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DETERMINACIN DE LOS PARMETROS CINTICOS DE UNA ENZIMA I.INTRODUCCIN La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica y de la dinmica qumica de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas. El conocimiento adquirido acerca de la estructura de las enzimas ha sido de gran ayuda en la visualizacin e interpretacin de los datos cinticos. Por ejemplo, la estructura puede sugerir cmo permanecen unidos sustrato y producto durante la catlisis, qu cambios conformacionales ocurren durante la reaccin, o incluso el papel en particular de determinados residuos aminocidos en el mecanismo cataltico. Algunas enzimas modifican su conformacin significativamente durante la reaccin, en cuyo caso, puede ser crucial saber la estructura molecular de la enzima con y sin sustrato unido (se suelen usar anlogos que se unen pero no permiten llevar a cabo la reaccin y mantienen a la enzima permanentemente en la conformacin de sustrato unido). La importancia del estudio de la cintica enzimtica reside en dos principios bsicos. En primer lugar, permite explicar cmo funciona una enzima, y en segundo lugar, permite predecir cmo se comportar esa enzima in vivo. Las constantes cinticas definidas anteriormente, Km y Vmax, son los pilares fundamentales a la hora de intentar comprender el funcionamiento de las enzimas en el control del metabolismo. II.OBJETIVOS Conocer los parmetros de la actividad enzimtica Observar el comportamiento de una reaccin enzimtica en un extracto crudo vegetal. Determinar la Vm y Km de la enzima extrada de papaya

Portilla Diaz Italo Soto Castillo Arnold

I.MARCO TERICO

Valverde Otiniano Anghelo

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La velocidad de transformacin de los sustratos de una reaccin en los correspondientes productos en una reaccin enzimtica que transcurra en condiciones de estado estacionario es dependiente tanto de las concentraciones de la enzima como de los sustratos. Normalmente, esa dependencia puede expresarse matemticamente por la ecuacin de Michaelis-Menten: v = Vmax [S] / (Km + [S])

Representacin grfica de la curva de saturacin de una enzima donde se puede observar cmo evoluciona la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad de la reaccin. Esta ecuacin predice que la velocidad de formacin de producto es saturable con respecto al sustrato, es decir existe una concentracin de sustrato a partir del cual la velocidad (v) no aumenta de forma significativa. El Km es un parmetro que depende de la afinidad de la enzima por el sustrato y que se denomina constante de Michaelis. La Vmax se denomina velocidad mxima, y depende de la concentracin de enzima segn una relacin lineal: Vmax = k2 [E] El clculo de los valores de Vmax y Km se realiza mediante la representacin de Lineweaver-Burk, que es en realidad la ecuacin de Michaelis-Menten en forma doble recproca: 1/v = 1/Vmax + (Km/Vmax) [S] La representacin de 1/v frente a 1/[S] da lugar a una lnea recta cuya ordenada en el origen es 1/Vmax y cuya abscisa es -1/Km. La velocidad de reaccin se suele expresar en moles de producto formado por minuto, aunque existan unidades estndar, como el Katal, que por ser muy grande es poco empleada.

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La grfica de Lineweaver-Burke o del doble recproco muestra el significado de los puntos de corte entre la recta y los ejes de coordenadas, y el gradiente de la velocidad. El diagrama de Eadie-Hofstee, tambin llamado de Woolf-Eadie-Augustinsson-Hofstee o de Eadie-Augustinsson, es una representacin grfica de la funcin matemtica utilizada en bioqumica en el estudio de la cintica de las reacciones enzimticas , por la que se relaciona la velocidad de una reaccin con la concentracin del sustrato:

Donde:'v' representa la velocidad de la reaccin, 'Km' es la constante de Michaelis-Menten , [S] es la concentracin del sustrato y 'vmax', es el mximo de la velocidad de la reaccin. El diagrama puede deducirse de la ecuacin de Michaelis-Menten como sigue:

Si se invierte y multiplica por vmax, se obtiene:

Reordenando:

Al aislar V, se obtiene:

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De manera similar a otras tcnicas que permiten linealizar la ecuacin de MichaelisMenten, el diagrama Eadie-Hofstee permite visualizar rpidamente los parmetros cinticos importantes como Km y vmax a la vez que est menos afectada por el margen de error que el diagrama de Lineweaver-Burke , debido a que asigna el mismo peso a todos los puntos para cualquier rango de concentracin del sustrato o de la velocidad de reaccin. Una de las consecuencias de la aproximacin de Eadie-Hofstee es que tanto la variable en la ordenada como en la abscisa no son independientes, sino que dependen de la velocidad de la reaccin. De ste modo, cualquier error experimental se encuentra presente en ambos ejes. La velocidad de reaccin vara tambin con la presencia en el medio de determinados agentes qumicos que reciben el nombre de moduladores o efectores. Existen varios tipos, y uno de los ms frecuentes son los denominados inhibidores competitivos. Generalmente, stos son sustancias de naturaleza anloga al sustrato, que pueden competir con l por el centro activo de la enzima. As, disminuyen la velocidad de transformacin del verdadero sustrato, aumentando la constante de Michaelis. En su presencia, se puede obtener lo que se denomina constante de Michaelis aparente. La cintica de inhibicin competitiva responde a la siguiente ecuacin: v= Vmax.[S] / (Km ap +[S]) Donde la constante aparente (Km ap) vale: (Km)ap = Km/ (1+ [I] / Ki), siendo [I] la concentracin de inhibidor y Ki la denominada constante de inhibicin, caracterstica de cada enzima y cada inhibidor.

II.MATERIALES Y METODOLOGA MATERIALES Material Biolgico Fruto maduro de papaya Reactivos y Soluciones Solucin yodada Solucin de KCl (20ml, 0.54 M) HCl (0.1 N) Agua destilada Solucin de almidn (400 ppm) Material de Vidrio y otros

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Pipetas de 1 y 2 ml Pipetas de 5 y 10 ml Tubos de ensayo. Morteros Cuchillos

Equipos Balanza analtica Equipo de bao maria Centrfuga Fotocolormetro pH metro METODOLOGA OBTENCIN DE LOS PREPARADOS ENZIMATICOS CRUDOS Lavar la muestra con agua destilada. Pesar de 20 gr de la muestra. Homogeneizar en frio utilizando un mortero, para evitar la desnaturalizacin Agregar 20 ml de KCL 0.54 M, para lograr un medio isotnico parecido a la concentracin celular. Filtrar por doble capa de gasa. Centrifugar a 4000 rpm durante 10 minutos. Separar el sobrenadante en frascos estriles (PEC), y conservar en frio hasta el momento de su evaluacin. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD CATALITICA DE LOS PEC Para medir la actividad amilsica se proceder de acuerdo con el siguiente sistema de incubacin enzimtica: a. Mtodo de Street - Close, modificado por Cueva y Villanueva. Tabla 1. Componentes de los tubos testigo, problema y blanco Componentes Testigo Problema Solucin almidn 400 ppm (ml) Agua destilada (ml). Pre incubar a 35C por 5. 2.5 0.4 2.5 0.4

Blanco -2.9

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-0.1 0.1

Preparado enzimtico crudo (ml) Incubar a 35C por 15 HCl 0.1N, (ml). Preparado enzimtico, (ml) Solucin yodada, (ml) Mezclar y dejar en reposo por 5 min. Leer en espectrofotmetro a 660 nm.

2.5 0.1 0.5

2.5 -0.5

2.5 0.1 0.5

b. Calcular la curva de calibracin de almidn. O el factor de conversin de las lecturas fotocolorimtricas a miligramos de almidn hidrolizado, ejecutando el sistema siguiente: Tabla 2. Componentes de los tubos blancos y estndares Componentes Blanco 1 Solucin almidn (ml). Agua destilada (ml). Mezclar HCl 0.1N, (ml). Mezclar Solucin yodada, (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 -3 0.5 2.5 2 1 2

Estndares 3 1.5 1.5 4 2 1 5 2.5 0.5

Mezclar y dejar en reposo 5 minutos. Leer a 660 nm. Entre 5 y 30 CALCULAR LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Calibrar el espectrofotmetro con el tubo blanco. Restar la lectura de absorbancia del tubo testigo menos la lectura del tubo problema.

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Convertir la diferencia de las lecturas anteriores, en miligramos de almidn hidrolizado utilizando la curva de calibracin. Con el valor obtenido, hallas las unidades Street Close (USC) de actividad enzimtica presente en 0,1 ml de PEC. Considerar que una USC es la cantidad de enzima (amilasa) que hidroliza 20 mg de almidn durante 15 minutos a 35C y a pH 7 Las USC, posteriormente se pueden expresar por ml o por 100ml de PEC, segn sea necesario.
I. RESULTADOS Y DISCUSIONES A. DETERMINACIN DE LA CURVA DE CALIBRACIN

Tabla N01: Valores de absorbancia y concentracin de almidn Tubos B 0 3 2.5 0.1 0 0 1 0.5 2.5 2.5 0.1 0.295 0.2 2 1 2 2.5 0.1 0.621 0.4 3 1.5 1.5 2.5 0.1 0.884 0.6 4 2 1 2.5 0.1 1.067 0.8 5 2.5 0.5 2.5 0.1 1.484 1

Componentes Sustrato de almidn Agua deshidratada HCl 0.1 N Solucin Yodada Absorbancia mg de Almidn

En la tabla N 01, se aprecian los valores de absorbancia y concentracin de almidn para cada tubo. Con estos valores se construye la curva de calibracin (Figura N01), en la cual se hallaran los valores de almidn residual para la muestra estudiada (papaya), la cual nos servir para determinar la cantidad de almidn hidrolizado al restrselo a la cantidad de almidn inicial. Almidn hidrolizado = Almidn inicial - Almidn residual

Figura N01: Curva de calibracin del almidn La curva de calibracin obtenida presenta un coeficiente de correlacin (R2) alto, de 99.19%, por lo tanto podr predecir los valores de concentracin de sustrato a partir de la absorbancia medida.

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A. DETERMINACIN DE LOS PARMETROS DE MICHAELIS MENTEN (Km

y Vmx) Muestra: Papaya Tabla N02: Valores de Absorbancia, almidn residual y velocidad. TUBO Blanco * Problema1 Problema2 Problema3 Problema4 Problema5 ABS 0 0.073 0.143 0.144 0.316 0.574 C 0 0.073 0.143 0.144 0.316 0.574 mg de Almidn 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Almidn residual 0 0.0505750 3 0.0990716 4 0.0997644 5 0.2189275 3 0.3976721 6 Almidn hidrolizado 0 0.1494249 7 0.3009283 6 0.5002355 5 0.5810724 7 0.6023278 4

Tabla N03: Valores de velocidad y de cantidad de sustrato inicial, residual e hidrolizado TUBO Blanco * Problema 1 Problema 2 ABS 0 0.073 0.143 C 0 0.073 0.143 mg de Almidn 0 0.2 0.4 Almidn residual 0 0.0505750 3 0.0990716 4 Almidn hidrolizad o 0 0.1494249 7 0.3009283 6 USC (0.1ml) USC (100ml) -

0.0074712 7.4712484 5 4 0.0150464 15.046418 2 2

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0.6 0.8 1 0.0997644 5 0.2189275 3 0.3976721 6 0.5002355 5 0.5810724 7 0.6023278 4 0.0250117 25.011777 8 7 0.0290536 29.053623 2 4 0.0301163 30.116391 9 9

Problema 3 Problema 4 Problema 5

0.144 0.316 0.574

0.144 0.316 0.574

A partir de las lecturas de absorbancia se calcula la velocidad en USC para cada tubo

problema, luego se representa grficamente la cantidad de sustrato inicial (mg/ml) y la velocidad calculada en el paso anterior. En la figura N02, segn la representacin de Michaelis Menten se puede determinar los valores de la Vmx y el Km. REPRESENTACIN DE MICHAELIS MENTEN

Figura N02: Diagrama de velocidad de reaccin y constante de Michaelis-Menten

En la figura N02, se puede apreciar los valores de la Vmx y el Km, los cuales fueron

hallados haciendo una tabulacin empleando la ecuacin de la lnea de tendencia para el caso de la velocidad mxima y haciendo una interseccin del punto Vmx/2 con la lnea de tendencia, lo cual nos arrojo el valor de Km al trazar una lnea que vertical hacia el eje x. De esta grafica el valor del R2 fue de 0.9838, el cual indica que los datos fueron bien tomados y que no hay muchos errores.
De la figura N 02, se obtienen la ecuacin que describe la curva: y = -0,0237x2 +

0,0653x + 0,000, de donde se obtendr el valor mximo de velocidad, a una concentracin de sustrato de 1,0 mg/ml, el valor de la velocidad mxima es de 0,0416 USC.
En este cuadro se aprecia que la velocidad mxima obtenida fue de 0.0416 mg./min, con

lo cual se pudo hallar que la Vmx/2 fue de 0.0208 y con esto que el Km es de 0.36. Tabla N04: Valores de los parmetros de Michaelis Menten y valor de R2 Vmax Vmax/2 Km 0.0416 0.0208 0.36

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0.9838

R2

Los resultados obtenidos con la representacin de Michaelis Menten

son los

presentados en la Tabla N04.

Para determinar la velocidad mxima de una reaccin enzimtica, la concentracin de

sustrato ([S]) se aumenta hasta alcanzar una velocidad constante de formacin de producto. Esa es la velocidad mxima (Vmax) de la enzima. En ese caso, los sitios activos de la enzima estn saturados con sustrato. http://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C3A9tica_de_Michaelis-Menten En nuestra prctica se pudo comprobar lo expuesto anteriormente ya que al aumentar la concentracin del sustrato, se vio que en un determinado momento la velocidad fue constante, siendo esta mxima al ser igual a 0.0416 mg./min.

La velocidad V indica el nmero de reacciones por segundo que son catalizadas por una

enzima. Con concentraciones crecientes de sustrato [S], la enzima va acercndose asintticamente su velocidad mxima Vmx, pero nunca la alcanza. Por esta razn, no hay un [S] determinado para la Vmx. De todas formas, el parmetro caracterstico de la enzima est definido por la concentracin de sustrato a la cual se alcanza la mitad de la velocidad mxima (Vmx/2). http://es.wikipedia.org/wiki/CinC3%A9tica_de_Michaelis-Menten En este caso el parmetro caracterstico de la enzima es igual a 0.36 y es la concentracin de sustrato que se alcanza a la mitad de la velocidad mxima (Vmx/2)
Segn Nelson, DL., Cox, MM. (2000), aunque la concentracin de sustrato a Vmx no

puede ser medida exactamente, las enzimas pueden ser caracterizadas por la concentracin de sustrato a la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. Esta concentracin de sustrato se conoce como constante de Michaelis-Menten (Km). Esta constante representa (para enzimas que exhiben una cintica de MichaelisMenten simple), la constante de disociacin (la afinidad del complejo enzima-sustrato (ES) por el sustrato). Valores bajos indican que el complejo ES est unido muy fuertemente y raramente se disocia sin que el sustrato reaccione para dar producto. En

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nuestra prctica el valor de Km fue bajo (0.36), el cual nos indica que existe una unin muy fuerte del complejo enzima-sustrato (ES) por el sustrato.
Cuando [S] es ms pequea que la Km, la velocidad de la reaccin es aproximadamente

igual a la concentracin de substrato. La velocidad de reaccin se dice en estas condiciones es de primer orden con respecto al substrato. Cuando [S] es ms grande que la Km, la velocidad es constante e igual a la Vmx. La velocidad de la reaccin es independiente de la concentracin de substrato y se dice que es de orden cero con respecto a la concentracin de substrato. (ver figura N02) http://laguna.fmedic.unam.mx/evazquez/0403/ecuaciondemichaelis3.html Lo dicho anteriormente pudo ser comprobado en la figura N02, ya que se observa como a una concentracin inferior a Km, la velocidad de la reaccin es aproximadamente igual a la concentracin de substrato y para el caso de ser mayor que el Km, se aprecia la tendencia a ser constante. Al comparar las figuras N03 y 02 vemos una gran similitud por lo cual decimos que los datos estaban bien tomados.

Figura N03

REPRESENTACIN DE LINEWEAVER BURK En este caso se emplear la siguiente ecuacin: 1/V = (Km/Vmx)*(1/S) + (1/Vmx)

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El grfico de Lineweaver-Burke, tambin se denomina de dobles recprocas y se

utiliza para calcular la Km y la Vmx as como para determinar el mecanismo de accin de los diversos tipos de inhibidores. La ecuacin que describe esta grfica de es una recta en donde el intercepto con el eje de las abscisas es igual a 1/Km y el intercepto con el eje de las ordenadas es igual a 1/Vmx. Tabla N06: Valores de cantidad de sustrato, velocidad y de sus respectivas inversas PAPAYA [S]inicial (mg./ml.) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Veloc. (mg./min) 0 0.009961665 0.020061891 0.033349037 0.038738165 0.040155189 1/S 5 2.5 1.666666667 1.25 1 1/V 100.3848294 49.84575007 29.98587336 25.81433613 24.90338164

Con los valores de 1/V y 1/S, se construye una grfica (ver figura N04), de la cual se

obtienen los valores de Vmx, Km y el R2 de la ecuacin de la lnea de tendencia. Figura N04: representacin de Lineweaver Burk Tabla N07: Valores de Vmx, Km y R2 1/V=(Km/Vmx)x(1/S)+(1/Vmx) y = 19.614x + 1.4007 Km/Vmx 1/Vmx R2 19.614 1.4007 Km Vmx 14.0029985 0.71392875 0.9919

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REPRESENTACIN DE EADIE HOFSTEE En este caso se emplear la siguiente ecuacin: V/S = Vmx/Km - (1/Km)*V Tabla N08: Valores de cantidad de sustrato, velocidad y de velocidad/sustrato PAPAYA [S]inicial (mg./ml.) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Veloc (mg./min) 0 0.009961665 0.020061891 0.033349037 0.038738165 0.040155189 V/S 0.04980832 0.05015473 0.05558173 0.04842271 0.04015519 V 0.009961665 0.020061891 0.033349037 0.038738165 0.040155189

Con los valores de V/S y V, se construye una grfica (ver figura N04), de la cual se

obtienen los valores de Vmx, Km y el R2 de la ecuacin de la lnea de tendencia.

Figura N05: Representacin de de Eadie Hofstee Tabla N09: Valores de Vmx, Km y R2 V/S= Vmx/Km - (1/Km)*V y = -0.15x + 0.0531 Vmx/Km 1/Km Vmx Km R2 0.0531 0.15 0.354 6.666666667 0.1235

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REPRESENTACIN DE LANGMUIR En este caso se emplear la siguiente ecuacin: S/V = Km/Vmx + S*(1/Vmx)

Tabla N10: Valores de cantidad de sustrato, velocidad y de sustrato/velocidad PAPAYA [S]inicial (mg./ml.) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Veloc (mg./min) 0 0.009961665 0.020061891 0.033349037 0.038738165 0.040155189 S/V 20.07696588 19.93830003 17.99152402 20.6514689 24.90338164 S 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Con los valores de S/V y S, se construye una grfica (ver figura N06), de la cual se

obtienen los valores de Vmx, Km y el R2 de la ecuacin de la lnea de tendencia.

Figura N06: representacin de Langmuir

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Tabla N11: Valores de Vmx, Km y R2 S/v=(Km/Vmx)+S*(1/Vmx) y = 5.183x + 17.603 Km/Vmx 1/Vmx Vmx Km R2 REPRESENTACIN LINEAL DIRECTA Tabla N12: Valores de la cantidad de sustrato y velocidad PAPAYA [S]inicial (mg./ml.) 0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1 Veloc. (mg./min) 0 0.0100 0.0201 0.0333 0.0387 0.0402 17.603 5.183 0.192938453 3.396295582 0.4137

Con los valores del cuadro N12, la grafica (Figura N07) que contiene los valores de

S y V, en la cual al hacer las intersecciones entre las lneas rectas, se trazan lneas verticales y horizontales de tal manera que intercepten a los ejes y as poder hallar los valores de Vmx y Km. Figura N07: Representacin lineal directa
De la figura N07, se obtienen los valores de Km y Vmx de la siguiente manera:

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Km 0.15 0.45 0.7 2 3.15 Vmax 0.048 0.056 0.072 0.12 0.166 0.0924

Promedio Km=1.29 Vmax=0.0924

1.29

Tabla N13: Cuadro comparativo de los resultados finales REPRESENTACIN MICHAELIS MENTEN LINEWEAVER BURK EADIE HOFSTEE LANGMUIR LINEAL DIRECTA Vmx 0.0416 0.71392875 0.354 2.82485876 0.98359688 Km 0.36 14.0029985 6.66666667 3.39629558 6.10649019 R2 0.9838 0.9919 0.1235 0.4137 -

Un valor numrico pequeo de Km como los obtenidos por los diferentes mtodos de

linealizacin, refleja una alta afinidad de la enzima extrada de la papaya, por su substrato de almidn porque a una baja concentracin del mismo, la enzima a desarrollado ya la mitad de la velocidad mxima. (DORAN, 1998)
La determinacin de los parmetros de la reacciones de Michaelis Menten no es tan

sencillo como para las reacciones de orden cero o de primer orden. Por ello existen varios mtodos grficos aunque desafortunadamente no consiguen resultados precisos. (DORAN, 1998). En nuestra prctica se pudo comprobar lo mencionado anteriormente

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ya que para cada mtodo grfico empleado se obtuvo un resultado diferente, no presentndose valores precisos.
En la representacin de MICHAELIS MENTEN, la precisin es generalmente pobre

debido a la dificultad de extrapolacin de Vmax. (DORAN, 1998). En nuestra prctica lo obtenido fue lo contrario a lo mencionado por el autor, ya que el coeficiente de correlacin obtenido para este mtodo fue de 0.9838 el cual nos indica que hay una buena relacin entre los datos.
En la representacin de LINEWEAVER BURK, el proceso de linealizacion utilizado

en este mtodo distorsiona el error experimental en v, por lo que estos errores se ven aumentados a concentraciones bajas de sustrato. Como consecuencia la representacin Lineweaver Burk a menudo produce resultados imprecisos y no es muy recomendable. (DORAN, 1998). En nuestra prctica lo obtenido fue lo contrario a lo mencionado por el autor, ya que el coeficiente de correlacin obtenido para este mtodo fue alto (de 0.9919) el cual nos indica que hay una buena relacin entre los datos, o sea nos muestra que los resultados son precisos y que este es recomendable.
La representacin de Eadie Hofstee, al igual que la representacin de Lineweaver Bur,

distorsiona los errores existentes en los datos originales por lo que el mtodo presenta una precisin limitada. (DORAN, 1998). En este caso el coeficiente de correlacin obtenido fue de 0.1235, el cual es un valor bajo y nos demuestra lo expresado anteriormente por el autor.
La linealizacion de los datos para la representacin LANGMUIR minimiza la distorsin

de los errores experimentales por lo que se recomienda su utilizacin para el clculo de Vmax y km. (DORAN, 1998). En este caso el coeficiente de correlacin (R2) obtenido fue de 0.4137, el cual es un valor bajo y nos demuestra lo contrario al autor, que al compararlo con el valor de R2 obtenido con el mtodo de Lineweaver Burk, vemos que es menor, indicando as que el mejor mtodo es el de la representacin de Lineweaver Burk, cosa que es incorrecta segn el autor.
Por ltimo, la representacin Lineal directa, es un mtodo relativamente insensible a las

lecturas errneas individuales que se encuentran lejos de los valores correctos. Sin

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embargo un inconveniente de este mtodo es la dificultad de detectar las desviaciones del comportamiento de MICHAELIS MENTEN. Por lo tanto, ste mtodo se recomienda para aquellas enzimas que se conoce que obedecen a una cintica de MICHAELIS MENTEN. (DORAN, 1998). En nuestra prctica los valores de Km y Vmax obtenidos con este mtodo fueron los ms bajos despus de los obtenidos con la representacin de MICHAELIS MENTEN, y como indica el autor, no se puede detectar las desviaciones del comportamiento de MICHAELIS MENTEN ya que este mtodo no nos da ningn valor de R2. De manera general podemos decir lo siguiente:
Segn DORAN, 1998, la temperatura a la cual se produce la reaccin enzimtica tiene

influencia sobre la velocidad de reaccin, la cual se incrementa con la temperatura hasta que un punto mximo es alcanzado. Este incremento se debe a que aumenta el nmero de molculas ricas en energa que pueden pasar la barrera energtica de estado de transicin, para formar a los productos. La elevacin excesiva de la temperatura del medio que contiene a las enzimas, disminuye la velocidad de reaccin como resultado de la desnaturalizacin de las enzimas, es decir, la prdida de la estructura tridimensional de las mismas. En nuestra prctica se tomo en cuenta todo el tiempo el valor de la temperatura, la cual fue de 37 C, tratando de evitar as la desnaturalizacin de las enzimas. Los tiempos a los que tuvo a esta temperatura a estos cultivos, tambin fue controlada estrictamente.
Segn MATHEWS, 1998, para inactivar enzimas se emplean cidos, porque a pH bajos

se consigue la desnaturalizacin de las enzimas, ya que debido a que la estructura con estos cambia, es posible modificar las interacciones inicas que intervienen en la estabilidad de la enzima en su estado nativo. En la presente prctica el cido empleado para esta inactivacin de las enzimas fue el HCl, ya que este acido ayuda a bajar el pH, con lo cual aumentara los iones H+, y con esto se ayuda a desdoblar las cadenas el cual detuvo la hidrlisis despus que se termino de incubar el PEC.
Segn ALAN WISEMAN 1986, los medios de extraccin fsica mas utilizada son

relativamente violentos y pueden ocasionar problemas ya que desintegran las paredes celulares, dificultando la filtracin y centrifugacin posteriores, o bien porque daan a las propias enzimas, lo que necesita solamente una suave agitacin para dispersar el agente qumico de extraccin utilizado durante el proceso. La extraccin por medio fsico de las enzimas debe de trabajarse a una temperatura de 4 C. Al relacionar lo mencionado por el autor y lo realizado en la prctica, podemos decir que no se cumpli eso de la extraccin a 4 C, si no que se trabajo a temperatura ambiente en un mortero.

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Por otro lado se puede decir, que el empleo de este mortero ocasionar problemas como la desintegracin de las paredes celulares, dificultando as la filtracin y centrifugacin posterior.
La coloracin que se da en los tubos, cuando se agrega el lugol, o solucin yodada, para

determinar la cantidad de almidn hidrolizado, mediante el espectrofotmetro, se debe a que el almidn con el yodo reaccionan, cuando ms almidn a hidrolizado la coloracin ser, menos o ms claro, mientras que cuando existe ms coloracin es que en el tubo existe ms almidn por lo que la cantidad de amilasa presente en este tubo es reducido. I.CONCLUSIONES Se logr determinar las constantes cinticas enzimticas de Michaelis Menten (Vmax y Km) y se las pudo comparar con los obtenidos por las representaciones Lineweaver Burk, Eadie Hofstee, Langmuir y Lineal Directa, tal y como se muestra en la siguiente tabla: Tabla N19: Cuadro comparativo de los resultados finales REPRESENTACI N MICHAELIS MENTEN LINEWEAVER BURK EADIE HOFSTEE LANGMUIR LINEAL DIRECTA Vmx 0.0416 0.713928 75 0.354 2.824858 76 0.983596 88 Km 0.36 14.00299 85 6.666666 67 3.396295 58 6.106490 19 R2 0.9838 0.9919 0.1235 0.4137 -

Aqu segn el coeficiente de regresin se ve que el mejor mtodo que representa la cintica de MICHAELIS MENTEN es la representacin de LINEWEAVER BURK. Segn los resultados del Km, se puede decir que la enzima amilasa de la papaya mostr una alta afinidad por el sustrato.

II.BIBLIOGRAFA

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