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Publicado porLuis Rimarachín
LABORATORIO - SEMANA 1
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10/01/2015

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OBJETIVOS

Conocer y realizar las diferentes técnicas de siembra y aislamiento bacteriano.
Observar el desarrollo de bacterias aisladas a partir de un cultivo puro.

INTRODUCCIÓN

En Microbiología se entiende como siembra al proceso mediante el cual se lleva una
porción de una población de microorganismos (inóculo), de un cultivo crecido a un
medio nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con
instrumentos y medios previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los
profesores de práctica. La principal advertencia consiste en trabajar siempre
próximos a la llama del mechero que , debido a las corrientes de convección verticales
que genera es capaz de crear un ambiente estéril en la zona inmediatamente
alrededor y debajo de la llama.

Para realizar un cultivo de microorganismos es necesario que el número de células
bacterianas (inóculo) sea transferido (inoculado) a un medio de cultivo estéril. Al
querer aislar una especie en particular a partir de una mezcla de microorganismos
deben emplearse técnicas de aislamiento lo que permite, obtenerlas en forma pura.
Esto implica la utilización de medios tanto simples como especiales , mayormente
sólidos de acuerdo a la naturaleza del microorganismo.

Las técnicas de cultivo se realizan por siembra o diluciones sucesivas :

Por siembra : es el procedimiento por el cual se pone en contacto al microorganismo
con un medio de cultivo, para que en condiciones óptimas de temperatura y tiempo
de incubación , pueda desarrollar y multiplicarse in vitro. La finalidad es el
aislamiento para tener un cultivo puro de bacterias a partir de una muestra
problema (orina, heces, secreciones, agua servida).

La siembra puede ser :
Por inoculación
Por estrías simples
Por dispersión o agotamiento
Por puntura

Por diluciones sucesivas : consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del
inóculo, ésta se utiliza cuando se tienen muestras líquidas ( orina, agua ) , se realiza
haciendo diluciones a las muestras : 1 :100, 1:1 000, 1:10 000 etc. Luego se
siembra cada dilución en placas de Petri con medios de cultivo.
Una vez obtenidos los cultivos, se puede proceder al examen macroscópico :
morfología de las colonias, actividades bioquímicas o características inmunológicas
de los microorganismos aislados.

29

MATERIALES

Asa de siembra en aro y en punta
Tubos de vidrio de 16 x150mm
Tubos de caldo Nutritivo con cultivo mixto bacteriano : Staphylococcus aur$

us y

Escher%

chia coli

Placas con agar Nutritivo, agar Sangre y agar Manitol salado
Tubos con caldo y agar Nutritivo
Suero fisiológico estéril
Mechero de Bunsen

METODOLOGÍA

Manejo del asa bacteriológica o de siembra :
El profesor demostrará el manejo adecuado del asa y explicará las precauciones que
se deben tener en la toma de la muestra :
Esterilizar el asa y dejarla enfriar para evitar quemar a las bacterias
Sumergir el asa hasta el fondo del cultivo líquido, ya que en este lugar se encuentra
una mayor concentración de microorganismos.
Observar que al retirar el asa del tubo esté cubierta por una película líquida.

Tomado de Microbiología Tomo II de Granados 2ª edición

Técnica de siembra por diluciones sucesivas

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Método de siembra por agotamiento : aislamiento a partir de un cultivo mixto

Con un lápiz graso marcar por detrás de la placa que contiene el agar ,las líneas
como está indicado en la figura Nº 1, por lo que quedarán tres sectores : el sector
uno (1) el más pequeño de los otros dos , servirá para descargar el asa.
Esterilizar el asa y obtener una asada de cultivo del medio líquido , cerrar el tubo y
colocarlo en la gradilla.
Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la placa de Petri y sembrar
trazando una serie de líneas en zigzag muy cerradas a todo lo ancho del sector uno
(1) . Esto mismo se puede hacer colocando la placa de Petri sobre la mesa y con la
palma de la mano , hacer un movimiento rápido para levantar el fondo que contiene
el medio de cultivo, como lo indicará el profesor.
Esterilizar el asa en el mechero. Girar la caja 90 grados , hasta que el sector uno (1)
quede a la izquierda y el sector dos (2) hacia arriba. Sin volver a tomar el inóculo,
trazar un zigzag un poco más abierto en el sector dos (2), invadiendo el sector uno
(1) en las primeras líneas del zigzag , pero no en las últimas.
Girar nuevamente la placa 90 grados , ahora el sector dos (2) estará a la izquierda y
el sector tres (3) hacia la derecha.
Hacer un nuevo zigzag en el sector tres (3), invadiendo el sector dos (2) . Este paso
puede repetirse sembrando un cuarto sector.
Incubar las placas a 37º C durante 24 horas. Las placas ya sembradas deberán
colocarse con la tapa hacia abajo y la parte que contiene el agar sembrado hacia
arriba.

El asa de siembra se
toma del
mango como si fuera un
lápiz

El tapón del tubo se
toma
con el dedo meñique
de la mano derecha

La boca del tubo se
flamea después de
abrirlo
y antes de cerrarlo

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Método de siembra en caldo de cultivo

Coger el asa de siembra en aro , esterilizarla al mechero al rojo vivo y dejarla enfriar
por unos segundos.
Abrir la placa que contiene el agar con el crecimiento bacteriano y con la ayuda del
asa de siembra coger una colonia bien aislada (figura Nº 1) .
Luego destapar un tubo con caldo de cultivo (figura Nº 2), coger la torunda, que está
dentro de este con el dedo meñique de la mano con que se está cogiendo el asa de
siembra con la colonia
Introducir el asa de siembra en el tubo y agitar suavemente hasta que se desprenda
la colonia del asa de siembra.
Introducir la torunda, tapar el tubo, llevar a esterilizar el asa de siembra y
homogeneizar bien el caldo.
Llevar a incubar a 37º C por 12 horas.

Transcurrido el tiempo de incubación, observar el desarrollo bacteriano en los medios
de cultivo líquido y sólido

Medio líquido : la turbidez indica desarrollo
Medio sólido : presencia de colonias

Figura Nº 1

Figura Nº 2

Figura Nº1

Figura Nº2

1

2

3

1

2

3

32

RESULTADOS

Realizar la lectura, observar y graficar los resultados.

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Agar Nutritivo

Agar Sangre

Agar Manitol
Salado

Agar Nutritivo

Agar Sangre

Agar Manitol
Salado

33

EVALUACIÓN

1. ¿Qué método de siembra usaría en cada uno de los casos siguientes?

‡ Cultivo de heces :
‡ Cultivo de líquido cefalorraquídeo :
‡ Contaje de colonias en urocultivo :

2. ¿Por qué el agar Nutritivo es un medio de uso general para el cultivo bacteriano?
¿Qué sustancias se le pueden agregar par hacerlo enriquecido para bacterias Gram
positivas?

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3. ¿Cuál es la importancia de un cultivo puro?

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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PRÁCTICA Nº5

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