta el trabajo clásico de Schoenheimer, justamente antes y durante la 11 Guerra Mundial, que se estableció concluyentemente. Midiendo las velocidades de incorporación de aminoácidos rnarcados con NI5 a las proteinas y los índices de pCrdida de NI5 de las proteinas, Schoenheimer concluyó que las proteínas están en un estado de "equilibrio dinamico", un concepto extendido desde entonces a otros constituyentes del cuerpo, incluyendo los Iípidos y los ficidos nucleicos.

Las velocidades de degradación de las enz'imas específicas están sujetas a regulación
La degrada~ionde proteínas de mamfferos por vías que dependen de ATP y ubiquitina, asi como las independientes dc ATP, se describen en el capitulo 3 1. La susceptibilidad de una enzima a la degradacibn proreolitica depende de su ~onfomacibn. presencia La o la falta de sustratas, coenzirnas o iones metálicos, que pueden modificarla, alteran lasusceptibilidad proteolítica. De este modo, laconcenmci61-ide sustratos, de coenzímas y posiblemente de iones en las cklulas puede, influenciar las vclocidades a las cuales son degradadas enzimas especificas. La arginasa y la triptófano oxigenasa (tripthfano pirrolasa) e,jemplifican estos conceptos. La regulación de las cifias hephticas de arginasa puede incluir ya sea un cambio en k, o en L. Despudc de la ingestidn de una dieta abundante , en protehas, los valores hepriticos de arginasa se elevan debido a un incremento en la velocidad de su sintesis. Los mismos valores también aumentan en los animales hambrientos. Aquí, sin embargo, es la degradación de la arginasa la que está disminuida, en tanto que k, permanece inalterada. En un segundo ejemplo, tanto la inyeccidn de glucocorticoides como la ingestión de triptófano aumentan 30s valores de triptofano oxigenasa en los mamíferos. El efecto de las hormonas es la elevacibn de la velocidad de síntesis de la oxigenasa (aumento de k).El triptófano, sin embargo, no ejerce efecto sobre k, pero abate be, estabilizando la oxigenasa respecto a la digestibn proteolitica. Estos dos casos contrastan con la inducción enzimática en las bacterias. En el caso de Ia arginasa, el incremento en la ingesti6n de nitrhgeno por una dieta abundante en proteinas puede elevar las cifras hepáticas de arginasa (capitulo 3 1). El aumento en Ia velocidad de síntesis de la arginasa se parece así, superficialmente, a la induccibn por sustrato en las bacterias. En el caso de la triptdfano pirrolasa, sin embargo, aun cuando el triptbfano puede

actuar como un inductor en las bacterias (afecta k,), su efecto en los marniferos sc qjerce solamente sobre el proceso degradante (abate kd,,). Los valores enzimaticos en los tejidos de marniferos pueden ser alterados por una amplia gama de factores fisiologicos, hormonales o dietéticos. Se conocen ejemplos para una diversidad de tejidos y vias metabólicas, pero nuestro conocimiento es fragmentario acerca de los detalles molecularec que intervienen para producir estos cambios. Los glucocorticoides incrementan Ia con~entración de tirosina trancaminasa estimulando su k,. Este fue el primer caso cSaro de una hormona reguladora de la sintesis dc una enzima de mamíferos. La insulina y cl glucagbn, no obstante sus cfectos fisiológicos mutuamente antagbnicos, incrementan k,, de manera independiente, de 4 a 5 veces. El efecto del glucagón probablemente es mediado a través del cAMP.

La síntesis de ciertas enrimas

como precursores inactivos tienen
ventajas en la regulación
La actividad enzimatica puede regularse con la conversión de una proenzima inactiva a la forma catalítica activa. Para volverse catallticamente activa, la proenzima debe experimentar una proteólisis limitada, un proceso acompañado de cambios en la conformación que revelan o "crean" el sitio catalítico. Esto se mostrara después en relacibn con la enzima quimotripsina.

MUCHAS PROTEASAS SE SECRETAN COMO PROENZIMAS SIN ACTIVIDAD CATAL~TICA
Ciertas proteinas se elaboran y secretan en forma de proteinas precursoras inactivas conocidas como proproteínas. Cuando son enzimas, las proproteinas se denominan proenzimas o cimógenos. La conversion de una proteína en proteina madura implica la proteólisis selectiva, proceso que convierte la proproteina en una forma que tiene la actividad típica de la proteina madura (su actividad enzimfitica} mediante uno o más "cercenamientos" proteoliticos sucesivos. Los ejemplos de proteinas elaboradas como proproteinas incluyen la hormona insulina (proproteina = profnsulina), las enzima5 digestivas pepsina, tripsina y quimotnpsina (proproteínas = pepsindgeno, tripsindgeno y quimotripsinógeno, respectivamente), varios factores de la cascada de la coagulacibn sanguínea y de la disolución del cohgulo (capitulo 59), y la proteina cotágena del tejido conjuntivo (proproteina = procoIágena}.

La conversibn de proquimotripsina (pro-QT), polipéptido de 245 residuos aminoacilo, en la enzima alfa quimotripsina activa implica tres cercenamientos y la formación de un intermediario activo conocido como piquimotripsina (pi-QT) (figura 1 1-3). En la alfa quimotripsina las cadenas A, B y C permanecen integradas en virtud de la presencia de dos enlaces disulfuro entre las cadenas (figura 1 1 4 ) .

estar disponible un conjunto completo de los aminohcidos precursores. Como consecuencia, cl proccso de secrecidn puede ser de lentitud relativa con relación a la demanda físiológica.

La activación de la proquimotripsina requiere de proteolisis selectiva
El e.jernplo de conversihn de una proproteína a s u

Las proenzimas facilitan la movilización rápida de una actividad en respuesta a la demanda fisiológica
¿Por qu$ cicrias proteínas se secretan en la forma inactiva? Algunas son necesarias practicamenlc en todo momento, mientras que otras (como las enzimas de la fomacidn y disolucilin del coágulo sanguíneo) se requieren sólo de manera intermitente. Más aún, cuando estas últimas se necesitan de urgencia, Ciertos procesos flsiologicos como la digestión son intermitentes, pero bastante regulares y predecibles (aunque éste pudo no ser el caso para los seres humanos primitivos). Otros, como la formacibn y disolución de coágulos sanguíneos y la reparación tisular, tan rolo deben estar "en Iinea", para responder a la presibn de una necesidad fisiológica o fisiopatológica. Puede apreciarse con facilidad que el proceso de formación y disoluci6n de coágulos sanguíneos debe ser coordinado en el tiempo para alcanzar Ia homeostasia. Además, la sintesis de proteasas como proteinas precursoras sin actividad catalítica sirve para proteger el tejido de origen (por ejemplo, el pfincreas) de la autodigestibn, lacual puede presentarse en lapancreaiitis. La sintesis de nuvo de las protehas que se requieren puede no efectuarse con la rapidez suficiente para responder a la presión de una demanda fisiopatolégica como es la pérdida de sangre. Más aun, debe

forma madura con actividad fisiológica ejernplifica
los principios generales siguientes de tal conversión:
1) El proceso implica la proteblisis selectiva que, en algunos casos, sb10 requiere un cercenamiento proteolítico Único. 2) Los productos polipéptidos se pueden separar o permanecer integrados a la proteína madura. 3) El proceso puede (o no) cumplirse con cambio significativo en el peso molecular. 4) La principal consecuencia de la proteólisis selectiva es alcanzar una nucva conformación. 5) Si la proproteína es una enzima, el cambio mena cionado en T conformación origina el sitio catalítico de la enzima.En taI virtud, la proteolisis selectiva de una proenzima puede verse como un proceso que desencadena cambios esenciales en la conformación que "crean" el sitio catalitico.

Obskrvese que mientras His 57 y Asp 102 se encuentran sobre el peptido B de la alfa quimotripsina, Ser 195 se encuentra sobre el peptido C (figura 1 1-3). La proteblisis selectiva de la proquimotripsina (quimotripsinógeno) facilita la aproximación de los tres residuos del sistema relevador de carga, lo cual muestra la manera en que la proteólisis selectiva da lugar al sitio catalítico. Nótcse que el contacto y los residuos

Figura 113.Convessi611de la proquimotripsina {pro-QT) a pi-quimotflpsina (pi-QT) y de manera subsecuente a la enzima madura alfa quimotripsina (alfa-QT) con actividad catalitica.

S-S

S-C

S -

S

Flgura 1 1 4 Enlaces de disulfuro intra e tntercadenas de la alfa quirnotripsina (alfa-QT).

cataliticos pueden localizarse sobre diferentes cadenas de péptidos, pero mantenerse a una distancia que permita formar enlaces con el sustrato enlazado.

describe la función de los "mecanismos de lanzadera" para poder lograr el equilibrio de Ias confluencias metabblicas dc equivalentes reductores, del ciclo del hcido cltrico y de otros intermediarios anfibólicos.

EXISTEN MÚLTIPLES OPCIONES PARA REGULAR LA ACTIVIDAD CATAL~TICA
Si una modificacibn fisiológica altera el grado de la actividad enzimatica, se puede preguntar si la cantidad de enzima ha cambiado o si la enzima es un catalizador más o menos eficaz. A todos los cambios de la actividad enzimatica sin modificación de la cantidad de enzima presente se les denominara como "efectos en la eficacia catalítica".

LAS ENZIMAS PUEDEN FORMAR COMPLEJOS MACROMOLECULARES
La organización de un conjunto de enzimas quecatalizan una secuencia de reacciones metabhlicas, coordina a las enzimas y a los canales intermediarios a lo largo de una via metabdlica. La alineacibn apropiada de las enzirnas puede facilitar la transferencia del producto entre las enzimas sin equilibrio previo con las confluencias metabblicas. Esto permite un modo más fino de control metabólico que el posible con los componentes aislados del complejo. Además, los cambios de confomacl6n en un componente del complejo puede transmitirse por interacciones de proteína con proDe teína hacia otras ennimas del ~omple~jo. este iriodo es posible laamplificacion de los efectos reguladores.

LA SEPARACIÓNDE ENZIMAS EN COMPARTlMlENTOS FACILITA LA R E G U L A C I ~ N DEL METABOLISMO
No se puede pasar por alto la importancia de la disposicidn en compartimientos de Tos procesos metabhlicos en las ct5lulas eucariotas, que incluyen las de los mamíferos. La IocaZización de los procesos metabólicos especificas en el citosol o en los organelos subcelulares facilita la regulación de estos procesos independientemente de los que suceden en otras partes. La extensa formación de compartimientos de los procesos metabolicos tipicos de las formas superiores de vida confiere asi el potencial para un ajuste fino de la regulación del metabolismo. Al mismo tiempo, plantea problemas con respecto a lamovilizacion de metabolitos a través de las barreras de los compartimientos. Estos metabolitos pasan las barreras mediante "mecanismos de lanzadera", que convierten el metahlito en una forma permeable para la barrera del compartimiento, lo cual va seguido por el iransporte y la conversión a la forma original en el otro lado de la barrera. En censecuencia, estas interconversiones requieren, por ejemplo, formas citosólicas y mitocondriales de la misma actividad catalítica. Puesto que estas dos formas de la enzima están fisicamente separadas, su regulación independiente se facilita. En el capitulo 18 se

LAS CONCENTRACIONES LOCALES DE SUSTRATOS, COENZIMAS Y CATIONES PUEDEN REGULAR LAS ENZIMAS
La concentracién intracelular media de un sustrato, una coenzima o un ion methlico puede tener escaso significado para el camportamiento rn vivo de una enzima. Es necesaria la informaci6n sobre las concentraciones de metabolitos esenciales en la vecindad inmediata de la enzima en cuestibn. Sin embargo, aun la medicibn de las concentraciones de metabolitos en compartimientos celulares diferentes no toma en cuenta las discontinuidades locales en su concentraci6n dentro de los compartimientos, causadas por factores como la proximidad al sitio de entrada o de producción de un metaboiito. Por último, generalmente se le da poca importancia a la discrepancia entre la concentracibn total y libre del metabolito. Por ejemplo, aunque la concentración total del 2,3-difosfoglicerato en los eritrocitos es extremadamente alta, la concentracidn

Enzimas: regulucidn de actividades

1.25

libre de bisfosfoglicerato (es decir, no unida a la h e m e globina) es comparable a la de otros tejidos. Consideraciones semejantes se aplican a otros metabolitos en presencia de proteínas que los fijan de modo eficaz y que reducen su concentracibn en estado libre. Una hiphtesis del enfoque cinético de MichaelisMenten es que la concentración del sustrato total es igual en esencia a la concentración del sustrnto libre. Como se anot6, esta suposicibn puede no ser vilida in vivo, donde es posible que las concentraciones de los sustratos libres se aproximen a las de la concentracibn de enzimas. Los iones metálicos que desempefian funciones catalíticas y estructurales en mas de una cuarta parte de todas las enzimas conocidas (capitulo 103, pueden tener tambien funciones reguladoras particularmente en las reacciones en que el ATP y otros polianiones son sustratos, Se observa la tlpica actividad mhxima cuando el cociente molar de ATP a metal es casi la unidad. El exceso de metal o de ATP son inhibitorios. Dado que los di y trifosfatos de nucleósidos forman complejos estables con los cationes divalentes, Ias concentraciones intracelulares de 30s nucle6tidos pueden influir sobre las concentraciones intracelulares de los iones methlicos libres y, por tanto, la actividad de ciertas enzimas.

titiva, no acoplada o mixta. Es la más común en tas vias biosinttticas. Frecuentemente, el inhibidor por retroacciones es la ultima molkcula pequefia antes de una macromol~cula (por ejemplo, arninohcidos antes de proteínas o nucleótidos antes de ácidos nucleicos). La regulacibn por retroacción tiene Iugar generalmente en el paso mhs temprano, funcionalmente irreversible*, que es exclusivo para una serie biasintética particular. Un ejemplo muy estudiado es la inhibición de aspartato transcarbamilasa bacteriana por CTP (véase después y capitulo 36). Frecuentemente, una ruta biosintkticapuede estar ramificada, sirviendo la porción inicial para la síntesis de dos o mBs metabolitos esenciales. La figura 1 1-5 muestra los sitios probables de inhibición por setroacción simple en una vía biosintdtica ramificada (por ejemplo, para aminoácidos, purinas o pirimidinas). Los Si,S2y S3 son precursores de los cuatro productos finales (A, B, C y D). El S4 e5 un precursor de B y C y S, es precursor únicamente de D; de este modo, las secuencias:

CIERTAS ENZIMAS SON REGULADAS POR EFECTORES ALOSTÉRICOS
La actividad catalítica de ciertas enzimas reguladoras es controlada por efectores alostericos de peso molecular bajo que por lo general tienen poca o ninguna semejan72 estructura1 con los sustratos o coenzimas para la enzima reguladora. La inhibición por retroalimentacibn se refiere a la inhibición de la actividad de una enzima inicial en una vía biosintktica, por medio de un producto final de esa vía. Para la biosíntesis de D a partir de A, catalizada por las enzimas En21 a Enq,
Enzi EUQ Eny

constituyen sucesiones de reacciones lineales de las que puede esperarse sean inhibidas por sus productos finales. De nuevo, la biosintesis d e nucleotido (capitulo 36) proporciona ejemplos especificas.

Circuitos múltiples de retroalimentación regulan vías biosintéticas ramificadas
Múltiples asas de retroalimentación (figura 3 1 4) proporcionan control fino adicional. Por ejemplo, si B se encuentra en exceso, disminuye el requerimiento de S.La capacidad de B para disminuir la producción de S2 confiere asi una ventaja biolbgíca. Sin embargo, si el exceso de B puede inhibir no 5610 la porción de la vía particular de su propia síntesis, sino tambitn porciones comunes a la de la síntesis de A, C o D, un exceso de B deberá reducir la síntesis de los cuatro productos finales. Claramente esto es indeseable. Sin embargo, existen mecanismos para evitar esta dificultad. En la inhibicidn por retroalimentación acumulativa, el efecto inhibidor de dos o mhs productos finales sobre una sola enzima reguladora es estrictamente aditivo.

A+B+C-+

D

una concentraci6n alta de D, inhibitii de manera típica la conversion de A en B. Esto no implica un simple "retraso" de los intermediarios sino la capacidad de D para unirse a Enzl e inhibirla. Asi, D actúa como un efector alostérico negativo o inhibidor por retroalimentacihn de Enz,. Por tanto, la inhibicidn por retroalimentaci6n de Enzl mediante D regula la slntesis de D. De manera tlpica, D se une a la enzima sensible en un sitio alost4rico remato del sitio catalítico. La cinetica de la inhibición por retroaccion puede ser no competitiva, competitiva, parcialmente compe-

* Uno favorecido fuertemente (en terminos termodinamicos) en una sola dirección, esto es, uno con un gran AG
negativo

(Capítulo 11)

Flgura 11-5. Sitios de inhibicibn por cetroalimentaubn en una via biosintética ramificada. SI o S5 son intermediariosen la biosintesis de los prcdudos finales R a D, las flechas rectas representan las entimas que catalizan las conversiones indicadas. Las flechas curvas representan asas de relroalimentacibn e ~ndican sitios probables de inhibilos cibn por retroalimentación medlante productos finales esnecificos.

del ingles, cyfidine triphosphate}. Después del tratamiento con compuestos mercuriales, la aspartato transcarbamilasa pierde su sensibilidad a la inhibicion por el CTP,pero retiene su actividad completa para la slntesis del carbamilaspartato. Esto sugiere que el CTP esta unido a un sitio (alostérico) diferente del de cada sustrato. La ATCasa consiste en múltiples protómeros cataliticos y reguladores. Cada protómero catalitico contiene cuatro sitios aspartato (sustrato) y cadaprotbmero regulador por lo menos dos sitios CTP (reguladores}.

Los sitios catalíticos y alostéricos muestran diferencia espacial
Monod observ6 la falta de semejanza estructural entre el inhibidor por retroalimentacibn y el sustrato para la enzima cuy a actividad regula. Dado que los efectos no son kocstéricos con un sustrato, sino alostéricos (ocupan otro espacio), este investigador propuso que las enzimas cuya actividad es regulada por efectores aIost&ricos(por ejemplo, los inhibidores por retroalimentacidn) fijan el efector en un sitio alostérica físicamente distinto del sitio catalítico. Las enzimas alostdricas son, pues, enzirnas cuya actividad en el sitio catalítico puede ser regulada por la presencia de efectores en un sitio atostérico. Varias pruebas apoyan

En la inhibici6n por retroalimentaciónconcertada o multivalente, la inhibicibn completa se produce sólo cuando dos o más productos finales están presentes en exceso. En la inhibición por retroalimentación cooperativa, un solo producto final presente en exceso inhibe la enzirna regladora, pero la inhibición que se observa cuando se encuentran dos o m& productos finales excede, con mucho, a los efectos aditivos que se ven en la inhibición por retroalimentación acumulativa.

La enzima alosterica más estudiada es la aspartato transcarbamilasa
La aspartato transcarbamilasa (ATCasa) cataliza la a primera reaccibn peculiar a E biosintesis de las pirimidinas (figura 1 1-7). La ATCasa es inhibida por retroacción mediante el trifosfato de citidina (CTP,
fosfato

Carbami'-

+

L-Aspartato

- oC II -,
HzN
C

O
CHP I H

I

Figura ll4. lnhibicibn milltiple por retroalimentacidn por una via ramificada biocint&titica. Sobrepuestas a las asas de retroalimentaciónsimple (flechas curvas de guiones) estfin las asas de retroalimentacidnmúltiples (flechas curvas eontinuas) que regulan las enzirnas comunes a la biosíntesis de varios productos finales

4

c\

'

o

H

COO -

Figura 11-7. Reacción de la aspartato transcarbamilasa (ATCa sa) .

Emimus: regulación de actividades

127

la existencia de sitios alosttricos fisicamente distintos en las enzimas reguladas; entre ellas está la siguiente:

1 ) LE. eenzirnas reguladas, modificadas portkcnicac químicas o fisicas apropiadas, frecuentemente se vuelven insensibles a sus efectores alostkricos sin alteración de su actividad catalítica. La desnaturalización selectiva de los sitios alostéricos ha sido lograda mediante tratamiento con derivados del mercurio, con urea, rayos0X, enzima proteoliticas, fuerza ilinica o pH exmmos. envejecimientode O a 5 "C opor congelación o calentamiento. 2) Lo efectos alostéricos frecuentemente protegen el sitio catalitico de la desnaturalización en condiciones en las cuales los propios sustratos no lo hacen. Dado que parece inverosfmíl que un efector unido al sitio catalitico proteja cuando no lo hacen los sustratos, esto sugiere un segundo sitio alostérico en cualquier otra parte de la molkcula enzirnAtica. 3) En ciertas células mutantes, bacterianas y de mamíferos, las propiedades para ia regulacion de las enzimas reguladoras tienen modificadas sus propiedades para la regulacidn, pero sus propiedades catalíticas son idénticas a las del tipo nativo de donde deriv6 la mutante. Así, la estructura de Ios sitios alost&ricosy catalitica son geneticamente distintos. 4) Los estudios sobre uni6n de sustratos y de efectos alost&ricosa las enzima5 reguladas muestran que cada uno se puede unir independientemente del otro. S) En ciertos casos (por ejemplo, ATCasa), el sitio alostkrico se halla colocado en un protómero diferente al que posee el sitie catalitico.

Figura 11-8. Curva sigmoide de saturación para el sustrato en presencia de un inhibidor alostérico.

Las enzírnas alostericas por lo general muestran una cinética sigmoidea de saturación con sustrato
En la figura 1 1-8 se muestra la velocidad de reaccibn catalizada por una tipica enzima alosttrica medida a varias concentracianes del sustrato, en presencia y ausencia de un inhibidor alostdrico. Cuando este último falta, se observa una cindtica de saturacidn hioerbólica normal. En su presencia. la curva de sahraciiin por sustrato es dis&rsionada de una hipdrbola a una curva sigmeidea, que a concentraciones altas de sustrato puede coincidir con su forma hiperbdlica. Nótese la analogía de la relacion con las curvas de saturación de 0 2 de la rnioglobina y la hemoglobina (capitulo 7). El anhlisis cinktico de la inhibicibn por remalimentaci6n parece ser competitivo, no competitivo, pmcialmente competitivo de otros tipos. Si aconcentraciones

elevadas de S, hay actividad comparable en presencia o ausencia del inhibidor aIostkrico, la cindtica superficialmente se parece a la de una inhibicibn competitiva. Sin embargo, dado que la curva de saturacibn por el sustrato es sigmoide y no hiperbólica, no es posible obtener resultados significativos graficando los datos para la inhibicibn alostérica por la tkcnica del doble recíproco. Este método de análisis fue elaborado para la inhibicibn competitiva con el suskato en el sitio catalítico. Puesto que los inhibidores alost&ricosactúan en un sitio diferente (alóstérico), el modelo cinético ya no es válido. El carácter sigmoide de la curva de v respecto a [S] en presencia de un inhibidor alostérico, refleja el fenómeno de cooperatividad. A bajas concentraciones de sustrato, la actividad en presencia del inhibidor es baja con relacibn a la que se observa en su ausencia. Sin embargo, cuando [S] aumenta, el grado de inhibición se vuelve m e w s intenso. Estas cinéticas son congruentes con la presencia de dos o más sitios de uni6n de sustrato que actuan reciprocamente, donde la presencia de una molécula de sustrato en un sitio catalitico facilita la unión de una segunda molkcula del mismo en un segundo sitio. La cooperatividad de la fijacibn del sustrato se describid en los capitulos 7 y 9: la curva sigmoide de saturación de Oz se forma a consecuencia de las interacciones cooperativas entre cuatro sitios de fljacj6n de oxígeno que se localizan en los diferentes protbmeros de hemoglobina y en el uso de la escala de Hill para cuantificar la cooperatividad.

(Capítulo I 1)

Los efectos alostéricos pueden ser en Kmo sobre,,Y ,
La referencia a fa cinktica de la inhibición como "competitiva'k ''no competitiva" respecto al sustrato lleva implicaciones mecanicistas que son desorientadoras. Es preferible referirse a dos amplias clases de enzimas reguladas, las de la serie K y las de la serie V. Para !as mzimas alostkricas de la serie K, la cinética de saturacibn por sustrato es competitiva en el sentido de que Kmse eleva sin efecto alguno sobre Vmk.Para las enzimas de la serie V el inhibidor alostdrico abate V , sin afectar la Km aparente. Probablemente las alteraciones en Kmo en V resultan de cambios conforma, cionaies en el sitio catalitico, inducidos por Ia fijacion del efector alostérico en el sitio alostérico. Para una enzima alostérica de la serie K, este cambio en la conformación puede debilitar los enlaces entre el suctrato y los residuos que se fijan a &l.Para una de la serie V, es posible que el efecto primario sea alterar la orientacion o la carga de los residuos cataliticos, de modo que V,,, disminuya. Sin embargo, se pueden observar efectos intermedios sobre Kmy Y , conse, cutivos a estos cambios en la confomacibn.

LA REGULACIÓN POR RETROALIMENTACI~N, ES NO SINÓNIMO DE INHIBICIÓN POR WETROALIMENTACIÓN
En ambas clases de ctlulas, de mamíferos y bacterianas, los productos finales retroalimensan y controlan su propia síntesis. En muchos casos, esto involucra la inhibicibn por retroalimentacibn de una enzima biosintCtica inicial. Sin embargo, se debe distinguir entre regulacibn por retroalimentaci6n, un termino fenomenol~gico exento de implicaciones mecanísticas, e inhibición por retroalimentación, un mecanismo para fa regulación de numerosas enzimas bacterianas y de mamíferos. Por ejemplo, el colesterol de la dieta restringe la sintesis de1 procedente de acetatos en los tejidos de los mamíferas. No obstante, esta regulación al parecer no hace intervenir a la inhibicibn por retroalimentacidn de una enzima inicial de la biosintesis del ~olesterol.Una enzima inicial (HMG-COA reductasa) es afectada, pero el mecanismo comprende la interrupción de la expresibn de los genes que codifican para la formacibn de la HMG-Coh reductasa mediante el colesterol o un metabolito derivado de él. El colesterol agregado directamente a la HMG-COA reductasa no tiene efecto sobre su actividad catalitica.

La fijación cooperativa de un sustrato confiere una ventaja fisiológica
Las ventajas de la cinCtica de fijación cooperativa de3 sustrato son anklogas a aquetlas que se producen por la fijación cooperativa del O? a Ia hemoglobina. h concentraciones bajas de sustrato, el efector alostérico es un inhibidor eficaz. De este modo, la regulación es más eficiente en el momento en que la necesidad es máxima, es decir, cuando la concentración intracelular de los sustratos es baja. Si se comienza a disponer de más sustrato, entonces es menos necesaria una regulación rigurosa. Cuando la concentración del sustrato se eleva, el grado de inhibicion disminuye y se formauna cantidad mayor de producto. Al igual que con la hemoglobina, la curva sigrnoide de saturacion del sustrato en presencia del inhibidor también asegura que cambios relativamente pequefíos en la concentraci6n del sustrato ocasionan grandes modificaciones en la actividad. Asl, se logra un control sensible de la actividad catalitica mediante cambios pequefios en la concentración del sustrato. Finalmente, por analogla con las diferencias en l a curvas de saturacion de 0 1 de hemoglobinas de diferentes especies, las enzimas reguladoras de orígenes distintos pueden tener curvas sigmoideas de saturacibn desplazadas a la izquierda o a la derecha para acomodarse a los llmites de las concentraciones de sustrato que prevalecen i vivo. n

LA MODIFICACIÓMCOVALENTE REVERSIBLE REGULA ENZIMAS ESENCIALES DE MAM~FEROS
La modulacibn reversible de laactividad catalitica de las enzimas puede producirse por la adherencia covalente de un grupo fosfato a uno o mhs residuos Ser, Tri, Tir
o His. Las enzimas que experimentan modificacibn covalente con regulacilin concomitante de su actividad se denominan "enzimas interconvertibles". Las enzirnas interconvertibles existen en dos condiciones de actividad, una de eficacia catalítica elevada y otra de baja eficacia. Dependiendo de la enzima de que se trate, el catalizador más activo puede ser la fosfoenzima o la que no posee grupo fosfato (cuadro 1 1-1).

Las enzirnac pueden tener numerosos sitios de fosforilación
Un residuo seril especifico es fosforilado, formando el O-fosfoseril o un residuo tirosil es fosforilado para formar el residuo O-fosfotirosil. Aunque una enzima interconvertible puede contener muchos residuos Ser
o Tir, la fosforilación es sumamente selectiva y se produce s61o en un pequefio nUmero de sitios posibles. Probablemente estos sitios no f m e n parte del sitlo

E m i m m : reqialacihn de actividades

129

"

>

Cuadro 1 1-1. Ejemplos de enzimas dc mamíferos cuya actividad catalítica está alterar'acihn-de!
izime

La fosforilacion-desfosforilación consume ATP
Las reacciones de la figura 1 1-9 se parecen a las de la interconversión de gIricasa y gIucosa 6-fosfato o de fructosa-6-frrsfatoy fnictosa- l,6-difosfato (capitulo 1 4). El resultado neto de la fosforilaci6n y luego de la desfocforilación de 1 m01 de sustrato (enzima o azúcar) representa la hidrálisis de 1 mol de ATP. Las actividades de Ias cinasas, que catalizan las reacciones 1 y 3 (abajo), y de lac fosfatasas, que catalizan las reacciones 2 y 4, deberhn, en sí mismas, ser reguladas, porque de otra manera podrian actuar juntas para catalizar de modo incontrolable la hidrolisis del ATP.

-

-

A<
GI

,arboxilasa
ntasa

I'iruvalo deshrdrogcnasr HMG-COA ri Glucbpcno fc

t
f

Rnjo

Alto

11.P 1 1' ;.

Citratoliiisii l'cisforil¿isnb L I I I ~ M
IIMG-COA reductnsa cinnsa
E. dcslosforocn7ima; EP, fosfuenzimn.

--

2. HzO + Glucosa-6-P + Pi + Glucosa
Neto: HzO + ATP 3. Enz-Ser4i-I

Las prateinas cinasas y las fosfatasas son proteinas convertidoras
La fosforilaci0n y la desfosforilacion son catalizadas por una variedad de proteínas cinasas y proteina fosfatasa (proteinas ctinvertidoras), respectivamente (figura I 1-9). l.a capacidad de estas proteínas cfnasac para reconocer figuras o patrones distintivos de la estructura primaria esta relacionada en parte, con su alta especificidad. En casos especificas, las mismas protefnas convertidoras pueden ser enzimas convertibles (cuadro 1 1 -1 ). De este modo hay proteína cinasa y prcrfeina cinasa fosfatasa que catalizan la interconversicin de estas ~roteinas convertidoras. Las tiruebas de que las proteha fosfatasa sean proteínas interconvertibles son menos convincentes, aunque su actividad es regulada. La actividad de la proteina cinasaestli regulada y, lo mismo que la de la proteina fosfatasa, csth baja control hormonal y neurolbgico, si bien los detalles precisos por los cliales estos agentes actúan están lejos de ser claros en la mayor parte de los casos.
ATP ADP

+ ADP * Pi
+ ATP +ADP * E n z 4 e r 4 - P

- -

4. HzO + Enr-Ser-O-P
4 ADP

Neto: H2O + ATP

La modificación covalente regula el flujo del metabolito
La regulación de la actividad enzimática por medio de la fosforilación-desfosforilación tiene analogías con la regulacion mediante la inhibicibn por retroalimentaci~n. Ambas proporcionan una regulación a corto plazo, fhcilmente reversible, del flujo de metabolitos en respuesta a señales fisioldgicas específicas; actúan sin alterar la expresión gendtica; actúan cobre enzimas tempranas de una prolongada secuencia metabólíca (a meniido biosintética} y en los sitios alostéricos más que en los cataliticos. Sin embargo, la inhibición por retroacciiin incluye a una sola proteina y carece de las caracteristicas hormonales y neuroIógicas. Por el contrario, la regulación de las enzimas de los marniferos por fosforilacilindesfosforil ación comprende a varias proteinas y ATP estk bajo directo control hormonal y ncurol6gica.

RESUMEN
Figura 11-9. Modificacibn covalentede una enzima regulada por la focforilación-desfosfonlacibnde un residuo ser11

La regulaciiin de la actividad enzimática contribuye en gran parte a preservar la homeostasia que mantiene

+

catalítico, ciiando menos en lo que se refiere a la estructura. primaria, por lo cual constituyen otro ejernplo de iin sitio alosterico.

,-

* ATP

ADP

+

Glucoca-fi-P

-+
+ Pi

Pi + E n z 4 e r 4 H

1311

Bioquímiea de Hurper

un entorno intracelular e intraorganismo relativamente constante en presencia de arnpl iq fluctuaciones a en el medio ambiente externo (como cambios de temperatura, presencia o ausencia de agua o tipos específicos de alimentos). Para lograr la homeostasia, las velocidades de numerosas reacciones bioquímicas deben responder a la necesidad físiolbgica. ¿Cómo se logra este propósito? Las concentraciones locales de sustrato, Ia separacibn de enzimas en compartimientos y la secrecibn como proenzimas o cimiigenos (por ejemplo, quimotripsina) sin actividad catalitica, contribuyen a la regulacibn de los procesos metabólicos. Muchas proteasa y otras proteinac se secretan como proproteínas biol6gicamente inertes que deben someterse a un desprendimiento proteolitico selectivo para formar una enzima u hormona con actividad biológica. Los ejemplos incluyen quirnotripsina, insulina y las proteasas de las cascadas de la formacibn y disolucibn de los coagulos sanguíneos. La secrecibn, como precursor inactivo, protege contra su acci6n hasta que surge la necesidad, al mismo tiempo que facilita la movilización rhpida de una actividad sin que se requiera nueva sintesis de la proteina. Uno o más procesos proreoliticos desencadenan cambios en la conformación, los cuales aproximan y alinean 30s residuos previamente distantes para formar el sitio catalítico. Los pkptidos que se forman por la proteblisis selectiva pueden descartarse (qjernplo, dos dipéptidos de QT) o pueden permanecer unidos mediante enlaces disulfiro (los peptidos A, B, y C de la QT y las cadenas A y B de la insulina). Además, las alteraciones rhpidas y minimas en la actividad catalitica de enzimas clave reguladas tienen funciones importantes en la canalizacibn selectiva de metabolitos hacia uno u otro proceso metabólico. Las enzimas reguladas tienden a ser aquellas que catalizan una reaccibn inicial única (con frecuencia la primera) de una secuencia detenninada de reaccionw metaMlicas. La actividad catalitica de las enzimas reguladas puede modularse (por qjernpto, cambios repetidos entre estados bajo y alto de actividad catalitica) cuando no hay nueva síntesis ni degradaciiin proteinica. La modu-

lacibn se logra cuando metabolitos específicos se fijan a la enzima regulada, en general a sitios (alost&rfcoc) bastante separados del sitio catalitico. La modulación de la actividad enzimbtica por cambios en la conformación del sitio catalitico puede incluir la alteración de Kmpara un sustrato, de V,,, para la reacción global o efectos sobre los dos, Km y V,,. A menudo, las curvas de saturacibn de sustrato para la inhibición aIostéríca son sigmoideas, por lo cual no se aplica la ecuación de Michaelis-Menten. La evaluacibn cuantitativa de la cooperatividad de las enzimas alostericas utiliza la ecuacicin de Hill. Para procesos biosintéticos, la inhibicibn por retroalimentaciOn incluye metaboiitos reguladores, que se encuentran en la biocintesis "corriente arriba" de la enzima regulada (por ejemplo, inhibición de la aspartato transcarhomilasa por CTP). En secuencias de reacciones catabólicas, metabolitos "corriente abajo en la biodegradacion" de la enzima en cuestibn actúan como reguladores (como la inhibición de fosfofructocinasa por ATP o citrato). Cuando más de un metabolito puede regular por retroalimentación a una enzima dada, la accion de estos metabolitos reguladores múltiples puede ser acumulativa, cooperativa o multivalente. Adernris, un metabolito dado puede regular la actividad de varias enzimas, cada una de ellas única para una secuencia particular de reacciones rnetabálicas (asas múltiples de retroalimentacibn). En el ser humano y otros eucariotes, la actividad de numerosas enzimas es regulada por modificacibn covalente, siendo la forma más cornun la fosforilacibn dependiente de ATP con elirninaci6n hidrolitica de fosfato como ortofosfato inorgánico. La fosforilación selectiva y la desfosforilaciiin subsiguiente, cn parlicular de residuos específicos de Ser o Tír, son catalizados por proteínas cinasas y proteínas fosfatasas (cnzimas convertidoras). A su ve& la actividadde estas en7imasconvertidoras puede ser regulada. Por tanto, la enzima blanco y sus enzimas convertidoras pueden constituir una porcibn de una cascada reguladora que responde a una sefial disparada por una hormona o por un segundo mensajero como cAMP. II

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Bioeneraetica: la función de AñP
+ir

Peter A. Mayes, PhD, DSc

La bioenergética o termodinhrnica bioquimica, es el estudio de los cambios de energía que acompaíían a las reacciones bioqulmicas. Proporciona los principios que explican la causa de que algunas reacciones puedan producirse en tanto que otras no. Los sistemas no bioldgicos pueden utilizar la energia calorífica para realizar trabajo, pero los sistemas bioIbgicos son en esencia isotbrmicos y emplean la energla química para energizar el proceso de la vida.

Los sistemas biológicos cumplen con las leyes generales de la termodinámica
La primera ley de la termodinhrnica establece que T a energía total de un sistema, incluyendo la de su entorno, permanece constante, ksta es también la ley de la conservacibn de la energia. Implica que durante cualquier cambio dentro del sistema completo, w se pierde ni se gana energia. Sin embargo, dentro de ese sistema total, la energía puede transferirse de una parte a otra o puede transformarse a otm forma de energia. Por ejemplo, Ia energia química puede convertirse en calor, electricidad, energia radiante o energía mecánica en los sistemas vivos. La segunda ley de la termodinámica establece que si un proceso se produce espanthneamente, la entropia total de un sistema debe aumentar. La entropia representa e1 grado de desorden o lo fortuito del sistema y se torna mfixima en un sistema cuando &te se aproxima at equilibrio verdadero. En condiciones de temperatura y presibn constantes, la relaci6n entre el cambio de energia libre (AG) de un sistema en reacci6n y el cambio de la entropia (AS) estfi dada por la siguiente ecuación, que combina las dos leyes de la termodinhica:

IMPORTANCIA BIOQU~MICA
Para proveer la energia que capacite a! ser vivo para llevar a cabo sus procesos normales, se requiere un combustible adecuado. Entender la forma en que los organismos obtienen esta energía de sus alimentos basico para comprender la nutrici6n y el metabolismo nomales. La muerte por inanicibn se produce cuando las reservas energeticas disponibles se agotan y ciertas formas de desnutrición se relacionan con un desequilibrio de la energía (marasmo). El índice de emisión de energía, medida por el indice rnetab6lic0, se controla por las hormonas tiroideas cuya disfuncion es una causa de enfermedad. El almacenamiento excesivo del suministro de energia produce obesidad, una de las enfermedades más frecuentes de la sociedad occidental.

LA ENERG~A LIBRE ES LA ENERG~A UTIL EN UN SISTEMA
El cambio en la energia libre (AG) es esa porci6n del cambio de la energía total de un sistema que está disponible para realizar trabajo; es decir, la energía
iitil, conocida tarnbikn en los sistemas químicos como potencial qilimica.

donde hH es el cambio de la entalpía (calor) y T es la absoluta. Bajo las condiciones de las reacciones bioquímicas, debido aque A-3 es aproximadamente igual a AE, que es el cambio total en la energía interna dc la reacción,

la relacibn anterior puede expresarse de la manera siguiente:

Si AG es de signo negativo, la reacción procede de manera espontánea con pdrdida de energla libre, es decir, es exergónica. Cuando, adembs, AG es de gran magnitud, la reaccicín se dirige virtualmente a su consumaci6n y es esencialmente irreversible. Por otra parte, si AG es positiva, la reaccidn procede s61o si puede ganarse energia, es decir, es endergónica. Si, ademas, la magnitud de AG es grande, el sistema es estable con poca o ninguna tendencia para que se produzca una reaccibn. Si AG vale cero, el sistema esta en equilibrio y ningUn cambio neto tiene lugar. Cuando los reactantes esthn presentes en concentraciones de 1 .O mol!L, AG' es el cambio de la energia libre esiandar. En las reacciones bioquímicas. una condicióti estándar se define con un pH de 7.0. El cambio de la energia libre estlndar a este pH se designa por AG". Puede calcularse a partir de la constantedeequilibrio K',

calor, los t$minos químicos nomiales exotémico y endotermico no pueden aplicarse a estas reacciories. En su lugar, se emplean las palabras exergunico y endergbnico para indicar que un proceso se acornpafia con perdida o ganancia, respectivamente, de energía libre, independientemente de la forma de energia de que se trate. En la prhctica, un proceso endergónico no puede existir solo, sino que debe ser un componente de un sistema acoplado exergónico-endergónico donde el cambio neto global es exergonico. Las reacciones exergiinicas constituyen el cata bolismo (degradacion u oxidacián de moléculas combustibles), en tanto que las reacciones sintéticas que fuman sustancias se denominan anabolismo. El conjunto de procesos catab6licos y anabblicos constituye el metabolismo. Si la reacción mostrada en la figura 12-1 se mueve de izquierda a derecha, e\ proceso global debe estar acompaiiado por pérdida de energia libre como calor. Puede concebirse un mecanismo posible de acoplamiento si un intermediario comun obligatoria (I)toma parte en ambas reacciones, es decir,

AG*' - 2.303 RT log Ks, =
donde R es la constante de los gases y T es la temperatura absoluta (capítulo 9). Es importante destacar que la 3G real puede ser mayor o menor que AG", segiin la concentracion de los diversos reactantes, incluso el solvente, varios iones y proteinas. En un sistema de reacciones bioquimicas, debe apreciarse que una enzima s61o las acelera hasta liegar al equilibrio: esto nunca modifica la concentracion final de los reactantes en equilibrio después de su desprendimiento de la enzima.

En los sistemas biolbgicos, algunas reacciones exergónicas y endergbnicas estan acopladas de esta manera, DeberA apreciarse que este tipo de sistema tiene incorporado un mecanismo para el control biotogico de la velocidad a la cual se permite que se produzcan los procesos oxidativos, ya que la existencia de un intermediario común obligatorio para las dos reacciones, exergbnica y endergbnica, deja que la velocidad de utilizacibn del producto de la vla sintetica (D) determine por acci6n de masas E velocidad a

Calor

LOS PROCESOS ENDERGONICOS SE LOGRAN POR ACOPLAMIENTO A PROCESOS EXERGON~COS
Los procesos vitales -como las reacciones sintéticas, de la contracción muscular, la conduccione~ impulsos nerviosos y el transporte activo- obtienen energía por enlace quimico o acoplamiento, con las reacciones oxidativas. De manera más simple, este tipo de acoplamiento puede ser representado como se muestra en la figura 12-1. La conversibn del metabolito A al metabolito B produce energia libre. Esta se acopla con otra reacción, en la cual se requiere energia libre para convertir el metabolito C al metabolito D. Como parte de la energia liberada en la reacci6n degradativa se transfiere a la reaccibn sinte-tica en forma diferente al

Energía qulmica

Figura q2-1. Aco'plamiento de una reaccidn exergbnica y una endergbnica.

n la cual A es oxidado. De hecho, estas relaciones proporcionan una base para el concepto del control respiratorio, proceso que evita que un organismo

fuera de control se incendie. Una extensión del concepto de acoplamiento lo dan las reacciones de deshidrogenación. que están acopladas a hidrogenaciones por iin portador intermediario (figura 12-2). U n metodo alterno de acoplar un proceso exergónico a unti enderghnico es sintetizar un compuesto con alto potencial energético en la reaccion exergonica e incorporar cstc nuevo compuesto a la cndergbnica, efectuando así una transferencia de energía libre de la a via exerg~nica la endergónica. En la figura 12-3, -@ es un compuesto con un alto potencial energetico y @ cs el compuesto correspondiente con bajo potencial enercélico. I,a ventaja biológica de este mecanismo es que u -@, al contrario de 1 en el sisten~a anterior, no necesita tener una estructura seme-jante a A, R, C o D. Esto J perm itiria que K actuara como transductor de energía desde una amplia gama de reacciones exerglinicas a un igualmeiite extenso grupo de rcnccioncs o procesos endergónicos, como se muestra en la figura 1 2 4 . Por otro lado, en la cdlula viva, el principal compuesto intermediario o portador de alta energía (designado es el trifosfato d c adcnosina (ATP, del iriglés. ~r(ic~i7osine f ripho.~phate).

Figura 12-3. Transferencia de energla libre de una reacción exergonica a una endergbnica a travhs de la formación de un compuesto de alta energía.

-a)

LOS FOSFATOS DE ALTA ENERG~A DESEMPENAN UNA FUNCIÓN PRINCIPAL EN LA CAPTURA X TRANSFERENCIA

DE ENERGIA
Para conservar los procesos de la vida, todos los organismos debcn obtener suministros de energia libre a partir de su entorno. Los orgmisinos autótrofos acoplan su metabolismo a aEgiin proceso exergónico simple en su entorno; por .ejemplo, las plantas verdes utilizan la energía de la luz solar y ciertas bacterias autotrofas utilizan la reacción FeZ' -r Fe3'. Por otro lado, los organismos heterbtrofos obtienen energia libre mediante el acoplamiento de su metabolismo a la rotura de moléculas orghnicas cornple-jas procedentes de su

entorno. En todos estos organismos, el ATP desempefia una funcihn en la transferencia de la energia libre de las reacciones exerg~nicasa las endergíinicas (figuras 12-3 y 124). El ATP es un nucleiitido especiaIizado que contienc adenina, ribosn y tres grupos fosfato. En sus actividades celulares, funciona como un complejo con Mp7+(figura 12-51. La imporiancia de los fosfatos en el metabolismo intermedio se hizo cvidente con el descubrimiento de los detalles quiniicos de Ia glucólisis y de la función del ATP, del difosfato de adenosina (ADP, dcI inglés, udenosine djphosphuie) y del fosfato inorghnico (P,) en este proceso (capítulo 19). El ATP se considerh

Proceso enderg6nlco

Excitacibn
nerviosa

activo

Figura 12-2. Acoplamiento de las reacciones de deshidrogenactbn e hidrogenacrón mediante un portador tntermediario

Figura 12-4- Transduccibn de energla a los procesos biolbgiees que la requieren (endergbnims) a través de un compuesto común de alta energia

138

Bioquimica de Harper

se debe a la carga de repulsilin de los ritomos de oxigeno adyacentes, con carga negativa y a la estabilización de los productos de la reaccion, especialmente fosfatos, como híbridos de resonancia. Orros compuestoc de importancia bíologica que se clasifican como "compuestos de altaenergia" son tioésteresentre losquese encuentran ésteres de la coenzima A (por ejemplo, acetil-COA), proteínas acilportadoras, esteres de aminoácidns que participan en la síntesis proteínica, S-ad~nosilmetionina (metionina activa) UDPGIc (uridindifosfato glucosa) y PRPP (S-fosforrihosi 1-pirofosfato).
Figura 12-5. El trifosfato de adenosina se muestra aquí como un complejo de magnesio. El ADP forma u n complejo similar con ~ g ~ ' .

Los fosfatos de alta energia se designan por el símbolo

-@

como un medio de transferir radicales fosfato en el proceso de la fosfonlacion. La función del ATP en la energdtica bioquimica fue descubierta en experimentos que demostraron que el mencionado ATP y la fosf'ocreatina eran degradados durante la contraccion muscular y que su síntesis ulterior dependia del suministro de energia procedente de procesos oxidativos en el rnUcculo. No fue sino hasta que Lipmann introdu-jo el concepto de "fosfatoc de alta energia" y el de "enlace fosfato de alta energia", que la función de estos compuestos en hioenergdtica se apreció con claridad.

Lipmann introdujo el slmbolo -@, para indicar la presencia del enlace fosfato de alta energia. El simbolo seiiala que cl grupo adherido al enlace, en la transferencia a un aceptor apropiado, traspasa la mayor cantidad de energia libre. Por esta razlin algunos prefieren el termino "potencial d e transferencia de griipo" al de "enlace de alta energia". Asi, el ATP cnntiene dos grupos fosfato de alta energia y el ADP contiene uno, mientras que el enlace fosfato del AMP (monofosfato de adenosina) es del tipo de baja energia ya que se trata de un enlace Cster normal (figura 1 2 4 ) .

El valor intermedio para Ia energía libre de la hidrólisis de ATP comparado con el de otros organofosfatos tiene un importante significado bioenergético
En el cuadro 12-1 se muestra la enesgla libre esthndar dc la hidrólisis de varios fosfatos importantes desde el punio de vista bioquirnico. Es posihEe obtener el c8lculo de la tendencia comparativa de cada uno de los grupos dc fosfatos para transferir energia a un aceptor adecuado, a partir de los AG"' de su hidrólisis (medido a 37 "C). En et cuadro se puede observar que el valor de la hidról isis del fosfato terminal del ATP divide la lista en dos grupos. Uno, de fosfatos de baja energía, e~jemplilicado por los fosfoksteres intermediarios de la gIucolisis, tiene valores AGO' menores que el del ATP, en tanto que en el otro grupo, designado fosfatos dc alta energia, el valores igual o misalto queel del ATP. Los componentes de este ultimo grupo, incluyendo al ATP y al ADP, por lo general son anhidridos (pos ejemplo, el I -fosfato del 1,3-difosfoglicerato), enolfosfatos (corno el fos.foenolpiruva2o)y fosfoguanidinas (por ejemplo, focfato de creatina, fosfato de arginina). La posicicin intermedia del ATP le permite desernpefiar una fi~ncián importante en la transferencia de energía. El alto cambio de energía libre en la hidrólisis de ATP

Cuadra 12-1. Energía libre estlindar de la hidr6lisis de algunos fosfatos orgánicos e import:incia bioc
-" --

-

-- A -A ~

l

rompuesto

Fosfocnolpiruvato CarbamillFisFato 1,3-Diti)sfi~gI liccrato f a glicerato) Fosfocreatin~

I'P -+ ADP
I'il '010S1iit0

A11I' + AMI , .+ .

-

Gl ucosa I-fo!sfato Friuctusa h-fosfato AFvil' G1ucosa 6-foi G1icerol 3-fo!

* P i, ortofosfatc

+ Valores de ATP y ntms rnbs tomados de Krebs y Krirnberg (1957). Los valores difieren entre investigadores según las situacioncs precisas bajo la cuales se efeclunron las mediciones.

I
Adenosina - O -

I

I

Fosfoenol piruvato

1,3-Difosfogliceratc

P-0-P-O-P-0-

o

II

o

11

o

II

Fosforilación oxidativa

Trifosfato de adenoslna (ATP)

Adenosina - O - P - O

I

a
o Adenosina

H

-

P- OII

1

O

-@-@

Disfosfato de adenosina (ADP)

I
Adenoctna - O - P

o
o Adenosina

11

- O-

- '@
Otras fosforilaciones,
activaciones y procesos endergbn~cos

Monofoslato de adenosina (AMP)

Figura 12-6. Estructuras del ATP, ADP y AMP que muestran la posición y el número de fosfatos de alta energía

(a)

//

\
Glucusa 1.6difosfato

Glicerol 3-fosfato Glucosa 6-fosfato

LOS FOSFATOS DE ALTA ENERG~A ACTUAN COMO LA "ENERGIA CIRCULANTE" DE LA CELULA
Como consecuencia de su posición media en la lista de energías libres cstándar de la hidrblisis (cuadro 12-1 ), el ATP puede actuar como donador de fosfato de alta energía para formar aquellos compuestos que están después de él en Ia lista. Asimismo, el ADP puede aceptar fosfato de alta energía proveniente de aquellos compuestos que estén en la parte superior del cuadro, para formar ATP, siempre y cuando se disponga de la maquinaria enzimlitica adecuada. En efecto, un ciclo ATPIADP conecta los procesos que generan *a las reacciones que lo utilizan (figura 12-7). As[, el ATP se consume y regenera de manera continua. Esto tiene lugar a una velocidad muy rápida, dado que el depósito ATP/ADP total es en extremo pequeno y suficiente para mantener un tejido activo s61o durante algunos segundos. Hay tres ruentes principales de -@, que toman parte en la conservación o captura de la energía:
1) Fosforilaci6n oxidativa: Ésta es la fuente los organismos cuantitativa mayor de -@en aerobios. La energía libre para conducir este proceso procede de la oxidacibn de la cadena

Figura 12-7. Función del uclo ATPlADP en la transferencia de fosfato de alta energia. Obdrvese que @no existe en un estado libre sino que es transferido en las reacciones que se muestran

respiratoria empleando O? rnolecular dentro de Ias mitocondriats (capítulo 13). 2) GIucblisis: Hay una t'ormacibn neta de dos @como resultado de la formación de Iactato a partir de una mol8cula de glucosa, generados en dos reacciones catalizadas por la fosfoglicerato cinasa y la piruvatocina, respectivamente (figura 19-2). 3) Ciclo del hcido cítrico: En el ciclo se genera un directamente en el paso catalizado pos la succinil tiocinasa (figura 18-3).

a,

Otro grupo de compuestos fosfhgenos representado en el cuadro actúan como formas de almacenamiento de fosfato de alta energía. En éste se incluye a la fosfocreatina, que existe en el músculo esquelético, en el com6n, los ecpermatomides y en el cerebro de los vertebrados, y la fosfoarginina, que s61o se encuentra en el músculo de los invertebrados. En condiciones fisiológicas, esta reaccilin permite que las concentraciones de ATP se conserven en el m.iisculo, aunque esté utilizindose rhpidamente, porque la fosfocreatina

I4O Biquímica de Harper

(Capítulo 12)

sirve como fuente de energía para la contraccion muscular. Por otra parte, cuando el ATP es abundante, su concentración puede funcionar como almacén de fosfato de alta energia (figura 12-8). En el muscrilo, se ha descrito una lanzadera de fosfato de creatina que traslada fosfato de alta energía de las mitocondrias al sarcolema y que actua como un amortiguador del mismo {figura 14-16). En el miocardio, este amortiguador puede ser importante para proveer una protección inmediata contra los efectos del infarto. Cuando el ATP actiia como donador de fosfato para formar aquellos compuestos de menor energia libre de la hídrólisis (cuadro 12-11, el grupo fosfato es convertido invariablemente en otro de baja energía, por ejemplo:

de la glucosa. Tal reaccihn es la hidrblisis del fosfato terminal del ATP.
(2) ATP
t ADP

+ P (AG"=

- 30.5 kJlmol)

Cuando (1) y ( 2 ) se acoplan en una reacción catalizada por la hexocinasa, la fosforilación de la glucosa avanza con facilidad en una reaccibn altamente exergónica que en condiciones fisiolbgicas dista mucho del equilibrio y, por tanto, es irreversible para propbsitos prhcticos.

Glicerol + Adenocina

-@ Glicerol -@ + Adenosina - @ - @

-) @a

Glucosa + ATP 9 -

Glucosa 6-fosfato + ADP (AG" - 16.7 kJlmol) =

Muchas reacciones de "activación" siguen este

El ATP permite el acoplamiento de reacciones desfavorables en el aspecto termodinámico con otras favorables
La energktica de las reacciones acopladas se describe con m& detalfe en las figuras 12-1 y 12-3. Tal reacción es la primera en la vía de glucólisis (figura 19-2), la fosforilación de la glucosa a glucosa 6-fosfato, que es endergónica por excelencia y que, en condiciones fisiológicas, podria no proceder en esa forma.
( 7 ) Glucosa +. Pi + Glucosa 6-fosfato+ H20 (AG" = + 13.8 kJlrnol)

modelo.

La adenilil cinasa produce la interconversión de nucleótidos de adenina
La enzima adenilil cinasa (miocinasa) esta presente en
la mayoria de las células. Cataliza la interconversion de ATP y AMP por un lado y de ADF por el otro:

ATP + AMP >-

f

2 ADP

Para que tenga lugar, la reacci6n debe estar acoplada con otra que sea más exergbnica que la fosforilacibn

Esta reaccibn tiene tres funciones:
1) Permite al fosfato de afta energia del ADP ser usado en la formación de A V . 2) Permite al AMP, formado como consecuencia de diversas reacciones de activacibn en las que interviene el A V , ser fosfosilade nuevamente para formar ADP. 3) Permite al AMP, el cual aumenta en concentracibn cuando el ATP se agota, actuar como una seflal metabblica (alostérica) para incrementar la velocidad de las reacciones catabólicas, las que a su vez llevan a la generacidn de rnhs ATP (capitulo 2 1).

'Ha

\

HIC-N

G-N

1
? 'a '

ADP

ATP

Coow

(dGO' -12.6 W/moll

Fasfato de creatina

-

c m
Creatina

Flgura 724. Transferencia de fosfato de alta energla entre el ATP y la creatina.

Cuando el ATP reacciona para formar AMP, se forman pirofosfatos inorgánicos (PPi)
Este proceso tiene lugar, por ejemplo, en la activacibn de los ácidos grasos de cadena larga:

Otros trifosfatos de nucleósidoc toman parbe en la transferencia de fosfatos de alta energia
Por medio de la enzima nucle6sido difosfatocinasa. los trifosfatos de nucleósidos semeiantes al A'TP, pero que contienen una base distinta de la adenina, pueden ser sintetizados a partir de sus difosfatos, por ejemplo:

ATP + COA SH + R C O OH
AMP

* PPi + R

COCCoA

DIFOSFATOClNASA

La reaccibn se acompafía de perdida de energia libre en forma de calor, lo cual asegura que la reaccibn de activación se desplace hacia la derecha; esto es facilitado ulteriormente por la escisión hidrolitica del PP, catalizada por la pirofosfatasa inorghnica, reacción que por sí sola tiene un elevado AGO' de -27.6 kJ/mol. Obsérvese que la activacidn por la ruta del pirofosfato produce una perdida de dos en lugar de uno que es lo que se pierde cuando se forman ADP y P,.

A fP + U P D> ATP + GDP
ATP + CP> D< -

ADP + UTP

(trifosfato de uridina) ADP + GPT
(trifosfato de guanosina) ADP + CTP (trifosfato de citidina)

a,

PIROFOSFATASA

Todos estos lxifosfatos intervienen en las fosfonlaciones en la célula. De modo similar, las nucleósido monofosfato cinasas específicas de cada nucleósido de purina o pirimidina, catalizan la formación de difosfatos de nucleósido a partir de los rnonofosfatos cosrespondientes.

La combinacibn de las reacciones anteriores hace posible que el fosfato pueda utilizarse de nuevo y que los nucleótidos d e adenina se intercambien (figura 12-9).

ATP + Nucleósido

-@

P

ADP

* Nucleósido -@ -@

Por tanto, la adenilil cinasa es una monofosfato cinasa especializada.

RESUMEN

I

ADP

Flgura 12-9. Ciclos del fosfato e intercambio de los nucledtidos de adanina.

1) Los sistemas biolbgicos son isotkrmicos en esencia y usan energia química para suministrar energía a los procesos de los seres vivientes. 2) Las reacciones son espontheas cuando hay pérdida de energia libre (AG es negativa); es decir, son exergiinicas. Si AG es positiva, la reaccibn tiene lugar 5610 si puede disponerse de energIa libre; es decir, es endergbnica. 3) Los procesos endergbnicos se efectúan sblo cuando se acoplan a procesos exerg6nicos. 4) El ATP actúa como la '"moneda circulante" o "corriente energktica" de la cdlula, transfiriendo energia libre derivada de sustancias con mayor potencial energético a las de potencial menor.

142 Bioqquimica de Hurper

(Capítulo IZ)

REFERENCIAS
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Oxidación biolóqica
V

Peter A. Mayes, PhD, DSc

y, en ocasiones, la administración de oxigeno a presiones altas (terapéutica con oxigeno hiperbarica) ha proEn química, Ia oxidacidn se define como la pérdida de electrones y la reducción como la ganancia de ellos; esto se ilustra mediante la oxidación del ion ferroso en férrico.
e- (electrón)

bado ser valiosa, aunque puede causar intoxicaciún.

'i

LOS CAMBIOS DE ENERG~A LIBRE PUEDEN EXPRESARSE EN TÉRMINOS DEL POTENCIAL REDOX
En las reacciones que implican oxidacián y reducción, el intercambio de energia libre es proporcional a la tendencia de las sustancias reaccionantes para donar o aceptar electrones. De este modo, además de expresar eI cambio de energía en términos de A G ' (capitulo 1S), ~ es posible, de manera análoga, expresarlo numkricamente como un potencial de oxidación-reduccibn o potencial redox (E'& F usual comparar el potencial A redox de un sistema (E,) contra el potencial del electrodo de hidrógeno, el cual, a pH O, se designa como 0.0 voltios. Sin embargo, para los sistemas biológicos es normal expresar el potencial redox (E',) a pH 3.0 en el cual el potencial del electrodo de hidrdgeno es -0.42 voltios. Los potenciales de oxidorreducci6n de algunos sistemas redox de interés especial en la fisiología de los mamíferos están indicados en el cuadro 13-1. La lista de potenciales redox que se muestran en el cuadro permite predecir la dirección del flujo de electrones de un par redox al otro.

En consecuencia, la oxidación está siempre acompaiíada por la reduccion de un aceptor de electrones. Este principio de oxidacibn-reducción se apiica del mismo modo a los sistemas bioquimicos y es un concepto importante en la comprensidn de la naturaleza de la oxidacion biolbgica. Se apreciar&que numerosas oxidaciones biologicas pueden tener lugar sin la participaciiin del oxígeno molecular, por ejemplo, las deshidrogenaciones.

IMPORTANCIA BIQMÉDICA
Aunque ciertas bacterias (anaerobias) sobreviven en ausencia de oxfgeno, la vida de los animales superiores depende de manera absoluta de su suministro. ES uso principal de este es en la respiracibn, que puede ser definida como el proceso por el cual las cdlulas obtienen energía, en forma de A V , de la reaccibn controlada del hidrbgeno con el oxigeno para formar agua. Además, el oxigeno molecular es incorporado a una variedad de sustratos por las enzimas designadas como axigenasas; muchos medicamentos, contaminantes ambientales y carcinbgenos quimicos (xenobibticos) son metaboli7ados por enzimas de esta clase, conocida como el sistema del citocromo P450. La administración de oxigeno puede salvar la vida de pacientes con insufíciencia respiratoria o circulatoria

LAS ENZIMAS QUE INTERVIENEN EN PROCESOS DE OXIPACIÓN Y R E D U C C I ~ N DENOMINAN SE OXIOORREDUCTASAS

En la siguiente descripcibn, las oxidorreductasas se clasifican en cuatro grupos: oxidasas, deshidrogenasas, hidroperoxidasas y oxigenasas.

(Capitulo 13j

Cuadro 13-1. .Algunos potenciales redox importaricia espm temas

de oxid acitin en
-

- -+"

I S

'

m

-

-

"nlt;nn

Figura 13-1. Oxldacibn de un metabolito catalizado por una oxidasa (A) que forma H20, ('B) que forma H202.

Citocromo I hiquinon l Citocromo

tocromo uaf. Contiene dos moleculac de hem, teniendo cada una un &tomode Fe, que oscila entre Fe" y Fe2- durante la oxidacibn y la reduccién. Además, están presentes dos aíomos de Cu, ligado cada uno con una unidad hemica.

LAS OXIDASAS UTILlZAN OXÍGENO COMO ACEPTOR DEL HIDRÓGENO
Las oxidasas catalirart la eliminacihn de hidrógeno be un sustrato iisando al oxígeno como aceptor de hidriigenoa. Forman agua o peróxido de: hidrbgeno como u n producto de la reacción (figura 13-1).

Otras oxidasas son flavoproteínas
Las ~nzimas flavoproteinicascontienen rnononucle6tido
de flavina (FMN,del ingl&s,flavin rnononucleotide) o dinucleliticlo dc flavina y adenina (FAD, del ingles, flavin adeninc u'inucleorrde) como grupos

Algunas oxidasas contienen cobre
Idacitocrorno oxidasa es una hemoproteínaamplíarnente distribuida en muchos tejidos, pues tiene cl típico grupo prostetico hem presente en la rnioglobulina, hemoglcibulina y otros citocromos (capitulo 7). Es el cornpcincnte terminal de la cadena de portadores rcspiratorios que se encuentran en las mitocondrias y resulta. de este modo, responsable de la reacción por la cual los electrones que provienen de la oxidación dc las moléculas del sustrato por las deshidrogenasac son transferidos a su aceptor final, e1 oxígeno. La enzima e5 envenenada por el monbxido de carbono, el cianuro y el bcido siilfhídrico. TamhiCn se le ha llamado ci~ocromo A1 principio, se pensó que el citocromo a a,. y el citocrorno a eran compuestos separados, dado 3 que cada uno tiene un espectro distinto y propiedades diferentes con respecto a los efectos del monóxido de carbono y el cianuro. Estudios mhs recientes demuestran que los dos citocromos estiin combinados con la misma proteína y el complejo se conoce como ci-

*

Algunas veces el tkrmino "oxidasa" se utiliza indistintamente para nombrar n todas las enzimas que catalizan reacciones en que interviene oxlgeno rnolecular

prost&icos. El FMN (figura 52-2) y FAD (figura 52-31 se forman en el cuerpo a partir de la vitamina rihoffavina (capitulo 52). Por lo general, EMN y FAD están unidos estrcchamente -pero no por covalencia- a su respectiva proteina, apoenzima. Numerosas enzimas flnvoproteinicas contienen uno o mAs metales como cofactores esenciales y se conocen como metaloflavoproteinas. Las enzimas que pertenecen a este grupo de oxidasas incluyen a la ~ a m i n a a c i d o oxidasa, una enzima ligada al FMN que se encuentra en el riñiin con especificidad general para la desaminacibn oxidativa de los L-an~inoicidosque se encuentran en la naturaleza. La xantina oxidasa tiene una extensa distribución, pues se encuentra en la leche, en el intestino delgado, el rirlon y el hígado. Contiene molibdeno y desempefla una fincibn importante en la conversión de las bases púricas en ficido úrico (capitulo 36). Es de particular irnportaicia en el higado y los tifionec de las aves, las cuales excretan hcido úrico como el principal producto final nitrogenado, no sblo del metabolismo de las pwinas, sino también del catabolismo de las protetnas y aminodcidos. La aldehido deshidmgenasa es una enzima ligada al FAD que se encuentra en el hígado de los marniferos. Es una metaloflavoproteina que contiene molibdeno y hierro no h6mico la cual actúa sobre aldehidos y sustratos N-heterociclicos. La glucosa oxidasa, una enzima FAD especifica preparada a partir de algunos hongos, es de interés ya que se emplea para deteminar glucosa.

Oxidación biológica

145

Los mecanismos de oxidacibn y reducciiin de estas enzimas son complejos. Sin embargo, la evidencia seaala que la reduccihn del anillo de isoaloxacina se efectúa en dos pasos por la via de una serniquinona (radical libre) intermediaria (figura 13-2).

AH2 ,Red)-\/D

PoFtador
(OX,

Portador-H2

O DEStIIDROGENASA

ESPECIFICA A PARA

DESHIDROGENASA ESPECIFICA PARA B

LAS DESHIDROGENASAS PUEDEN USAR OXIGENO

NO

Figura f3-3. Oxidación de un metabolita catalizado por deshidroaenacas amaladas

Son numerosas las enzimas de esta clase. Llevan a cabo dos funciones principales:

1) Transferencia de hidrdgeno de un sustrato a otro en una seaccibn de oxidacihn-reduccibn acoplada (figura 13-3). Estas deshidrogenasas son especificaspara sus sustratos, pero a menudo utilizan la misma coenzima o portador de hidrogeno qiie otras deshidrogenasas por ejemplo NAD'. Cuando las reacciones son reversibles, estas propiedades permiten que los eqiiívalentes reductores se transfieran con libertad dentro de la cklula. Este tipo de reacción, que habilita a un sustrato para ser oxidado a expensas de otro, tiene utilidad particular para permitir los procesos oxidativos en ausencia de oxígeno, como sucede durante la fase anaerobia de la gIuchlisis (figura 19-2). 2) Como componentes m una cadena respiratoria de transporte de electrones del sustrato al oxigeno (figura 13-43,

Muchas deshidrogenasas dependen de coenzirnas de nicotinamida
Muchas deshidrogenasas son especiticas para dinucleótido de adenina y nicotinamida (NAD', del ingles, nicotinamideadenrne dinucleoride)o para fosfato de dinucieótido de adenina y nicotinamida (NADP', del inglés, nicotinamide adenine dhucleolide phosphare) como coenzimas. Sin embargo, algunas deshidrogenasas pueden usar en forma in-

distinta NAD' o NADP". Los NAD' y NADP' son formados en el cuerpo a partir de la vitamina niacina (figura 5 2 4 ) . Las coenzirnas son reducidas por el sustrato específico de la deshidrogenasa y oxidadas de nuevo por un aceptor de electrones adecuado (figura 13-5). A diferencia de FMN y FAD', tienen la peculiaridad de disociarse libremente y de modo reversible de sus apoenzimas respectivas. Por lo general, las deshidrogenasas ligadas al NAD cataban reacciones de oxidorreducciiin en la vía oxidativa del rnetaboIismo, particularmente e n la glucólisis, en el ciclo del Acido citrico y en la cadena respiratoria de la rnitocondria. Las deshidrogenasas ligadas al NADP se encuentran característicamente en la síntesis reductora, como en la vía extrarnitocondrial de la slntesis de los Acidos grasos y de los estecoides. También se encuentran como coenzimas de las deshidrogenasas en la vfa de la pentosafosfato. Por otro lado, se ha descubierio que algunas deshidrogenasas dependientes de las coenzimas de nicotinamida contienen cinc, de modo remarcable la alcohol deshidrogenaca del higado y la gliceraldehido-3-fosfatodeshidrogenasa del músculo esquelktico. No se considera que los iones cinc participen en la oxidacibn y reducción.

Otras deshidrogenasas dependen de la riboflavina Los grupos flavínicos relacionados con estas deshidrogenasas son semejantes a los FMN y FAD que se presentan en las oxidasas, Están, en gencral, más estrechamente unidas a sus apoenzimas que las coenzimas

Figura 13-2. Oxidorreduccibn del anillo isoaloxacina en los nucléotidoc de Ravina

146

Bio~uiminica Harper de

(Capitulo 13)

Figura 1 3 4 . Oxidacibn de un metabolito por deshidrogenasas y, finalmente, por una oxidasa en una cadena respiratoria.

de nicotinamida. La mayoría de las deshidrogenasas anaerobias ligadas a la riboflavina están implicadas en el transporte de electrones en (o hacia) la cadena respiratoria (capitulo 14). La NADH desbidtogenasa es un miembro de la cadena respiratoria que actliacomo un transportador de electrones entre el NADH y los componentes mhs electropositivos (figura 14-3). Otras deshidrogenasas, como la succinato deshidrogenasa, la acil-COAdeshidrogenasa y la glicerol-3fosfato deshidrogenasa mitocondrial transfieren equivalentes reductores de manera directa desde el sustrato a la cadena respiratoria (figura 14-4). Otro papel de las deshidrogenasas dependientes de la flavina es deshidrogenar el lipoato reducido (dihidrolipoil deshidrogenasa), un intermediario en la descarboxilacibn oxidativa del piruvato y el alfa cetoglutarato (figura 14-4). En este caso particular, debido al bajo potencial redox, la flavoproteína (FAD} actiia como un portador de electrones desde el lipoato reducido al

NAUt (figura 19-5). La flavoproteína que transfiere electrones es un transportador intermediario de electrones entre la acil-COA deshidrogenasa y la cadena respiratoria (figura 144).

Los citocromos pueden considerarse también como deshidrogenasas
Excepto por la citocromo oxidasa (descrita previamente), los citocromos están clasificados como deshidrogenasas. Su identificación y estudio se facilitan por la presencia, en cl estado reducido, de banda5 características de absorción, 1% cuales desaparecen cn la oxidación. En la cadena respiratoria, intervienen como portadores de electrones desde las flavoproteinas por un lado hasta la citocromo oxidasa por otro (figura 14-4). Los citocromos son hemoproteinas que contienen hierro, en las cuales el &romode este metal

EzEcl
ESPECIFICA PARA 6

Figura 13-5. Mecanismo de oxidación y reduccibnde las coenzimac de nicotinamida Hay estereoespecificidadalrededor de la posicibn 4 de la n~cotinamida cuando es reducida por un sustrato AH2. Uno de los átomos de hidrbgeno es removido del sustrato como un n~icleo hidrágeno con dos electrones (ion hídndo, H 2 y es transferido a la posicidn 4, donde puede de adherirse en las posiciones A o B de acuerdo a la especificidad determinada por la deshidrogenasa particular que cataliza la reaccidn. El hidrbgeno remanente del par removido del cuctrato se conserva libre como ion hidrbgeno.

Oxidación hiolh~ica 147

oscila entre Fe3' y Fe2+durante la oxidación y la reducciirn. Varios citocromos identificables se encuentran en la cadena respiratoria, es decir, los citocromos b, CI, c, a y al (citocromo oxidasa). De estos, sólo el citocromo c es soluble. Además de la cadena respiratoria, los citocromos se encuentran en otros sitios, por ejemplo, el retículo endoplhrnico (citocromo P450 y Bs), las células vegetales, bacterias y levaduras.

La catalasa utiliza a l peróxido de hidrogeno como donador y como aceptor de electrones
La catalasa es una hemoproteína que cantíene cuatro grupos hem. Ademfis de poseer actividad peroxídfisica, es capa? de usar una molécula de H20?como sustrato donador de electrones y otra molécula de H202 como oxidante o aceptor de electrones.

LAS HlDROPEROXlDASAS 'USAN PEROXIDO DE HIDRQGENO U OTRO PERÓXIDO ORGANICO COMO SUSTRATO
Dos tipos de enzima entran en esta categoría: las peroxidasas y las catalasas. Estos dos tipos se encuentran en animales y en vegetales. Las hidraperoxidasas protegen al cuerpo de los peMoxidos nocivos. La acumulación de perdxidos pueden conducir a la generación de radicales libres, que a su vez destruyen membranas y son causa posible de cáncer y aterosclerosis (capítulos 16 y 53 para una descripción y resumen de los mecanismos de defensa contra los radicales librcs).

1CATALASA --A
En la mayoría de las condiciones in vivo, la actividad peroxidasica de la catalaca parece ser favorecida. La catalasa se encuenm en sangre, médula bsea, mucosas, rifiiin e higado. Se supone que su funcidn es la desmiccibn del: peróxido de hidrógeno formado por la accibn de las oxidasas. Los microcuerpos o peroxisomas se encuentran en numerosos tejidos incluyendo el hlgado. En ellos abundan las oxidasas y la catalasa, lo cual sugiere que puede haber alguna ventaja biológica al agrupar a las enzimas que producen H 2 0 2 con la enzima que la destruye (figura 2 3 4 ) . Ademhs de las enzimas peroxisomales, los sistemas mirocondriales y microsómicos de transporte de electrones asi como la xantina oxidasa se deben considerar como ruentes de
H202.

Las peroxidasas reducen peróxidos usando varios aceptores de electrones
Aunque consideradas originalmente como enzimas vegetales, las peroxidasas se encuentran en la leche y en leucocitos, plaquetas y otros tejidos que intervienen en el metabolismo eicosanoide(capítulo 25). El grupo prostético es el protohem, el cual, a diferencia de la mayoria de las hemoproteinas, esta débilmente unido a la apoproteina. En la reacción catali~adapor la peroxidasa, el perdxido de hidrdgeno es reducido a expensas de varias sustancias que actúan como dondores de electrones tales come el ascorbato, las quinonas y el citocromo c. La reacción catalizada por la peroxidasa es compleja, pero la reaccibn global es como sigue:

LAS OXlGENASAS CATALliAN LA TRANSFERENCIA DIRECTA Y LA INCORPORACI~N OX~GENO DE A UNA MOLÉCULA DE SUSTRATO
Las oxigenasas intervienen en la síntesis o la degradacibn de numerosos tipos diferentes de metabolitos, más bien que m las reacciones que proveen de energía a la dlula. Las enzirnas de este gmpo calalizan la

1

PEROXIOASA

1

A'H,
1

A 1

En los eritrocito&y otros tejidos, la enzima glutatión peroxidasa, que c o n t i e n e selenio c o m o g r u p o prostktico, cataliza la destrucción del HzOz y los hidroperbxidos lipidicoc por el glutatibn reducido, protegiendo a los Iípidos de la membrana y a la hemoglobina contra la oxidacibn por los peróxidos (capítulo 22).

Figura 13-6. Función de la catalasa en la destruccibn de peroxido de hidrogeno.

148

Bioquimica de Harper

(Capítulo 13)

incorporacibn del oxigeno a una molécula de sustrato. Esto se efectiia en dos etapas: 1) la fijación del oxigeno al sitio activo de la enzima y 2) la reacción en la que el oxígeno unido se reduce o es transferido al sustrato. Hay dos subgrupos de oxigenasas:

enzimhticas conocidas ~olectivamente como ciclo de la hidroxilasa (figura 13-8).

~~ki*i,l;
Fármaco-H

+ Oz + 2 ~ e +~2-* H t
(P450)

Las dioxigenasas: incorporan los dos átomos de oxigeno molecular al sustrato
La reacción básica es:

F a m i a c o 4 H + HzO + Xe3' (P450)

Ejemplos de ese tipo incluyen las enzimas que contienen hierro, por ejemplo, la homagentisato dioxigenasa (oxidasa) y la 3-hidroxiantranilato dioxigenasa (oxidasa) de la fracción sobrenadante del higado, y las enzimas que utilizan hem como grupo prostktico, por ejemplo, la btriptófano dioxigenasa (triptbfano pirrolasa) del hígado.

Entre los f i m a c o s metabolizados por este sistema están el benzopireno, la arninopirina, anilina, morfina y benzotelarnina. Muchos fármacos como el fenobarbital tierieri la capacidad de inducir la formación de enzimas rnicrosOmicas y de citocromo P450.

Las monooxigenasas (oxidasas de función mixta, hidroxilasas): incorporan sólo un átomo de oxígeno al sustrato
El otro átomo de oxígeno es reducido a agua, por lo que es necesario un donador adicional de elecirones o cosustrato.

Los sistemas mitocondriales de la monooxigenasa del citocromo P450 catalizan hidroxilaciones de esteroides
Estos sistemas se encuentran en tejidos esteroidogenicos como la corteza suprarrenal, los testlculos, los ovario y la placenta e intervienen en la biosíntesis de las hormonas esteroides a partir del colesterol (hidroxilaci6n en CZZ CZO la separación de la cadena lateral y en y en las posiciones 1 1P y 18). Los sistemas renales catalizan las hidroxilaciones la- y 24- del 25hidroxicolecaIciferoI y el hígado cataliza Ia hidroxilaci6n en 26- en la biosíntesis de Acidos biliares. En la corteza suprarrenal, el citocromo P450 mitocondrial es seis veces mlis abundante que los citocromos de la cadena respiratoria.

Los sistemas microsómicos de la monooxigenaca del citocromo P450 son importantes para la hidroxilacion de muchos fhrrnacos
Estas monooxigenasas se encuentran en los microsomas del higado junto con el citocromo P450 y el

LA TOXICIDAD DEL OX~GENO PUEDE DEBERSE AL RADICAL LIBRE SUPERÓXIDO
La potencial toxicidad del oxigeno, se ha atribuido por tanto a la formación de H202.Sin embargo, recientemente, la facilidad con la que el oxigeno puede ser

citocromo bs. Tanto el NADH como el NADPH donan equivalentes reductores para la reducci6n de estos citocromos (figura 13-71, los cuales son oxidados a su vez por sustratos en una serie de reacciones

NADH
Amino oxidasa. etdtem

\
/
+

FlavoPr~telna2

Flavopmteina3

NADPH

Flavoproteina~

/l-

-

CNEstearil-COA desaturasa

Cit bs

Cit P450

A
+

Hidraxilaabn

Figura 13-7. Cadena de transporte de electrones en los microsomas. El cianuro (CN-) inhibe e paso indicado l

NADPH t H'

r A-OH

o,,

Figura 13-8. Ciclo de 3 citocromo P450 hidraxilasa en los microsomas El sistema mostrado es tipico de las hidroxilasas de a esleroides de la corteza suprarrenal. La citocromo P450 hidroxrlasa microsórnica del higado no requiere de la sulfoproteina ferrica Fe2S2 El rnonoxido de carbono (CO) rnhibe el paso indicado

rcdiicido en los te-jidos al radical superóxido libre (Oz5} la existencia de una supcróxido dismutasa y en los rnicroorganisrnns acrobios (aiinque no en los aiiaerobios obligados) ha sugerido que latoxicidad del oxigcnri cs dcbida a su conversibn e n superóxidn. Se origina superóxido cuando las flavinas reducidas -por eiernplo. presentes en la xantina deshidrogenasa- son reoxidadas de modo univalente por el oxigeno molecular.

El superoxido puede reducir cl citocromo c oxidado
0' 2

+ Cit c ( ~ e ~4)0 2 + Cit c (Fe2+) '

o ser eliminado por la prcsencia de la enzima especifica superhxido dismutasa.

0 2 ' unido al citocromo f40 es un intermediario en la '5 activación del oxigenri en las reacciones de hidroxilación (figura 13-8). La runciiin dc Iri superhxidri disinutasa parece ser la de proteger a los microurganismos aerobios contra los efectos deletéreos potenciales del siiperoxído. La enzima se encuentra en varios cornpartimicntos difer~ntes de la célula. La enzima citosólica, está compuesta de do?subunidades similares que contienen cada una un equivalente de Cu" y Zn2', en tanio rlue la enzima mitocondrial contiene Mn". por lo que es similar a la enzima que se encuentra en la bacteria. Bstc dcscubrimiento apoya la hiphtesis dc que la? mitocondrias han evolucionado a partir dc uii procariota que entrb en simbiosis con un protoeucariota. La dismutasaesta presentc cn todos los principales te-jidos acrvhios. Si bien la exposición de los animales a una atmbsfera de 100% de O2 causa un incremento adaptativo de la enzima, particularniente en loc pulmones, la exposición prolongada ocasiona daRn puIrnonar y muerte. Los antioxidantes, por ejemplo, el alfa tocoferol (vitamina E), actúan como recolectorcs d e radicales Iibrcs y reducen la toxicidad del oxígeno (capitulo 53).

En esta ieaccicín el super6xido actúa como oxfdantc y como reductor; los efectos quimicos cn los tejidos son amplificados por las reacciones de las cadenas con i-ndicalcs libres (capítulo 16). Se ha propuesto que el

RESUMEN
1) En los sistemas biológicos, como en los qziímicos, la oxidacihn (perdida de electrones)

1SO

Rioquimica de Harper

(Capilulo 13)

se acompafia siempre con la reduccibn de un aceptor de electrones. 2) Las oxidorreductasas se clasifican en cuatro grupos: oxidasas, deshidrogenasas, hidroperoxidasas y oxigenasas. 3) Oxidasas y deshidrogenasas tienen diversas funciones en el metabolismo, aunque las dos clases de enzimas desempeiian actividades importantes en la respiración.

4) Las hidroperoxidasas protegen al cuerpo contra Iesion por radicales libres, mientras que las oxigenasas realizan la hidroxilaci6n de medicamentos. 5) La toxicidad del oxígeno puede ser causada por el radical libre super~xido.La enzima específica super6xido dismutasa protege a los tejidos del superóxido. I

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Cadena respiratoria y fosforilación oxidativa
Peter A. Mayes, PhD, DSc

La mitocondria ha sido llamada apropiadamente, la "casa de fuerza" de la célula, puesto que es dentro de este organelo en donde se captura la mayor parte de la energia derivada de la oxidacihn respiratoria. El sistema de las rnitocondrias donde la respiración se acopla para la generacion del Intermedio de alta energía, ATP, se denomina fosforilaci6n oxidativa.

La fosforilaci6n oxidativa capacita a los organismos aerobios para aprovechar la energía libre disponible de sustratos respiratorios en una proporción mucho mayor que los organismos anaerobios. La teoría quimiosmóiics ofrece una perspectiva de la forma en que esto ocurre. Cierto número de medicamentos (por ejemplo, amobarbital), y venenos (por ejemplo, cianuro y monbxido de carbono}, inhiben la fosforilación oxidativa, por lo general con consecuencias letales. Se han informado diversos defectos rnitocondriales hereditarios que comprenden componentes de la cadena respiratoria y de la fosforilación oxidativa. Los pacientes presentan miopatia, cncefalopatia y con frecuencia presentan lactacidosis.

en pliegues o crestas y una matriz dentro de la membrana intema (figura 14-1). La membrana externa puede removerse por tratamiento con digitonina y se caracteriza por la presencia de monoamino oxidasa, acil-COA sintetasa, glicerofosfato aciltransferasa y fosfolipasa Az. En el espacio intermembrana se encuentran adenilil cinasa y creatina cinasa. El fosfolipido cardioiipina se concentra en la membrana intema. Las enzimas solubles del ciclo del icido citrico y las enzimas de la beta oxidación de Acidos grasos se Iocal izan en la matriz, requ irikndose mechnisrnos para el transporte de metabolitos y nucleótidos a travds de la membrana intema. La succinato deshidrogenasa se ubica en la superficie interior de la membrana interna, donde transporta equivalentes reducidos por las enzimas de la cadena respiratoria, siendo estas ultimas los constituyentes principales de la membrana interna. Ida 3-hidroxibutirato deshidrogenasa se fija t a m b i h en eI lado de la matriz de la membrana interna. La glicerol3 -fosfato deshidrogenasa se encuentra en la superficie exterior de la membrana interna, lugar adecuado para participar en la lanzadera de glicerofosfato(figura 14-1 S).

LA CADENA RESRlRATORlA COLECTA Y OXIDA EQUIVALENTES REDUCTORES
Toda la energia útil liberada durante la oxidacidn de ácidos grasos, aminoheidos y virtualmente toda la que proviene de la oxidaci6n de los carbohidratos se vuelve disponible dentro de las rnitocondrias en forma de equivalentes reductores (-H o electrones). Las mitocondrias contienen la serie de cataliadores conocidos como la cadena respiratoria que colectan y transportan equivalentes reductores y los dirigen a su reacción final con el oxígeno para formar agua. Tambikn está en las mitocondrias la maquinaria que atrapa la ener-

ENZIMAS ESPEC~FICAS ACTÚAN COMO MARCADORES DE LOS COMPARTIMIENTOS SEPARADOS POR tAS MEMBRANAS MITOCONDRIALES
Las mitocondrias tienen una membrana externa permeable a la mayor parte de rnetabolitos, una membrana interna con permeabilidad selectiva y moldeada

MATRIZ

Particula submitocondrial formada por fragmentos de membrana interna

Figura 14-1. Estructura de las membranas mitocondriales Las partículas submitocondrialesestán "al revés" y permiten el estudio del sistema encerrado en la membrana. donde las subunidades fosforilantea estan en el lado externo.

gi'a libre producida como fosfato de alta energia. Éstas también contienen los sistemas enzimiiticos responsables de la producción de la mayor parte de los equivalente? reductores en primer lugar, es decir, las

enzimas de la beta oxidación y del ciclo del acido citrico. Este último es la via mctabólica final corniin para E oxidacion de todos !os alimentos principales. a Estas interrelaciones se muestran en la figura 14-2.

ALIMENTO

Lipidos -

Carbohidratos

- 1

1

bcidos grasos

+

2

P O
E
, A

Glicerol

, beta-Oxidacibn \ --- - - - - - - - - \

ATP

t
4 -

$

h

Glucosa,etc

Acetil-COA

:o

/

. '

I I I
MITOCONDRION
I

ADP

l

I

I
Fuentes extramitouindrialesde

equivalentes reductores
Figura 14-2. Funcibn de la cadena respiratoria mitocondrialen la conversión de energia de los alimentos a ATP La oxidación de los nutrientes principales genera equivalentes reductores (2H) que son capturados por la cadena respiratoria para la oxidac16ny formación acoplada de ATP

Cadena respiratoria y fosforilacih~l oxidutrvu

153

Los componentes de la cadena respiratoria están colocados por orden creciente de su potencial redox
Los componentes principales de la cadena respiratoria se muestran en la figura 1 4-3. Los electrones o el hidrogeno fluyen a travÉs de la cadena de manera escalonada desde los componentes más electronegativos al oxigeno mas electropositivo, a traves de una expansión redox de 1.1 voltios dcl NAD'/NAUH al 0?/2Hz0 (cuadro 1 3-1). Ida cadena resuiratoria de las rnitocondrias está formada por cierto número de portadores redox que va desde los sistemas de deshidrogenasa unidos aNAD, flavoproteinas, citocromos, hasta llegar aI oxigeno molecular. No todos los sustratos esthn ligados a la cadena respiratoria a través de deshidrogenasas específicasde N AD: algunos, debido a que sus potenciales rcdox ron mhs positivos (por ejemplo, furnaratolsuccinato, cuadro 13-1 ), esthn ligados directamente a las deshidrogenasas flavoproteinicas, las cuales a su vez esthn ligadas a los citocromos de Ia cadena respiratoria (figura 1 4 4 ) . En aAos recientes se ha aclarado que se encuentra otro poriador adicional en la cadena respiratoria que une las flavoproteinas con ei citocromo h, el miembro de la cadena de citocromos de mBs bajo potencial redox Esta sustancia, que ha sido IIamada uhiquinana o Q (cwnzima Q; figura 14-51, existe en las miiocondrias en fuma de quinona oxidada en condiciones acrobias y en la forma de quinol reducido en condiciones anaerobias. La coenzima Q es un constituyente de los Iípidos mitocondriales, siendo los otros lipidos predominantemente fosfolipidos que conslituyen parte de la membrana rnitocondrial. La coenzima Q tiene una estructura muy semejante a la de las vitaminas K y E (capitulo 53). También es semejante a la plastoquinona que se encuentra en los cloroplastos. Todas estas sustancias se caracterizan por la posesi~nde una cadena lateral poli-isoprenoide. En las mitocondrias hay un gran exceso estequiométrico de Q coinparado con otros miembros de la cadena respiratoria; esto es compatible con Q actuando sobre un coinponente mhvil de la cadena respiratoria que recoge cquival entes reductores fijados a los complejos de flavoproteinas y los pasa a los citocromos.

Un componente adicional que se encuentra en las preparaciones de la cadena respiratoria es Ia proteína fierrosulfurada (FeS: hierro no himico), el cual esta relacionado con las flavoproteinas (metaloflavoproteínas) (figura 1 4 4 ) y con el citocromo h. Se cree que el azufre y el hierro intervienen en el mecanismo de oxidorreducción entre la flavina y la coenzima Q, que incluye el cambio de un sor0 e-; el atomo de hierro experimenta oxidorreduccibn entre Fe2' y Fe3 . El punto de vista actual acerca de los componentes principales de la cadena respiratoria se muestra en la figura 1 4 4 . En la terminal electronegativa de la cadena, las e n z i m a deshidrogenasas catali~an transla ferencia de electrones desde los sustratos hasta el NAD de la cadena. Existen varias diferencias en la manera como esto se IIeva a cabo. Los alfa cetohcidos pirúvico y cetoglutarico tienen sistemas compIejos de deshidrogenasas que implican al lipoato y al FAD antes de1 paso de electrones al NAD de la cadena respiratoria. La transferencia de electrones de otras deshidrogenasas como las de L (+)-2-hidroxiacil-COA. D (-)-3-hidroxibutirato, prolina, glutamato, malato e isocitrato, al parecer se acoplan directamente con el NAD de la cadena respiratoria. El NADH reducido de la cadena respiratoria es a su vez oxidado por la enzima metaloflavoproteinica NADH deshidrogenasa. Esta e n ~ i m contiene FeS y a F M N , se encuentra unida con firmeza a la cadena respiratoria y pasa equivalentes reductores a Q. La Q es tambikn el punto de acopio en la cadena respiratoria para los equivalentes reductores derivados de otras sustancias que estan unidas directamente a la cadena respiratoria a través de las flavoproteína deshidrogenasas. Estos sustratos son succinato, colina, glicerol 3-fosfato, sarcosina, dimetilglicina y acil-COA (figura 1 4 4 ) . El componente flavina de todas estas deshidrogenasas parece ser el FAD. Los electrones fluyen desde Q a través de la serie de citocromos que se muestra en la figura 14-4, hasta el oxigeno molecular. Los citocromos están arreglados en orden creciente de su potencial redox. El citocromo terminal ua, (citocromo oxidasa) es el responsable de la combinacibn final de los equivalentes reductores con el oxigeno rnolecular. Se observa que este sistema de enzima contiene cobre, un compo'

A

NADH

2Fs2'

%O*

Figura 1 4 3 . Transporte de equivalentes reductores a traves de la cadena respiratoria.

Prolina
3-Hidr~~ia~il-Cd 3-Hidroxibutirato Glutamato
Malato
Piruvato

Succinato Colina

Isocitrato

FP (FAW FeC

i

Cit b
FeS

--t

Cit CI

-

Cit c

Cit aa3

Cu

FP (FAD)

'

FP (FTE)

FP
FAD)

t

Acil-COA Saruisina Dimetilgliuna

t

FTE Flavoproteina transferida de electrones Fp Flavoproteína Q Ubiquinona Cd citocromo

Flgura 1 4 4 . Componentes de la cadena respiratoria en las mitomndrias mostrando las puntos de reunibn para las equivalentes reductores a partir de los sustratos importantes. FeS ocurre en la secuencia del lado del 0 de Fp o de Cit b 2

nente dc algunas oxidasas. La citocromo oxidasa tiene una afinidad muy elevada por el oxigeno, lo cual permite que la cadena respiratoria funcione a velocidad mkirna hasta que virtualmente se ha agotado el oxigeno en el tejido. Dado que &sta es una reaccidn irreversible (la única en la cadena), le imparte dirección al movimiento de los equivalentes reductores en la cadena respiratoria y a la producción del ATP a la que está acoplada. La organizacibn estructural de la cadena respiratoria ha sido un tema de considerable especulaci6n. De importancia es el descubrimiento de proporciones molares casi constantes entre los componentes. Funcional y estructuralmente, los componentes de la cadena respiratoria se encuentran en la membrana interna de la mitocondria corno cuatro complejos de la cadena respiratoria proteína-llpido que se extienden en la

membrana. El citocromo c es el unico citocrom~ soluble y al igual que Q, parece ser el componente m i s mbvil de la cadena respiratoria que conecta a los complejos fijados (figuras 14-7 Y 14-10).

LA CADENA RESPIRATORIA APORTA LA MAYOR PARTE DE LA ENERGIA OBTENIDA DEL METABOLISMO
El ADP es una molécula que captura, en forma de fosfato de alta energia, algo de la energia libre resultante de los procesos catabblicos y que corno ATP pasa esta energia para impulsar aquellos procesos que la requieren. Asi, el ATP ha sida llamado la "liqujdez" energética de la cdlula (figura 12-7).

Forma totalmente oxldada o quinbnica

Forma semiquindnica (radical libre)

Forma reducida e qulndllca (hidroquinona)

Figura 14-5. Estructura de la ubiqulnona (0). número de unidades isoprenoides el cual es 10 veces mayor en animales, n= es decir, QIO.

Cadena resprratoriay f~~forilacrón oxidativa

1j5

Gis
\

Pr

Figura 14%. El complejo hierro-azufre-proteína (Fe&) @, azufre lábil a los hudos. Pr, apoproteina, Crs. residuo de cisteina. Algunas proteínas fierrosulfuradas contienen dos Btornos de azufre y de hierro (FezS2).

Hay una capturaneta de dos grupos fosfato de alta energia en las reacciones glucoliticas (cuadro 19-1) que equivalen aproximadamente a 103.2 kJlmol de gfucosa.(ln vivo, el AG para la síntesis de ATP a partir de ADP se ha calculado que es de aproximadamente 5 1.6 kJ/mol, tomando en cuenta que este valor es a partir de las concentraciones actuales de los reactivos presentes en la cilula. Ésta es mayor que el AGQ'para la hidrolisis de ATP como se muestra en el cuadro

12-1, el cual se obtuvo a partir de una concentracibn estándar de 1.0 mol/L). Debido a que un m01 de glucosa genera aproximadamente 2780 kJ en la combustibn completa, la energia capturada por fosforilación en la glucólisis es insignificante. Las reacciones del ciclo del ácido cítrico, la via final para la oxidacibn completa de la glucosa, incluyen s61o un paso de fosforilaci6n, la conversi6n de succinil-COA en succinato, lo cual permite la captura de dos fosfatos de alta energía m& por m01 de glucosa. Todas las fosforilaciones descritas hasta ahora ocurren al nivel del sustrato. E[ examen de las mitocondrias intactas respirando, revela que cuando los sustratos son oxidados por la r í a de las deshidrogenasas ligadas al NAD y la cadena respiratoria, se incorporan 3 mol de fosfato inorgáslico al ADP para formar 3 m01 de ATP por medio mol de O2consumido, es decir, la relacibn P:O = 3 (figura 14-7). Por otro lado, cuando un susirato es oxidado por la vía de una deshidrogenasa Iigada a flavoproteína, s61e se forman dos moléculas de ATP, es decir, P:O = 2. Estas reacciones se conocen como fosforilacidn oxidativa al nivel de la cadena respiratoria. Tomando en consideración las deshidroger&iones en la r í a del catabolismo de la glucosa, tanto en la gludlisis como en el ciclo de! &ido cftrico, más las fosforilaciones al nivel del sustrato, es posible ahora das cuenta de al menos 68% de la energía libre que resulta de la combustión de glucosa, capturada en la forma de fosfato de alta energia. Es evidente que la cadena respiratoria es responsable de una proporclbn importante del total de ATT formado.

Maloneto

Complejo II
Suocinato

TTFA
BAL
Antimiuna A

H2S

CO
Complejo IV

Complejo r

-I

FMN, FeS

De=coliladores

4
1

Piencidina A ArnobarbAl
Rotenona
I

esac copla dar es

ADP + PI

ATP

ADP

; PI

T+

Oligomlcina

ATP

ADP I PI

4
ATP

Flgura 14-7. Sitios propuestos de inhibiUbnOds la cadena respiratoriapor medicamentos, compuestos qulmieos y antibidtieds especlfims. Los sitios que al parecer apoyan a la fosforilación estan indicados. BAL, drnercaprol: T F A es un agente quelante del hierro; wrnplejo I , NAOH ubiquinona oxidorreductasa; complejo II, sucunato:ubiquinona oxidorreductasa; complejo III, ubiquinol~ferricitocromo oxidorreductasa; mmplejo IV, ferrocitocromo:oxigeno oxidorreductasa. Las demhs abreviaturas son c iguales a tas de la figura 1 4 4 .

El control respiratorio asegura un suministro constante de ATP
La velocidad de recpimci6n de las mitocondrias se puede controlar por la concentración de ADP. Esto se debe a íluc !a oxidacihn y la fosforilacibn están íntimamente nc,opladas; cs decir. la oxidaciiin no puede proceder por la vía de la cadena respiratoria sin la fo~forilacion ~oncornitantc ADP. Chance y Williams han definido del cinco condiciones que pueden controlar la velocidad dc respiraciOn en las mitocondrias (cuadro 14-1 ). En general. la mayor parte de las células en estado de repriso se encuentran en el cstado 4, sicndo larespimcion controlada por la disponibilidad del ADP. Cuando se efectúa trabajo, el A'l'P es convertido en ADP, pemitiendo que ociirra m i s respiración, lo cual a su vez reabastece el depósito de A'I'P (figura 1 4 4 ) . Pareceria que eii ciertas condiciones la concentmcibn de fosfato iiiorgánico podria afectar tambiCn la velocidad de funcionamicnto de la cadena respiratoria. Conforme la frcciiencia respiratoria aumenta (como con el e.iercicio). la célula se aproxima al estado 3 o al 4 ya sea que la capacidad de la cadena respiratoria sc satura o la PO2 decrece a valores menores del Km para el citocromo 01. 'También existe la posibilidad de que el transportador de ADPIATP (figura 14-2), que tjcilita la entrada de ADP citosólico a la mitocondria, se convierta en el limiiante de la velocidad. Así. la manera en que lo? procesos oxidativos hiol6gicoc permiten que !a energía libre que resulta dc la oxidacicihn de los alimentos se vuelva disponible y sca capturada. es escalonada, eficaz (apmximadamcnte 68%) y conirolada, en lugar de explosiva, ineficaz y sin control como en muc2ios procesos no biológicos. 1.3 energía libre remanente, que no es capturada como fnsfato de alta energía se libera en forma de calor. Esta i~ecesidadno debe considerarse coma "despilfarro",

dado que asegura que cl sistema respiratorio como iin todo sea suficientcrnente exerghico para alejarse del equilibrici y permite un flujo unidireccional cotitiriuo y una provisión constante de ATP. En el animal dc sangre calientc contribuye a la conservación de la temperatura corporal.

NUMEROSOS VENENOS INHIBEN LA CADENA RESPIRATORIA
Mucha de la infot-rnaciiin de la cadena respiratoria ha sido obtenida por el uso de inhibidores y, a la inversa, esto ha aportado in Cormación sobrc el mecanismo de acción de algunos venenos. Este lugar dc accion propuesto se muestra en la figura 14-7. Con propósitos der;criptivos se pueden dividir en inhibidores dc la propia cadena respiratoria, inhibidores de la fcisforilacihn oxidativa y desacoplantes de la misma. bloLos inhibidores que detienen la re~piración queando la cadena respiratoria parecen actuar en tres sitios. El primero es inhibido por los harbitíiricris como el amobarhital, porcl antibiótico piericidina A y por la rotenona, que es un insecticida y veneno de Deces. Estos inliibidores evitan la oxidación dc los sustratos que coinunican directamente con la cadena respiratoria por la via dc una desliidr-ugeilasa ligada al NAD al bloquear la transferencia de FeS a Q. A una dosis suficiente, son rnortaPcs in vivo. El dimercaprol y la antimicina A inhiben la cadena respiratoria entrc el citrocromo h y el citocromo c. Los venenos cl6sicos &S. rnonóxida de carbono y cianuro inhiben a la citocromo oxidasa. La carhoxina y el TTFA inhiben especificamente la transferencia de equivalentes reductores d e la succinato dcshidrogenasa a Q , en tanto que el malonato es un ínhibidor competitivo de la succinato dcshidrogenasa. El antibihiíco oiigomicina bloquea completamente laoxidación y la fosforilación en I& rnitocrindrias intactas. Sin embargo, en presencia del desacoplante dinitrofennl, la oxidación procede sin fosforilacibn, indicando que la oligomicina no actua directamente en la cadena respiratoria, sino en un paso subsecuente de la fosforilaci6n (figura 14-9). EI atractilásido inhibe la fosforilaci~n oxidativa, la cual depende del transporte de nuclebtidos de adenina a t r a v h de la membrana interna de la mitocondria. Se considera que inhibe al portador de ADP en la mitocondria y el ATP fuera de ella (figura 14-1 2). La acción de los desacoplantes consiste en separar la oxidacibn de la fasforilaciiin en la cadena respiratoria y esta accibn puede explicar la toxicidad de estos compuestos i vivo. Esto da por resultado una n respiracion no controlada, puesto que E concena tracihn de ABP o P,ya no limita la velocidad de la

-y'

y $ ; ? '

--- -- - -.--

Cuadro

Lados de control riiq?iratorio
-.

-

-

Condic iones que limitan la velocidad
de res,plración

--

-

."

III'~~JL,IIILJJ

LLU(IU IIC

I

XIII' ~11StTüivauiniii~iite Y

r
-

Dispcinihil idud de su!

-

-

Estado 3 1 [a ripacidad de la cadena respiralorra misniii, , cuantlo to dos los susiratus y componen les esthn psect>ntesen cantidades de, saturaci6r;I
"

1

Dispcinihildad de ADP solamca
idad de ox Ipcnci solarnente

-

Cadena res~iraforia fo,sforiiación oxidatrva Y

157

Figura 14-8. Funcion del ADP en el control respiratorio.

respiración. El desacoplador que ha sido usado mis frecuentemente es el 2,4-dinitrofenol, pero otros compuestos actúan de una manera semejante, incluso al dinitrocresol, el pentaclorofenol y la CCCP (m-clorocarbonilcianuro fknilhidrazona). Este último compuesto, comparado con el dfnitrorenol, es cerca de 100 veces mBs activo.

LA TEOR~A QUIMIOSM~TICA EXPLICA EL MECANISMO DE LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA
Se han emitido dos hipotesis principales tanto quirnica como quimiosm6tica para explicar el acoplamiento dc la oxidacion y la fosforilación. La hiphtesis quimica postula el acoplamiento químico directo en todas las etapas del proceso, como en las reacciones que generan ATP en la gtucblisis. No obstante, nunca lograron aislarse intermedios ricos en energíaque enlaman oxidación con fosforilacibn y la hipotesis se desacreditb.

ADP
Estado 4

1

La cadena respiratoria es una
bomba de protones
Desacoplamiento

1

1

2

3
Minutos

4

5

Figura 14-9. Control respiratorio en las mitocondrias. El experimento A mllestra la situacibn básica de la respiraudn en el estado 4, la cual es acelerada por la adiubn de ADP. Cuando el ADP exdgeno ha sido fosforilado a ATP, la respiración regresa al estado 4. La adicrón de un desacoplante, por ejemplo, dinitrofenol, separa a la respiracidn de la fosforilacibn. En el experimento E , la adicibn de oligomicina bloS quea la fosforilacibn del ADP aAadido y por tanto tambibn a la respirac16n. La adición de un desacoplante separa nuevamente a la recpiractbn de ia fosforilaubn

La teorla quimiasmática de Mitchell postula que la energía de la oxidación de componentes en la cadena respiratoria genera iones hidrógeno que son expulsados al exterior de una membrana acopladora en la mitocondria; es decir, la membrana interna. La diferencia de potencial electroquímico que resulta de la de distribución a~imétrica iones hidrógeno (protoncs, FI'j se emplea para dirigir el mecanismo responsable de la formacibn de ATP (figura 14-1 O. ) Cada uno de los complejos de la cadena respiratoria 1, III y 1V (figuras 14-7 y 14-10) actúan como una bomba de protones. La membrana interna es en general impermeable a iones, pero en particular a protones, que se acumulan fuera de la membrana, creando una diferencia de potencial electroquímico a travds de la membrana ( A ~ H + )Esta diferencia con. siste en un potencial químico (diferencia de pH) y un potencial elkcbico.No se conoce con certeza el numero preciso de protones bombeados por cada NADH oxidado, pero en la actualidad se calcula que el complejo

Membrana acopladora Oligommcina

Ubiquinona

Citocromo c

EXTERIOR

+ (APH)

Figura 14-10. Principios de la teoria quimiosmótica de la fosforitacrbn oxidativa El circuito protbnico principal es creado por el acoplamiento de la oxidacibn a la expulsibn de protones del interior al exterior de la membrana, conducida por los complejos 1, II y 1 de la cadena respiratoria, cada uno de los cuales actúa como una bomba de protones. Subunidades F y Fo de la V i proteina las cuales utilizan energfa de la gradiente de protones para promover la fosforilación Los agentes desacoplantes como el dinitrofenol permiten la fuga de iones H' a travbs de la membrana, colapsando asi, el gradiente electroquimico de protones. Específicamente la oiigcrmicina bloquea la conduccidn de H* a través d e Fo

el complejo IV,2. Por tanto, la relacibn P:O puede no ser un enterocabal, por ejemplo, 3, pero es posible que sea 2.5. Por simplificacibn, se continuarhn utilimdo en este texto un vaior de 3 para la oxidacibn del NADH + H y de 2 ' para la oxidacidn del FADH2.En la figura 14-1 1 se muestra un mecanismo posible para el bombeo de protones por el complejo 911; esto es, el ciclo Q.
1expulsa 3 a4. el complejo I I I , 4 y

Una ATP sintasa localizada en la membrana forma ATP
La diferencia de potencial electroquimico se usa para impulsar a una ATP sintasa localizada en la membrana la cual en presencia de P, + ADP forma ATP (figura 14-1 0). Así, no hay intermediario de alta energta común para la oxidacion y la fosforilación como en la hipbtesis química. Esparcidas en la superficie de la membrana interna están los complejos fosforilantes responsables de laproduccibn de ATP (figura 14-1). Estos constan de varias subunidades de protehas que se conocen en

conjunto como la subunidad F,, la cual se proy ecta hacia la matriz y contiene a la A V sincasa (figura 14-1 0). Las subunidades están adheridas, posiblemente mediante un tallo, a una subunidad protetnica de la membrana conocida como Fo, que es probable se extienda a travks de la membrana (figura 14-10}, Los protones pasan a travks del complejo FOa F 1con formación de ATP a partir de ADP y P,. Es interesante observar que unidades fosforilantes similares se encuentran en el interior de la membrana plasrnitica de las bacterias, asi como en el exterior de la membrana de los tilamides en los cloroplastos. Es significativo que el gradiente de protones es de fuera hacia dentro en mitocondrias y bacterias, pero en sentido inverso en los cloroplastos. El mecanismo de acoplamiento de la expulsibn de protones al sistema de la ATP sintasa es una conjetura de la Ripdtesic. Los estudios sugieren que la sintesis de ATP, la cual puede tener lugar mientras se encuentra pegado a la enzima, no es el paso principal que requiere energja, sino más bien la liberacibn del ATP del sitio activo. En esta accibnpodrian intervenir cambios de confomaci6n de la subunidad FI.

Cadena resprratnriay JosforilaciOn oxidufrva

159

Figura 44-41. Ciclo "Q" generador de protones. La figura muestra corno los componentes del complejo III están organizados como bomba de protones. El QH' se anda a cada lado de la membrana a una proteína fijadora de Q, en tanto que. QH2 Y Q son móviles. Los citocromos se muestran como b y ci.

Los hallazgos experimentales respaldan la teoria quirniosmótica
1) La adicidn de protones (gcido) al medio extemo de mitocondriasconduce a la generación de ATP.

La teoría quimiosmótica explica la acción de los desacopladores
compuestos ( ~ o r e j e m ~ ldinitrofenol) son mo, fiphticos (capitulo 16) e incrementan la permeabilidad de las mitocondrias a los protones (figura 14-10), reduciendo así el potencial electroquímico y el corto circuito de la ATP Por tanta, la procede focforilacibn,

2) La fosforilaci6n oxidativa no ocurre en sistemas solubles donde no existe la posibilidad de una ATP sintasa vectorial. Debe haber una

membrana cerrada para obtener fosforilacidn oxidativa (figura 14-1 0). 3) La cadena respiratoria contiene componentes organizados lateralmente (asimetríatransversal) como los requiere la teoria quimiosm6tica.

La teoria quimiosmótica explica la existencia de sistemas transportadores de intercambio mitocondrial
Estos sistemas son una consecuencia de la membrana acoplada que debe ser impermeable a los protones y otros iones para conservar el gradiente electroquimico (vkase adelante).

La teoria quimiosrnótica puede explicar el fenómeno de control respiratorio
La diferencia de potencial electroqulmica a travts de la membrana, una vez establecida como resultado de la translocacibn de protones, inhibe el transporte posterior de equivalentes reductores a travks de la cadena respiratoria a menos que se descargue por una translocación retrógrada de protones a traves de la membrana hacia la ATP sintasa vectorial. Esto a su vez depende de la disponibilidad de ADP y P,.

LA IMPERMEABILIDAD RELATIVA DE LA MEMBRANA MITOCONDRIAL INTERNA NECESITA DE INTERCAMBIO DE TRANSPORTADORES
Los sistemas de difusidn para intercambio existen en la membrana para cambiar aniones por iones OH-y

(CapituloId)
cationes por iones H'. Estos sistemas son necesarios para la captación y excreción de metabolitos ionizados en tanto se conserva la neutralidad eldctricn y osrnbtica. L a membrana mitocondrial bilipoide interior es totalmente pemeable a moléculas pequefias sin carga, como oxígeno, agua, C02 y NHI y a acidos monocarboxilicos, como 3-hidroxibutírico, acetoacético y acético. Los iicidos grasos de cadena larga son transportados al interior de la mitocondria por el sistema de la ornitina (figura 24-1) y existe también un transportador para piruvato que comprende un "simport" que utiliza el gradiente de t del exterior al interior i ' d e la mitacondria (figura 14-12). Sin embargo, aniones diwboxilato y trimboxilato y amino8cidosrequieren un transportador especifico o sistemas de transportadores para facilitar su paso a rravks de la membrana. Al parecer, los ácidos monocarboxílicos penetran con mAs facilidad debido asu menor disociacibn. Se cree que
Membrana interna de

EXTERIOR

la mitouindria

INTERIOR

los ácidos sin disociar o m& liposoluhles son la especie molecular que atraviesa mejor la membrana lipoide. El transporte de aniones dicarboxílicos y tricarboxilicos se relaciona de manera estrecha con el fosfato inorgánico, el cual atraviesa con facilidad como ion HzP04-enintercambio por OH-. La captacibn neta de malato por el transportador de dicarboxilato requiere fosfato inorghnico para intercambiar10 en direccion opuesta. La captacion neta de citrato, isocitrato o cisaconitato por el transportador de tricarhxilato requiere malato en intercambio. El transportador de alfa cetoglutarato tambikn necesita intercambio con malato. si, ~ o medio de mecanisinos d c intercambio re r conserva el equilibrio osmiitico. Dcbe apreciarse que el transporte de citrato a traves de la membrana mitocondrial depende no solo del transporte de malato sino tambien dcl intercambio de fosfato inorgánico. El transportador de nucleiitidos de adenina permite el intercambio de ATP y ADP, pero no AMP. Esto es esencial para dejar salir al ATP de las mitocondrias hacia los sitios de su utilización exn-arnitocondrial y permitir el regreso del ADP para la produccibn de ATP denm de la rnitocondria (figura 14-13). El Na' puede intercambiarse por H', cori ayuda del gradiente de protones. Se piensa que la captación activa de Caz' por las mitocondrias ocurre con transferencia de una carga neta con valor de 1 (Ca' "uniport"), quizá a traves de un antiport Ca2'/H'. ],a liberacion de calcio de las mitocondrias es facilitada por el intercambio con Na' .

EXTERIOR

Membrana interna de la

INTERIOR

mitoccndria

Figura 14-12. Sistemas transportadores en la membrana mitocondrial Transportador de fosfato @ Sirnportador de piruvato @Transportador de dicarboxilato.(a Transpertador de tricarboxilato. Transportador de alfa cetoglutarato. ( Transportadorde nudeótido de adenina. Netilmaleimida, @ hidroxicinarnato y atratilbsrfo inhiben los sistemas indicados. TambiBn existen (pero aqui no se muestran) sistemas transportadorespara glutarnatolaspartato (fgura 14-1 5)-glutamina, ornitina, aminoácidos neutros y carnitina (figura 24-1)

8

($2

Figura 14-13. Carnbinacibn del transportador de fosfatosm con el transportador del nuclebtido de adeninacg en la sintesis del ATP. El simportador H+IP, es equivalente si antiportador PJOH que se observa en la figura 14-12. Tres o posiblemente cuatro protones penetran a la mitocondriapor cada ATP que sale. Sin embargo,penetra un protbn menos cuando el ATP es usado en el interior de la mitocondria.

Los ionóforos permiten a cationes específicos atravesar membranas
[,os ionóforos reciben ese nombre por su capacidad para fonnar compIc,jos con cationes específicos y facilitar su transporte a través de membranas biológicas. Esta propicdad de fonoforesis se debe a su carácter l ipofílico, que le permite atravesar membranas lipoides como Ia rnitocondrial. Un qiernplo es el antibiótico valinomicina, que ayuda al paso de K ' a travCs de In niembrana mitocondrial y luego descarga el potencial de mernbrwa*del interior al exterior de la mitocondria. La nigericina actúa también como un ionhforo para K' pero en iiiicrcambio por HA. Por tanto, elimina el gradiente de pIl a travis de la membrana. Eri presencia de valinomicina y nigericina, tanto cl potcnc~aldc niembrana como el gradiente dc pll desaparecen y por tanto, la fosforilación es completarnente inhibida. De hecho, los desacoplantes clásiccis como dinitrorenol son ion6foros de proiones.

La oxidacion del NADH extramitocondrial es mediada por lanzaderas de sustrato
Aunque el NADH no piicde penetrar la mcnihrana mitocondria1, es producido continuamente en el cftosol por la 3-tos~oglfceraldehido deshidrogenasa, una enzima de la secuencia de la glucólisis (iigtira 19-2). Sin embargo, en condicione$ aerobias, el N A DH extram itocondrial no se acumula y sc supone que es oxidado por la cadena respiratoria cn las mitocondrias. Se han considerado varios mecanismos posibles quc permiten este proceso. Estos iinplican la transferencia de equivalentes rediictores a travis dc la membrana rnitocondrial por la vía de los parcs dc sustratos, ligados por deshidrogenasas apropiadas. Es necesario que se encuentre la deshidrogenasa especifica en ambos Iados de la mern brana mitocondrial. El mecanisrnv de transferencia que utili7a la lanzadera d e glicerofosfato se muestra en la figura 14-14. Debe advertirse que la enzima mitocondrial se enlaza a la cadena respiratoria a travCs de una flavoproteina en lugar de N A D y que en lugar de tres, shlo se fonnan dos moléculas de ATP por átomo de oxígeno consumido. En algunas cspccics, la actividad de la enzima ligada a FAD decrece despues de tiroidectomia y aumenta después de la administración de tiroxina. Aunque esta lanzadera existe en el músculo de las alas de IOF insectos, cerebro, tejido adiposo oscuro y cn cI miiscrilo blanco y podrta ser importante en el hígado; otros ie,jidos (por ejemplo, músculo cardiaco) muestran deficiencia de glic~rol3-fosfato deshidrogenasa. Se cree, por tanto, que iin sistcma de trancporte que implica al malato y al malato citos6lico y mitocondrial es de mayor utilidad universal. En la figura 1 4-1 5 se muestra el sistema lanzadera del malato. La com-

Una transhidrogenasa traslocadora de protones es fuente del NADPH intramitocondrial
Esta trarishidrogenasri ligada a energía, que es una prciteina de la membrana mitocondrial interna, se acopla al paso de protones corriente abajo del gradiente electroqiifmico del exterior al interior de la mitocondria con transferencia de hidrhgeno del NADI-1 intramitocondrial para formar NADPH. Al parecer actua como un amortiguador redox ligado a energía y como fuente de N A D P H para la? enzimas intramitocondriales. como glutamñto deshidrogenasa e hidroxilasa, que intervienen en la slntcsis de esteroides.

Figura 14-14. Lanzadera de glicerofosfato para la transferencra de equivalentes reductores desde el citosol al interior de la mltocondria.

162

Rioquímica de Harper

(Capitulo 14)

MEMBRANA

CITOSOL

INTERIOR

MITOCONORIA

MALATO DESHIDROGENASA

+

H'

transFigura 14-15. Lanzadera del malato para transferencia de equivalentesreductores del citosol al interior de la mitocondria portador del oetoglutarato, transportador de glutarnato-aspaflato (nótese el sirnportador protbnica con glutamato).

a

plejidad de este sistema se debe a la impermeabilidad de la membrana mitocondrial al oxalacetato, el cual debe reaccionar con el glutamato y ser transarninado a aspartato alfa cetoglutarato antes de su transporte a travks de la membrana rnitocondrial y reconstituido a oxalacetato en el citosol.

El transporte de iones en las mitocondrias se enlaza a la energia
Las mitocondrias que respiran activamente en donde se lleva a cabo la fosforilacion oxidativa, conservan o acumulan cationes como K', Na', Ca2', MgZ' y P,. El desacoplamiento con dinitrofenol conduce a la pérdida de iones del interior de la mitocondria pero la captacibn de iones no es inhibida por la oligomicina. lo que sugiere que la energíano necesita ser suministrada por la fosforilacion del ADP, Se considera que una bomba primaria de protones dirige el intercambio catidnico.

para transferir fosfato de alta energia desde la mitocondria. En el espacio intemembrana de la mitocondria se encuentra una isoenzima de la creatincinasa (CK,)que cataliza la transferencia de fosfato de alta energia a la creatina a partir del ATP que surge del nuclebtido transporhdor de la adenina A su vez, el dna fosfato se transporta al interior del citosol mediante los poros de proteinas en la membrana mitocondrial exterior y queda disponible para la generación extramitocondrial de ATP. Diferentes isoenzimas de la creatincinasa median la transferencia de fosfato de alta energia hacia y desde los diversos sistemas que lo utilizan o generan, ejemplo, contraccion muscular, gluc6lisis (figura 14-1 6).

ASPECTOS CL~NICOS

M m t o m o de la miopatfa mitocondrialy la disfuncibn
renal infantil mortal comprenden disminución grave, o ausencia, de la mayor parte de las oxidorreductasas de la cadena respiratoria. La MELA (miopatía, encefalopatía, lactacidosis y apoplej ia) es un estado hereditario causado por NADH: deficiencia de ubiquinona oxidorreductasa (complejo 1) o de citocromo oxidasa. Se han descrito las enfermedades que implican deficiencias de gran parte de la fosforilacibn oxidativa. Cierto numero de fhrmacos y venenos actúan por inhibicibn de la fosforilacibn oxidativa (vkase antes).

La lanzadera de creatina fosfato facilita el transporte de fosfato de alta energía desde la mitocondria
Esta lanzadera (figura 14-1 6) aumenta las funciones de la creatina fosfato como un amortiguador de energía al actuar en los tejidos activos como son el corazón y el musculo esquelético, como un sistema dinámico

Cadena respiratoria yfo.sforilacidn oxidativa

163

/
ATP

P m s o s que requreren energía ejemplo. contraccibn rnuswlar

RESUMEN

\
ADP

1) Virtualmente toda la energia liberada de la

.:,:,;,.,embrana mitomndria . : .......-. ,. ;y..>.-,
..,.,.,.,.,,mi.:.; exterior
.,$: ;;:;, , ;

:::%;::f<<:'

p
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ATP

/

\
ADP

Espacio

intermembrana

Figura 14-16. La lanzadera de creatina fosfato del músculo cardiam y esquelético La lanzadera perrnlte el transporte rhpido de fosfato de alta energia desde la matriz de la mitomndria al interior del citosol (Cka, es la creatina ctnasa que interviene en los grandes requerimientos de ATP, ejemplo. contraccibn muscular, C k , es la icoenzirna que mantiene el equilibrio entre la creatina y el fosfato de creatina con ATPIADP, C b es la isoenzlma que acopla la glucblisis a la slntecis de creatina fosfato, C b e3 la creatincinasa mitocondrial que media la creaci6n de fosfale de creatina a partir del ATP formado en la fosfoñilacibn oxidativa; P es el poro de la proteína en la membrana mitocondrial exterior.)

oxidación de carbahidratos, Iípidos y proteinas se vuelve disponible en las mitocondrias como equivalentes reducidos (-H o e-). Estos son canalizados a la cadena respiratoria, donde pasan corriente abajo por un gradiente redox de transportadores a su reaccibn final con oxigeno para formar agua. 2) Los transportadores redox se agrupan en complejos de la cadena respiratoria en la membrana mitocondrial interna. Estos usan la energía liberada en el gradiente redox para bombear protones al exterior de la membrana, creando un potencial electroquimico a través de ésta. 3) Atravesados de uno a otro lado de la membrana estan los complejos de ATP sintasa que usan la energía potencial del gradiente de protones para sintetizar ATP a partir de ADP y Pi. En esta forma, la oxidación se acopla en forma íntima a la fosforilacibn para proveer a las necesidades energdticas de la cklula. 4) Debido a que la membrana mitocondrial intema es impermeable a protones y otros iones, transportadores de intercambio especiales se extienden a travks de la membrana para permitir el paso de iones como OH-, P17ATP~-, A D P ~ -y rnetabolitoc, sin descargar el gradiente electroquimico a través de la membrana. 5) N u m e r o s o s v e n e n o s c o n o c i d o s , como cianuro, detienen la respiracibn mitocondrial por inhibicibn de la cadena respiratoria.

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Carkohidratos de importancia fisiológica
Peter A. Mayes, PhD, DSc

Los carbohidratos esthn ampliamente distribuidos en vegetaIes y animales, donde desempeñan funciones estructurales y rnetabólicas. En los vegetales, la glucosa es sintetizada por fotosintesis a partir de bióxido de carbono y agua y almacenada como almidón o convertida a celulosa que forma parte de la estructura ,s de soporte vegetal. 1o animales pueden sintetizar algunos carbohidratos a partir de Iípidos y proteinas, pero el volumen mayor de los carbohidratos de animales se d ~ r i v a Última instancia de los vegetales. en

LOS CARBOHfDRATOS SON DERIVADOS ALDEH~DOS CETONAS O DE ALCOHOLES POLIH~QRICOS
Se clasifican como sigue:

1) Los monosacásidos son aquerlos carbohidrato~que no pueden ser hidrilizados en
moleculas más sencillas. Pueden subdividirse en triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, heptosas u octosas, dependiendo de la cantidad de ariíornos de carbón que contengan; y como aldosas y cetosas dependiendo si tienen o no grupo aldehido o cetona. En el cuadro 15-1 se dan algunos e-jemplos 2) Los disachridos producen dos moléculas del mismo o de diferentes monosacáridos cuando se hidrolizan: ejemplos de estos compuestos son la maltosa, que produce dos moléculas de glucosa, y la sucrosa, que produce una inolécula de glucosa y una de fructosa. 3) [,os oligosacáridos son los compuestos que por hidrólisis dan 2 a 10 moléculas de rnonosacirido. La maltotriosa* es un ejemplo. 4) Los polisachridos so11aquellos carbohidratos que dan, al ser hidrolizados, mhs de 10 moléculas de monosacaridoc. Los almidones y las dextrinas son ejemplos de polisacáridos que pueden ser lineales o ramificados. Segun la naturaleza de los monosacAridos a que dan origen por hidrblisis, en ocasiones se le designa como hexosanos o pentosanos.

IMPORTANCIA BIOMÉDICA
Para comprender su funci6n fundamental en la economia del organismo de los marniferos es esencial el conocimiento de la estructura y propiedades de los carbohidratos de importancia fisiologica. El azúcar glucosa es el carbohidrato más importante. La mayor cantidad del carbohidrato dietético pasa al torrente sanguíneo en forma de glucosa o es convertida en el hígado y, a partir de ella, pueden formarse los demás carbohidratos en el cuerpo. Es tarnbien el combusliblc principal de los mamíferos (excepto los rumiantes) y un combustible universal para el feto. En el organismo es convertida a otros carbohidratos que tienen funciones altainente especificas, por ejemplo, glucbgeno para almacenaje; ribosa en los ácidos nucleicos; galactosa en la lactosa de la leche y en ciertos Iípidas complejos y, combinada con proteinas en las glucoproteínas y los proteoglucanos. Las enfermedades que se relacionan con carbohidratos incluyen diabetes sacarina, galactosemia, enfermedades por almacenaje d e glucógeno e infolerencia a la lactosa.

*

Obsérvese que esla no es una triosa verdadera sino un trisacárido giic conticnc trcs rcsiduos de alfa glucosa.

Cuadro 15-1. Clasificaciónde aziicares
importnntes
---L.
" -

--

1

--

ulosa ulosa

Para la mayor parte de los praphsito~,la fbrmula estructural puede ser representada como un simple anillo en perspectiva como lo propuso Haworth (figura 15-1 R). 11 anilisis por difracción de rayos X 3 muestra que el anillo de seis miembro5 contienc un átomo de oxigeno y que en realidad tfenc la forma de una silla (figura 15-1 C).

ctosa

Los azúcares poseen varias formas
de icornerismo

LA GLUCOSA ES EL MONOSACARIDO MÁS IMPORTANTE EN MEDICINA
La estructura de la glucosa puede representarse de tres maneras
Aunque la fhmula estructural de cadena lineal (aldohexosa, figura 15-1 A) puede ayudar a comprender algunas de sus propiedades, una estructura cíclica cs favorecida por razones temodinSimicas y expIica completamente el resto de sus propiedades quimicas.

Los compuestos que tienen Ia misma formula estructural, pero que difieren en configuracibn espacial se conocen camo etercoisómeros. La presencia de atonios de carbono asimétricos (Atomos de carbono unidos a o cuatro h~omos grupos diferentes) permite la formación de isbrneros. El numero de isbrneros posibles de un compuesto depende de1 numero de htomos asimétricos de carbono (n) y es igual ri 2". La glucosa, con cuatro htomos asimttricos de carbono tiene, por tanto, 16 isomeros. Los tipos más importantes de isomeria que se encuentran en la glucosa son los siguientes:

o
'C-H

11
I

- OH HO -3C - H 1 H -4C - OH l H -=C -OH
H -2C

1

1) lsomerismo D y L: La designación de un isiimero como 13 o de su irnagcn en espejo como la forma L está determinada por su relacion espacial con el compuesto progenitor de la familia de carbohidrato~,el azúcar de tres carbonos, la glicerosa (gliceraldehído). Las formas L y D de este azíicar se muestran en la Figura 15-2,jiinto con los correspondientes isdmeros de la glucosa. La orientacihn de los grupos -H y -0H alrededor del átomo de carbono adyacente al carbono con el ~ l c o h o l primario terminal (por ejemplo, el Atomo de carbono cinco en la glucosa) determinan si el asicar pertenece a la serie D o a la l.. Cuando el grupo -OH en este carbono está a la derecha {como se ve en la figura 15-2), el azúcar es miembro de la serie D; cuando esti a la izquierda, pertenece a la serie L. La mayor parte de los monosacaridos dc los mamíferos tienen la configuracibn u y las enzimas qiie intervienen en su metabolismo son específicas para esta configuracibn. La presencia de átomos de carbono asimCtncos tambikn confiere actividad óptica a los compuestos. Cuando un rayo de luz polarizada en un plano se hace pasar a través de la soluciiin de u11Eshmero óptico, el plano de polarizaci0n girarA en el sentido de las manecillas del reloj si el isómero es dextrorrotatario (+), o en el sentido opuesto si es levomtatorio (-1. Un compuesto puede scr designado n(-), »(A), L(-) o c(+),indicando su rclación estructural con la glicerosa n o L, pero no necesariamente exhibiendo la misma rotacibn 6ptica. Por ejemplo, la forma de F fructuosa que ocurre en la naturaleza, a es el isiimcro D(-).

1

6CH,OH

Figura 15-1. o-Glucosa A: Forma en cadena recta; B alfao-Glucosa proyección de Haworth; C: alfa-o-Glucosa forma de silla.

C -H I

H-C
I

-OH
Furane

O

ti

C -H

HO-

' -H C
I

1

1
H-C
1

-0H
-51

HO-C H-C

I
I
I

-0M

m-"

-H

I

H-C

-0H

Figura 15-3. Formas piranosa y furanosa de la glucosa.

'CH,OH

CH?OH

Figura 15-2. Isomeria o- y L- de la glucerosa y de la glucosa.

anbmeros alfa y beta de la glucofuranosa. Este equilibrio se acompaña de rotacibn 6ptica (mutarrotación) cuando el anillo semiadtico se abre y
se vuelve a formar con cambio de la posicibn de los grupos -H y 4 H del carbono 1. El cambio se efectua probablemente via una molécula hidratada, acíclica, dc cadena recta, aunque la polarografia ha mostrado que la glucosa existe en forma aciclica en una proporción de sólo 0.0025 por ciento. La desviación bpticade la glucosa en soIución es dextrorrotatoria; de aqul, el nombrc alterno de dextrosa que se usa con frecuencia en medicina.

Cuando existen cantidades iguales de isomeros n y l,, la mezcla resultante no tiene actividad 6ptica puesto que las actividades de cada isbmero se anulan entre si. Tal mezcla se designa como racemica o mezcla ni.. [,os compuestos producidos por síntesis son necesariamente recdrnicos, ya que las oportunidades para la forrnacíón de cada ic6mero ~ p t i c o idénticas. son 2) Estructuras cíclicas piranosa y furanosa: Esta terminologia se basa en el hecho de que las estructuras ciclicas estables de los rnonosacáridos son sirnilms a las del pirano y del furano (figura 15-3). También las cetosas pueden presentar la forma ciclica (por e.jempi0, D-fsuctofuranosa o D-fn~cto~iranosa) (figura 1 5 - 4 ) . En el caso de la glucosa en solucit~n, m& de 99% esta en la forma piranosa; por tanto,menos de 1 % esta en la forma furanosa. 3) Anbrneros alfa y beta: La estructura ciclica de una aldosa es un sem iacética, puesto que esti formada por la combinacibn de un aldehído y un grupo aIcohol (figura 15-5). En forma semejante, la estructura cíclica de una cetusa es un semiacético. La glucosa cristalina es alfa-u-glucopiranosa. La estructura ciclica se conserva en solución, pero el isomerismo tiene lugar alrededor de la posicihn 1, el carbonilo o atorno anornérica d i carbono, prodriciendo una rnezcIa de alfa-u-glucopiranosa (38%) y beta-glucopiranosa (62%). Menos de 0.3% e s t $ representado principalmente por

Figura 15-4. Formas piranosa y furanosa de la fructosa.

HO O'd
H

L.
Forma de
aldehido aciclico
0h

HOCH,

(sedcheptiilosa), se forman en la degradacibn de la gliicosa por la vía alterna del fosfato de pentosa. Las pentosas son constituyentes importantes de nucleótidos, ácidos nucleicos y numerosas coenziinac (cuadro 15-2). De las hexosas, las fisiolúgicamente más importantes son Ja glucosa, galactosa, fructosa y manosa (cuadro 1 5-3). En la figura 15-8 se muestran las estructuras de los azúcares aldosas de importancia bioquimica. En la figura 15-7 se muestran cinco cetosas que son importantes en el metabolismo. También significativos so11 los derivados ácido carboxílicos de la glucosa como el D-glucuronato (importante en la formación de gliicurhnidos y prescnte en los glucosaminog~ucanos) y sus derivados metabolicos 1--iduronato (presente eii glicosarninoglucanos) (figura 15-9) y 1 ,-gulonato (un in iembro de la via del icido urhnico, figura 2 2 4 ) .

Figura 15-5. Mutarrotaciones de la glucosa.

Los azúcares forman glucósidos con otros compuestos y entre si
Los glucósidos son compuestos formado< de la condensación entre el grupo hidroxilo del c ~ r b o n o anomérico de un monosaclirido o un residuo de monosacarido y un segundo compuesto que puede spr o no (en el caso de una aglucona), otro monosacarido. Si el segundo grupo es un hidroxilo, e1 enlace O-glucosidico es un enlace acetal debido a que resulta de utia reaccihn entre un grupo semiacético (formado de un grupo aldehido y un grupo -0H) y otro grupo -0H. Si la porcihn serniacética es la glucosa, el compuesto resultante es un glucbsido; si es la galactrisa, un galactosido, etdtem. Si el segundo grupo es iina arnina. se forma un enlace N-glucosídico, por c,jemplo, entre adenina y ribosaen nuclcbtidos como ATP (figura 12-5). Los glucósidos se encueiitran en muchos medicamentos, en las espccias y en las constituyentes de tejidos animales. El aglucano puede ser metanol, glicerol, un esterol o fenol, o una base como adenina. Todos los gluc6sidas que son irnportantcs en medicina, debido a su acci6n sobre el corazón (glucosidos cardiacos), contienen esteroides como

4). Evímeroq: 3.0s isomeros que difieren como con-

secuencia de variaciones en la configuracibn de los

4 H y -H unidos a los átomos de carbono 2,3 y 4
de la glucosa se conocen corno epimeros. Diológicarnente, los epimeros más importantes de la glucosa qon la manosa y la galactosa, formadas por epimerizaci6n en los carbonos 2 y 4, respectivamente (figura 15-45). S') lsom~rismo aldí)sa+etosa: La fructuosa tiene la tnisma formula niolecular de la glucosa, pero difiere en su fiirmula estructural, dado que hay un grupo cetosa potencial en la posición 2 dc la fmctuosa (figura 15-73 y un grupo aldehido potencial en la posición 1 dc la glucosa (figura 15-8).

Muchos monosacáridos tienen importancia fisiológica
Los derivados de triosas se forman en el ciirso de la degradación metabolicade la glucosapor la vía de la glticólisis, en tanto que los derivados de iriosas. tetrosas. pentosas, a partir del azúcar de siete carbonos

HOCH,

HOCH,

HOCH,

Figura 15-6. Epimerización de la glucosa

CHIOH
I

C=O
I

CH,OH
I

CH,OH
I
I

C=O
1

HO-C
I

-H

C-O
I

C=O

HO-C-H

1
I

H-C - 0 H
I I

HO-C-H

H-C-DH
I

H-C

-0H

H-C

-0H

H-C

-OH I CHzOH

Dihidmxiacetona
Figura 15-7. Ejemplos de cetosas de importancia fisiol6gica

componente aglucona. Estos gluciisidas incluyen derivados de la digital y del estrofanto coma la oua baína, que es un in hibidor de E Na'f K' -PiTPasa de a las membranas celulares. Otros glucósidos incluyen antibióticos como la estreptomicina (figura 15-?U).

LOS deoxiazúcares carecen
de un oxígeno
Son aqiiéllos en los cualcs un gnipo hidroxilo unido a la estructura cíclica ha sido reempla7ado por un atomo

CHO
I

H-C-OH CH2OH
~Gllcerosa (Dgllceraldehldo)
I

CHO

f . CHO
I

CHO
HO-C - H
l

m
CHO
1 I

$HO H-C - 0 H I H -C - 0 H I CHIOH .~Erltrosa

HQ-C -H

I HO-C - H
I

H-C - 0 H
H-C

I

H-C - 0 H H-C - 0 H

H-C - 0 H

4

-OH
~Ribosa

&,OH
~Llxosa ~Xllosa

-7

CHO
[

CHO HO-C - H
I
I

CHO
I

H-C-OH
HO -C -H

H-C-OH
4

HO-C -H
H-C
I

HO -C -H
I

4 H-C-OH
1

HO-C -H

H-c-OH
H -C - 0 H
I

H-C - 0 H

CH20H

I

- OH

CHZOH

CH20H

Figura T5-8. Relaciones estructurales de las aldosac de la serie o con importancia fisiológica La o-triosa no tiene importancia fisiológica. La serie se construye por la adicidn tebrica de una unidad CHzO al grupo -CHO del azúcar

Cuadro 15-2. Pentosas de importancia fisiolbgica .. . -

-

---- -

eicos
YnbnbU,
1 ,

Import:ancia bio~uírnica

(ii&zi

:mentas es1:ructuraIcs de los acidl .lai~n~ A .,e las coen7imaq com 'P. NAD, f U'ADP, llav,{>proteínas S fosfatus de rihiisa !Fon intcrm rios en la i de la peintosn fosfa [la . 1 rormada cn los nroce.sus I f i i fosl'ato de : . es iin inxcrrn rinuiusa ) dia.rio en la vi a de la pcntosa fosfati 1 rnetüb6licos ,,. nsiiluyente dc glucop.rvteintis ; ciruela Y de rd ~ G I C L ~ ~ v e gel iomas nstituyenie de glucop eptidogliucnnos Iiicosamint)gluc;inos un constit!~ y e n t cde u la cual ha Sido aislada diaco hum;m0 1 I ' iterrnediario en la via aer aciao urnnico ae encucnira en ia orina cn l a -pentosuria cscncial
""
T...,
--,m
A

de hidrógeiio. Un ejemplo es la desoxirribosa (figura 1 5-1 1) que existe en los hcidos nucleicos (DNA). Tambien se encuentran como un carbohidrato de glucoproteinas en forma de desoxi id-fucosa (figura 1 5-1 7 ) y la 2-desoxiglucesa es un inhibidor impartante del metnbolisma de la glucosa.

Los aminoazúcares (hexosaminas) son

componentes de glucoproteinas,
gangliócidos y glucosami nog lucanos
Ejemplos de aminoazúcares con la r~-glucosarnina (figura 15-12), la D-galactosamina y la D-ma-

Cuadro 15-3. Aexosas de importancia Tisiolligica
-A- - .

-

--

-- --

ente
-

I
-

-

3 lucosa

; Jugo

:

ar" del 1Prescntc cnI la orina (E

"lm;

.

.,

.

maltosa y la lac

-

insporta leI sangre y el que incipalmente usan los tejidos

r

de In g1ucosa santesgluce~ni; 3)

-

1 del azúcar de cziaa y de la i nulina con v k i r ~ i e iglucosa J (pro1cedente de la alcachi]fa de foirma In lisa iel organisn Jem~

fructuosa r:ondiice a Iación dc c:cte cnrbrih 1izipogluceniia

-

Hidr ólisis de la
zada cn las glándulas mamwias para formar la lactosade la leche. Es un constituyente de Ios gluD-1

imposibilidad de metaboizarla caiisa galact oscmia y :ataratas

Hidrblisis del mank y gomas Es un ctinsliiuyente de muchas vegetales glucoproteinas

COO-

H

5

HOCH,

Figura 15-9. alfa-o-Glucuronato (izquierda) y beta-L-iduronato (derecha)

Figura 15-17. 2-Desoxi-D-ribofuranosa (forma beta)

nosamina, las cuales han sido identificadas en la naturaleza. La glucosarnina es un constituyente del ácido hialurdnico. La galactosamina o condrosamina es un componente de la condroitina (capitulo 57). Varios antibióticos como la eritromicina y la carbomicina contienen aminoazúcares. Se cree que los aminoazUcares están relacionados con la actividad antibidtica de estos medicamentos.

LOS POLISACARIDOS TIENEN FUNCIONES DE ALMACENAJE Y ESTRUCTURALES
Entre los polisachridos figuran los siguientes carbohidrato~ son lisiol6gicamente importantes: que El almidón esta formado por una cadena alfaglucosídica. Compuesto que siilo produce glucosa en la hidrólisis, es un homopolímero denominado gIucosano o glucano. Constituye la fuente más importante de carbohidrato$ de los alimentos y se encuentra en los cereales, las patatas, las legumbres y en otros vegetales. Los dos constituyentes principales del almid6n son: la amilosa (15 a 20%) que tiene estructura helicoidat no ramificada (figura 15-14), y la amilopectina (S0 a 85%), que consiste en cadenas muy rarnificadas, de 24 a 30 residuos de glucosa unidos por enlaces 1 -+ 4 en las cadenas y por enlaces I + 6 en los puntos de ramificación. El glucógeno (figura 15-15) es el polisacárido que se almacena en el organismo animal. A menudo se le designa como almidón animal. Es una estructura mucho más ramificada que la arnilopectina con cadenas de 12 a 14 residuos de alfa-D-glucopiranosa (con enlaces glucosidicos alfa-D-f l -% 41) y ramificaciones

LOS DISACARIDOS MAS IMPORTANTES SON MACTOSA, SACAROSA Y LACTOSA
Los disacáridos son azucares compuestos de dos residuos de monosachrido unidos por un enlace glucosidico (figura 15-1 3). Su nombre quimice refleja sus componentes monosacáridos. Los disachridos fisiológicamente importantes son maltosa, sacarosa, trehalosa y lactosa (cuadro 1 5 4 ) . La hidrblisis de la sacarosa da una mezcla cruda que se denomina "azucar invertida" debido a que la fnictosa que se produce es fuertemente levorrotatoria y cambia (invierte) la previa accibn dextrorrotateria de la sacarosa.

Figura .15-10. Estreptomicina (izquierda) y ouabalna (derecha).

17 Rioquírnicu de Hurper 2
MALTOSA

(Capitulo ISI

Figura 15-1 2. Glucosamina (2-amino-o-glucopiranosa) (forma alfa) La galactosarnina es E 2-amino-o-galactopiraa noca Tanto la glucosamina como la galactosamina a menudo se presentan como derivados N-acetilo en carbomas complelos, por ejemplo, glucoproteinas. hidrato~
SACAROSA

unidas por medio de enlaces glucocidicos al fa (1 +6). La inulina es un alrnidhn que se encuenbaen los tuMrcu los y raíces de las dalias, alcachofas y dcl diente de león. Por hidrólisis se obtiene fructosa y por tanto es un h c tosano. Este almidón diferente: al de la patata es fácilmente soluble en agua caliente y se usaen fisiología para determinar la velocidad de filtración glomenilar. Las dextrinas son sustancias que se producen durante el proceso de desintegración liidrolítica del a l m i d ~ nLas . dextrinas son los primeros productos que se forman cuando la hidrdlisis alcanza un cierto grado de las ramificaciones. La celulosa es el principal constituyente del armazón de los vegetales. No es soluble en los solventes ordinarios y consiste en unidades de beta-D-glucopiranosa unidas por enlaces beta (1 + 4) para Fomar cadena rectas, largas, reforzadas por enlaces cruzados de puentes de hidrógeno. L a celulosa no puede ser digerida por numerosos mamíferos, incluso el ser humano debido a la ausencia de una hidrolasa que ataca al enlace beta. Por tanto, es fuente importante del "volumen" en la alimentación. En el intestino de los rumiantes y otros hcrbivoros, hay microorganismos que pueden atacar el enlace beta, haciendo a la celulosa accesible para usarse como fuente energktica importante. Este proceso puede tener lugar a un grado limitado en el colon humano. La quitina es un importante polisacárida estructural de los invertebrados. Se encuentra, por ejemplo, en los exosqueletos de los crustáceos e insectos. Químicamente, la quitina está formada por unidades de h c e t i l - ~ - g l u c o s a m i n a unidas por enlaces beta (1 -r 4)-glucosídicos (figura 15-I6). Los glucosaminogiucanos ~mucopolisac~ridos) están constituidos por cadenas de carbohídratos complejos que se caracterizan por su contenido en aminoazúcares y iicidos urónicos. Cuando estas cadenas se unen a una molicula de proteína, el compuesro se conoce como un proteoglucano. A l igual que la sustancia fundamental o de envoltura, están relacionados

LACTOSA

HH O H O Q

H H

oH

H H

Figura 15-13. Estructuras de disacáridos representativos Los simboloc alfa y beta se refieren a la configuración en el átomo anomériw de carbono (*) Cuando el carbono anormerico del segundo residuo toma parte en la formación del enlace glucosidim, el residuo se convierte en un glucósido conocido corno furanósido o piranbsido Como el azúcar ya no tiene carbono anomerico con un grupo libre potencial, aldehido o cetona, ya no muestra propiedades reductoras, como la mayor parte de los demas azucares.

con elementos estructurales de los tejidos como el hueso, la elastina y la colhgena. Su propiedad de retener grandes cantidades de agua y de ocupar espacio, acojinando o lubricando otras estructuras, es auxiliada por el gran número de grupos 4 H y de cargas negativas de las molkculas, las cuales por repulsión conservan separadas a las cadenas de carbohidrato. Ejemplos son el ácido bialurbnico, el sulfato de

Cuadra 15-4. Disachridos
-.
u""--

"

.

""""" " "

"

.u"

. -

"
-LA

Fuente
A -

+

-

clínica

n can arnilasa n hir

1

piicdc apnirccer eri l a I;n la deficienciade Iactasü, sii nialahsorciún crinduce a diarrea \. flatulencia
Zzúcar de caria y betabcl. Sorgo. Pifia. kwahorias

En la deficiencia de sacarosa, la rnalabsorciiiii
,

flatulenci:

Jcar princ ipal de l a

condroitina y la heparina (figura 15-16}, descritos con detalle en el capítulo 57. Las gliicoproteínas (mucoproteinas) existen en muchas condicianes diferentes en los líquidos corporales y en los tejidos, incliiyendo las membranas celulares (capítulos 43 y 56). Son proteinas que contienen carbohidratos en diversas proporciones adheridos en fonna de cadenas cortas o largas (hasta 15 unidades), ramificadas o no. Estas se denominan cadenas oligosacáridas (aun cuando en ocaciones pueden exceder de 10 unidades). Los carbohidratos constituyentes se listan en el cuadro 15-5. Excepto en la colágena, la glucosa no se encuentra en las glucoproteinas maduras y, al contrario de los glucosaminoglucanos y peptidoglucanos, caTecen de acidos urónicos. Los acidos siirlicos son derivados N-acilo u Oacilo dcl icido neuraminico (figura 15-18). El hcido neurzimínico es un aziicar de nueve carbonos derivado d e la manosarnina (un epimero de la glu-

cosamina) y piruvato. Los ácidos siBlicos son constituyentes de gliicoproteínas y ganglicísidos(capítulos 16 y 56). Los gangliosidos tamhien son glucolípidos.

LOS CARBOHIDRATOS ESTÁN PRESENTES EN LAS MEMBRANAS CELULARES Y EN LAS LIPOPROTE~NAS
La estructura lipídica de la membrana celular se describe cn los capítulos 16 y 43. Sin embargo, el análisis de componentes de membranas celulares de los marniferos indica que aproximadamente 5% de ellos son carbohidratos. presentes como glucoproteínas y glucolipidos. Los cm-bohidratos también estan presentes en algunas lipoproteinas, por ejemplo, las lipoproteinas lipode baja densidad (1,DL del ínglks, iow-de~sifv proleiris). Su existencia en la superficie externa de la membrana plasmática (el glucocáliz) ha sido de-

Figura 15-14. Estructura del almidón. A: Amilosa, mostrando F estructura helicoidal. B: Amilopectina, mostrando un punto a de ramificación 1+ 6.

1 74 Binqztitnica de Harper

(Capitulo I 5)

Figura 15-5. Molecula de glurkgeno A: Estructura general B: Amplifimcibn de la estructura en un punto de ramificación. La molécula es una esfera que se aproxima a los 21 nm de diámetro y puede visualizarse en el microscopio elecirbnim. Tiene una masa rnolecular de 1' Da y consta de cadenas polisacaridas cada una de las cuales contiene alrededor de 13 residuos 0 de glucosa. Las cadenas son ramificadaso no ramificadas y se agrupan en 12 capas conoéntricas (enla figura sdlo se muestran cuatro). Las cadenas ramificadas (cada una tiene dos ramas) se localizanen las capas interiores y las cadenas no ramificadas en la capa externa (G. glumgenina, la primer molécula de la sintesis del gluc6geno)

mostrada con el empleo de las lectinas, vegetales que se fijan de modo especifico a ciertos residuos glucosilo. Por ejemplo, la concanavalina A tiene especificidad hacia r e s i d u o s alfa-glucosilo y alfa-manosilo. La glucoforina es la mas importante

glucoproteina integral de la membrana de los eritrocitoc humanos. Tiene 130 residuos de aminohcidos y se extiende por la membrana Eipidica, dejando porciones polipeptidicas libres tanto por el lado externo como por el interno (citoplismico) de la superficie. Las cadenas de carbohidrato únicamente están adheridas a la porcion arnino terminal del lado externo de la superficie de la membrana (capitulo 43).

-

Cuadro 15-5. Carbohidsatos que se encuentran en las g:lucoprot1eínas -. . . . .. .
xosas
a( M 4 osa (Gal)

RESUMEN
1) Los carbohidratos son constituyentes principales del alimento y los tejidos animales. Pueden caracterizarse por el tipo y número de residuos monosac8ridos en sus mol&culac. 2) La glucosa es el carbohidrato m b importante en la bioquirnica de los mamíferos debido a que casi todo el carbohidrato de los alimentos se convierte en glucosa por metabolismo adicional. 3) Los azúcares tienen un número elevado de estereoisbmeros debido aque contienen varios Atomos de carbono asjmétricos.

Acetil hexr

samin,
ntosas

tilglucosmiina (GlcNAc) iilgalactosíimina (GalNAc)
Arabinosa (Ara)

neurhico, is Derivados K-acilc1 del ácidom Ineurhico p r ejt:mplo, hciilo.h7-aceti'. . .... . .

. 1 ,,, figura predominante
C)rlmii

A.c,

15-18), e l ácido sialico

Quitina

Figura 15-77. beta-L-Fucoca(6-desoxi-p-L-galactoca)

Acido hlalurónico
HOCH,

4) Los monosacaridos de importancia fisiológica

cm-

H

HN*CO*CH

-

H

OH

Condro~tin 4-sulfato [Nofa: tambien hay 6-sulfatoj

HOCHZ

incluyen glucosa, que es el "azúcar sanguíneo", y ribosa, constituyente importante de nucleótidos y dcidos nucleicos. 5) Los disacaridos de importancia fisiolhgica son rnalíosa, intermedio importante en la digestión de alrnidbn y glucdgeno; sacarosa, irnportante como constituyente dietktico que se compone de h c l o s a y glucosa; y lactosa, hnico azticar encontrado en la leche y que contiene galactosa y glucosa. 6 ) El almidón y el glucógeno son polimeros de almacenaje de glucosa en vegetales y animales, respectivamente. Son fuentes importantes de energia de la alimentación. 7) Las carbohidmtos complejos contienen otros derivados como aminoazúcares, ácidos ur6nicos y ácidos sialicos. Incluyen a proteoglucanos y glucosaminoglucanos, que son elementos estructurales de los tejidos y glucoproteinas, que son proteínas que tienen adheridas cadenas de oligosacáridos; se encuentran en los organismos en numerosas ubicaciones, incluyendo la membrana celular. I

H

OH

Acido B-glucurónico

Suifato de N-acetiigaiactosamina

Heparina

Glucosamina sulfatada

Acido idudniw sulfatado

Figura 15-1 6. Estructura de algunos polisacaridos complejos y glucosaminoglucanos.

Flgura 15-1 8. Estructura del Bcido N-acetilneuraminico, un lcido siálico (Ac = CH3-CO-).

1 76

Bioq~iitnica Hurper de

(Capítulo 15)

REFERENCIAS
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Lípidos de importancia fisiológica
Peter A. Mayes, PhD, DSc

LOS L~PIDOS CLASIFICAN SE COMO SIMPLES O COMPLEJOS
Los Iípidos son un grupo heterogéneo de compuestos emparentados, real o potencialmente, por sus propiedades físicas. mis que por las químicas. Tienen la propiedad corntín de ser: 1 ) relativamente insoliibles en agua y 2) solubles en los solventes no polares como el Mer, el cloroformo y el benceno. Asi, los lipidos incluyen grasas, aceites, esteroides, c e r a y compuestos relacionados. Los lipidos son constituyentes importantes de la alimentación no cOlo por su elevado valor energitico, sino tarnbiin por las vitaminas liposolubles y los ticidos grasos escnciales contenidos en lagrasade los alimentos naturales.

La siguiente clasificaci6n de los lipidos modifica la de Eloor:
1 ) Lípidos simples: Ésteres de hcidos grasos con diversos alcoholes.

a. Crasas: h t e r e s de hcidos grasos con glicerol. Unagrasaen estado iiquido se conoce como aceite. b. Ceras: Esteres de icidos grasos con alcoholes rnonohidricos de peso molecular más elevado.
2) Lipidos complejos: Ésteres de ácidos grasos que contienen otros grupos quimicos además de un alcohol y del Acido graso.

IMPORTANCIA BIOMÉDICA
En el cuerpo, las grasas sirven como una fuente eficiente, directa y potencial, de energía directa cuando están almacenadas en el tejido adiposo. Sirven como aislante t&rmicocn los tejidos subcucaneos y alrededor de ciertos organos, y los Iípidos no polares actúan como alslantes clkctricos que permiten la propagacion rápida de las ondas dcspolñrizantes a lo largo de los nervios rnielinizados. El contenido de lipidos en el tejido nervioso es particularmente alto. Los lipidos y proteínas combinados (Iipoproteínas) son constituyentes celulares importantes que se encuentran en la membrana celular y en las rnitocondrias y sirven tambien como medios para transportar Iípidos en la sangre. El conocimiento de la bioquirnica de los Iípidos es importante en la comprension de muchas áreas biomkdicas de interés, por ejemplo, obesidad, aterosclcrosis y la fincibn de varios Acidos grasos poliinsaturadris en la nutrición y la salud.

a. Fasfolfpidos: Lipidos que contienen ademhs de hcidos grasos y un alcohol, un residuo de acido fosfdrico. Con frecuencia tienen bases nitrogenadas y otros sustituyentes, por ejemplo, en Ios glicerofosfolipidos el alcohol es el glicerol y en los esfingofosfolípidosel alcohol es la esfingosina, b. Glucolipidos (glucoesfingolípidos): Lipidos que contienen un ácido graso, esfingosina y carbohidratos. c. Otros lipidos complejos: Lipidos como sulfolipidos y aminolípidoc. También las lipoproteinas pueden colocarse en esta categoría.

3) Lipidos precursorm y derivados: Incluyen ácidos
gracos, glicerol, esteroides, alcoholes diferentes al glicerol y los esteroles, aldehidos de las grasas y cuerpos cetónicos (capitulo 241, hidrocarburos, vitaminas Eiposolubles y hormonas. Debido a que no poseen carga eleictrica, los acilgliceroles (acilglicéridos), el colesterol y los esteres de colestenlo sc IIaman Iípidos neutros.

LOS ÁCIDOS GRASOS SON ACIDOS CARBOXFLICOS ALIFÁTICOS
Los ácidos grasas existen en grasas y aceites naturales en gran parte como ésteres, pero se les encuentra sin esterificar como acidos grasos libres, modalidad plasmritíca de transporte. Los que existen en las grasas naturales generaln~ente contienen un níimero par de átomos dc carbono porque sc sintetizan a partir de unidadcs de 2 carbonos. La cadena puede ser saturada (esdecir, sin dobles ligaduras) o no saturada (con una o más dobles ligaduras).

Los acidos grasos saturados no contienen dobles ligaduras
Los acidos grasos saturados teóricamente se puedcn considerar como provenientes del ácido acético (CI4,-COOH) que sería el primer miembro de la serie en la cual se adicionan progrer~vamente --CH?entre Ins grupos 4 O O H y el CI1,- termina1. Ejemplos de los ácidos de esta serie se muestran en cl cziadro 16-1. Se sabe que existen otros miembros de esta. serie con mayar número dc átomos de carbono,

Los acidos grasos se denominan de acuerdo a los hidrocarburos correspondientes
a noinenclatura cistemhtica usada mis frecuentemente , [

" -

<

Cuadro 16-1. Ácidas grasos saturados
Numei

-. "

Nombre común

se basa en poner al icido graso el nombre del hidrocarburo con el mismo número de átomos de carbono, sustituycndo la. o final por la tenninacion -oico (sistema ginebrino). Así, los ácidos saturados terminan en -iinoico, por ejemplo el ácido octanoico, y los ácidos insatiirados cnn dobles ligaduras terminan en -cnoico, por ejemplo, el ácido octadecenoico (Acido oleico}. Los ritornos de carbono se numeran a partir del carbono mrboxilico(carbonoNo. 1). Al átomodecarbono adyacente al carbono carboxilico (No. 2) 5e le conoce también como el carbono alfah1,os itomos de carbono No. 3 y Nci. 4 son el carbono beta y el carbono gamma; el carbono metiiico terminal se conoce como carbono omega o carbono n. Se usan varios convencionalismos para indicar el numero y I A posicibn de las dobles ligaduras, por ejemplo, A'5ndica una doble ligadura entre Ios &tomos de carbono 9 y 10 del hcido graso; el símbolo m 4 indica una doble ligadiira en el noveno carbono contando desde el itomo de carbono omega. Una costumbre in iiy difiindida consiste en indicar el número de atitornos de carbono y el número y la posición de las dobles ligaduras como se muestra en la figura 16-1. En los animales, las dobles ligaduras adicionales se introducen solo entrc la doble ligadura existente (por ejemplo, (119, w6 u w3) y el carbono del carboxilo, conduciendo a Eses series de &cidos grasos, conocidas como las familias 09, m 6 y w3, recpcctivamente.

Fhrmice*
Acftico

2

1 Principal producto final de
rilmcllt
u i i vlVLIUbLU

Interviene en cl metabiilisrno de las unidddes *'Cl (fomiato)
"

Li ;

' fcrmc:ntacion di: carbohidradel tos pi31. microor
-

Caproico

ExisTcn mi ntrlueii~x.,>..&,:,l* . . irnr criiiii~iíadcs en ciertas grasas (cspccialmente: cn la mntitcquilln) Iln producto final ri e la Ikrrnentar:ihi 7 ne carnohidratos pnr
en cn peclueAas cnriti-

1 1 1 ~ ~de la fer1 rncntaciiin de (;arhnhidra tos rumen . -- noi del-- -

en mucnas grasas (iiiilla): cspccliil-

vegetal
,,311b1lllaliCLI*

IiIIIICLU,

CLllllcn)CU

dra dt:palma, at
el, nianteq .......................

Nuez
1,

,,cn,.lo iirti>baiiix,

ciiiiiciiui

o

de

aceites dl

to.

:quilla
mes cn totins Iss Erasas

-is)

'
Figura 16-1. Acido oleim, n-9 (n menos 9) es equrvalente a (:19

iceite de ciicahiia ,,,,, --, . , * r.c[ric[amcntc.no es un aerivauo airIU1111. TarnbiCn se forma en el ciego de los hcxbívor'os y cii menor cantidad en el colon de seres hurnni 10s.
-a

Cerek
1

Lipidos de importancia fisiol6:ica

J 79

en especial en las ceras. Tambikn se han aislado algunos hcidos grasos de cadena ramificada de fkentes vegetales y animales.

Los ácidos grasos insaturados contienen una o más dobles ligaduras (cuadro í6-2) Se pueden subdividir según el grado de insaturacihn en:
1) Ácidos monoinsaturados (rnonoetenoide, monoenoico), que contienen una doble ligadura.

2) Ácidos poliimburadm ( p o l i o i d e , polienoioo), que contienen dos o más dobles ligadurac. 3) Eicosanoides: Estos compuestos derivados de IOF Acidosm eeiosapolienoicos (20-421, m, prenden a los prmtanoides y los Ieumtrienos (LT). Los prostanoides incluyen a las prostaglandinas (PG), prostaciclinas (PGI) y tsomboxanos (TX).

Las prostaglandinas fueron descubiertas originalmente en el plasma seminal, pero ahora se sabe qiie
mportencia fisiolhgica y nutricional
.

--- .-. -

Cuadro 16-2. Ác idos grasi
común

. - .. -. -- -- . . ..- -. . .

-. - . . .

-

-..

llUIrleruuiatomi~T de C y porricibn de as dobles Iligaduras
. "
-

-

Yambre sir

Presencia
-

oicos (una doble liga

I casi

todas las grasas

isiblemente el icido graso mas rnun en las grasas naturales
laidico
nicico
1 o nabo j 7 a
I

erv6nico
,,,.,,,,,,,, , " ,,,,..,,, +

1 cir- 1 5 - ietracoseno
, ,,, ,,, ,,, ,,

.

,

.

los cerebr

IX:2;9.12
-

,.
-%

Ácirlos dienoic:os (dos ,,,,,,,,,, do

1 h d o s cis-Y,~ Z - O C ~ ~ ~ ~ C ~ Maíz,~ cacahuate. semillas de alIC O~CO
dhn, frijol de soju 1
SS

. .-

I

i ac, cites vegct; ales

-

Ácidos trienoicos (tres dohles ligaduras)

18:3;6,Y,12

gmrna-l ,i-

noico
& -

nolenico
Todos ci.
ioico

AI gunas plantas; por gempio, aceite i de la hierba del asno; hcido graso i mi:nor en los animales --

1

Acidos tetrnenoicos (cuatro dobles lig

1

"

"

A

"

-

C ) frecuencia se encuentra juntO cn con el áado linoleico pero en pa rtic ular en el eiceite de !iri a a
m

r n q u i d b Todos c i co 1

-1

encuentra en grasas animales y en aceite de i:acahuatc; cornponcnte A. pul iruiiG U< los fosfolipidos en los imales
,, , d , , ,

Ácidos pentaenoiicos (cinco dobles lig

22:5;7,30,13,16,19

aceites de pescado, huevo, higado d e bacaIao,marcarda. shbaio, salmiin

1 tenoico
icos (seis dlobles ligniiduras)
,%A

rehro
17 16.19-ducuhn- . l r c e i i c b uc pcxauu. i u ~ i v ~ ~ l i i u u s uel
-

Lcr voriico

1 hexanoico
I

uulii. crh-.t, t , I u

'

-

-1- cerebro .. . .
.

existen virtualmente en todos los tejidos de marniferos y que actúan como hormonas locales; tienen importaiites actividades fisiolbgicas y farmacológicas. Son sintetizadas in vivo por ciclización del centro de la cadena de carbono de los ácidos grasos poliinsaturados 20-C (eicosanoicos) (por ejemplo, ácido araquidónico) para formar un anillo ciclopentano (figura 16-2 j. Una sene análoga de compuestos, los tromboxanos, descubiertos en las plaquetas, tienen el anillo ciciopentano interrumpido por un átomo de oxígeno (anillo oxano) (figura lb-3). Tres hcidos grasos eicosanoicos diferentes daii origen a tres grupos de eicosanoides caracteri7ados por el niirnere dc dobles ligaduras en sus cadenas laterales; por ejemplo, PGi, PG?, t'G3. Las variaciones en los grupos sustituyentes adheridos a los anillos originan tipos diferentes en cada serie de prostaglandinas y tromboxanos, denominados A, B, etcetera. Por ejemplo, el tipo "E" de prostaglandina (como en PGE:) ricnc un grupo cet6nico en la posición 9, en tanto que el tipo "F" tiene un grupo hidroxilo en esta posición. Los leucotrienos y las Iipoxinas son un tercer grupo dc derivados eicosanoidcs romados por la via de Ia lipoxigenasa mas bien que por ciclización de la cadena del ácido graso (figura 164). Descritos en un principio en los leucocitos, se caracterizan por la presencia de tres dobles ligaduras conjugadas, respectivamente.

Figura 1 6 3 . Tromboxano A2 (TXA2)

La mayor parte de los ácidos grasos insaturados naturales tienen dobles ligaduras cls
Las cadenas de carbono de los ácidos grasos saturados tienen un patrón de zigzag cuando se extienden, corno seria el caso a temperaturas bajas. A temperaturas mayores, algunos enlaces giran, haciendo que la cadena se acorte, lo cual explica por que las biornembranas se adelgazan cuando la temperatura aumenta. En los ácidos grasos insaturados existe un tipo de isomeria geométrica, dependiendo de la orientación de los átomos o grupos funcionales alrededor del eje de Ias dobles ligaduras. Si las cadenas acilo están en el mismo lado del enlace es ~ i scomo en el ácido oleico; si estan , en lados opuestos, es tran~, como en el acido elaidico, isómero del Acido olclico (figura 16-5). Los hcidos grasos insaturados de cadena larga que existen en la naturaleza son casi todos de la configuración cis, con

un "doblez" de 120" en la doble ligadura. Por tanto, el iicido oleico tiene forma de L, en tanto que el ácido elaidico se conserva "recto" en su doble ligadura Irunh. El aumento en el numero de doblcs ligaduras cis en un Bcido graso conduce a una diversidad de configuraciones espaciales prisi hles de la mulécula. por c,jcmplo, ácidri araquidonico, con cuatro enlaces dobles crs, puede tener "rizos " o una forma de U. Esto puede tener un significado profiindo e n el empaquetamiento molecular dentro de las membranas y en las posiciones ocupadas por los acidos grasos en moleculas más complejas como los CosfoIipidos. La presencia de dobles ligaduras trans alterará las relaciones espaciales. Algunos alimentos contienen hcidos grasas fraris.I,a mayor parte son subproductw en la saturacion de los ácidos grasos durante el proceso de hidrogenación o "endurecimieiito" de aceites naturales para fabricar margarina. Una contribución pequefia adicional proviene de la íngestihn de grasas de n i rniantes que contienen ácidos grasos iruns procedentes de la acción de los rnicroorganismos en el rumen.

Las propiedades físicas y fisiolcigicas de los ácidos grasos están determinadas por la longitud de su cadena y por su grado de insaturación
Por tanto, los puntos de fusión de ácidos grasos con un numero par de carbonos se elevan con la longitud de Ia cadena y bajan de acuerdo a la insaturacion. U n triacilglicerol que contienc todos los Bcidos gracos de 12 C omhc saturados, es s6lido a la temperaturacorporal, en tanto que, si los tres residuos de ácido graso son I&:2,es liquido por abajo de O "C. En la práctica, los acilgliceroles naturales contienen una mezcla de ácidos grasos que los adapta con precisión a sus funciones.

Flgura 46-2. Prostaglandina

E2

(PGE2).

Figura 1 6 4 . Leucotrieno A4 (LTA4)

Lipidos de importancia fisinlb~ica 18J

puesto que se forma por tres residuos d e acido estearico esterificados por el glicerol. Un ejemplo de acilgliceroles mixtos se muestra en la figura 16-7.

Los átomos de carbono 1 y 3
del glicerol no son idénticos
Cuando es necesario numerar de manera inequívoca a los carbonos del glicerol, se utiliza el sistema -sn(s~ereuchernreal numhering = numcraciún estereoqu imica), por ejemplo, 1,3-distearil-2-palmitil-.m-gliceroI (que se muestran GQmOuna fbmula proyectada tarnbien en la tigura 16-81, Es importante comprender que los carbonos 1 y 3 de glicerol no son iddnticos cuando se ven en tres dimensiones. Las enzimas los reconocen con facilidad y son casi siempre especificas para uno u otro carbono; por ejemplo, el glicerol siempre es fosforilado en sn-3 por la glicerocinasa para dar 3-fosfato de glicerol y no 1-fosfato de glicerol. También se encuentran en los tejidos acilgliceroles parciales que consisten de mono y diacilgliceroles en los cuales dos hcidos grasos o solo uno esthn esterificados con el glicerol. Estos son de particular importancia en la síntesis e hidrolisis de los triacilgliceroles.

: (Bcido oleico) Forma cis :
\

II c

'.

("H

Y'
coo -

Figura 16-5. lsomeria geometrica de los ácidos grasoc d9,I 8.1 (Acidos oleico y elaidico).

Los lípidos de la membrana, que deben ser líquidos a todas las temperaturas ambientales, son más insaturados que Ios lipidos almacenados. Los Iipidos que en los tejidos están sujetos a enfriamiento, por ejempIo, en hihernadores o en las extremidades de animales, son más insatusados.

LOS FOSFOL~PFDOS SON LOS PRINC1PALES CONSTITUYENTES LIP~DICOS LAS MEMBRANAS DE
Los fosfollpidoc comprenden los siguientes grupos: F j hcicido fosfatidico y fosfatidilgl iceroles, 2) fosfatidi lcolina, 3 ) fosfatidiletanolarnina, 4) fosfatidilinositol, 5) fosfatidilserina, 6j lisofosfolipidos, 7) plasmalógenos y 8) esfingomielinas. Todos &tos son fosfoacilgliceroles, diferentes de las esfingomielinas, las cuales no contienen glicerol. Pueden considerarse como derivados del hcido fosfafidico (figura 16-9), en donde el fosfato se esterifica con el - 0 H del alcohol adecuado. El ácido fosfatídico es muy importante como intermedio en la síntesis de triacilgliceroles y fosfollpidos, pero no se encuentra en gran cantidad en los tejidos.
4
S

Ciertos alcoholes se encuentran en los Fípidos naturales Los alcoholes relacionados con los lipidos incluyen el glicerol, el colesterol y los alcoholes superiores (por usualmente enejemplo, alcohol cetílico, C L ~ H ~ ~ Q H ) , contrados en las ceras y cl alcohol poliisoprenoide, dolicol (figura 16-26), LOS TRIACILGLICEROLEC (TRIGLICERIDOC)*SON LAS PRINCIPALES FORMAS DE ALMACENAJE DE LOS ÁCIDOS GRASOS Los triacilgliceroles son &eres del alcohol glicerol y ácidos grasos. En las grasas que se encuentran en la
naturaleza, la proporción de rnoleculas de triacilgliceroles que contienen el mismo residuo de ácido graso en las tres posiciones esterificadas ES muy pequetia. Casi todos son acilgliceroles mixtos. En la figura I 6 4 , si los tres ácidos g a s o s representados por R fueran Bcido estchríeo, la grasa scrla la triestearina,

I)e acuerdv con la terminología estandarizadaactual dc la Uniún Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC.

del inglks, lnrernat~onal Union o Prwe and Applled f Chemishy) y de la Unibn Internacional de Riuquiiiiica (IUB, del ingles. Inlernaiiunal IJniun nJ Bincirerni.~tg~). los monuglicéridos, digliceridos y triglirkridos se designarj, en adelante como monoacilglicerciles,diacilglicernles y triacilgliceroles, rcspcctivamentc. Stn embargo, la terminología anterior se utiliza con amplitud, cn particular en la medicina clinica.

18.2 0 Bioauimica de Harner

(Capítulo 16)

O O 'CH, - O-C-R, II R, -C -O 261-1 O
I
II

La cardiolipina es el principal Iipido de las membranas mitocondriales
El hcido fosfatidico actúa como precursor del fosfatidilglicerol, el cual n su vez, da origen a la cardiolipina (figura 16-1 0) en las rnitocondrias.

II

T H , -O-C-R, Figura 16-6. Triacilglicerol.

Las fosfatiditcolinas (lecitinas) se encuentran en las membranas celulares
Éstas son fosfogliceroles que contienen colina (figura 16-1 1 ). Son los fosfolipidos m6s abundantes de E a membrana celular y constituyen la reserva corporal mhs importante de colina. Esta última se requiere como neurotransmisor y para almacenar grupos metilo libiles. La dipalmitil-iecitina es un agente activo de superficie muy eficaz y el principal constituyente de los surfactantes que impide la adherencia debida a la tensión superficial, de las superficies internas de los pulmones. Su ausencia en los pulmones de los Iactantesprernaturos causa el sindrome de insuficiencia respiratoria. Sin embargo, la mayor parte de los! fosfolipidos tienen un radical acilo saturado en la posicidn an-1 y un radical no saturado en la posición sn-2 del glicerol. La Fosfatidiletanolamina (cefalina) difiere de las lecitinas s61o en que la etanolamina reemplaza a In colina (figura 16-12). La fosfatidilserina, que contiene al aminokcido serina en lugar de ebnolamina, se encuentra en la mayor parte de los tejidos (figura 16-13), También se han aislado fosfolipidos que contienen tresnina.

Figura 16-7. 1,3-Diectearopalmitina.

I
H$-

O - C-R,

O lf

E! fosfatidilinositol es un precursor de segundos mensajeros
El inositol se halla como el estereois6mero mioinositol (figura 16-1 4). El 4,Hifosfato de fosfatidilinositoE es un constituyente importante de los fosfolipidos de la membrana celular, con la estimulaci6n por un agonista hormonal apropiado, se separa en diacilglicerol y trifosfato de inositol, actuando ambos como sefiaies internas o segundos mensajeros (capitulo 44).

Figura 16-8. Triacil-snglicerol

O
O
rl

CH,I
I

II C-Rl

R2-

C - O-CH

CH, - O - P - 0 I

R

Los lisofosfolípidos son intermedios en el metabolismo de fosfogliceroles
Estos fosfoacilgliceroles contienen s61o un radical acilo; por ejemplo, la lisolecitina que es importante en el metabolismo y en la interconversibn de los fosfolipidos (figura 16-1 5).

0-

Figura 16-9. Acido fosfatidico.

Fosfatidil acilglicerol

Diosfatidil acilglicerol (cardiolipina)

Figura 16-10. Cardiolipina (difocfatidilgiicerol)

Los plaamalógenos se encuentran en el cerebro y los músculos
o
II

lp,-O-C-R,

R r C -02CH

9 T H , -0-7 -O-CI
I

i- CH,
\CH,
Colina

F H 3

O-

c
Figura 16-1 1. 3-Fosfatidilcolrna

Estos compuestos llegan a constituir hasta 10% de los fosfolípidos del encefalo y del músculo. Estructuralmente, los plasmalogenos semejan a la fosfatidiletanolamina, pero poseen un enlace éter en el carbono SPI-1 en lugar del enlace &ter normal que se encuentra en casi todos los acilgliceroles. Clasicamente el radical alquilo es un alcohol insaturado (figura 16-1 6). En ocasiones la colina, la serina o el ínositol pueden sussituirse por la etanolamina.

Las esfingomielinas también se presentan en el sistema nervioso
u
l7HI -O-C-Rl RrC-OLyH
>CHl -O-P
11

f
1

-O-CH2*

O-

CH,NHi
Etanolamina
J

Las esfingomielinas se encuentran en grandes cantidades en el endfalo y tejido nervioso. Por hidrólisis de las esfingomielinas se obtienen un hcido graso, hcido fosfbrico, colina y un aminoalcohol complejo, la esfingosina (figura 16-17), N o hay glicerol. La combinación de la esfingosina con un Acido graso se conoce con el nombre de ceramida, estructura que también se encuentra en los glucosfingo1 ipidos (vkase adelante).

Figura 16-1 2.3-Fosfatidiletanolamina.

14

II

'yH2 -O-C -R1
FH,

c - o -%tiI

- O-P

HHa+ FI -0-CHp-Ctl-C00I

o-

F C

Serina

Y

Fígura 16-1 3. 3-Fosfatidilserina.

Figura 16-14. 3-Fosfatidilinositol.

CH2- O-C-R

7

LOS GLUCOL~PIDOS (GLUCQESFINGOL~PIDOS) TIENEN IMPORTANCIA EN TEJIDOS NERVIOSOS Y EN LA MEMBRANA CELULAR
Los glucolipidos están distribuidos ampliamente en cada tejido del cuerpo, en particular en el tejido nervioso (como en el cerebro). En especial, se encuentran en la capa extenia de la membrana plasmática donde forman partc de los carbohfdratos d e la superficie celular. La glucolipidos principales en los tejidos animales son los glucoesfingolipidos. Contienen ceramida y una o mas anicares. Los dos más sencillos son galactosilceramida y glucosilceramida. La galactosilceramida es un glucoesfingolipido mayoritario del cerebro y otros tejidos nerviosos, pero se encuentra en cantidades relativamentebajas en el resto del cuerpo. Contiene cierto número de acidos grasos C:r caracteristicos. La galactosilceramida (figura 1 6-1 8) puede convertirse a sulfogalactosflceramida (el sulfato clasico), que abunda en la mielina. La glucosilceramida es el glucoesfingolipido sencillo predominante en los tejidos extraneurales, pero también existe en el cerebro en cantidades pequefias. Los gangliósidos son glucosfingolipidos complejos que se derivan de la glucosilceramida. Un ganglidsido es un glucoesfingolipido que contiene adernh una o más moléculas de un ácido sihlico. El ácido neurarninico (NeuAc; capitulo 15) es el principal &ido siálico encontrado en los tejidos humanos. Los gangliosidos están presentes también en el tejido nervioso en concentraciones altas. Al parecer tienen funciones de receptor y otras. El gangliósido m8s simple en los te.jidos es Gw, que contiene ceramida, una molécula de glucosa, una mol&culade

Colina

Figura 16-15. Lisolecitina.

Etanolamina

Figura 16-1 6. Plasmalbgeno (fosfalidaletanolamina)

Ceramida

Acido fosfórico

I O=P-0
I

1

0

graso
-

O-CH,-CHyN(CH,lI,
Colina

+

Figura 16-1 7. Una esfingomielina

f

OH

\

1
CH,-(CH,),2-CH=
CH-CH-CH-N-C-

o
11
CH(0H) - (CH2)2i-CH,
Ácido graso por ejemplo, Bcido cerebróniw

H

I

Galactosa

O-CH,

Figura 16-18. Estructura de galactosilcerarnida (galactocerebrbcido, R = H) y sulfogalactosllceramida (un sulfato, R = ~ 0 4 ~ 7 .

Ceramida-Glucosa4alaciosa-A-Acetilgalaosa

(Acilesfingosina)

NeuAc oí

I

Cer-Glc-Gal-GalNAc-Gal NeuAc

I

Figura 16-19. Gangliosido G M ~ , rnonosfa10gangl1~sido es el receptor en el intestino humano para la toxina del cólera. un que

galactosa y una molCcula de NeuAc. En la nomenclatura abreviada que se utiliza. (3 representa al ganglibsido; M es una especie que contiene un monosialice y el subindice tres es un numero arbitrario asignado con base en SU migración crornatográfica. La estructura de un gangliósido más complejo derivado de GVI, Ilamado GM~, muestra en la figura 16-19. El GMIes se un compuesto de considerable interés biolbgico ya que se sabe es el receptor en el intestino humano para la toxina del colera. Otros ganglibsidos pueden contener de 1 a 5 moléculas de Bcido sihlico, dando origen a di-, trisialogangliósidos, etcétera.

comprender que en las fórmulas estructurales de los estcroidcs, un simple anillo hexagonal denota 1 de 6 carbonos completamente saturado, con todas las valencias satisfechas con ligaduras de hidrógeno a menos que se sefíale de otra manera, es decir, no es un anillo bencénico. Todas las dobles ligaduras se muestran como tales. Las cadenas laterales de metilo sc señalan como ligaduras sencilIas libres en el extremo (metilo) final. Esto sucede clásicamente en las posiciones 10 y 13 (constituyendo los atomes de CIs y Cis). Es comun una cadena lateral cn la posicihn 17, como sucede en el colesterol. Si el compuesto posee uno o m i s grupos hidroxilo y carece de grupos carbonilo y carboxilo, se trata dc un esterol y el nombre termina en -1.

LOS ESTEROIDES DESARROLLAN NUMEROSAS ACTIVIDADES FISIOLÓGICAS IMPORTANTES
El colesterol es quizá el esteroide mejor conocido debido a su relación con la aterosclerosis. No obstante, en bioquimica también tiene importancia debido a que es precursor de un gran numero de esteroides igualmente importantes que incluyen ácidos biliares, hormonas suprarrenales, hormonas sexuales, vitaminas D. glucósidos cardiacos, sitosteroles del reino vegetal y algunos alcaloides. Todos los esteroides tienen un núcleo ciclico semejante al del fenantreno (anillos A, B y C), al cual se une un anillo de ciclopentano (anilla D). Las posiciones de los carbonos en el núcleo esteroide se numeran como se muestra en la figura 16-20. Es impartante

Debido a la asimetría en la molécula esteroidea con posibles numerosos estereoisómeros
Cada uno de los anillos de seis carbonos del núcleo del esteroide es capaz de existir en la conformacibn tridimensional de "silla" o de "barca" (fígura 16-2 1). En los esteroides que se encuentran en la naturaleza, virtualmente todos los anillos estan en forma de "silla" que es la conformaci6n m8s estable. Respecto uno del otro, los anillos pueden ser crs o trans (figura 16-22).

Forma de "silla'

Forma de "barca"

Figura 16-20. El nicle0 esteroide.

Figura 16-21. Conformaciones de los estereoisdmeros

Figura 16-22. Núcleo generalizado de los esteroides que muestra (A) una mnfiguracibn trans total entre andlos adyacentes, y (E) una configuración cis entre los an~llos y B. A

La union entre los anillos A y B pueden ser cis O trans en los esteroidec que se encuentran en la naturaleza. Aquélla entre B y C es trans y la unión C/Des truns excepto en los gluc6sidos cardiacos y los venenos de sapo. Las ligaduras que unen grupos de sustitucion por arriba del pIano de los anillos se indican con líneas negras continuas (beta), mientras que aquellas que unen grupos por abajo lo están con líneas punteadas (al fa). El anillo A de un esteroide Salfa está siempre en la forma trans con respecto al anillo B, mientras que es cis en un ecteroide Sbeta. Los grupos metilo unidos los C i n y CI3 esthn invariablemente en la configuración beta.

El ergosterol es un precursor
de la vitamina D
El ergosterol existe en vegetales y levaduras y es importante por ser precursor de la vitamina D (figura 96-24). Cuando sc irradia con luz ultravioleta adquiere propiedades antirraquiticas debido a la abertura del anillo B (figura 5 3 4 ) .

El coprosterol se encuentra

en las heces
El coprosterol (coprostanol) existe en las heces como producto de la reducción, por las bacterias intestinales, de la doble ligadura entre los carbonos 5 y 6 del colesterol.

El colestro! es un constituyente importante de numerosos tejidos
El colesterol (figura 16-23) se encuentra ampliamente distribuido en todas las cdlulas del organismo, pero especialmente en las del teiido nervioso. Es un constituiente de mayor importancia de la membrana celular y de las lipoproteinas plasmaticas. A menudo se encuentra combinado con ácidos grasos como &ter de colesterilo, cuando se esterifica el grupo hidmilo de la oosicibn 3 con un acido graso de cadena larga, Existe :n Ias grasas animales, pero no en las vegetales.

Los poliprenoides comparten el mismo COrn~UestQ precursor que el
Aunque estos compuestos no son esteroides, están relacionados debido a que se sintetizan al igual que el colesterol (figura 28-2) a partir de unidades de isop p n o de cinco carbonos (figura 16-25). En el10s se incluye la u biquinona (capitulo 14), un miembro de

Figura g6-23. Colesterol, 3-htdroxi-58-colesteno.

Figura 16-24. Ergosterol.

Lípidos de in?portanciafisioIOgica 187

Figura 16-25. Unidad isoprenica.
Figura 16-26. Dolicol a alcohol de 95 carbonos, Cgs.

la cadena respiratoria en la mitocondria y el alcohol de cadena larga, dolicol (figura 16-26), que toma parte en la síntesis de glucoproteínas transfiriendo residuos de carbohidratos a residuos de asparagina del polipkptido (capitulo 56). 1,os compuestos isoprenoides derivades de los vegetales comprenden el hule, el alcanfor, las vitaminas liposolubles A, D, E y K, y el beta caroteno (provitamina A).

rior. El proceso completo puede ilustrarse como sigue:
1) Inicio: ROOH + metal(")++ ROO' + metal("- l P + H'
X'+KH+R0+XH

LA PEROXIDACIÓN DE LOS L~PIDOS UNA FUENTE ES DE RADICALES LIBRES
La peroxidación (autooxidacibn) de los Iípidos expuestos al oxígeno es la causa no sólo del deterioro de los alimentos (sancidez), sino tarnbidn del daflo a los tejidos rn vivo,donde pueden ser una causa di*chncer, enfermedades inflamatorias, aterosclerosis, envejecimiento, etcetera. t o s efectos deletéreos se inician por los radicales libres (ROO', RO' ,OH' ) producidos durante la formación de peróxido a partir de Qcidos grasos que contienen enlaces dobles de grupos metiIenos interrumpidos, es decir, de los Acidos grasos poliinsaturados que se encuentran en la naturaleza (figura 16-27). ~a pperoxidaci6n lipidica es una reacción en cadena que produce un suministro continuo de radicales libres que inician la peroxidacibn poste-

R' + 0 2 + ROO' ROO' + RH -+ ROOH + R., etcétera

3) Terminación:
ROO' + ROO* -+ ROOR + 0 2 ROO'+ R" +ROOR R' + R ' + R R

Puesto que el precursor rnolecular para el proceso de inicio es generalmente el producto hidroperoxido ROOH, la peroxidación de los lipidos es una reaccidn en cadena ramificadora con efectos potencialmente devastadores. Para controlar y reducir la peroxidacion lipídica, tanto los seres humanos en sus actividades como la naturaleza, usan los anbioxidantes. El galato

R

R m

R.

ROO*

-LvH

H

H

Al&

/ :H km
Hidroperbxido ROOH

+Rm

H

H

Malondialdehldo,

Figura 16-27. Peroxidadón de los lipidoc La reaccidn se inicta por la luz o por ionec metálicos. El malondialdehldo es el único compuesto formado por los Bcidos grasos con tres o mBs dobles ligaduras y se emplea como una medida de la peroxidacibn de los Ilptdos junto con el etano del carbono 2 terminal de los hcidos grasos omega3 y el pentano del carbono 5 terminal de los ácidos grasos omega6.

de propilo. butilato dc hidroxianisol (RHA, del inglCs, hutytated hdroq)unisole)y but ilato de h idrox itolueno (BI-ET,del inglés, hu~latedhydroxy~nluene) antison oxidantes usados como aditivos en los alimentos. Los antioxidantes naturales son la vitamina E (tocoferol), que ec liposoluble, y los uratos y la vitamina C que son hidrosolubIes. El heta caroteno es un oxidante cuando la PO: es baja. Los antioxidantes perttnccen a dos clases: 1) preventivos, que reducen la velocidad de iniciación de la cadena y 2 ) los interruptores de la cadena quc interfieren con su propagación Los antioxidantes preventivos incluyen a la catalasa y otras peroxidasas y reaccionan con ROOH y con quelantes de ionec metálicos como el dietilentriaminopentaacetato (DTPA) y etilendiaminotetraacetato (ED'I'A). Los antioxidantes interruptores de la cadena son a menudo fenoles o aminas aromat icas. /n vivo, los principales son: la superóxido dismutasa que actúa en la fase acuosa para atrapar a los radicales superóxido libres (O2-); ea1 ve2 el urato; y la vitamina E, que actúan en la rase lipídica para atrapar a los radicales ROO' (figura 53-9). La peroxidacion rn vivo se cataliza tam bien por los compuestos hemicos y por las lipoxigenasas que se encuentran en plaquetas y leucocitos, etcetera.

Q

L

ente del ente

Triscilglicerolea

l

t

Ácidos grasos libres

Colesterol 1,3-üiacllgliceroles 1,Z-Diacilgliceroles

Figura 46-20. Separaciónde las principales clases de Ifpidos por cromatografia en capa fina. Un sistema adecuado de solventes para ellos seria hexano-&ter dietilico-acido famiice

(80~ O ' ~ V / V / V ) .

PARA IDENTIFICAR Y SEPARAR L~PIDOS UTILIZAN METODOS SE CRQMATOGRÁFICOS
Los antiguos métodos de identificación y separacion de lipidos, basados cn procedimientos quimicos clasicos de cristaltzación, destilacion y extracción por solventes, se han reemplazado en gran parie por procedimientos cromatograficos. Particularmente util para la separación de las diversas clases de lipidos es la cromatografía en capa fina (CCF) (figura 16-28) y para la separación de los Acidos grasos individuales, la cromatografía gas-líquido (CGL). Antes de aplicar estas técnicas a los tejidos húmedos, los lipidos se extraen por un sistema de solventes usualmente basado en una mezcla de clorofomo-metano1 (2: 1).

LOS L~PIDOS ANFIBÁTICQS SE ORIENTAN POR S! MISMOS EN LAS ENTERFASES ACE1TE:AGUA
Forman membranas, micelas, liposamas y emulsiones
En general, los lipidos son insolubles en el agua puesto que en SU contenido predominan los grupos no polares (de hidrocarburos). Sin embargo, los ácidos

grasos, algunos fosfelipidos, esfingolipidos (las lipidos polares) y en menor grado, el colesterol, contienen grupos polares. Por tanto, parte de la molécula es hidrhfoba, o insoluble en agua, y parte es hidrófila o soluble en agua. Estas moléciilas se describen como anfipáticas (figura 16-29). En las interfases aceiteagua se orientan con el grupo polar en la fase acuosa y el no polar en la fase oleosa. Una capa doble de lales lipidos polarcs se considera como una estructura básica en las membranas biol~gicac(capitulo 43). Cuando se halla una concentración critica de estos lípidos en un medio acuoso, rorman micelas. Los agregados de salec biliares en micelas asi como Iiposomas, y Ia formacibn de micelas mixtas con las productos de la digestión de las grasas son importantes para facilitar la absorción de lipidos en el intestino. Los liposomas pueden formarse sorneticndo a un lipido anliphtico aultrasonido en medio acuoso. Consisten en esferas de dobles capas de Iipidos que encierran parte del medio acuoso. Tienen uso clínico potencial, particularmente cuando se combinan con anticuerpo5 específicos de los tejidos, como transportadores de fármacos en la circulacibn, orientados a órganos específicos, por ejemplo, en la terapéutica del cáncer. Ademas, se les utiliza como gen transferidor hacia el interior de las células vasculares y como porteadores para la administraciiin topica y transd6rmica de medicamentos y cosmeticos. Las ernalsiones son partículas mucho inhs grandes, usualmente formadas por lipidos no polares en un medio acuoso. Son estabilizadas por agentcs emulsionantes como los lipidos an fipáticos (por ejemplo, la lecitinn) los cuales forman una capa superficial que separa la masa principal del material no polar de la fase acuosa (figura 16-29).

Grupo polar o hidrdfilo
Grupo no polar o hidrofob
Fase acuosa

Fase acuosa

Fase "olsosa"o no polar
!

000

Fase acuosa

"k
Compat4rmientos
~CUOSOS

DE ACEITE EN

AGUA
O

Bicapas Iipidicas

LlPOSOMA (UNICAMELAR)
E

LlPOSOMA (MULTILAMELAR)
F

Figura 16-29. Formacidn de membrana Iipidicas, micelas, ernulsiones y liposomas a partir de lípidos antipatims. por ejemplo, fosfolipido

RESUMEN
1) Los lipidos tienen la propiedad común de ser relativamente insolubles en agua (hidrofobos) pero solubles en solventes no polares. Sin embargo, los lipidos anfipaticos tienen agregado uno o mhc gmpos polares que los vuelve en particular adecuados como constituyentes de membranas en interfases 1ipidolagurt. 3) Los lípidos de mayor importancia fisiol6gica son los acidoc grasos y sus esteres, junto con colesterol y otros esteroides. 3) Los ácidos grasos de cadena larga pueden ser saturados, monoinsaturados o poliinsaturados, de acuerdo con el número de dobles ligaduras presente. Su fluidez disminuye de acuerdo con la longitud de la cadena y aumenta con el grado de insaturacion. 4) Los eicosanoides se forman de hcidos grasos poliinsaturados de 20 carbonos y constituyen un grupo

importante de compuestos activos en aspectos fisiológicos y farmacológicos, conocidos como prostaglandinas, iromboxano, leucotrienos y lipoxinas. S) Los Csteres de glicerol son respecta a su cantidad, los lipidos más importantes, representados por triacilglicerol ("grasa"), que tiene gran significado como constituyente principal de las lipoproteinas y como manera de almacenaje de Iípidos en el tejido adiposo. Los fosfoacilgliceroles son Iípidos anfipaticos y cubren numerosas funciones importantes; por ejemplo, constituyentes mayores de las membranas y de su capa exterior de Iipoproteínas, tensoactivos en el pulmón, precursores de segundos mensajeros y componentes importantes del tejido nervioso. 6) Los glucolipidos son tambiCn constituyentes significativos del tejido nervioso, como el encéfalo y la capa exterior de la membrana celular, donde forman parte de los carbohidratos de la superficie celular.

190 Broquímica de Hurpr

(Capitulo 16)

7) El colesterol, como lipido anfipático, es un componente importante de las membranas. Es la rnolecula precursora a partir de la cual se sintetizan los demás

estervides corporales. Éstos incluyen hormonas importantes como las suprarrenacorticales y sexuales, vitamina B y hcidos biliares. M

REFERENCIAS
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Gurr

Panorama del metabolismo intermediario
Peter A. Mayes, PhD, DSc

El destino de los componentes de [a dieta después de la digestidn y la absorción, constituye el metabolismo intermediario. Por tanto, abarca un campo extenso que no sólo describe las vias metabólicas seguidas por las moléculas individuales, sino que intenta comprender sus interrelaciones y los mecanismos que regulan el flujo de los metabolismos a través de ellas. Las vías metabóli cas pueden c tasificarse en tres categorías (figura 17-1): 1) Vías anabhlicss, se ocupan de la síntesis de los compuestos que constituyen la estruc-

tura y la maquinaria corporal. Una de ellas es la sintesis de proteinas. La energia libre requerida por estos procesos proviene de la categoría siguiente. 2) Vias catabólicas, realizan procesos oxidativos que producen energia libre, por lo general, en forma de fosfatos de alta energia o de equivalentes reductores, por ejemplo, la cadena respiratoria y la fosforilacibn oxidativa. 3) Vías anfibálicas, con mhs de una función y tienen lugar en las "encrucijadas" del metabolismo, cuando actijan como enlace entre las vías anabblicas y catabdlicas, por ejernplri, el ciclo del Acido citrico.
Proteinas, carbohidratos, lipidos. Icidos nucleicos, etdtera

Mol&ulas
del alimento

Digestidn

Molbculas sencillas

Vlas

Otms endergdnicos

aníibólicas

Figura 1 7 4 . Las tres categorlas princrpales de las vías metabblicas. Las vías catabblicas producen energía libre en forma de equivalentes reductores (2H) o fosfato de aRa energia para suministrarla a ias vías anabblicas. Las anfibblicas actuan como enlace entre las dos categorías anteriores.

(a)

192 a Bioquirnica de Harper

(Capítulo 17)

El conocimiento del metabolismo en el animal normal es rin prerrequisito para la comprensión profunda de las anomalías que se producen en muchas enfermedades. El metabolismo normal incluye las variaciones y adaptaciones necesarias en periodos de inanicihn, qiercicio, embarazo y lactancia. Los desequilibrios del metabolismo son consecuencia de, por ejemplo, una deficiencia nutricional, deficiencia de enzimas o la secreción alterada de hormonas. Un ejemplo importante de una enfermedad causada por metabolismo alterado ("enfermedad metabólica") es la diabetes sacarina.

LAS V ~ A S E T A B ~ L I C A S M BASICAS PROCESAN LOS PRODUCTOS PRINCIPALES DE LA DIGESTION
La naturaleza de la alimentación define el patr6n btisico del metabolismo en los tejidos. Los mamíferos como el ser humano necesitan procesar los productos a absorbidos de E digestión de carbohidratos, lipidos y proteínas de la dieta. Los principales son glucosa, Acidos grasos, glicerol y aminoácidos, respectivamente. En los rumiantes (y en menor extensihn en otros herbívoros), la celulosa proveniente de los alimentos la digieren microorganisrnos simbiontes a hcidos grasos de peso molecular bajo (acdtico, propiónico y butírico) pues en estos animales el metabolismo tisular se ha adaptado para utilizar ácidos grasos de cadena corta como sustratos principales. Todos estos productos de digestibn se procesan por sus vias metabólicas respectivas a un producto común, acetiE-CoA, que luego se oxida en el ciclo del icido citrico (figura 17-2).

Figura t7-2. Esquema de las vías para el catabolismo de carbohidratos, protelnas y grasas dietarias. Tpdas las vias conducen a la producudn de acetil-COA, mal se oxida en la el ciclo del ácido citrico, originando finalmente ATP en el procese de fosforilacibn oxidativa.

El metabolismo de los carbohidratos se ocupa del destino de la glucosa (figura 17-31
Todas las cklulas de los mamíferos metabolizan la glucosa a piruvato y lactato por la vía de la glucóIisis. La glucosa es un sustrato único ya que la gluc6lisis puede realizarse en ausencia de oxígeno (anaerobia) y el producto final es el lactato. Por otro lado, Ios tejidos que pueden utilizar el oxigeno (aerobios) tienen la facultad de metabolizar el piruvato a acetilXoA, que puede entrar al ciclo del itcido cítrico para su oxidacibn completa a COI y HzO,con producción de gran cantidad de energia libre como ATP en el proceso de fosforilación oxidativa (figura 18-21. Asi, la glucosa es el combustible principal de numerosos tejidos. Ademis, con algunos de sus metabolitos, interviene en otros procesos, como los siguientes: 1) conversi611

a su polimero de almacenaje, gluc6gen0, particularmente en el músculo esqueIético e hígado. 2) La vía de la pentosa fosfato que proviene de intermediarios de la glucólisis. Es una fuente de equivalentes reductores (2H) para la biosintecis -por ejemplo, de ácidos grasos- y es tambikn fuente de ribosa, que se utiliza en la formación de nuclebtidos y hcidos nucleicos. 3) La triosafosfato da origen a la fracción glicerol de los acilgliceroles (grasas). 4) El piruvato y los intermediarios del ciclo del acido citrico proporcionan los esqueletos de carbono para la sintesis de aminohcidos y la acetil-CoA es el bloque estructural para los hcidos grasos de cadena larga y para el colesterol, precursor de todos los esteroides sintetizados en el cuerpo. El proceso que produce glucosa a partir de precursores que no son carbohidratos, como los lact a n t e ~ ,aminoAcidos y glicerol, se denomina gluconeogénesis.

EI metabolismo de los fipidos se centra principalmente en los ácidos grasos y en el colesterol (figura 1 7 4 )
El origen de los hcidos grasos de cadena larga es la sintesis de novo de la a c e t i l 4 o A a partir de los carbohidratos o lipidos de los alimentos. En los teji-

Panorama del metabolismo rnlermedrarro

193

Giudgeno

Glucofosfatas

Vias de la pentosa fosfato
'O
3i

O

Triosafosfatos

-----A-

-+

Rtbosafosfato

Acilglicerol

Acetil-Co-A - - f Ácidos grasos Colesterol

l

Proteína

1

Figura 17-3. Esquema del metabolismo de los carbohidratos que muestra las prinupales vlas y productos finalec La gluconeog8nesis no se muestra.

dos, los acidos grasos pueden ser oxidados a acetilCOA(beta-xidación) o esterificadosa acilgficeroles, donde, como triacilgliceroles (grasas), constituyen la principal reserva calhrica de! cuerpo. La a c e t i l 4 o A formada por la beta-xidacibn tiene varios destinos importantes.

tidad considerable de energía en la beta oxidacibn y en el ciclo del Bcido cítrico y, por tanto, son combustibles tisulares muy efi-

caces.
2) Es una fuente de &tomos de carbono para el colesterot y otros esteraidcs. 3) En el hígado forma cuerpos cetónicos, que son combustibles tisulares hidrosolubles alternos, los cuales se convierten en importante fuente de energía bajo ciertas condiciones (por ejemplo, en inanicihn).

1) Como en el caso de la a c e t i l 4 o A proveniente de los carbohidratos, es oxidada completamente a Coz+ H 2 0 en el ciclo del ácido cítrico. Los ácidos grasos producen una can-

194

Bioqeciminica de Harper

(Capitulo 17)

Dieta

e '

Carbohidrato Aminoácidos

\

Cuerpos cetónlcos

Figura 17-4. Esquema del metabolismo de Iípidos mostrando sus v[as y productos finales más importantes. Los cuerpos oetbnicos comprenden las sustancias acetoacetato, 3-hidroxibutirato y acetona.

Gran parte del metabolismo de los aminoácidos se enfoca a la transaminación (figura í 7 6 )
Los aminoácidos son necesarios para ta síntesis de proteinas. Algunos deben ser suminismdos de manera específica por los alimentos (aminoácidos esenciales), ya que los tejidos son incapaces de sintetizarlos. El resto, o aminohcidos no esenciales, también se obtienen de la dieta, pero pueden formarse a partir de intermediarios por transarninaci6n, utilizando el nitrbgeno arninico de otros arninoAcidos que estén en exceso. Después de la desaminacián, e3 exceso de nitrógeno aminico es eliminado como urea y los esqueletos de carbono que permanecen despuh de [a transaminación: 1) son oxidados a COIpor el ciclo del ácido cítrico, 2) forman glucosa (gluconeogCnesis), o 3) forman cuerpos cetónicos. Además de requerirse para la sintesis protelnica, los arninoácidos también son precursores de muchos otros compuestos importantes, como las purinas, pirirnidinas y hormonas como adrenalina y tiroxina.

LAS V ~ A S METABÓLICAS PUEDEN ESTUDIARSE A DlFERENf ES NIVELES DE ORGANIZACI~N
Hasta la fecha s610 se ha visturnbrado el metabolismo como ocurre en el organismo intacto. La ubicación e integracihn de vias metabblicas se han identificado por estudios a niveles menores de organización, esto es: 1) A nivel tejida y 6rgan0, la naturaleza de los sustratos que entran y los metabolitos que salen de tejidos y brganos es definida y su destino final se conoce. 2) A niver subcelular, pues cada organelo (por ejemplo, Ia mitocondria) o compartimiento (como el citosol) posee funciones bioquimicas especificas que determinan un patrón subcelular de vías metabblicas.

A tisu lar y de órgano, la circulación sanguínea se integra
al metabolismo
Los aminohcidos obtenidos de la digestión de las proteínas procedentes de los alimentos y la glucosa

Panorama del rnetabo/isrno intermediario 195

Cuerpos cetdnlcos
Nitrbgeno arnlnica en

del aado citrico

Figura 17-5. Esquema del metabolismo de aminoAcidos que muestran las vlas productos finales prinupales

que se produce durante la digestibn de los carbohidrato~, comparten una via común de absorcion por la vena portal hephtica. De este modo se asegura que ambos tipos d e metabolitos y otros productos hidrasolubles de la digestibn se dirijan inicialmente al hígado (figura 1 7 4 ) . El hígado tiene la funcibn rnetabólica primaria de regula la concentracibn sanguínea de la mayoría de los metabolitos, en particular de la glucosa y aminoácidos. En el caso de la glucosa, el exceso es convertido a glucbgeno (glucog~nesis) o a grasa (lipogénesis). Entre comidas el higado puede extraer sus reservas de glucbgeno para restituir la concentracibn sanguinea de glucosa (glucogen6Iisis) a, en colaboracibn con el rifíón, convertir metabolitos no carbohidratos como lactato, glicerol y aminohcidos en glucosa (gluconeog&nesis). La conservaci6n de una concentracidn adecuada de glucosa en la sangre es vital para ciertos tejidos en los que es combustible obligatorio, por ejemplo, el cerebro y los eritrocitos. Además, el hígado se ocupa de sintetizar las principales protelnas plasmáticas (por ejemplo, albúmina) y de desarninar a los aminohcidas que exceden los requerimientos, mediante la formación de urea, lacual es transportada por la circulacibn hasta el rifión para ser excretada. El mtsculo esqueletico utiliza glucosa como combustible, formando lactato y Coz. Almacena glucógeno que se utiliza como combustible en la contracci6n muscular y sintetiza proteínas musculares

a partir de aminaácidos procedentes del plasma. El musculo constituye aproximadamente 50% de la masa corporal y, en consecuencia, representa una reserva considerable de proteína que puede ser aprovechada para suministrar aminoácidos al plasma, en particular cuando la alimentación es escasa. Los Eipidos de la dieta (figura 17-71, principalmente triacilgliceroles, durante la digestibn forman monoacilgliceroles y acidos grasos, los cuales se recombinan con proteinas en las cdlulas intestinales; desputs se secretan, inicialmente al torrente linfático y de aht a la circulación como lipoproteínas,conocidas como quilomicrones. Todos los productos hidrófoims y liposolub~esde la digestibn, forman lipoproteínas para facilitar su transporte a los tejidos en un ambiente acuoso, el plasma. Al contrano.de la glucosa y los arninoácidos, tos triacilgliceroles quilomicrones no son captados por el hígado. Los tejidos extrahepáticos que poseen la enzima lipoproteína lipasa los metabolizan; esta enPma hidroli~a triacilglicerol, liberando el hcidos grasos que son incorporados a los tipidos tisulares u oxidados como combustible. La otra fuente principal de Acidos grasos de cadena larga es su síntesis (lipoghesis) a partir de carbohidratos, en particular en el tejido adiposo y en e[ higado. El trirtcilgliceral del tejido adiposo es la reserva de combustible mhs importante del organismo. Despuks de su hidrblisis Oiphlisis), los ácidos graso: pasan a la circulacibn como acidos grasos libres. Estos son captados por casi todos los tejidos (pero no por el

196

Bioquimicu de Jirarper

-

(Capitulo 17)

Roteinas plasmaticas

Figura i 7 4 . Transporte y destino de sustratos y metabolitos de los carbohidratos y aminoácidos principales. Nbtese que en el músculo hay escasa cantidad de glucosa libre, ya que es fosforilada con rapidez al entrar

cerebro y los eritrocitos) y esterificados a acilglicerofes u oxidados como combustible principal a Coz. Dos vías de importancia adicional existen en el hígado: I } el triacilglicerol en exceso procedente de la lipogenesis y de los Acidos grasos libres es secretado a la circulación como lipoprotelna de muy baja densidad (VLDL, del inglés, very Sow demi@ lipoprokin). Este triacilglicerol tiene un destino semejante al de los quilomicrones. 2) La oxidación parcial de los iicidos grasos libres conduce a la produccibn de cuerpos cetónicos (cetogenesis). Los cuerpos cetónicos son transportados a los tejidos extsahepáticos, donde actúan como otra fuente importante de combustible.

A nivel subcelular, la glucblisis se lleva a cabo en el citosol y el ciclo del ácido
cítrico en las rnitocondrias
En el cuadro 2 4 se proporciona un resumen de las funciones bioquimicas principales de los componentes y organelos subcelulares. No obstante, la mayoría de la ceIulas e s t h especializadas en sus funciones y tienden a enfatizar ciertas vias metabólicas y a relegar

,

otras. La figura 17-8 esquematiza las vías metab6llcas principales y su integracibn en una c61ula del parenquima hephtico, con knfasis especial en su ubicacion intracelular. De inmediato se observa la funci6n central del mitocondrión, ya que actúa como base y encrucijada del metabolismo de carbohidratos, lípidos y aminoácidos. En particular, alberga las en7irnas del ciclo del ácido cítrico, de la cadena respiratoria y la ATP sintetasa, de la beta oxidación de los ácidos grasos y de la producción de cuerpos cet~nicos. Además, es sitio de depbsito para los esqueletos de carbono de arninoácidos después de la transminacion y suministra estos esqueletos para la sintesis de aminoicidos no esenciales. La glucólisis, la vía de la pentosafosfato y la sintesis de ácidos grasos tienen lugar en el citosol. Se observará que en la gluconeogénesis, sustancias similares, como lactato y piruvato que se forman en el citosol, deben entrar al mitocondrión y formar axalacetato antes de su conversion a glucosa. Las membranas del retlculo endopliismico contienen el sistema ensirnhtico para la sintesis de acil-

Panorama del mefaholi.~mo infermediario 19 7

Figura 17-7. Transporte y destino de los sustratos y rnetabofitos prrncipales de los Iípidos (AGL, ácidos grasos libres: LPL, Iipoproteina Iipasa, MG, monoacilglicerol, TG, triacilglicerol, VLOL, lipoproteina de muy bala densidad).

gliceroles mientras que los ribosomas se ocupan de la sintesis proteínica. Puede apreciarse que el transporte de metabolitos de diferentes tamaiíos, carga y solubilidad a travks de las membranas que separan a [os organelos requiere mecanismos complejos. Algunos se explicarhn en relacibn con la membrana mitocendrial (capitulo 14) y otros en los capítulos siguientes.

total de una via rnetabblica (capítulo 9) . Sin embargo, la temperatura y et pH son factores que influyen en la actividad enzimatica, se conservan constantes cn los vertebrados de sangre caliente y tienen poca irnportancia reguladora. (No obstante, recuérdese la variación de pH en el aparato gastrointestinal y sus efectos en la digestión; capítulo 55).

Las reacciones "no equilibradas" son puntos de control potenciales

EL FLUJO DE METABOLITOS EN LAS VIASMETABOLICAS DEBE REGULARSE DE MANERA COMBINADA
La regulacion de todo el flujo a tmvis de una via metabblica a menudo se combina con el control de sólo l o quizá 2 reacciones clave en la vía, catalizadas por "enzimas reguladoras". Los factores fisicoqulmicos que controlan Ia velocidad de una reacción de cathlisis enzimática, como la concentraci6n de custrato son de primordial importancia en el control de la velocidad

En una reacción en equilibrio, las reacciones hacia adelante e inversa se llevan a cabo a velocidades iguales y por tanto no hay un flujo neto en cualquier dirección. Muchas reacciones en 7% vins metab6licas son de este tipo, es decir son reacciones equilibradas.

Por otra parte, In vrvo, bajo condiciones de "estado constante" habría probablemente un flujo neto de

CITOSOL

m

grasoe

Figura 1 7 4 . Ubicacibn rntracetular e integracibn de las vías metabblicas principales en una célula del parknquima hepdtico. (AA +, metabolismo de uno o m i s aminoAcidos esenciales, AA e,metabolismo de uno o más de los srninoácidos no esenciales)

izquierda a derecha debido al aporte continuo de A y la elirninaci~ncontinua de D. Esta via podria funcionar, pero tendría poco objeto controlar el flujo regulando la actividad enzirnhtica ya que un incremento de ia actividad s61o servirla para acelerar y lograr el equilibrio.

En E practica, en una vía metabolica hay invaa riablemente una o más reacciones del tipo no equilibrado en las que los reactantes se encuentran en concentraciones que están lejos del equilibrio. En un intento por alcanzarlo, se producen grandes pérdidas de energía libre en forma de calor, el cual no puede

Panorama del me fabolismo intermediario

199

ser utilizado de nuevo, haciendo que este ripo de reacción sea esencialmente no reversible, por ejemplo:
Calor

Reaccidn no equilibrada

Esta vía tiene flujo y direccidn, pero se agotaria a si misma si no se ejerciera control. Las enzimas que catalizan reacciones no equilibradas suelen estar en concentraciones bajas y sujetas a otros mecanismos de control. Esto es similar a la apertura y cierre de una válvula "unidireccional" permitiendo controlar el flujo total.

La reacción de generación de flujo es la primera reacci6n en una vía saturada con custrato
Puede identificarse como una reaccibn no equilibrada en la cual el Km de la enzima es considerablemente mas bajo que la concentracion normal de sustrato. La primera reacción en la glucólisis, catalizada por hexocinasa (figura 19-Z), es un paso generador de flujo debido a que su Km de 0.05 mmollL para glucosa es bastante menor que la concentracion sanguínea de glucosa de 5 rnmol/L.

LOS MECAN1SMOS ALOSTERICOS Y HORMONALES SON IMPORTANTES EN EL CONTROL METABÓLICO DE REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS
En la figura 17-9 se muestra una vía metabdlica hipotktica, A, B, C, D, en la cual las reacciones A B y C t D son equilibradas y B + C es una reacción , no equilibrada. El flujo a travds de una via de este tipo puede ser regulada por la disponibilidad de sustrato A. Esto depende de su abastecimiento por la sangre, que a su vez esta sujeto a la absarcibn de alimento por el intestino o a ciertas reacciones clave que conservan y liberan sustancias importantes a la sangre; por ejemplo, las reacciones que generan flujo, cataliadas por la fosforilasa en el higado (figura 20-l ), la cual ataca las reservas de glucbgeno y proporciona la glucosa sanguínea y la lipasa hormona sensible en el tejido adiposo (figura 27-8), que suministra Bcidos grasos libres, principales combustibles para los tejidos. El

flujo tambikn depende de la capacidad del sustrato A para pernear la membrana celular. Adernhs, dependerh de la eficacia de la eliminacibn del producto final D y la disponibilidad del cosustrato o cofactores representados por X e Y. Las enzirnas que catalizan reacciones no equilibradas son a menudo proteinas alostéricas sujetas a la rhpida accibn de "retroalimentación" o "alimentacibn delantera" controladas por modificadores alostericos, a veces como respuesta inmediata a las necesidades de la dlula (capitulo 1 1). Con ft-ecuencia, el producto de una via biosintética, como la acetiI4oA de cadena larga, inhibirá la enzima que cataliza la primera reacción en la via, por ejemplo, la acetil-CeA carboxilasa. Otros mecanismos de control dependen de la acci6n de hormonas que responden a las necesidades del cuerpo como un todo. Estas actúan por varios mecanismos diferentes [capitulo 44). Uno es la modificacibn covalente de la enzima por fosforilaci6n y desfosforilacibn. Ésta ec rápida y con frecuencia mediada a través de la formación del segundo mensajero cAMP, el cual a su vez convierte una enzima inactiva eii activa. Este cambio es originado por la actividad de una protetna cinasa dependiente de cAMP que fosforila la enzima, o por fosfatasas especificas que desfosforilan [a enzima. La forma activa de la enzima puede ser la enzima fosforilada, como en enzimas catalizadoras de vías degradativas (por ejemplo, la fosforilasa a) o la enzima desfosforili7ada, como las enzirnas catalizadoras de procesos de síntesis (como la glucbgeno sintasa a). Algunas enzimas reguladoras pueden ser fosforiladas sin intervencibn del cAMP y proteína cinasa dependiente de cAMP. Estas enzima5 responden a otras sefíales metabhlicas, como la relacibn [ATP]/[ADP], por ejemplo, pimvato deshidrogenasa (figura 196), o la proteína cinasa dependiente de Ca2'/calmodulina, por ejemplo, la fosforilasa cinasa (figura 206). Las hormonas pueden afectar la sintests de las enzirnas controiadoras del ritmo. Ya que esto incluye [a síntesis de nuevas proteínas, no es un cambio rápida pero a menudo es una respuesta a variaciones nutricionales. Por otro lado, las hormonas pueden actuar como inductoras o represoras de la formaci6n de mRNA en el núcleo, o estimulantes de la fase de traslacibn de la sintesis de proteínas a nivel ribosbmico (capítulos 41 y 44). Una caracteristica importante que ayuda al control metabblico es que las vias que catalizan la degradacibn de una sustancia no son una simple inversi6n de la sintesis. Por lo general participan dos vias independientes por completo, lo cual permite el control separado de cada una, por ejernpio, la síntesis de glucbgeno y su desdoblamiento (figura 20-1 j.

200 Bioquim ica de Happer

(Capitulo 17)

Inactiva

Enzl

Membrana

celular

X

Y

Activa

D -c

Activación alostArica "alimentacion delantera"

Inhibición afostkrica
negativa

retroalimentacion

Producción en el núcleo de mRNA

Induccibn
Figura 17-9.

Represibn

Mecanismos d e control de una reaccion catalizada por enzimas Los números en 10s círculos indican posibles sitios de actividad d e hormonas @ alteración de la permeabilidad de la membrana, inversibn de una enzima inactiva. por lo general involucra reacciones de fosforilaci6n, desfosforilacion, alteración d e la velocidad d e traslacibn del mRNA a nivel ribosomico, @ inducción de la formacibn del nuevo mRNA y @ represion de la formacibn de mRNA. @ y son formas rapidas, en tanto que @ a @ son mecanismos más lentos d e regular la actividad enzimatrca.

a

a

RESUMEN
1) Los productos de la digestion proporcionan a los tejidos. bloques estructurales para la bioslntesis de moleculas complejas, as1 como combustible para energizar los procesos vivientes. 2) Casi todos los productos de la digestión de carbohidrato~, lípidos y proteínas son catabolizados a un metabolito común. acetil<oA, antes de su oxidación final a C 0 2 en el ciclo del ácido cítrico. 3) La Acetil-CoA se utiliza también como bloque estructirral para la biosíntesis de ácidos grasos de cadena larga, colesterol y otros esteroides a partir de carbohidratos y de colesterol y cuerpos cetiinicos a partir de Acidos grasoc.

4) La glucosa proporciona esqueletos de carbono para la fraccibn glicerol de las grasas y para varios arninohcidos no esenciales. 5) Todos los productos hidrosolubles de la digestibn son transportados al hlgado a través de la vena portal hepática para procesamiento, el cual, a menudo, comprende la oxidacibn o sintesis de moltculas, algunas de las cuales son exportadas al resto del cuerpo; por ejemplo, las proteínas plasrnaticac. El hígado tiene una función directa en la regulaciiin de la concentraciór! de numerosos constituyentes sanguíneos, incluyendo glucosa y aminoAcidos, dado que su función primaria es servir a los tejidos extrahepáticos.

Panorama del metaboiismo rnb~rmediario 201

6) Además del núcleo, hay tres compartimientos metabblicos subcelulares primarios. El citosol contiene las enzirnas de las vías de glucblisis, glucogknesis, glucogenó2isis, del fosfato de pentosa o pentosafosfato y de la lipogénesis. Por su parte, !a mitocondria contiene las enzimas principales de la oxidacibn, incluyendo las del ciclo del ficido cítrico, beta oxidacibn de Iicidos grasos y cadena respiratoria. El metabolismo de aminoacidos tiene lugar no solo en el citosol y las mitocondrias, sino tambien en el retículo endoplásmico, donde en los ribosomas, los aminoacidos son

convertidos en proteínas. Además, las membranas del retículo endoplasmico contienen enzimas para otros numerosos procesos, incluyendo la formación de glicerolipidos y el metabolismo de fármacos. 7) Las vías metabblicas son reguladas por mecanlsmos rapidos que afectan la actividad de enzimas existentes, por ejemplo, F modificacibn alostérica a y covalente. A menudo, esta ultima es iniciada por la acción de hormonas. Las hormonas regulan tambiCn mecanismos mhs prolongados o lentos. a través de la estimulaciiin o inhibición de la síntesis de protelnas enzimiiticas.

REFERENCIAS
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Hall, 1983. Hue L, Van de Werve C (editors): Short-Term Regulation o Lzver hdefaholism. EIsevieriNonh Holland, 198 1. f

Newshome EA, Csabtree B: Flux-generüting and regulatory steps in rnetabolic control. Trends Bzochem Ser 1981;6:53. Newsholme EA, Start C: ReguIaiinn in iidetabolasm. Wilcy. 1973.

FiI ciclo del ácido cítrico:
Petes A. Mayes, PhD, DSc

El ciclo del acido cítrico (ciclo de Krebs, ciclo de los icidos tricarboxilicos) es una serie de reacciones que se efectúan en las mitocondrias, las cuales llevan a cabo el catabolismo de los residuos acetilo, liberando equivalentes de hidrógeno, los que, durante la oxidaciiin, permiten la liberación y captura como ATP de la mayor parte de la energía libre de los combustibles tisulares. Los residuos acetilo estfin en forma de acetil4oA ( C H 3 - C o S-CoA, acetato activo), un &ter de la coenzima A. La COA contiene la vitamina acido pantoténico.

EL CICLO DEL ÁCIDO C~TRICO PREPARA EL SUSTRATO PARA LA CADENA RESPIRATORIA
En esencia, el ciclo comprende la cornbinacibn de una molecula de acetilXoA con el oxalacetato, hcido dicarboxilico de cuatro carbonos, lo que da por resultado la fomacibn de citrato, un hcido tricarboxílico de seis carbonos. Sigue despuCs una serie de reacciode nes en el curso de las cuales dos mol~culas Cozson liberadas y se regenera el oxalacetato (figura 18-1 1. Puesto que sólo se necesita una pequefia cantidad de oxalacetato para facilitar la cenversibn de una gran cantidad de unidades acetilo en Coz, se puede considerar que desempefia una función catalítica.

-

La función principal del ciclo del ácido cítrico es
servir como vía comun final de la oxidación de carbohidrato~,lipidos y proteínas. Esto es porque la glucosa, los ácidos grasos y muchos arninoácidos son metabolizados a a c e t i l 4 o A o a intermediarios del ciclo. Además, desempefia un papel principal en la gluconeogénesis, en la transarninación, desaminacibn y lipogdnesís. Algunos de estos procesos se realizan en casi todos los tejidos, pero el hepatico es el único donde todos tienen importancia extrema. Por tanto, las repercusiones con profundas cuando, por ejemplo, gran número de células hepaticas esthn dafíadas o han sido reemplazadas por tejido conectivo, como en la hepatitis aguda y en la cirrosis, respectivamente. Un mudo testimonio de la importancia vital del ciclo del hcido citrico es que, respecto a los seres humanos, se ha informado muy pocas, si es que algunas, anoi-malidades genéticas de sus enzima, por lo que se presume que estas anomatías sean incompatibles con un desarrollo normal.

Ciirato
(c6)

Figura 18-1. Cielo del dcido cltrim que ilustra la funcibn catalítica del oxalaeetato.

204

Bioquímica de Harper

(Capitulo 18)

El ciclo del hcido cítrico es una parte integral del proceso por el cual se hace disponible mucha de la energía Iibre liberada durante la oxidación de carbohidrato~,lipidos y amino8cidos. Durante el curso de la oxidacihn de la a c e t i l 4 o A en el ciclo, se forman equivalentes reductores en forma de hidrbgeno o de electrones como resultado de Ia actividad de deshidrogenasas especificas. Estos equivalentes reductores entran entonces en la cadena respiratoria donde son generadas grandes cantidades de ATP en el proceso de fosforilaci6n oxidativa (tigura 18-2 y capitulo 14). Este proceso es aerabfo por lo cuaI requiere oxígeno como oxidante final de los equivalentes reductores. Por tanto, la ausencia (anoxia) o deficiencia (hipoxia) de O1causa la inhibición total o parcial del ciclo. Las enzirnas del ciclo del ácido cítrico localizan en la matriz mitocondrial, ya sea libres o adheridas a la superficie interior de la membrana interna, lo cual facilita la transferencia de equivalentes reductores a las enzimas adyacentes de la cadena respiratoria, Ia que también esta situada en lamembrana mitocondrial interna.

ferrosulíürada (Fe:S). Esta conversión tiene lugar en dos pasos: deshidratacibn hasta cis-aconitato, algo del cual permanece unido a la enzima, y rehidratación hasta isocitrato.

Citrato

Cirsconitato (unido a enzima) H20 HzO

LAS REACCIONES DEL CICLO DEL ÁCIDO C~TRICO LIBERAN EQUIVALENTES REDUCTORES Y CO2 (figura 1 8 3 ) "
La condensación inicial de acetil-CoA con oxalacetato para formar citrato es catalizada por la enzima condensante, citrato sintasa, que efectúa la sintesis de un enlace carbono a carbono entre el carbono del metilo de la acetil-CoA y el del carbonilo del oxalacetato. La reacción de condensación, que forma la citrilXoA, es seguida por la hidrólisis del enlace tioCster de la COA,acompafíada por una considerable pérdida de energia libre como calor, lo cual asegura que la reaccibn prosiga hasta su terminación.
Acetil-CoA + Oxalacetato + HzO

+ Citrato + COA

El citrato es convertido en isocitrato por la enzima aconitasa (aconitato hidratasa), que contiene hierro en el estado Fe2' en forma de una proteina compleja

La reaccidn es inhibida por la presencia de fluoroacetato, el cual en forma de fluoroacetil4oA, se condensa con el oxalacetato formando fluorocitrato. Este ÚEtimo inhibe a la aconitasa lo que ocasiona acumulación del citrato. Los experimentos con intermediarios marcados con C" indican que el citrato reacciona con la aconxtasa de manera asimktrica, con el resultado de que tsta siempre actúa sobre aquella parte de la molécula que deriva del oxaiacetato. Esto era desconcertante,ya que el ácido cítrico es un compuesto simktrico. Sin embargo, ahora se comprende (cuando la mol&culaes visualizada en tres dimensiones) que los dos grupos -CH2C00no son idinticos en el espacio con respecto a los grupos 4 H y 4 0 0 - . Las consecuencias de la acci6n asirnktrica de [a aconitasa, que es atraido por el enlace de tres puntos de la enzima hacia el sustrato (figura 8-31, puede apreciarse por referencia del destino de la acetil-COA,marcada en el ciclo del ácido cítrico, tal como se muestra en la figura 15-3. Es posible que el cis-aconitato no sea un intermediario obligatoria entre el citrato y el isocitrato, pero de hecho puede ser una rama lateral de la via principal. El isocitrato experimenta deshidrogenacibn en presencia de isacitrato deshidrogenasa formando oxalosuccinato. Se han descrito tres isocitrato deshidrogenasas diferentes. Una, que es NAD+-específica, se encuentra sblo en las mitocondrias. Las otras dos enzimas son NADP+-especIficas y se encuentran en las mitocondrins y en el citosol, respectivamente. La oxidación del isocitrato acoplada con la cadena respiratoria procede casi completamente a travbs de la enzima dependiente del NAD'.
lsocitrato + NAD' e+Oxalosuccinato H (unido a la enzima)

*

De la circular No. 200 del Comitt de Editores de Hiochemical Journals Recommendations ( 1 975): "De acuerdo Con la regla bioquímica esthndar, la terminacibn -ato por ejemplo. en palmitato, denota cualquier mezcla de ácido libre y la(s) forma(s) ionizada(s) (segUn el pH) en la cual no cstán especificados los cationes". La misma regta se adopta en este texto para todos los ácidos carboxilicos.

alfa-Cetoglutarato + COI + NADH + H'

Sigue una descarboxilacibn a alfa-cetogiutarato, también catalizada por la isocitrato deshidrogenasa. El Mn" (o Mg2') es un componente importante de la reacción descarboxilante. Pareceria que el oxalosuccinato permanece unido a la enzima como un intemediario en [a reacci6n global.

El crclo del ácido citr'rrico: cutaholrsrnu de la acetilJoA

0

205

lsocitrato (Ce)

t

Q ~ r e s p M

Fosforilacion oxidativa

-@

5

Flavoproteina

anaerobiosis (hipoxia. anoxia)

Cit Citocromo

m@ Fosfato de alta energía

H" ,

Figura 18-2. Ciclo del Bcido cítrico la vía catabblica principal para la acetil-COAen los organismos aerobies La acetil-COA, producto del catabolismo de carbohidratos, proteínas y Iipidos, es introducida al ciclo junto con H20, y oxidada a C02 con Iiberacibnde equivalentes reductores (2H) La oxidacibn subsiguientede 2H en la cadena respiratoria conduce al acoplamiento de la fosforilación de ADP a ATP Para una vuelta del crclo, se generan 11 -@ por medio de fosforilactón oxidativa y un surge a nivel de sustrate a partir de la conversion del succinil-COAen sucunato.

a

o
COA SH

CH,- COO-

k ~ , - COOHO-C-CODCH,-COOCitrato
I

HO-CH

k~,-~OOL-Malato

1

-&ONAO*

Fluoroacetato

~ H ~ ~ o o -

H- ¿ - ~ O O -

c-coo-

i

- 00;-gFumarato

n

1I CH-COOCls-aconitato

A

J

C H ~ ~ O O Succinato

H 0- C H - C 0 0 Isocitrato

I

ADP + Pi

Arsenito

NADH + H*
Oxalosuccinato

O Z C -coo-

Figura 18-3. El ciclo del ácido cltrico (de Krebs). La oxidación del NADH y del FADH2 en la cadena respiratoria wnduce a la generacibn de ATP a travks de la fosforilacibn oxidativa. Para seguir el paso del aeetil-COAa travks del ciclo, los dos Btomos de carbono del radical aoettlo se muestran marcados en el carbono del carboxilo (usando la designacibn y en el carbono del rnetilo (usando la desgnaubn [i]). Aunque se pierden dos &tornos de carbono como CO2 en una revolucrbn del ciclo, estos dtomos particulares no derivan de acetil-COAque ha entrado inmediatamente antes al ciclo sino que surgen de aquella porción de la moléwla de citrato que derivb del oxalacetato. Sin embargo, al completarse una vuelta del uclo, el oxalacetato que se regenera está ahora marcado; de él se forma el COZ marcado que se elimina en la segunda vuelta de uclo Debido a que el succinato es un compuesto simétrica y la suminato deshidrogenasa no distingue entre sus dos grupos carboxilo, se produce un "proceso aleatorio" del marcaje en este paso de modo que los cuatro Btomocde carbono del oxalacetatoaparecen marcados decpuks de una revolucibn del ciclo. Durante la gluwneogenesis, parte de la marca en el oxalacetato es rncarporado a la glucosa y el gludgeno (figura 21-1) Para una explicacibn de las aspectos estereoquimicos del ciclo del Bcido citrico, consultese Greville (1 968). Se indican los sitios de inhibicibn por fiuoroacetato, malonato y arcenito.

m)

E/ ciclo del úcido cjtrico. catahoiismo de l acetil-CoA a

207

Luego, el alfa-cetoglutarato pasa por una descarboxilaci6n oxidativa de una manera anhloga a la del piruvato (figura 1 9-5), ya que ambos sustratos son aIfa-cetoacidos.

Succinil-COA+ COI + NADH + H'

La reacción catali~ada un complejo de alfa-ceiopor gluhrato deshidrogenasa tarnbitn requiere de idénticos cofactorec -por ejemplo, difosfato de tiamina, lipoato, NAD', FAD y COA- y da por resultado la , formación de s u c c i n i l ~ o Aun rioéster de alta energía. El equilibrio de esta reaccibn está tan en favor de la fonnacibn de succinil<oA, que Pa reaccion se debe considerar fisiológicamente unidireccional. Como en el caso de la oxidacion del pinivato (capitulo 193, el arsenito inhibe la reacción haciendo que se acumule el sustrato alfa<etoglutarato. Para continuar el ciclo, la succinil-CoA se convierte en succinate por la accibn de la enzima succinato tiocinasa (succinil4oA sintetasa).

ferencia directa de hidrdgeno desde el sustrato a una flavoproteína sin la partictpacibn del NAD'. La enzima contiene FAD y proteína ferrosulfurada (Fe:S). Se f m a fumarato como resultado de la deshidrogenacibn. Los experimentos con isótopos han mostrado que la enzima es esteroespecifica para los Atomos de hidrógeno trans de los carbonos metileno del succinato. La adición de rnalonato o de oxaiacetato inhibe a la succinato deshidrogenasa competitivamente, dando por resultado [a acumulación de succinato. La fumarasa (fumarato hidratasa) cataliza la adicibi de agua al fumarato para formar malato.
Fumarata + H 2 0o L-Malato

Además de ser especifica para el L-is6mero del malato, la túmarasa cataliza la adición de los elernentos del agua a la doble ligadura del fumarato en la confíguracibn tranrr. El malato es convertido en oxalacetato por la malato deshidrogenasa, reaccibn que requiere NAD'.
L-Malato + NAD* e Oxalacetato

* NADH + H'

Aunque el equilibrio de esta reaccihn esta muy en

Éste es el único ejemplo en el ciclo del hcido citrico de la generación de un fosfato de alta energia a nivel sustrato y se produce debido a que la liberacibn de energia libre procedente de la descarbaxilacibn oxidativa del alfa-cetoglutarato es suficiente para generar un fosfato de alta energía además de la formación de NADH (que equivale: a 3 4. La matriz mitocondrial tambikn contiene una segunda succinil4oA sintetasa, especifica para nucleótidos de guanina, pero esta no interviene en el ciclo del ácido cihico. Una reacción alternativa en los tejidos extrahepaticos catalizada por succinilZoAacetoacetato COAtransferasa (tioforasa), es la conversión de la succinil-CoA en succinato acoplada con la conversión del acetoacetato en acetoacetil-CoA (capitulo 24). El succinato es metabolizado ahn mfis por medio de una deshidrogenacibn seguida por la adicibn de agua y, subsiguientemente, por una deshidrogenacihn más que regenera el oxalacetato.
Succinato

favor del malato, el flujo neto es en la direccibn del oxalacetato porque este compuesto, junto con el otro producto de la reacción (NADH) es eliminado continuamente en reacciones ulteriores. Las enzimas del ciclo del hcido citrico, excepto las alfa-~etoglutaratay succinato deshidrogenacas, tmbikn se encuentran fuera de la mitocondria. Aunque pueden cata1izar reacciones similares, algunas de las enzimas, por ejemplo, la malato deshidrogenasa, pueden no ser de hecho las mismas proteinas que las enzimas mitocondriales del mismo nombre, es decir, son isoenzimas.

POR CADA CICLO DEL ÁCIDO C~TRICO FORMAN SE 12 MOLECULAS DE ATP
Como resultado de las oxidaciones cataljzadas por las enzimas deshidrogenacas del ciclo del ácido cítrico, se producen tres moléculas de NADH y una de FADHz por cada molécula de acetilXoA catabolizada en una vuelta del ciclo. Estos equivalentes reductores son transferidos a la cadena respiratoria situada en la membrana mitocondrial interna (figura 18-2). Durante el paso a lo largo de la cadena, tos equivalentes reductores del NADH generaran tres enlaces fosfato de alta energia por la esterificacibn del ADP en ATP en el proceso de F fosforilación oxidatira (capitua

* FAD

t Fumarato ,

+ FADHz

La primera reaccidn de deshidrogenacidn es catalizada por la succinato deshidrogenasa, que está unida a la superficie interior de la membrana mitocondrial interna, al contrario de otras enzimas del ciclo, que se encuentran en la matriz. Es la única deshidrogenaci6n en el ciclo del k i d o cltrico que incluye la trans-

208

Bioquimica de Hurper

In 14). Sin embargo, el FADH? produce s61o dos enlaces fosfato de alta energía porque transfiere su poder reductor a la Q, evadiendo asi el primer sitio de iosforilaciDn oxidativa en la cadena respiratoria (flgiira 14-7). Un nuevo enlace de alta energia es generado a nivel del ciclo mismo (csto es, a nivcl del sustratci) durante Ia conversión de la succinilXoA en succinato. De este modo, 12 nuevos enlaces fosfato de alta energia son generados en cada vuelta del ciclo

EL CICLO DEL ÁCIDO C~TRICO ACTÚA COMO P!VOTE EN EL METABOLISMO
Algunas vías metabólicas terminan en un ctinstitiiyente del ciclo en tanto que otras se originan de C1.I;stas vias intervienen en los procesos de gluconeogcncsis, transaminación, desaminaci~n sintesis de acidos grasos. y Portanto. el ciclo del ácido cítrico interviene en ambos procesos, oxidativo y sintktico; es decir, cs anfihtilico. Sus actividades se resumen a continiiacion.

(cuadro 18-1).

LAS VITAMINAS TIENEN FUNCIONES ESENCIALES EN EL CICLO DEL ÁCIDO C~TRICO
Cuatro dc las vitaminas solubles del cornple-jo 3 intervienen de rnancra precisa en el funcionamiento del ciclo dcl hcido cilrico. Son: 1) Riboflavina en forma de dinucleótido d c flavina y adenina (FAD) cot'actor en el compleLio la alfa<etoglutarato deshidrogenasa de 4 en el succinato deshidrogenasa. 2) Niacina en forma de diniicleótido de adenina y nicotinamida (NAD), cocnzima para tres deshidrogenaas de! cicIo, isocitrato deshitlrogenasa, alfa-cetoglutarato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa. 3) Tiamina (vitaniina RI), como difosfato de tiamina, coenzima para la descarboxilaci6n en la reacción de la alfa-cetoglutarato deshidrogenasa. 4) Acido pantotknico como parte de la coenzirnn A, cofactor adherido a residuos acilo "~ctivos" como en la acctil-CoA y s u c c i n i l ~ o A .

El ciclo del ácido cítrico interviene en F gluconeog6nesis, a la transaminación y la desaminación
Todos los miembros principaIes de ciclo, desde el citrato hasta el oxalacetato, son glucogénicos en potencia, puesto que pueden dar origen a una produccián neta de glucosa en el hígado o el riñbn, Organos quc contienen un Jiiego completo de enzima5 para la gluconeogénesis (capitulo 2 1). Laenzima clave que facilita la transferencia neta fuera del ciclo, hacia dentro de la via principal de gluconeogénesis es la fosfoenolpiruvato carhoxicinasa, que catalim la descarboxilación del oxalacetato para dar fosfocnolpiruvato, actuando el GTP como fuente de fosfato de alta cncrgia (figura 184). Oxalacetato + GTP +
Fosfoenolpiruvato+ COZ+ GDP

-1. Cerieración (i e ATF p del ácido cítrico
- "- E
1'. 11
J.

. .

A-

---;
1 uirieru

Kcacció

catalizad~

:

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4 .

rolCculas d P formada

La transferencia neta al cicIo es resultado de varias reacciones diferentes. Entre las mas importantes está la fomacibn de oxalacetato por la carhoxilacicín del piruvato, calalizada por la piruvatn carhoxilasa.
ATP + COZ+ HzO + Piruvato +

Isocitrato

.iuncirin iI>t l en la

.,

ia rt'spiralc -idación del rDt l en la
ia respiratc

Oxalacetato + ADP + Pi

1
1
-

e1 uc
-u"

.susui
m

idacihn D I2en la i
respiratc in

2

idacibn

IDH cn la ia respiratc. -

,
1
Neto 12

Esta reacción se considera importante en conservación de concentraciones adecuadas de oxalacetato para la reacción de condensacibn con la acetil-CoA. Si ésta se acumula, actúa como un activador alosterico de la piruvato carboxilasa, Io cual asegura un abastecimiento de oxalacetato. El lactato, un irnportante sustrato para la gluconeogénesis, entra en el ciclo a través de la conversión en piruvato y oxalacetato. Las reacciones de la arninotransferasa (transaminasa) producen piruvato a partir de la alanina, oxalacetato del aspartato y alfa-cetoglutarato del ácido glutamico. Debido a que estas reacciones son reversibles, el ciclo tambikn sirve como fuente de

El ciclo del ácido clfrico: catabolismo de l aceti/-CoA u
\

209

Hidroxiprollna Serina Cisteina Treonina Glicina

1

Lactato

.

. +

Glucosa

+ -

P-enolpiruvato

.

Oxalacetato

Tirosina Fenilalanina

+ Fumarato

f
COZ

Aspartata Citraio

lsoleucina Metionina Valina

Propionato
~[TRANSAMINASA
) Glutamato

]

Histidina Pmlina Glutarnina Arginina

7

Figura 1 8 4 . Participacibn del ciclo del Bcido citriui en la transaminación y la gluconeog6nesic. Las flechas gruesas indican la via principal de la glumneog8nesis

esqueletos de carbono para la síntesis de aminohcidos no esenciales, por ejemplo,
+

Piruvato t Oxalacetato + ,
+ Alani"=

Grutamato + PiruMto e-, a-Cetoglutarab

vla glucogenica a través de la carboxilación formando oxalacetato. De particular importancia para los rumiantes es [a conversión del propionato, el principal producto glucogCnico de la fermentación en el rumen, en succ i n i l 4 o A por la via de la m e t i l m a l o n i l ~ o A (figura 2 1-2).

Otros aminoácidos contribuyen a la gluconeogénesis debido a que el total o parte de sus esqueletos de carbono del entran al C ~ C ~ O ácido cítrico despuks de la desaminacibn o la transaminacion. Ejemplos son la alanina, la cisteina, la glicina, la hidroxiprolína, la serina, la treonina y el triptdfano, los cuales forman piruvato; la arginina, la histidina, la glutamina y la prolina forman alfa-cetoglutarato por la vía del glutamato; la ícoleucina, la metionina y la valina forman succinilCOA; y la tirosina y fenilalanina forman fumarato (figura 18-4). Se debe notar que las sustancias que forman piruvato tienen la opción de oxidación completa hasta C 0 : si siguen la vía de la piruvato deshidrogenasa hasta acetilZoA o pueden seguir la

El ciclo del ácido cítrico interviene en la síntesis de ácidos grasos (figura 1 8 4 )
La acetilXoA formada a partir del piruvaio es el principal bloque de construcción para la síntesis de Acidos grasos de cadena larga en los no rumiantes. (En los rumiantes, la a c e t i l 4 o A proviene directamente del acetato.) Dado que la pimvato deshidrogenasa es un enzima mitocondrial y las enzimas responsables de la síntesis de ácidos grasos son extramitocondriales, la cdlula necesita transportar acetil-CoA a traves de la membrana de la mitocondria, la cual es imper-

21 0 Bioquimica de Harper

(Capítulo 18)

Glucosa

* b

t~iruvato

cido os grasos

MEMBRANA MITOCONDRIAL

- JL, L ~

N

Figura 1 8 4 . Participación del ciclo del hado cítrico en la clntecic de Bcidos grasos a partir de la glucosa Véase tambien la figura 23-5

meable a este compuesto. Esto se logra permitiendo que la acetil4oA forme citmto en el ciclo del ácido cítrico, entonces se transporta el citrato fuera de la mitocondria y, por último, se hace que quede disponible acetilXoA en el citosol medianie escisihn del citrato en una reacción catalizada por la enzima ATPcitrato liasa.
Citrato + ATP + COA + Acetil-COA+ Oxalacetato ADP + Pi

*

La regulación del ciclo del ácido cítrico depende principalmente del suministro de cofactores oxidados
En la mayoría de los tejidos, donde la funcibn primaria del ciclo del ácido cítrico es proporcionar energia, hay escasa duda respecto a que el control respiratorio a travks de la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa es el regulador dominante de la actividad del ciclo del acido citrico. Así, la actividad depende de manera inmediata del suministro de cofactores oxidados de la deshidrogenasa (por ejemplo, NAD), los cuales a su vez, debido al estrecho acoplamiento entre oxidacibn y fosforilación, dependen de la disponibilidad de ADP y por tanto, en ultima instancia, de la velocidad de utilizaciiin del ATP. De este modo, siempre que se disponga de la cantidad adecuada de 02, velocidad de utilización de ATP para efectuar la

trabajo determina el índice de respiracibn y de actividad del ciclo del Acido citrico. Ademhs de este control global y ordinario, las propiedades de algunas de las enzimas del ciclo indican que la regulación podria ejercerse tambidn n nivel del ciclo mismo para refoszar el control. Los sitios de regulación más probables son las reacciones sin equilibrio, las cuales son catalizadas por la piruvato deshidrogenasa, citrato sintasa, isocitrato deshidrogenasa ligada a NAD y alfa+etoglutarato deshidi-ogenasa. Todas estas deshidrogenasas son activadas por Caz', cuya concentraci6n aumenta durante la contracción muscular y secrecibn, cuando hay un incremento en la demanda de energia. En un tejido como el cerebro, que depende en gran medida de carbohidratos para el suministro de acetilXoA, el control del ácido cítrico puede producirse en el paso de la piruvato deshidrogenasa. En el propio ciclo, varias enzimas son sensibles at estado energético tal como se expresa en las proporciones [ATPlJrADP] y [NADI-I]/[NAD]. Por tanto, hay inhibición alostérica de citrate sintasa por ATP y por a c i l 4 o A de cadena larga. La activacibn alostérica de la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NAD mitocondrial por ADP es c o n m t a d a por ATP y NADH. A[ parecer, el complejo de la alfa-cetoglutarato deshidrogenasa esta bajo un control anilago al de piruvato deshidrogenasa (figura 1 9 4 ) . La succinaio deshidrogenasa se inhibe la presencia de oxalacetato y la disponibilidad de oxalacetato regulada por mala10 deshidrogenasa, de-

El ciclo del iicido cítrico: catubolismo de ¡a acetilXoA

2 11

pende de la proporcibn !?lADHJ/pAD']. Dado que la Kmpara oxalacetato de citrato sintasa es del mismo orden de magnitud que la concentración intramitocondrial, podria parecer que la concentración de oxalacetato interviene en el control de la velocidad de formación de citrato. Aún faSta por resolver cual de estos mecanismos (si es que se trata de alguno de ellos) opera rn vivo.

RESUMEN
1) El ciclo del Bcido cítrico es la vía final para la oxidaci~nde carbohidratos, Iipidos y proteínas. Cataliza la combinacion de su metabolito comilin, la acetil<oA, con oxalacetato para formar citrato.

Por una serie de deshidrogenaciones y descarboxilaciones, el citrato es degradado, liberando equivalentes reductores y 2CO2 y regenerando oxalacetato. 2) Los equivalentes reductores son oxidados por la cadena respiratoria con forrnacibn de ATP. Por tanto, el ciclo es ta vía principal para la generacibn de ATP y se ubica en la matriz de las rnitocondrias adyacente a las enzimas de la cadena respiratoria y la fosforilacibn oxidativa. 3) El ciclo del ácido citrico es anfbblico, dado que tiene otras funciones metabólicas además de Ia oxidaci6n. Toma parte en la gluconeogénesis, transaminación. desarninacion y en la síntesis de acidos grasos.

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Gbucólisis y la oxidación del piruvato
Peter A. Mayes, PhD, DSc

isquemia. Existe un número pequeño de enfer-

Hay una necesidad mfnima de glucosa en todos los te-jidos. Cn algunos casos, por ejemplo, en el cerebro,

la necesidad es sustancial; en tanto que en otros, como en los critrocitos, es casi total. La gIuciilisis es la via prii~cipalpara la utililación de la glucosa y se lleva a cabo en el citosol de todas las células. Es una via única, dado que pucde utili7ar oxigeno si estl disponible (aerohia) o fi~ncioiiar su ausencia total (anaerobia). en Sin embargo, para que la glucosa se oxide hasta la etapa terminal del piauvnto de laglucólisis, precisa no solaincnte oxigeno moleculas, sino también sistemas eiiziiiiáiicos rnitoccindriales, como el complejo piruvato deshfdrogenasa, e1 ciclo del iicido cítrico y la cadena respiratoria.

medades donde las enzimas de la gluciilisis (coino la pimvato cinasa) muestran actividad deficiente; estos trastornos se manifiestan principalmente como anemias hemolíticas o, si tienen lugar eii el niiisculo esquelético (por ejemplo, la fosfofructocinasa), coino fatiga. En las cClulas cancerosas que proliferan con rapidez, la gluc6lisis procede a una velocidad mucho mayor que la precisada por el ciclo del ácido cítrico. Por tanto, se produce inás piruvato que el que puede ser metaboli7,ado. El resultado es una producciiin excesiva de lactato. que favorece un entornti local relativamente ácido en el tumor, situacióii quc puede tener implicaciones con ciertos tipos de terapéuíicii contra e1 ciinccr. Tambien se produce acidosis lhctica debida a varios factores incluso a la deficiencia de piruvato desliidrogcnasa.

IMPORTANCIA BIOMÉDICA
L a glircólisis iio sólo es la ruta principal para el metabolisiiio de la glucosa que conduce a la producción de acetil-CoA y a su oxidacihn cn el ciclo del Iicido cítrico. sino que también proporciona una vía importante para metabolizar fiuctosa y galactosa provenientes de los aliineiitos. La capacidad de la gluc6lisis para proporcioiiai. ATP en ausencia de oxígeno tiene crucial significado biomedico, porque permite al musculo csqueletico trabajar con mucha eficiencia aun'cuando la oxidación aerobia se vuelva insuficiente. a E vez a que IOF tc,iidos con capacidad glucolítica importante pueden obrev vivir a episodios de anoxia. Por el contraria, el músculo cardiaco, que esth adaptado al traba,jo acrobio. tiene capacidad glucolítica relativamenie deticicntc y escaw supervivencia en condiciones de

LA GLuCÓLISIS PUEDE FUNCIONAR EN CONDICIONES ANAEROBIAS
Al principio del curso de las investigaciones sobre la gliichlisis, se comprendió que el proceso de fermentacihn en las levaduras es semejante a la degradacihn del gluciigeno en el m ~ s c u l oSe notó que cuando iin . musculo se contrae en un medio anaerohici, es decir excnlo de oxigeno, el glucógeno desaparece y sc forma Iactato como principal producto final. Cuando se intraducc el oxígeno, tiene lugar la recuperacióia aerobia y el glucógeno reaparece, mientras que el lactato desaparece. Sin embargo, si la contracción se produce en condiciones aerobias. no hay acuinulacion de lactato y el piruvato se convierte en el prodiicto

final principal; este hltitno es oxidado después a COZ y agua (figura 19-1 ). Como resultado de estas observaciones, se Iia hecho costumbre separar el rnetaboI ismo de los carbohidratos en una fase anaerobia y otra aerobia. .lo obstante, esta distinción es arbitraria ya que las reacciones de la gluclilisis son las mismas tanto en presencia de oxígenci como en su ausencia, excepto en su extensión y en siis productos finales. Cuando ci aporte de oxígeno es pequeño, se altera la reoxidación del NADH, formado a partir de NAD' dusaiite In glucóli~is.En estas circunstancias, el NADH es reoxidado al acoplarse a la reducción dcl piruvato en lactato y el N A D ' que resulta se utiliza para pcrnlitir qiie ulteriormente prosiga la glucólisis (figura 19-1). La glucólisis pucdc así efectuarse en condiciones anaerobiac. pero esto tiene un precio, ya que limita lacaiitidad de energía Iiberada por rnol&cula degli~cosaaxidada. Consecuentemente, mayor cantidad de glucosa debe intervenir en lagluciilisis anaerobiapara proporcionar la misma cantidad dc energía que la obtenida en condiciones aernbias.

LAS REACCIONES DE LA GLUCÓLISIS SON LA PRINCIPAL V ~ A UTILIZACION DE DE LA GLUCOSA
La ecuacihn global para la gIucolisis desde gliicosa hasta lactato e$:
Glucosa * 2ADP * 2Pi t
2L(+)-Lactato

* 2ATP + 2Hz0

Glucosa
Cs

Glua6geno
(CsIm

Todas las enzimas de la vía de Ia gluchlisis (figura 1 9-2) se encuentran en la fracción soluble extirimitocondrial de la célula, el citoso!, aunque se acumula evidencia indicadora de que alguna de las enzimas puede estar integrada con estructuras subcelulares ranto en la celula como en e1 citosol. Ellas catalizan Ias reacciones implicadas en la gluclilisis de la glucosa, hasta piruvato y lactato. del modo siguiente: La glucosa entraen la vía gluctiIitica mediante su fosforilación a glucocad-iosfato, función que realiza la enzima hexocinasa. Sin embargo, en las células del parinquirna hephtico y en Ias dc los islotes pancreáticos, es realizada por la glococintisa, cuya actividad en el hígado puede inducirse y afectarse por los cambios en el estado nutricional, El ATP es necesario coma donador de fosfato y, como en muchas reacciones en que interviene la fosforilacihn, reacciona coino el complejo Mg-ATP. Se utiliza un enlace fosfato de alta energia del ATP y sc produce ADP. La reacciiin se acompana por una phrdida considerable de energia Eibre como calor y, par consiguiente, en condiciones fisiológicas, puede considerarse como irreversible. La hexocinasa es inhibida de modo alostérico por e1 producto glucosad-fosfato.

TriosatosfaZa

C3

+H+ -

Glucosa + ATP

-

Glucosa-6-fosfato + ADP

Triosalosfato

o*

Figura 19-1. Resumen de la gluc61isis 0, bloqueado por condiciones anaerobias o por ausencia de mitowndrias que contengan las enzimas respiratorias claves, por ejemplo, como ocurre en los eritrocitas

que existe virtualmente en todas las J ~ i e n e gran afinidad (K,, baja) por 't una ' su siistrato. laglucnsa. Su f u n c i ~ n consiste en asegiirar $* el suministro dc glucosaa los tejidos, aiin en presencia q de concentraciones bajas de glucosa sanguínea, fusforilar lo cual mantiene un alto gradiente de cone e n t r a f i de glucosa entre la sangre y el medio intracelular. Actúa sobre ambos anómeros de la gii~cosa, el alfa y beta y puede también catalizar Ia fosforilación de otras hexosas, pero a una velocidad mucho menor que a la glucosa. La fiinciiin de la u elucocinasa cs la dc eliminar la glucosa de la sangre después de la ingestihn de alimentos. En cornparaci0n con la hexocinasa, ticne una Km alta para la glucosa y opera de modo dplimo en

x

Glucosa 1-fosfato CHz-O-

AfP
(1- glucosa

ADP
tx- glucosa

6-fosfato

r+Fruciosa 6-fosfato

CINASA

~Fructosa l,6-bisfosfato

EH,- O 4
C=O
COO I
CINASA

H-c=O H- C-OH
CH,-O-@ ADP
NAOH +H

Focfato de dihidroxiacetona

3

ATP

+

NAD+ Gllceral-

3-Fosfoglicerato

1.3-bisfosfoglicerato

3-fosfatn
Mitochondrial respiratory chain

dehido

FOSFOGLICERATOMUTASA

$00H-$-O-@ CHz0H

2-Fosfqlicerato

1
1 I

I
I I
1

3ADP + p,

3ATP

I
I
I

I I

Anaembiosi~
I I I

I
I

I

Mg2+p;;
$ -0-E)
CHI plWvATo CINASA

?O0 -

1

I 1

Fosfoenolpiruvato

I

Oxrdacibn en el ciclo del

I

I
I

q 1

1
1

acrdo cítrico l NADH+H+

t

1

NAD'

CoOC
II

- DH

EspontAnea

$00-

$00 -

CH2

(Enol) piruvato

(Ceio)
Piruvato L(+)-Lactato

Figura 19-2. Vía de la glucólisis -PO~~-;P~, HQPQ~'-; 0, inhibicibn *Los átomos de carbono 1 a 3 de bisfosfato de fructosa forman focfato de dihidroacetona, en tanto que los carbonos 4 a 6 forman gliceraldehido bfosfato El termino bis, como en bifosfato, indica que los grupos focfato están separados, en tanto que difosfato como en el difosfato de adenosina. indica que están juntos

e, )

concentracioriec dc glucosa sanguinea por arriba de loc 5 inmol/C (tigiim 2 1 -S). Es cstxcítica para la glucosa. I,a g1ucrisn4-frisfato es un compuesto irnportaiiic ~ L I Cti en el enironque de varias vías metabólicas (gl~icólisis. gluconeogénesis. v i n de la pentosafosfato. glucugérieiií y ~lucogenólisis).En la glucOlisis, cs cciiivcrtida a fiuctosa4-fosfato por la Frisfohexosa irornerssa, proceso que cainprcndc iina isomeriznción nldosa-cetosa. Shlo participa el anomero alfa de E glucosa4-losfato. a

actividad de la fo~fritrio~a isonierasa. el fosfato d e diliidroxiacetona es también oxidado ; 1.3-bisfosfoi ~Iicerato 13 via dcE gliccraldchidn 3-fo~fato. por

1,3-Bisfosfoglicerato + NADM + H'

La enziina que causa Iaoxidaci~n, gliceraIdehido-3fosfato dcsliidrogcnasa, depende del NAD'. Estruc-

Ectn reacciiin e i scgiiida por otra focforilacibn con ATP, c:ilalitada por la eri7iina fnifofriictocinass (fosfofructocinasn-1) para prodiicir íiiiictosa 1.6-bisfosfato. I,a hifcifi.~ictocinas;ies otra cnziina inducibfe y alristérica, y se considera quc su actividad tiene uiia I'~ii1ciiin ir~iportarite la regulación de In velocidad de en la gFuccilisis Tainbien la reacción de la fosfofructocinasa puede considerar~efiincionalmente irreversible cii cciiidiciones fisiológicas. D-Fructosa-6-fosfato + ATP -+ 0-Fructosa 1,6-bisfosfato

Ida fructoca 1 .(i-hisfoslato. es separada por la aldolasa (ftuctosa I .h-hisfc>sfato aldolasa) eii dos tricisahsfritos. cl zliceraldehído-3-fosfato y el fosfato de diliiclroxiacetonn.

tiiralmente consiste en cuatro polipéptidos identicos (rnonhmeros) que forman un terrhrnero. Se encueritran ciiiitro grupos -SH cn cada polipkptido, derivados dc los scsiduos de cisteina dentro de la cadena polipeplídica. Uno de estos grupos se localiza en el sitio activo dc la enziina (figura 19-3). Inicialmente, el sustrato se conibina con ese gmpi -SH, rominndo un tioliemiacctal qiie cs convertido en iin ester tiolico por oxidación: los hidrógenos removidos eii estaoxidacibn ce trancfiereii al NAD' unido a la enzii~ia. NADH prtid~icido E1 en la eiizima no estiran íirnicincntc unido a clln como el NAD'. Eii consecuencia. el NADI Ies fácilmente desplazado por otra molécula de NAD'. Finalmente, se adiciona fosfato inorg5nicn (P,) mediante fosforolisis, formindose I,3-bisfosfnglicerato, y la en7ima libre, coi1 un grupo -SH rcctinstituido, .c s La energia liberade durante la oxidacihn cs crinccrvada por la formación de un enlacc dc a ~ u f r c alla cncrgía qiie de se vuelve, despucis d c la rosforiilisis, uiz cnlacc i'isfato dc aIta energia en la posición I del I ,.3-bi~fosfnglicerato. Este fosfato de alta cncrgia cs capturado como ATP en una rcaccihn posterior con cl ADP, catali~adapor la fosfogliceratocinasa, desiando 3 fosfogliccrato.
1,3-Bisfosfoglicerato + ADP H 3-Fosfoglicerato + ATP

Fosfato de di hidroxiacetona

Sc hnii dcscrito diferentes aldola~as quc coiitienen

cuatro subiinidades. [,a aldciliisa A existe en la mayoría cle los te,jidoc 4. adcinis, la B se encuentra en el higado y el riñbti. I,oc fosfator; dc fructosa existen cn la célula principalinenle bajo la forma furanhsica, pero reaccionan coi1 la liisfohcxosa isomerasa, la fosfofructocinaca y la aldolasa en la configuracion de cadena abiertri. El gliceraldchida 3-fosfato y el fosfato de diIiidroxincetrin:i son interconvertidos por la enzima Fosfotriosa isomeraisa.
O- Gliceraldehido 3-fosfato u
Fosfato de dihidroxiacetona I,a yliicOli5i~ prosigue por la oxidacihn del gliceraldeIiido 3-fosfato cn 1.3-bisfosfoglicerato y, debido a la

Puesto que se forman dos mol~culas e triosafosfato d por moléculas de glucosa que experimenta la glucolisis, en esta etapa se generan dos moléculac de ATP por molécula de glucosa, un e-jempl de fusrorilación "a nivel del sustrato". Si hay arscninto, competirá con el fosfato inorganico (P,) en las reacciones anteriores para prod~icir I -atscno-3-fosfoglicerato, que se hidroli7a en fnrniri espontanea para dar 3-fosfoglicerrito y calor, sin gcnerar ATP. Este es uri importante e.jeinplo dc IR propiedad del nrseniato para IIcvar a cabo el desacoplamiento de la ovidacihn y la Cosforílacibn. C 3-fosfoglicerato que proviene de la5 reaccicincs 1 anteriores, es convertidoen 2-fol;fogliceratopor la eninia fosfogliceratom~itasa.Es probable que el 7.3-bi~fr,sloglicerato (difosfoglicerato, L K P , en inglis, diphu,vpho~/yccvwie) un intermediario en esta seaccibi~. sea

E1 piso siguiente es catatizado por la enolasa e iinplica unadeshidratacioi~ redistrihución de la energia y

H-C-OH

I

CH~O-Q

t

Gliceraldehido 3,fosfato

7

i
..

7

Complejo enzima-sustrato

Oxidación del sustrato por

I

H - C - OH
I

Intermediario rico en energia

Figura 19-3. Mecanismo de oxidacrón del gliceraldehido 3-fosfato. (Enz, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa ) La enzima es inhibida por el yodoacetato, que es un veneno para el -SH, el cual de esta manera es capaz de inhibir la glucólisis

dei~tro la niolécula. lo cual eleva el fosfato de la de posiciiin dos al estado dc alta energía, formándose así e fosfocnolpiriivato. La enolasa cs inhibidri por C] E flririruro, iina propiedad que puede usarse cualido se ncccsite impedir la glucólisis antes de calcular la gllicosa sangvinca. La eaizilna depende tambicn de la prcsencia de Mg2'o de Mnn+.
2-Fosfoglicerato t Fosfoenolpiruvato + H20 ,

anaerobias, se eviia la reoxidacibn del N A U H mediante la transferencia de equivalentcs rcductores a través de la cadena respiratoria liasta el oxigeno. El pirtivato es reducida por el NADH hasta lactato. en una reaccibn catalizada por I n en7ima lactato deshidrogenasa. se han encontrado varias isoziinac de esta y iicnen importancia clínica (capitulo 8).
Piruvato + NADH + H' ++ L(+)-Lactato + NAD'

El fosfato dc alta energía del fosfoenolpíruvato es transfcrido al A D P por la enzima piruvato cinasa, para generar en este estadio dos moléculas de ATP por inolécula de glucosa oxidada. En enolpiriivrtto que se forina eii csta reacciiin cs convertido cspontkneamentc a la forina ceto del piruvato. Esta es otra reacción sin equilibrio que se acompaña de una pérdida considerable de energía libre en forma de calor y debe considerarse fisi<ilhgicainente irreversible.
Fosfoenolpiruvato + ADP t Piruvato + ATP
L'! estado redax dcl tejido determina ahora riifil de las dos vias se debe seguir. Si prevalecen las condiciones

La reoxidación del NADlI, por la via de la formación de lactato, permite que la gluc0lisis prosiga en auscncia de oxigeno al regenerar suficiente NAD' para otro ciclo dc la reacción calalizada por la gliceraldchído3-Tosfato deshidrogenasa. En condiciones aerobias, el piruvato se lleva al interior de las mitocondrias y, antes de su conversión en acetil-COA, se le oxida a CQ2 en el ciclo del ácido cítrico. Los equivalentcs reductores a partir de NADH - H- quc se forman en la gluc6lisis se introducen a las rnitocondrias por medio de 1 de las 2 lanzaderas que cc describen en el capitulo 14.

2 ¡S

Bruquimrca de Hrrrper

(Capítulo I9j

Tejidos que funcionan en circunstancias hipóxicas tienden a producir lactato (figura 19-2)
Esto e5 particularmente cierto en el rnusculo csqueIético, donde la velocidad de trabajo del órgano IIO e s t i limitada por su capacidad de oxigenaci6n. Las cantidades adicionales dc lnctato producidas piiedcn ser determinadas eii los tejidos y en la sangre y la orina. Laglucólisis en los eritrocitos, aun en condiciones aerobias, termina siempre en lactato porque la ~nitocondria,que contiene la maquinaria enzirnhtica para la oxidación aerobia del piruvato no esta presente. El eritrocito de mamiferos es único en el sentido de qiie 90% de su necesidad total de energia es sumfnistrada por la gluc0lisis. Ademhs de las fibras blancas del niiisculo esqueletico, músculo liso y eritrocitos, otros te¡idos que nortnalrnente derivan la mayor parte de SLI cncrgia a partir de la glucólisis y producen Iactato, incluyen al cerebro, el conducto gastrointestinal, la in6diila renal. la retina y la piel. El hígado, riñones y corazón por lo general captan el lactato, pcro In producen shln en condiciones de hipoxia.

H-c=O
H-C-OH
I

t---Glucosa

JNADH + H' j

ADP.

T

coo-

La glucólisis se regula en tres pasos que implican ecuaciones no equilibradas
Aunque la mayoría de las reacciones glucolíticas son reversibler, tres de ellas son marcadamente exergbnic a i y, por tanto, deben considerarse fisiológicamente irrever5ibles. Estas reacciones con catalizadas por la herocinasa (y la glucocinasa), la fosfofructocinasa y el piritvato cinasa y son los principales sitios de regulación de la gluc6lisis. Las cClulas que son capaces de efectuar un movimiento total de metabolitos en la direccion de la síntesis de la vía glucolitica (gluconeogénesis) lo hacen debido a la presencia de diferentes sistemas enzimáticos, los cuales proporcionan rutas alternas de las reacciones irreversibles catalizadas por las enzimas mencionadas. Estas, junto con !a re&<?cidn dt. la g~ucóiisS,se e.~tua'ia;lnal tratar la regulación de la gluceneogknesis cn el capitiilo 2 1.

700H-C-OH

L--

+ Piruvato

Figura 1 9 4 . Ciclo del 2,3-b1sfosfoglFceratoen loseritrocitos.

En los eritrocitos, puede suprimirse el segundo sitia de glucólisis para generación de ATP
E n los eritrocitos d e numerosas especies d e mamiferos, el paco catalizado por la fosfoglicerato cinasa. puede ser desviado por un proceso que disipa eficazmente, en forma de calor, la energía libre relacionada con el fosfato de alta energía del 1,3-bicfos-

foglicemto (figura 194). Una enzima adiciona!, !a bisfosfoglicerato mutasa, cataliza la convcrsfdn dcl 1,3-bisfosfoglicerato a 2,3-bisfosfoglicerato. El último es convertido en 3-fosfoglicerato par la 2,3bisfosfogliceratofosfatasa, actividad que tambien se atribuye a la fo.~fogliceer;ifu rnuktsa. L7 p é d i d s de un r fosfato de alta energía, Indicadora de que no hay produccihn neta de ATP cuando la gluchlisis toma esta vía, puede ser vent,josa para la economía del eritrocito, ya que permitiría que la glucólisis continuara cuando la necesidad de ATP fuera mínima. Sin embargo, el 2,;-bisfosfoglicerato, que se encuentra en concentracibn elevada, se combina con la hemoglobina, causando una disminucibn de la afinidad por el oxigeno y un desplazamiento hacia la derecha de la curva de disociación de la oxihemoglobina. Asi, su presencia en los eritrocitos ayuda a la oxihemoglobina a descargar oxigeno (capitulo 7 ) .

LA OXIDACIÓN DE PIRUVATO A ACETIL-CoA ES LA V ~ A IRREVERSIBLE DE LA GLUCOLISIS AL CICLO DEL ÁCIDO C~TRICO
Aiitcs dc quc cl piriivato pueda entrar en el ciclo del acidocitricci debc Ilcvarsc al interior de lamitocondria 1.13 iin transportador especial de piruvato que a) uda a su paso a través de la membrana mitocondrial interna. E.itci crlmprcnde un mecanisnio simportador q ~ c c o t r i n ~ p o riin proton (figura 14-1 2). Dentro de ta la iiiitocondria, el piruvato es descarboxilado por oxirlaciiin a a c e t i l 4 o A . Varias enzima5 catalizan esta rc,i~cicin nperarido secuencialmente en 1111 comple-jo riiultieiiziinático. Se lec designa de manera colectiva coino cl cornple,jo piriivato deshidrogenasa y son ,iiialogas al comple.io de la alfa-cetoglutarato dcsliitlrogenasa del ciclo del hcido cítrico (figiira 18-3). t:l pirutato es descarboxilado por Ia piruvato dcshidrogenasa, componente del complejo de la en7inia ii un dcrivado hidroxietilico del anilla tiazhlico del riifosfatn de tiamina unido a la enzima, que a su veL i~acciona la lipoamida oxidada, el grupo prnsiiiico con dc l a riihidrolipolil transacetilasa, para formar ,icciil-liponrnida (figura 19-5). La tiamina es un imporiantc miembro del complc,jo de vitamina B (capitulo 52). EI aceti 1-Tipoamida reacciona con la cticnrinia A formando acetil-CoA y lipoamida rediicido. E1 ciclo de reacción se complcta ciiando el uliimo cs reoxidado por iina flavoprotcina conteniendo FAD. eii presencia de dihidrolipoil deshidrogenasa. rinnlmcnte, la flavoproteina reducida cs oxidada por cl NAD-, cI que a su ve7 transfiere equivalentes rediictores a la cadena respiratoria.
Piruvato + NAD' + COA 4

La piruvato deshidrogenasa se regula mediante la inhibición por el producto final y la modificación covalente
La piruvato deshidrogenasa cc inliiblda por siis productos. acetilCoA y N A D H (figura 1 9 4 ) Tamhibn Fe regula mediante la fosforilaciún de tres recidiios de serina dcl componente piruvato desl-iidrogcnasa del compleio multienzima con participacihii de una cinaa especifica de A'ff', la cual disminuye la actividad, y por medio de la fo~forilacionpor iina fosfiitasa quc iiicrtnientn la actividad de la deshidrogeriasa. La cinasa se activa cuando aumeiitan las proporciones de [acetil4oA]ilCoA], pADH]rmAD'l o [ATP]/[ADP]. Por tanto, la piruvaio dcshidrogenasa y, del mismo modo, la glucólisis se iiihiben no shlnpor un potencial energético eievado, sino también bajo condiciones de oxidación de acidos grasos, quc incrementan estas proporciones. Así, en la inanicihn, cuando se increnienta la concentración dc icidos graso5 libres. di+ rninuye la proporcihn dc Ia cnzima en la forma activa lo que ahorra carbohidratos. Un aumento en la actividad en el tejido adiposo ocurrc dcspiiks de la administración de insulina, pero no en el Iiigndo.

La oxidación de la glucosa produce hasta 38 moles de ATP en condiciones aerobias, pero sólo dos cuando no hay oxígeno
Cuando un m01 de glucosa es qucmado e n un calorímetro hasta CO? y agua, se liberan aproximadamente 2780 kJ como calor. Cuando la oxidacion tiene lugar en los tejidos, algo de esta energia no se pierde inmediatamente como calor, sino quc cs "capturada" en enlaces fosfato de alta energía. Aprouimadamcnie 38 moles de A'TP son generados por molécula de glucosa oxidada hnsia CO? 4 agua. In vivo. se ha calculado que el AG para la reacción de la sintesis de ATP es de aproxiinadamente de 5 F . 6 kJ. Se asume que la energia total capturada en forma de A'I'P por las moleculas de glucosa oxidada es de 1961 kJ, o cerca de 68% de la energia de combustión. La mayor parte del ATP se produce como consecuencia de la fosforilación oxidativa resultantc de la reoxidación por la cadena respiratoria de las coenzimas reducidas. El resto es generado por fosCoriIacih a "nive1 de sustrato" (capítulo 14). En el cuadro 19-1 se muestran las reacciones responsablps de la forinacicín de fosfato de alta energia durante la oxidación de la glucosa y la producción total cn condiciones acrobias y anacrubias.

Acetil-Cok + NADH + H'

+ CO2

CI coniplejo piruvato hidrogenasa consiste en cierto riiiinero de cadenas polipeptidicas de cada una de las tres en7imas componentes, organizadas en una config~iración espacial regular. El movimiento de las enzimas individuales parcce ser restringido y los intermediarios inctabiilicos no se disocian libremente, cino que permanecen unidas a las enzirnas. Tal complejo enzimatico, en donde los sustratos se manejan dc una enzima a la siguiente, incrementa la velocidad de reaccion y elimina reacciones secundarias, lo que eleva la eficiencia global. k.s de notarse que el sistema piruvato deshidrogenasa es suficientemente elecíronegativo con respecto a la cadena respiratoria que, además de generar tina coenzima reducida (NADH), tambien genera un cnlace tioester de alta energia en la acetilXoA.

Figura 19-5. Descarboxilacion oxidativa por el complejo piruvato deshidrogenasa El acido Iipoico esta unido mediante un enlace amida al residuo de Iisina del componente transacetilasa del complejo enzimatico. Forma un brazo largo y flexible, permitiendo que el grupo prostetico del Acido Iipoico gire secuencialmente entre el sitio activo de cada una de la$ entimas del complejo (NADt. dinucleotido de adenina y nicotinamida, FAD, dinuclebtido de flavina y adenina. TDP, difosfato de tiamina.)

ASPECTOS CL~NICOS

La inhibición del metabolismo del piruvato produce acidosis Iáctica
Los iones arsenito o mercuricos forman complejos con los grupos -SH del ácido lipoico e inl~ibena la piruvato deshidrogenasa, del mismo modo que una dcftcicncia diet4tica de tiamina, la cual permite la acurnulaciiin de piruvato. Los alcoh6licos privados de

aliinei~iostienen deficiencia de tiamina por lo que. cuando reciben glucosa, muestran una acumulacion ripida de piruvato y acidosis lactica, que con frecuencia es mortal. Por su parte, los pacientes con carencia hereditaria de piruvato deshidrogenasa, que puede deberse a defectos en uno o más de los componentes del complejo de la enzima, se preseiitan con una acidosis lactica similar, en especial después de una carga de glucosa. En virtud de su dcpeiidencia de este carbohidrato como combustible, cl ccrebro es uti tejido relevante para que este defecto metabblico se manifieste en trastornos neurol6gicos.

i-i-1
NADH + H+
PDH-a

[ A~etil-COA ]

!COA]

[NADH] [NAD']

W I
[Aopl

M~''

fOESFOSF0-ENZIMA activa)

1

PDHFOSFATASA

M ~ ' +ca3+ .

\

1

Insulina

(en el tejido adrposo)

Figura 1 9 4 . Regulacion de la piruvato deshidrogenasa (PDH) Las flechas onduladas indican afectos alost8ricos. A: Regulación por inhibición d e producto final B: Regulación por interconverción de formas activa e inactiva

Se Fabe de mutaciones de virtualmente todas las enzimas del metabolismo de carbohidratos, cada una de el las relacionada con enfermedades Iiumanas. La deficiencia hereditaria de aldolasa A y de piruvato cinaFa en los eritrocitos causa anemia hemolítica. La capacidad de esfuerzo de los pacientes con deficiencia muscular dc frisfofriictocinasa es baja, en particiilar con dietas ricas en carbohidratos. Proporcionar iin coinbustible lipidico alterno. por ejemplo, durante iriaiiicihn. ciian'do hcida'; gmsos y cuerpos cetonicos auincntaii, inejora la capacidad para el trabajo.

RESUMEN
1) Ln glucolisis es la via para el metabolismo de

rlucosa (o gliicbgeno) a piruvata y lactato, la cual -

se efectúa en el ciiosol de todas las celulas de mamíferos. 2) Funciona de manera anaerobia mediante la regeneración del NAD' necesario en la reaccion de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, por acoplamiento de csta reacción a la reduccihn de piruvato a lactato. 3) El lactato es cl producto final de la glucolisis anaerobia(por ejemplo, en el músculo en ejercicio) o cuando la maquinaria inetabhlica no existe para oxidacion ulteriw del pituvato (comoen los eritrocitoc). 4) La glucolisis se regula por tres enzirnas qiie catalizan reacciones sin equilibrio, a saber, hexocinasa (o glucocinasa), fosfofiuctocinasa y pinivato cinasa. 5) En los eritrocitos, el segunda sitio donde se lleva a cabo la gluciilisis para producir ATP, puedc ser

222

Binquimfca de Harper

(Capitulo 19)

-

Cuadro 19-1. Generacibn de fosfato de alta energía en el catabolismn de la glucosa
acci6n cat ción d e 4
rcspiratoria osforilacion ;iE nivel cle1 sirstrato osforilación al nivel cle1 sustrato

Gliceralaeniao-.+-tosrato deshiidrogenasa
Fosfogliscerato cina Piruvato cinasa

Cantidad de ATP consumida por reacciones catalizadas por la hexocinasa y la fosfofructacinasa

clo del ido
rico

deshidrogi

iglutmato r o tiocinasa . ... Malato cleshidroger

nasa

Qxidacibn de 2 NADH en la cade rcspirato,ria Oxidacibn dc 2 NADH. en la cade respira10 0ixidacihn de 2 NADH: en la cadc licL respiratoria ixidacibn al nivel del sustrato . . ixidaciiin de 2 FADH2 en la cadena respiratolria ixidación de 2 NADH: en la cade
,,S

6

2
4

-

Totai por moiecuia ae glucosa eti condiciones aerobias
-

as

respiratosria
,
,*"A""

Total 30

4

T c condiciont -)tal por moslkculas de glucosa en Ia glucblisis -St- c,urirs -.. el NADH
que
c---.liiiiiiiiuiii c i i

las rnitocandiim ~ J IiiicJio de la l a n ~ ~ suc ai ~ a l a t o i (figura 1 14-16) Si se emplea la lanzadera de glicerofosFato s61o podrian formarse 2 - P por mo de NADE1, siendo ent nnces la producción ñetrI total de 36 en lugar de 38 El calculo ignora la pequeiia perdida de ATP debido al transporte de H N con piruvato hacia la niitocondria ) a un transporte semejante de H' en la operacibn de la lanzadera de malato, lo cual totali r aproximridamente 1 rno1 del ATP'. Nótese qur l hay un beneficio sustancial en condiciones anacrobiaf SI el glucbgeno es el punto de Iinicio, dado que . a prodiicci6n total 43e fosfato dr .. . . alta cnergil en la glucíilisis se eleve de 2 a 3, puesto que e l ATP ya no se necesita para la reaccibn de hexocinaa.
L> L I ~ I W ~ U ~

tado hacia

-

esquivado, lo cual conduce a la formacibn de 2,3bisfosfoglicerato, importante para disminuir la afinidad de la hemoglobina por 0 2 . 6 ) El piruvato es oxidado a acetilXoA por un complejo multienzimatico conocido como piruvato

deshidrogenasa que depende del cofactor vitarnínico difosfato de tiamina. 7) Los trastornos que implican una incapacidad para metabolizar pimvato con frecuencia conducen a acidosis Iáctica.

REFERENCIAS
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El glucaghn es la principal forma de almacenaje de carbohidratos en los animales y corresponde al almidón de las plantas. Se encuentra en proporcibn mayor en el hígado (hasta 6%) y en el musculo, donde rara vez excede de 1 por ciento. Sin embargo, debido a su masa mayor, el músculo almacena 3 a 4 veces la cantidad de gluciigeno que tiene el hígado como reserva (cuadro 20-1). Al igual que el almidón, es un polimero ramificado de alfa-D-glucosa (figura 15-1 5).

glucógeno. Por su parte, el glucógeno muscular s61o disminuye de manera significativa después de un qjercicio vigoroso prolongado. Las enfermedades por almacenamiento de glucógeno son un grupo de trastomos hereditarios caracterizados por la deficiente movili7ación de glucógeno o por la deposicibn de formas de glucógeno anormales, originando debilidad muscular o, inclubo, la muerte.

LA GLUCOGENESIS SE PRESENTA PRINCIPALMENTE EN MÚSCULO E HIGADO
La vía de biosíntesis del glucógeno utiliza un nucleótido de glucosa especial (figura 20-1)
La glucosa es fosforilada a glucosa-6-fosfato, una reaccihn que es comun para la primera reacción en la vía de glucblisis a partir de la glucosa. Esta reacción es catalizada en el rnúscuto por la hexocinasa, y en el liigado por la glucocinasa. La glucosa-6-fosfato es convertida en glucosa-l -fosfato en una r e a c c i ~ n que catafiza la enzima fosfoglucomutasa. La enzima participa misma está fosforilada y cl gmpo fosf~rico en una reacción reversible en la cual la glucosa-1,6bisfosfato es un intermediario.

El glucógeno muscular funciona como fuente de fácil disponibilidad de unidades d e hexosa para la glucblisis dentro del propio musculo. El glucógeno hepatico sirve en gran medida para exportar unidades de htxosa para la conservación de la glucosa sanguinea, en particular entre comidas. Despuds de 12 a 18 horas de ayuno, el higado casi agota su reserva de

dro 20-1. Almacenamiento de carbohidsatos I ser humano adulto normal (70 kg), después I
Glucógeno hepi (ilucúgtno mus Gluc-osa extrace
--..-m

i

del hlgado,

a muscular. 33 ~ g . imen total, 10 L.

En seguida, la glucosa-1-fosfato reacciona con el ,rifosfato de uridina (UTP, de1 ingles, uridine briphos-

Gjucbgeno
(Unidades glucos~lo1
4 y 1+6)

(Unidades glucosilo 1 +4),

Insulina I

"Glucogeno

primordial"

t

1 0 I

Glucagon Adrenalina
D~fosfato de uridina y glucosa

A la vla del Bcido v r 6 n i c ~

UDPW PPIROFO~~JFORIMSA,~

Glucosa liberada por la enzima desramificante

2 PI

Tnfosfato
de uridina (UTP)

\

Glucosa-1 -fosfato

u
CINAJA

Glucosa-6-fosfate

ATP

T alyc0Wsis and mntoss o bhmphaie pathway

Glucosa

Figura 20-1. Vía de la glucog4nesis y glucogenblisis en el higado. Se emplean dos enlaces fosfato de alta energía en la incorporacion de 1 mol de glucosa al glucbgeno 0 , estimulacion, inhibición La insulina reduce la concentración de cAMP s61o después de que el glucagón o la adrenalina la han elevado, es decir. antagoniza su accibn El glucagon es activo en el músculo cardiaco pero no en el músculo esquelético. Al parecer, la glucanotransferaca y la desramificación son dos actividades separadas de la misma enzima.

e ;

phcrrc) para formar el nucleótido a c t i v o difosfato de gliicosa de tiridina (UDPGlc, del inglés, uridine ~liphmphute pltrrn.re)* (figura 20-2).

La reacción entre l a glucosa-1-fosfato y el trifosfato de uridina es catalizada por la enzima UDPGIc pirofosforilasa.

UJP + Glucosa-1-fosfato

c-, UDPGIC+

PPi

* hbc conoccii otros compuestos de ~iiiclc~sidosdií'nsfatos de
<le wucares. por cjernplo el UDPGal. Además, CI mismo

sriicar pucdc citar unido a diferentes nuclchtidiir Por cjcinplo. la glucosa puede enlazarse a los nuclcótidos de iiridina (cumu se muestra desput's), asi como a Iris de guatiosina. tiinidinn. adcnosina o citidina.

La consiguiente hidrblisis del p i r o f o s f a t o inorzanico por la pirofosfiitasa inorganica impulsa la reacción la derecha la Gracias a la acción de la enzima gluchgeno sinta-9 el C I de la g l u c ~ s a c t i v a d a de la UnPGlc a forma un enlace glucosidico c o n e l C4 d e l residuo

En el mecanismo de ramificación hay desprendimiento de cadenas de glucógeno existentes
O
I

---HO OH

Ribosa

Glucrisa

Cifosfato

Uridina

Figura 20-2. Difosfato de glucosa de uridina (UDPGlc)

teriiiin;il de glucosa dcl glucogeno, liberando difosfato dc uridina (llDP). Debe haber una molécula preexisterite d e glucógeno o gluchgeno primordial para iniciar esta reacción. Ida molécula priinordial dc gliicrjgeno puede a su ycz haberse formado de una ~iroteinaconocida como glicogenina.
UDPGlc

L,a adición de un residuo de glucosa a una cadena previa de gluc6geiio o molkcula primordial tiene lugar eii el extremo externo no reductor de la molécula. de manera que las "rainas" dcl "árbol" de glucógerio se vayan alargando conforme se constitiiycn otroc enlaces 1 +4 (figura 20-3). Cuando la cadena se ha alargado como minimo a 1 I residiios d e glucosa, una segunda enzima. la enzima ramificante ([1+41=tl l k 6 ) amilotransgliicosidasa), transtiere tina parte de la cadena 1 4 4 (longitud rnfnima de seis residuos cfc glucosa) a una cadena vecina, para formar un enIace 1- 6, estableciendo de este niodo un punto de ramificación en la molécula. Las ramas crcceii por inis adiciones de unidades glucosilo 1 +4 con ramificacihn posterior. Ciiando el número de residuos terininales no redrictores aumenta, la cantidad total de ciclos reactivos en lamcil~ciila e eleva, lo cual acelera F taiito la glucogCiiesis como 13 glucogen<ilisic.

* (CE.1"

t

UOP + (Cs)n+i

glucogeno

glucogeno

LA GLUCOGEN~LISIS 0 ES N LA INVERSA DE LA GLUCOGENES~S
SINO UNA V ~ A SEPARADA En la via de degradación interviene un mecanismo de desramificación (figura 20-1 )
Es el paso catalizado pos In fosforilasa, que es liinitante de la velocidad en la glucogenhlisis:
(C8)n +

Ln ~l,liicogeriiriaes una prntcina de 37 kDa qiie se glucohila sobre iin residuo especifico de timsina medinnte UDPGlc. Otros rcciduos adicionales deglucosa se adhiere11en la pocicibn 1 4 4 para hacer una cadena corta cpe se activa For la gluc6geno sintasa. En el iiiúsciilo esqueletico, la glucogenina pcrmancce adIierida en el centro de la molécula de glucógeno (figura 15-5 j, ~nicntias en el higado, el numero de moléculas qtic tic :I~ic6gcnci supcra al de glucogenina.

P r

+

(C&-1

+ Glucosa-1-fosfato

glucogeno

glucogeno

O Residuos de glumsa no marcado OK3 Enlace glucosidico l+6

~~~-~lucosa adicionada

..

,
, .

CC'

1

/

Figura 20-3. Biosintesis del glucogeno El mecanismo de la ramificación puede observarse por adición de glucosa marcada con C" a la dieta en animales vivos y examinando el glucbgeno hephtiw en posteriores intewalos

Esta enzima es especifica para la degradacion fosforolítica (fosforólisis confrontese hidrólisic) de Ios enlaces 1 del glucbgeno para producir glucosa-l -fos4 Iaro. Los residuos glucosilo de las cadenas más externas de la inolécula del glucógeno son separadas hasta qiie nihs o mcnns cuatro residuos de glucosa permanecen en cualquier lado de una rama 1 4 6 (figura 2 0 4 ) . Otra enzima (alfa-1 I +4]-+aIfa-[1-+4] glucano transferasa) transfiere una unidad trisachrida de una rama a la otra. exponiendo los puntos f+6 de la rama. La escisibn hidrnliticii de estos últimos enlaces requiere la acción de una enzima desramificante Q[1+61amilogliicosidasa). Con la eliminacion de la rama, pi~ede proseguir la accfiin de Ia fosforilasa. La accihn combiiiada dc la fosforilasa y de estas otras enzimas conduce a la degradación completa del gIucbgeno. La reacción catali7.ada por la fosfoglucomutasa e5 reversi hle, de modo quc puede formarse glucosa-h-fosfato a partir de la glucosa-l-fosfato. En e1 hígado y e1 riñiin (pero tio en el míisculo), hay una enzima específica, la glucosa-ti-fosfatasa, que rctira cl fosfato de la glucosa-6-fosfato, permitiendo que la glucosa libre difiinda de fa cklula a la sangre. Éste es el paso final de l a glucogenolisis hepática, la cual se refiqja en la elevación de fa glucosa canguinea.

EL AMP C~CLICO INTEGRA LA REGULACIÓN DE GLUCOGENOLIS~S Y GLUCOGÉNESIS
Las principales enzimasqlic controlan el metabolismo del glucógeno -gluccigcno fosforilasa y glucógeno sintasa- están controIadas a sti vez por una serie compleja de reacciones que comprenden mecanismos alostéricos y modificaciones cova~entesdebidos a la fosforilacibn y desfosforilación reversible de la proteína enzimatica (capítulo 1 1). Muchas modificaciones covalcntes se deben a la acción del cAM P (ácido 3',5' -adenilico cidico; AMP cíclico) (figura 20-5). El cAMP es el compuesto intermediario intraccluIar o segundo rncnsajero, a travbs del cual actúan numerosas hormonas. Proviene dcl ATP mediante Ia acción de la enzima adenilato ciclasa, que se encuentra en la superficie interna de las membranas celulares. La adenilato ciclasa es activada por hormonas como la adrenalina y la noradrenalina que actúan a travCs de receptores beta adrenérgicos en la membrana ccEular y en el higado por medio de! glucagdn, que actúa a traves de un independiente receptor de glucaghn. E1 cAMF es destruido por una fosfodiesterasa y la actividad de esta enzima es la que, por lo c o m h , conserva baja la concentracihn de cAMP. Se sabc que la insulina incrementa su actividad en el liigado, disminuyendo por tanto la concentración de cAMP.

La fosforilasa hepática es diferente a la muscular
En el higadn, la enzima existe en tanto en la forma activa como en Ia inactiva. L a fosforilasa activa (fosforilasa a) tiene uno de sus grupos hidroxiIo de seriiia fosforilado en un enlace éster. Con Ia acción de una fosfatasa especifica (proteína fosfatasa-ll ), la enzima es

cosa por enlaces glucosidi-

cos 1+4 Unibnde residuos de glucosa por enlaces glucosldicos 1+6

Figura 2 0 4 . Pasos en la glucogenólisis

Figura 2 0 6 . Ácido 3',5'-adenilico (AMP ciclico; cAMP).

Metabolismo d ! g/i:cb,yyno i¡

22 7

inactiv~da fosforilasa b en una reacción que comprende a In cliiiiinacion hidrolitica del residuo de serina. La rcaciivacion requiere una nueva fosforilaci6n con A 1'1' y u n a enzima especifica, la fosforilasa cinasa. 1.a f<isSorilasa muscular es inrnunol~gicay genéticainente distinta a la dcl hígado. Existe en dos formas: fosfiirilasa a, la cual esta fosforilada y es activa en precencia o en ausencia de A M P (su rriodificador alosterico) y la fosforilasa h, la cual esta desfosforilada 4 es activa solo en presencia del AMP. Esto ocurre diirante ejercicio cuando laconcentracibn dc cAM P aumenta, mecanismo que proporciona combiistiblc al músculo. L,a fosforilasa a es la forma activa Iisiolhgicamente normal de la enxima.

dependiente de cAMP. La subunidad beta fija 4 Ca" y es identica a Ia pmtcina ,¡adora dc Caz+. la calmodulina {capítulo 44). La fijación del Ca2' activa el sitio cataIitico de la subunidad garnma en tanto que la molécula permanece en la configuracicin b desfnsforilada. Sin embargo, la f ~ m a fosforilada sólo es activada por completo en presencia de Caz'. Es un hecho significativo que la calmodulinn sea analoga cn estructura a la 'lpC. la proteina .jadora de Cal' en el mlisculo. Una segunda molecula de ca!modulina o dc TpC puede interactuar con la fosforilasa cinasa, aumentando la nctivacibn. Por tanto, la activaciiin de la contraccibn muscular y de la glucogcn6lisis son realizadas por la misma proteina tijadora de Caz-, 10 cual asegura su sincronizacidn.

El cAMP activa la fosforilasa muscular
I .a fcisforilasa en el músculo es activada por la adreiialiiia (lisura 20-6). Sin embargo, esto ciicede no conio u11 cfccto directo cine por medio de la accion del cAMP. EI increinento en la concentraci6n del cA M 1' activa a iina enzima con especificidad amplia, la proteína cinasa dependiente de cAMP. Esta cinasa catali7a la foshrilación por el ATP de la fosforilasa cinasa b inact ¡va a la fosforilasa cinasa a activa, lacual, a SLI vez, por conducto de una fosforilacibn posterior. activü a la t'osforilasa b a fosforilasa a. La proteína cinasa inactiva depeiidiente de cAMP esti ctinslituida por dos partes de subunidades, cada par formado de una subunidad reguladora (R), que fija 2 moleculas de cAMP y una subunidad catalitica (C), que contiene cl sitio activo. La combinacihn con el cAM13 hacc que el cornple+joR2C2 se disocie, liberando los inonómeros C activos.
R2C2 + 4cAMP o 2C + 2(R<AMPz) Enzima Enzima

La glucogenólisis en el hígado puede ser independiente del cAMP
AdemBs de la importante accihn del gIucag6n en la formacibn del cAMP y en la activacion de la fosforilasa hepática, los csiudios han mostrado que los receptores alfa, son los principales mediadores de la estimulaci6n de las catecolaminas en la glucogenolisic. Esto implica una movili;r,acibn de Ca2-, independiente del cAMP, de las mitocondrias al citosol, segiiida por la estimulacion de una fnsforilasa cinasa sensible a Ca2t/ca1modulina. La gliicogenólisis independiente de cAMP es causada tambidn por la vasopresina, la oxitocina y la angiotensina 11 que acíiian a travds del calcio o de la via del bisfosrato de fosfatidilinositol (figura 44-7).

La inactivación de la fosforilasa es efectuada por la proteina fosfatasa-í
Tanto la fosforilasa a como la fosfori lasa ciiiasa a son desfosforiladas e inactivadas por la proteína fnsfatasa-l. Esta ultima es inhihida por una proteina denominada inhihidor-l, el cual es aclivo siilo después de que ha sido fosforilado por una proteina cinasa dependiente de cAMP. Por tanto, el cAM13 controla tanto la activación como la inactivacibn d e la fasforilasa (figura 2 0 4 ) .

inactiva

activa

El Ca2+sincroniza la activación de la fosforilasa para iniciar la contracción muscular
La glucogenólisis aumenta cn el mucculo varios ciendespués del comienzo de tos de veces inmedia~amente la ~nnlraccibn.Esto comprende la activación rhpida de la fosforilasa, caiisada por la activación de la fosforilasa c i n a ~ apor el Caz+, la misma sefía1 que inicia la contracción. La fosforilasa cinasa muscular tiene cuatro tipos de subunidades: alfa, beta, gamma y deIta en una estructura represcntada como (apyG)4. [,as subunidades alfa y beta contienen residuos de scrinn que son fosforilados por la proteina cinasa

La actividad de la glric0geno sintasa y de la fosforilasa se regula de manera recíproca (figura 20-7)
AI igual que la fosforilasa, la glucógeno sintasa existe en estado fosforilado y no fosforilado. Sin embargo, al contrario de la primera, la fbrma activa está desfosforilada (gliicógeno sintasa a) y puede ser inactivada a gliiciigeno sintasa b mediante la l'osforilaci6n en siete residuos de scrina por no metios dc

Adrenalina
Receptor p

Adenilato

clclasa inactiva

Adenilato ciclasa

activa

FQSFODIESTERAJA
ATP
r-

Glu~&geno(~+i]
c 5'-AMP

CAMP

1

Figura 20-6. Control d (n = numero de

La secuencia de reacciones ordenadas corno una cascada permite la amplificación de la seíial hormonal en cada paso

~cic proteina cinasas difcrcntcs. Los siete sitios dc fosfori laciijn ecthri coriten idos eii cada 1 de 4 subunitladts idkilticas. Dos de las proteína cinasas son depeiidientes de Caz-'calmodulina (una de estas es E a frisforilasa cinasa). Otra c i In prolcliia ciiiasa depend i c i ~ t edc cAMP. que permite la accioli honnonal mediada por cAM13,de iiiliibir la síntesis de glucogeno dc inodo siiicronizado con la activación de la glucosenniisis. [ , a 5 cinasas rcstnntcs son conocidas como gliicogeno sintnsa cinasa-3, -4 y -5. La glucosa-ú-iosI';iio cs ti11 aclivador alostérico de la glucbgenci sintasa li. que C¿ILIWLIII~ wduccihn en Ia Klllpara la UDP-glucoca y que permite lii síntesis dcl gluctigeno por la cn~ii-tiai i s h i ilada. E l g l u c ~ g e n o l tatnbien e-jeerce una iiihibición sobre su propia forniacibii, y la insulina t;irnbi&i-i estiinula la ~ i n t e ~ de gluchgcno en cl is iníisculo, al proinover la de~fosforiIaciiiri activaciiin y de Iri glucbgeiici sintasa b. Por lo general, la decfosfo-

rilacion de la glucOgeno sintasa b se efectUa por la acciiin de la proteina fosfatasa- 1 , la cual estd Iiajo el coritrol de la proteina cinasa dependicntc dc c A M I '

(tigura 20-7).

EL EQUILIBRIO DE LAS ACTIVIDADES ENTRE LA GLUCOGENO SINTASA Y LA FOCFORILASA REGULA EL METABOLISMO DEL GLUCOGENO (Figura 20-8)
La glucógeno sintasa y fosforilasa estan baio control del su.;tratn (por alosterismo) asi coino b control horo i . inonal. L a ioslorilasa sc activa no solo por uii aiinicnto en la ~oiicentraciónde c A M t' (por medin de uiia fci~ftirilasaciiiasa). sino quc al inisnio licinpo la

Adrenalina

Receptor p

@
Adenilato ciclasa activa

Adenilatocicla~a inactiva

ATP

4

cAMP
l

1 FOSFODIESTEWSA 1
t

5'-AMP

inactiva

DEPENDIENTE Inhibidor-1 (inactivo)

pr m a Cl*& r9 u
DEFf PI3 E n

PROTEINA

DEPENDIENTE

ADP

Glucosa-6-tosfato

GlucbgenomF
+ UDPG
Inhibidor-1-fosfato (activo)

PROTE~NA FOSFATASA-1

Figura 20-7. Control de la glucogeno sintasa en el musculo (n = número de residuos de glucosa) La secuencia de reacciones ordenadas en cascada permite la amplificacibn de cada paco. lo que hace que cantidades nanomolares de hormonas produzcan cambios importantes en la concentracibn de glucbgeno (GSC, glucógeno sintasa cinasa-3, -4 y -5. flecha ondulada. adivacion alostérica)

glucógeno sintasa se convierte en la forma inactiva; Im dos efectos son mediados por una proteína cinasa dependiente dc cAMP. Aqí, la inhibición de la glucogenblisis potencia la glucogenesis total y, a sir vez, la inhihiciOn de ésta incrementa Ia glucogenblisis total. Tn~iibiCi~ la regulacihn del metabolismo del en gluch~eno importante el hallazgo de que la desfoses torilación cie la fosforilasa a, de la fnsforilasacinasa g dc la gliicíigeno sintasa h cs llevada a cabo por una sola enziina de especificidad amplia-proteína iosfataw-l. A sii vez, esta ultima cs ínhibida por una ~xwteinacii~asadependiente de cAMP a tmvtSs del ilihibidor- I (Figura 20-8). Por tanto, la gliicogenolicis ~ ~ c krminarse y la glucog&nesis estimularse dc d c inanera sincrnnizada o viceversa, debido a que los dos prncecns se sincroilizan por la actividad de la proteína cinasa dependiente de cAMP. La dos cnzimas, fosfo-

rilasa y glucógerio sintasa, piicden iosforilarsc de mancrareversible en mhs de un sitio por de las cinasas y la acción de las fosfatasas separadas. Estas fosFnrilaciones secundarias modifican la sensibilidad de los sitios primarios para fosforilacion y desfrisforilaciiin, Io cuaI se conoce como fosfnril~cihn sitios rnirltiples. de

El factor principal en el control del metabolismo hepático del glucógeno es la concentración de fosforilasa a
Esta cnzima controla no sOlo cl paso limitante de velocidad en la glucogentílisis, sino qiie tambien inhibe la actividad de la proteína fosfatasa- I y, de este modo, controla la sintcsic de glucogeno (figura 20-3). La inactivacibn de la fosforilasa es consecuencia de la inhibición alostérica por glucosa cuando In concen-

' J

/

PKOTEINA
FOSFATASA-1

/

PwTEINA CIHASP DEPEND~ENT E
DE cAMP

PROTE~M A
FOSFATASA-í

A

\

O

\
\

,/ '

Y
/

glucbgeno
\
\
/

J
/

Glucosa 1-Fosfato

Giuwsa (higade)

Glucosa

Lactato ( m ú s w i ! ~ }

Figura 20-8. Control coordinado de glucogenólisis y glucog8nesis por proteina cinasa dependiente de cAMP Las reacciones que conducen a glucogenólisis como resultado de un incremento en la concentracibn de cAMP se muestran por flechas gruesas y las que inhiben por activacibn de la proteina focfatasa-1 se muestran por flechas interrumpidas Lo inverso ocurre cuando la concentración de cAMP disminuye debido a la actividad de la fosfodresterasa, conduciendo a glucogenesis

Metahdi~mo nlucúgeno del

23 1

tracibn de esta se eleva después de una comida. La activación es causada por 5'-AMP que responde a la depleción de ATP. La administración de insulina de inmediato inactiva a la fosforilasa, lo cual es seguido por activación de la glucdgeno sintasa. Los efectos de la insulina requieren la presencia de giucosa. No se produce regulación de las enzimas de rarnificación y desramificacidn.

glucogenosis se resumen en el cuadro 20-2. Asimismo, se tienen informes de deficiencias de adenilata cinasa y proteína cinasa dependiente de cAMP. Algunos de los trastornos descritos han me-¡orado con los trasplantes de higado.

RESUMEN
1) El glucógeno representa la rnhs importante forma de almacenaje de carbohidrato en el cuerpo del mamífero y se encuentra principalmente en hígado y músculo. 2) En el hígado, su función principal es servir a otros tejidos mediante la generación de glucosa sanguinea. En el músculo, cubre las necesidades s61o d e ese órgano, como una fuente de combustible metabólico lista para usarse. 3) El glucógeno se sintetiza a partir de glucosa y otros precursores por la vía de la glucogénesis. Es degradado por una vía separada conocida como glu-

ASPECTOS CL~NICOS
Las enfermedades por almacenamiento de glucógeno son hereditarias
El termino de "enfemedad por almacenamiento de glucógeno" es una expresidn genkrica que intenta describir a un grupa de trastornos hereditarios que se caracterizan por depósitos de un tipo o de una cantidad anormal de glucógeno en los tejidos. Las principales
Cuadro : 20-2. Enf
. .

-- . - - ..---

iento de es por alrnacenam. . Causa del trasto rno

. .

Noin b r e

'aracterist

Enfi

:von Gierke

Deficiencia d e gIu fi

. . . Las ctlulas hephticas y del túbulo renal cargad as con glu cbgcno. Hipogluceinia, cetosiS e hiperlipidemia
acumulaci en los lis ~ c i cardia, a

-

iipo ir

hfemeaaa oe trompe

Deficiencia de fa glucosidasa alfa-1 +4 y 1 +6 l isosornal (maltasa ácida) iusencia dr inzima di

Tipo III

Dex trinosis Iírnite o enf: dad de Forbes o Cori
ris. cnfcrn

antc
enzima ante:

Acumula dos rami-

; polisaciri

acterísticu:

Tipo l V

Acumula S con puntos cioncle no esian muy ramificados. La muerte se debe a insuficiencia cardiaca o hepática en el primer ano de vida Disminliyc la tol erancia a 1 ,. ejercicio:; los musc UIOS tienen ---*--LA -- aiiuiiirale~altos de Luiireriiuub glucbgeno (2.5 a 4.1%). POCO O nada de lactato en la sangre dcsputs de ejeercich
4

Tipo V

Deficiencia de miofosfoi
sind:reme de McArdlc

fosforilasamuscular

Tipo VI

de fosfor ilasa he-

Alto coritcnido de gluchgeni hcphtíco , se tiendle hacia 1; hipogluclcmia Como eri el tipo V , pero tm bitn eki ste la pos ibilidad di anemia h emolitica
Lurrici cri

)eficienciaI de fosfo fructociasa en mil:rculos y eri trocitos
Jeiicierrcla de

fosforilasn ciria-

el tino VI

cogenbli~is. ~ t última conduce a la formacion de E a gliicora cri el hígado y de lactato en el músculo dehiclo ¿i la prcsenciñ o aur;ericia respectiva de gluciisa-O-fosfataca. 4) El A M P cíclico integra la rcgiilacion de In glucog c ~ i ~ i l i s iys de l a glucogdnesis cn Iin patroii

recíproco nl pi*omovcr la ac~ivaciiinde la fosforilasa y la inhibiciún de In glucógeno ~intasa. 5 ) Dcficicncias Iiercditarias en enziinas c h p c c i f i ~ r i s de metabolismo en hígado y múcciilo ocasionan enfermedades por almacentlrniento de glucógeno.

REFERENCIAS
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de la glucosa sanquinea
U

Peter A. Mayes, PhD, DSc

La gluconeogénesis es el temino que se iitiliza para incluir todos los mecanismos y vías responsables de convertir otras sustancias diferentes de los carboa hidrato~ glucosa o glucbgeno. Los sustratos principales para la gluconeogénesis son los amínoacidos glucogknicos, lactato, glicerol y propionato. El higado y el riíión son Tos tejidos donde se realiza principalmente el proceso, ya que contienen el conjuntocompleto de enzirnas necesarias.

en la glándula mamaria y se capta activamente por e! feto. Además, los mecanismos gluconeogénicos sc utiliran para depurar los productos dcl metabolismo de otros tejidos desde la sangre; por ejemplo, lactato, producido por el músculo y los eritrocitos, y glicerol, que se f o m a continilamente por el tejido adiposo. El pmpionato, principal ácido graso glucogénico producido por los rumiantes en la digestión de las carbohidratos, es un sustrato importante para la gluconeogénesis en estas especies.

IMPORTANCIA BIOMÉDICA
La gliiconeogénesis cubre las necesidades corporales de glucosa cuando el carhhidrato no esta disponible en cantidades suficientes en la alimentacion. Se rcquiere un suministro constante de gtucosa como fuente de energia, en especial para el sistema nervioso y los eritrocitos. La insuficiencia L.L la gluconeogénesis es por lo general mortal. Por debajo de una concentraci6n critica de la glucosa sanguínea, hay disfunción cerebral que puede conducir a coma y muerte. La glucosa se requiere también por el te-jido adiposo como fuente de glidrido-glicerol y es probable que intervenga en la conservaci6n de la cifra de intermedios en el ciclo del acido cítrico en numerosos tejidos. Es evidente que aun en las situaciones en qiie la grasa puede suministrar la mayor parte del requerimiento calórico del organismo, hay siempre un cierto requerimiento basa1 de glucosa. Además, la glucosa es el unico cambustible que suministra energia al muscu!o esquelético en condiciones de anaerobiosis. Es precursora del azucar de la leche (lactosa)

LA GLUCONEOGENESIS INCLUYE LA GLUCOLISIS Y EL CICLO DEL ÁCIDO C~TRICO,MAS ALGUNAS REACCIONES ESPECIALES (Figura 21 -1)
Las barreras termodinámicas impiden una inversión simple de la glucólisis
Krebs seílaló que las barreras energeticas obstruyen la reversión simple de la gluciilisis: entre el pimvato y el fosfoenolpiruvato, entre la hctosa-l ,B-bisfoshto y la fnictosa-6-fosfato, entre la glucosa-6-fosfato y la glucosa, y entre la glucosa-l -fosfato y el gluc6geno. Todas estas reacciones no tienen equilibrio, liberan gran parte de energia libre como calor y por tanto son fisloliigicarnente irreversibles. Es posible esquivarlas mediante reacciones especiales.

A. Piruvato y fosfoenoIpiruvato
En la mitocondria se locali7a la enzima piruvato carboxilasa, la cual, en presencia de ATP, la vitamina B biotina y CQ:, convierte al piruvato en oxalacetato.

234

Bioquím ica de Hurper

capitulo 2 1)

-

Glucosa HEXOCINASA

Glucosa 6fosfato
Glucógeno
AMP

A

1

Gliceraldehido 3-tosfato

Fosfato de dihidroxiacetona

3-Fosfato de glicerol

Fosfoenotpiruvato

Oxalacetato

Figura 21-1. Vias mayores y regulacibn de gluconeog8nesis y gluc6lisis en el higado. Los puntos de entrada de aminoácidos glucog&nicosse indican por flechas que salen de circulos (figura 1 8 4 ) . Las enzirnas gluconeogenrcas clave se muestran con un rectángulo doble El ATP requerido para gluconeog8nesis se suministra por oxidacibn de Budos grasos de cadena larga. El propionato s6lo tiene importancia cuantrtativa en los rumiantes. Las flechas onduladas significan efecto alost&rico, las flechas cortadas modificación covalente por fosforilacibn reversible Las concentraciones altas de alanina actuan como una "cefial gluconeogifnica" que inhibe la glucblisrs en el paso de piruvato cinasa

Gluconeogknesis y control de la gluco.~a san~uinea 235

La función de la biotinaes ligar el CO?del bicarbonato a la enzima antes de la adición del CO: al pinivato (figura 52-13). Una segunda enzima la fosf ~ e n ~ l p i r l l carboxicinasa, cataliZí! la Conver~at~ si6n dcl oxalacetato en fosfoenolpinivato. En esta reacción se necesita fosfato de alta energía en la fonna de GTP o ITP v se libera CO,. Por tanto. con la avuda de estas dos enzimas que catalizan transformaciones endergbnícas y de la deshidrogenasa Iáctica, el lactato se puede convertir en fosfoenolpiruvato, a! rebasar la barreraenergetica entre el piruvato y el fosfoenolpinivato. En el higado de pichones, pollos y cone,jos, la fosfocnolpiruvato carboxicinasa es una enzima mitocondrial y el fosfoenolpiruvato se transporta al citosol para su conversión en 1,6-bisfosfato de fmctosa por inversión de la glucólisis. En la rata y el raton la enzima esta en el citosol, lo cual genera un problema ya que el oxalacetato no difunde al travCc de la membrana mitocondrial interior. Esto se resuelve mediante conversión a malato, el cual puede transportarse al interior del citosol y reconvertirse en seguida a oxalacetato mediante la malato deshidrogenasa extramitocondrial. En el ser humano, cobayoc y vacas, las enzima se distribuyen por igual en mitocondrias y citosol.

C. Glucosa 6-fosfato y glucosa
~a conversión de glucosa h-fisfato en glucosa se cataIiza por otra fosfatasa especifica, la glucosa ó-fosfa-

h , no

, lo, ,

Esta enzima se encuentra en higado y pero tejidos muscular y adjpoco, supresencia a un agregar glucosa a la sangre,

D. Glucosa .I-fosfato glucógeno y
La degradacihn del glucógeno Iiasta gl~icosa -fosfato 1 se efectua por la fosforilasa. La sinresis de gluc6geno implica una vía enteramente diferente a travds de la formacibn de la difosfato de widina y glucosa y la actividad de la glucógeno sintasa (fígura 20-1). Estas enzimas esenciales que permiten la inversión de la glucólisis tiene una función importante en [a gluconeogenesic. Las relaciones entre e s t a enzimas claves de la gluconeogénesis y la vía glucoIitica se muestran en la fígum 2 1-1 . Decputis de la transarn inacidn o desaminacibn, los aminoacidos glucog~nicos forman ya sea piruvato o miembros del ciclo del ácido cítrico. Por tanto, las reacciones descritas pueden dar cuenta de la conversibn tanto de los aminodcidos glucog&nicos como del lactato, en glucosa o glucógeno. Asi. el lactato forma pinivato y dehe entrar las mitocondrias antes de convertirse en oxalacetato y en último término en glucosa. El propionato, que es la fuente principal de glucosa en los rumiantes, entra a la ruta gluconeog&nica principal por la via del ciclo del hcido cítrico despuis de su conversidn en succinil-COA. El propionato se activa primero con ATP y COA por una acil-COA sintetasa apropiada. La propionil-COA, producto de esta reacción, experimenta una reaccibn de fijacibn de COZpara formar D-metilmalonil-COA, catalizada por la propionil-COA carboxilasa (figura 2 1-2). Esta reaccion es anhloga a la fijacibn det C 0 2 en la

B. Fructosa 6-fosfato y fructosa 7,6-bisfosfafo
La conversión de fnictosa 1,6-bisfosfato en fiuctosa6-fosfato, necesaria para lograr la reversión de la glucolisis, se cataliza por una enzima especifica, la fructosa-1 ,&bisFosfatasa. Esta es una enzima clave en el sentido de que su presencia determina si un tejido es o no capaz de sintetizar glucógeno a partir no s61o del piruvato sino tambiin de los triosafosfatos. Esth presente en el hígado y ridones y demostrada en eI músculo estriado. Se sostiene que esth ausente en los musculos cardiaco y liso.

CoA*SH

CO2 +H,O
CARROXILASA

H -$- COO-

coo Propronato

CO- S- COA
ATP A M P + PPI
Propionil-COA ATP ADP + p,

o-Metilmalonil-COA

lntermedlos del ciclo del Acido

e

CH,

cítríco

C H ~ -C<>Pnlim.Bli~~~-tH 60-$-COA CO-S- COA
SucclnilEoA
L-Metilmalonil-COA

I

Figura 21 -2. Metabolismo del propionato.

acetil-COA por la acetil-COA carboxilasa (capitulo 23) en que forma un derivado malonilo y requiere la vitamina biotina como coenzima. La D-metilmalonilCOA debe convertirse en su estereoisómero, I -me& rnalonil-COA, por E metilmalonil-COA racemasa a antes de cu isomeracícin final a succinil-COA por la enzima metilmalonil-COA isomerasa, la cual requiere vitamina B 1 2 como coenzirna. La deficiencia de vitamina B 7 en el ser humano y los animales conduce 1 a la excrecion de grandes cantidades de metilmalonato (aciduria metilrnalhnica). Aunque la via hacia el succinato es su ruta metabólica principal, el propionato puede también utilizarse como cebo rnolecular para la sintesis, en el tejido adiposo y glandula mamaria. de los hcidos grasos que tienen un número impar de átomos de carbono en la molécula. Los acidos grasos C I qy C17se encuentran particularmente en los lipidos dc los rumiantes de donde constituyen una fuente importante de estos acidos grasos en la alimentación humana y por iiltimo se degradan en propionato en los tejidos (capitulo 24). El gIicerol es un producto del metaboIismo de[ tejido adiposo y sólo los tejidos que poseen la enzima activadora glicerol cinasa, lo pueden utilizar. Esta enzima, que requiere ATP, se encuentra entre otros tejidos, en el higado y riiiones; y cataliza la conversibn de glicerol en glicerol-3-fosfato. Esta via conecta con las etapas de triosafosfatode la vía glucolitica, porque el glicerol-3-fosfato puede ser oxidado a fosfato de dihidroxiacetona por el NAD' en presencia de la glicerol-3-fosfato desfiidrogenasa. E hígado y el b riii6n son capaces de convertir el glicerol a glucosa sanguinea haciendo uso de las enzimas anteriores, de algunas de las enzimas de la glucólisis y de las enzimas especificas de la via gluconeogénica: fmctuosa-1,6hisfosfataca y glucosa-6-fosfatasa (figura 2 1-1).

ficarse como responsables de la regulacíon de la actividad enzimática en el metabolismo d e carhohidratos se muestran en el cuadro 21-1: 1 ) cambios en la velocidad de sintesis enzimática, 2) modificación covaientc por fosforilación reversible y 3) efectos alost~ricos.

La inducción y represión de la síntesis de ensimas clave no son rápidas sino que utilizan varias horas
Algunos dc los cambios mejor estudiados de la actividad cnzimática que ociirre bajo diversas condiciones rnetaMlicas aparecen en el cuadro 2 1-1. La infmaci6n en este cuadro se aplica en gran parte a enzima? hepiiticas. Las enzimas catali7an reacciones de no equilibrio que fisiológicamente pueden considerarse como " una dirección'' más que ecuaciones balanceadas. h menudo 10s efectos se refuerzan dado que la actividad de las enzimas que catalizan los cambios en la dirección opuesta varían de manera recíproca (figura 2 1-1 1. Es importante observar que las enzimas clave que intervienen en una vía metabólica se activan o deprimen d e manera coordinada. El cuadro 2 1-1 muestra con claridad que éste es el caso. Todas las enzimas que a intervienen en S utilízacibn de la glucosa (es decir, Ias de glucólisis y lipogenesis) son más activas cuando hay un exceso de sustrato y bajo estas condiciones las enzirnas responsables de la pl-oduccibn de glucosa por la vía de gluconeogénesis muestran escasa actividad. La secreción de insulina. que es sensible a la conccntraci6n sanguínea de glucosa, aumenta la sintesis de las enzirnas responsables de la glucólisis. Del mismo modo, antagoniza el efecto de los glucocorticoides y del cAMF estimulado por glucagón el cual induce la síntesis de las enzimas clave responsables de la gluconeogknesis. Se ha demostrado- la regulación d e las especies mRNA de estas enzirnas y la modulacion de la expresión de sus genes. Las dos deshidrogenasas de la vía de la pentosa fosfato pueden clasificarse como enzimas adaptativas, dado que aumentan su actividad en ct animal bien alimentado y cuando la insulina se administra a un animal diabético. Su actividad es baja en diabetes o en ayuno. La "enzima malica" y la ATP-citrato liasa se comportan de igual moda, 10 cual indica que estas dos enzimas intervienen en las lipog6nesis mas que en la gluconeogCnesis (capitulo 23).

TODA VEZ QUE LA GLUCOLISIS Y GLUCONEOGENESIS COMPARTEN LA MISMA V ~ A PERO EN DIRECCIONES OPUESTAS, DEBEN REGULARSE DE MANERA REC~PROCA
Los cambios en la disponibilidad de sustratos son responsables de manera directa o indirecta de lamayor parte de los cambios en el metabolismo. Las tluctuaciones de su concentración sanguínea por cambios en la disponibilidad dietética pueden alterar el indice de secrecidn de hormonas, que a su vez, influye en el patrón del metabolismo en las diversas vias, a menudo modificando la actividad de enzimas clave que intentan compensar el cambio original en Ia disponibilidad del sustrato. Tres tipos de mecanismos pueden identi-

La modificación covalente por fosforilación reversible es rápida
El glucag6n y en menor grado la adrenalina, hormonas que disminuyen la glucosa en la sangre, inhiben la glucólisis y estimulan la gluconeogénesis en el hígado mediante el aumento d e la concentraci6n de

Gluconeo,~éncsis control de la nIucosa sanguínea 237 y

Cuadro 21-1. Enzimas reguladoras y adaptativas de la rata (hephticas en gran parte)
... .

;

Activid Dieta con

r-1

-- -

i

-

1-

-

carbohidratns
-"A"

,,,vi,

J

diabetes
-

Enzimas de gluco~eno; ~knesis, glu

S istema de glucógeno sini; asa

HLAVL~LLU~
C;
-

.". Fosfofructot

l
1
zenesrs
,

i

Insulin
fosfori geno

--

--

I
--.A A-

-" -

Insulina
1

Cilucagón I

I

-

-

Piriitfatocin asa
-

alanina
bn (cAMI' ndrcnal ina -

Piruvato dt:shidrog cnasa

1
4, T

!
1

NAD*, i rI- A c e t i l - C O A , ,ADP. pin1- NADH',ATP (ácidos grasos. cuerm n r o o t Xn;'.n"l

-

Enzimas ae

Piruvata c arboxi11 . ~

Glucor ticoides, glucagún, aatena-

-

F
carnox~c~
-

F

t i c o i d e s , tnsulina 1, glucagó~ adrcnalina (CAP dl=) ticoides, glucagh1, adrenaAl'l

gón?
--

Glucagbn (cAMP

1'6 ato, AMP
3SB
:n

7 h

Glucosa-h-t

r

"ticoides, ~nsul~na

-E C
dcshidrol h
L

giucagui1, adrenalina (cAb L . . c ras vias d8 fosfatos ii e pen tosa y de lipop

L

t
1

,fosfato

t

l L 1 lnsulina

Insulina

Enzima m i -P,1P-C itratc .. II.

,

A

-.
oA de ca-

A C C LP - ~ - L WU"L A CCL ~

xilasa
-"

dena la
T

h,cido grasn -

* AIOSIC~IC~

---

'En tejido adiposo pero nin en higado.

+

fructesa t5- Citrato (ácidos grasos, cuierpos cct& fosfato* n i c o s li * . A T P * ,

.Pi, fructo!;a

cAMP. Lo cual, a su vez, incrernenta la actividad de tina proteína cinasa dependiente de cAMP, conduciendo a fbsforilación e inactivacion de la piruvato cinasa. También afectan la concentracibn de fructosa 2.6-bisfosfato y por lanzo la glucólisis y la gluconeogenesis, como se expiica adelante.

La modificación alosterica tambien es rápida
Se dispone de varios qjernplos del metabolismo de carbohidratos para ilustrar el control alostérico de la actividad de una enzima. En la gluconeogknesis, la síntesis de oxalacerato a partir de bicarbonato y piruvato que se cataliza por E enzima piruvato carboxilasa, a requiere la presencia de acetil-COA como activador alostérico. La adición de acetil-COA conduce a un cambio en la estructura Terciaria de la proteína, que reduce el valor Km para el bicarbonato. Este efecto tiene implícaciones importantes en la autorregulación del metabolicrno intermedio, en donde, igual que acetil-COA se forma del pinivato, asegura de manera automática una produccién constante de oxalacetato y, por tanto, su oxidación ulterior en el ciclo del hcido cítrico por la pinivato carboxilasa. I,a activación de esta última enzima, y la inhibicibn recíproca de la piruvato deshidrogenasa por el acetil-COA formada de la oxidacilin de Bcidos grasos, ayuda a explicar la accibn "ahorradora" de esta oxidacibn de Bcidos grasos en el metabolismo del pinivato y en la estimulación de gtuconeog~nesishepatita. La relación recíproca entre la actividad de piruvato deshidrogenasa y pimvata carboxilasa en hígado y riiíón altera el destino metabólico del pinrvato cuando el tejido cambia de oxidación de carbohidratos por glucólisis a gtuconeogtnesis durante la transicihn de un estado de nutrición adecuada a inanicihn (figura 2 1-1). Una funcibn importante de la oxidacidn de Bcidos grasos en la promocibn de la gluconeogknesic es suministrar el ATP requerido en las reacciones de piruvato carboxilasa y fosfoenolpiruvato carboxicinasa, y también, invertir la reacción catalizada por fosfoglicerato cinasa en la gluc~lisis. Otra enzima que est6 sujeta a control por retroalimentación es Ia fosfoIructocinasa (fosfofructocinasa-1)Ocupa una posicion fündamental en la regulación de la gluc6lisis. La enzima fosfofnictocinasa-1 se inhibe por citrato y por ATP y se activa con AMP, El AMP actiia como un indicador del estado energktico de E a cklula. La presencia de adenilato cinasa en el higado y muchos otros tejidos permite el equilibrio rápido de

Asi, cuando el ATP se usa en procesos que requieren energia y deja como subproducto ADP, la concentracihn de AMP silbe.Como [ATP] puede ser 50 veces mLs elevada que [AMP] en el equilibrio, una disminuci6n fraccionaria pequeña en [ATP] causará una elevacion importante en [AMPJ. Por tanto, un cambio g r a n d e en [ A M P ] a c t ú a c o m o a m p l i f i c a d o r metabólico de un cambio pequefio en [ATP]. Este mecanismo permite que la actividad de fosfofi-uctocinasa- 1 sea muy sensible inclusive a cambios mínimos en el estado energetico de la celula y controle la cantidad de carbohidratos que experimentan glucólisis antes de entrar al ciclo del ácido cítrico. El aumento en [AMP] tambikn puede explicar por qué la glucólisis se acelera durante la hipoxia, cuando [ATF] disminuye. De manera simultánea, la A M P activa una fosforilasa que incrementa la glucogen6lisis. La inhibición de la fosfohctocinasa-1 por citrato y ATP podria ser otra explicación del efecto ahorrador de la oxidación de ácidos grasos en el consumo de glucosa y también del efecto Pasteur donde la oxidación aerobia (por el ciclo del ácido cltrico) inhibe la degradacirin anaerobia de la glucosa. Una consecuencia de la inhibición de fosfofructocinasa- 1 es la acumulaci6n de glucosa6-focfato que, a su vez, inhibe la captacibn adicional de glucosa en tejidos extrahepáticos por inhibicibn alostérica de la hexocinaca.

ha fructosa 2,6-bisfosfato tiene una función exclusiva en la regulación de la glucólisis y la gluconegoénesis en el hígado
El efector aloct6rico positivo más potente de la fosfohctocinasa-1 e inhibidor de la fnictosa-1 , 6-bifosfatasa en el hígado es la froctosa 2,6 bisfosfata. Alivia la inhibicibn de fosfofmct~inasa- por ATP e incrementa 1 su afinidad por fructosa 6-fosfato, Inhibe la fructosa1,ó-bisfosfatasa por incremento de Km para h c t o s a 1,6-bisfosfato. Su concentmcibn esta bajo control del sustrato (alost&rica) y hormonal (modificación coralente) (figura 2 1-3). La fnictosa 2,6-bisfosfato se forma por fosforilación de la fmctosa 6-fosfato por acción de fosfofructocfnasa-2. La misma enzima es también responsable de su degradacidn, ya que posee actividad de fructosa-2,6bisfosfatasa. Esta enzima bifuncional esta bajo el cona01 alostérico de fnictosa 6-fosfato, el cual cuando aumenta de concentracirin debido a una abundancia de elucosa. es decir. en un estado de suficiencia de nuiientes,'estimula á la cinasa e inhibe a la fosfatasa. Por otra parte, cuando la glucosa escasea, el glucagbn estimula la producción de cAMP, activando a la ~ r o t e i n a cinasa devendiente de cAMP la cual a su vezrinactiva a la fos'fofructocinasa-2 y activa a la fnictosa-2,6-bisfosfatasa fosforilación. por

la reacción:
ATP + AMP
H

2ADP

:luconeogkne.~i~s y cnnfi-ni de la glucosa sanguinea

-

239

Glucosa

-

y glucbgeno

. Fnictosa 6-fosfato

1

.

Los ciclos (vanos)de sustrato permiten un ajuste fino
en la gluctilisic

Puede apreciarse que muchos de los puntos de control y el metabolismo del gluciigeno comprenden un ciclo de fosforilación y desfosforilaci0n catalimdo por las enzimas siguientes: glucocinasa y glucosa-6-f'osfatasa; fosfofnictocinasa- l y h c t o s a I ,6-bisfosfataca; piruvato cina~a, pinivato carboxilasa y fosfoenolpiruvato carhoxicinasa; y glucógeno sintasa y fosforilasa, Si se permitiera a estos ciclos continuar sin freno, serian ciclos vanos (inutiles) cuyo resultado neto conduciría a la hidrólisis de ATP. Que esto no ocurra de manera extensa se debe a varios mecanismos de control que aseguran la inhibición de un extremo en tanto que el otro se estimula en cada ciclo, de acuerdo al requerimiento tisular y corporal. No obstante, es probable que haya alguna ventaja fisiológica en permitir cierta ciclizacibn. Por ejemplo, en el ciclo fosfofructocinasa~fructosa-l,6-bisfosfatasa, podria ocurrir una amplificación del efecto de un modificador alostérico. como fnictosa 2,6 bisfosfato, productor de un cambio algo mayor en el flujo total de mmbolitos en cualquier direccibn que el que ~ u r r i r i a en ausencia de la ciclizaci6n de sustrato. Este "ajuste fino" del control metabolico causa siempre cierta pérdida de ATP.

ADP

tA CONCENTRACION DE GLUCOSA
Fructosa 1,s-bisfosfato

Piruvato

t

SANGU~NEA REGULA SE DENTRO DE L~MITES MUY ESTRECHOS
Después de la absorción, la concentración dc glucosa sanguínea en el ser humano y muchos mamíferos se encuentra dentro de los límites de 4.5 a 5.5 mmollL. Cuando se ingiere una comida rica en carbohidratos, puede elevarse a 6.5 a 7.2. Durante el ayuno, los valores bajan entre 3.3 y 3.9. La glucosa sanguinea en ares es bastante mayor (14.0 rnrnollL) y en rumiantes considerablemente menor (alrededor de 2.2 mmollL en ovejas y 3.3 en el ganado vacuno). Al parecer estos valores bajos se relacionan con el hecho de que los rumiantes fermentan casi la totalidad del carbohidrato de los alimentos a hcidos grasos de cadena corta (volátiles) y estos reemplazan en gran parte a la glucosa como combuctible metabolico principal de los tejidos en estado de suficiencia de nutrientes. Una disminución repentina de glucosa sanguínea causa ~onvulsiones, como en una sobredosis de insulina, debido a la dependencia inmediata del cerebro de! suministro de glucosa. No obstante, si se permite una adaptación progresiva es posible tolerar concentraciones sanguínea mucho menores de glucosa; por ejemplo, r a t a adaptadas a dietas ricas en grasas parecen normales con una concentración sanguinea de glucosa tan baja como 1.1 mmol/L.

Figura 21-3. Control de gluo61isic y glucuneogénesis en el higada por fnrctoca 2,6-bisfosfato y la enzima bifuncional PKFIF-2,6-Paca (6-fosfofructo-2-cinasalfructoca-2,6-bisfosfataca). (PFK fosfofructocinasa 16-fosfofructo-9-cinasa]; F16-Pasa, fructosa-l,6-brsfocfatasa. Las flechas onduladas indican efectos alost~riws E

Por tanto, bajo abundancia de glucosa, la fnictosa2,6-bisfosfato aumenta su concentraci6n y estimula la gluc~lisis activación de fosfofructocinasa-1 e inpor hibicion de fnictosa- l,6-bisfosfatasa. Cuando la glucosa escasea, se estimula la gluconeogénesis por disminucion de la concentración de fnictosa 2,6-bisfosfato, que desactiva la fosfofructocinasa- 1 y ddesinhibe a la fnictosa-1,6-bisfosfatasa.Este mecanismo tambi&nasegura que la estimulación de la glucogen6lisis hephtica por el glucag6n conduzca a liberación de glucosa y no a gluc6lisic. lnvestigac iones recientes indican que el 1,6-bisfosfato de glucosa desempeila una funcibn semejante en algunos tejidos extraheplticos.

LA GLUCOSA SANGU~NEA DERIVA DE ALIMENTACI~N, GLUCONEOGENESIS
Y GLUCOGENOL~SIS
La mayor parte de los carbohidratos digeribles de la alimentación en última instancia forman glucosa. t o s carbohidmtos dietéticos que se digieren en forma activa contienen residuos de glucosa, galactosa y fnictosa que se liberan en el intestino. Éstas se transportan al higado por la vena portal. La galactosa y fnictosa se convierten con facilidad a glucosa en el higado (capitulo 22). La glucosa se forma a partir de compuestos glucogénicos su,jetos a gluconeogcnesis (figuras 1 8 4 y 21-1). Estos compuestos se agrupan en dos caxegorias: 1) los que tienen conversión neta directa a glucosa sin reciclamiento significativo, como algunos aminoácidos y propionato; y 2) aquellos que son productos del metabolismo parcial de lo glucosa en ciertos tejidos y se llevan a hígado y riflbn, donde se sintetizan de nuevo a glucosa. Asi, el lactato, formado por oxidacibn de glucosa en músculo esquelktico y eritrociios, se transporta al hígado y riflón para regenerar la glucosa, que está de nuevo disponible para oxidación en los tejidos. Este proceso se conoce como cicln de Cori o del heido Ihctico (figura 2 1 4 ) . El 3-fosfato de glicerol para la síntesis de triacilgliceroles en el tejido adiposo deriva de la glucosa sanguinea. Estos aciIgliceroles experimentan

hidrólisis en forma continua para formarglicerof libre. que no puede utilizarse por el tejido adiposo y por tanto, difunde a la sangre y sc convierte de nuevo a glucosa por mecanismos gluconeogenéticos en hígado y rifion (figura 71 -1 j. De los aminoácidos tmnsnortadosdesde el músculo al higado durante inanición, predomina la alanina. Esto tia conducido a la hipótesis de un ciclo glucosaalanina, como se muestra en la figura 2 1 4 , qiie tiene e1 efecto de un ciclado de glucosa desde hígado al musculo, con fonnaciiin de pinivato, seguida por transam inacihn a alan ina; luego, esta es llevada al h igado y sigue gluconeogénesfc de rcgreso a glucosa. Ocurre una transferencia neta de nitrógeno de amina del rnúsculo al higado y de energia libre del higado al músculo. La energia requerida para la síntesis hepática de glucosa a partir de piruvato deriva de la oxidacion de ácidos grasos. La glucosa tambien se genera a partir del gluchgeno hephtico por glucogenolisis (capitulo 20).

Mecanismos metabólicos y hormonales regulan la concentración sanguínea de glucosa
La conservación de valores estables de glucosa en la sangre es uno de los mecanismos homeostá~icos regulado con mayor precisibn y en el10 toman parte el hígado, tejidos extrahepáticos y varias hormonas. Al parecer, las celulas hepaticas son totalmente per-

Figura 2 1 4 . Ciclo del ácido lactico (Cori) y ciclo de la glucosa-alanina,

Gliaconeogéne~z.~ -v control de la ~Iucosu sanguíneu * 211

meables a glucosa (vía el transportador GLUT 2) en tanto las células de los tcjidos extrahepfiticos (excepto los islotes pancreiiticos) son relativamente impermeables. Debido a esto, el paso a traves de la membrana celular es la Iimitante de la veIocidad en la absorción de glucosa en tejidos cxtrahepáticos y la glucosa se fosfotila con rapidez por acción dc una hexocinaca al entrar a la célula. Por otro lado. es probable que la actividad de ciertas enzimas y la concentracibn de intermedios clave ejerzan un efecto mucho más direcm sobre la captación y salida de gliicosadel hígado. No obstante, la concentracidn de glucosa en sangre es un factor importante en el control del indice de absorcibn tanto en hígado como cn tejidos extrahepáticos. Ida funciiin de varias proteínas transporíadoras de glucosa que se encuentran en la membrana celular, cada 1 con 12 dominios transmembrana, se muestran en cl cuadro 2 1-2.

nes encontradas en la vena portal después de una comida rica en carbohidraios. Su ausencia en los rumiantes, en donde entra poca glucosa a la vena porta procedente del intestino, es compatible con esta función. En concentraciones sanguineas nonnales de glucosa (4.5 a 5.5 rnmol:L) el hígado se comporta como un productor neto de glucosa. Sin embargo, cuando la glucosa se eleva, la excreción hepatica de glucosa cesa, de modo que a valores altos hay una captación ncta de glucosa. Se calcula que en la rata. los índices de absorción y los de excrecihn son iguales a la concentracion de glucosa en E sangre de la vena porta a esto es, X.3 rnmol/L.

La insulina tiene una función central en E regulación de la glucosa sanguínea a
Adernis de los efectos directos de la hiperglucemia para amplificar la captación de glucosa en hígado y tejidos perifericos, la honiiona insulina interviene de manera critica en la regulacion de los valorcs sanguíneos de glucosa. Esta hormona se sintetiza en las ~Clulas de los islotes de Langerhansen el páncreas como 13 una respuesta directa a la hipergiucemia. ],a célula del islote es permeablc a la gliicosa por la via del transportador GLUT 2 y se fosforila por tina glucocinasa de una Kmalta. Asi la concentración dc glucosa sanguinea determina el flujo por medio de la gluc6lisis, el ciclo del ácido cítrico y la generación de A'I'P. El aumento en las concentraciones de IZTP inhibe los canales de K' sensibles al ATP lo que da lugar a despolarizacion de la membrana de la célula B; esto, a su vez, incrementa el influjo de Ca" por la vía de canales de Ca2' sensibles al voltaje y estimula la exocitosis de insulina. Es de remarcarse que los medicamentos de Ia sulfonilurea que se utilizan para estimular la secrecidn de insulina en la diabetes sacarina de tipo 11 (diabetes sacarina no

La glucocinasa es importante en la regulación de la glucosa sanguínea posprandial
Debe recordarse que la hexocinasa se inhibe por glucosa 6-fosfato, de modo que es posible ejercer cierto control por retroal imentaci6n en la absorción de glucosa por tqjidos extrahepáticos dependientes de hexocinasa mediante la fosforilacihn de glucosa. El higado no esta sujeto a esta restriccion debido a que la glucocinasa no se altera con el 6-fosfato de glucosa, La glucocinasa, que tiene una Km (menos afinidad) mas elevada para la glucosa que la hexocinasa. aumenta su actividad con concentraciones de glucosa por arriba de los límites fisiol6gicos (figura 2 1-5) y al parecer, se ocupa de manera específica de la captacion de glucosa en el hígado bajo las elevadas concentracio-

.

-

. . - .. . - ..--. -

Cuadro 21-2. Transportadores de ~lucosa
.

.

l l bitación tisula
-

--

Fu nciiincs
. -

--

'ransportadotes hidlreccionaleS facilitadi~ r e s

Cerebro. riilon, colon. placenta.- . eritrociin

t-ligado. céluln B pancrcitica, intestino del gatlo, cal rifiún Ccrcbro, I "
- . .

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itacibn de 1
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Miisculos- " -- esquelktico, tejido ad iposo Cal cardiaco y !

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-

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Transportadores unidireccionalesdepcnd

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1

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itacihn nctiiva de gluc la luz intc: l .. A - -*.. '.L..ltina1 . Icariwi A ut.~ I L I C ~ I ' CII CI IUUUIU p~11,\1y LICIII ~U nial renal contra el gradiente dc conccntraciún

. .. .,,,,,,.,..,,,,,,, , , , -

Vmai

100

Hexocinasa

endógeno (e insulina) se depura de la circulación por el hígado. Al c o n m i o de la adrenalina, el glucagón no tiene efecto sobre la fosforilasa muscular. También incrementa la glriconeogénesis a partir de aminolcidos y lactato. La glucogen0lisis y gluconeogénesis hepática contribuyen al tfccto hipergluccmiante del glucagón, cuyas acciones se oponen a las de la insulina.

Otras hormonas inftuencian la glucosa sanguínea

Glumsa sanguinea {mmolfL)

Figura 2 1 4 . Variacibn de la actividad fosforilantede glucosa de hexocinasa y glucocinasa con incremento de la concentración sanguinea de glucosa La K, para la glucosa de la hexounasa es de O 05 mmollL y de la glucocinasa es de 10 mrnollL.

insulinoclependiente; QSNID), actuan asi al inhibir los canales de K' sensibles al ATP. De esta manera la concentración de insulina en sangre va en paralelo con la glucosa sanguinea y sil administración conduce con rapidez a hipoglucemia. Otras susrancias que provocan la liberacibn d e insulina incluyen aminohcidos, ticidos d grasos libres, cuerpos cetlinicos, glucagbn, secretina y el fármacoto!butarnida. Laadrenalina y la noradrcnalina bloquean la secreci~n insulina. La insulina tiene un de efecto inmediato de incremento en la captación de glucosa en tejidos como el adiposo y el músculo. Esta accirin se debe a una aceleración en el transporte de glucosa através de la membranacelular por reclutamiento de transportadores de glucosa (GLUT4) desde el interior de la cdlula a la membrana plasrnática. Por el contrario, no hay efecto directo de la insulina sobre ta penetración de glucosa a células hephticas, estos hallazgos concuerdan con el hecho de que el metabolismo de glucosa en higado no es16 limitado en velocidad por su permeabilidad a la glucosa. No obstante, la insulina incrementa de manera indirecta la captacion hepática a largo plazo de glucosa como resultado de sus acciones sobre la sintesic de las enzirnas que controlan la glucólisis, la gtucogénesis y la gluconeog~nesis. inLa sulina tiene un efecto inmediato al activar la glucógeno sintasa (capítulo 20).

El glucagón se opone a las acciones de la insufina
El glucagón es la hormona producida por las células A de los islotes de Langerhans del pancreas. La hipoglucemia estimula su secrecion. Cuando alcanza al higado (por la vena porta), causa glucogenolisis por activacion de la fosforilasa. La mayor parte del g l u q ó n

La hip6fisis anterior secreta hormonas que tienden a elevar la glucosa san~uinea por tanto. antagonizan y, la acción de insulina. Estas son hormonadel crecimiento. ACTH (corticotropina) y qui& otros principios "diabetogenos". La hipoglucemia estimula la secrecidn de hormona del crecimiento. Esta hormona reduce la captacion de glucosa en ciertos tejidos, por ejemplo. muscular. Es probable que parte de este efecto no sea directo, ya que moviliza acidoc &rasos libres del tejido adiposo que por si mismos inhihen la uti li7ación de la glucosa. La administración crhnica de hormona del crecimiento conduce a diabetes. Al causar hiperglucemia estimula la secrecihn de insulina y origina, por ultimo, agotamiento de las células B. Los glucocorticoides (1 1-oxiestcroidcs) se secretan en la corteza suprarrenal y lienen importancia en el metabolismo de carbohidratos. La administración de estos esteroides Encrementa la gluconeogénesis. Esto es consecuencia del catabolismo proteínico tisular excesivo, del incremento en la absorcion hepática de arninoacidos y del aumento de la actividad de aminotransferasas y otras enzimas que inservienen en la gluconeogénesis hepática. Además, los glucocorticoides inhiben la utilizaci6n de glucoca en los tejidos extraheptiticos. En todas estas actividades, los glucocorticoides actúan como antagonistas de la insulina. Idaad rerralina, secretada por la mddula suprarrenal como~sultndo estímulos intensos (temor, excitaciún, de hemorragia, hipoxia, hipoglucemia, etcdtera), origina glucogenolisis hepática y muscular debido a activación de la fosforilasa. En el músculo, por ausencia de accihn de la glucosa-6-focfatasa, sobreviene glucogenolisis con formacibn de lactato, en tanto que en el hígado, la glucosa es el producto principal con elevacidn concomitante de la glucemia. La hormona tiroidea tambitn d c b r á considerase aquí por su efecto modificador de la glucosa sanguínea. Se tienen datos experimentales de que la tiroxina tiene accibn diabetógena y que la tiroidectomia inhibe el desarrollo de diabetes. También se observa que en animales tirotbxicos no existe glucbgeno hepático. En el ser humano, la glitcosa sanguinea en ayunas esth elevada en pacientes hipertiroideos y es baja en hipotiroideos. Sin embargo, al parecer las personas hipertiroideas utili7an la glucosa a una velocidad nomal o

;Iiiconeogkne.~isy control de la glucossa sanguinea 8 243

mayor, en tanto 10shipotiroideos muestran disminucidn en su capacidad para utilizar glucosa. Además. estos iiltfmos son mucho menos sensibles a la insulina que las personas normales o hipertiroideas.

La hipoglucemia se puede presentar durante el embarazo y en el neonate
Durante el embarazo aumenta el consumo de glucosa por el feto y existe riesgo de hipoglucemia materna y posiblemente fetal, en particular si hay un intervalo largo entre las comidas o durante 3 noche. Aderniis, a los niños prematuros o de bajo peso al nacer son mas susceptibles a la hipoglucemia toda vez que tienen escaso te-jidoadiposo para generar combustibles alternativos como son los ácidos gasos libres o los cuerpos cetónicos durante la tmnsicih del estado de dependencia fetal al de la vida independiente. Las enzimas dc la fungluconeogénesis pueden no estar compl~tamente cionales en tal momento y el proceso depende del suministro de Acidoc grasos libres para la energía. El glicerol, que podría liberarse a partir del tejido adiposo. se encuentra menos disponible para glucaneoginesis.

ASPECTOS CL~NICOS ADICIONALES Cuando el umbral renal para glucosa se excede se presenta glucosuria
Cuando la glucosa sanguínea se eleva a valores relativamente altos, e! riñon también ejerce un efecto regulador. La glucosa se filtra de manera continua en los glomemlos pero, de ordinario, retorna en su totalidad a la sangre por el sistema de resorción de los tubulos renales. La resorción de glucosa contra su gradiente de concentración se enlaza con el suministro de ATP en las celulas tubulares. La capacidad del sistema tubular para resorber glucosa se limita a una velocidad de alrededor de 350 mg/minuto. Cuando la concentracion sanguínea de glucosa aumenta, el filtrado glomerular puede contener mis glucosa de la que logra resorber; el exceso pasa a la orina para generar glucosuria. En personas nomales, se produce glucosuria cuando la concentración de glucosa en sangre venosa excede de 9.5 a 10.0 mmol/L. Esto se conoce como umbral renal para la glucosa. En anirnaIes de laboratorio puede producirse glucosuria con florhicina, que inhibe al sistema de resorci6n de la glucosa en el túbulo. Esto se conoce como glucosuria renal. La glucosuria de origen renal puede deberse a defeoos renales hereditarios o es posible adquirirla por procesos patolbgicos. Con frecuencia, la presencia de glucosuria es indicador de diabetes sacarina.

La capacidad del cuerpo para utilizar glucosa puede investigarse por medición de su tolerancia a la glucosa
La tolerancia a la glucosa se indica por la naturaleza de la curva de glucosa en sangre después dc la administraci6n de una dosis de prueba de este azúcar (figura 2 1 4 ) . La diabetes sacarina (tipo 1, o diabetes sa-

La deficiencia de fructcisa-1,6-bisfosfatasa causa lactacidosis e hipoglucemia
El bloqueo de la glucogenog&nesispor deficiencia de esta enzima impide que el lactato y otras sustancias glucogenicas se transformen a glucosa en el hígado. El trastorno puede controlarse con dietas ricas en carbohidratos que contengan cantidad escasa de fnictosa así como sacarosa y evitando el ayuno.

El deterioro de la oxidación de ácidos grasos produce hipoglucemia
Varios trastornos en los que la oxidacidn de los Bcidos grasos es deficiente se caracterizan por hipogliicemia. Esto se debe a la dependencia de la gluconeogénesis de una oxidacihn activa de estos ácidos (véase antes). Estos trastornos se describen en el capitulo 24.

Tiempo (hora)

Figura 2 1 4 . Prueba d e tolerancia a la glucosa. Curvas de la glucosa sanguínea de una persona nomal y de un dtabbtico después de administracibn oral de 50 g de glucosa Nbtece la elevacdn inicial de la concentracidn en el diabetico El criterio de normalidad es que la curva regrese a su valor inicial en dos horas.

carina insulinodependiente, DSID) se caracteriza por disminución de la tolerancia a la glucosa debida a secreción insuficiente de insulina en respuesta a una carga de glucosa, Esto se manifiesta por concentraciones altas de glucosa sanguínea (hiperglucemia) y glucosuria y puede acompañarse con cambios en el metabolisino de lipidos. La tolerancia a la glucosa declina no sólo cn diabetes tipo 1 sino tambien en estados donde el higado se Icsiona; en algunas infecciones; en diabetes sac'uina tipo 11 (diabetes sacarina no insulinodependiente, DSNID), que se acompaiia con obesidad y valores elevados de ácidos gasos plasmaticos; bajo la influencia de algunos fámacos y en ocasiones en aterosclerosis. TambiCn, cabe esperar que ocurra en preseiicia de hiperactividad de la hiphfisis o la corteza suprarrenal, debido al antagonismo de las hormonas de esta glándulas endocrinas a la acción de la insulina. La insulina incrementa la tolerancia a glucosa. La inyección de insulina reduce el contenido de glucosa en sangre e incrementa su utilización y su almacenaje en hígado y musci~locomo glucógeno. Un exceso de insulina puede causar hipoglucernia grave, quc prosigue a convulsiones e inclusive muertc a menos que se administre glucosa con prontitud. En insuficiencia hipofisaria o suprarrenal se observa un incremento de tolerancia a la glucoca, atribuible a una reduccidn en el antagonismo normal a insulinapor parte de 1% hormonas que estas glindulas sccretan de manera normal.

RESUMEN
1) [a gluconeogénesis es el mecanismo que convierte , compuestos no carbohidratos a glucosa o glucdgeno. Suministra glucosa al cuerpo cuando no dispone de carbohidratos dietéticos. Los sustratos importantes son aminohcidos glucogénicos, lactato, glicerol y propionato.

2) La vía de gluconeogenesis,que tiene lugar en el hígado y riñón, utiliza las reacciones de la glucólisis que son reversibles, mas cuatro reacciones adicionales que evitan las reacciones irreversibles de no equilibrio. Las enzimas que catalizan las reacciones adicionales son: piruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxicinasa, fructuosa- l,6-bisfosfatasa y glucosati-forfatasa. 3) El lactato forma piruvato, que entra a la mitocondria por carboxilación a oxalacctata, antes de su conversión a fosfoenolpiruvato seguida por biosíntesis de glucosa en el citosol. 4) Dado que gluc6lisis y gluconeogenesis comparten la misma vía pero operan en direcciones opuestas, sus actividades deben regiilme de rnariera recíproca, Esto sc logra por medio de tres mecanismos principales: 1 ) induccilin o represión de la síntesis enzimática. 2) modificaci6n mvalentc por rosforilacibn reversible y 3) efectos aloctéricor. 5) La cilula hcpatica, qiie es permeable a glucosa, constituye el medio principal de regulación de la concentración sanguínea de glucosa debido a que contiene la glucocinasa dc Km alta que se adapta especificarnente a la disposición dc la glucosa ingerida. La insulina, que se secreta en respuesta directa a hiperglucemia, colabora con el hígado para el almacenaje de glucosa corno glucógeno y facilita la captacihn de glucosa en tejidos extrahepáticos. Por el contrario, el glucagbn se secreta en respuesta a hipoglucemia y activa la fosforilasa en el hígado, que desencadena glucogenólisis y liberacibn dc glucosa a la sangre. 6) Las enzirnas defectuosas de la vía de gluconeoginesis conducen a hipoglucemia y lactacidosis. El bloqueo de la oxidación de ácidos grasos es causa adicional del deterioro de la gluconeogenesis y de hipoglucernia. 7 ) Una deficiencia en la secreción de insulina conduce a diabetes sacarina tipo 1..

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Vía de la pentosa fosfato y otras vías eel rnetaboAismo de hexosas
Pefer A. Mayes, PhD, DSc

El ciclo d t la pentosa fosfato no genera A V , pero tiene dos funciones importantes: 1) La generacibn de NADPFI para la síntesis reductivas como la biosintesis de ácidos grasos y esteroides y 2) la fortnaci6n (provisirin) de ribosa para la biosintesis de nucle6tidos y de acidos nucleicos. La glucosa. fnictosa y galactosa son por su cantidad las hexosas más importantes que se absorben por las vías gastrointestinales. Derivan respectivamente del n l m i d ~ n ,sacarosa y lactosa dieteticos. Se han desarrollado vías especializadas en el cuerpo, en especial el hígado, para convertir fmctosa y galactosa a glucosa.

deficiencia en esta vía conduce a un estado conocido como pentosuria esencia1. La ausencia total de iina enzima particular de la via en todos los primatec explica el hecho de que en la alimentaci~n humana se requiere hcido ascbrbica (vitamina C), no asi en la mayor parte de otros mamíferos. Deficiencias en enzimas del metabolismo de fructosa y galactosa causan enfermedades metabólicas como fructosuria esencial y gal~ctosemias. fnictosa se usa para alimentación La parenteral, pero en concentracibn elevada puede causar deplccibn de nucleótidos de adenina en el higado y necrosis hepática.

LA V ~ A LA PENTOSA FOSFATO DE GENERA NADPH Y RIBOSA FOSFATO (Figura 22-1)
La vía de la pentosa fosfato (derivado de la hexosa monofosfato) es un camino alterno para la oxidacibn de la glucosa. Es un proceso multiciclico en el ciial tres mo!éculas de glucosa-6-fosfato dan origen a tres moléculas de COzy a tres residuos de cinco carbonos. Estos últimos se ordenan para regenerar dos moléculas de glucosa-6-fosfato y una del intermedio glucolítico glicemldehido 3-focfato. Dado que dos moldculas del gliceraldehido 3-fosfato regeneran a la glucosa- 6-fosfato de la vía puede efectuar la oxidacion completa de la glucosa.

Las principales rutas metabblicac para la utilización de la glucosa son la glucólisis y la via de la pentosa fosfato. Las deficiencias de ciertas enzimas de la vía de pentosa fosfato son la causa principal de hemólisis, que conduce a un tipo de anemia hemolítica. La principal enzima afectada es la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Cerca de 100 millones de personas en el mundo pueden tener valores bajos de esta enzima, determinados gedticamente. Las principales vías metabhlicas para la utilización de glucosa son Ia gluc6lisis y el ciclo de la De pentosa fosfa~o. mayor significado, pero de importancia cuantitativa menor para la excreci6n de metabolitos y compuestos quim icos extraaos (xenobi 6ticos) como glucurbnidos, es la elaboracibn de acido glucurbnico por la vía del acido urtínico a partir de glucosa. Una

Gliceraldehido 3-fosfato + GNADPH + 6H'

246

Bioyuimicu dc Hurper

(Cupitulo 22)

6-Fosfato de glucosa

6-Fosfato de glucosa

6-Fosfato de glucosa

NADP*+ H20
DESHIDROGENASA
6-FOSf0-

NADP'+ HIO

NADP'+ H10

NADPH + gluconato

Ht
o-F0SfOgluconato

NADPH + Hf

Cb

P

6~

* ;_

NADPH t H'

NADPH + Hr

NADPH + H*

Ribulosa 5-fosfato

-

Ribulosa 5-fosfalo

- - Ribulosa 5-fosfato

caz

- --

Xilulosa 5-fosfato

Ribosa 5-fosfato

Xilulosa 5-fosfalo

Slniesls de
nuckalidos, ANA, DNA Gliceraldehido 3-fosfato Cedoheptulosa 7-Iosfato

TRANSACDOMSA

FructOSa 6-fosíato

1

Eritrosa 4-fosfato

C b '*,

6-Fosfato de glucosa

Gliceraldehído 3-fosfato

112 Fructosa 6-fosfato

4
112 Fructosa 6-fosfato

C6

'

Glucosa 6-losfato

~Glucosa-6-fosfato

'11 6-Fosfato de glucosa

C*

c ,

c,

Figura 22-7. Diagrama de flujo de la via de la pentosa fosfato y sus conexiones con la vía de la gluc6lisis. Como se indica, la via completa consiste en tras ciclos intermneciados donde la glucosa-6-fosfato es tanto sustrato como producto final Las reacciones arriba de la línea punteada son irreversibles, en tanta que las inferiores con reversibles.

LAS REACCIONES EN LA V ~ A PENTOSA FOSFATO SE DESARROLLA EN EL CITOSOL

Las enzirnas de la via de la pentosa fosfato como en la
gluciilisis se encuentran en el citosol. Como en ella, la oxidación se logra por deshidrogenacibn; pero en el caso de la vía pentosa fosfato. se usa NADP' y no NAD' como aceptor de hidrógeno. Ida secuencia de reacciones de la vía puede dividirse en dos fases: una fase irreversible oxidativa y una fase reversible no oxidativa. En la primera, la glucow6-fosfaío experimenta deshidrogenación y descarboxilación para dar una pentosa, rihulosa-S-fosfato. En la segunda fase, la ribulosa-5-fosfato se convierte nuevamente a glucosa-6-fosfato por una serie de reacciones en las que intervienen principalmente dos enzimas: la transcetolasa y la transaldolasa (figura 72-11.

La fase oxidativa genera UADPH (figuras 22-1 y 22-2)
La deshidrogenacibn de la glucosa-6-fosfato a ó-fosfogluconato se efectúa por la via de la formación de 6-fosfogluconolactona, reacción catalizada por la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, una enzima dependiente del NADP. La hidr~lisisde la 6-fosfogluconolactona se logra por la accibn de la enzima gluconolactona hidrolasa. Un segundo paso oxidativo es catalizado por la 6-fosfogluconato deshidrogenasa, la cual tambikn requiere NADP' como aceptor de hidrbgeno. Sigue la descarboxilación con la formación de la cetopentosa ribulosa-5-fosfato. La reacción probablemente se efectúa en dos pasos a través del intermedio 3-ceto-6-fosfogluconato.

tiarnina, es decir, el "glucolaldehido activo". La transcetolasa catali7a la transferencia de la unidad de dos carbonos de la xilulosa-5-fosfato a la ribosa-5-focfato, aroduciendo la cetosa de siete carbonos sedoheatulosa5-fosfato y la aldoca gliceraldehído 3-fosfatg. Estos dos productos entran luego en otra reacción conocida como transaldolación. La transaldnlasa permite la transferencia de un grupo de tres carbonos, "la dihidroxiacetona activa" (carbonos I al 3) de la cetosa sedoheptulosa-7-fosfato a la aldosa gliceraldehldo 3fosfato para formar la cetosa fnictosa-6-fosfato y la aldosa de ciiatrci carbonos eritrosa-4-tbsfato. Una reacción posterior se efecíwa implicando otra vez a la transcetolasa, en la cual la xilulosa-5-fosfato sirve como donador del "glucolaldehido activo". En este caso, la eritrosa-4-fosfato, formada antes, actua coino aceptor y los productos de Ia reacción son fruct~sa-6-&fato y gliceraldehído-3-fosfato. Con el fin de oxidar a la glucosa completamente hasta CO? por la via de la p.entosa fosfato, es necesario que las enzimas esten presentes en el tejido para convertir el glicemldehido-3-fosfato en glucosa-6-fosfato. Esto implica que trabajan en sentido inverso las entimas de la vía d e glucólisis, ademas de la enzima gluconeogenicq fructosa-1 ,&bisfosfatasa. En ausencia de esta enzima, el 3-fosfato de gliceraldehido sigue la vía normal de la glucólisis a pimvata.

Las dos vías principales para el catabolisrno de glucosa tienen poco en común
Aunque algunos metabolitosson comunes, por ejemplo, glucosa 6-fosfato, la ria de pentosa fosfatos es notablemente diferente de la glucolisis. En las primeras reacciones, que utilizan NADP en lugar de NAD, hay oxidacibn y COZes un producto caracterlstico, lo que no ocurre en toda la glucblisis. En la vía de pentosa fosfato no se genera ATP, en cambio esa es una funcibn principal de glucólisis. Los fosfatos de ribosa son el principal producto de la vía de la pentosa fosfato, pero no de la glucólisis.

La fase no oxidativa genera precursores de riboca
La ribulosa 5-fasfato sirve ahora como sustrato para dos enzimas diferentes. La ribiilosa-Sfosfato 3-epimerasa altera la configuraci6n alrededor del carbono 3 , formando el epimero xilulosa-5-fosfato. que es otra cetopentosa. La ribosa 5-iosfato cetoisomerasa convierte el 5-fosfato de ribulosa a la aldopentoca correspondiente, esto es, el 5-fosfato de ribosa. mismo que es el precursor de los residuos d e ribosa que se requieren en la sintesis de nucleótido y ácido nucleico. La transcetotasa transfiere la unidad de dos carbonos, que contiene los carbonos 1 y 2 de una cetosa, al carbono aldehidico de una aldosa. Por tanto, efecnía la conversidn de una cetosa en una aldosa con dos carbonos menos y simultáneamente convierte una aldosa en una cetoca con dos carbonos más. La reacción requiere una vitamina B. tiamina, como la coenzima difosfato de tiarnina, además de iones Mf. El fragmento de dos carbonos transferido es probablemente el glucolaldehido enlazado al difosfato de

En los tejidos especializados para síntesis reductivas se generan equivalentes reductores
La valoracibn de la actividad de la vía de la pentosa
fosfato en varios tejidos indica su importancia metab6lica. Es activa en hígado, tejido adiposo, corteza suprarrenal, tiroides, eritrocitos, testículos y glandulas mamarias en lactancia. No lo es en las glhndulas mamariaq si no hay lactancia y su actividad es baja en el m ~ s c u l o esquelktico. Todos los tejidos que tienen actividad de la vía utilizan NADPH en síntesis reductoras, por ejemplo, la síntesis de hcidos grasos, esteroides, aminohcidos por la ruta de la glutamato deshidrogenasa o glutatión reducido en los eritrocitos.

248

Bioauimica de Harner
HO

(Canírulo 221
NADPH + H '

- C.-

H

NADPt

rdg2+ or cap' HO-C-H . ~ - i - o H H- C

i)

p

I HO-C-H
H- H IO t

I H-C

c l H9 0

- OH

DESHIDROGENASA

79 -

1

~ g ? :n2: or

'\

-

100H-C-OH HO-C-H I H-C-oH
I

I

HIDROLASA

I

H-C-OH

~H?-O-@
6-Fosfogluconato

1

NADP'

[ !r:H ]m H-C-OH
H-C-OH

NADPt+ H'

CH,OH l C=O I

'd-C-OH

CH,-O-@
Forma enediol

I H-6-OH I CH,-O-@
3-Ceto-6-fost~luwnato

Ribulosa 5-fosfato

3-EPIMERASA

......... ........

'GH,DH
1 'G

'fH20H
j

i

=O

*C=O
H-C-OH E H-C-OH
1

I H03C-H I

I t I H...- C -. . . . I' O H ... 8 + . .

;

H3C-OH

*cH,-O-@
Xriuiosa 5-tosfato

I

H-C-OH I CH,-O-@ Seudoheptulasa 7-fosfato

Rtbosa 5-fosfato

I H-C-OH

O
I

H - GI I

FH,

-O

-@

PRPP

*c=o
HO

'CH,OH l
1 1

~iamrna- , @ ~ g ~

-G -H

H-G-OH

Xilulosa 5-fusfato

Figura 22-2. Via de la pentosa fesfato. (@,

+

~

~

M

AMP

ATL4

Tiamina-

@ ,

H"C=O l H'G-OH 1 *m,-O-B Gliceraldehido 3-fosfato

...............
m

TH,M ,
I

I

H-C=O

I I

H-C-OH H-C-OH I CH,-O-@

ZS
TRANSALDOMSA

; *c=o I t I H O -. - H C L.... ..

H -"

1 -

/

H -*c - OH

I

- OH

*GH2 - 0 -@

!

Fructosa 6-fosfato

HO-c-H
'
H-C=O I H-C-OH
I H-C-OH

H-C-OH

I

I CH,-O-@

Gliceraldehido 3-fosfato

Fructosa 6-fosfatu

PO^^-; PRPP, 5-focforribosi~-l-~irofocfato.)

Via de /u uentosu fosfato

y orrus vías dcl

mefaboltsmo de hexosns 218

Es probable que la presencia de lipogénesis activa o de un sistema que utiliza NADPH estimule una degradación activa de la glucosa por la vía de la pentosa rosfato. De este modo, se obtiene NADP' que normalmente es escaso debido a la naturaleza irreversible de las primeras reacciones en la vía. Tantbién puede inducirse la síntesis dc enzimas glucoca-6-fosfato deshidrogenasa y 6-fosfogluconato deshidrogenasa por la insulina durante circunstancias relacionadas con el "estado nutricional" (cuadro 2 1-1).

una enzima flavoproteinica que contiene FAD. A su vez el glutariiin reducido remueve M O del eritrocito en :2 una reacción catalizadapor laglutation peroxidasa, una enzima que contiene el oligoelemento, seleniri (figura 22-3 j. Esta reaccihn es importante, ya quc la aciimulación de HzOz puede reducir la duración de la vida del eritrocito al incrementar la velocidad de oxidación de la hemoglobina a metahernoglobina.

En casi todos los tejidos es posible la síntesis de ribosa
La vía de la pentosa fosfato proporciona ribosa para la sintesis de nucleótidos y ácidos niicleicos (figura 22-2). La fuente es el intermedio ribosa-5-fosfato que reacciona para formar PRPP, utilizado en la biosintesis de nucleótidos (capitulo 36). El te-jidomuscular contiene cantidades muy pequeiías de glucosa-6-fosfato deshidrogenaa y 6-fosfogluconaro deshidrogenasa. No o'bstante,el musculo esquelético como miichos otros tejidos, es capaz de sintetizar ribosa 5-fosfato para la síntesis de nucleótidos. Es probable que esto se lleve a cabo por inversibn de la fase no oxidatíva de la vía pcntosa fosfato utilizando la fructosa-6-fosfato. Por tanto. no es necesario tener una via de pcntosa fosfato funcionando completamente para que un tejido cintetice ribosa fosfatos. La ribosa no ES un constituyente sanguíneo significativo de la circulacihn general. Por tanto, los tejidos deben satisfacer su propio requerimiento de este precursor importante de nucleótidos.

EL GLUCURONATO, UN PRECURSOR DE PROTEOGLUCANOS Y DE GLUCURONIDOS CONJUGADOS, ES UN PRODUCTO DE LA VIA DEL ÁCIDO URONICO
Aparte de las vias principales del metabolismo de la gliicosa-6-fosfato que se han descrito, existe una vía para la conversicin de glucosa en ácido glucurónico,acido ascórhico y pentosas, conocida come la vía del ácido uránico. Es tambibn una ruta oxidativa alterna para la glucosa, pero al igual que la via pentosa fosfato, no conduce a la generacibn de ATP. En la vía del acido uronico, el acido glucuronico se forma ñ partir de la glucosa por las reacciones que se muestran en la figura 2 2 4 . La glucosa-6-fosfato se convierte en glucosa-lfosfato, la cual reacciona entonces con el hifosfato de uridina ( U n ) formando el nuclebtido activo, difosfato de uridina y glucosa (UDPGlc}. Esta ultima reacción se cataliza por la enzima UDPGlc pirnfosforilasa. Todos estos pasos hasta aqui son los mismos señalados anteriormente en la vía de Ia glucogénesis hepática (capitulo 20). El UDPGlc se oxida en el carbono 6 por una operaci~n dos pasos para convertirlo en acido en glucurbnico. El producto de la oxidacihn, catatizada por una enzima dependiente del NAD, la UDPGlc deshidmgenasa, es por tanto UDP-glucuronato. El UDP-glucuronato es la forma "activa" del glucuronato para las reacciones que implican la incorporacibn de Bcido glucurónico a los proteoglucanor o para las reacciones en las cuales el glucumnato se conjuga con siistratos como las hormonas esteroides, ciertos medicamentos o la bilirrubina (figura 34-1 3).

LA VIADE PENTOSA FOSFATO COLABORA CON G L U T A T I ~ N PEROXIDASA EN LA PROTECCIÓN DE LOS ERITROCITOS CONTRA HEM~LISIS
La via de la pentosa fosfato en el eritrocito proporciona NADPH para la reducci6n del glutatitin oxidado a glutatión reducido catarizada por la glutation rcductasa,

FOSFATO DE -PENTOSA

PEROXIDASA

NADP*

2G-SH

Figura 22-3. Funcrbn de la via de la pentosa fosfato en la reaccibn catalizada por glutatibn peroxidasa de los eritrocitos. (G-S-S-G, glutatión oxidado; G-SH, glutatibn, Se, cofactor de celenro )

250

Bioquirnica de Harper

{Capitrrln 2 ) 2

H:c-o-QMUTPGA

H-C-OH

1

-

H-C-OH

1
UTP
PP,

o- - H-C-OW

u
CH.OH

-

1

1
2NADf 2NADH
+

CH,OH
Gluwsa 1 -fosfato

2H*

Undindifosfatoglucosa (UDPGlc)

/

/
UDP

{-O
O

Uridindfosfato glucuronato

GLUCUR~NIDOS H,O Pfokoglucanas

n
7-0

~
NADP' NAQPH + He

~

q

-

0

~

NADH + H' NAO+

$ - O

~ - 5 7 HO-5 - W O
C-O
II

c=o
H - 5 -0H HO-$ -H
m

H-7-OH

H-C-OH HO-{ - H

'CH20H L-Xilosa

3-Ceto-~~gulonatn Oxalato

'CH,OH L-Gulonato

O

~Glucuronato

NADPH + Ht NAOP' BLOQUEO EN LA
PENTOSURIA

4
Glucolato Glucolaldehido Gulonolactona BLOQUEO EN PRMATES Y COBAYOS O '

f

Y

BLOQUEO EN EL SER HUMANO

2-C~~PL-gulonolactona

wxiiosa 1-fosiato

-

?H,OH

t 'FHzDH
12Hl

i

O

HO-C-H

Xrlitol aXiioca 5-fosfato

HO-C-H

&CH,OH L-Aswrbato

" CH,OH L-Deshtdroascorbato:

Via pentosa fosfato

Figum 22-4. Via del Bcido urbnico. (Indica el destino del carbono 1 de la glucosa, @

PO^^-.)

En una reacción dependiente del NADPH, el glucuronato se reduce a L-gulonato. Este último compuesto es el precursor directo del ascorbato en aquellos animales que son capaces de sintetizar esta vitamina. En el ser humano y otros primates, así come en los cobayoc, el hcido ascórbico no puede sintetizarse debido a la ausencia de la enzima ~gulonolactona oxidasa. El gulonato se oxida a 3-ceto-L-gulonato que es entonces descarboxilado para formar la pentosa t-xilulosa. La L-xilulosa se convierte en el D-isomero mediante una reduccidn dependiente del NADPH que la convierte en xilitol, el cual entonces se oxida en una reaccion dependiente del NAD pasando a D-xilulosa; este último compuesto, después de convertirse en ~xilulosa-5-fosfato metaboliza posteriormente en la se vía pentosa fosfato.

LA INGESTIÓN DE CANTIDADES MASIVAS DE FRUCTOSA TIENE CONSECUENC~AS METABOLICAS
PROFUNDAS
Las dietas abundantes en sacarosa o en jarabes de fnictosa alta (HFS), que se utilizan en la elaboración de alimentos y bebidas, conducen al ingreso en la vena porta de grandes cantidades de fructosa (y glucosa). La fmctosa se glucoliza por el hígado con mayor rapidez que la glucosa. Esto se debe al hecho de que no requiere el paso en e1 metabolismo de glucosa catalizado por fosfofnictocinasa, que es donde se ejerce el control sobre la velocidad del catabolismo de glucosa (figura 22-5). Esto ocasiona que la fmctosa

Vio de la pen~osu fo.rfato y

orrm vías de¡ metabolismo

de hexo.sas

25 J

Dieta

[FRUGTUOCIMASA\ BLOQUEO EN LA FRUCTOSURlA ESENCIAL

Fructosa 1.6 bisfosfato

FRUCTUOSA 1-P
BLOQUEO EN INTOLERANCIA HEREDITARIA A LA FRUCTOSA

t

AFP

OIH1DROXIACETONA FOSFATO

TRIQSA 1SOMEWSA

GLICERALDEH~DO 3-FOSFATO 4

ATP

DGLICERALDEH~DO

t

pEEiÑzq

Figura 22-5, Metabolismo de la fructoca La aldolasa A se encuentra en todos los tejidos a excepción del higado, donde sblo existe aldolasa B. (No se encuentra en el higado )

inunde Ias vías en el hígado causando incremento de la síntesis de hcidos grasos, de Ia esterificacih de &os y de la secreci6n de VLDL, que pueden elevar lo5 triacilgliceroles siricos y al fina! eleva las concentraciones de colesterol de LDL (figura 27-7). La cantidad adicional de glucosa captada por el torrente sanguíneo estimula Ia secrecibn de mhs insulina, que potencia todos estos efectos. Una cinasa especifica, la fructocinasa, se encuentra en el higado y efectúa la transferencia del fosfato desde el ATP a la hctosa, formando h c t o s a 1-fosfato. Tarnbidn se ha demostrado en el riilon e intestino. Esta enzima no fosforila a la glucosa y, a

diferencia de la glucocinasa, su actividad no se afecta por el ayuw o por la insulina, lo que puede explicar por qué la fructosa desaparece a una velocidad normal de la sangre de los pacienres diabdticoc. La Km de la enzima para la h c t o s a en el higado es muy baja, lo cual indica una gran afinidad de la enzima por su sustrato. Es probable que ésta sea la ruta principal para la fosforilacion de la fi-uctosa. La h c t o s a - 1 -fosfato se desdobla en D-glicesaldehida y fosfato de dihidroxiacetona por la aldolasa B, enzima que se encuentra en el higado. La enzima tambikn ataca a la fnictosa 1,6 bisfosfato. El D-gliceraldehido puede entrar en la serie de reacciones de la

252

Bioauim ica de H a r ~ e r

gluclilisis por medio de otra enzima presente en el hígado, la triocinasa, la cual cataliza su fosforilación a gliceraldehido 3-fosfato. Los dos triosafosfatos, el fosfato de dihidroxiacetona y el gliceraldehido 3-fosfato, pueden degradar por la vía de la glucólisis o comhinarsc por la influencia de la aldosa y convertirse en glucosa. Lo último es el destino de mucha de In fructosa metabolizada en el hígado. La hexocinasa cataliza la fosforilacion de la mayon'a de los anícares hexosas, inclusive la fnictosa. Sin embargo, en presencia de glucosa se inhibe en gran medida la fosforilación de la fnictosrt. Mhs aún, es probable que por esta vía parte de la fnictosa se pueda metabolizar en tejido adiposo y rnusculo. La fnictosa libre se encuentra en el plasma s ~ m i n ay una cantidad l significativa se secreta hacia la circulación fetal en los ungulados y ballenas donde se acumula en los líquidos amniótico y alantoideo. En todas estas situaciones representa una fuente potencial de energía.

LA GALACTOSA ES NECESARIA PARA LA S~NTESIS LACTOSA, DE GLUCOL¡PIDOS, PROTEOGLUCANOS
Y GCUCOPROTE~NAS
La galactosa proviene de la hidrblisis en el intestino del disacarido lactosa, el anicar de la leche. En el hígado se convierte facilmente en glucosa. La facultad del hígado para llevar a cabo esta conversibn puede usarse como un examen del funcionamiento hepático en la prueba de tolerancia a la galactosa. La vía mediante la cual la galactosa se convierte en glucosa se muestm en la figura 2 2 4 . La galactosa se fosfwila mediante la galactocinasa usando ATP como donador de fosfato. El producto galactosa- 1 -fosfato, reacciona con el difosfato de uridina y glucosa (UDPGlc), para formar cl difosfato de uridina y galactosa (UDPGal) y glucosa- l -fosfato. En este paso, catalizado por una enzima llamada galactosa-1-fosfato uridiltrans-

Galactosa

t
GalaCtOSa-l
-1osfato

BLOQUEO EN GAIACTOSEML':

7I UDPGlc?
FOSFOGLUCOMCITASA 6-FOSFATASA
Glucosa-6-fosfato Glucosa

-

B
Glucosa

UDPGlc

NAD'

-

UDPGal

Lactosa

6-Fosfato de giuwsa

-

c 1-Fosfato de glucosa

Glucosa

Figura 22-6. Via de convercibn de A:

Galactosa a glucosa en el hígado. B: Glucosa a galaciosa en la glandula mamaria

Yía de d pentosa fusfafo y otras vim del rnerubo/ismo de hexo.rus a

233

ferasa, la galactosa se transporta a una posición en la

ASPECTOS CL~NICOS
El deterioro de la vía de la pentosa fosfato conduce a hemolisis
Una mutación presente en algunas poblaciones cauQ una deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidro,-enasa. con la consecuente perturbación en la formación de NADPH. Esta anormalidad se manifiesta como hemolisis cuando el individuo susceptible se sujeta a oxidantes, como el antipalhdico primacrina, aspirina o sulfonamidas o cuando ingiere habas (Y~ciafuvu -favismo), La glutatión peroxidasa es un antioxidante natural que se encuentm en numerosos tejidos y depende del suministro de NADPW. Ataca a perhxídos organices ademis del MzO?.Junto con la vitamina E, achía como parte de la defensa corporal contra la peroxidaciún lipidica (figura 16-27). Se tienen informes de cierta relación entre la frecuencia de algunos canceres y la presencia de concentraciones sanguineas bajas de selenio y de la actividad de la glutation peroxidasa. La medicí6n sanguínea de la actividad de la transcetolasa refleja el grado de deficiencia de tiamina. El unico trastorno donde su actividad se eleva es en la anemia perniciosa.

UDPGlc, reemplazando a la glucosa. La conversibn de galactosa en glucosa tiene lugar en una reacción del nucleótido que contiene galactosa catalizada por una epimerasa. El producto es UDPGlc. La epimerización probablemente implica una oxidacibn y reducción en el carbono 4, con N AD como coenzima. Finalmente, la glucosa se libera de la UDPGlc bajo la fonria de glude cosa- 1-fosfato, probablemente desp~its !a incosporación al glucógeno seguida por fosforólisis. Debido a que la reaccihn con epimema es reversible, la glucosa pucde convertirse en galactosa, de modo que la gaiactosa preformada no es esencial en la dieta. La galactosa se necesita en el organismo no sólo para la formacidn de laciosa, sino también como un constituyente de los glucolipidos (cerebrosidos), proteoglucanos y glucoprotcinas. En la sintesis de lactosa en la glándula rnamaria, la glucosa se convierte en UDPGal por las enzima descritas anteriormente. La UDPGal se condensa con la glucosa para dar lactosa catalizada por la factosa sintasa (figura 2 2 4 ) .

La glucosa es precursor de todos los aminoazúcares (hexosaminas)
Los aminoazúcares son componentes importantes de las glucoproteinas (capítulo 56), de ciertos glucoesfingolipidos (por ejemplo, gangliósidos) (capítulo 16), y de glucosaminoglucanos (capihllo 57). Los aminoazúcares principales son glucosamina, galactosamina y manosamina (todas éstas son hexosarninas) y el compuesto de nueve carbonos hcido siilico. El acido sihlico más importante que se encuentra en los tejidos humanos es el ácido IV-acetilneurarnínico (NeuAc). En la figura 22-7 se muestra un resumen de las interrelaciones entre los aminoazúcares; las siguientes son sus caracteristicas sobresalientes: 1) la glucosamina es el aminoanicar principal. Se forma como glucosamina 6-fosfato a partir de la fnictosa-6fosfato, utilizando a la glutamina como donador del grupo amino; 2) los aminoazúcares aparecen principalmente en la forma N-acetilada. El donador del radical acetilo es la acetil-COA; 3) la N-acetil manosarnina 6-fosfato se forma por epimerización de la glucosamina 6-fosfato; 4) NeuAc se forma por la condensación de rnanosamina 6-fosfato con fosfoenolpiruvato; 5) la galactosamina se sintetin por epimerización de UD?-A'-acetilglucosamina (WDPClcNAc) a UDPN-acetilgalactosamina (UDPGlcNAc); 6) los azúcares de nucleótidos son las formas en que Tos aminoazúcare5 se utilizan para la biosintesís de las glucoproteinas y de otros compuestos complejos; los anícares de nucl&tidos importantes, que contienen aminoazúcares con UDPGlcNAc, UDPGalNAc y CMP-NeuAc.

La interrupción de la vía del ácido urónico se produce por defectos enximáticos y por algunos fármacos
En la pentosuria esencial, enfermedad hereditaria poco común, aparecen en la orina cantidades considerables de L-xilulosa. Este hallazgo puede explicarse por la ausencia cn pacientes pentosíiricos de la enzima necesaria para catalizar la reducción de L-xilulasa a xilitol. La administración parentera! de xilitol puede conducir a oxalosis que consiste en deposito de oxalato de calcio en encéfalo y rifiones. Esto se debe a la conversibn de n-xilulosa a oxalato a travCs de la formación de xilulosa l -fosfato. glucoaldehído y glucolato (figura 2 2 4 ) . Varios medicamentos incrementan de manera importante la velocidad de entrada de glucosa a la vía del ácido urónico. Por qjcrnplo, la administracibn de barbital o de clorobutanol a ratas causa un aumento significativo en la conversión de glucosa a glucuronato, 1.-giiIonato y accorbato. Se sabe que la arninopirina y antipirina aumentan la excreción de 1.-xilulosa en sujetos pentoslirícos.

La carga hepática con fructosa puede potenciar hipertriacilgliceralemia, hipercolesterolemia e hiperuricemla
Ya se hizo referencia a los efectos de la fructosa sobre el metabolismo hepático en la promocion de la síntesis de triacilglicerol y secreción de VLDL e hipemiaciIglicerolemia, que puede 1levar a incremen-

254

Bioqtrimicu de Hurper

(Capitulo 22)

ATP
GLUCOSA

GLUCOSA 1-FOSFATD ADP
GLUCOSA 6-FOSFATC

t

Glucdl~sis
FRUGTOSA 6-FOSFATO

-

Ciclo del
Bcido

citnco CO1+H,O

PIRWVATO

GLUTAMATO Glucosamina Acetil-COA

UTP

GLCICOSAMINA*

N-ACETICGLUCOSAM INA

N-ACETIL-

FLUCOSAMINA 6-FOSFATO

P>

p,

N-ACEflLGLUCOSAMINA
1 -FOSFATO

1

b

GLUCOSAMINOGLUCANOS (COMO HEPARINA)

N-ACETILMANOSAMINA

UDP-

6-FOSFATO FOSFOENOLPIRUVATO

N-AC ETILGLUCOSAIAINA

-

GLUCOSAMINOGLUCANOS (AC100 HIALURGNICO) GLUCOPROTEINAS

NAO+

t
Aciua N-ACETILNEURAM~NICO
9-FOSFATO

UDP N-AC ETILGALACTOSAMINA

1

-1

inhibitorio

ÁCIDO s r A ~ l c o GANGL16SlDOS GFUCOPROTEINAS

GLUCOSAMINOGLUCANOS (CONDROITINAS)
GLUCOPROTE~NAS

Figura 22-7. Resumen de las interrelaciones en el metabolismo de los aminoazúcares ('Análogo al UDPGlc.) Es posible que otros nucleotidos d e purina o pirimidtna estén enlazados de manera similar a azúcares o aminoazúcares. Ejemplos son timidina de difosfalo (TDP)-glucosamina y TDP-N-acetitglucosamina

tos en las concentraciones de colesterol LDL, todo lo cual puede considerarse como potencialmente aterogénico (capitulo 28). Además, la sobrecarga aguda del higado con fructosa, como puede suceder con la infusión intravenosa o ingesta muy grande de ella, da lugar a secuestro de fosfato inorganico en el 1-fosfato de f r u c t o s a y disminuci6n de la síntesis de ATP. En consecuencia, se suprime la inhibicibn por el ATP de la enzima de la degradacibn del nuclebtido de adenina y se promueve la formacibn de hcido urico, produciéndose hipeniricemia, la cual es causa de gota

(capinilo 36). Estos efectos son de particular importancia en personas que tienen predisposici6n a la hipertriacilglicerolemia o hipemricernia.

Los defectos en el metabalismo de fructosa causan patología (figura 2 2 6 )
La carencia de fnictocinasa hepatica causa fructosuria esencial y la ausencia de aldolasa hepitica E, que

:a Vía de la pcnro~ fos fato y otras vIas del rnetaholi.vmo de hexosas * 2.55

degrada a la fmctosa 1-fosfato, conduce a intolerancia hereditaria a la fructosa. Las dietas deficientes en fructosa y sacarosa son benéficas en los dos trastornos. El defecto en la aldolasa €3 no afecta de manera tan nociva la actividad hacia el 1,ó-bisfccfato d e fructosa, así sólo hay ligero deterioro de la gluconeogenesis. Una consecuencia de la intolerancia hereditaria a fructosa y otro padecimiento causado por deficiencia de fructosa-l,dbisfosfatasa es una hipoglucemia inducida por fmctosa a pesar de la presencia de abundante resetva de glucógeno. Al parecer, la acumulaci6n de fructosa l-fosfato y fructosa 1,6-hisfosfato inhibe la actividad de la fosfori lasa hephtica por mecanismos alostéricos.

Las deficiencias enzimáticas en la vía de la galactosa causan galactosemia
En las galactosemias existe incapacidad para metabolizar esta hexosa y pueden deberse a deficiencia hereditaria de galactocinasa, uridilo transferasa o 4epimerasa (figura 22-6A), aunque la me-jor conocida es la deficiencia de uridilo transferasa. La galactosa, cuya concentracion sanguinea aumenta, se reduce por la aldosa reductasa en el ojo al polio1 con-espondiente (galactitol), que se acumula generando cataratas. El estado general es m& grave si la galactosemia se debe a deficiencia de uridilo transferasa, dado que hay acumulación de galactosa 1-fosfato y perdida de fosfato inorgánico hepatico. Por ultimo, ocurre insuficiencia hepática y deterioro mental. En la deficiencia de uridiE transferasa, la epimerasa eszá presente en cantidades adecuadas, por lo que la persona galactosémica aun puede formar UDPGal a partir de glucosa. Esto explica por qué es posible que los niiios afectados muestren crecimiento y desarrollo normales a pesar de la dieta exenta de galactosa para controlar los sintomas de la enfermedad. Se han descrito varios defectos gentiticos que causan deficiencia parcial m& que tofal, de la transferasa. Como normalmente la enzima esta presente en exceso, una reduccirin de su actividad de 50% o menos no causa síntomas o signos de enfermedad, por tanto, el defecto se identifica 5610 en homocigotos. Se han encontrado deficiencias eritrocitarias de epimerasa, pero en estos individuos aun existe en hfgado y otros drganos y aI parecer este tercer trastorno es asintomático.

La catarata diabética se relaciona con la presencia de fructosa y sorbitol en el cristalino
Normalmente, el cristalino humano contiene fructosa y sorhitol; la patogenia de la catarata diabética puede incluir un aumento en B concentracibn de éstas. a La via del sorbitol (poIiol) (no localirada en el higaiio) es responsable de Ia fomacibn de fiuctosa a partir de glucosa (figura 22-5) y su actividad, aumenta confonne la concentración de glucosa aumenta en la diabetes, en aquellos tejidos que no son sensibles a la insulina; es decir, cristalinos, nervios periféricos y glomérulos renales. La aldosa reductasa cataliza la reducción de glucosa a sorbitol por la NADPH, seguida por oxidación de1 sorbitol a fructosa en presenciadeNAD4 y sorbitol rleshidrogenasa (polio1 deshidrogenasa). El sorbitol no se difunde con facilidad a través de las membranas celulares y, por tanto, se acumula para producir daño osmotico. De manera sirnulthnea, las concentraciones de rnioinositol bajan. La acurnulaci6n de sorbitol, disminucion de mioinositol y catarata diabctica pueden evitarse en ratas diabéticas mediante la adrninistraciiin de inhibidores de la aldosa reductasa, y se están oliteniendo resultados promisorios en la practica clínica. La aldosa reductasa se encuentra en la placenta de la oveja y ocasiona la secrecibn de sorbitol a la sangre fetal. La presencia de sorbitol deshidrogenasa en el hígado, incluyendo el fetal, conduce a la conversibn del sorbitol a hctosa. Esta vía es responsable tambidn de la presencia de fructosa en el liquido seminal. Cuando el sorbitol se administra por via intravenosa, se convierte a fructuosa y no a glucosa; por el contrario, si se administra por via oral, gran parte escapa a la absorción en el intestinoy se fermenta por las bacterias del colon a productos como acetato e hidrógeno. Los edulcorantes "exentos de azúcar" que contienen sorbitol pueden causar dolor abdominal (intolerancia al sorbitol).

RESUMEN
1) La vía de la pentosa fosfato, cuyas enzimas se encuentran en el citosol, puede realizar la oxidación completa de la glucosa y sus productos principales son NADPH y COL.La via no genera ATP. 2) Esta via tiene una fase oxidativa que es irreversible y genera NADPH y una fase no oxidativa, que es reversible y proporciona precursores de ribosa para la síntesis de nucle6tidos, incluyendo RNA y DNA. La vía completa existe s61o en los tejidos que requieren NADPH para slntesis reductorris; por ejemplo, lipogknesis o esteroidogenesis; en tanto que, la fase no oxidativa se encuentra en todas las dlulac que requieren ribosa. 3) En los eritrocitos, la vía tiene la importante hnci6n de evitar la hem6lisis ya que suministra NADPH para mantener al glutation en el estado reducido. A

su vez, el glutatión sirve como sustrato de la glutatiiin peroxidasa, que es esencial para eliminar a la H202, nociva para la celula. 4) La vía del acido urónico suministra ácido glucurónico necesario para la conjugacibn con numerosas sustancias endógenac y exógenas, que se eliminan en la orina como glucurbnídos. 5) La h c t o s a tiene fácil acceso a las vias metabolicas, esquivando el paso principal de control de la

gliicólisis. cata1izado por fosfofnictocinasa. Por tanto, estimula la síntesis de ácidos grasos y la secrecibn de triacilglicerol hepático. Igual que la galactosa, forma con facilidad glucosa en el higado. 6 ) La galactosa se sintetiza a partir de la glucosa en la glándula mamaria y en otros tejidos donde se requiere para la formacidn de glucolipidos, proteoglucanos y glucoprotetnas. I

REFERENCIAS
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Biosíntesis de ácidos grasos
Peter A. Mayes, PhD, DSc

A semejanza de muchos otros procesos degradativos y siniéticos (por ejemplo, glucogenólisis y glucogenesic). la slntesis de los ácidos grasos (lipogénesis) se consideraba como la inversa de la oxidacihn en la mitocondria. Sin embargo, parece claro que un sistema extrarnitocondrial activo es responsable de la cnmpleta síntesis de palmitato a partir de acetil-CoA en el citosol. Otro sistema para la elongacion de la cadena de ácidos gasos también está presente en el reticulo cndoplismico hepático.

LA PRINCIPAL V ~ A PARA LA NUEVA S~NTESIS ÁC~DOS GRASOS DE (LIPOGÉNESIS) OCURRE EN EL Clf OSOL
Este sistema est8 presente en muchos tejidos, que incIuyen el hfgado, rifíbn, enckfalo, pulmbn, glándula mamaria y tejido adiposo. Sus requerimientos de cofactores incluyen el NADPI-I, ATP, biotina y HCOi(como fuente de CO:). La acetil-CoA es e1 sustrato inmediato y el palmitato libre es el producto final.

IMPORTANCIA BIOMEDICA
Existen amplias variaciones entre especies en la dispasicihn de las principales vías lipogknicas en los tejidos y en sustratos principales para síntesis de ácidos grasos. En la rata, una especie que ha proporcionado gran parte de la información acerca de lipogenesis, la vía se efectiia de preferencia en tejido adiposo e hígado, en tanto que en el ser humano el tejido adiposo puede no ser un sitio importante y el higado sólo manifiesta escasa actividad. En 1% aves, la lipogénesis se confina al higado, donde su importancia es pariicular para proporcionar lipidos utiluados en la formación del huevo. En muchos mamíferos, la glucosa es el sustrato primario para IipogtSnesis, pero en los nimiantes esta función la descrnpefia el acetato, que es la molécula combustible principal producida por la dieta. Dado que la via de lipogénesis puede ser de poca importancia en el ser humano no sorprende que se carelca de informes acerca de enfermedades criticas de ella. Sin embargo, las variaciones en su actividad pueden determinar la naturaleza y extensión de la obesidad y una de las lesiones causadas por la diabetes sacarina insulinodependiente o tipo 1 es la inhibicion de la lipogénesis.

La producción de malsnil-COA es el paso inicial y de control en la sintesic de ácidos grasos
El bicarbonato como fuente de COI resulta necesario en la reacción inicial para la carboxilacion de la acetilCOAa m a l o n i l ~ o A presenciade ATP y acetil-CoA en carboxilasa. Estaultima requierc de la vitamina biotina (figura 23-1). La enzima contiene un numero variable dc subunidades idénticas, asi como biotina, biotina carboxilasa, proteína portadora de carboxibiotina y transcarboxilasa, y lambien un sitio alosterico regulador. Ec por tanto una proteína multienzimlitica. La reacciiin tiene lugar en dos pasos: 1) la carboxilacibn de la biofina (que utiliza ATP, figura 52-1 3) y 2) la transfercncia del carboxilo a la acetil-CoA para formar malonilXoA.

El complejo 5cido graso sintasa es un polipeptido que contiene siete enrimas activas
Al parecer hay dos tipos de hcidos grasos sintasas. En las bacterias, plantas y formas inferiores, las enzimas individuales dcl sistema están separadas y los radicales aciro se encuentran en combinación con una proteina llamada proteina portadora de acilos

CH,

- CO-S

- COA

- O O ~ -CH,

-

CO-S-

COA

Acetil-COA

Malonil-CGA

ATP + HCOT + Enz-biotina

Figura 23-1. Biosintesis de la malonil-COA. (Enz, acetil-COAcarboxilasa.)

(ACP). Sin embargo, en las levaduras, los mamíferos y las aves, el sistema sintasa es un comple,jo multienzitnAtico que no puede subdividirse sin la pérdida de actividad y la ACP es parte de este complejo. Tanto la PPA como el complejo rnultientim~ticode las bacterias contienen la vitamina ácido pan totenico en la forma de 4'-fo~fo~anteteina (figura 5 2 4 ) . En este sistema la AC asume la función de la COA. La agregación de todas las enzima5 de una vía particular en una unidad funcional rnultienzimática ofrece gran

eficacia y libertad de interferencia por procesos competitivos, y así se logra el efecto de compartimentalización de la actividad en la célula, sin necesidad de erigir barreras de permeabilidad. Otra ventaja del polipkptido multienzimático Único es que la sintesis de todas las enzimas del complejo es coordinada ya que todo está codificado por un solo gen. El complejode la hcidos graws sintasaes un dírnero (figura 23-21, En los animales, cada rnonómero es idkntico al otro, y están formados por una cadena

SH SH
I

I

\
OivisiQn . de la subunidad

- -- _ \ -

\
\
I

-- - - -

- - --

I SH
y

SH

- - --

-

-

I
Cvs

4'-Fosfopantetelna

Figura 23-2. El complejo rnultienzimática de los Bcidos grasos sintasa. El complejo es un dírnero de dos rnonámeros de polipeptidoc idknticos, 1 y 2, cada uno constituido por seis adividades enzirnáticas y la proteina portadora de acitos (ACP) (El Cis-SH, y el Tiol cisteina.) El -SH de la 4'-fosfopanteteina de un rnonbrnero está en proximidad estrecha con el -SH del residuo de cisteina de la cetoacil cintasa de otro monomero, sugiriendo un arreglo "cabeza a cola" de dos monomeros. La secuencia detallada de las enzimas en cada rnonbmero es tentativa (basada en Wakil) Aunque cada mon6mero contiene todas las actividades parcialesde la secuencia de la reaccibn, la actual unidad funcional consiste en una mitad de un monbmero en interaccibn con la mitad complementaria del otro Así, dos cadenas acilo se producen simultáneamente.

polipeptidica notable que contiene las siete enzimns de la sintasa y una ACP con un grupo 4'-fosfopanteteína -SH. En proximidad estrecha esta otro ti01 de un residuo de cisteina adherido a la3<etoaciI sintasa (enzima condensante) de otro rnonómero (figura 23-21. Esto se debe a que los dos rnonórneros se encuentran en una configuracibn "cabeza a cola". Aunque ambos tíoles participan en la actividad de la sintasa, s61o el dimero es activo. En un principio, una molécula cebadora d e acetil-CoA se combina con un grupo -SH de cisteina catalizada por acctil transacilasa (figura 23-31, La malonil-CoA se combitia con el gmpo -SH en la 4'-fo~fo~anteteínade C A P del otro rnonómero, catalizada por la malonil transacilasa, para formar la grupo enzima acetiI [acill-malonit. El - . acetilo ataca al grupo metileno del residuo malonilo catalizado por 3detoacil sintasa para liberar COZ y fonnar una enzima 3xetoacilasa (enzima acetoacctil). Esto libera el grupo -SH de la cisteina. ocupado hasta el momento por el grupo acetilo. Esta descarboxilacion permite que la reaccibn prosiga harta su terminación y actíia como un fuerza de cond~iccion para la secuencia entera de reacciones. El gmpo 3-zetoacilo se reduce, deshidrata y reduce de nuevo para formar la aci1-Senzima saturada correspondiente. Una nueva moltcula de malonil4oA se combina con el -SH de la4'-f~sfo~anteteína desplazaal residuo acilosaturado y en el gmpo -SI-I libre de: la cisteina. La secuencia de las reacciones se repite seis veces más incorpohdose un nuevo residuo rnalonilo en cada secuencia, hasta que se ha ensamblado un radical acilo saturado de 16 carbonos (palmitilo). Éste se libera del complejo enzimático por la actividad de una séptima enzima en el complejo, la tioesterasa (deacilasa). El palmitato libre debe activarse a acil-CoA antes de que pueda proceder a otra mita rnetabálica. El destino habitual es su esterificación a aciIgliceroles (figura 2 3 4 ) . En la glanduia mamaria. hay una enzima tioesterasa separada. especifica para residuos acilo de Cs C 10 O C 12, los cuales se encuentran después en los Iípidos lácteos. En la glindula marnaria de: los rumiantes, esta cnzima es parte del complejo de la iicidos grasos sintasas. Podría parecer que son dos centros de actividad en un complejo dirnérico que funcionan de manera independiente y simultinea para formar dos moleculas de palmitato. La eciiaci~npara la síntesis global de pairnitato a paflir de a c e t i l x o h y rnalonil-COA se muestra en seguida:
CH2 COiS*CoA + 7HOOC*CHz COiSiCoA + + 14NADPH + 14H' + CH3 (CH2)11i COOH + 7CO2 + 6H20+ * 8CoAmSH + 14NADP'

La acetil-CoA iitilizada como piintal forma los átoLa mos de carbono 15 y 16 del palniita~o. adicion de todas las iinidadec C: subsiguientes es a traves de la formación de rnaloníl<oA. La butiril-CoA puede actuar como molécula cebadora en el hígado de Ios mamíferos y en la glándula mamaria. Si la propiotiilCOA actúa como cebador, se producen ácidos grasos de cadena,larga con un numero impar de átomos de carbono. Estos se encuentran en forma particular en los riimiantes. donde el propionato se forma por la acción microbiana en el rumen.

La fuente principal de equivalentes reductores (NADPH) para lipogenesis es la vía de la pentosa fosfato
El NADPFI interviene Como coenzima en ambas reducciones. la de los derivados 3<etoaciZos y la dc los derivados acilo 2.3-insaturados. Las reacciones oxidat i v a ~de la vía pentosa fosfato (capítulo 22) son la fuente principal del hidrbgcno que s e requiere para la sintesis reductora de k i d o s grasos. Es significativo que los tejidos que poseen una via pentosa fosfato activa, SOR también los especializados en la lipogtncsic activa, es decir, higado, rejido adiposo y glándula mamaria en lactancia. Además ambas vias metabblicas se localizan en la región extramitocondrial de la celula. de manera que iio hay barreras de membranas ni de permeabilidad para la transferencia de NADPH a partir de una vía a otra. Orras fuentes de NADPH incluyen la reacci~n convierte el malato a piruvato que y se cataliza por la "enzima miilica" {NADP malato deshidrogenasa) (tigura 23-5) y la reaccibn extramitocondrial de la isocitrato deshidrogenasa (probablemente no sea una riiente s~istancial).

La acetil-CoA es el bloque estructural de los ácidos grasos Se forma a partir de los carbohidratos a traves de la oxidaciiin del pinivato dentro de las rnitocondrias. Sin embargo, la acetil-COA no se difunde con facilidad en el interior del citosol extramitocondrial sitio principal de la sintesis de los ácidos grasos. La actividad de la ATP-citrato liasa extramitocondrial, al igual qiie la de la '-enzima malica", aumenta en condiciones dc buena nutricibn, en correlaci~n estrecha con la actividad del sistema de síntesis de ácidos grasos (cuadro 2 1-1). Se considera en la actualidad que la utilizacícin del pimvato para la IipogCnesis es mediante el citrato. La via involucra la glucrilisis seguida por la descarboxilación oxidativa del piruvato a acetil-CoA dentro de las mitocondrias, seguida por la condensacion con oxafacetato para formar citrato como parte del ciclo sigue la translocación del del ácido cítrico. A e ~ t o

Acetil-COA

+

Malonil'-COA

Cntransferidos desde
TRANSACILASA

Complefo multienzim8tim de la acldo
graso sintasa

o
111
a P a n ~ ~ ~ ~ I - IC'/ ~ ~ ~ -

Enzima Acil (aceti1)-malonila

Enzima 3-cetoacilo (enzima-acetoacetiio)

Enzima N-)-3-hidroxiacilo

-

SH
O

=Pan-s

-c-

II

CH=CH-CH,

Enzima acilo 2,3-insaturado

o
a trads de los pasos ( !a : 1 $ Palmttato

Despues de 7 ciclos

~ P ~ ~ - S - C - C H . - C H ~ - C H ,

11

(C.)

Enzima acilo

Figura 23-3. Biosíntesis de ácidos grasos de cadena larga. Detalles de la forma e n que la adicion de un residuo malonilo hace que la cadena acilo crezca cada vez dos átomos de carbono. (Cis, residuo de cisteina, Pan, 4'-fosfopanteteina.) En la figura 23-2 se muestran los detalles del dimero de la stntasa de los ácidos grasos. y @ representan los rnonbmeros individuales de la sintasa de hados grasoc.

a

Biosínresis de ácidos grasos

26 1

ATP + COA

Palmilato

u
AMP PP,

+

Acilgltceroles cstes de colesterrlo

f
Estenficactbri

Palmitil-COA

/

\ Alargamiento de la cadena de desaturactbn

' r

Acil-COA

1

Figura 2 3 4 . Destino del palrnitato después de la biosintesis.

Glucosa

Palmitato

Glucosa 6-fosfato

1

f

rato

-

lsocitrato

Figura 23-5. El abastecimiento de aoetil-COA y NADPH para la lipogénecis. (VPF,vla de la pentoca fosfato; T, transportador del tricarboxilato, K, transportador del alfa-celoglutarato, P, transportador de piwvato.)

citrato dentro del compartimiento extrarnitocondria!, donde en presencia de COAy ATP sufre la ft-apentacihn a a c e t i l 4 o A y a oxalacetato, catalizada esta fragment a c i ~ n la ATP-zitrato liasa. Laacetil-CoA se tiene por después disponible para la fomacion de malonilCOA y la síntesis de palmitato (figura 23-5). El oxalacetato puede formar malato mediante la maIato deshidrogenasa enlazada al NADH, seguida por la generacion de NADPH a través de la enzima malica. A su vez, el NADPH se tiene disponible para la lipogknesis. Esta vía es un medio de transferir equivalentes reductores del NADH extramitocondrial al NADP. En forma alterna, el malato puede transportarse al interior de la mitocondria donde puede reformar el oxalacetato. Es de notarse que el transportador de citi2t~ (tricarboxilato) en la membrana mitocondrial requiere E malato para intercambio con e ciwato (figura 14-13). Hay poca ATP-citrato liasa o enzima malica en los rumiantes probablemente debido a que en estas especies el acetato (proveniente del mmen) es la fuente principal de acetil-CoA. Debido a que el acetato surge y es aczivado a a c e t i l 4 o A fuera de las mitocondrias, no hay necesidad alguna de transportar citrato fuera de la mitocondria y forme citrato antes de su incorporacion en los ácidos grasos de cadena larga. La generacion de NADPH via la isocitrato deshidrogenasa extramitocondrial es más importante en estas especies, debido a la deficiencia de enzima málica.

El alargamiento de la cadena de los ácidos grasos tiene lugar en el retículo endoplásmico
La vía ("sistema micrnsomat") convierte a los compuestos acil-CoA de los Bcidos grasos a derivados acilo con dos átomos de carbono m6s, mediante la utilización de rnaIonil-CoA como donador de aceti lo y el NADPH como reductor y catalinda por las enzimas del sistema cromosómico de [a clongasa de los 4cidos grasos (figura 2 3 4 ) . Los grupos acilo que pueden actuar como moléculas cebadoras incluyen las series saturadas desde el CIOhacia adelante, al igual que hcidos grasos insaturados. El ayuno suprime principalmente el alargamiento de las cadenas. El alargamiento de la estearil-CoA en el encdfalo aumenta con rapidez durante la mielinizaci6n con el fin de proporcionar hcidos grasos con 22 y 24 átomos de carbono que estan presentes en los esfingolipidos.

R ~ H ~ O C H - C H ' ~ - S-COA
2,s-Acil-COAinsaturada

NADPH
2.3-ACIL-COA INSATURADA

+

Ht

NADP+

Figura 23-6. Sistema microsbmiul de la elongasa para el alargamiento de las cadenas.

EL ESTADO NUTRICIONAL REGULA LA LIPOGÉNESIS Muchos animales, incluso el ser humano, toman su
alimento como comidas espaciadas y por tanto, deben

almacenar gran parte de la energía de su dieta para usarla entre alimentos. El proceso de lipogknesis se ocupa de la conversi6n de glucosa e intermedios como piruvato, lactato y acetilXoA a lipido, lo cual constituye ta fase anabblica de este ciclo. El estado nutricional del cuerpo y los tejidos es el factor

principal de control de la velocidad de E Eipogknea sis. DE este modo. la velocidad es alta en el animal nutrido cuya dieta contiene una elevada proporcihn de carbohidratos. Se deprime en situaciones de ingestión caldrica restringida. con dietas ricas en Iípidos o cuando hay deficiencia de insulina, como en diabetes sacarina. Todos estos estados se acompañan de incremento en la concentración placmatica de acidos p q o s libres. La regulación del movimiento de icidos grasos libres del tejido adiposo se describe en el capitulo 27. Existe una r e l a c i ~ ninversa entre lipogenesis hephtica y la concentracion d r i c a de ácidos grasos libres (figura23-7). La inhibicibn mayor de la lipoghesis ociirre por arriba de los valores de Bcidos grasos libres (0.3 a 0.8 mmollmL de plasma) en los que Acidos grasos plasmáticos aumentan durante la transición de la alimentación a la Inanicibn. La grasa de la dieta también deprime la lipogénesis en el higado y cuando la alimentación contiene m&$ de t 0% de lipidos, es escasa la conversión de carbohidrato dieteitico a grasa. La lipogknesis es mayor cuando se ingiere sacarosa en lugar de glucosa debido a que la fructosa esquiva el punto de controt de fosfofmctocinasa en Z glucolisis e inunda la vía lipogénica a (figura 22-51,

La concentración de citrato y acEl4oA regula a la acetil4oA carboxilasa
La reacción limitante de la velocidad en la vía lipogénica es el paso de la acctil4oA carboxilasa. Erta enzima es alosterica y se activa por citrato, cuya concentracion aumenta en estado de nutncion adecuada y es un indicador de suministro complcto de acetilCOA. Sin embargo. la inhiben moléculas a c i l X o A de cadena larga, un ejemplo de inhibición metablilica por retroaiimentacidn negativa por un producto de la secuencia de acciones s. Asi, si la a c i l 4 o A se acumula debido a que no se esterifica con suficiente rapidez, reducid de manera autornatica la sintesis de acido graso nuevo. De igual modo, si la acilXoA se acumula como resultado del aumento de lipolisis o del flujo de hcidos grasos libres hacia el tejido, también se inhibirá la formación de acido graso nuevo (figura 23-7). La activacibn alostCrica de la enzima implica Ia agregación de la configuraciiin dimerica en polimCrica de varios millones de masa molecular. La Acil-CoA puede inhihir tambikn al transportador mitocondrial de tricarboxilatos, e impedir de este modo la salida de citrato de las mitocondrias al citosol.

LA LIPOGÉNESISSE REGULA
CON MECANISMOS INMEDIATOS Y A LARGO PLAZO

La Acil-CoA regula también a la piruvato deshidrogenasa
Existe tambien una relacibn inversa entre la concentracirin de hcidos grasos libres y la proporcibn entre piruvato deshidrogenasa activa e inactiva que regula la disponibilidad de acetilXoA para lipoginesis. La AciIXoA inhibe a la piruvato deshidrogenasa por bloqueo del transportador del intercambio ATP-ADP de la membrana interna mitocondrial, lo cual conduce a incremento en las proporciones [ATP]/[ADP] dentro de la mitocondria y por tanto a conversibn de pimvato deshidrogenasa activa a inactiva (figura 19-6). AdemBs, ¡a oxidación de a c i l 4 o A por aumento de la concentracibn de acidos grasos libres puede elevar las proporciones [acetil4oA]qCoA] y FADH]/[NADt] en la rnitocondrias, y en consecuencia inhibir la piruvato deshidrogenasa.

La sintesis de ácidos grasos de cadena larga se regula a termino corto por modificación alostérica y covalente de enzimas y a largo plazo por cambios en la expresibn genica que regula las velocidades de sintesis enzimáticac.

Las hormonas también regulan la lipogénesic
0.2

0.5

I .a

2.0

3.0

AGL cbricos (~tmollmC)

La insulina estimula la lipogénesis por diversos mecanismos; acelera el transporte de glucosa al interior de la celula (por ejemplo, en tejido adiposo) y por
consiguiente aumenta la disponibilidad de piruvato para la síntesis de hcidogmo y de glicerol 3-fosfatopara esterificación de estos ácidos grasos. La insulina convierte la forma inactiva de piruvato deshidrogenasa a la forma activa en el tejido adiposo, pero no en el

Figurá 23-7. Inhibicibn directa de la lipogénesis hepatica por Acidoc grasos libres La lipog&necis ce deteminb de la incorp~racion 3 ~ z a $cidos grasos libres en hígado de de 0 rata perfundido.AGL, bcidoc grasos libres. (Experimento del laboratorio del autor con DC Topping.)

264 0 Bioquirnica de IJarper

(Capitulo 23)

hígado. Ademhs, la acetilXoA carboxilasa es una enzima que puede regularse por fosforilaci6n reversible. La insulina activa la a c c t i l Z o h carhoxilasa. Esta activación implica la desfosforilac i ~ por una proteína n fosfatasa acornpaflada por el cambio en la agregacibn de monomeros a partir de un octbmero a un estado más polimerico. Tarnbidn, la insulina, por 5u propiedad de deprimir la concentraci6n de cAMP intracelular, inhibe la lipolisis y por tanto, reduce la concentración de la acil-CoA de cadena larga, un inhibidor de la lipogénesis. Por este mismo mecanismo, la insulina antagoniza las acciones de glucagón y adrenalina, los cuales inhiben la a c e t i l 4 o A y por consiguiente la lipogénesis, por incremento de cAMP, que permite a la proteína cinasa dependiente de cAMP que inactlve a la enzima por fosforilacilin. Otra proteina cinasa dependiente de 5'-AMP también inactiva la enzima. En los rumiantes, el acetato y no la glucosa es el compuesto de inicio de la lipogénesis. Se infiere que, en estas especies, se evitan muchos de los mecanismos de control en los que intervienen mitocondrias y por tanto no son aplicables.

de la gluctjlisis y la lipogénecis. Estos mecanismos para el control a largo plazo de la lipogénesis recién descritos emplean varios días para manifestarse en forma plena y aumentan el efecto directo e inmediato de ácidos grasos libres y hormonas como con la insu Iina y glucagón.

RESUMEN
1) La síntesis de hcidos grasos de cadenas largas (lipogenesis) se realiza por dos sistemas enzimá~icos presentes en el citosol de la célula: la acetilXoA carboxilasa y hcido graso sintasa. 2) La vía convierte la acetilXoA a palmitato y requiere NADPH, ATP, M#, biotina, ácido pantotenico y HCOt- como cofactorec. 3) El sistema de la a c e t i l 4 o A carboxilasa se requiere para la conversion de la acetil-CoA a malonilCOA. A su vez, la Bcido graso sintasa, cl complejo multienzim~tico una sola cadena polipeptídica de con siete actividades enzirnaticas separadas, cataliza el ensamble de palmitato a partir de una mol&culade a c e t i l 4 o A y siete de rnalonil4oA. 4) La lipogénesis se regula en el paso de la acetilCOA carboxi lasa por modifi cadoses alostéricos, modificación covalente e induccibn y represidn de Ia sintesis enzimhtica. El citrato activa la enzima; la a c i l 4 o A de cadena larga inhibe su actividad. A plazo corto, la insulina activa la acetil-CoA carboxilaca por desfosforilaci6n y a plazo largo, por inducción de la síntesis. El glucagbn y la adrenalina tienen acciones ovuestas a-la insulina. 5) El alargamiento de la cadena de los ácidos grasos tiene lugar en el retículo endoplhmico, cataliadapor el sistema enzirnhtico de la etongasa microshíca.

E complejo de ácido graso sintasa l y a c e t i l 4 o A carboxilasa son enzirnas adaptativas
Esto es, se ajustan a los requerimientos fisiolbgicos del organismo por incremento en la cantidad total en estado de nutrícibn adecuada y disminución en ayuno, dieta rica en Iípidos y diabetes. La insulina es una hormona importante que produce expresión génica e induce biosíntesis enzimática y el glucagán amagoniza este efecto. La ingestión de grasas que contienen ficidos grasos poliinsaturados regula la manera ordenada la inhibiciiin de la expresión de enzirnas criticas

REFERENCIAS
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Oxidación de ácidos grasos: cetoaénesis
Wd

Peter A. Mayes, PhD, OSC

Los ácidos gsasos son oxidados a acetil-COAy sintetizados a partir de la misma. Aunque la materia prima de un proceso es idéntica al producto de otro y las etapas químicas son comparables, la biosintesis de los acidos grasos no es simplemente la inversa de su oxidacihn, sino un proceso entemente distinto que tiene lugar en la célula en un compartimiento separado. La oxidacibn de Bcidos grasos separada de la biosíntesis permite que cada proceso se regule e integre de manera individual de acuerdo a las necesidades tisulares. La oxidacion de los ácidos grasos se lleva cabo en las mitocondrias; cada paso comprende derivados acil-COA catalizados por enzírnas diferentes, utiliza NAD' y FAD como coenzimas y genera ATP. Por el contrario, la biosintesis d e los ácidos grasos (Iipogenesís} se desarrolla en el citosol, comprende derivados acilo adheridos continuamente a un complejo multienzimatico, utiliza NADP' como coenzima y requiere de ionec bicarbonato y ATP. La oxidación de hcidos grasos es un proceso aerobio, que exige la presencia de oxígeno.

varios estados de deficiencia de carnitina o de las enzimas esenciales para la oxidacibn de los ácidos grasos (como la carnitina palmitoiltransferasa) o cuando la oxidacihn es inhibida por venenos (por ejemplo la hipoglicina).

LA OXIDACION DE LOS ÁCIDOS GRASOS SE PRODUCE EN LAS MITOCONDRIAS
Los acidos grasos san transportados en la sangre como ácidos grasos libres

lAGL1
El término "acido graso libre" se refiere a los ácidos grasos que no esthn esterificados. Otras nomenclaturas son AGNE (ácidos gracos no esterificados) o AGSE (acidos p o s sin esterificar). En el plasma, los AGL de cadena larga se combinan con la albumina y en la célula están adheridos a la proteína fijadora d e hcidos grasos o proteína Z, dc modo quc en realidad nunca están "librec". Los acidos grasos de cadena corta son m8s solubles en agua y existen como acido no ionizado a como anion.

IMPORTANCIA BIOMEDICA
El incremento de la oxidacibn de los hcidos grasos es tipico de la inanición y de la diabetes sacarina, donde ocasiona la produccibn de cuerpos cetónicos por el hígado (cctosis). Los cuerpos cetónicos son ácidos, cuya producción excesiva por periodos largos, como en la diabetes, causa cetoacidasis que finalmente es mortal, Debido a que la gluconeogénesis depende de la oxidacihn de Ios hcidos grasoc, cualquier alteración de dsta da lugar a hipoglucemia. Ésta se presenta en

Los ácidos grasos deben activarse antes de que puedan ser catabolizados
A1 igual que en el metabolismo de la glucosa, los Acidos grasos primero deben convertirse mediante la reaccibn con el ATP a un intermediario activo, antes de que reaccionen con las enzimas responsables de su metabolismo ulterior. Esta es ia única a a p a en la degradación completa de un ácido graso que requiere energía a partir dcl ATP. En presencia de ATP y de la

266 Bioquimica de Harper

coenzima A. la enzima acil-COA slntetaqa (tiocinasa) cataliza la conversión de un ácido graso (o ácido graso libre) a un "ácido grasa activo" o acil-COA. acompanada por el gasto de un focfato de alta energia.
Ácido graso + ATP + COA + Acil-COA + PP;+ AMP

ciona con COA, por acción de carnitina palmitoiltransfersa 11, adherida al interior de la membrana intenia. En la matriz mitocondrial se desprende la camitina y se regenera acil-COA (figura 24-1). Acil-CoA + Carnitina e Acilcarnitina + Cob

La presencia de la pirofosfata~ainorghnicti asegura que la activacihn sea cornplrtta, facilitando la pérdida del fosfato de alta energia adicional del pirofosfato. De este modo, de hecho son dos fosfatos de alta energia los que se gastan durante la activación de cada molécula de ácido graso.

Otra enzima, la carnitina acctiltransferasa, se encuentra presente en las mitocondrias, catalizando la transferencia de grupos acilo de cadena corta entre la COA y Ia carnitina. La función dc esta enzima es poco conocida, pero puede ser que facilite el transporte de grupos acetilo a través de la membrana de la mitocon-

PIROFOSFATASA

ATP

AMP+ PPi

La acil-COA sintetasa se encuentra en el retículo endoplasmico y en el interior y sobre la membrana externa de las mitocondrias. Han sido descritas varias acil-COAsintetasas, especificas pasa cada ácido graso de diferente longitud de cadena.

tos acidos grasos de cadena larga atraviesan la membrana mitocondrial interna como derivados de carnitina
La carnitina (beta-hidroxi-gamrna-trimeti!amoniobuikato), (CH&W -CH2-CH(Oi-WH:4OO-, está ampliamente distribuida y, en particular, es abundante en particular en el musculo. Es sintetizada en el hígado y el riñén a partir de lisina y metionina. La activación de los Acidos grasos mas pequefíos y su oxidacidn pueden ocurrir en el interior de las mitocondrias, independientemente de la carnitina, pero la acil-COA de cadena larga (o AGL} no penetrara a las mitocondrias y no es oxidada a menos que forme acilcarnitinas. Una enzima, la carnitina palrnituiltransferasa 1 esta relacionada con el lado exterior de la rnernbseina mitocondrial interna y convierte a los grupos acil-COA de cadena larga en acilcarnitina, la cual es capaz de penetrar la membrana interior de las mitocondrias y tener acceso al sistema de enzirnas de la beta oxidacibn (véase la reacción después), La carnitina-acilcarnitina translocasa actúa como un transportador de intercambio dc carnitina. La acilcarnitina se transporta al interior acoplada con la salida de una molecula de camitina. Luego, la acilcarnitina reacCarnitina Acilcarnitina

!

I

COA

/

\ Carnitina
Acil-COA

Aulwmitina

&brnitina

-

beta

ni da cid^

Figura 24-2. La funcibn de la carnitina en e transporte de 4 los ácidos grasos de cadena larga a travec de la membrana interna de la rnitocondria La cadena larga de acetil-COA no puede atravesar la membrana interna de ta mitomndria, paro si su producto metabolico, la acilcarnitina

cual se encuentra en la membrana interna}. Estas * catalizan la oxidacibn de la acil-COA a acetil-COA, acopliindose el sistema con la fosforilación del ADP a ATP (figura 24-3). Después de que el residuo acilo penetra en Ia mernbma m itmondnal mediante el sistema transporAcetil-COA + Carnitina t Acetilcamitina + COA , tador de la carnitina y la reformacibn de acil-COA, sigue la eliminaciiin de dos átomos de hidrhgeno de los carbonos ?(alfa) y 3(beta), catalizada por la acilCOAdeshidrogenasa. Esto resulta en la formación de A'-trans-enoil-COA. La coenzima para la desh idrogenasa es una flavoproteina que contiene FAD como grupo prostttico, cuya nueva oxidacibn por la cadena LA BETA OXIDACION DE ÁCIDOS respiratoria requiere la mediación de otra flavoproteína. denominada flavoproteina transferenie de GRASOS IMPLICA SU electrones (capitule 13). Se afíade agua para saturar DESDOBLAM1ENñO SUCESIVO el doble enlace y formar 3-hidroxiacil-COA, cataliCON LIBERACION DE ACETIL-COA zada por la enzima A'-enoil-COA hidratasa. El derivado 3-hidroxi sufre una deshidrogenación posteEn la beta oxidación (figura 24-2), cada vez se rior sobre el carbono 3 (L(+)-3-hidroxiacil-COA separan dos carbonos de las rnol&culasde acil-COA, deshidrogenasa) para formar el compuesto 3-cecomenzando por e! extremo carboxilo. La cadena se toacil-COAcorrespondiente. En este caco, la coenzima rompe entre los Atomos de carbono alfa(2) y beta(3), dc aquí el nombre de beta oxidación. Las unidades de NAD interviene en la deshidrogenación. Finalmente, dos carbonos formadas son acetil-COA, por tanto, el la 3-cetoacil-Coa es fragmentada en la posición 2,3 palrnitoil-COA forma ocho molt5culas de acetil-COA. por una tiolasa (3-cetoacil-COA-tiolasa), la cual cataliza un desdoblamieiito tiolítico que afecta otra molécula de COA.Los productos de esta reacción son La secuencia de reacción cíclica la acetil-COA y un derivado acil-COA que contiene genera NADH y FADH2 dos carbonos menos que la motccula original de acilCOAoxidada. La acil-COA formada en la reacción dc Diversas enzimas conocidas colectivamente corno fragmentacion vuelve a entrar a la vía oxidativa en la "acidos grasos oxidasas" se localizan en la matriz reaccihn 2 (figura 24-31, De esta manera, un ácido mitocondrial adyacente a la cadena respiratoria (la graso de cadena larga puede ser degradado por completo a acetil-COA (unidades C:). Como la acetil-COA puede ser oxidada a COz y agua a través del ciclo del ácido cítrico (que se encuentra tarnbikn dentro de las mitocondrías}, se logra Ia oxidacion completa de los ácidos grasos. dria. Junto con fiuctosa y lactato, la acetilcarnitina es una fuente energdtica importante para el esperma, respaldando su movilidad.

La oxidacion de un ácido graso can un número impar de carbonos produce una molécula de acetil-COA y una molécula de propionil-COA
1

Remoción sucesiva de dos unidades C

Acetil-CoA

Figura 24-2. Esquema global de la beta oxidacion de los ácidos grasos.

Los acidos grasos con un número impar de átomos de carbono son oxidados por la vía de la beta oxidación produciendo acetil-COA hasta que quede un residuo de tres carbonos (propionil-COA). Este compuesto se convierte en succinil-COA, un constituyente del ciclo del ácido cítrica (figura 2 1-2). De aquí que, el residuo propionilo d e un ácido graso de cadena impar es la única parte glucogénica de 61.

d

0
II

Acido graso

R3CH,'CH$ I

-O -

S NTETASA 1

AMP+ PP,

Aul-COA (Acido graso activo)

R"CIi,

7CHrC-S-CoA

- -------------------+ - L L -

MEMBRCrN.4 MITOCONDRWL INTERNA C

f-

R ~ C H T ~ C H , - C -S-COA Acv'-cOA
DESHlOROGENASpl
.

1
I

-

Lado C (fuera)
-e----------------

+-

TRANSPORTADOR CARNITINA

-

- .

-

-.

----------

o
II

Lado M (dentro)

Cadena

NADH+H

Cadena

CCdo del af ido

Figura 24-3. Beta oxidacibn de los ácidos gracos La acil-COA de cadena larga participa en el ciclo a través de las reacciories 2 a 5, la acetil-COA es separada en cada cicla por la Ziolasa (reaccibn 5) Cuando el radical acilo tiene únicamente cuatro Atomos de carbono se forman dos moléculas de acetil-COA en la reaccidn 5.

La oxidación de los ácidos grasos produce un gran numero de msleculas de ATP
El transporte de electrones en la cadena respiratoria, procedentes del FADEI: y el NAD, conducira a la síntesis de cinco fosfatos de alta energia (capitulo 14) para cada una de las primeras siete rnolticulas de acetil-COAformados por la beta oxidacidn del palmitato (7 x 5 = 35). Se forma un total de ocho moles de acetil-COA y cada uno dar&lugar a 12 moles de ATP en la oxidación en el ciclo del ácido cítrico, obteniendoce 8 x 12 = 96 moles de ATP derivados de la acetil-COA formada a partir del pahitato; de éstos se restan dos por la activación inicial del ácido graso, rindiendo una ganancia total de 1 29 moles de ATP por mol de palmitato, es decir, un total de 129 x 5 1.6* = 6656 kJ. Como la energia libre de la combustión del ficido palniitico es de 979 1 kJlmol. el proceso captiira como fosfato de alta energia alrededor de 68% de la energia total de combustiiin del acido graso.

LA ALFA O X I D A C I ~ N LA OMEGA Y OXIDACIQN DE ACIDOS GRASOS SON V ~ A S ESPECIALIZADAS
De manera cuantitativa, la beta oxidacion en las mitocondrias es la via mas importante para la oxidación de los acidos graos. Sin embargo, la alfa oxidación, es decir, la eliminación de un carbono a la vez. del extremo carboxilo de la molécula ha sido detectada en el tejido encefático. No necesita intermediarios COAy no conduce a la generación de fosfatos de alta energía. La omega oxidación se origina en el reticulo endoplAsmico por las enzímas hidroxilasas, interviniendo un citrocromo P450 (capitulo 13). El grupo -CHi se convierte en el 4 H l O I - I que posteriormente es oxidado a -COOH, lo cual forma un acido dicarboxiIico. Este es beta oxidado habituarmente a ácido adipico (Cbjy sub6rico (CR). los ciialcs se excrefan en la orina.

Los peroxisomas oxidan a ácidos grasos de cadena muy larga
En los peroxisomas se encuentra una forma moditicada de la beta oxidacion que conducc a la formación de acetil-COA y HzOl (del paso de la deshidrogenasa ligada a flavoproteína). Por tanto, esta primera deshidrogenación no se vincula directamente con la fosforilación y la generación de ATP pero, mediante la activación inicial por la acil-COA sintetasa de cadena muy larga, facilita la oxidación de ácidos grasos cuya cadena tarnbikn es muy larga (por ejemplo, CZo C2,). y Estas enzimas se inducen por dictas abundantes en grasas y, en algunas especies, por fhrrnacos hipolipiddmicos como el ctofibrato. Las cnzimas en los peroxisomas no atacan a los ácidos grasos de cadenas más cortas; la secuencia de la beta oxidación termina en el octanoil-COA. A continuación los grupos octanoilo y acetilo se eriminan de los peroxisomas en la forma de octanoil carnitina y acetit carnitina y, más tarde, ambos son oxidados en las mitocondrias. Una funcihn posterior de la beta oxidación peroxisómica es acortar la cadena lateral del colesterol en la fomaci6n de hcido biliar (capítulo 28). Los peroxisomas también participan en la síntesis tanto de Cter glicerolipidos (capitulo 26), como del colesterol y del dolicol (figura 28-2). t o s peroxisomas no contienen carnitina palmitoiltransferasa.

LA OXIDACIÓNDE ÁCIOOS GRASOS INSATURADOS SE PRODUCE POR UNA V ~ A MODIFICADA DE LA BETA OXIDACION

Los ésteres COA de estos Acidos son degradados por las enzimas que normalmente se ocupan de la beta oxidacibn hasta que se forma un compuesto A'-cisacil-COA o un AA-cis-acil-COA,dependiendo de la posición de las dobles ligaduras (figura 2 4 4 ) . El primer coinpuesto es isomerizado (~"cis-tA~-irunsenoiS-COAisomerasa) a la etapa correspondiente A ~ tram-COA de la beta oxidación para la subsiguiente hidsatacidn y oxidacibn. cualquier d4-cis-acil-COAse conserva, como en el caso del hcido linoleico (figura 2 4 4 ) o entra a la via en este punto y es convertido por la acil-COA deshidrogei~asa ~ ~ - t r a n s - ~ ~ - c i s - d i a enoi 1-COA. Ésta es convertida a A3-irans-enoit-COA por una enzima que depende de NADP. ~ ~ - t s a n s - ~ ' ' c i s d ienoil-COAreductasa. La A 3 - c i ~ - f A Z ~ n s e n o i ~ o ~ isomerasa tarnbikn atacará a la doble ligadura A'-iruns para producir A~-rruns-enoil-COA, intermediario un en la beta oxidación.

LA CETOGÉMESIS SE PRESENTA CUANDO HAY UN ~NDICE ELEVADO DE OXIDACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS EN EL HÉGADO
En ciertas condiciones mctab6licas relacionadas con un índice alto de oxidación de ácidos pasos, el higado

*

AG para la reacción ATP. tal como se explica cn el
capítulo 19.

cis

cis

C

0 S - COA

-

3

Ciclos de

B oxidacibn

0

3 AwtiI-CoA

a2-trans-i\6-c~s-Dienoi~-~o~

(A~-tmns-Enoil-COA estado de a-oxidación)
Un uclo de

p oxidacibn

Acetil-COA

produce cantidades considerables de acetoacetato y de D(-)-3-hidroxibutirato (beta bidroxibutirato). El acetoacetato continuamente se descarboxila de manera esponthnea para dar acetona. Estas tres sustancias se conocen colectivamente como cuerpos cetánicos (se designan como cuerpos acetónicos o [incorrectamente*] "cetonas") (figura 24-5). El acetoacetato y el 3Aidroxibutirato son interconvertidos por la enzima mitocondrial D(-)-3-hidr~xibutirato deshidrogenasa; el equilibrio es controlado por la proporción mitocondrial del fNADt] a WADH], es decir, el estado redox. La proporcibn E-hidroxibutirato]/[acetoacetato] en la sangre varia entre 1 : 1 y 10:1 . La concentración de cuerpos cetónicos totales en la sangre de mamlferos bien arimentados por lo común no excede de 0.2 mmollL. En los rumiantes es algo mayor debido a la formacidn en la pared del mmen de 3-hidroxibutirato a partir del ácido butirico [un producto de la fermentación en los rumiantes). En general la perdida por la orina es menor de 1 mg por 24 horas en el ser Iiumano. In vivo, el hígado parece ser el Unico 6rgano en los no rumiantes que agrega una cantidad significativa de cuerpos cet6nicoc a la sangre. Los tejidos extrahepAticos los utilizan como sustratos respiratorios. Las fuentes extrahepáticas de cuerpos cetbnicos, por ejemplo, el epitelio del rumen en los rumiantes, no contribuyen de manera importante a la producción de cetosis en estas especies. El flu-jo neto de cuerpos cetónicos del hígado a tos tejidos extrahepaticos proviene de un activo mecanismo enzimatica en el hígado para la produccion de cuerpos cet6nicos acoplado con una actividad muy baja de las enzimas encargadas de su utilizacidn. La situacidn inversa tiene lugar en los tejidos extrahepaticos (figura 2 4 4 ) .

3-hidroxi-3-metilglutaril-COA (HMG-COA) es un intermediario en la vía de la cetogénecis
Las enzimas que forman cuerpos cet6nicos estan relacionadas principalmente con las mitocondrias. A l principio se creía que sólo se formaba una molécula de acetoacetato a partir de los cuatro carbonos terminales de un ácido graso despues de oxidacibn. Más tarde, para explicar tanto la produccihn de mlis de un equivalente de acetoacetato a partir de un hcido graso de cadena larga, como la formación de cuerpos cetbni-

4 Ciclos de

p oxidacibn

5-Aoetil-COA

!

Figura 24-4. Secuencia de reacciones en la oxidacibn de Bcidoc grasos insaturados, por elernplo, Acido linoleiw. Los Acidos grasos h4-ciso los que forman n4-us-enoil-COA entran a la via en la posicibn que se muestra. El NADPH para el paso de la dienoil-COA reductasa es tomada de fuentes intramitocondriaies como la acción del glutamato deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa y MAD(P)H transhidrogenasa

*

El termino "ceionaq" no debe usarce debido a que el 3-hidroxibutirato no es iinacetona y ha! muchas ceicinas en la sangre que no son ciicrpos cetónicos, por ejemplo cl piniuato y la fructosa.

Oxidació~1 úcidos grasos. cet o~énesis 2 71 de

tiolasa donde dos moléculas de acetil-COA se con-

Acetoaoetato a[-FJ-HtPROXfBUTiWTO
UADH + W f

CH,-

CH - CH,-

cm-

Figura 2 4 6 . Interrelaciones de los cuerpos cetbnicos. La o(-)-3-hidroxibutirato deshidrogenasa es una enzima mitoconcirial

cos a partir del acido acktico se propiiso que las unidades C2 formadas en la beta oxidación se condensaban entre si para formar acetoacetato. Esto puede ocurrir por una invessiíin de la reacci6n de la

densan para formar acetoacetil-COA. Así, surge la acetoacetíl-COA, que es el material inicial para la cetogénesis, ya sea directamente durante el curso de la beta oxidación o como resultado de la condensación de acetil-COA(figura 24-7). Esta vía implica la condencacion de acetoacetil-COA con oua molécula de acetil-COA para formar HMG-COA catalizada por la 3-hidroxi-3-metilglutaril-COA sintasa. La presencia de otra enzima en las mitocondrias, la 3bidroxi-3-metilglutaril-COA liasa, s e p a r a a la acetil-COA de la HMG-COA, dejando acetoacetato libre. Los átomos de carbono separados de la molécula de acetil-COA provienen de la molécula de acetoacetil-COA original (figura 24-71. Ambas enzimas deben estar presentes en las mitocondrias para que se lleve a cabo la cetogénesis. Esto sucede exclusivamente en el epitelio del mmen y en el hígado. Aunque la actividad de la HMG-COA liasa aumenta durante el ayuno, los resultados no sugieren que esta enzima sea limitante de la velocidad en la cetoh~nesis. El acetoacetato está en equilibrio con el 1i(-)-3hidroxi butirato catalirado por la n(-)-3-hidroxibutirato dcshidrogenasa, q u e s e e n c u e n t r a en la mitocondria d e muchos tejidos, incluyendo el hepático (figura 24-5). El n(-)-3-hidroxibutirato es, cuantitativamente, el cuerpo cetonico predominante en la sangre y orina en la cetosis.
L

SANGRE
--+.*,,
,,

ronos
EXTRAWEPATICOS

Cuerpos cetaniws

Cuerpos cetonicos

cuerpos cetonicos

del ácido cítrico

Figura 24-6, Forrnacidn, utilizacion y excrecion de los cuerpos cetbnims. (La vía principal está indicada por las flechas continuas )

AGL

Acii-COA

I
(Acetii-

beta Oxidacibn

COA^

Figura 24-7. Vias de cetogénesis en el hígado. (AGL, Bcidos grasos libres. HMG,3-hidroxi-3-metilglutaril )

Los cuerpos cetiinices se utilizan

como combustible para los tejidos
extrahepáticos
Aunque el hígado cuenta con un activo mecanismo enzimático para la producci6n de acetoacetato a partir de acetoacetil-COA, una vez que se forma, no puede ser reactivado directamente en este 6rgano excepto en el citosol de su5 cklulas, donde es precursor en la síntesis del colesterol, una via mucho menos activa. Esto explica la produccion total de cuerpos cet6nicos por el hígado. En los tejidos extrahepliticos, la principal via de utilizacion para la activacihn del acetoacetato a acetoacetil-COA irnptica a la succinil-COA y a la enzima succinil-COA-acetoacetato COA transferasa. E 1

acetato reacciona con la succinil-COA, y la COA se transfiere para formar acetoacetil-COA. dejando suc. cinato libre (figura 24-81. La acetoacetil-COA que se produce, es separada en acetil-COA por la tiolasa y oxidada en el ciclo del ácido cítrico como se muestra en la figura 2 4 4 . Los cuerpos cetónicos son oxidados en los tejidos extrahepáticos de modo proporcional a su concentraci6n en la sangre. Si esta se eleva, la oxidación de los cuerpos cetonicos aumenta hasta que, a una concentracibn de aproximadamente 12 mmol/L, saturan la maquinaria oxidatíva. Cuando esto ocurre, una gran proporcibn del consumo de oxígeno puede deberse a la oxidación de los cuerpos cetónicos. La mayoría de las pruebas sugieren que la cetonemia se dcbc a la elevadaproducci6n de cuerpos cetónicos por el higado, mas que a una deficiencia en

+

'

Ertefificacisn

r,k,,igiiceroi fosfolípido

Oxidación de cicrdo.7

graso.^:

cerogénesis 2 73

Figura 24-8. Transporte de cuerpos cetbniws desde el hígado y mecanismos de utilizacion y oxidación eii los tejidos intra hepatioos.

su utilización por parte de los tejidos extrahepáticos. Sin embargo, los experimentos con ratas despancreatizadas apoyan la posibilidad de que la cetosis en la diabetes grave puede empeorar por una capacidad reducida para catabolizar los cuerpos cetónicos. Aunque el acetoacetato y el D(-)-3-hidroxibutirato se oxidan con facilidad por los te-jidos extrahepáticos, la acetona es difícil de oxidar ir? vivo y una gran cantidad se volatili~a los pulmones. en En ta cetonemia moderada, la pérdida dc cuerpos cetónicos a través de la orina es s610 un pequeño porcentaje de su produccidn y utilización. Coma hay efectos que semejan el renal (aunque no hay verdadero umbral), Ios cuales varían entre especies y personas, In medición de la cetonemia, no de la cetonuria, es el método preferido para valorar la gravedad de la cetosis.

adiposo. Los ácidos grasos son los precursores de los cuerpos cetbnicos en el hígado. Este brgano, tanto en el animal alimentado como en ayuno, tiene la facultad de extraer 30% o más de lbs ácidos grasos libres que pasan a través de él por !o que, cuando hay concentraciones altas de Acidos grasos libres, el flujo por el hígado es sustancial. Por tanto, los factores que regulan la rnovi!i7acirjn de los ácidos grasos desde el tejido adiposo son importantes en el control de la cetogcnesis (figuras 24-9 y 27-9). 2) Uno de dos destinos esperan a los ácidos gracos libres despukc de su captacidn por el hígado y de ser activados a acil-COA: se oxidan en COz o en cuerpos cethnicos, o se esterifican en triacilglicerol y fosfoiipido. La capacidad de esterificaci6n como un factor anticetogénico depende de la disponibilidad, en el hígado, de precursores (figura 26-2) que suministran suficiente glicerol 3-fosfato. No obstante, la disponibilidad de glicerol 3-fosfato no limita la esterificacibn en hígados sin nutrientes. No se sabe si su disponibi1idadchepática es siempre el factor limitante en la esterificación; tamvoco se tiene información critica acerca de si las actividades i vivo de las enzirnac que intervien nen en la esterificacibn son limitantes de la veloci-

LA CETOGENESIS ES REGULADA EN TRES PASOS CR~TICBS
1) Al principio, el control se ejerce en el tejido adiposo. La cetosis no ocurre i vivo a menos que n

haya una elevación concomitante en la concentraci6n de hcidos grasos libres en la circulación que resulta de la lipólisis del triacilglicerol en el tejido

t
..................................
SANGRE

AGL

Cuerpos cetbnicos

Figura 24-9. Regulacibn de la cetogenesic. @ a @, muestra tres etapas cruciales en E via del metabolismo de a los acidos grasos libres (AGL) que determinan la magnitud de la cetogenesis. (CPT-1, carnitina palmitoiltransferasa l.)

dad de reaccibn. Al parecer no es un proceso regulador ya que ni los hcidos grasos librec ni sus intermediarios en la via de esterificación a triacilglicerol (figura 26-2) se acumulan jamás en el hígado. Los hígados con riego sanguíneo de ratas hambrientas oxidaron considerablemente mlis hcidos grasos marcados con C" a ~ 0 ~ cI4 ' "cuerpos cetonicos y esterificaron menos como C'Lacilglicerol que los órganos de ratas nutridas. Estos resultados pueden explicarse por el hecho de que la actividad de la carnitina palmitoiltransferasa 1 en la membrana mitocondrial exterior, regula la entrada de gmpos acilo de cadena larga en las rnitocondrias antes de la beta oxidación (figuras 24-1 y 24-1 0 ) . Su actividad es escasa cuando hay una nutrición adecuada, cuando la oxidacion de hcidos grasos se encuentra deprimida; asimismo, se eleva en ayunas, cuando la oxidación de ácidos grasos aumenta. Malonil-COA es un intermediario inicial en la biosintesis de hcidos grasos (figura 23-l), el cual aumenta en estado de nutrición, .

inhibe a esta enzima, lo cual bloquea la beta oxidacibn. Partanto, cuando lanutrición es adecurula, hay lipogénecis activa y concentración elevada de malonil-COA, que inhibe la carnitina palmitoiltransferasa 1 (figura 24-10). Los ácidos grasos libres, cuando hay nutrición adecuada, entran a la célula hepática en concentraciones bajas y son ecterificados casi en su totalidad a acilgliceroles y transportados fiera del hígado cn Eipoproteinas de muy baja densidad (VLDL, del inglés vepy Iow c l e n ~ lipoproteins). Sin embargo, conforme la i~ concentración de Acidos grasos libres aumenta con el principio de la inanicihn, la acetil-COA se inhibe y malonil-COA disminuye, desinhibiendo a la eanitina palrnitoil-transferasa I. al ticmpo que permite que una cantidad mayor de acil-COA sea beta oxidada. Estos procesos se refuerzan en la inanicibn por una caída en la proporción insulinaJglucag6n. El resultado directo de este decremento es la inhibición de la acetil-Coh carboxirasa en el higado mediante fosforilación covaIente; cl indirecto es el aumento en la lipblisis en el tejido adiposo y la liberacibn dc ácidos grasos libres, los cuales,despuks de su capt a c i ~ n f m a n acil-COA en el higado e inhiben la , acetil-COA carboxilasa (figura 24-1 0). Por tanto, la beta oxidaciiin a partir de los ficidos gmos libres se controla por la compuerta de la camitina palmitoiltransferasa 1 en el interior de la mitocondria, y se esterifica el remanente de la captación de ácidos grasos libres no oxidados. 3) A su vez, la acetil-COA formada en la beta oxidacion se oxida en el ciclo del ácido cítrico o entra en la vía de la cetogénesis para formar cuerpos cetbnicos. Conforme aumenta la concentracibn de ácidos grasos libres séricos, un mayor número es convertido en cuerpos cetonicos de modo proporcional y una cantidad menor es oxidada por la ruta del ciclo del dcido cítrico a COZ.La reparticihn de la acetil-COA entre la via cetogtnica y la de oxidación a COIes regulada de tal modo que laenergia libre total que resulta de la oxidacibn de los hcidos grasos atrapada en e1 ATP, permanece constante. Es posible apreciarlo cuando se considera que la oxidacibn completa de un mol de palmita10 conduce a una producción neta de 129 moles de ATP por la via de la beta oxidacidn y la produccibn de COZen el ciclo del acido citrico (vease antes), en tanto que solo se producen 33 moles de ATP cuando el acetoacetato es el producto final y sólo 21 moles cuando es el 3-hidroxibutirato. Por tanto, la cetogenesis puede considerarse como un mecanismo que permite al higado oxidar grandes cantidades de hcidoc grasos dentro de un sistema de fosforilacion oxidativa al parecer estrechamente acoplado, sin aumentar su gasto total de energía. Se han planteado otras varias hipótesis para explicar la desviación de la oxidación de los acidos

Oxidaci&~ úciu'os grasos: cetog&ne.~is 275 de

AGL
Carbohidratos - ) Acetil-COA - ) Esterificac16n
Acll-CaA

t f

H~GADO

Ac~lgliceroles

ACETIC-COA

.
Glucagon Malonil-COA

Insultna

-.

--. F

CARNITIIVA PALM lTOlL TRANSFERASAj

I

. . .

,

Acil-CzA
beta Oxidacibn

Mitocondria

,

Acetil-COA

-

Coz

Figura 24-10. Regulacion de la oxidacibn de Bcidoc grasos de cadena larga en el higado (AGL, ácidos grasos libres; VLDL, lipoproteinas de muy baja densidad.} Los efectos reguladores, positivos @ y negativo O están representados por líneas punteadas y el flujo de sustrato por líneas continuas.

graso5 de la formaci6n de COzhacia la cetogdnesis. Teóricamente, una caída en la concentracibn de oxalacetato, en particular dentro de las mitocondrias, podria restar capacidad al ciclo del Acido cítrico para metabolizar la acetil-COA. Esto puede ocurrir debido a un incremento en la relacidn ~ADH]/[NAD'], producido a su vez por la elevación de la k t a oxidación, lo cual puede afectar el equilibrio entre el oxalacetato y el malato, con disminución de la concentración del oxalacetato. Krebs ha sugerido que, puesto que el oxatacetato se encuentra tambitn en la vía principal de la gluconeogénesis, lapotenciación de esta, que disminuye la concentración de oxalacetato, puede ocasionar las formas graves de cetosis que se encuentran en la diabetes, así como la cetosis del ganado. No obstante, Utter y Keech han mostrado que la piruvato carboxilasa, que cataliza la conversion del piruvato en oxalacetato, es activada por la acetil-COA. En consecuencia, cuando existen cantidades importantes de acetil-COA, debe haber suficiente oxalacetato para iniciar la reacciiin de condensacion en el ciclo del ácido cit~ico.

ASPECTOS CC~NICOS

La oxidación defectuosa de los ácidos gracos da origen a enfermedades que con frecuencia se acompañan de hipoglucemia

La deficiencia de carnitina puede presentarse en particular en recién nacidos -y de modo especial en lactantes prematuros- debido a hiosíntesis insuficiente o escape renal. Su pérdida también puede darse en hemdiálisis; los pacientes con aciduria pierden grandes cantidades de carnitina, que se excreta conjugada con los acidos orginicos. En algunos individuos, la deficiencia de carnitina indica un requerimiento dietético semejante al de las vitamina. Los signos y sintomas de deficiencia incluyen episodios peribdicos de hipoglucemia causados por la reduccion de la gluconeogénesis que resulta de una oxidación defectuosa de hcidos grasos y de cetogénesis en presencia de concentraciones plasmáticas elevadas de AGL, que conducen a la acurnulaci6n de lipidos con debilidad muscular. El tratamiento es mediante suplementación

oral de carnitina, Los síntomasson semejantes al síndrome de Reye (encefalopatía con degeneracidn grasa de las vísceras), pero en este hltimo las cantidades de carnitina son adecuadas y su origen se desconoce. Por otro lado, la deficiencia de carnitina palmitoiltransferasa 1 afecta sólo al hígado y conduce a reduccion de la oxidacihn de acidos grasos y cetogcnesis con hipoglucemia. Por su pme, la deficiencia de carnitina palmitoi~transferasaF1 afecta de manera primaria al músculo esquelético (debilidad y necrosis con mioglobiniiria) y, en su forma más grave, al hígado. En un patrhn semejante, las sulfonilureas hipoglucémicas (glihurida [glibenclamida]y tolbutamida) reducen la oxidación de iicidos grasos por medio de la inhibición de la camitina palrnitoiltransferasa. Los defectos hereditarios en las enzirnas de la beta oxidación también ocasionan hipoglucemia, coma e higado graso; por ejemplo. la deficiencia de !a beta oxidación-COA deshidrogenasa de cadena larga puede ser una causa de hígado graso agudo en el embarazo. Se conocen bien los defectos en Ios genes para la 3-cetoacil-COA tiolasa. También se han ohservado errores innatos de la cetogénesis, como es el caso de la deficiencia de H MC-COAliasa, la cual también afecta la degradacibn de leucina, un arninohcido cetogénico (capítulo 32). La enfermedad jamaiquina del vbmito es causada por comer fruta sin madurar del árbol a h e (Blighia sapidaj que contiene una toxina, hipoglicina, la cual inactiva a la acil-Co.4 deshidrogenasa de ácidos grasos de cadena media y corta, inhibiendo la beta oxidación y causando hipoglucemia con excreción de ácidos mono y dicarboxilicos de cadena media y corta. La aciduria dicarboxilica se caracteriza por la excreción de Bcidoc omega dicarboxilicos C ~ IyD por la hipoglucemia no cetbtica. Su causa es la falta de acil-COA deshidroeenasa de cadena media en lar " mitocondrias. Esto altera la beta oxidacibn, pero incrementa la omega oxidación de acidos grasos de cadena larga y media, que luego son acortados por la beta oxidacibn, a ácidos dicarboxilicos de cadenas media y corta, !os cuales son excretados. En la actualidad se sabe de deficiencias de acil-COA deshidrogenasas de cadena larga y media, junto con deficiencias de hidroxiacil-COA deshidrogenasa y 2,4-dienoil-COA reductasa, la cual conduce a excreción urinaria de 2-truns-4-crs decadienoilcarnitina como consecuencia de la deficiencia de E beta oxidacibn de ácidos a grasos pol iinsaturados. La enfermedad de Refsum es un trastorno neurolbgico poco común causado por acumulación de ácido fithnico, formado del fitol, un constituyente de la clorofila que se encuentra en alimentos vegetales. El ácido fithnico contiene un grupo metilo en el carbono 3 que bloquea la beta oxidación. Normalmente, una alfa oxidación inicial elimina at grupo metilo, pero las

personas con esta enfermedad tienen un defecto hereditario en la alfa oxidación que permite la aciimulaci6n del hcido fithnico. El sindrorne de: Zellwegcr (cerebrohepatorrenal) se presenta en individuos con una rara ausencia hereditaria de peroxisomas en todos los te,jidos. Este defecto causa la acumulación de ácidos poliénicos Ct6 a Cis en el tejido encefalico, debido a Ia incapacidad para oxidar ácidos grasos de cadcna larga en los peroxisomac, aunque también presenta una perdida generalizada de las funciones peroxisdmicas, como la deficiencia en la síntesis de hcido biliar y de &eres de Iípido~.

La cetoacidosis se debe a la cetosis prolongada
La presencia en sangre u orina de cantidades de cuerpos cetónicos mayores de las normales constituye cetoancmia (hipercetonemia) o cetonuria, respectivamente. El trastorno global se llama cetosis. Los ácidos acetoacético y 3-hidroxibutirico son ácidos moderadamente fuertes y necesitan ser amortiguados cuando se presentan en la sangre o en los tejidos. No obstante, su excreción continua en cantidad produce cierta pbrdida de amortiguamiento catiónico (a pesar de la produccibn de e o n i a c o en el riñón) que agota de manera progresiva la reserva de álcali, causando cetoacidosis, que puede ser mortal en diabetes sacarina no controlada. La forma más simple de cetosis tiene lugar en la inanicihn y se debe a la deplecibn de los carbohidratos disponibles acoplada con la movilizacic5n de ácidos grasos libres. Al parecer, ningún otro trastorno donde se presenta la cetosis difiere cualitativamente de este patrbn general de metabolismo, aunque: en el aspecto cuantitativo puede exagerarse para producir los estados patológicos encontrados en diabetes sacarina, toxernia gravidica en ovejas y cetosis en vacas cn lactancia. Forrnas no patológicas de cetosis se encuentran en condiciones de alimentación rica en grasas y despues de ejercicio extenuante durante el periodo posabsorción.

RESUMEN
1) La oxidaci6n de los ácidos grasos en las mitocondrias produce cantidades abundantes de ATP por un proceso llamado beta oxidacibn, el cual escinde en secuencia las unidades de acetil-COA de las cadenas de acidos grasos. La acetil-COA se oxida en el ciclo del ácido citrico, con formación adicional de ATP. 2) La oxidación de hcidos grasos de un numero impar de carbonos produce acetil-COAmás una molkcula de propionil-COA, que es glucogenica.

OxidaciBn de ácidos grasos: cetogénesis

2 77

3) Los peroxisornas tienen la propiedad de oxidar ácidos grasos de cadena muy larga, pero siilo hasta octanoil-COA que luego debe ser transferido a las mitocondrias para oxidacihn ulterior. 4) Los cuerpos cetónicos (acetoacetato. 3-hidroxibutirato y acetona) se forman en las mitocondrias hephticas cuando hay un índice elevado de axidacion de hcidos grasos. La vía de la cetogknesis comprende la formacion y degradacion de 3hidroxi-3-metilglutaril-COA (HMG-COA) por acc i o n d e dos e n z i m a s c e t o g é n i c a s claves, HMG-COA sintasa y HMG-COA liasa. 5) Los cuerpos cetónicos son energéticos importantes en los tejidos extrahepáticos.

6 ) La cetogdnesis es regulada en tres etapas criticas: a) control de la movilización de acidos grasos
libres del tejido adiposo; b) actividad de carnitina palmitoiltransferasa 1 en el hlgado, la cual determina la proporción del flujo de hcidos grasos hacia oxidación en lugar de esterificacilin; c) reparticion de acetil-COAentre las vías de cetog4nesis y ciclo del Acido cítrico. 7) Las enfermedades relacionadas con el deterioro de la oxidacion de ácidos grasos conducen a hipoglucernia, infiltración de grasa de órganos e hipocetonernia. 8 ) La cetosis es leve en la inanicihn, pero grave en diabetes sacarina y en la cetosis de rumiantes.

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insa+.uñados de A s eicosanoides y o
Peter A. Mayes, PhD, DSc

Comparados con los vegetales, los tejidos animales tienen una capacidad limitada para desaturar a los ácidos grasos. Por esto requieren ingerir en los alimentos, ciertos ácidos grasos poliinsaturados derivados en última instancia de fuentes vegetales. Tales &cidos grasos esenciales dan origen a los acidos grasos eicosanoicos (&),de los que dwivan familias de compuestos conocidos como eicosanoides. Estos constitiiyen las prostaglandinas, los tromboxanos, los leucotrienos y las lipoxinas.

parte, los leucotrienos causan contracción mizccular y tienen propiedades quimiotácticas, que sugieren una intervencicin importante en las reacciones aldrgicas y en la inflamacibn. Se ha identificado a la sustancia de reaccihn lenta de la anafilaxia (SRL-A} como una mezcla de leucotrienos. Variando las proporciones dietkticas de los diferentes Bcidos grasos poliinsaturados, es posible influir en el tipo de cicosanoides sintesiz,ados, lo cual indica que sería posible modifícar el curso de la enfermedad por medio de la alimentacibn.

IMPORTANCIA BIOMÉDICA
El contenida de iicidos grasos insaturados en un lipido natural es un determinante principal de su punto de fusibn y, por tanto, de su fluidez. De modo similar, los fosfolipidos de la membrana celular contienen hcidos grasos insaturados importantes en la conservación de la fluidez de la misma membrana. Una proporción alta de ácidos grasos poliinsaturados a Acidos grasos saturados (proporcibn P:S) en la alimentación es un factor importante para reducir el colesterol plasmático por medios dietéticos y se considera benifico en la prevención de la enfermedad coronaria. Las prostaglandinas y tromboxanos son hormonas locales sinteti~adas con rapidez en el momento en que se necesitan y que actiian cerca de sus sitios de sintesis. Las principales actividades fisiol6gicac de las prostaglandinas son como reguladores de la acci6n de la adenililo ciclasa, por ejemplo, 1 ) en el control de la agregaclon plaquetaria y 2) en la inhibicibn del efecto de la hormona antidiuretica en el riR6n. Los antiinflamatorios no esteroides, como la aspirina, actiian mediante la inhibición de la síntesis dc prostaglandinas. Por su

LOS MAM~FEROS PUEDEN NO SINTETIZAR ALGUNOS ÁCIDOS GRASOS POLIINSATUMDOS POR LO CUAL SON ESENCIALES EN LA NUTRICIÓN

En la figura 25-1 se muestran algunos Iicidos grasos
insaturados de cadena larga, de importancia en el metabolismo de los mamíferos. (Para una revisión de la nomenclatura de los ácidos p s o s , capitulo 16.) Otros ácidos grasos polienoicos de C2n, Cz: y Cz4 pueden detectarse en los tejidos. Estos pueden ser derivados de los ácidos oleico, linoleico y alfa linolénico mediante el alargamiento de las cadenas. Es de notarse que todos los enlaces dobles presentes en los ácidos grasos insaturados naturales en los mamiferos, son de la configuración cis. Los acidos palmitoleico y oleico no son esenciales en la alimentacidn, debido a que los te.jidos pueden introducir una doble ligadura en la posicidn A9 en el Acido graso saturado correspondiente. Los experimentos con el palmitato marcado han demostrado que la marca penetra libremente al interior

dobles ligaduras en las posiciones A ~ A ~ A6 y A' , , (contando desde la terminal carboxilo: capítulo 163. pero nunca más allá de la posición A'. Por el contrario, los vegetales pueden introducir dobles ligaduras en las posiciones &'l y A", y de esta manera pueden sintetizar acidos grasos esenciales en la nutrición.

LOS ÁCIDOS GRASOS MONOlNSATURADOS SE SINTETIZAN POR UN SISTEMA DE DESATURASA A'
En cuanto a los ácidos grasos monoinsaturados no esenciales, se considera que varios tejidos incluyendo al hígado, se encargan de su forrnacibn a partir de ácidos grasos saturados. La primera doble ligadura introducida en un acido graso saturado es siempre en las cercanias de laposicibn A'. Un sistema enzimAtico, A9 desaturasa (figura 25-2), en el retículo endoplacCOOH
20

Estearoil-COA+ Enzima

*Acido amquidbnico (cii6. 20.4, d5,B,11-14

Estearoil-Enz Ácido eicosapentaenoico ((03.20:5.A ~ ~ ~ ~ ' . ~ ~ , ~ f

Figura 25-1. Estructura de algunos ácidos grasos insaturados. Aunque los átomos de carbono en las moléculas ecthn numerados de manera convencianal, es decir, a partrr del carboxilo terminal, los números m (porejemplo, w 7 en el Acido pafmitoleico) se calculan desde el extremo opuesto (del metila terminal) de las mol8culas. La informacibn entre paréntesis muestra, por ejemplo, que el acida U-linolénica contiene dobles ligaduras comenzando en el tercer carbono desde el metila terminal, su cadena es de 18 carbonos w n tres dobles ligaduras en los carbonos novena, duodécimo y decimoquinto desde el carboxilo temlnal ("Clasificado como "hcido graso esencial".)

de los acidoc pahitolcico y oleico, pero se haya ausente de los ácidos Iinoleico, y alfa linolénico. Estos son los únicos ácidosgmos conocidosque son esenciales para lanutricion completa de muchas especies de animales. incluyendo al ser humano, por lo que deben incluirse en la dieta; en consecuencia se conocen como Acidos grasos esenciales en la nutrición.El acida araquidónico puede formarse a partir del hcido linoleico en la mayoria de los mamíferos (figura 2 5 4 ) , pero no en los felinos, donde debe clasificarse como ricido graso esencial. En la mayoria de 10s animalec, es posible introducir

COA SH hansferasa

Oleil-COA+ Enzima

Figura 25-2. Sistema de desaturasa rnicrosbmica 3"

Mefabolismo de los Ucidos

graso.^

iniaturadmy de los eico.~anni&s 28 1

mico catalizara la conversi611 de palmitoil-CoA o estearoil-CoA en palmitoleil<oA y oleiE<aA, respectivamente. El oxigeno, NADPH o el NADH son necesarios para la reaccibn. Las enzimas parecen ser las de un sistema típico de monooxigenasa que involucm al citocromo hs (hidroxilasa; capitulo 13).

LA S~NTESIS ÁCIDOS GRASOS DE POLIINSATURADOS IMPLICA A LOS SISTEMAS ENZIMATICOS DE DESATURASA Y ELONGASA
Los dobles enlaces adicionales introducidos en los ácidos grasos monoinsaturados siempre se separan uno de otro por un grupo metileno (intempcidn metilénica), excepto en las bacterias. En los animales, los enlaces dobles adicionales son introducidosentre el enlace doble existente y el grupo carboxilo, pero en las plantas pueden tambien ser introducidos entre el enlace doble existente y el carbono omega (metito terminal). Así, dado que los animales tienen una A' desaturasa, son

capaces de sintetizar completamente la familia omega 9 (ácido oleico) de ácidos grasos incaturados mediante una combinación de alargamiento de la cadena y desaturacion (figura 25-3 ). Sin embargo. puesto que son incapaces de sintetizar ácidos linoleico (omega6) o alfa IinolCnico (omega3), al estar ausentes las desaturasas necesarias, estos hcidos necesitan ser surninistrados en la dieta para que se efectúe la síntesis de los demás miembros de la familia omega6 y omega3 de los ácidos grasos poliinsaturados. El linoleato puede convertirse en araquidonato (figura 2 5 4 ) . Al principio, la vía es por deshidrogenacibn del éster COA a aavks de gamma linolenato, seguida por la adición de una unidad de dos carbonos de la malonil-COA en el sistema microsiimico de alargamiento de las cadenas (figura 2 3 4 ) ) ,para producir eicosatrienoato (dihomo gamma linolenato). Este último forma araquidonato mediante una deshidrogenacibn ulterior. El sistema deshidmgenantc es semejante al descrito antes para los acidos grasos samrados. El requerimiento nutricional para el araquidonato puede, por tanto, omitirse cuando hay linoleato en la alimentación.

Acido

.r

; 18.2

-

20:2

*

20:J----+

22:3

m--+-

+ 22-4

la deficiencia de acidos grasos

esenciales

20.2
E

/@
I

I I Ácido a-linolbnico

Figura 2 5 3 . Biosintesis de las series w9,(06 y m3 de Bcidos grasos poliinsaturados.Cada paso es cataltzado por los cisternas rnicros6rnims de alargamiento de la cadena o sistema desaturasa. Los Bcidos grasos poliinsaturados m 9 sólo se vuelven cuanttativamente importantes cuando los ácidos Iinoleico y a-linol&nico se restringen en la dieta Esto se debe a que cada serie compite por los mismos sistemas enzirnátims y las afinidades decrecen desde la familia 0 3 a la 09. inhibicibn).

(e,

o
C-S - C O A
IB

II

O7

+

NADH

+ H+,,

1

(Maionil-COA,NADPH)

DE AiARGAMIEN'TO

O7

+

NADH

+ Ht-,

1

C-S
m

-COA

Figura 2 5 4 . Converstbn del linolealo en araquidonato. Los gatos no pueden reafizar esta wnversibn ya que no poseen ri6 desaturasa y deben recibir araquidonata en su atimentacibn.

La desaturacibn y el sistema de alargamiento de las cadenas están muy disminuidos en el estado de ayuno, en la administración de glucagón y adrenalina y ante la falta de insulina como en la diabetes sacarina tipo 1.

CUANDO LA DIETA CARECE DE ÁCIDOS GRASOS ESENCIALES (AGE), SE PRODUCEN SINTOMAS DE DEFICIENCIA
En 1928, Evans y Burr notaron que las ratas alimentadas con una dieta purificada libre de lipidos a la cual se habían afíadido las vitaminas A y D, manifeszaban reduccibn de lavelocidad de crecimiento y deficiencia reproductiva. Trabajos posteriores mostraron que el sindrome de deficiencia se curaba mediante la adicibn de hcidos linoleico, alfa linolénico y araquidbnico a la alimentaci6n. Posteriores características diag-

n6sticas del sindrome incluyen piel con escamas, necrocis de la cola y lesiones en el sistema urinario, aunque el trastorno no es mortal. Estos ácidos grasos se encuentran en concentraciones altas en diversos aceites vegetales (cuadro 16-21 y en cantidades pequeiias en los canales de animales. Las funciones de los ácidos grasos esenciales parecen ser diversas, aunque no bien definidas, ademas de la fomaci6n de prostaglandinas y leucotrieno (vease después). Los hcidos grasos esenciales que se hallan en los lipidos estructurales de la cklula se relacionan can la integridad estructural de la membrana rnitocondrial. Las membranas celulares contienen hcido araquid6nico que constituye entre S y 15% de los hcidos grasos de fosfolípidos. El ácido docosahexaenoico (DHA; ornega3,2:6),que se sintetiza a partir de Acido alfa linolknico o se obtiene de manera directa de aceites de pescados, existe en concentraciones elevadas en la

Metaboll~mo los ácidos grasos insaturudosy de los eico.~anoides 283 de

retina,la cortezacerebral, tos testículosy e! esperma El DEIA se requiere en particular durante el desarrollo cerebral y es suministrado a través de la placenta y la leche. Los segmentos exteriores de los bastones de la retina contienen concentracionesmuy altas de DHA; la mayoria de los fosfolípidos contiene al menos rnolkculas de éste. Al parecer la gran fluidez resultante se necesita para el funcionamiento de la rodopsina, que consiste en activacion por un fotbn que produce movimientos laterales y rotatorios dentro de la membrana. En los pacientes con retinitis pigmentosa se encuentran valores sanguíneos bajos de DHA. Los recikn nacidos prematuros tienen una baja actividad de A4 desaturasa, lo cual reduce su capacidad para sintetizar DHA a partir de precursores de ácidos grasos n-3. En muchas de sus funciones estructurales, los ácidos grasos esenciales se hallan presentes en los fosfolipidos, principalmente en E posición 2. En la defia ciencia de hcidos grasos esenciaIes, los hcidos pol ienoicos no esenciales de la serie omega9 reemplazan a los ácidos grzisos esenciales en los fosfolipídos, otros Iípidos complejos y membranas, en particular el hcido A'.*.' '-eicosatrienoico (figura 25-31, Pasa diagnosticar el grado de deficiencia de los ácidos grasos esenciales puede usarse la proporción trieno:tetraeno en los lipidos plasmáticos.

LOS EICOSANOIDES SE FORMAN DE ÁCIBOS GRASOS BOLllNSATURADOS C20
El araquidonato y algunos otros ácidos grasos Czocon enlaces interrumpidos por metilenos dan origen a los eicosanoides, compuestos activos de manera fisiológica y famacológica, conocidos como prostaglandinas (PC), trornboxanos (TX) y leucotrienos (LT) y aipoxinas (LX) (capítulo 16). En el aspecto físiológico, sc considera que actiian como hormonas locales que funcionan a travds de receptores enlazados a proteína G para estimular sus efectos bioquímicoc. El araquidonato, que habitualmente deriva de la posición 2 de los fosfolípidos de la membrana plasmhtica, como resultado de la actividad de la focfolipasa A2 (figura 26-6), es e[ sustrato para la síntesis de los compuestos PGz, TX2,LT4 y LXs. Sus vías metabólicas son divergentes, compitiendo la síntesis de las series PG2 y TX: (prostanoides) con la de LT4 y LX4 por el sustrato araquidonato. Estas dos vías se conocen respectivamente como la via de la ciclooxigenasa y la de la lipoxigenasa (figura 25-5). Hay tres grupos de eicosanoides (cada una conteniendo PG, TX, LT y posiblemente LX) que con sintetizados de ácidos eicosanoicos Czoderivados a partir de los ácidos grasos esenciales, linoleato y alfa tinolenato, o directamente del araquidonato y eicosapentaenoato en la dieta (figura 2 5 4 ) .

Los ácidos grasos trans pueden

competir con ácidos grasos cis
Se han encontrado pequehas cantidades de ácidos p o s con insaturación truns en las grasas de los rumiantes, donde se originan por la accihn de los rnicroorganismos en et turnen; pero la presencia de cantidades abundantes de ácidos grasos trans-insaturados en los aceites vegetales parcialmente hidrogenados (por ejemplo, margarina) plantea la interrogante respecto a su seguridad como aditivos de alimentos. Sus efectos a largo plam en el ser humano son dificiles de valorar, aunque han estado en la alirnentaci6n humana por muchos aííos. Hasta 15% de hcidos grasos tisulares se han hallado en la configuracibn bram durante las necropsias. Sin embargo, hasta la fecha, ningún efecto grave ha sido comprobado. Son metabolizados más como hcidos saturados que como hcidos insaturados de forma cis. Esto puede deberse a su conformaci6n semejante de cadena lineal (capitulo 16). A este respecto, tiende a elevar las concentraciones de LDL y bajar las de HDL y por tanto se contraindican en relación con el incremento de aterosclerosisy enfermedad coronaria. Los hcidos grasos trans-poliinsaturados no poseen actividad de ácido graso esencial por lo que pueden antagonizar el metabolismo de los hcidos grasos esenciales y agravar su deficiencia.

LA S~NTESIS PROSTANOIDES DE SE E F E C T ~ A POR LA V ~ A DE LA CICLOOXIGENASA
La sintesis de prostanoides (figura 25-7) implica el consumo de dos moléculas de 0 7 catalitadas por la prostaglandina-endoperbxidosintasa, la cual posee dos actividades enzimhticas separadas, cidooxigenasa y peroxidasa. El producto de la vía de la ciclooxigmasa,, un endoperóxido (PGH), es convertido en las prostaglandinas D, E y F así como en el tromboxano (TXAz) y la prostaciclina (PGI2). Cada tipo celular produce una sola clase de prostanoide. La aspirina, la indometacina y el ibuprofeno inhiben a la ciclooxigenasa.

La actividad de los ácidos grasos esenciales y la producción de prostaglandinas está correlacionada
Aunque existe una notable comlaci6n entre Ia actividad de ácido graso esencial en varios hcidos grasos y su propiedad de convertirse en prostaglandinas, al parecer los hcidos grasos esenciales no ejercen todos sus efectos fisiolbgicos a travds de la síntesis de estas últimas. La fÜnci6.n de los ácidos grasoc esenciales en

Fosfollpldo de la membrana

, estimulos. oor Varios

ejemplos, angiotensina II.

FOSFOLtPhm

bradicinina,adrenalina. trombina

o \

Corticosteroides antiinflamatorios

Leucotrienos y llpoxlnas

Brostaglandinas y tromboxanoc

Aspirina lndometacina Ibuprofeno

Figura 2 5 6 . Conversión del Acido araquidbnico en prostaglandinas y tromboxanos por la vía de la ciclooxigenasa y en leucotrienos y lipoxinas por la vía de la Iipoxigenasa. El esquema indica por q J los esteroides que inhiben la produoción total de los eicocanoides, son mejores agentes antiinflamatorios que los medicamentos análagos de la aspirina, los cuales sblo inhiben la via de la ciclooxigenasa. Se piensa que los antiinflamatorios esterordes inhiben la fosfolipasa A2 por ~nduccibn de
una proteína rnhibidora llamada Iipocortina

la fortnacibn de membranas no se relaciona Con la formacidn de prostaglandinas, las cuales no alivian los síntomas de deficiencia de los hcidas prasos esenciales y un sindrome por esta deficiencia no es causado por inhibicibn crbnica de síntesis de prostaglandinas.

La ciclooxigenasa es una "enzima suicida"
La "suspensibn" de la síntesis de prostaglandinas se logra en parte por una propiedad notable de la ci-

clooxigenasa: la de catalizar su propia destt-ucci~n; es decir, es una "enzima suicida". La inactivacibn de las prostaglandinas es ripida. La presencia de la enzima 15-hidroxiprostaglandina deshidrogenasa en l a mayoría de los tejidos de mamíferos es quizh la causa de principal. El bloqueo de la a c c i ~ n esta enzima con sulfasalacina o indometacina puede prolongar la vida media de las prostaglandinas en el cuerpo.

Ieucotrienos. El primero en ser sintetizado es el Ieucotrieno As,que a su vez es metaboli~ado leucotrieno a R4 o a C4. Este ultimo se forma por la adicibn del péptido glutation mediante un enlace tioéter. L a eliminación subsecuente del glutamato y la glicina genera en secuencia a los leucotrienos D y L. s Las lipoxinas con una familia de tetraenos conjugados tambKn presentes en los leucocitos. Se forman por la acciiin combinada de una lipoxigenasa, que introduce mas oxigeno en la molecuIa. Varias lipoxinas (LXA4 a LXE4) se forman de manera similar a la descrita antes para los leucotrienos.

ASPECTOS CL~NICOS

El ser humano también muestra síntomas cuando tiene deficiencia de ácidos grasos esenciales
En seres humanos cuyas dietas carecen de los ácidos
grasos esenciales, se-observan síntomas cutheos y deterioro del transporte de lipidos. En los adultos que subsisten con alimentacion ordinaria, no se ha informado de signos de deficiencias de Acidos graos esenciales. Sin embargo, lactantes a~imentadosconf6rmulas pobres en grasas, desarrollaron defectos cutaneos que se curaron mediante la administracibn de linoleato. Las deficiencias atribuibles a falta de ácido5 grasas esenciales. incluyendo ácido alfa Iinolénico, ocurren también en pacientes que reciben exclusivamente nutricion intravenosa pobre en lipidos por periodos Iargos. La deficiencia puede prevenirse mediante la ingestión de un ticido graso esencial de I a 2% del requerimiento calórico total.

LOS LEUCoTRIENoS Y LAS LIPOXINAS SE FORMAN POR LA VIA DE LA LlPOXlGENASA
Los leucotrienos son una familia de trienos conjugados que se forman a partir de hcidos eicosanoicos en los leucocitos, cilulas de los rnastocitomas, plaquetas y macrófagos por la vTa de la Iipoxigenasa en respuesta a estimulos inmunologicos y no inmunoIógicos (figura 25-31. Tres diferentes lipoxigenasas (dioxigenasas) insertan oxigeno en las posiciones 5, 12 y 15 del ácido araquidbnico, dando origen a hidroperoxidos (HPETE). Solo la 5-lipoxigenasa forma

Metabolismo de los ácidos graaTosinsulzarudo.~ de los eicosanoides y

285

Dieta

1
y-linolenato

kPC
B , l l,l4-Eiwsatrienoato

(dihorno-7-linolenato)

f icosatstraenoato

Eicosatetraenoato
\ Octadecatetraenoato
5,$,11,14,17-

Eiwsapentaenoato

Dieta

t

Dieta

t

Figura 2 5 6 . Los tres grupos de eicosanoides y sus orígenes biasint&ticos. (PG, prostaglandina: PGI, prostaciclina; TX, trornboxano; LT, leucotriene, U ,lipoxina; @ vía de la ciclooxigenasa; @ via de la Iipoxigenasa.) El subíndice denota el ( numero total de dobles ligaduras en la molécula y las series a las cuales pertenece el compuesto.

En varias enfermedades e! metabolismo de ácidos grasos esenciales es anormal
Ademb de la deficiencia de icidos grasos esenciales y de los cambios en los patrones de acidos grasos insatwrados en la desnutrición crónica, se ha observado un metabolismo anormal de hcidos grasos esenciales, el cual puede estar conectado con insuficiencia dietktica en la fibrosis quisrica, acrodermatitis enteropatica, síndrome hepatorrenal, síndrome de Sjtjgren-Larsson, degeneracion neurona1 multisistimica, enfermedad de Crohn, cimsis y alcoholismo y en el síndrome de Reye. En los cerebros de pacientes con el síndrome de Zellweger (capítulo 24) se han encontrado concentraciones elevadas de ácidos polienoicos de cadenas muy

largas. Las dietas con una alta proporción P:S (ácidos grasos pol iinsaturados: saturados) reducen las concentraciones del colesterol sérico. en particular en las lipoproteinas de baja densidad. Esto se considera benéfico en vista de la retacion entre la concentración sbrica de colesterol y la enfermedad coronaria.

t o s prostanoides son potentes sustancias biológicamente activas

Los tromboxanos se sintetizan en las plaquetas y su liberación produce vasoconstricción y agregacibn
plaquetaria. Las prostaciclinas (PG12) son producidas por las paredes de los vasos sanguíneos y son potentes inhibidorec de la agregación plaquetaria. Por tanto, tromboxanos y prostaciclinas son antagónicos

286 Bioquirnica de Harper

(Capítulo 23)

COOH

Araquidonato

*

8Aspirina
Indometactna

lbupmfeno

6-ceto PGFl,

COOH

OH

OH

OH

OH

Figura 25-7. Conversibn del heido araquidbnica en prostaglandinas y tromboxanos de la serie 2. (PG, prostaglandina. TX, tromboxano, PGI, prostaciclina, HHT, hidroxiheptadecatnenoato.)' (Lasdos adivklades se atnbuyen a una enzima, prostaglandina endoperbxido stntasa. Conversiones semejantes tienen lugar en las prostaglandinas y tromboxanos de la sene 1 y 3).

L,a escasa frecuencia de cardiopatias, la agregacibn plaquetaria disminuida y los tiempos prolongados de coagdacibn de los esquimales de Groenlandia se han atribuido a su elevada ingestion de aceites de pescado que contienen205 omega 3 (EPA o ácidoeicosapentaenoico), el cual da origen a la serie 3 de las prostaglandinas (PG3)y de los tromboxanos TX3 (figura 2 5 4 ) . La PG3 y el TX, inhiben la liberacibn de araquidonatos de los fosfollpidos y la ~onfomaci6n PGz y TXz. La PGI, de es tan potente como antiapgador plaquetario como la PGI2;pera el TXA3 es un agregador más dkbil que e E TXA2; par tanto, el equilibrio de la actividad est6 desplazada contra la agregacibn. Ademas, las concentraciones plasmhticas de colesterol, triacilglicerol y de las lipoproteinas de baja densidad y de muy baja densidad, son todas bajas en los esquimales, en tanto que las de lipoproteinas de alta densidad esthn elevadas; se considera que todos estos factores operan contra la aterosclerosis y el infarto del miocardio.

Concentraciones de prostaglandinas tan pequehas como de 1 ng/mL provocan la contraccibn del músculo liso en los animales. Los usos terapéuticos potenciales incluyen la prevencirin de la concepcihn, la induccibn del parto a tkrmino, la terminación del embarazo, la prevencibn o alivio de las úlceras gástricas, el control de la inflamacibn y de Ia presión arteria1 y el alivio del asma y de la congestión nasal. Las prostaglandinas aumentan el cAMP en las plaq w , tiroides, cuerpo lúteo, hueso fetal, adenohipófisis y pulmones, pero lo disminuyen en las dlulas de los tiibuloc renales y en el tejido adiposo (capítulo 27).

Los leucotrienos y las lipoxinas son potentes reguladores de muchos
procesos patológicos

La sustancia de reaccibn lenta de la anafilaxia (SRL-A) es una mezcla de los leucotrienos G, D4y E4. Esta

Merahnlismn de los úcrdos grusos insaiurados y de los eicosunoides

287

COOH

+

COOH

Leucotrieno 8 4

Acido glutamico

b

-/

Leumtrieno &

Lipoxinas. es decir. LXA4

Giutat'6n

Cisteina

Leucntrieno C4

Leucotrieno D4

Leucotrieno E*

Figura 25-8. Conversidn del Acido araquiddnico a leucotrienos y Iipoximas de la serie 4 por la via de la lipoxigenasa Algunas conversiones similares se presentan en las serres 3 y 5 de los leucotrienos. (HPETE, hidroperoxieicosatetraenoato, HETE, hidroxieicosatetraenoato) @ peroxidasa, leucotrieno A4 epdxldo hidrolaca, @ @utatibn S-transferasa; @ y-glutamrRransferasa,@ ~isteinilglicina dipeptidasa.)

a

mezcla es entre 100 y 1000 veces más potente que la histamina o las prostaglandinas como constrictor de la musculatura de las vias respiratorias bronquiales. Estos leucotrienos junto con el Bd provocan también la permeabilidad vascular, la atraccibn y activacibn de los leucocitos y parecen ser reguladores importantes en numerosos trastornos que invoiucran reacciones inflamatorias o de hipersensibilidad inmediata como el asma. Los leucotrienos son vasoactivos y la 5lipoxigenasa se ha encontrado en las paredes arteriales.

Existen pruebas de que las lipoxinas participan en las funciones vasoactivac e inmunosreguladoras, por ejemplo, como contrarreguladores (chalonas} de la respuesta inmunitaria.

RESUMEN
1) La biosintesis de los iicidos grasos insaturados de cadena larga se logra por medio de la combinación

288 Bioquim ica de Harper

(Capitulo 25)

de enzimas desaturasas, que introducen dobles ligaduras, y enzimas elongasas, que alargan las cadenas acilo existentes en dos carbonos por vez. 2) Los animales estan restringidos a desaturasas A ~ , A', A' y A ~ lo cual no les permite introducir dobles , ligaduras m i s alla de la posición 9 de los hcidos grasos. La consecuencia es que no pueden sintetizar ácidos linoleico (o6)y alfa linolénico ( 0 3 ) y deben recibirlos en la dieta. Estos se conocen como acidos grasos esenciales. 3) Los acidos g a s o s esenciales dan origen a ácidos Czo(eicosanoicos) a partir de los cuales se sintetizan grupos muy importantes de compuestos con

actividad fisioIógica y farmacol6gica: los eicosanoides, los que comprenden prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos y lipoxinas. Los dos primeros se sintetizan por la vía de la glucooxigenasa (inhibida por la aspirina); tos leucotrienos y las lipoxinas se sintetizan en la vía de la lipoxi-

genasa. 4) Dado que a partir de los ácidos grasos esenciales se sintetizan grupos diferentes de eicosanoides, el equilibrio entre los efectos fisiológicos de los diversos eicosanoides puede ser manipulado cambiando la composición de acidos grasos de la alimentacihn.

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t o r ~ )Benjamin/Cumrnings, 1'185. .

Peter A. Mayes, PhD, DSc

Los acilgliceroIcs constituyen la mayoria de los lipidos en el cuerpo. Los triacilgliceroles son tambikn los lipidos principales locatizados en los depositos de grasa y en los alimentos. Además, los acilgllceroles, en particuiar los fosfolipidos, son componentes importantes de la membrana plasmhtica y de otras membranas. Por su parte, los fosfolipidos intervienen en el metabolismo de muchos lípidos. Los glucoesf3ngolipidos, que contienen esfingosina, residuos de azúcares y ácidos grasos, forman de 5 a 10% de los lipidos de la membrana plasrnática.

man parte del glucocáliz de la superficie celular y se consideran importantes: 1) en la comunicacián intercelular y contacto; 2) como receptores para las toxinas bacterianas (por ejemplo, la toxina que causa el cólera). y 3) como sustancias de los grupos sanguíneos ABO. Se ha descrito aproximadamente una docena de enfermedades por almacenamiento de glucolipidos (por ejemplo, la enfermedad de Gaucher y la de Tay-Sachs) que se deben a deficiencias en la enzima hidrosiiasa de la via que degrada los glucolipidos en los lisosomas,

EL CATABOLISMO DE LOS AClLGLlCEROLES NO ES EL PROCESO INVERSO DE LA BIOS~NTESIS
La función del triacilglicerol en el transporte y almacenaje de los lipidos y en varias enfermedades como la obesidad, diabetes e hiperlipoproteinemia se describirá con detalle en los capitulas siguientes. Los fosfogliceroles, fosfoesfingolípidos y glucoesfíngolipidos, son todos anfipáticos y por tanto, idealmente adecuados como constituyentes lipidicos principales de la membranaplacrnatica. Algunos fosfolípidos tienen funciones especializadas; por ejemplo, la dipalmitoil lecitina es el componente principal del surfactante pulmonar, cuya ausencia en los lactantes prematuros provoca el sindrome de insuficiencia respiratoria del recien nacido. Los fosfolípidos de inositol actúan como precursores de los segundas mensajeros de las hormonas y el .factor activador de plaquetas es un alquilfosfolipido. Los glucoesfingolIpidos, que se encuentran en la capa externa de la membrana placmhtica con sus cadenas de oligosaclidos protuberante$, for-

El catabolismo del triacilglicerol comienza con la hidrólisis
Los aiacilgliceroles deben ser hidrotizados a sus ácidos grasos constituyentes y glicerol por las lipasas antes de proseguir con su catabolismo. G a parte de rn esta hidrhlisis tiene lugar en el tejido adiposo con la liberación de acidoc grasos libres en el plasma, donde se hallan combinados con la albúmina sérica. Esto va seguido por la absorcibn de ácido graso libre en los tejidos y la oxidacidn subsiguiente o su reesterificación. Muchos tejidos (incluyendo hígado, corazbn, rifiiin, mhsculo, pulmones, testiculos, encéfalo y tejido adiposo) tienen la capacidad de oxidar a los Acidos grasos d e cadena larga aunque el encéfalo no puede extraerlos fAcilmente de la sangre. La utilización del glicerol depende de la posesion por parte de dichos

290

Rioquimica de ffuvper

(Capítulo 26)

tejidos de la enzima activante glicerol cinasa. ],a enzima ha sido hallada en cantidad significativa en el higado, el riiihn. el intestino, el tejido adiposo pardo y la glhndiila mamaria en lactancia.

LOS TRIACILGLICEROLES Y FOSFOGLICEROLES SE FORMAN POR ACILACIÓN DE FOSFATOS DE TRIOSAS
En la figura 26-1 se delinean las vías principales de la biosíntesis de triacilgliceroles y fosfogliceroles. A partir del glicerol 3-fosfato se forman numerosas sustancias importantes que desempeñan funciones vitales en el metabolismo celular. Estos compuestos van de reservas importantes de triacilgticerol a derivados fosfatidilos de colina, etanolamina, inositol y cardiolipina, un constituyente de las membranas rnitocondriales. Hay dos puntos de ramificacihn importantes en los pasos intermedios de fosfatidato y diacilglicerol. Del fosfato d e dihidroxiacetona derivan fosfogliceroles que contienen un enlace kter ( 2 - 0 4 - 1 , de los cuales los mejor conocidos son los plasmal6genos y el factor activador de plaquetas (PAF, del inglks, plo~eletaclivafing factor). Debe hacerse notar que el glicerol 3-fosfato o fosfato de dihldroacetona deriva, o es un miembro. de la via de la glucólisis, lo cual sefiala una conexibn muy importante entre los carboy hidrato~ el metabolismo de los lípidos.

ser invertidas en el laboratorio, éste no es el mecanismo por el cual se sintetizan los acilgliceroles en los tejidos. 'ramo el glicerol como los k i d o s grasos deben ser activados por el ATP antes de incorporarse a los aci~glíceroles.La glicerol cinasa catalizará la activación de glicerol a sn-glicerol 3-fosfato. Si esta enzima se halla ausente, o esti baja en actividad como ocurre en el músculo o en el tejido adiposo, la mayor parre del glicerol 3-fosfato debe derivarse de un intermediario del sistema glucolítico, el fosfato de dihidroxiacetona, que forma glicerol 3-fosfato mediante reducción con NADH catalizada por la gliccrol3-fosfato deshidsogenasa (figura 26-2).

A. Biosintesis de triacilgliceroles
Los ácidos grasos son activados a a c i l 4 o A por la enzima acil-CoA sintetasa, utilizando ATP y COA (capitulo 24). Dos moléculas de acil-COA se combinan con glicerol 3-fosfato para formar fosfatidato (1,2diacilglicerol fosfato). Esto se Ileva a cabo en dos etapas mediante la vía del lisofosfatidato, catalizada primero por glicerol 3-fosfato-aciltranskrasa y luego por la l~cilglicerol-3-fosfato~ciltransferasa. E1 fosfatidato es transformado por la fosfatidato fosfohidrolasa a 1 ,S-diaciIglicerol. Una nueva rnoldcula de acil-COA se esterifica con diacilglicerol para formar un triacilglicerol, catatizada por diaciIgliceml aciltransferasa. En la mucosa intestinal, existe una via del monoacilglicerol, mediante la cual este es convcrtldo en 1,24iacilglicerol como resultado de la presencia de monoacilglicerolaciltraneferacia. La mayor parte de la actividad de estas enzimas reside en el retículo endoplásrnico celular, pero parte se encuentra tambikn en las mitocondrias, por ejemplo. la glicerol3-fosfato aciltransferasa. La actividad de la fosfatidato fosfohidrolasa s e encuentra principalmente en la fraccidn sobrenadante libre de partículas pero tambien est8 iinida a la membrana.
dihidroxiacetona

El fosfatidato es el precursor común en la biosíntesis de triacilgliceroles muchos fosfociliceroles Y cardiolipinas Aunque las reacciones en las que interviene la hidrdlisis de los triaciIgliceroles por la lipasa pueden
Glicerol 3-fosfato

T Fosfato de

Fosfatidato

plasmalbgenos

PAF

~iac~lgliCer~l

Fosfatidilinositol

Cardiolipina

Fosfatidiluilina. fosfatidiletanolamina

1

Triacilglicerol

1

\

4,5-Bisfosfato de fosfatidilinositol

Figura 26-2. Panorámica de la biosíntesic del acilgltcerol y fosfoglicerol (PAF, factor activador de ptaquetas )

ATP

H?p-OH HO-C-H

\

ADP

NAD'

) , ,

H.?-0: HO-C-H

\) ,

NADW t Ht

;,y-OH
C=O

I

H~C-OH

~GL~CEROL NASA~ C~

I

H~C-O-B

Glicerol

sn-Glicerol 3-íosfato

Aul-COA (pnncipalmeniesaturada)

E_
3-fosfato
dah'drOgenasa

H,C-O-@

I

--

* GIucbI~sis

n~Fosfato e ~ d dlhidroxiacetona

H2C-O-C-R,

I
I

m3-CH

n,c -OH
I
&-C-0-C-H

&-a-@
1-Acilglicerol 3-hfata (Ilsoíosfaiidam) mt ge (;F he en l-;! r F
7-Act@licemr
insaturada\

II
O

I
H~C-OH

2-Monoaolgliceml

AUI-COA acl~ansfwesa

a~ittransbm

H,C-O-C-R1 Cn A R2-C-O-C-H

I I

I I
O

n,c-O-@

1,2-DiaciiglicerolCdina

CTP

Fosfwolina
HIC-O-C-R,

I I

HPC-O-C-R, R,-C-O-C-H II I a H,C-O-@-@

&-C-O-C-H

I

H
O

H.WH

1.2-Diacilgliceml

I INOStTOL

CMP
H?C-O-C-R, H2C-O-C-R, HIC-O-C-R, R,-C-O-C-H
O

~~-c-a-c-n
II I
O

I

&-c-o-c-H
'i
O
1

I
1

o
II

I
I Lb

H,C-O-C-R1 R,-C-O-C-H

Il

I I

HIC-O-@

H,C-O-C-n3
Triaalglwml

II

H,C-O-@

Colina Fosfatdilcolina

I Inositol Fosfa~ilinositol

o ~~C-~-e)-l~~~it~l-@i 4-Fosfato de fosf&tidilrnositol

Fosratdiletanolarnln.

4DP

Fosfatdrkenne
O

H~C-O-C-A,
I

&-C-O-C-H

II

I

H ~ C O-

-

@- fnasifol- @

@
4,5=Bisfosfato loslatidilinosiiol de

I

Figura 26-2. Biocintesisdel triacilglicerol y f m b l í p i d o s Vía del monoaulglicerol. V í a del glicerol focfato. La fosfa tidiletanolam i n a puede formarse a partir de la e t a n o l a m i n a por una via srmilar a la mostrada p a r a formación de focfatidilcolina a partir de colina

0

(Capitulo 26j

B. Biosintesis de fosfogliceroles
!:$tos festblipidos son sinteti7;idos a partir de fosfatidato: por ejemplo. el fosfatidilinositol, o a partir del 1,2-diacilglicerol como la fosfatidilcolina y la fosfatidiletanolamina. En la sintesis de fosfaiidilinositul, tsifosfato de citidina (CTP, del ingles, cytidine friphosphate) un fosfato de alta energía, formado a partir de ATP (capítulo 12) reacciona con fosfatidato para formar citidina4ifosfato4iacilgiicerol (CDPdiacilglicerol). Finalmente, este compuesto reacciona con hositol, cataliziida la reaccibn por Ia enzima CDP-diacllglicerol inositol transferasa para formar fosfatidilinositol (figura 26-2). Por fosforilaciones sucesivas, el fosfatidilinositol es iransformado primero a fosfatidilinositol4-fosfato y despuds a fosfatidilinositol 4,5-bis~osfato. Este ultimo es desdoblado en diacilglicerol y trifosfato de inositol por las hormonas quc incrementan [Ca"], por ejemplo, vasopresina. Estos dos productos actúan como segundos mensajeros en la acción hormonal (capítulo 44). En la biosintesis de )a fosfatidilcolina y la fosfatidiletanolarnina (lecitinas y cefalinas), la colina o la etanolamina deben primero convertirse a "colinaactiva", o a "etanolamina activa", respectivamente. Este es un proceso en dos etapas, que implica primero, una reaccibn con ATP para formar el monofosfato correspondiente, seguida de una reacción con el CTP para formar citidina difosfocolina ( C D P ~ o l i n a o citidina ) difosfoetanolmina (C&P+tanolamina). En esta forma, cualquiera de ellas reacciona con el 1,24iacilglicerol de manera que una base fosforilada (ya sea fosfocolina o fosfoetanolamina) es transferida al diacilglicerol para formar fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina, respectivamentc. La citidina transferasa parece ser la enzima que regula la vía de la fosfatidilcolina. Se forma fosfatidilserina a partir de la fosfatidiletanolamina directamente por reaccibn con la serina (figum 26-2). La fosfatidilserina puede volver a formar fosfatidiletanolamina mediante descarboxilacibn. En el higado, una vía alterna permite a la fosfatidiletanolamina dar lugar directamente a rosfatidilcolina, mediante la metilación progresiva de residuo de etanolamina utilizando la S-adenosilmetionina como donador de metilo. A su vez, el grupo metilo de la metionina puede derivar de mefil-Ha fo'Iato(figura 52-1 5). A pesar de estas fuentes de colina, se considera un nutriente esencial en muchas especies de mamíferos, pero esto no se ha establecido en el ser humano. Un fosfolipido presente en las rnitocoridrias es la cardiolipina (difosfa~idilglicerol;figura 16-1 0). Se forma de fosfatidilglicerol, el cual a su vez se ha sintetizado de CDP-diacilg!icerol (figura 26-21 y glicerol 3-fosfato de acuerdo al esquema mostrado en la figura 26-3. La cardiolipina, ubicada en la membrana interior de la mitocondria, se requiere de manera específica para el funcionamiento del transportador de fosfazo y para la actividad de la citocromooxidasa.

C. Biosíntesis de fosfolipidos de glicerol éter Al parecer esta via se encuentra ubicada de manera
exclusiva en los peroxisomas. El fosfato de dihidroxiacetons es el precursor del residuo fosfolípidos de glicerol &ter(figura 264). Este compuesto se combina con la acil-CoA para dar 1-acil4ihidroxiacetona fosfato. Se lleva a cabo una reacción de intercambio entre el grupo acilo y un alcohol de cadena larga para dar I -alquildihidroxiacetonafosfato(que contiene el enlace éter), el ciral en presencia de NA DPH se convierte a 1 -alquil-glicerol-3-focfato. Despues de acilacion ulterior en la posición 2, el 1 -alquil-2-acilglicerol-3-fosfato resultante (anhlogo al fosfatidato en la figura 26-2) es hidrolizado para dar el derivado del glicerol libre. Los p l a s m a lbgenos se forman por desaturación del derivado analogo 3-fosfoetanolamina (figura 2 6 4 ) . Gran parte de los fosfolipidos de las mitocondrias con plasmalbgenos. El factor de activacibn plaquetaria (PAF) se sintetiza a partir del derivado 3-fosfocolina correspondiente y ha sido identificado como 1-alquil-2-acetil-.~n-g1icerol-3fosfocolina. Los sintetizan muchas de las ctlulas y otros tejidos y causa agregación plaquetaria a concentraciones tan bajas de hasta lo-'' rnolk. También tiene propiedades hipotensoras y ulcerogenicas.e interviene en diversas respuesta biológicas incluyendo quimiotaxis y fosforilación de proteinas.

Las fosfolipasas permiten la
degradación y remodelación de fosfogliceroles
La degradación de muchas moléculas complejas en los tejidos es completa, por ejemplo, de proteínas a

Fosfatidilglicerofosfato

I

Fosfatidilglicerol

CMP
Cardiolipina (difosfatidilgliceroi}

Figura 263. Biosintesic de la cardiolipina.

O
H,COH
Acyi-COA

I

II HIC-O-C-R,

Al-ECHIIi- OH
H,C-O-ICH~I~-R

NADPH +H'

NADP'

HiC-O-ICHiIl-R>

I HO-C-H

HCIOr-R

---

1-Alquilgiiceroi 3-fosfatc

Fosfato de dihidroxiacetona

Fosfato de 1-acildihidroxiaceton6

1-alqurldihidroxiacetona

Fosfata de

Acil-COA

ACILTRANS.~

O
bI

H,C -O- ICH,I,
I

- R,

,-~p

CDP-Etanolamina?

G
O
H

H,C-O-rCH,I,-R,
I

C-O-C-H

&o-@

-a+cH2-NI

R,-C -O-C-H
H;C-OH

RS-C-O -C-H

r

FOSFOHlbROMSA

1

H?&-O

-@

1-Alquil. 2-acilgliceml 3-fosfato

FOSFOCOLIND~AC~LGLICEROL
TRANSFERASA
Alquil. d~acilgiiceroies

1-Alquil, 2-acilglicerol 3-fosfocolina Acetil-C*

Colina

\

1- ~ ~ q u i f . 2-fisogltcerol 3-fosíom~ina

Coiina 1-Alquil. 2-acetilglkerol 3-fosfomlina

PAF

Figura 2 6 4 . Biosíntesis de éteres lipídicoc, plasmalogenos y del factor activador de plaquetac (PAF). En la vía de novo para sintesis de PAF, aoettl-COA s incorpora en la etapa", evitando los dos ultimos pasos de la vía que se muestra aqul. e

aminoscidos. Por tanto, puede determinarse un tiempo de recambio para dicha rnolecula. Aunque los fosfolipidos son degradados activamente, cada porción de la molécula se recambia a una velocidad distinta; por ejemplo, el tiempo de recambio del grupo fosfato es diferente del tiempo de recambio del grupo l-acilo. Esto se debe a la presencia de enzimas que permiten la degradación parcial seguida por nueva slntesis (figura 26-5). La fosfolipasa A2 cataliza la hidrblisis del enlace dster en ta posicibn 2 de los glicerofosfolípid~s para formar un hcido graso libre y un Iisofosfolipido, los cuales pueden ser reacilados por Ia acil-COA en presencia de una aciltransferasa. De manera alterna, el lisofosfolípido (como [a lisolecitina) es atacado por la lisofosfolipasa (fosfolipasa B), eliminando el grupo 1-acilo residual y

formando la base glicerilfosforilo correspondiente, la cuat a su vez puede ser fragmentado poruna bidrolasa, liberando glicerol 3-fosfato mas una base. La fosfolipasa Ai ataca el enlace éster en la posicion 1 mientras que la fosfolipasa Az ataca el enlace en la posición 2 de los fosfolipidos (figura 2 6 4 ) . La fosfolipasa C ataca el enlace éster en la posición 3, liberando 1,2diacilglicerol miis una base fosforilo. Es una de la principales toxinas secretadas por bacterias. La iosfolipasa D es una enzima descrita principalmente en los vegetales, que hidroliza la base nitrogenada de los fosfolipidos. La IisoIecitina puede formarse mediante una vla alterna que involucra a la Lecitin:colesterol aciltransfcrasa (LCAT, del ingles, 1ecitin:cholestesol ucyltran.$era,~e). Esta enzima, que se: encuentra en el

plasma y es sintetizada en el hígado, cataliza la trmsferencia de un residuo de Acido graso de la posición 2 de la lecitina al colesterol para formar éster de colesterilo y se considera la causa de gran parte del &ter de colesterilo de las lipoproteinas del plasma. Idas consecuencias de la deficiencia de LCAT se describen en el cuadro 28-1.
LEClflN:

COLESTEROL
ACILTRANSFERASA

ACII-CQ A

H,; - O

-@-

Lecitina + Colesterol P
colina

Lisofusfatidilcolina (lisolecitina)

Lisolecitina + Éster de colesterilo

H,$-OH HO - C- H
H,C
4

-0 -@ L-

Colina

Glicerilfoslocolina

t
H,C
H,C
1

- OH

Se encuentran icidosgrasos saturados de cadena larga predominantemente en la posición 1 de los fosfoliptdos, mientras que los acidos poliinsaturados (por ejemplo, los precursores de las prostaglandinas) se incorporan mis en la posicitrn 2. La incorporacibn de los Bcidos grasoc a la lecitina tiene lugar por Ia sintesis completa del fosfolipido, mediante la transacilacion entre el ester colesterilo y la lisolecitina, y por acilacidn directa de lisolecitina por la acil-CoA. Por tanto, es posible un intercambio continuo de los Qcidos grasos, particularmente en relación con la introducciiin de hcidos grasos esenciales al interior de las molécuIas de fosfolípidos.

HO-C-H
I

-0-e,

+

Colma

sn-Glicerol 3-fosfate

TODOS LOS ESF~NGOL~P~DOS SE FORMAN DE CERAMIDA
La ceramida (figura 26-7), se sintetiza en el retículo endoplásmico. Primero, el aminohcido serina se activa mediante cornbinacibn con fosfato de piridoxal, se combina con palmitoil-COA para formar 3-cetoesfingonina. A su vez, este se convierte en dihidroesfingosina en un paso reductor que utiliza NADPH. Por una combinación con acil-COA, se forma dihidroceramida, seguida por desaturacihn para originar ceramida. Hay evidencia de que la cerarnida puede actuar como un mediador lipido (segundo mensajero), mediante la activacibn de una proteina cinasa y. por oposicihn, a algunas de las acciones del diacilglicerol (capítulo 44). El grupo acilo se presenta con frecuencia por cadenas largas saturadas o ficidos monoenoicos. Las esfingomielinas san fosfolípidos (figura 16-1 7) y se forman cuando la ceramida reacciona con fosfatidi! colina para formar esfingomielina más diacilglicerol (figura 26-8). Esto se !leva a cabo principalmente en el aparato de Golgi y en menor grado en la membrana plásrnica. En los organelos que participan en los procesos secretorios y endociticos, la esfingomielina está restringida a la región luminal.

Figura 26-5. Metabolismo de la fosfatidilcolina (lecitina).

LTO
FOSFOLIPASA A i

1 FOSFOLIPACA A ~ A

Figura 26-6, Sitios de la actividad hidrotitica de las fosfolipasas sobre un sustrato fosfolipido.

Metabolismo de acilgliceroles y esfingolípidos 0 293

II

CH3-(CH,),,-C S -COA Palmitoil-COA

-

I W O C - CH - CH,Serina

OH

Los glucoesfingolípidos son una combinación de ceramida con uno o mas residuos de azúcar
Es típico que los hcidos grasos de muchos glucoesfingolípidos sean C 4 en particular en el cerebro (ácidos 2, lignocérico, cerebrbnicoy nervhnico). El Bcido lignt>cérico (C23H47COOH) sintetizado completamente a partir es de acetil-COA. Por su parte, eE hcido cerebrónico, que es el derivado Z-hidroxi de! Bcido lignodrico, se forma a partir de &te. Por Último, el ácido nervhnico (C23H45COOH)r Iicido monoinsaturado, se sinun tetiza por alargamiento del ácido oleico. Los glucoesfingolipidos mas sencillos (cerebrásidos) son galactosilceramida (GalCer) y glucosilceramida (GIcCer). La GlcCer es un llpido importante de la mielina, en tanto que GlcCer es el glucoesfingol ipido principal de los tejidos extraneurales y un precursor de la mayoría de los glucoesfingolipidos más complejos. La difosfato de uridina y galactosa epimerasa (figura 26-9) utiliza la difosfato de glucosa de uridina (UDPGlc) como sustrato y epimeriza la fiacci6n de gtucosa en galactosa, formando asi difosfato de galactosa de uridina [UDPGal). La reacción en el cerebro es semejante a la descrita cn la figura 22-6 para el higado y la glándula mamaria. La galactosilceramida es sintetiada en una reacción entre ceramida y UDPGal. La sulfogalactosilceramida se formadesp d s de reaccionar con e1 31-fosfoadenosina-51-fosfosulfato (PAPS; "sulfato activo"). El PAPS interviene tambikn en la biosintesis de otros sulfolipidos, es decir, los sulfo(galacto)gtuccrolipidos y los sulfatos de esteroides. Los gangliúsidos son sintetizados a partir de la ceramida por la adicibn escalonada de azúcares activados (por ejemplo, UDPGlc y UDPGal) y un Acido sihlico, por 10 general el iicido N-mcetilneliramlnico (figura 26-10). Puede formarse un gran número de ganglibsidos de peso mdecular creciente. La mayoría de las enzirnas que transfieren los anjcares desde los nucledtidos (gIucosil transferasas) se encuentran en el aparato de Golgi.

i_

Fosfato de piridoxal, ~

2
n ~ '
NHj

3-Cstcesfinganina
NADPH + Ht

3-CETOESFINGANINA
NADP+

OH

N ; W

I Dihidmesfingosina(esfinganina)

A~yl-COA

COA SH
CH3-/CH,),,-CH2-CH,CH-CH

I

l

-CH,-OH

OH Dihidroceramida

NH-CO-R

Figura 26-7. Bioslntesis de la ceramida.

UDPGlc

Cerada Fosfatidilcolina

Esiingornielina Diacilglicerol

UDPGal Ceramida

11-

UDP

PAPs

Sulfogalactosil ceramida (sulfatido)

Figura 26-8. Bioslntesis de esfingomielina.

Figura 26-9. Biocíntesic de galactosilceramida y su sulfo derivado (PAPS, "cuifato activo", focfoadenosina-5'-fosfosulfato.)

UDPGlc

Ceramida

\ /"

UDP

UDPGal GIUCOSII ceramida (Cer-Glc)

< f,

UDP

CMP-NeuAc

Cer-GIc-Gal

\

CMP

) = ,
Cer-Glc-Gal I NeuAc

(D;

7Ga1

UDP-N acetil galadosamina

"Dp

4

Gangliósidos superiores(disiaio y trisialogangliósidos)

Cer-Glc-Gal-C~INAGG~I

I

NeuAc
(GM~)

Cet-Glc-GaCGaiiu~c I NeuAC
(GMZ)

Figura 26-10. Biosíntesis de ganglibsidos (NeuAc, ácido N-acetilneurárnico.)

Los glucoesfingolipidos son constituyentes de la capa exterior de la membrana plasmática, y pueden ser importantes en la comunicación y el contacto intercelufar. Algunos son antigenos, por ejemplo, el anzígeno de Forssman y las sustancias de los grupos sanguineos ABO. Cadenas semejantes de oligosacáridos son constituyentes de las glucoproteinas de la membrana plasmática. Ciertos ganglibsidos actúan como receptores de toxinas bacterianas (por ejemplo, para la toxina del cblera, la cual de manera subsecuente activa a la adenilato ciclaca).

Los fosfolipidos y los esfingolípidos contribuyen a la esclerosis múltiple y a la lipidosis
Ciertas enfermedades se caracterizan por cantidades anormales de estos lipidos en los tejidos, a menudo en e! sistema nervioso. Pueden clasificarse en dos gmpos: 1) enfermedades desmiclinizantes verdaderas, 2) esfingolipidosis. En la esclerosis múltiple, que es una enfermedad desmiel inizante, hay pérdida de fosfol ipidoc (en particutar det plasmalbgeno etanolamina) y de esfingolipidos de la sustancia blanca, al grado que su composición se asemeja a la de la sustancia gris. Se pueden enconh-ar dsteres de colesterilo en la sustancia blanca, aunque por lo común es& ausentes. El liquido cefalorraquideo muestra elevadas cifras de fosfolipidos. La esfingolipidosis constituye un grupo de enfermedades hereditarias, que a menudo se manifiestan en la niAez. Estos padecimientos son parte de un grupo mayor de trastornos de los lisosomas. Las enfermedades por almacenamiento de lipidos muestran diversas características constantes: 1) En varios tejidos, hay una acumulación de lipidos cemplejos que tienen una porción de su estmctura en comijn, una ceramida. 2) La velocidad de síntesis del lipido almacenado es comparable a la de las personas E normales. 3 ) E defecto enzimático en cada una de de estas enfermedades es una deficiencia ~pecffica una enzima lkodmica hidrolitica necesaria para degradar al lipido. 4) El grado en que se encuentra disminuida

La deficiencia de surfactante pulmonar causa el síndrome de insuficiencia respiratoria
El surfactante pulmonar es una secrecion con propiedades notables de tensoactivo, que se compone en gran parte de lipidos con cantidades pequeñas de proteinas y carbohidratos, el cual evita el colapso de los alveolos. La actividad del surfactante se atribuye principalmente a la presencia de un fosfolípido, la digalmitoilfosfittidilcolina, cuya síntesis comienza poco después del nacimiento en los lactante5 a tdrmino. La deficiencia pulmonar de surfactante en los pulmones de recién nacidos prematuros da origen al sindrorne de insuficiencia respiratoria. La administración de surfactante natural o artificial tiene beneficios terap6uticos.

Metabolismo de aciiglicerolesy ~sfingolipidos 29 7

la actividad de la enzima afectada, es semejante en todos los tejidos de la persona enferma. Como resultado de estas consideraciones básicas unificadoras, se han creado procedimientos para ei diagnóstico de pacientes con estos padecimientos. Asimismo. ahora es posible descubrir a los portadores heterocigotos de las anormaIidades geneticas quc producen estos padecimientos, al igual que detectar en el feto la presencia de esfingolipodistrofia. Durante muchos afios se ha intentado la terapéutica de restituciiin de enzimas con escaso éxito; sin embargo, en época reciente, se han logrado tratamientos exitosos con enzimas cuya estructura química se han modificado para asegurar su fijacibn a los receptores de las células blanco, antes de endocitosis mediada por el receptor, por ejemplo, a los macrdfagos en el higado para entregar beta glucocidasa (glucocerebrocidasa) en el tratamiento de la enfermedad de Gaucher. En la actualidad la terapiutica génica para los trastornos lisos6micos se encuentra en investigacibn. En el cuadro 26-1 se muestra un resumen de las lipidosis más importantes.

La deficiencia multiplc dc sulfatasa conduce a la acumulaci6n de sulf~galactosflceramida, sulfaros los de esteroides y peptidoglricanos, debido a una deficiencia combinada de las arilsulfatasas A, 3 y C y de esteroides sulfatasa (cuadro 5 7 4 ) .

RESUMEN 1) Los triacilgliceroles son los principales encargados del almacenaje de lipidos, en tanto que los fosfogliceroles, esfingomielina y glucoesfingolipidos son anfipáticos y cubren numerosas actividades, que van desde funciones estructurales en las membranas celulares a acciones especializadas; por ejernplo, precursores de segundos mensajeros para hormonas, surfactante pulnionar y factor activador de plaquetas (PAF). 2) Los triacilgficeroles y algunos fosfogliceroles se sintetizan por acilación progresiva de glicerol 3fosfato. La vía se bifurca a fosfatidato, que forma

-

..

Cuadro 2!6-1- Eje1mplos de esfingoliliidosis
- . - --- .

- - .

.

. . . -Gai

Enfer

zima deficientc

Lipidii acumula
A -

:r4ilc4aINAc4al-Fuc

- .

-

ticidad mu: icular, piel gruesa
generaiizac

nglihsido :eTay-Sacl2s
Variante d e enlerme Tay-Sachs de Sandho

Hexosamidinase

I -

WJ~cIngliósido ~ 4 1 ~ 4 obósido m

: 1irn6tirn deformación .-,-..--, ' I tRetraso m
lidad rnmusciilar

j 1Retraqo niental. crecimiento
esqueental, cegilera debi-

Enfermedad de Fabry
-m,-

Cei-amida lact

nida lactc

I -inidmi<
Cei

..

:r-Glc4al Ceramida Iacthsidc
mida

Daao ccrcbral progre';ivo, creci, miento del hígado y brazn-

e Krabbc

Jalactosid;iea neta-Glucosidas;

Enfermeaaa ae ciaucner

1

~r

elina casi

ie les hur:sos largo S, retraso nentaI en 1:actantes

Enfermedad de NiemannP;,.L

ina
:: 1 ,,

lazo crecidos: retraso
&*I*l
..A-,
:A---

A-

1-

e Farher

osina a

L~~~~~ ubi

aermariris, deformabJqueleto, retraso men--"

.

NeuAc = Ácido :Ir-acetilneuraminico: Cer = cernida; Glc = glucosa, Cd = galactosa; Fuc, 1 i

Sitio de reaccibn enzrmática deficiente.

fosfolipidos de inositol y cardiolipina por un lado y triacilglicerol, colina y fosfolipidos de etanolamina, por otro. 3) Los plasmalhgenos y el PAF son éteres de fosfolípidos formados por acilación y alquilacion del fosfato de dihidroxiacetona. 4) Todos los esfingolípidos se forman de ceramida (N-acilesfingosina). La esfingomielina es un fosfolipido que se encuentra de manera típica en las membranas de los organelos que se ocupan de los procesos secre~orios ejemplo, aparato de Golgi). Los (por glucoesfingo~ipidos más simples son una combinación de ceramída más un residuo anicar (por ejemplo, GalCer en la rnielina). Los gangliósidos

son glucoesfingollpidos rnbs complejos que contienen un número mayor de residuos azúcar más ácido siálico. Se encuentran en la capa externa de la membrana plasmatica, donde contribuyen al glucochliz y son importantes como antígenos y receptores celulares. S) Los fosfolipidos y esfingolipidos intervienen en varios procesos patol&gicos,incluyendo el sindrome de insuficiencia respiratoria (carencia de surfactante pulmonar), a esclerosis múltiple (desmielinización) y la esfingolipidosis(incapacidad para degradar esfingolipidos en los lisosornas debido a alteraciones hereditarias de enzirnas hidrolasas). I

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Transporte y aIrnacenamiento de Iipidos
Peter A. Mayes, PhD, DSc

Las grasas absorbidas a partir de la alimentación y 10s lipidos sintetizados por el hígado y el tejido adiposo deben ser transportados a los diversos tejidos y organos para su utilizacién y almacenamiento. Dado que los lípidos son insolubles en el agua, es un
problemael transporte en unmedio acuosocomo el plasma sangnineo. La solucibn consiste en asociar lípidos no polares (triacilglicerol y esteres de colesterilo) con lipidos anfipáticos (fosfolipidos y colesterol) y protefnas, para formar lipoproteinas rniscibles en agua.

AGL y la subutilizacilin de quilomicrones y VLDL lo cual provoca hipertriacilglicerolemia. La mayor parte de tos demás trastornos patoIbgicos que afectan al transporte lipidico, se deben de manera primaria a defectos hereditarios en la sintesis de la porcion apoproteinica de la lipoproteina, de las enzimas clave o de [os receptores de lipoproteinas. Algunos de estos defectos causan hipercolesterolemia y aterosclerosis prematura. Los depbsitos excesivos de grasa producen la obesidad. En particular, la obesidad abdominal es un factor de riesgo para aumentos en la mortalidad. hipertensibn, diabetes sacarina n o insulinodependiente (DSNID), hiperlipidemia, hiperglucemia y varias disfunciones endocrinas.

IMPORTANCIA BIOMEDICA
En un ornnivoro consumidor de carne como el ser humano, se ingieren catorias en exceso en la fase anabólica del ciclo alimentario, seguido por un periodo de equilibrio calórico negativa en que el organismo utiliza sus reservas de carbohidrato5 y grasas. Las lipoproteinas median este ciclo transportando a los Iípidos del intestino como quilomicroncs y a los hephticos como lipoproteinas de muy baja densidad (VLDL}, para su oxidacibn en gran parte de los tejidos y al tejido adiposo para su almacenamiento. Los lipidos son movilizados de este último tejido como ácidos grasos libres (AGL) fi-jadosa la albúmina sérica. Las anormalidadesdel metabolicino de los lipidos se presentan en los sitios de producción o en los deutilización de las lipoproteinas, causando varios tipos de hipo e hiperlipoproteinemias. La más común es la diabetes sacarina, donde la deficiencia de insulina causa la movilízacibn excesiva de

LOS L~PIDOS SON TRANSPORTADOS EN EL PLASMA COMO LIPOPROTE~NAS

Existen cuatro grupos principales
de Iípidos en las lipoproteinas
La extraccion de los Iípidos del plasma con un solvente adecuado para lipidos y la subsiguiente separación del extracto en diversas clases de lipidos, muestra la presencia de triacilgliceroles, fasfollpidos, colesterol y &eres de colesterilo, además de una muy pequeiía fraccibn de ricidoc grasos de cadena larga no esterificados (acidos grasos libres} que cuman menos de 5% del total de ácidos grasos presentes en el plasma (cuadro 27-11. Se sabe ahora que esta última fracción, los hcidos grasos libres (AGL), son los Iipidos plasmaticos más activos en el metabolismo.

Cuadro 27-1. Llpidos del plasma sanguíneo

Triacilglicerol
Total - de fosfolipidoc*

Tot
C -

:erol
irc (no este1

[meu'uF
0.2 a O.ht
)

Se han identificado cuatro grupos principales de lipoproteínas plasmáticas

~ c i a o grasos libres (no estcrifi- O s
cados)
I

* Analizado como fhqtoro lir1A;rn ' Varia con el estado niitricii

El total de acidos grasos.45% son fnsfolipidos. 1 Soh Esteres de colesterilo y menos de 3% de ácidos graso5 libres. Est os limites pueden ex 1 sit~iacionesansormales o 1~atolhgicas -

La grasa pura es menos densa que el agua; de esto se deduce que cuanda la proporción de lipidos a proteina aumenta en las lipoproteínas, Ia densidad disminuye (cuadro 27-2). Esta propiedad se utiliza para separar a las diversas Iipoproteinas plasmhticas mediante ultracentrifugacibn. La composición de las diversas fracciones lipoproteinicas obtenidas por ultmcentrifugación se muestra en el cuadro 27-2. Se ha observado que concurren varias clases de compuestos químicos en cantidades diferentes en la mayoria de las fracciones lipoproteinicac. Dado que las fracciones representan las entidades fisiologicac presentes en el plasma, el anhlisis químico simple de los lípidos plasmtiticos (sin incluir los AGL) aporta escasa informacibn sobre su función fisiológica. Sin contar los AGL, se han identificado cuavo grupos mayores de lipoproteinas fisiológicamente importantes y Útiles en el diagnostico clínico. Estos son: 1) q u ilom icrones, derivados de la absorción intestinal

-

Cuadro 27-2. Composicibn de las lipoproteinas en el niasma human

Y-

=====e-1 UlZll

,,, . -.. .

imposición

..

m

:I total de Ilipidos

foli-

dr* co-

Qu i -lomicroncs Intestinc
L ~ioproteina s Hígado F

0.95

a l.OOh 2

ae muy naja (intestinr
3 .

densidad (VI,DL)

Lipoproteínas
de densidad

intermedia

je'alta der sidad VLDL kli-1 lornicroines

Al1juminaAGL -

* Una unidad Sf (Svedberg) es igud a 1Ux"
ACiL. kidos

crn/seg!dina/g a 16 ' C libres. VHDL (lipoproteinasj muy alta dewidad) es una fritccihn mnor que se encuenh a una densidad de enbe 1.21 y 1.25. :

t

-

de triacilgEiceroles; 2) lipoproteinas d e muy baja densidad (VLDL o prebetalipoproteínas), derivadas del hígado para exportar los triacilgliceroles; 3) lipoproteínas de baja densidad (LDL, o betalipoproteínac). que representan una etapa final en el catabolismo de VLDL; y 4) lipoproteínas de alta densidad ([HDL] o alfa lipoproteínas), que intervienen en el metaboSismo de las VLDL y los quilomicrones y tambitn en el transporte del colesterol. El triacilglicerol es el lipido predominante en !os quilomicrones y en las VLDL,.cn tanto que el colesterol y los fosfolipidos predominan en las LDL y HDL, respectivamente (cuadro 27-2). A d e m b del uso de técnicas que dependen de su densidad, las lipoproteinas pueden separarse por sus propiedades electraforkticas en alfa, beta y prebetalipoproteinas (figura 27-1) y se identifican con mayor precisión por medio de inmunoelectroforesis.

Aproproteina periférim (por ejemplo, apo C)

Iipidos no polares principalmente

qzj:si
Apoproteína

lipidos anfipaticos principalmente

Los Iípidos anfipáticos son componentes esenciales de las lipoproteinas
Una Iipoprotelna tlpica - c o m o quilomicrones o VLDL- consiste en un nUcleo Iipidico formado en gm parte de triaciIglicero1no polar y Éster de colesterilo rodeado por una sola capa superficial de moléculas de fosfolípido anfipatico y colesterol. Estas se orientan de modo que sus grupos polares se enfrentan al medio acuoso, como en la membrana celular(capitu1o 16). La fraccidn proteinica de las tipoproteinas se conoce como una apolipoproteina o apoprotelna y constituye casi 60% de algunas HDL y sólo 1% de los quilomicrones. Algunas apoproteinas son integrales y no pueden ser removidas, en tanto que otras pueden ser transferidas con libertad a otras lipoproteinas (figura 27-2).

Fígura 2 7 3 . Estructura generalizada de una lipoproteína plasm8tica. Se notan las semejanzas con la estructura de la membrana plasmhtica. Una pequefia cantidad de éster de colesterilo y tnacilglicerof, se encuentran en la capa cuperficial y algo del colesterol libre se ubica en el núcleo.

La distribución de apolipoproteinas caracteriza a la lipoproteína
En cada lipoproteina hay una o mhs apolipoproteínas (proteínas o polipéptidoc). De acuerdo a la nomenclatura ABC, la apolipoproteina mayor de HDL (alfa lipoproteina) se designa A. La apoIipoproteina principal de LDL (beta lipoproteina) se designa B y también se encuentra en VLDL y quilomicrones. Sin embargo, Ia apo R de los quilomicrones ( B 4 g ) es m8s pequ&a que la apo B-l O0 de LDL o VLDL. La B 4 8 es sintetizñda en el intestino y B-l M) en el hígado. (Al parecer, en el higado de rata se f m a B-48 además de B-100.) La apo E-1 00 es 1a cadena polipeptidica sencilla más larga que se conoce, pues tiene 4536 arninoácidos. La apo B-48 (con 48% de la longitud de B-100) se sintetiza del mismo mRNA como apo E-100. Aparentemente, en el intestino, un codbn de detencibn que no está presente en el DNA genómico, se introduce por un mecanismo editor del RNA que detiene la traslación en el residuo aminoacidico~2153 para liberar la apo B 4 O . Las apolipoproteinas C-1, C-II y C-111 son los polipkptidos más pequefios que se transfieren libremente entre varias lipoproteínas diferentes (cuadro 27-3). La apo B tiene un contenido aproximado de 5% de carbohidratosque incluyen manosa, galactosa, fucosa, glucosa, glucosarnina y ácido sialico. Por tanto, algunas lipoproteinas son también gliicoproteínas. En las lipoproteínas plasrnhticac se han cncon-

Densidad

Figura 27-1. Ceparacibn de Iipopmteínas del plasma por ekctroforesis en gel de agarosa.

302

Bioquímica de Hurper

(Capítulo 27)

Cuadro 27-3. Apoproteinas de las lipoproteinas del- plasma hurnan . -- -- . - . . . - -.

polipopro
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resente en t s con hipt

is

trado otras apolipoprotelnas. Una es la apolipoproteina E, rica en arginina, aislada de las VLDL y HDL; su contenido en arginina ec hasta de 10% del total de aminoacidoc y representa de 5 a 10% de las apolipoproteinas VLDL totales en personas normales, aunque existe en exceso en el espectro de las beta VLDL de pacientes con hiperlipoproteinemia tipo 111. Las apolipoproteinac tienen varias acciones: 1) Son cofactores de enzimas; por ejemplo, C-11 para lipoproteina lipasa, A-1 para lecitin:colesterol aciftrancferasa. 2) Pueden actuar como Iípidos para transferir proteinas. 3 ) Sirven como ligandos para interaccionar con receptores de lipoproteinas en los tejidos, por ejemplo, apo B-100, apo E para el receptor LDL, apo E para el receptor remanente y apo A-1 para el receptor de HDL.

LOS ÁCIDOS GRASOS LIBRES SE METABOLIZAN CON SUMA RAPIDEZ
Los ácidos grasoc libres (AGL, hcidos grasos no esterificados, Bcidos grasos inesterificados) aparecen

en el plasma a partir de la lipblisis de los triacilgliceroles en el tejido adiposo o como resultado de la accibn de la lipoproteina lipasa durante la incorporación en los tejidos de los triacilgliceroles plasmaticos. Se encuenzran combinados con la albúmina del suera en concentraciones variables entre 0.1 y 2 pEq/mL del plasma y comprenden a los hcidos grasos de cadena larga que se encuentran en el tejido adiposo, es decir, acidos palrnitico, estclirico, oleico, palmitoleico, Iinoleico, otros Acidos poliinsaturados y cantidades mas pequeiías de otros Acidoc grasos de cadena larga. Se han descrito sitios de unión sobre la albúmina, de afinidad variable para los ácidos grasos. Se registran valores bajos de hcidos grasos libres en el plasma en estado de alimentacidn completa, elevándose a cerca de 0.5 pEqlmL en la posabsorción y entre 0.7 y 0.8 pEqlmL en el ayuno total. En la diabetes sacarina no controlada, la cifra puede elevarse a 2 pEqlmL. El valor cae inmediatamente después de comer y sube otra vez antes de la siguiente comida; mientras que en los que se alimentan de manera continua como los rumiantes, en donde hay constante afluencia de nutrientes a partir del intestino, los ácidos grasos libres permanecen eszables en un valor ba,jo.

Transuorfe y almacenamiento de linido,~ 303

La velocidad de eliminación de ácidos grasos libres de la sangre es muy rápida. Parte de la captacihn se oxida y suministra alrededor de 25 a 50% de los requerimientos energéticos durante el ayuno. El resto de la incorporación es esterificada. En la inanición, se oxida una cantidad de grasa considerablemente mayor de la que puede ser atribuida a la oxidacion de los acidos grasos libres. Esta diferencia se puede explicar por la oxidación de kipidos esterificados circulantes o de !os presentes en los tejidos. Se cree que E último e n o particular se presenta en el corazón y el músculo esquelCtico, donde se encuentran depósitos considerables de lipidos en las células musculares. El recambio de ácidos grasos libres está directamente relacionado con su concentraci6n. Así, la velocidad de producción de ácidos &rasos libres en el tejido adiposo controla su concentraci6n en e[ plasma, la cual a su vez determina su captación por otros tejidos. El estado de nutriciiin no parece tener un gran efecto sobre la incorporacibn Fraccionada de los hcidos grasos libres por tos tejidos. Sin embargo, altera la proporción de la cantidad que es oxidada comparada con la fraccién que es esterificada, siendo mayor la oxidaci6n en el estado de ayuno que en el de nutrición. DesputSs de la disociacion del complejo Iicido grasoalbúmina en la membrana plasmiitica, tos ácidos gmsos se unen a una proteina membrana1 fijadora de Acidas grasos que actúa como un comansportador transrnembrana con Na'. Al entrar al citosol, los acidos grasos libres son retenidos por una proteína fijadora de Bcidos grasos o proteína Z. Se piensa que la función de ksta en el transporte intracelular es semejante al de la albúmina serica en el transporte extracelular de los ácidos grasos de cadena larga.

LOS TRIACILGLICEROLES SE TRANSPORTAN DESDE EL INTESTINO EN QUILOMICRONES Y DESDE EL H~GADO LIPOPROTE~NAS EN DE MUY BAJA DENSIDAD
Por definición, los quilomicrones se encuentran en el quilo formado sólo por el sistema linfatico que drena el intestino. Se ocupan del transporte de todos los Iipidos diet6ticos en la circulaci6n. Hay partículas m& pequefias y m& densas que tienen características de la VLDL que tarnbikn se encuentran en el quilo. Se forman incluso en estado de ayuno, sus Iípidos derivan principalmente de las secreciones biliares e intestinales. Por otro.lado, la formacibn de quilomicrones aumenta con la carga de triacilglicerol absorbida. La mayoría de las VLDL plasmaticas es de origen hephtico. Ellas son el vehículo de transporte del triacilglicerol desde el hígado hasta los tejidos ex-

nales y el de las VLDL con las células del parénquima hepático (figura 27-3). La apolipoproteína B es sintetizada por los ribosomas en el retículo endopl~smico rugoso y ES incorporada a las lipoproteínas en el retículo endoplasmico liso, que es el principal sitio de sintesis de triacilglicerol. Las lipoproteínas atraviesan el aparato de Golgi donde más lipidoc y residuos de carbohidratos se agregan a la lipoproteina. Se liberan los qiiilomicrones y las VLDL ya sea de la célula intestinal o dc la hephfica por medio de la fusión de la vacuola secretora con la membrana celular {pinocitosis inversa). Los quilomicrones pasan a los espacios entre las células intestinales, abriéndose camino fínalmente hacia el sistema linfático (quiliferos) que drena el intestino. Las VLDL son secretadas por las células del parénquima hepático dentro del espacio de Disse y luego en los sinusoides hepaticos a través de las venranas del revestimiento endotelial. Las similitudes entre los dos procesos y los mecanismos anatómicos son sorprendentes porque, aparte de la glándula marnaria, los tejidos intestinal y hepatico son los únicos desde donde se excretan lipidos particulados. La incapacidad de un lipido particulado del tamafio de los quilomicrones y de las VLDL para pasar a través de las células endoteliales de los capilares sin una hidrolisis previa es probablemente la razbn por la que las grasas de los alimentos entran a la circulación a travks de los linfhticos (conducto torácico) y no por el sistema portal hepático. Aunque tanto los quilomicrones como las VLDL aisladas de la sangre tienen apolipoproteínas C y E, las Iipoproteinac recien secretadas o "nacientes" contienen poca o nada de ella, y pareceria que el cornplemento de polipéptidos de la apoproteina C y E es tomado por transferencia desde l& HDL una vezque los quiIomicrones y las VLDL han entrado en la circulación (figuras 2 7 4 y 27-5). Una descripcidn mas detallada de los factores que controlan la secreción hepática de VLDL se da despds. La apo B es indispensable para la formación de quilomicrones y VLDL. En la abetalipoproteinemia (una enfermedad poco frecuente), la apoB es incapaz de funcionar a causa de un defecto en una proteina transferidora de triacilglicerot que evita la carga de la apo B con lipidos; por tanto, no se forman las lipoproteinas que la contienen y las gotitas de lipidos se acumulan en el intestino y el higado.

LOS QUILOMICRONES Y LAS LIPOPROTE~NAS MUY BAJA DE DENSIDAD SON CATABOLIZADAS RÁPIDAMENTE
La depuracibn de la sangre de los quilomicrones marcados es rápida, pues su tiempo medio de desapariciones
del orden de minutos en los animales pequefios (como

trahephticos. Hay muchas semejanzas entre el mecanismo de
fomaci6n de los quilomicrones con las cdlulas intesti-

3 04

* Bioauímica de Haraer

(Cmítulo 2 7)

A

Luz intestinal

B

Capilar
sanguineo

Vasos Iinfaticos hacia el mndLicto

E
Luz del sinusoide sangulneo

torAcico

Figura 27-3. Forrnacibn y secrecibn de (A) quilomicrones por una célula intestinal y (B) lipoproteinas de muy baja densidad liso, G, aparato de Golgi: N, núcleo, por una dlula hep8tica. (RER, reticule endoplBsmiw rugoso, REL, reticulo endopl~smico Q , quilomicrones, VLDL, Iipoproteinac de muy baja densidad; E, endotelio, DE, espacio de Disee, que contiene plasma sanguíneo.) El esquema es una representacióndiagramática de sucesos que pueden observarse con microsmpio electrbniw.

Figura 2 7 4 . Destino rnetabdlimde los quilomicrones. (A, apolipoprofeina A; 8-48, apolipoproteina B d 8 ; 0,apolipoproteína C; E, apolipoproteina E; HDL, Iipoproteínasde alta densidad;TG, triaeilglicerol; C, colesterol y éster de colestetilo; P, fosfolípido: LH, Iipasa hephtica.) Se muestran $610 los Ilpidos más importantes

Transporte y alrnaceriamiento de lípidos

305

Figura 2 7 6 . Destino rnetabólico de las Iipoproteinas de muy baja densidad (VLDL) y producción de Iipoprotelnas de baja densidad (LDL) (A, apolipoproteina A: B-100, apolipoproteina B?00; Q, apolipoproteina C; E, apolipoproteina E: HDL, lipoproteina de alta densidad; TG, triacilglicerot; SDL, lipoproteína de densidad rntermedia; C, colesterol y ester de colesterilo: P, fosfolípidos ) Solamente se presentan los Iipidos mas importantes. Es posible que una parte de IDL sea metabolizada por la via del receptor para el remanente de quilomicrbn (apo E).

las ratas), aunque es mas largo en los animales grandes (como en el ser humano), en quienes todavía es menor de una hora. Las particu las más grandes se catabolizan más rapidamente que las mas pequefias. Cuando se administran, por la vía venosa, quilomicrones marcados en los acidos grasos del triacilglicerol, casi 80% de la marca se encuentra en el tejido adiposo, corazón y músculo, y aproximadamente 20% en el hígado. Como los experimentos con organo irrigado han demostrado que el hígado no mesaboliza de manera significativa los quilomicrones o las YLDL locales la marca en el higado debe ser un resultado secundario de su metabolismo en los tejidos extrahepáticos.

Los triacilglicerol de los quilomicrones y las V L D t se hidrolizan por acción de la lipoproteina lipasa
Hay una corretacion significativa entre la capacidad de un tejido para incorporar ácidos graso5 de los triacilgliceroles de l lipoproteinas y la actividad de a la enzima lipoprotefna lipasa. Se loca!iza en las paredes de los capilares sanguíneos, anclada por ca-

denas de peptidoglucano de sulfato de heparhn y se ha encontrado en extractos de corazhn, tejido adiposo, bazo, pulmdn, meduIa renal, aorta, diafragma, glhndula mamaria en lactancia y en el hígado del recien nacido; no es activa en el del adulto. La sangre noma1 no contiene cantidades apreciables de la enzima; sin embargo, después de una inyeccibn de heparina se libera la lipoproteina lipasa de su enlace al sulfato de heparán y entra en la circulacibn acompañada de la desaparicihn de la lipemia. Tmtiikn del higado se libera una lipasa, la lipasa hephtica, cuando hay grandes cantidades de heparina, pero esta enzima tiene propiedades diferentes de las de la lipoproteina Iipaca y no reacciona facilmente con los quilomicrones. Se encuentraen las células endotelialesdel hígado y se vincula con el quilomicrón remanente y el metabolismo de las HDL. Tanto los fosfolipidas como Ia apolipoproteina C-II se requieren como cofactores para la actividad de la lipoproteína lipasa. La apo C-Fl contiene un sitio específico de fijación de fosfolipido n través del cual se adhiere a la Iipoproteína. Por consiguiente, los quilomicranes y las VLDL proporcionan la enzima para su metabolismo con su sustrato y sus cofactores.

(Capitulo 27)

La hidrdlisis tiene lugar mientras las lipoproteinas esthn adheridas a la enzima en el endotelio. El triacilglicerol es hidrolizado de modo progresivo a travb de un diacilglicerol a iin monoacilglicer~l finalmente se que hidroliza a hcido graso libre y glicerol. Algunos de los Acidos grasos liberados regresan a la circi~lacion, unidos a la albúmina, pero el volumen mayor es transportado al tejido (figuras 2 7 4 y 27-5). La lipoproteína lipasa cardiaca tiene una Kmbaja para el triacilglicerol en tanto que la ICTl de la enzima en el tejido adiposo es 10 veces mayor. Conforme la concentraci~n triadel cilglicerol plasmlitico decrece en la transicion del estado de nutrición al de ayuno. las enzirnas cardiacas permanecen saturadas con sustrato, pero la saturación de la enzima disminuye en el tejido adiposo, con lo cual la captación se redirige del tejido adiposo hacia el corazbn. Un encausamiento semejante se produce d~irante a lactancia, en la cual la actividad del te-jido S adiposo disminuye y Ia de la glándiila mamarla aumenta, permitiendo la captacibn de triacilglicerol can hcidos grasos de cadena larga, de las lipoprotelnas, para la sintesis de los lipidos lácteos. En tejido adiposo, la insulina incrementa la sintesis de lipoproteína lipasa y su traslado a la superficie luminal del endotelio capilar.

Idos estudios que utilizan VLDL con apo B-100 mascada, han demostrado que las VLDL son precursoras de las IDL y que estas Últimas lo son de las LDL. Solamente una de la apo R-100 esta presente en cada particula de esta lipoproteína y se conserva durante las rransformaciones. Cada pariiculia de LDL deriva de una sola partícula de VLDL (figura 27-5). Dos destinos posibles esperan a IDL. Pueden ser captados de manera directa por el higado a través del receptor para LDL Capo 8-1 00, E) o convertirse en LDL. En la rata, la mayoria de las IDL se captan por cl higado, en tanto que en Ios seres humanos una proporcibn mucho mayor forma LDL, y participa así en la mayor concentración de LDL en éstos en comparación con la rata (y muchos otros marniferos).

LA LDL ES METABOLIZADA POR INTERACCIQN CON SU RECEPTOR
A1 parecer, la mayoria de las LDL se forman a partir de las VLDL como se describió, pero existen evidencias de alguna producción efectuadadirectamente por e[ higado. El tiempo promedio de desaparición de la circulación de la apoproteína 0-1 00 en las LDL es d e alrededor de dos días. Los estudios en cultivos de fibroblastos humanos, linfocitos y celulas de músculo liso arteria1 han demostrado la existencia de sitios especiiicos de enlace o receptores para las LDL, los receptores (B-100. E). Se designa asi debido a que es específico para apo B-100, pero no para apo R-48 y bajo ciertas circunstancias captará lipoproteinas ricas en apo E. La Apo E 4 8 carece del dominio carboxilo terminal de B-100 que contiene el ligando para el receptor de LDL. Estos receptores son deficientes en la hipercolesterolemia familiar. Aproximadamente 30% de LDL es degradada en los tejidos extrahepáticos y 70% en el hígado. Existe una correlación positiva entre la frecuencia de la aterosclerosis coronaria y la concentracibn plasmática de LDL. Para descripcibn adicional de la regulación del receptor para LDL, véase capitulo 28.

La acción de la lipoproteína lipasa forma lipoproteinas remanentes
La reacción con la lipoproteína lipasa conduce a la pérdida de aproximadamente 90% del triacilglicerol de los quilomicrones y a la pérdida de apo C (la cual regresa a HDL) pero no la apo E (la cual es retenida). La IBpoproteina resultante o quilomicr6n remanente tiene un diámetro aproximado de la mitad del quilomimbn precursor y, en tkrrninos de porcentaje, su composicion se enriquece relativamente en colesterol y en Csteres de colesterilo por la perdida de triacilglicerol (figura 2 7 4 ) . Cambios semejantes tienen lugar en las VLDL con la formación de VLDL remanentes o IDL (lipoproteinas d e densidad intermedia; figura 27-5).

El hígado capta las lipoproteínas remanentes
Los quilomicrones remanentes son captados por el higado a través de endocitosis mediada por receptor y los Csteres de colesterilo y los triacjlgliceroles son hidrolizados y rnetabolizados. Al parecer, la captacidn es mediada por un receptor específico para apo E (figura 2 7 4 ) . La infomacion actual sugiere que tanto el receptor de LDL (apo B-100, E) y el receptor remanente específico para apo E participan en la captación del remanente. La lipasa hepática tienc una funcion doble: 1) actuar como ligando para la lipoproteina y 2) hidrolizar sus triacilgliceroles y fosfolipidos.

LAS HDL INTERVIENEN EN EL METABOLISMO DE LOS TR1ACILGLICEROLES Y DEL COLESTEROL
Las HDL son sintetizadas y secretadas tanto en el hígado como en el intestina (figura 2 7 4 ) . Sin embargo. las HDL nacientes (recitn secretndas) del intestino no contienen apolipoproteina C o E, solo apolipoproteína A. Así. la apolipoproteina C parece ser sintetizada en el hígado y transferida a las IlDL

Transporte y alrnacenumlento de 1i;aidos* 307

Figura 2 7 4 . Metabolismo de las lipoproteinas de alta densidad (HDL) (LCAT, lecitin:mlesterolaciltransferasa; C, colesterol, EC, Bster de colesterila, PL, fosfolípido; AGL, ácidos grasos libres; A-1, aproproteina A-l.) La figura muestra el papel de las tres enzimas lipasa hep8tica LCAT y LPL en el ciclo de las HDL postulado para el transporte del colesterol desde los tejidos al hígado HD4, HDL3, cuadro 27-2 Además de triacilgliceroles, la lipasa hepática hidroliza fosfolípidos de la superficie de HDL2, liberando colecterol para captación hepatita, lo que permite la formación de HDL3 más pequeños y más densos La actividad de lipasa hepAtica es incrementada por andrbgenos y disminuye por estrógenos, lo cual puede explicar los valores plasmáticos más elevados de HDL2 en mujeres.

intestinales cuando esths entran al plasma. Una funci6n importante de las HDL es actuar como reservorio de las apoproteinas C y E que son requeridas en el metabolismo de quilomicrones y VLDL (figuras 2 7 4 y 27-5). Las HDL nacientes consisten en dobles capas discoides de fosfolipidos que contienen apoproteinas y colesterol libre. Estas lipoproteinas son similares a las partículas encontradas en el plasma de pacientes can deficiencia de la enzima lecitin:colesterol~ciltransderasa (LCAT) y en el plasma de pacientes con ictericia obstructiva. La LCAT y la apolipoproteina activadora A-1 de dla, se unen al disco. La catllisis

por la LCAT convierte el fosfoIipido superficial y el colesterol libre en ésteres de colesterilo y en licolecitina. Los ésteres de coleszerilo no polares penetran en el interior hidrófobo de la doble capa, en tanto que la licolecitina es transferida a la albúmina del plasma. La reacción continúa generando un nucleo no polar que empuja a E doble capa hasta que se forma a una HDL esferica seudomicélica, cubierta por una película superficial de lipidos y apolipoprotcinas polates. De este modo, el sistema de la LCAT interviene en la eliminación del CXGeSO de colesterol no esterificado de tas lipoproteinas y de las tejidos. El higado es el sitio final de degradacilin de los esteres de coleste-

rilo HDL. No se sabe con precisibn si en la endocitosis de HDL interviene un receptor verdadero para HDL O apo A-P. N o parece que el hígado capte las HDL que contienen apo A-1, de modo significativo. Las apo A-l son disociadas y eliminadas por el riirbn. Se ha propuesto un ciclo de las 1-IDLpara explicar el transporte del colesterol de los tejidos al hígado, un proceso conocido como transporte inverso de colesterol (figura 2 3 4 ) . El ciclo considera captaci~n y esterificación de colesterol mediante HDL,, que a su vez se toma menos densa formando aci HDL?. La lipasa hepática hidroliza fosfolípido HDL y triacilglicerol, permitiendo que la partícula libere su carga (colesteril Csrer hacia el hígado, donde la particula se condensa más, volvit5ndose a fonnar HDL, que asi se reincorpora al ciclo. Los valores de HDL varían reciprocamente con las concentraciones plasmaticas de triacilglicerol y de manera directa con la actividad de la lipoproteina lipasa. Esto se puede deber a los elementos de superficie, por ejemplo, fosfolipidos y apo A-1 liberados durante la hidrólisis de quilomicrones y que contribuye a la formacibn de HDL naciente. Las concenmiones de HDL p L 2 ) tienen relación inversa con la frecuencia de la aterosclerosis coronaria, posiblemente debido a que reflejan la eficiencia de la depuración del colesterol de los tejidos. La HDL, (HDL,) se encuentra en la sangre de los animales con hipercolestesolemia causada por la dieta. Es rica en colesterol y su Unica apolipoproteina es apo E. Es captada por el hígado por medio del receptor para la apo E remanente, pero también por los receptores para LDL. Es por esta razón que estos hltimos se designan en ocasiones receptores apo B-100. Parece que todas las lipoprotefnas plasrnáticas son componentes interrelacionados de uno o más ciclos metabolicoc que juntos son responsables del complejo proceso del transporte de los lipidos plasmAticos.

digestión mediante la produccibn de bilis, que contiene colesterol y sales biliares sintetizados en el propio higado de novo o de la captación del colesterol de las lipoproteinas (capítulo 28). 2) Tiene sistemas enzimliticos activos para la formacihn y oxidación de los Bcidos grasos (capítulos 23 y 24) y para sintetizar triacilgliceroles, fosfolípidos (capítulo 26). 3 ) Convierte los ácidos grasos en cuerpos cetonicos (cetoghnesis) (capitulo 24). 4) Desempefia una parte integral en el metabolismo de las lipoproteínas plasrnhticas (en este capítulo).

La secreción de VLDL hepaticas se relaciona con el estado nutricional y hormonal
Ya se describieron las acciones celulares que intervíenen en la formación y secrecion de VLDL. Los triacilgliceroles hepáticos son precursores inmediatos de sus homblogoc contenidos en las VLDL plasmfiticas (figura 27-7). La sintesis de triacilglicerol proporciona el estímulo inmediato para la creación y secrecibn de VLDL. Los ácidos grasos usados en la síntesis de h a cilgliceroles hepáticos se derivan de dos fuentes posibles: 1) sintesis dentro del hígado a partir de ta acetil-CoA derivada principalmente de los carbohidratos (quizls no sea inlportante en los seres humanos) y 2) captación de bcidos grasos libres desde la circulacibn. La primera fuente predomina en estado de buena alimentacibn, cuando la síntesis de hcidos grasos es alta y el valor de acidos grasos libres circulantes es bajo. Como los triacilgliceroles no se acumulan normalmente en el hígado en este estado, se debe inferir que son transportados del hígado en las VLDL tan rápidamente como son sintetizados y que la sintesis de apo B- 100 no es limitante de la velocidad. Por otro lado, durante el ayuno, en las dietas ricas en -as oen la diabetessacarina, se eleva la cifra de hcidos grasos libres circulantes y mAs de ellos son captados por el hígado. En estas condiciones, la lipogenesis se inhibe y !os Qcidos graos libres son la fuente principal de ácidos gasos de los triacilgliceroles en el hígado y en las VLDL. Los mecanismos enzimáticos encargados de la síntesis de triacilgliceroles y fosfolipidos han sido descritos en el capitulo 26. Los factores que aumentan tanto la sintesis de triacilgliceroles como la secrecibn de VLDL por e! higado incluyen: 1 ) estado de nutrición adecuada más que ayuno; 2 ) la alimentación con dietas abundantes en carbohidratos (particularmente si contienen sacarosa o fmcrosa), que conduce a velocidades elevadas de lipogknesis y de esterificación de ticidos grasos; 3 ) altos valores de hcidos grasos libres circulantes; 4) la ingestibn de etanol; y 5) la presencia de concentraciones altas de insulina y bajas de glucagón, que incrementan la sintesis y esterificación de hcidos grasos e inhiben su oxidación.

EL H~GADO TIENE UNA FUNC~ÓN PRINCIPAL EN EL TRANSPORTE Y METABOLISMO DE LOS L~PIDOS
Al principio se pens6 que mucho del metabolismo de los lipidos del cuerpo era prerrogativa del higado. E! descubrimiento de que muchos tejidos tienen la facultad de oxidar completamente los acidos grasos y el conocimiento acumulado que demuestra que el tejido adiposo es metabólicamente activo en extremo, han tendido a modificar el Cnfasis anterior sobre la funci6n del hígado. Sin embargo, el concepto de una funcion central y única para el hígado en el metabolismo de los lipidos es todavía importante. Este brgano lleva a cabo las siguientes funciones principales en el metabolismo de los lípidos: l} Facilita su absorcion y

Transporte y alrnucenamren~o lipido.7 de

309

Figura 27-7. Sintesis de lipoproteinasde muy baja densidad (VLDL) y los posibles sitios de accibn de los factores que causan acumulacibn de triacilglicerolese hígado graso. (AGE, ácidas grasos esenciales, AGL, Sicidos rasos libres; HDL, lipoprotelnac de alta densidad;A p o apolipoproteina,MTP proteína microsomalde transferencia d e b l a s v i a s indicadasforman la base para los fenbmenos que se muestran en la figura 27-38. La reserva principal de triacilglicerot en el higado na está en fa via directa de sintesis de VLDL a partir de acil-COA.Por tanto, AGL, insulina y glucagbn benen efectos inmediatos sobre la secreción de VLDL ya que su concentracibn afecta directamente al depósito precursor pequeiio de triacilglicerol En el estado de alimentación total, se sintetiza apo 8-100 en exceso a los requerimientos de secrecibn para VLDL, y el exceso se destruye por vía hepática

(Capítulo 2 7)

El desequilibrio en la velocidad de formación y exportación de triacilglicerol causa la acumulación de grasa en el hígado
Por muchas razones, los Iípidos, principalmente como triacilglicerolcs, se pueden acumular en el higado (figura 27-7). La acumulación extensa es considerada coma patolbgica. Cuando se hace crhnica, se producen cambios fibrsticos en las c&lulas, los que progresan hasta lacirrosis y el deterioro de las funciones hepáticas. La acumulaciún de grasaen el hígado se cla~ifica en dos categorías principales. La primera está relacionada con valores elevados de Acidos grasos libres plasmátkos qiie resultan de la movilizaciiin de kas grasas del tejido adiposo, dc la hidriilisis de triacilgliceroles de las lipoproteínas o de los triacilgliceroles de los quilomicrones por la acción de la lipoproteína lipasa en los tejidos extrahepiiticos. El higado incorpora cantidades crecientes de ácidos grasos libres y los esterifica. La producción de VLDL no va pareja con la afluencia de dcidos grasos libres, permitiendo que se acumulen los triacilgliceroles y dé por resultado un hígado graso. La cantidad de triacilglicerol que se encuentra en el higado aumenta de modo significativo durante la inanición y en la alimentacibn con dietas ricas en grasas. En muchos casos (por ejemplo, en inanicion), la capacidad de secretar VLDL también está deteriorada. Las causas pueden ser concentración baja de insulina y alteración en la sintesis de proteinas. En la diabetes sacarina no controlada, en la toxemia del embarazo de las ovejas y en la cetosis del ganado, la infiltración de grasa es suficientemente gravc para causar palidez visible (apariencia grasa) e hipertrofia del hígado, con posible disfuncion hepática. El segundo tipo de acumulación de grasa en el higado se debe generalmente a un bloqueo metabólico en la produccion de lipoproteinas plasrniticas lo cual ocasiona que se acumulen los triacilgliceroles. Tebricamente, la lesión se puede deber a: 1) un bloqueo en la sintesis de apolipoproteinas, 2) a un bloqueo en la síntesis de lipoproteína a partir de los lipidos y las apolipoproteinas, 3 ) a una falla en la provisibn de fosfolípidos que se encuentran en las lipoproteínac, o 4) a una falla en el propio mecanismo secretor. Un tipo de hígado graso que ha sido estudiado extensamente en las ratas se debe a una deficiencia de colina, la que por esto ha sido llamada factor lipotrdpico. Como la colina puede ser sintetizada usando grupos metílo Iábiles, donados por ta metionina en el proceso de transrnetiZacibn (capítulos 32 y 33), la deficiencia se debe básicamente a la escasez de ese grupo metilo. Se han sugerido varios mecanismos

para explicar la funcihn de la colina como agente Iipotrópim, incluyendo su ausencia, que cama alteraciones en la síntesis de los fosfolípidos lipoproteínicos. El antibibtico puromicina inhibe la sintesis proteinica y provoca la aparición de hígado graso y una marcada reducción en la concentracibn de VLDL en las ratas. Otras sustancias aue actúan en forma similar incluyen a la etionina (&ido alfa-amino-garnmnmercaptobutlrico), tetracloruro d e carbono, cloroformo, fosforo, plomo y arsénico. La colina no protege al organismo contra esos agentes pero parece que ayuda en la recuperación. Es muy verosimil que el íetracloruro de carbono afecte tambikn al mecanismo secretor mismo o a la conjugación del lípido con la apoprotcina de la lipoproteina. Su efecto no es directo. sino que m8s bien depende de la transfomacibn ulterior Esto probablemente implique ta forde la mol~cula, macicín de radicales libres que pueden desintegrar a las membranas 3ipidas en el reticulo endoplásmico mediante la formación de peróxidos de Ilpidos. La alimentacibn enriquecida con vitamina E proporciona cierta protección contra la peroxidacibn de los lipidos inducida por el tetracloruro de carbono. Se cree que la acción de la etionina es causada por una reduccidn en la disponibilidad del ATP. Esto resulta cuando la etionina, que reemplaza a la metionina en la S-adenosilmetionina, atrapa adenina disponible y así evita la síntesis de ATP. El icido orolico también causa la acumulaci6n de grasas en el higado; conforme se acumulan VLDL en el aparato de GoEgi, se considera que el ácido or6tico bloquea la glucosilacibn de S a lipoproteína, inhibiendo, por tanto, su Iiberacibn y explicando la disminución notoria de las lipoproteinas plasrnáticas que contienen apo B. Una deficiencia de vitamina E aumenta la necrosis hepatica en el hígado graso por deficiencia de colina. La administración de vitamina E o una fuente de selenio tiene un efecto protector al combatir la peroxidación del lípidos. Además de la deficiencia proteinica, Es deficiencias de Acidos grasos esenciales a y vitaminas (por ejemplo, ácido linoleico, piridoxina y ácido pantoténico) pueden causar infiltracion grasa en el higado. Se cree que la deficiencia de ácidos grasos esenciales deprime la síntesis de fosfolípidos; por consiguiente, otras sustancias, como el colesterol, que compiten por los Acjdos grasos esenciales disponibles para"laesterificacihn, pueden también causar acumulación de grasas en el higado.

El etanol tambien causa acumulación de grasas en el hígado
El atcoholismo tarnbien provoca la acumulaci6n de grasas en el higado, hiperlipidemja y, en ultima instancia, cirrosis. El mecanismo exacto de la acción del alcohol a largo pla7o es todavía desconocido. N o estB

Transportey almacenamiento de lbidos

3I I

claro si la movilización adicional de acidos grasos libres interviene en la acumulación de grasas, pero varios estudios han demostrado valores elevados de ácidos grasos libres en la rata despues de la adrninistración de una sola dosis intoxicante de etanol. Sin embargo, el consumo de alcohol por periodos [argos conduce a la acumulación de ácidos graso5 en el hígado los cuales derivan de la síntesis endógena m8s que del tejido adiposo. Después de la ingestibn de etanol no hay al~eraciánde la síntesis proteinica en el hígado. Existen evidencias de un incremento en la sintesis hepatica de triacilglicerol, disminucihn de la oxidaci6n de Acidos grasos libres y reducción d e la actividad del ciclo del ácido cítrico, causada por la oxidacihn del etanol en el citosol de las células hepaticas por la acción de la alcohol deshidrogenasa que conduce a la producción excesiva de NADH.

inhibe t a m b i h el metabolismo de algunos fatmacos, por ejemplo, barbituratos, al competir con las enzimas dependientes de citocromo P45O (capitulo 61).

C H z - C H 2 4 H + NADPH + H" + 0 2 Etanol CHj-CHO + NADP' + 2HzQ kcetaldehido

!
ALCOHOL
DESHIDROGENASA

La alcohol deshidrogenasa se encuentra tarnbien en la mucosa gástrica, pero su actividad es 60% menor en mujeres que en varones. La elevada disponibilidad de etanol causada por esa escasa utilizacibn gástrica puede explicar por qué las mujeres son más susceptibles a los efectos del consumo de alcohol. DespuCs de L ingestión de etanol, algunas poblaciones asiatia cas y de indios americanos muestran predisposiciiin a un incremento en las reacciones adversas a acetaldehido debido a un defecto genético de la aldehido deshidrogenasa mitocondrial.

CH3-CHz4H p C H 3 Ebnol NAD' NAOH + H'

2 H 0 Acetaldehido

EL TEJIDO ADIPOSO ES EL PRINCIPAL SITIO DE ALMACENAJE

El NADH generado compite con los equivalentes reductores de otros sustratos por la cadena resplratoria, inhibiendo su oxidacibn. El aumento de la proporción [NADH]I[NAD"] origina un desplazamiento a la izquierda en el equilibrio rnaIato = oxalacetato, que puede reducir la actividad del ciclo del ácido citrico. E efecto total de inhibir la oxidacibn de los Acidos E grasos es provocar mayor esterificacidn de los mismos en el triacilglicerol, lo cual parece ser la causa de la acumulación de grasa en el hígado. La oxidacion del etanol conduce a la fomación de acetnldehido, el cual e5 oxidado por la aldehído deshidrogenasa en las mitocondrias, y el acetato es el producto final. O t o s efectos del alcohol pueden incluir aumento de la lipogénesis y de la síntesis de colesterol a partir de acetilXoA. El mayor cociente de [NADH]/[NAD'] provoca también un mayor cociente de [lactato]/[pinivatoj que produce hiperlactiacidemia, la que a su vez disminuye la capacidad del rifibn para excretar acido úrico.Al parecer, esto último es la causa del agmvamiento de la gota por la ingestion alcohblica. Aunque la principal ruta del metabolismo del etanol es a través de la via de la atcoho! deshidrogenasa, algo del rnetabolismo se lleva a cabo mediante el sistema oxidante de etanol de los microsomas (MEOS, del inglds rnicrosomal ethanoi' oxidizing sistem) dependiente del citocromo P45O que involucrael NADPI-Iy al Oz.Este sistema aumenta su actividad en el alcoholismo crónico y explicaría la depuración metabblica acelerada en este trastorno, como lo indican las altas concentraciones sanguineas de acetaldehido y acetato. El etanol

DE TR\AC\LGL\CEROLEN EL CUERPO
Los depisitos de tríacilglicerole~ el tejido adiposo en estan continuamente experimentando lipólisis (hidrblisis) y reesterificaciiin (figura 27-8). Estos dos procesos no son las fases en ambos sentidos de la misma reoccibn. MAS bien con vEas enteramente diferentes en las que intervienen reactivos y enzimas distintos. Muchos de los factores nutritivos, rnetabólicos y hormonales que regulan el metabolismo del tejido adiposo acnian ya sea cobre los procesos de esterificacibn o en la lipblisis. La resultante de estos dos procesos determina la magnitud del depósito de ácidos grasos libres en el tejido adiposo, que a su vez es la fuente y determinante de la cantidad de ácidos grasos libres que circulan en el plasma. Debido a que la cifra plasmaticade acidos grasos libres tiene efectos m& profundos sobre el metabolismo de otros tejidos, particularmente el hepático y muscular, los factores que operan en el tejido adiposo y regulan la salida de ácidos grasos libres qiercen una influencia más alla del zejido mismo.

La provisión de glicerol 3-fosfato regula la esterifícación: la Iipóllsis es controlada por una lipasa sensible a hormona
En el tejido adiposo, el triacilglicerol es sinteti~ado a partir de la acil-CoA y del glicerol 3-fosfato. segun

312

Bioquimicade Hurper

(Capítulo 2 7)

Glrceml3-fosfato

TEJIDO ADIPOSO

Figura 27-8. Metabolismo del tejido adiposo. La lipasa sensible a hormonas es activada por la ACTH, la TSH, el glucagbn, la adrenalina. la noradrenalina y la vasopresina, e inhibida por la insulina, la pmctaglandina Ei y el lcrdo nicotínico. Los detalles de la forrnacibn d e glicerol 3-fosfato a partir d e intermediariosd e la gluCblisis se muestran en la frgura 26-2. (VPF, vía de la VLDL, Iipoproteínas d e muy baja densidad.) pentosa fosfato; TG, triacilglicerol,AGL, ácidos grasoc I~bres;

el mecanismo que se muestra en la figura 26-2. Debido rt la baja actividad de la enzima glicerol cinasa en el tejido adiposo, el glicerol no puede ser utilizado de manera amplia en la esterificación de acil-CoA. Para. la pmvisibn de glicerol 3-fosfato, el tejido depende de la gluc6lisis y de un suministro de glucosa. El triacilglicerol es cometido a hidrotisis por la tipasa sensible a hormona para formar ácidos grasos libres y glicerol. Esta lipasa es distinta de la lipoprotcina lipasa que cataliza la hidrólisis de los triacilgliceroles lipoproteinicos antes de su captacibn por los tejidos extrahepáticos (vCace antes). Puesto que este

tejido no puede aprovechar con facilidad al glicerol, este se difunde al plasma, desde donde ya puede ser utilizado por tejidos como el higado y el rifírjn, los cuales poseen una glicerocinasa activa. Los acidos grasos libres obtenidos en la lipdlisis pueden volver a ser convertidos dentro de1 tejido adiposo en acil<oA por la a c i l z o h sintetasa y reesterificados con glicerol 3-fosfato para formar triacilglicerol. Por tanto, hay un ciclo continua de Iip6lisis y reesterificacibn dentro del tejido. Sin embargo, cuando la velocidad de reesterificacibn no es suficiente para igualar la velocidad de la lipblisis, 30s Acidos grasos

Transporte y almacenutnien~o lbidos de

3 13

libres se acumulan y difunden hacia el plasma, en donde se combinan con la albúmina y elevan laconcentracion de ácidos grasos libres plasmaticos. Estos son una fuente importante de energía para muchos tejidos.

Un metabolismo acelerado de glucosa reduce la salida de ácidos gracoc libres
Cuando aumenta la utilizacibn de glucosa por el tejido adiposo, la salida de ácidos grasas libres disminuye. Sin embargo, la liberacion de glicerol continúa demostrando que el efecto de la glucosa no es mediado por la reduccion de la velocidad de lipólisis. Se cree que el efecto se debe a la provisión de glicerol 3-fosfato, e cual mejora la estesificacion de Lcidos grasos 1 libres por la vía de la acil-CoA. La glucosa puede tomar varias rutas en el tejido adiposo, incluyendo la oxidacihn a COI por la vía del ciclo del ácido citrico, la oxidación en la vía de la pentosa fosfato, converci6n en ácidos grasos de cadena larga y formación de acilglicerol por la via del glicerol 3-fosfato. Cuando la utilizacihn de la glucosa es elevada, una mayor proporcion del consumo es oxidada a COI y convertida en ácidos grasos. Sin embargo, a medida que disminuye la utilización total de glucosa, es más grande la praporcibn de la misma que se dirige a la formacihn de glicerol 3-fosfato y para la esterificacibn de acil-CoA, los cuales ayudan a minimizar la salida de ácidos grasos libres.

Los ácidos grasos libres son captados debido a la actividad de la Fipoproteína lipasa
Existe m 8 de un depbsito de AGL dentro del tejido ms adiposo. Se ha demostrado que el depósito de ácidos grasos libres (figura 27-8, depósito 1) formado por lipdlisis de triacilglicerol es el mismo que surte los kidos grasos para la reesterificacidn; también los libera hacia el medio externo (plasma). Los hcidos grasos captados del entorno como resultado de la accibn de la lipoproteina Eipasa sobre el triacilglicerol de quilomicrones y VLDL, no marcan al depbsito 1 antes de ser incorporados al triacilglicerol, pero viajan a travks de un pequeflo depbsito 2 de recambio rhpido.

hormonas que influyen tanto en el indice de esterificacion como en el de lip6lisis. La insulina inhibe la libe