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Publicado porLuis Rimarachín
LABORATORIO - SEMANA 1
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OBJETIVOS

Explicar el fundamento de la coloración de Gram.
Ejecutar la técnica de coloración más usada en bacteriología : coloración de Gram.
Establecer la diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas.

INTRODUCCIÓN

Descrita por Christian Gram en 1884, permitiendo dividir a las bacterias en dos
grupos taxonómicos : Gram positivas y Gram negativas.
En esta técnica se deben tener en cuenta tres aspectos fundamentales :
‡ Las bacteria Gram positivas retienen firmemente el colorante inicial
‡ Al añadir el mordiente se forma un complejo molecular de gran tamaño
‡ La penetración está condicionada por la permeabilidad de la pared celular.

Los mecanismos antes mencionados se relacionan con la composición química de la
pared de las bacterias. Las bacterias Gram positivas contienen una mayor cantidad
de mureína, ácido tecoico, pocas proteínas y algunas contienen polisacáridos.
Las bacterias Gram negativas poseen poca mureína, una elevada cantidad de lípidos ,
proteínas y polisacáridos y no contienen ácido tecoico.

La mureína en las bacterias Gram positivas impide que el complejo cristal violeta-
yodo sea eliminado por el decolorante alcohol²acetona, ya que es insoluble en alcohol.
El alto contenido de lípidos en la pared de las bacterias Gram negativas ocasiona que
el complejo cristal violeta ² yodo sea eliminado o disuelto por el decolorante.

Al finalizar la coloración las bacterias Gram positivas quedan teñidas con el cristal
violeta : morado y la bacterias Gram negativas quedan teñidas con el colorante de
contraste : safranina : rojo.

MATERIALES
Cultivos en medio líquido de Escherichia coli y Staphylococcus sp.
Asa bacteriológica
Equipos de coloración para tinción de Gram
Mechero, portaobjetos y puentes para tinción
Microscopio

METODOLOGÍA
Preparar un frotis de cada uno de los cultivos de Escherichia coli y Staphylococcus sp

Preparación del frotis para la tinción
Trabajar en un área aproximadamente de 10 cm de distancia de la llama del
mechero ( zona considerada estéril ), flamear el asa, hasta el rojo vivo y dejarla
enfriar por 30 segundos
Con un lápiz graso identificar cada una de las láminas portaobjetos donde se van a
realizar las preparaciones.
Destapar el tubo con el cultivo, empleando para el propósito los dedos anular y
meñique , introducir el asa, tomar una pequeña muestra de cultivo.
Depositar el material en el centro de una lámina portaobjetos y extenderlo en un
área aproximadamente de 0,5 cm.

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Cuando se trata de cultivos de medio sólido , colocar una gota de agua destilada
sobre la superficie , descargar la muestra y homogeneizar. Dejar que la preparación
seque espontáneamente al aire libre.
Fijar la preparación pasándola rápidamente sobre la llama del mechero ,evitando
un calentamiento excesivo para evitar que el material se carbonice.
Con un lápiz graso identificar cada una de las preparaciones.

Para la realización de un buen frotis se deben cumplir las siguientes condiciones :

Utilizar láminas limpias y en perfecto estado, libre de rayones y de manchas, deben

ser previamente pasadas por la llama del mechero para eliminar trazas de grasa y no
se deben tocar con las yemas de los dedos .
Debe ser delgado, transl

cido y homogéneo para que, durante el proceso de tinción,
reciba en toda su superficie el mismo tratamiento con las diferentes sustancias
químicas y se debe usar para la preparación la técnica aséptica.
Utilizar un mínimo de cultivo cuando es un medio sólido.
Cuando se trabaja a partir de un medio líquido debe tomarse suficiente cantidad :
una muestra con el asa de siembra.

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:
‡ Cubrir las preparaciones con cristal violeta , durante un minuto, lavar ligeramente
con agua corriente.
‡ Cubrir con lugol durante un minuto, lavar ligeramente con agua corriente.
‡ Decolorar con la mezcla alcohol ² acetona , escurrir de 5 a 6 gotas y lavar con agua
corriente
‡ Cubrir con safranina durante 30 segundos , lavar con agua corriente y dejar secar.
‡ Colocar sobre la coloración una gota de aceite de inmersión .
‡ Observar al microscopio con la lente de mayor aumento.

1. Cubrir con
cristal violeta
(1 minuto)

2. Lavar con
agua corriente

3. Cubrir con lugol
(1 minuto)

4. Lavar con
agua corriente

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5. Decolorar con
alcohol acetona
(5 a 6 gotas)

6. Lavar con agua
corriente

7. Cubrir con
safranina
(30 segundos)

8. Lavar con
agua corriente

Bacteria Gram
positiva

Bacteria Gram
negativa

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RESULTADOS

Graficar lo observado al microscopio

EVALUACIÓN

1. ¿Cuáles son las principales precauciones del manejo del microscopio y por qué se
debe utilizar el aceite de inmersión al hacer el estudio microscópico de las bacterias ?

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2. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación de un frotis?

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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PRÁCTICA 4

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