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Publicado porLuis Rimarachín
LABORATORIO - SEMANA 1
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OBJETIVOS

Conocer los procedimientos de identificación bioquímica de las principales bacteria
Gram negativas.
Interpretar los resultados de las pruebas bioquímicas y correlacionarlas con la
diferentes especies de bacterias Gram negativas.

INTRODUCCIÓN

Las bacterias Gram negativas pueden presentarse como bacilos o cocos siendo los
primeros los más abundantes tanto en el hombre como en los animales. Varios de
estos microorganismos pertenecen a la flora intestinal normal , algunos están
asociados a infecciones entéricas y a procesos infecciosos (especialmente cuando
éstas bacterias invaden otros órganos o sistemas).
Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal , de un portador
sano o de la diseminación endógena de la bacteria en una persona susceptible,
pudiéndose ver afectado cualquier órgano del cuerpo.

Familia de bacilos entéricos

Esta familia Enterobacteriaceae, incluye a varios patógenos que causan síndromes
diarreicos . Un gran número de ensayos han sido desarrollados a manera de
identificar rápidamente al patógeno, para que posteriormente el médico, con base en
el reporte, indique el tratamiento adecuado o para que los epidemiólogos puedan
localizar la fuente de infección. Dentro de los bacilos Gram negativos , las
enterobacterias son responsables del 30 a 35 % de todas las septicemias, más del
70 % de todas las infecciones del tracto urinario y muchas infecciones intestinales.

Dentro de las especies de enterobacterias que son los agentes etiológicos de
infecciones entéricas tenemos : Salmonella , Shigella, y Escherichia coli. Estas pueden
producir cuadros diarreicos e infección sistémica , que son procesos infecciosos que
se diseminan generalmente por vía sanguínea o linfática.

Medios de aislamiento primario

Son medios selectivos porque permiten el desarrollo de algunas bacterias e inhiben el
desarrollo de otras. Esta capacidad puede ser moderada (agar Eosina azul de
metileno (EMB) y Mac Conkey) y alta (agar Salmonella-Shigella, Desoxicolato y Citrato)
o completamente específica (Sulfato de bismuto y Verde brillante).
Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo que
permite desde el principio tener colonias aisladas de bacterias fermentadoras como

Escherichia coli y no fermentadoras de la lactosa : Salmonella, Shigella.

Medios diferenciales : Pruebas Bioquímicas

Son aquellos en los que se pone de manifiesto las propiedades metabólicas de los
microorganismos frente a diferentes sustratos. Existen medios que permiten observar
una, dos o más características metabólicas de la bacteria inoculada . Entre los más
utilizados están :

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Agar Triple Azúcar (TSI): medio sólido que contiene glucosa, sales de hierro
y un indicador de pH. Permite conocer la capacidad de la bacteria para fermentar los
carbohidratos. Se detecta la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S), así como de
gas. El tubo se siembra por picadura y en estría por lo que se debe observar tanto
el fondo como la superficie del medio

Agar Lisina Hierro (LIA) : medio sólido que contiene lisina, sales de hierro, glucosa
y un indicador de pH. Se determina la descarboxilación y desaminación oxidativa de
la lisina, la producción de ácido sulfhídrico o sulfuro de hidrógeno (H2S) y la
fermentación de glucosa. Se siembra por picadura y estría.

Medio para Sulfuro , Indol y Movilidad (SIM) : medio semisólido, se utiliza en la
producción de sulfuro de hidrógeno, la formación de Indol y movilidad. Se inocula con
una única punción con asa de siembra recta a través del centro, hasta una
profundidad de unos dos tercios del medio.

Agar Citrato de Simmons : medio sólido que contiene citrato de sodio, compuesto
que puede ser utilizado como única fuente de carbono, por algunas bacterias. Se
siembra por picadura y estría

‡ Agar Úrea (Método de Christensen) : medio sólido, se utiliza para determinar la
capacidad de un organismo para producir la enzima ureasa, que hidroliza la úrea . La
hidrólisis de la úrea produce amoníaco y anhídrido carbónico. La formación de
amoníaco alcaliniza el medio y el cambio de pH se detecta por el cambio de color del
rojo fenol de naranja pálido a magenta.

Existen más pruebas bioquímicas que pueden utilizarse como complemento a las ya
descritas como son : rojo de metilo, Voges Proskawer, utilización de malonato, las
cuales ayudan a determinar la especie del microorganismo aislado. En ocasiones a
pesar de recurrir a diversas pruebas metabólicas, no se consigue la identificación ,
siendo necesario realizar reacciones inmunológicas para llegar al diagnóstico
definitivo.

BACTERIAS PIÓGENAS GRAM NEGATIVAS

Otro grupo menos abundantes en especies pero de gran importancia clínica son las
bacterias piógenas Gram negativas, que pueden ser cocos o cocobacilos . Las
enfermedades que producen por lo general incluyen la acumulación de abundantes
cantidades de pus y afectan frecuentemente el aparato genital o respiratorio. Dichas
enfermedades comprenden : uretritis purulenta (gonococo) , meningitis , neumonías ,
bronquitis, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, epiglotitis etc.
Las bacterias piógenas Gram negativas patógenas en humanos son : Neisseria,

Haemophilus, Bordetella, Moraxella.
Las bacterias del género Neisseria son diplococos Gram negativos inmóviles, cuyos
lados adyacentes son aplanados y ligeramente cóncavos. Sólo dos especies de este
género son patógenas exclusivamente de humanos : Neisseria gonorroheae o
gonococo, agente causal de la enfermedad de transmisión sexual, la gonorrea y la

N .meningitidis o meningococo productos comensales para el hombre y que habitan
principalmente el tracto respiratorio superior.
Esporádicamente se pueden comportar como patógenos oportunistas N. sicca y

N. mucosa.

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El diagnóstico definitivo de una infección gonocócica se hace por el aislamiento en
cultivo de N. gonorrhoeae.
Para el diagnóstico del gonococo, el lugar de la toma de la muestra dependerá de la
edad, sexo y de las características de la infección.
La tinción de Gram es el método de elección para el examen directo de las muestras.
Son oxidasa positiva.
Para los cultivos , el medio debe ser de preparación reciente, bien hidratado y
precalentados. Se utilizan medios selectivos como agar Thayer Martin modificado. Se
debe utilizar un medio no selectivo ya que algunas cepas pueden inhibirse por los
antimicrobianos contenidos en los medios selectivos. Debe estar además en una
atmósfera que contenga de 3 a 5 % de CO2.
El diagnóstico de la infección meningocócica, se hace con el aislamiento de N.

meningitidis a partir de líquido cefalorraquídeo, sangre, líquido sinovial, pleural o
pericárdico. Las más utilizadas son las dos primeras.

Con la tinción de Gram se observan como diplococos Gram negativos, crecen en los
medios de cultivo enriquecidos y su crecimiento se favorece con una atmósfera de
CO2. Son oxidasa positivo y fermentan los carbohidratos.

MATERIALES

Placas con agar Eosina azul de metileno sembradas con cepas problemas.
Placas con medio Mac Conkey, Eosina azul de metileno (EMB) y Salmonella-Shigella
Tubos con medio TSI, Citrato de Simmons, LIA, ÚREA, SIM, sin sembrar y
sembrados con cepa problema
Asas de siembra
Reactivo de Kovacs
Láminas fijadas con frotis de líquido cefalorraquídeo con tinción de Gram.
Microscopio
Aceite de inmersión
Placas de cultivo con agar Chocolate.

METODOLOGÍA

Enterobacterias
En las prácticas se harán los trabajos de laboratorio que nos permitan observar las
características de cultivo y con ello su identificación
A partir de uno de los tubos problema, tomar con el asa de siembra previamente
esterilizada una muestra y sembrar por estrías en los medios Eosina azul de
metileno y Salmonella ² Shigella. Incubar a 37ºC por 24 horas.
Transcurrido el tiempo de incubación , observar la morfología de las colonias de las
placas sembradas (Mac Conkey, EMB y S-S).
Seleccionar una colonia y realizar cultivos en los tubos de TSI, Citrato de Simmons,
LIA y SIM. Esto se hace por puntura en los medios y luego en estrías en la parte de
inclinación (pico de flauta) como lo indicará el profesor en cada medio. Llevar a
incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.
Hacer la lectura de las pruebas bioquímicas, interpretar y realizar la identificación
del microorganismo proporcionado.

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Interpretación Bioquímica

Agar Triple Azúcar (TSI):
Fermentación de glucosa : en la picadura (fondo del tubo) el medio vira a color
amarillo. Es una reacción débil.
Fermentación de sacarosa : en todo el tubo el medio cambia a amarillo,
principalmente en el fondo, donde se intensifica el color debido a la reacción de la
glucosa.

Fermentación de lactosa : en la superficie el medio vira a amarillo.
Debido a la fermentación puede hacer producción de gas, lo que se manifiesta por la
presencia de burbujas en el medio.
Producción de ácido sulfhídrico o sulfuro de hidrógeno (H2S): por degradación
enzimática de aminoácidos que contienen azufre originan un precipitado de color
negro. La producción de H2S tiene lugar en ambiente ácido, de ahí que el precipitado
negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan ácidos a partir de la
glucosa. Así , un fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque
el color amarillo se haya enmascarado con el precipitado negro.

Agar Lisina Hierro (LIA) :
Descarboxilación de lisina : el medio se alcaliniza y se observa lila o ligeramente
morado en la superficie.
Fermentación de la glucosa : en el fondo del tubo el medio vira a amarillo.
Desaminación de la lisina : vira a color rojizo en la superficie del medio. Es
característico de Proteus y Providencia.
Producción de H2S : precipitado de color negro ( por el mecanismo citado
anteriormente).

Agar Citrato de Simmons :
Utilización de citrato como fuente de carbono : el medio vira a color azul.

Agar Úrea :
Los microorganismos que hidrolizan la úrea producen un cambio de color en el pico
de flauta de naranja pálido a magenta.

Medio para Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM) :

Motilidad: Los cultivos móviles muestran un crecimiento difuso o turbidez lejos de la
línea de inoculación , por lo que observando si el crecimiento está solo en la
picadura o se extiende a los lados de ella, se puede determinar si el microorganismo
es inmóvil o móvil.
Indol : la aparición transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la
interfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por lo tanto , la
prueba se considera positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupo aldehído
del reactivo originando un complejo de color rojo.
Producción de H2S: precipitado de color negro ( por el mecanismo citado
anteriormente).

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Escherichia

coli

Klebsiella

Salmonella

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RESULTADOS

Realizar la lectura e identificación de los microorganismos, observar y anotar los
resultados.

‡ Escherichia coli :

TSI

LIA

Citrato de
Simmons

Úrea

SIM

Shigella

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‡ Klebsiella sp

‡ Proteus sp

‡ Salmonella sp

TSI

LIA

Citrato de
Simmons

Úrea

SIM

TSI

LIA

Citrato de
Simmons

Úrea

SIM

TSI

LIA

Citrato de
Simmons

Úrea

SIM

52

‡ Shigella sp

TSI

LIA

Citrato de
Simmons

Úrea

SIM

53

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