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Microbiologia General

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Microbiología general - Hans G. Schlegel
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El conocimiento de la diversidad de los microorganismos se debe ados
procedimientos. Algunos microorganismos han despertado nuestro interes
por la formacion de colonias, agrupaciones llamativas 0 por modificacio-
nes en el medio. Muchos de estos microorganismos aparentes a simple
vista pueden someterse a un aislamiento directo. Para estos organismos
pudieron establecerse facilmente los medios de cultivo y las condiciones
de crecimiento que permitiesen su desarrollo. No obstante, muchos tipos
fisiologicos distintos de microorganismos pudieron investigarse solo
cuando se desarrollo la tecnica del cultivo de enriquecimiento de WINO-

GRADSKY YBEIJERINCK.

Cultivo de enriquecimiento. El metodo del cultivo de enriquecimiento es
en su principio y en la practica muy sencillo. Las condiciones de enrique-
cimiento son aquellas en las que un organismo se implanta por competen-
cia. Estableciendo una serie de factores (fuentes de energfa, carbono,
nitrogeno, aceptor de hidrogenos, atmosfera, luz, temperatura, pH, etc.) se
determinan unas condiciones ambientales precisas, y se siembra con una
poblacion mixta, como la que se presenta en el suelo 0 los lodos. En un
caldo de enriquecimiento de este tipo se desarrolla mejor el mas adaptado
y sobrecrece a todos los demas organismos acompafiantes. Mediante
varias transferencias en el mismo caldo de cultivo y extension en el mismo
medio solidificado puede aislarse facilmente la cepa enriquecida. Una
"resiembra lfquido-lfquido" frecuente, despues de cortos intervalos de
tiempo, impide el crecimiento de los microorganismos acompafiantes, que
podrfan aprovechar los productos de excrecion, 0 incluso de autolisis, de
las celulas favorecidas primariamente. Un material de inoculo apropiado
10 ofrecen aquellas muestras de lugares en donde ya haya tenido lugar un
"enriquecimiento natural": microorganismos utilizadores del monoxido
de carbono en aguas residuales de fabricas de gas, utilizadores de hemo-
globina en aguas residuales de mataderos y oxidadores de hidrocarburos
en campos petrolfferos 0 depositos de petroleo.

EI cultivo de enriquecimiento permite aislar microorganismos concual-
quier combinacion de requerimientos nlltritivos, Ilatllralmentecohla pre-
misa de que el tipo elegido se presente en la Ilatllraleza. Para los microor-
ganismos muy especializados pueden establecerse condiciones de enri-
qllecimiento especialmente selectivas. Un medio mineral sin nitrogeno
combinado expuesto a la luz es muy selectivo para cianobacterias fijado-

6.4 Metodos de cultivo selectivo 205

ras de nitrogeno. Si al mismo medio de cultivo se Ie afiade una fuente
organica de energfa y carbona predominara Azotobacter en la oscuridad y
condiciones aerobicas, Clostridium en condiciones anaerobicas. El exito
de un cultivo de enriquecimiento radica en satisfacer tan solo los requeri-
mientos mfnimos del tipo fisiologico que se intenta enriquecer. Si por
ejemplo se buscan bacterias que oxiden metano 0 hidrogeno con nitrato 0
sulfato como aceptor de hidrogenos, hay que procurar eliminar el oxfge-
no; de otro modo predominarfan las bacterias oxidadoras del metano 0 del
hidrogeno aerobicas. La seleccion puede emplear tambien la resistencia 0
la tolerancia frente a acidos 0 bases, la infIuencia del calor 0 las radiacio-
nes. Frecuentemente la seleccion incluye tambien una contraseleccion
mediante el empleo de sustancias inhibitorias selectivas. Sobre un medio
de cultivo con azida crecen por ejemplo en condiciones aerobicas los lac-
tobacilos, mientras que otros microorganismos de crecimiento aerobico
quedan reprimidos; azida, cianuro 0 sulfuro de hidrogeno seleccionan con-
tra organismos aerobicos, en cuyos procesos respiratorios estan implica-
dos los citocromos. En el diagnostico medico para la demostracion de
Corynebacterium diphtheriae (sobre medios que contengan telurito) y de
Enterobacteriaceas pat6genas (agar-bismuto) se recurre a una inhibici6n
selectiva. Acerca de la contraseleccion con penicilina para el enriqueci-
miento de mutantes auxotr6ficos de Escherichia coli insistiremos en la
pag. 506. Para impedir el crecimiento de bacterias Gram positivas se
afiade penicilina a los medios de cultivo. El crecimiento de hongos, leva-
duras, protozoos y otros eucariotas se impide afiadiendo cicloheximida.

En el material utilizado como inoculo por el experimentador puede haber
varias cepas 0 variantes del mismo tipo fisiologico, que se diferencien tan
solo, por ejemplo, en los optimos de pH 0 en las velocidades de creci-
miento. Si se inocula con este material un cultivo de enriquecimiento, pre-
dominara la cepa mejor adaptada 0 la de crecimiento mas rapido, y el
resto de las cepas quedara sobrecrecida por ella y no podran aislarse. Si el
aislamiento se encamina a la obtencion de un gran mimero de cepas que
crezcan bajo estas condiciones selectivas hay que recurrir al "metodo
directo en
placa". Si el inoculo se siembra sobre el medio selectivo soli-
dificado, los tipos fisiol6gicos favorecidos se desarrollaran hasta formar
colonias. Si las colonias estan suficientemente separadas no compiten por
los nutrientes; las cepas de crecimiento mas lento no quedan reprimidas
por las de crecimiento mas rapido y pueden aislarse separadamente.

En la tabla 6.4 se dan las condiciones selectivas de crecimiento para una
serie representativa de tipos fisiologicos. El cuadro reline los datos al con-
siderar el enriquecimiento de cada uno de los tipos fisiol6gicos.

Cultivo puro. Se entiende por cultivo puro a la descendencia (clon) de
una sola celula. La funci6n plincipal del microbiologo es la obtencion de

206 6. EI crecimiento de los microorganismos

Tab. 6.4 Condiciones de enriquecimiento de algunas bacterias seleccionadas.

Microorganismos fototr6ficos (principal Fuente de C: CO2)

H2

}

Rodospirilaceas

0

acidos _,;mU.dos }

:0

e organ.

,,>800 nm

N

CJ)

SH2 dador de H

Cromatiaceas

'"

.2 c
c

'" SH2 dadorde H

A>715 nm Clorobiaceas

CJ)

0

CINH4

oKNOa como fuente N Algas verdes

:0

e N2

como fuente N Cianobacterias

CJ)

'"

Bacterias quimiolitotrofas (aut6trofas) (principal Fuente de C: CO2)

Ul

0

Dadorde H

Aceptor de H

0

()

:0 NH4+

O2

Nitrosomonas

'E

0

.",

Q;

N02-

O2

Nitrobacter

Ol -0

'"

O2

Bacterias del H2

~ '"

H2

0-0 C

CJ) ·C

'" SH2, S, S20,>-

O2

Thiobacillus

o ::J

-()

Fe2+

O2

Thiobacillus ferrooxidans

Ul Ul

~ 0

a.c

E OJ 0

S, S20,>-

NOa-

Thiobacillus denitrificans

0

:0

()

e H2

NOa-

Paracoccus denitrificans

c

CJ)

'w

'" H2

CO2

Metanogenicas

Bacterias qUimioorganotrofas (heter6trofas)

I

CJ)

-0

o 0
.- c

. o ~

o OJ

til CJ)

C ~
'" 0

Q.

CJ)

()

'"

c

8

o

:0

e

CD

'"

KNOa 2% + ac. organ.
KNOa 10% + extr. lev:
Sulfato + ac. organ.

glutamato, histidina
lactato + extr. lev.
almidon + NH4+
almidon + N2
glucosa + NH4+

glucosa + 1% extr. lev.; pH 5
lactato + 1% extr. lev.

lactato + NH4+

}

benzoate + NH4+
manitol, benzoato + N2
almidon + NH4+
4% etanol + 1% extr. lev.; pH 6,0
5% urea + 1% extr. lev.
petroleo + NH4+
celulosa + NH4+

Pseudomonas } desnitri-
esporulados ficantes

Desulfovibrio

C. tetanomorphum
Veillonella
Clostridium
C. pasteurianum
Enterobacter y

organismos fermentadores
bacterias del acido lactico
bacterias del acido propionico

Pseudomonas f1uorescens

Azotobacter
Bacillus polymyxa y otros
Acetobacter, Gluconobacter
Sporosarcina ureae
Mycobacterium, Nocardia
Sporocytophaga

+ Inoculo pasteurizado

extr. lev. = extracto de levadura

6.4 Metodos de cultivo selectivo 207

cultivo puro, demostrar su pureza sin lugar a dudas y mantener el cultivo
puro libre de contaminaci6n. El aislamiento del cultivo puro tiene lugar,
con alguna excepci6n, sobre 0 en medios s6lidos. Se inicia por la separa-
ci6n de una sola celula a partir de una poblaci6n y requiere tambien que la
colonia que surja de esta celula se mantenga separada de otras celulas 0
colonias. Las bacterias aer6bicas se afslan segun el metodo de vertido en
placa de KOCH, 0 mas sencillamente por siembra en estrfa con el asa de
platino sobre medios con agar (Fig. 6.6). Las bacterias anaer6bicas se sus-
penden en agar calentado a una temperatura de 45°C y se incuban en
ausencia de aire (Fig. 6.7). Con la separaci6n cuidadosa de una colonia,
posterior suspensi6n en un liquido y nueva siembra por estrfa 0 diluci6n en
agar pueden conseguirse cultivos puros de la mayorfa de microorganismos.

EI aislamiento de un cultivo puro puede hacerse tambien en medios liqui-
dos, siempre que el organismo predomine en el material de partida. Por
una diluci6n en serie de la suspensi6n en el caldo de cultivo se consigue
que en la ultima diluci6n se encuentre tan s610 una celula; el clon repre-
senta al cultivo puro.

Fig. 6.6 Siembra por agotamiento
para conseguir un cultivo puro de una
bacteria aer6bica. Con ayuda de un
asa de platino se sembr6 una suspen-
si6n bacteriana sobre la superficie del
agar. Las estrfas sucesivas iban per-
diendo densidad celular. Las colonias
aisladas situadas al final proceden muy
probablemente de una sola bacteria. La
colonia aislada situada en la parte supe-
rior de la imagen es un contaminante
(Fotografia de B. LEHMANN).

Cultivo mixto. Las poblaciones naturales estan compuestas por 10 gene-
ral de una mezcla de distintos microorganismos. Entre ellos se establecen
interrelaciones de distinto tipo. Estas se basan en la competencia por el
sustrato comun como comensalismo 0 mutualismo (vease pag. 593 y sig.).
Para el estudio de las interrelaciones de este tipo, y otras, se hace cada vez
mas uso de los cultivos discontinuos. Tanto en los cultivos estaticos como
continuos pueden establecerse condiciones definidas, y pueden determi-
narse sucesiones de distintos organismos y acumulaciones de productos
metab6licos. A partir de aquf pueden extraerse conclusiones de relaciones
sinergisticas 0 antag6nicas entre los organismos. Los cultivos mixtos pue-

208 6. EI crecimiento de los microorganismos

Fig. 6.7 Banco de diluci6n de una bacteria purpurea del azufre en agar blan-
do (0,8%) tras incubar durante siete dfas con luz. La imagen demuestra el aisla-
miento de un cultivo puro de bacterias anaer6bicas por el metodo de diluci6n. EI agar
se cubri6 con una capa formada por parafina y parafinol a fin de evitar la entrada de
oxfgeno atmosferico (Fotograffa de B. LEHMANN).

den obtenerse tambien pOl' uni6n de cultivos puros. Las investigaciones de
cultivos mixtos definidos conducen al conocimiento de las relaciones
complejas que se dan entre los microarganismos en el habitat natural.

En la economfa domestica y en la industria no se utilizan exclusivamente
cultivos puros, sino tambien cultivos mixtos, algunos de los cuales se
denominan tambien "cultivos puros naturales". Ejemplos de ellos son la
levadura, el kefir, el hongo de te, etc. Tambien en la purificaci6n de aguas
residuales tienen un papel importante los cultivos mixtos, especialmente
en la degradaci6n de xenobi6ticos en las aguas residuales industriales.

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