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Publicado porLuis Rimarachín
LABORATORIO - SEMANA 1
LABORATORIO - SEMANA 1

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10/01/2015

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OBJETIVOS

Conocer los riesgo y precauciones durante el procesamiento de muestras con
micobacterias.
Conocer el procesamiento de las muestra para el estudio de micobacterias.
Explicar el fundamento de la coloración de Ziehl-Neelsen.
Ejecutar la técnica de coloración de Ziehl-Neelsen.

INTRODUCCIÓN

El género Mycobacterium está integrado por más de 100 especies, presentan alto
contenido de ácidos micólicos en su pared que retienen las anilinas utilizadas como
colorantes : fucsina , auramina, aun después de ser tratadas con alcohol-ácido de
modo que todas las especies se presentan como ácido-alcohol resistentes (BAAR).
El complejo Mycobacterium tuberculosis comprende varios agentes etiológicos de

tuberculosis M.tuberculosis , M.africanum y M.canetti , los cuales son primariamente
patógenos en el hombre.

M.tuberculosis y M.africanum son las especies de micobacterias más importantes por
ser altamente patógenas para el hombre y muy transmisibles de persona a persona
por aerosoles expulsados por la tos de pacientes con lesión pulmonar.

La muestra más examinada en la investigación de Mycobacterium tuberculosis es la de
esputo debido a que la tuberculosis pulmonar es la más frecuente, sin embargo dado
que la enfermedad puede manifestarse en cualquier órgano , con menor frecuencia
puede requerirse la investigación de muestras como orina, líquido cefalorraquídeo,
líquido pleural, líquido ascítico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias, las
cuales deben procesarse también para cultivo.

La muestra de esputo mucopurulenta proveniente del árbol bronquial que se obtiene
después de un esfuerzo de tos, es la que asegura mayor probabilidad de que se
puedan observar bacilos, debe tener un volumen aproximado de 3 a 5 ml .Se
recomienda analizar 2 ó 3 muestras de cada sintomático respiratorio. La primera
muestra debe obtenerse en el momento de la consulta y la segunda al día siguiente al
despertar por la mañana. Puede obtenerse una tercera muestra al momento de
entregar al laboratorio la segunda muestra. El envase debe ser de boca ancha y con
tapa de rosca.

Si la muestra de esputo no va a ser procesada el mismo día, se debe introducir cada
envase en una bolsa de polietileno y anudar la bolsa por encima de la tapa , se
conservarán en refrigeración a 4º C, para impedir la proliferación de la flora
secundaria, preferentemente dentro de una caja de plástico.
Para manipular las muestras y sobre todo los pasajes a otros medios de cultivo es
importante hacerlos en la cabina de seguridad.
Para que la baciloscopía sea positiva es preciso que la muestra contenga entre 5 000
y 10 000 bacilos por ml de muestra.
Las micobacterias se multiplican con más lentitud que otras bacterias patógenas para
el hombre a causa de su pared celular hidrófoba, que las hace agruparse e inhibe la
permeabilidad celular a los nutrientes

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El medio de cultivo más conocido es el Löwenstein-Jensen. La temperatura óptima de
crecimiento es de 37ºC. Los cultivos se revisarán diariamente hasta un total de 60
días , pasados los cuales si no hay crecimiento se considerarán negativos.

Lectura de los extendidos
Observar cada campo microscópico en superficie y profundidad , moviendo el tornillo
micrométrico antes de desplazarse al siguiente campo; seguir un recorrido en líneas
rectas, para recorrer el extendido evitando repetir la lectura de los campos , ejemplo :
de izquierda a derecha. El número mínimo de campos a examinar es de 100 , los
cuales pueden ser leídos por un microscopista experimentado en cinco .
Los bacilos se observarán como bastoncillo delgados , ligeramente curvos, rojo fucsia,
destacándose claramente contra en fondo azul. Pueden presentarse aislados,
apareados o agrupados.

Escala semicuantitativa para los extendidos examinados por tinción Ziehl-Neelsen

Resultado del examen microscópico

Informe

No se encuentran BAAR en 100 campos
observados
Se observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos
observados
Se observan entre 10 y 99 BAAR en 100 campos
observados
Se observan de 1 a 10 BAAR en 50 campos
observados
Se observan más de 10 BAAR en 20 campos
observados

No se observan bacilos ácido-alcohol
resistentes
Nº exacto de bacilos en 100 campos

Positivo (+)

Positivo (++)

Positivo (+++)

Tinción de Ziehl-Neelsen

La ácido-alcohol resistencia es la propiedad que tienen las micobacterias de captar en
su pared fucsina fenicada y retenerla aun con la acción de los decolorantes como la
mezcla de ácido y alcohol . Esta característica se debe al alto contenido lipídico
fundamentalmente fosfolípidos, ceras y ácidos micólicos.

MATERIALES
Muestras de esputo inactivadas (autoclavadas) de pacientes Bk positivos
Frotis fijos de Mycobacterium tuberculosis a partir de esputos
Tubos con medios de cultivo Löwestein-Jensen mostrando colonias de micobacterias
Equipo de coloración para tinción de Ziehl-Neelsen
Mecheros
Láminas portaobjetos
Microscopios

METODOLOGÍA

Preparación y fijación del extendido

1. Ordenar las muestras
2. Numerar las láminas portaobjetos
3. Tomar la muestra y la lámina portaobjetos y colocarlas por detrás del mechero, de
manera que la llama quede entre el operador y el frasco

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4. Destapar con cuidado el envase
5. Partir un aplicador en dos. Tomar una parte del aplicador con la mano izquierda y
la otra con la mano derecha entre el pulgar y el índice y con los extremos
irregulares seleccionar la partícula más densa o purulenta de la muestra
6. Colocar las partículas seleccionadas sobre la lámina portaobjetos y extenderla con
movimientos suaves . Dejar secar el extendido a temperatura ambiente
7. Desechar el aplicador en un frasco que contenga una solución de hipoclorito de
sodio al 1 %.
8. Cerrar el envase de la muestra
9. Cuando el extendido haya secado, pasarlo sobre la llama del mechero por tres (3) o
cuatro (4) veces para fijarlo.

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I

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e ZiehQ

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1. Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada
2. Con la llama de un hisopo embebido de alcohol calentar suavemente por debajo de
los extendidos, con movimientos de vaivén, hasta observar que se desprenden los
primeros vapores blancos
3. En el término de 5 minutos calentar tres veces hasta la emisión de vapores.
No dejar hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y
colorearse mal.
4. Dejar enfriar y enjuagar con abundante agua
5. Cubrir todo el extendido con la solución decolorante y dejar actuar por tres
minutos. Enjuagar con abundante agua
6. Cubrir todo el extendido con solución de Azul de metileno, dejar actuar por un

minuto
7. Enjuagar con abundante agua
8. Dejar secar al medio ambiente

1. Cubrir con fucsina
básica fenicada

2. Calentar suavemente con

ayuda del hisopo (5 minutos)

58

6. Cubrir con Azul de
metileno (1 minuto)

5. Enjuagar con
abundante agua

4. Cubrir con solución
decolorante (3 minutos)

3. Enjuagar con
abundante agua

7. Enjuagar con
abundante agua

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RESULTADOS

Realizar la observación microscópica de las láminas y graficar los resultados.

Bacilos ácido-alcohol
resistentes

Medio de cultivo

R

enstein-S

ensen

Crecimiento de

Mycobacterium tuberculosis

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BACTERIAS ANAEROBIAS

Las bacterias anaerobias han sido encontradas en infecciones que
comprometen todos los órganos y regiones anatómicas del cuerpo. Los abscesos más
profundos y las lesiones necrosantes que involucran anaerobios son polimicrobianos
y pueden incluir aerobios obligados, anaerobios facultativos, microaerófilos como
microorganismos acompañantes. Estos microorganismos, de forma conjunta con el
trauma, la éstasis vascular o la necrosis tisular, reducen la tensión de oxígeno y el
potencial de oxidoreducción en los tejidos y proveen las condiciones favorables para
la multiplicación de los anaerobios obligados.
En las últimas décadas , las infecciones anaerobias se han vuelto más comunes, para
lo cual existen dos probables explicaciones : a) el aislamiento por parte del laboratorio
de las bacterias anaerobias ha mejorado de modo que las infecciones endógenas no
son más mal diagnosticadas o pasan inadvertidas , b) una proporción mayor de
pacientes está recibiendo fármacos inmunosupresores por neoplasias u otras
enfermedades , lo que deriva en la resistencia del huésped inmunodeprimido. Las
infecciones anaerobias primarias se establecen fácilmente en áreas de tejido dañado y
la bacteriemia, diseminación metastásica de las bacterias con formación de abscesos
distantes y una cadena progresiva de eventos , pueden suceder a veces con un
desenlace mortal. Es importante el aislamiento e identificación de las bacterias
anaerobias debido a que estas se asocian a una elevada morbimortalidad y a que el
tratamiento varía según la especie implicada.
Aislamiento de bacterias anaerobias
Selección de las muestras para el cultivo :

Debido a que los anaerobios residentes
a menudo están presentes en grandes cantidades como flora normal en las
superficies de las mucosas , incluso la contaminación mínima de una muestra puede
dar resultados erróneos. Todos los materiales recogidos de lugares que carecen de
flora natural como líquidos corporales que no sea orina, exudados de abscesos
profundos, aspirados con aguja fina y biopsias de tejidos pueden ser cultivados para
bacterias anaerobias.
Recolección y transporte de las muestras:

Al tomar muestras de piel o mucosas, se
debe se descontaminar la superficie, para lo cual se debe utilizar jabón , alcohol
etílico al 70 % y tintura de yodo por un minuto ( en círculos concéntricos comenzando
por el centro), también se puede utilizar yodopovidona al 10 % , luego de lo cual se
espera al menos 2 minutos antes de la extracción de la muestra . El material para el
cultivo anaerobio se obtiene mejor por biopsia de tejidos o por punción y aspiración .
El empleo de hisopos no es una alternativa adecuada debido a la exposición excesiva
de la muestra a los efectos de la desecación , la posibilidad de contaminación
durante la recolección y a que los microorganismos pueden quedar retenidos dentro
de las fibras del hisopo. Si se utiliza un hisopo, este debe provenir de un sistema de
transporte exento de oxígeno.

Un factor crucial para la viabilidad de los cultivos anaerobios es el transporte
de las muestras; el efecto letal del oxígeno atmosférico debe ser nulo hasta que la
muestra pueda procesarse en el laboratorio. Ya no se acepta tapar de nuevo una
jeringa ni el transporte de la aguja y la jeringa al laboratorio debido a los problemas
secundarios a lesiones por punción . Por lo tanto incluso los aspirados deben
inocularse en el mismo tipo de tubo o frasco ampolla libre de oxígeno. La muestra
(pus,líquidos corporales u otro material líquido) se inocula a través del tapón de goma
después de extraer todo el aire de la jeringa y la aguja. Si sólo se puede obtener una
muestra con hisopo, se requiere de un dispositivo especial para la recolección con
una atmósfera libre de oxígeno. Cuando se reinserta el hisopo, debe de tenerse
cuidado de no inclinar el recipiente , lo que provocaría la salida y el desplazamiento

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del anhídrido carbónico o el nitrógeno libre de oxígeno al aire ambiental.
El tejido puede colocarse en una pequeña cantidad de líquido para preservarlo de la
desecación y luego colocarlo en una bolsa para anaerobiosis.
Todas las muestras deben mantenerse a temperatura ambiente hasta su
procesamiento en el laboratorio, dado a que la refrigeración puede oxigenar la
muestra. Todas las muestras deben ser remitidas al laboratorio lo antes posible.

Examen directo de los materiales clínicos :

El análisis macroscópico de las
muestras es importante para establecer la presencia de anaerobios, datos
orientadores serán el hallazgo de un olor fétido, el aspecto purulento de muestras
líquidas así como el hallazgo de tejido necrótico y gas.
En los portaobjetos preparados para la tinción de Gram, es más útil la fijación con
metanol que el calor; se deben observar características celulares y el fondo del frotis y
en la tinción de Gram , observar la forma, tamaño, disposición de las bacterias y
registrar el número de microorganismos presentes . Observar características
morfológicas distintivas como : presencia de esporas, ramificaciones, filamentos con
corpúsculos esféricos, formas granulares. La tinción de Gram permite determinar
características celulares, las tinciones de Wright y Giemsa a veces pueden revelar
información adicional. Las tinciones de naranja de acridina son las más útiles para
detectar bacterias en hemocultivos, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido
articular y exudados.

Procesamiento de las muestras
Las muestras para cultivos anaerobios pueden procesarse en la mesa de
trabajo común con incubación en jarras o bolsas para anaerobiosis o en una cámara
anaerobia.

Jarras para anaerobiosis : el sistema que más se utiliza para crear una atmósfera
anaerobia es la jarra para anaerobiosis; para lo cual se utiliza una jarra plástica
transparente ( disponible en el comercio) con una tapa que se cierra para hacerla
hermética. Las condiciones de anaerobiosis pueden obtenerse mediante el uso de un
sobre que se adquiere en el comercio, generador de hidrógeno y CO2, que se activa
con el agregado de agua o con la humedad proveniente de las placas de agar. La
anaerobiosis se alcanza luego de 1 a 2 horas.

Bolsas plásticas anaerobias : Es una bolsa de plástico transparente , de varios
tamaños, con capacidad para una a tres placas de Petri de 100 mm de diámetro, un
generador de gas H2-CO2 que produce una atmósfera cuando se le agrega agua,
partículas de catalizador de paladio frío y resazurina como indicador. La bolsa se sella
con calor luego de la activación del generador para permitir el mantenimiento de las
condiciones anaerobias.

Incubación de los cultivos
En la mayoría de los casos, la temperatura adecuada es de 35 a 37°C, para el
aislamiento primario de bacterias anaerobias a partir de muestras clínicas. Las
placas inoculadas en las mesas de trabajo y colocadas en las jarras de anaerobiosis
deben incubarse al menos 48 horas y reincubarse por otros 2 a 4 días para permitir
que los microorganismos de crecimiento lento formen colonias; algunos anaerobios
como ciertas especies de Actinomyces y Eubacterium, crecen más lentamente y las
colonias no pueden detectarse si las jarras se abren antes. Si las jarras se abren
pronto, algunos de los microorganismos de crecimiento lento pueden morir debido a
la exposición de oxígeno. Debe evitarse la exposición prolongada de las placas recién
inoculadas al aire ambiental, ciertos anaerobios encontrados en muestras clínicas

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como Peptostreptococcus anaerobius , pueden no crecer o mostrar un retraso
prolongado en el desarrollo cuando las placas recién inoculadas se mantienen en el
aire ambiental.

CUADRO N°1 : Incidencia de anaerobios como flora normal de los seres humanos

NERO

Piel

Tracto
Respiratorio
Superior

Intestino

Genitales
externos

Uretra

Vagina

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