Compostos Voláteis Associados A Defeitos de Cortiça de Quercus Suber L

Universidade de Aveiro Departamento de Qumica 2005
Paula Maria da Costa Vieira Neto
Compostos volteis associados a defeitos de cortia de Quercus suber L.: Estudo dos efeitos de matriz por micro-extraco em fase slida na regio de espao de cabea
Universidade de Aveiro Departamento de Qumica 2005
Paula Maria da Costa Vieira Neto
Compostos volteis associados a defeitos de cortia de Quercus suber L.: Estudo dos efeitos de matriz por micro-extraco em fase slida na regio de espao de cabea.
dissertao apresentada Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessrios obteno do grau de Mestre em Mtodos Instrumentais e Controlo da Qualidade Analtica, realizada sob a orientao cientfica do Doutor Armando Silvestre, Professor Associado do Departamento de Qumica da Universidade de Aveiro e da Doutora Slvia M. Rocha, Professora Auxiliar do Departamento de Qumica da Universidade de Aveiro
Dedico este trabalho aos meus pais, Maria Dulce e Ado, e aos meus filhos Filipa, Rita e Ricardo
o jri
presidente
professor Catedrtico da Universidade de Aveiro Prof. Dra. Ana Maria Costa Freitas Drumond Ludovice professora Associada com Agregao da Universidade de vora
Prof. Dr. Armando da Costa Duarte
Prof. Dr. Armando Jorge Domingues Silvestre

professor Associado da Universidade de Aveiro
Prof. Dra. Slvia Maria Rocha Simes Carrio

professora Auxiliar da Universidade de Aveiro
agradecimentos
Ao Doutor Armando Silvestre e Doutora Slvia M. Rocha pela orientao cientfica, sugestes, incentivo e confiana demostradas. Ao Marco Tavares e ao Sr. Alberto Tavares pela recolha da cortia e sua transformao industrial. Ao Sr. Fernando Oliveira e Dra Susana Santos pelo apoio na realizao dos ensaios cromatogrficos (GC/MS) Ao Sr. Emlio Campos (Emlio de Azevedo Campos, SA) pela cedncia graciosa das fibras e septos de micro-extraco em fase slida. A todos os colegas e amigos que sempre me incentivaram e motivaram na realizao deste trabalho. A toda a minha famlia, em especial ao meu irmo Pedro Cosme, Professor Auxiliar da Faculdade de Economia da Universidade do Porto, pelo apoio na anlise estatstica.
palavras-chave
Cortia, HS-SPME, efeito de matriz, cortia normal, cortia bolor, cortia mancha amarela, off-flavours, compostos volteis, A. Mellea. A cortia o material de eleio para o fabrico de vedantes para garrafas de vinho. No entanto, sendo um produto natural, a cortia pode ser contaminada e atacada de diferentes formas, o que pode promover alteraes nas suas propriedades. Um dos problemas mais crticos o aparecimento de alteraes organolpticas em vinhos, cujas causas tm vindo a ser atribudas migrao de compostos de aroma indesejvel, existentes na cortia. Estes compostos, na sua maioria relacionados com a actividade microbiolgica, podem ter a sua origem no facto da cortia, desde a floresta at ao engarrafamento, ser susceptvel de sofrer degradaes microbiolgicas com consequente formao de metabolitos secundrios volteis, alguns dos quais com aromas indesejveis. A grande maioria dos estudos sobre este problema tem incidido na quantificao do 2,4,6-tricloroanisole (TCA), considerado um marcador de defeito pois ocorre em cerca de 80% dos casos de alterao organolptica. A tcnica de microextraco em fase slida na regio de espao de cabea (HS-SPME) tem vindo a ser utilizada na anlise da fraco voltil de vinhos e no controlo da qualidade das rolhas de cortia. Esta tcnica tem sido, ainda, utilizada na anlise de vinhos e cortias com defeitos organolpticos, especialmente na deteco e quantificao do TCA. Considerando que so conhecidos outros compostos, associados cortia, susceptveis de provocar defeitos de aroma em vinhos ser importante estudar a aplicabilidade da tcnica de HS-SPME na sua anlise. Assim, com este trabalho pretendeu-se desenvolver uma metodologia de HSSPME para identificar e quantificar compostos volteis da cortia susceptveis de provocar defeitos sensoriais em vinhos: 3-metil-1-butanol (3-MB), 1-octeno3-ol (1-Oct-3), 1-octanol (1-Oct), guaiacol (Gua), 2-metilisoborneol (MIB), 2,4,6tricloroanisole (TCA) e geosmina (Geo). O estudo de optimizao da metodologia incidiu sobre: i) temperatura de extraco, ii) linearidade global, iii) linearidade e reprodutibilidade relativamente a cada padro e estimativa dos Factores Relativos de Resposta da metodologia de SPME e iv) avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz. Aps a fase de optimizao procedeu-se pesquisa destes compostos padro em simulantes de vinho que estiveram em contacto durante treze meses com cortia normal (N) e cortia com defeitos: bolor (B) e mancha amarela (MA). Foram preparadas solues padro em simulantes de vinho em gamas de concentrao que incluem os limites de percepo sensorial (LPS) dos diversos compostos: 3-MB (47,7-191,0 mg/L), 1-Oct-3 (10,7-42,7 g/L), 1-Oct (20,8-208,0 g/L), Gua (5,2-51,6 g/L), MIB (8,0-80,0 ng/L), TCA (2,0-19,8 ng/L) e Geo (8,4-84,0 ng/L). As amostras foram analisadas em modo espaode-cabea usando uma fase estacionria do tipo absorvente, a polidimetilsiloxano (PDMS), de 100 m de espessura.
resumo
Do trabalho realizado, destacam-se como principais concluses: i) Os compostos estudados tm comportamentos distintos em HS-SPME, o que pode ser observado atravs dos diferentes valores de Log(FRR), que dependem das suas caractersticas fsico-qumicas (solubilidade em gua, volatilidade, presso de vapor e coeficiente de partio fase lquida vs fase gasosa); ii) Apesar de se ter trabalhado numa gama de concentraes em que se verifica uma resposta linear da fibra relativamente concentrao total da matriz , verificou-se que a variao da concentrao do 1-Oct (20,8 208,0 g/L) interfere na quantificao dos restantes componentes, com excepo do 1-Oct-3. Este efeito ocorre de forma positiva para o 3-MB e negativa para o Gua, MIB, TCA e Geo. O 1-Oct apresenta o maior valor de Log(FRR) (4,9), e causa interferncia em todos os compostos com valores de Log(FRR) menores mas no naquele que tem um valor de Log(FRR) prximo do seu, no caso o 1Oct-3 (Log(FRR)= 4,3). A variao da concentrao de 1-Oct levou observao de erros de determinao dos restantes compostos, com coeficientes de variao de 13,8, 39,5, 53,7, 67,1, 62,2% para o 3-MB, Gua, MIB, TCA e Geo, respectivamente. Uma vez que o 1-Oct faz parte da composio qumica, quer de vinhos quer da cortia, em quantidades que variam entre 3 e 250 g/L, o efeito observado pode explicar a existncia de discrepncias entre a anlise sensorial de determinado composto e a sua quantificao por HS-SPME. iii) Finalmente, os compostos em estudo foram pesquisados em simulantes de vinho rolhados com cortia N, B e MA, de acordo com a metodologia desenvolvida. O nico composto identificado, foi o TCA, com concentraes de 0,6, 0,4 e 2,4 ng/L, para os simulantes rolhados com a cortia N, B e MA, respectivamente. Verifica-se que 25% dos simulantes rolhados com cortia N e 35% dos rolhados com cortia B apresentam TCA, encontrando-se todos os valores abaixo do LPS (4 ng/L). Estes resultados indicam que nenhum dos simulantes rolhados com cortia N e B seria susceptvel de apresentar defeitos de aroma associados aos descritores de aroma dos sete compostos estudados. No caso dos simulantes rolhados com cortia MA, foi detectada a presena de TCA em 65% dos simulantes, dos quais 35% apresentavam concentraes superiores ao LPS. Assim, 35 % dos simulantes rolhados com cortia MA so susceptveis de apresentar defeitos de aroma.
keywords
Cork, HS-SPME, matrix effect, normal cork, mould cork, yellow stain cork, Mancha amarela, off-flavours, cork volatiles, A. mellea.
abstract
Cork is the premium raw material used to produce wine-bottling stoppers; however, being a natural product, cork can be contaminated and attacked in different ways that could promote modifications in its proprieties. One of the most critical problems of the cork industry is that wine may be organoleptically affected, due to off-flavours migration from cork. These compounds, mostly related with microbiological activity, may have its origin in the fact that cork is susceptible of microbiological attack during cork processing from the forest to the bottle, with production of off-flavours metabolites. Most studies on this problem are dedicated to 2,4,6-trichloroanisole (TCA) quantification, once it is present in around 80% of the organoleptically deviation cases. The headspace solid phase microextraction methodology (HS-SPME) has been used in the analysis of wines with organoleptic deviations, and in cork stoppers quality control, with particular emphasis on the detection of TCA. Considering wine organoloeptic deviations can be due to other cork off-flavours components, it is important to implement this technique to their determination.The present study aims to develop an HS-SPME methodology to identify and quantify cork volatile components that could produce a wine organoleptic deviations, namely: 3-methyl-1-butanol (3-MB), 1-octen-3-ol (1Oct-3), 1-octanol (1-Oct), guaiacol (Gua), 2-methylisoborneol (MIB), 2,4,6trichloroanisole (TCA) and geosmine (Geo). The methodology optimization study has considered the following aspects: i) extraction temperature, ii) global linearity, iiii) linearity and reproducibility to each compound and estimative of SPME Relative Response Factors and iv) analysis of interference effects of the concentration of each compound over the chromatographic areas of the other compounds. After the optimization step, the studied compounds were searched in wine simulants stoppered with standard (N) and defective cork: moulds (B) and yellow stain (MA). Standard solutions in wine simulants were prepared, in concentration ranges including the sensorial perception limits (LPS) of the studied compounds: 3-MB (47,7-191,0 mg/L), 1-Oct-3 (10,7-42,7 g/L), 1-Oct (20,8-208,0 g/L), Gua (5,251,6 g/L), MIB (8,0-80,0 ng/L), TCA (2,0-19,8 ng/L) and Geo (8,4-84,0 ng/L), using a polidimethylsiloxane (PDMS) fiber, with 100 m thickness. The main conclusions arising from the experimental results are: i) The studied compounds have different HS-SPME behaviour, observed by the different Log(FRR) values, which depend on the physical and chemical properties (water solubility, volatility, vapour pressure and liquid phase vs gaseous phase partition).
ii) Although the work was carried out in a concentration range in which it is observed a global linearity in fiber response in relation to the total concentration, the variation of the 1-Oct concentration (from 20,8 to 208,0 g/L) interferes in the quantification of the other components, with exception of 1Oct-3. This effect is positive to 3-MB, and negative to Gua, MIB, TCA and Geo and is related with changes in headspace composition and sorption in the fibre 1-Oct is the component with the higher Log (FRR) value (4,9), interfering with all compounds with lower Log(FRR) values, with no interference in the component with a similar Log(FRR) value, 1-Oct-3 (Log(FRR)= 4,3). The variation of 1-Oct concentration causes errors in the determination of the other components with variation coefficients of 13,8, 39,5, 53,7, 67,1, 62,2% to 3-MB, Gua, MIB, TCA and Geo, respectively. Since 1-Oct is found in the composition of wine and cork in concentrations between 3 and 250 g/L, the observed effect may explain the existence of discrepancies between sensorial analysis of a compound and its quantification by HS-SPME. iii) Finally, the studied compounds were searched in wine simulants, stoppered with N, B and MA cork stoppers, according to the studied methodology. Only TCA was detected, with a concentration of 0,6, 0,4 and 2,4 ng/L, in the wine simulants stoppered with N, B and MA cork stoppers, respectively. TCA was detected in 25% of the simulants stoppered with N cork and 35% of the simulants stoppered and B cork, with all determinations below TCA LPS (4 ng/L). These results indicate that none of the simulants stoppered with N and B cork will be susceptible of present off-flavour defects associated to the seven studied compounds. In the case of simulantes stoppered with MA cork, TCA was detected in 65% of the wine simulants, 35% of them with values higher than the TCA LPS. Thus 35% of wine simulants stoppered with MA cork are susceptible to present off-flavours.
Compostos volteis associados a defeitos de cortia de Quercus suber L.
NDICE
Prembulo Parte I. Introduo 1.1. Cortia
1.1.1. Produo subercola 1.1.2. Caracterizao econmica da indstria da cortia em Portugal 1.1.3. Estrutura celular 1.1.4. Composio qumica 1.1.5. Ataques microbiolgicos 1.1.6. Influncia da cortia sobre as caractersticas organolpticas do vinho
5 7 9
9 11 12 12 23 27
1.2. Micro-extraco em fase slida

1.2.1. Fundamentos tericos 1.2.2. Dispositivos de extraco 1.2.3. Modos de extraco 1.2.4. Fases estacionrias 1.2.5. Influncia das condies experimentais
31
31 33 34 37 38
1.3. Metodologias SPME na anlise de 2,4,6-tricloroanisole em cortia e em vinho 1.4. Enquadramento e objectivos do trabalho Parte II. Materiais e Mtodos 2.1. Materiais
2.1.1. Reagentes e padres 2.1.2. Preparao de rolhas de cortia (N, B e MA) e posterior engarrafamento 2.1.3. Equipamentos
40 43 45 47
47 48 50
2.2. Optimizao da metodologia de HS-SPME

2.2.1. Efeito da temperatura de extraco 2.2.2. Linearidade global da metodologia de HS-SPME
52
52 53
2.2.3. Reprodutibilidade e linearidade da metodologia e estimativa dos Factores Relativos de Resposta (FRR) 54 2.2.4. Avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz 54
2.3. Pesquisa dos compostos-padro nos simulantes de vinho rolhados com cortia N, B e MA 2.4. Tratamento de dados 55 56
2.4.1. Temperatura de extraco 2.4.2. Linearidade global da metodologia HS-SPME 2.4.3. Reprodutibilidade e linearidade da metodologia HS-SPME 2.4.4. Estimativa dos Factores Relativos de Resposta
56 56 57 57
2.4.5. Avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz 57 2.4.6. Pesquisa dos compostos-padro nos simulantes de vinho rolhados com cortia N, B e MA 58
Parte III. Resultados e Discusso 3.1. Optimizao da metodologia HS-SPME

3.1.1. Efeito da temperatura de extraco 3.1.2. Linearidade global da metodologia HS-SPME
59 61
64 69
3.2. Reprodutibilidade e linearidade da metodologia HS-SPME 3.3. Estimativa dos Factores Relativos de Resposta 3.4. Avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz
71 74
77
3.4.1. Anlise do efeito da variao individual da concentrao de cada um dos compostos sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz 77 3.4.2. Anlise do efeito da variao da concentrao dos compostos constituintes da matriz sobre a rea individual de cada um dos compostos 87
3.5. Pesquisa dos compostos padro nos simulantes de vinho rolhados com cortia N, B e MA Parte IV. Concluses Parte V. Bibliografia 93 97 103
Lista de abreviaturas e siglas 1-Oct: 1-Octanol 1-Oct-3: 1-Octeno-3-ol 3-MB: 3-Metil-1-butanol APCOR: Associao Portuguesa de Cortia B: Bolor CAR: Carboxen CAS: Chemical abstract service CV: Coeficiente de variao CW: Carbowax DA: Descritor de aroma DHS-TD: Dinamic headspce-thermal desorption (Espao de cabea dinmico - desoro trmica) SDE: Simultaneously Distillation Extraction (Destilao e extraco simultneas) DVB: Divinilbenzeno FRR: Factor Relativo de Resposta Geo: Geosmina Gua: Guaiacol HACCP: Hazard Analysis and Control of Critical Points (Anlise de perigos e controlo dos pontos crticos) HS: Headspace (espao de cabea) INE: Instituto Nacional de Estatstica LD: Limite de deteco LLE: Liquid-Liquid Extraction (Extraco lquido-lquido) Log(FRR): Logaritmo do FRR LogP (oct/ag): Logaritmo do coeficiente de partio octanol/gua
LPS: Limite de percepo sensorial LQ: Limite de quantificao MA: mancha amarela MHS-SPME: Multiple headspace-solid phase microextraction (mltipla microextraco em fase slida) MIB: 2-Metilisoborneol MS: Espectrometria de Massa m/m: massa/massa MM: Massa molecular N: Normal p.e: Ponto de ebulio PA: Poliacrilato PAH: Polycyclic aromatic hydrocarbons (hidrocarbonetos aromticos policclicos) PDMS: Polidimetilsiloxano PI: Padro interno r.p.m. rotao por minuto SBSE: Stir bar sorption extraction (Soro em barra agitadora) SPME: Solid phase microextraction (microextraco em fase slida) TCA: 2,4,6-Tricloroanisole tr: Tempo de reteno v/v: volume/volume
Prembulo
A rolha de cortia o vedante de eleio para garrafas de vinho. Do ponto de vista fsicomecnico, as suas propriedades de impermeabilidade e elasticidade conferem-lhe caractersticas mpares, no havendo substituto que permita conciliar um mximo de estanquecidade com um to longo prazo de aplicao, que chega a ser de dcadas1. O facto de ser um produto natural torna-a susceptvel de sofrer alteraes, desde a floresta at ao momento do engarrafamento, as quais podem causar desvios organolpticos de impacto negativo nas bebidas. Estes desvios tm vindo a ser atribudos a compostos resultantes da actividade microbiolgica2,3 ou ainda de compostos qumicos utilizados no acabamento das rolhas. A contaminao pelo meio ambiente envolvente4,5 igualmente uma das vertentes a considerar. Os compostos volteis susceptveis de provocar defeitos apresentam normalmente baixos limites de percepo sensorial, bastando assim a sua presena em concentraes muito baixas, da ordem dos ng/L, para causarem alteraes organolpticas nas bebidas que so rolhadas com cortia, particularmente no vinho. Os processos de migrao destes compostos a partir da cortia e os eventuais efeitos de interaco entre estes na matriz, podem afectar a sua deteco, a nvel sensorial e instrumental. A microextraco em fase slida (SPME) tem sido amplamente usada para anlise de compostos volteis em vrios produtos, nomeadamente a quantificao, em cortia e vinho, de compostos associados a defeitos, especialmente o 2,4,6-tricloroanisole (TCA). No entanto, por vezes verificam-se algumas discrepncias entre os dados obtidos por esta metodologia e os da anlise sensorial. A tcnica de SPME, comparada com as tcnicas clssicas de anlise de compostos volteis, especialmente com a extraco por solventes orgnicos (LLE e SLE), tem como vantagens o facto de no recorrer a solventes, de no necessitar de preparao prvia da amostra, ser facilmente automatizada e ainda permitir a anlise dos compostos presentes no espao de cabea, os quais so responsveis pelo aroma dos produtos6,7. O presente trabalho tem 2 objectivos principais:
i)
Desenvolver uma metodologia de HS-SPME para identificar e quantificar compostos volteis susceptveis de provocar defeitos sensoriais em vinhos em contacto com cortia;
ii)
Pesquisar os compostos padro estudados em simulantes de vinho que estiveram em contacto com cortia normal e cortia com defeitos (bolor e mancha amarela).
Parte I Introduo
1.1. Cortia
A cortia um tecido vegetal, constitudo de clulas mortas dispostas em parnquima suberificado, originado pelo meristema sbero-felodrmico que constitui o revestimento do tronco e ramos do sobreiro, Quercus suber L.. O felogene (tecido merismtico com capacidade de diviso celular) tem uma espessura unicelular e gera clulas de cortia (felema, ou sber) para o exterior. Para o seu interior o felogene origina um outro tecido, a feloderme (clulas semelhantes s da madeira), que normalmente constituda por poucas fiadas de clulas e quantitativamente menos significativa. O felema, felogene e a feloderme constituem no seu conjunto a periderme, constituda quase na totalidade pelo sber8. O interesse industrial da cortia deve-se a um conjunto de caractersticas invulgares que este tecido apresenta face a outros materiais naturais. Propriedades, tais como, baixa condutibilidade trmica, relativa impermeabilidade a lquidos e elasticidade, e pelo facto de se tratar de um tecido homogneo suficientemente espesso que naturalmente regenerado aps cada extraco, tem permitido a sua longa explorao9. Actualmente a principal aplicao como vedante (nos sectores vincola e automvel) ou como isolante e decorativo (no sector da construo civil). Em termos econmicos, Portugal tem uma posio de liderana mundial em vrios domnios10, nomeadamente: na produo de matria-prima, com a maior taxa de produo por hectare e mais de metade da produo mundial de cortia em bruto (Tabela 1); na produo industrial, com mais 60% do valor da produo de produtos de cortia transformados;
1.1.1. Produo subercola Em termos de produo subercola, apesar do sobreiro se conseguir desenvolver em vrias zonas do mundo, s na regio mediterrnica apresenta a capacidade de regenerao de cortia aps sucessivas extraces. A zona de produo de cortia restringe-se assim a 7 pases: Portugal, Espanha, Frana, Itlia, Arglia, Tunsia e Marrocos (Figura 1).
Figura 1. Distribuio actual da rea de plantao do sobreiro9.
Portugal o maior produtor subercola do mundo, verificando-se no ano 2000 uma rea de plantao de 730 000 hectares com produo de 185 000 toneladas de cortia, o que representa mais de 50% de toda a cortia extrada anualmente (Tabela 1). As condies edafo-climticas e as tcnicas de produo utilizadas permitem que se consiga, em Portugal, a maior taxa de produo mundial por hectare.
Tabela 1. Distribuio da rea de plantao de sobreiro e produo de cortia a nvel mundial rea de sobreiro Hectares 730 000 500 000 410 000 340 000 100 000 99 000 90 000 2 269 000 % 33 22 18 15 4 4 4 100 Produo mdia anual Toneladas 185 000 88 000 20 000 15 000 5 000 9 000 18 000 340 000 % 54 26 6 4 1 3 5 100 Taxa de produo Ton/Ha 25,3 17,6 4,9 20,0 4,4 9,1 5,0 15,5
Pas Portugal Espanha Arglia Marrocos Frana Tunsia Itlia Total
Fonte: APCOR dados de 2002.
10
1.1.2. Caracterizao econmica da indstria da cortia em Portugal A organizao do sector industrial da cortia em Portugal reparte-se em ramos de actividade, com um processo de transformao faseado e classificado nos seguintes subsectores: Preparao, que integra as operaes de seleco, cozedura e estabilizao e
triagem (seleco) da cortia que, sob a forma de prancha, segue o ciclo de produo como matria-prima do sub-sector seguinte: a transformao; Transformao, que visa a elaborao de produtos por simples corte da prancha e
onde se inclui a fabricao de rolhas de cortia natural; Granulao, com operaes de triturao de cortia de calibre/qualidade inferior e
desperdcios resultantes do fabrico natural (apara), produzindo as diferentes matriasprimas para a indstria de aglomerados; Aglomerao, que corresponde produo de diferentes tipos de aglomerados
conforme envolva ou no produtos estranhos cortia. Como se pode depreender, h uma elevada interdependncia entre os diferentes ramos da indstria, uma vez que correspondem a fases sequenciais de transformao de um mesmo material. Segundo dados do INE, os valores finais para o ano de 2002 indicam um valor total de exportao de 903 milhes de euros, relativos a mais de 138 mil toneladas dos diversos produtos. O sector vincola o principal mercado, representando 68% em valor dos produtos fabricados, seja a rolha cortia natural como a de cortia aglomerada, com 57% e 11% do valor, respectivamente. Segue-se o sector de matrias de construo civil e o sector da indstria automvel, com 19% e 11%, respectivamente. Em termos socio-econmicos, caracterizado pela existncia de mais de 900 unidades em todos os ramos sectoriais, localizadas na sua grande maioria no distrito de Aveiro, que representam mais de 10 000 postos de trabalho. O tecido industrial constitudo por micro e pequenas empresas, em que mais de 70% delas tm menos de 20 trabalhadores. Este sector integra um elevado nmero de unidades certificadas (com sistemas de Gesto da Qualidade: ISO9001, Ambiental: ISO14001, HACCP: Segurana Alimentar:
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DS3027 e Systecode11), que utiliza tecnologias de produo avanadas e apresenta sinais de crescentes esforos de investigao e de controlo.
1.1.3. Estrutura celular Macroscopicamente, a cortia apresenta uma colorao castanha clara com linhas relativas aos anis de crescimento anual e canais lenticulares. Trata-se de um material leve e elstico, apresentando como caracterstica mpar a capacidade de ser comprimido sem expanso lateral. Microscopicamente constituda por camadas consecutivas de clulas mortas de aspecto alveolar (Figura 2). Apresenta uma estrutura regular com clulas de forma aproximadamente prismtica, empilhadas em camadas na direco radial do tronco da rvore, ligadas entre as bases. Na seco tangencial as clulas de cortia apresentam a forma de polgonos com 5, 6 ou 7 faces num arranjo de aparncia alveolar em forma de favo de mel12. A espessura da parede de 1,1-1,4 m (Figura 2).
A: ampliao de 500 vezes
B: ampliao de 5000 vezes.
Figura 2. Fotografias de microscopia electrnica de varrimento. Clulas de cortia de reproduo. A: corte da seco tangencial, mostrando o arranjo em forma de favo de mel; B: Parede celular de cortia normal, com espessura 1,1-1,4 m12.
1.1.4. Composio qumica A constituio qumica das paredes celulares da cortia pode ser dividida em dois tipos de componentes: os componentes estruturais e os componentes no-estruturais. Os
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componentes estruturais so macromolculas de natureza polimrica, que conferem s clulas a sua forma e grande parte das suas propriedades fsico-qumicas. A remoo de um dos componentes estruturais s possvel atravs de ataques qumicos ou mecnicos com intensidade suficiente para promover a sua despolimerizao parcial e solubilizao, alterando as caractersticas fsico-qumicas da cortia. Os componentes estruturais maioritrios da cortia so a suberina (ca. 40%), lenhina (ca. 20%) e polissacardeos (ca. 20%)8. Os componentes no estruturais classificam-se em compostos extractveis e compostos inorgnicos. Os compostos extractveis podem ser retirados das paredes celulares sem alterao significativa as propriedades mecnicas da cortia. Representam cerca de 15%, dividindo-se em fraco cerosa e fraco fenlica3. Os componentes inorgnicos so englobados no que geralmente se denomina por cinzas (ca. 1,2%)8, ou seja, o resduo da combusto completa da matria orgnica, sendo constitudos principalmente por clcio (60% m/m das cinzas), seguindo-se o fsforo, o sdio, o potssio e o magnsio. Tem surgido um crescente interesse no estudo e caracterizao dos compostos constituintes da cortia, nomeadamente a suberina13,14,15 como fonte de polmeros e por ter actividade anti-mutagnica16 e os triterpenos, como a betulina, o cido betulnico e a friedelina, com actividade anti-cancergena17. 1.1.4.1. Fraco voltil A composio voltil da cortia tem sido pouco estudada. Os primeiros estudos publicados foram baseados em tcnicas de extraco e concentrao da fraco voltil da cortia considerada normal usando Freon 113, Chromosorb 101 e Freon 11, seguida de separao e identificao dos compostos por GC/MS18, tendo sido identificando o terpineol, a cnfora, o furfural, a vanilina, o acetato de etilo o n-hexanol, o 5-metilfurfural, o cido butanico, o 1,2-dimetioxibenzeno, o benzotiazole, o pentanol, o pentanal e o 2pentilfurano. Em estudos posteriores procedem anlise da fraco voltil da cortia recorrendo a tcnicas de anlise de espao de cabea dinmico com desoro trmica (DHS-TD)19 e extraco-destilao simultneas (SDE) pelo mtodo de Lickens-Nickerson modificado20. No primeiro, aps se proceder remoo da camada exterior da rolha de cortia (cerca de 4 mm de espessura em toda a superfcie), estas so trituradas. O p de cortia
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resultante submetido a um fluxo de hlio e os compostos volteis libertados so adsorvidos em Tenax. A remoo no GC efectuada por um sistema de desoro trmica, tendo sido identificados 90 compostos (Tabela 2). Este mtodo de extraco s permite a remoo dos compostos volteis. A introduo de artefactos pela degradao trmica do sorbente utilizado a maior dificuldade desta metodologia, pois a interaco de vapor de gua, compostos volteis e o material sorbente utilizado pode produzir artefactos durante a anlise de compostos volteis21. No segundo estudo procede-se recolha de pranchas de cortia consideradas normais (sem cheiros anormais ou defeitos visuais), que so cortadas em pedaos e colocadas no sistema de Lickens-Nickerson modificado, extradas durante 24 horas com n-pentano, sendo o extracto concentrado e analisado por GC/MS, tendo sido identificados 74 compostos (Tabela 2). Esta metodologia apresenta algumas desvantagens: uma metodologia muito morosa e podem ocorrer artefactos formados por degradao trmica de componentes da cortia, nomeadamente o furfural e 5-metilfurfural 20,21,22. Os compostos detectados em cada um dos estudos apresentam-se na tabela 2, por classe qumica, sendo colocados dentro de cada classe por ordem alfabtica, indicando a deteco em cada um dos mtodos com (+) e no deteco com (-). Os cidos carboxlicos alifticos identificados, unicamente pelo mtodo de DHS-TD, resultam provavelmente da degradao de compostos cidos da fraco cerosa dos compostos extractveis da cortia, composta por cidos, dicidos e hidroxicidos gordos, com cadeia longa de C20 a C26. A degradao dos cidos gordos, seja por auto-oxidao seja por actividade enzimtica, resulta no aparecimento de cidos de cadeia mais curta, seguindo-se a reduo aos correspondentes compostos carbonlicos alifticos, aldedos e cetonas, lcoois e alcanos e alcenos. Estes cidos (hexanico, octanico e decanico), apresentam aromas intensos e com descritores de aroma a cera e rano (Tabela 3). A causa para a no deteco de cidos volteis por SDE poder estar relacionada com o facto de no serem solveis em n-pentano. A produo de compostos carbonlicos alifticos, como aldedos e cetonas, resulta assim da degradao de cidos gordos (peroxidao lipdica). As ceras e a suberina contm quantidades de cidos gordos livres susceptveis de degradao. Esta degradao pode ocorrer por auto-oxidao dos cidos gordos ou por actividade enzimtica, promovendo a primeira a formao de aldedos volteis, caracterizados por apresentarem aromas excepcionalmente fortes, mesmo que presentes em pequenas quantidades, e a segunda
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a produo de metilcetonas que em parte so reduzidas aos correspondentes lcoois secundrios20. Os lcoois primrios encontrados foram o 1-butanol, o 1-pentanol,o 1-hexanol,o 1-octanol e o 1-dodecanol, cuja origem pode estar na reduo de aldedos alifticos. A origem dos hidrocarbonetos alifticos (maioritariamente alcanos), embora ainda no completamente conhecida, parece resultar de actividade microbiolgica, uma vez que cortia sujeita a condies de actividade microbiolgica mais intensa sua superfcie apresenta maiores nveis de alcanos e cicloalcanos3. Verifica-se que os compostos que so comuns nos dois estudos so o n-octano, o n-undecano e n-tridecano. Na classe dos cicloalcanos alifticos, detectados unicamente por SDE, foram identificados 6 derivados substitudos de ciclo-hexano e 1 biciclo-heptano. Vrios derivados de furanos foram identificados, nomeadamente furfuraldeidos (furfural e 5-metilfurfural), lcool furfurlico e 2-pentilfurano, presentes em grande percentagem relativa em ambos os mtodos. A presena destes compostos est normalmente associada ocorrncia de reaces de degradao de acares (do tipo reaco de Maillard) provavelmente por aco da temperatura no processo de transformao industrial da cortia (cozedura, autoclavagem e secagem)22. O seu limite de percepo sensorial alto sendo por isso fraca a sua contribuio para o aroma da cortia19. Os furanos, como o 2-pentilfurano e o acetilfurano, so produtos resultantes da autooxidao do cido linolico20. Os principais compostos aromticos presentes so os alquilbenzenos, sendo a fonte mais provvel para o seu aparecimento a degradao da lenhina e da componente polifenlica da suberina, no havendo evidncia para ser resultante de actividade microbiolgica ou degradao trmica. Os cidos fenlicos e a lenhina so degradados termicamente ou decompostos por microrganismos resultado assim fenis: guaiacol, benzaldeido, vanilina e lcool benzlico. Os compostos com estruturas bifenlicas como naftaleno e naftaleno substitudo podem estar presentes na cortia como contaminantes qumicos de pela exposio a atmosfera contendo hidrocarbonetos aromticos policclicos (PAHs)19.
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Tabela 2. Compostos volteis identificados em cortia considerada normal. Classe qumica cidos alifticos Composto cido actico cido butanico cido 2-etil-hexanico cido heptanico cido hexanico cido 3-metilbutanico cido 2-metilpropanico cido nonanico cido octanico cido pentanico cido propanico Acetona Butanal 2-Butanona 2,4-Decadienal Decanal 2-Decenal 9-Deceno-2-ona 2,6-Dimetil-2,6-undecadieno-10-ona 6,10-Dimetil-5,9-undecadieno-2-ona 2-Dodecanal Heptanal 2-Heptanal 2-Heptanona Hexanal 3-Metilbutanal 6-Metil-3,5-heptadieno-2-ona 6-Metil-5-hepteno-2-ona 2-Metilpentanal 3-Metil-2-pentanona 2,4-Nonadienal Nonanal 2-Nonenal Octanal 2-Octenal Pentanal 2-Tridecenal 2-Undecanona Mtodo de extraco DHS-TD 19 SDE20 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Compostos carbonlicos alifticos
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Tabela 2 (continuao). Compostos volteis identificados em cortia considerada normal. Classe qumica lcoois alifticos Composto 1-Butanol 2-Butoxietanol 5,9-Dimetil-9-deceno-3-ol 1-Dodecanol 2-Etil-1-hexanol 1-Hexanol 3-Metil-1-butanol 1-Octanol 1-Pentanol 1-Undeceno-4-ol 2,3-Dimetil-1,3-butadieno Dimetil-heptano 3,5-Dimetil-1,6-octadieno n-Dodecano Etilmetil-hexano 3-Etil-2-metil-1,3-hexadieno 2-Metil-heptano 3-Metil-heptano 3-Metiloctano 2-Metil-1-penteno Metil-propeno Nonano n-Octano 1-Octino n-Tridecano n-Undecano 1,2-Dimetilciclo-hexano 1,3-Dimetilciclo-hexano 2,2-Dimetil-3-biciclo-heptano Etil-ciclo-hexano 1-Etil-2-metilciclo-hexano 1-Etil-3-metilciclo-hexano Isopropil-ciclo-hexano 2-Acetilfurano lcool furfurlico Furfural 5-Metilfurfural 2-Pentilfurano Mtodo de extraco DHS-TD19 SDE20 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
Alcanos, alcenos e alcinos
Cicloalcanos alifticos
Furanos
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Tabela 2 (continuao). Compostos volteis identificados em cortia considerada normal. Classe qumica Compostos Aromticos Composto Acetofenona (1-feniletanona) lcool ,-dimetilbenzlico lcool benzlico Alcool tert-butilbenzilico Benzaldeido Benzeno 3,8-Di-hidroxi-3,4-di-hidronaftaleno-1-ona 1,2-Dimetilbenzeno 1,3-Dimetilbenzeno 1,4-Dimetilbenzeno Dimetilnaftaleno 1,2-Dimetoxibenzeno (veratrole) 1,3-Dimetoxibenzeno (resorcinol) Etilbenzeno Etil-dimetilbenzeno 1-Etil-3-metilbenzeno Fenol 2- Hidroxibenzaldeido 2-Hidroxi-5-metilacetofenona Isopropilbenzeno 4-Metilacetofenona 1-Metil-4-isopropilbenzeno 3-Metil-isopropilbenzeno 1-Metilnaftaleno 2-Metilnaftaleno 1-Metilvinilbenzeno 2-Metoxi-4-metil-1-propilbenzeno 4-Metoxifenol (guaiacol) Naftaleno Propilbenzeno 1,2,3,4-Tetrametilbenzeno Tolueno 1,2,3-Trimetilbenzeno 1,2,4-Trimetilbenzeno 1,3,5-Trimetilbenzeno Vanilina Vinilbenzeno 1-Vinil-2-metilbenzeno Mtodo de extraco DHS-TD19 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + SDE20 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
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Tabela 2 (continuao). Compostos volteis identificados em cortia considerada normal. Classe qumica Terpenides Composto Borneol Canfeno Cnfora 1,8-Cineole Copaeno Fencol Geranilcetona Geraniol Isoborneol Isopinocanfona Limoneno Linalol -Ocimeno -Terpineol 1,3,3-Trimetilbiciclo[2.1.1]heptano-2-ol Benzotiazole Clorobenzeno 1,3-Diclorobenzeno Etilisotiocianato 1,1,1-Tricloroetano Triclorometano Acetamida Acetato de etilo 2-Butoxietanol 1,1-Dietoxietano N,N-Dimetilformamida ter dietlico Tetrametiltioureia 2,4,6-Trimetil-1,3,5-trioxano Mtodo de extraco DHS-TD19 SDE20 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -
Compostos clorados e sulfurados
Outros
Os terpenides so comuns em plantas, tambm podendo surgir como metabolitos de microrganismos. Na cortia foram identificados na fraco dos compostos extractveis23. Apresentam um vasto espectro de aromas, sendo a maioria muito agradvel19. Na classe de compostos clorados e sulfurados foram detectados clorofilinos (2 compostos), 2 clorobenzenos (2 compostos) e compostos sulfurados: o benzotiazole,
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comum nos dois mtodos, e o etilisotiocianato. Os compostos clorados, detectados unicamente por DHS-TD, com base na informao disponvel, no podem ser indicados como tendo causa natural (seja enzimtica seja degradao qumica dos componentes da cortia) parecendo tratar-se de resduos de tratamento qumico das rolhas analisadas19. Os compostos sulfurados podem ser metabolitos secundrios da degradao microbiolgica de aminocido, nomeadamente metionina24. Outros compostos identificados so aminas, teres e steres. As aminas, acetamida e N,N-dimetilformamida, podem resultar da reaco de aminocidos e acares redutores, por aco trmica (reaco de Maillard)19. Na classe dos teres foram identificados pelo mtodo DHS-TD o ter dietilico e o 2,4,6-trimetil-1,3,5-trioxano. Na classe dos steres, unicamente o acetato de etilo foi identificado por DHS-TD. A maioria dos compostos volteis identificados apresenta um aroma caracterstico (descritor de aroma- DA) a partir de uma dada concentrao (Limite de percepo sensorial-LPS). Assim, o aroma da cortia normal (N) depende do tipo de compostos volteis presentes e da sua concentrao. Na Tabela 3 apresentam-se alguns dos compostos volteis detectados na cortia considerada normal, agrupados de acordo com a respectiva classe qumica, o seu descritor aroma e o LPS em gua ou vinho. No sentido de clarificar o significado do gosto a rolha, e a afastar desta classificao desvios organolpticos que podem ter uma origem distinta, advir por exemplo, de acidentes de natureza enolgica, ou de contaminao da rolha por compostos de aroma nos locais de armazenamento do vinho2, e por outro lado normalizar a terminologia utilizada nos descritores de aroma dos resultados obtidos em ensaios de anlise sensorial de rolhas de cortia (aps contacto com gua ou soluo simulante de vinho ou mesmo vinho), foi elaborada uma roda de aromas da cortia25 (Tabela 4). Esta roda resulta da compilao de resultados de anlise sensorial de vinho, efectuada por 2 painis de provadores treinados. As amostras de vinho forma recolhidas com indicao e confirmao de existncia de alteraes em relao ao aroma caracterstico do vinho25. O vinho foi acompanhado na sua fase de fabrico para garantir que no apresentava defeitos ao nvel de aroma, as alteraes observadas deveriam ser associadas exclusivamente cortia.
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Tabela 3. Compostos volteis identificados na cortia e respectivos descritores de aroma e limites de percepo sensorial (LPS). Classe qumica Terpenides Composto Borneol Isoborneol Limoneno Linalol -Terpeniol lcoois alifticos 1-Butanol 1-Hexanol 3-Metil-1-butanol 1-Octanol cidos alifticos cido 3-metilbutanico cido octanico Compostos aromticos Acetofenona lcool benzilico Benzaldeido Guaiacol Vanilina Furanos lcool furfurlico Furfural 5-Metilfurfural Compostos carbonlicos alifticos Decanal Hexanal 2-Nonenal 2-Undecanona Outros Benzotiazole Descritor de aroma Pimenta Cnfora Frutado Floral Floral Farmacutico Herbceo Whisky, malte Cera, sabo Rano Cera, farmacutico Floral Frutado Amndoa amarga Fumado, madeira Baunilha Feno Caramelo Tostado, amndoa Mofo, marinho, pepino Verde, erva Metlico, oleoso, gernio Rosa, citrino Borracha LPS em vinho ou *gua19 60 g/L * 100 g/L * 280 g/L* 5 mg/L 5 mg/L 300 mg/L 700 g/L 15 mg/L 50 mg/L 3 mg/L 20 g/L 100 g/L * 52 mg/L 65 mg/L 35 mg/L 4,5 mg/L -
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De acordo com a roda de aromas da cortia, os descritores de aroma foram agrupados em famlias, que por sua vez se reuniram em 5 grupos principais: confero, vegetal, qumico, musgo e bolor (Tabela 4). Estes descritores de aromas podem ser associados a compostos qumicos volteis presentes na cortia (Tabelas 2 e 3).
Tabela 4. Grupos, famlias e descritores de aroma de acordo com a roda dos aromas da cortia25. Grupo Musgo Famlia Cogumelo fresco Hmus Terroso Qumico Sulfureto Pirognico Fenlico Hidrocarbonetos Vegetal Madeira Herbceos Balsmico Especiarias Confero Agressivo Terpnico Bolor Bolorento Descritor de aroma Cogumelo; Trufa Ptrido/Cogumelos Cortia hmida; Terra fresca; Beterraba vermelha; Batata Choco; Ptrido; Plo molhado; L molhada Alcatro; Borracha queimada; Cinza Farmacutico; Couro; Fumo Petrleo; Gasleo; Gasolina Cortia fresca; Madeira; Poeira Erva; Feijo verde; Madeira verde Caramelo; Baunilha; Feno Aromtico; Pimenta; Paprika Cnfora; Eucalipto Pinheiro; Resina Bolor; Bafio; Ptrido (frutos); Mofo de cortia; Mofo de cave
Pode-se assim constatar que o gosto a rolha foi decomposto em vrios descritores, podendo vrios compostos ser considerados como responsveis pela ocorrncia deste defeito no vinho, resultando muitas vezes da aco cumulativa de vrios compostos, sendo contudo o mais fortemente associado, e pelo seu baixo limite de percepo
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sensorial (4 ng/L) o 2,4,6-tricloroanisole. A concentrao necessria de cada compostos voltil, ou mesmo a concentrao resultante da aco sinergtica de diferentes compostos, necessria para induzir defeito num vinho depende ainda das prprias caractersticas deste ltimo, como o tempo de envelhecimento, o teor em lcool e as castas de uvas intervenientes2. Uma vez que uma grande maioria dos compostos volteis de aroma identificados na cortia (Tabelas 2 e 3) resulta de actividade microbiolgica ou degradao trmica, a cortia pode apresentar perfis de aromas que so dependentes das caractersticas de processamento industrial e dos ataques microbiolgicos sofridos.
1.1.5. Ataques microbiolgicos A cortia um produto natural susceptvel de sofrer ataques microbiolgicos, desde a floresta, durante o processamento industrial, at fase de engarrafamento. Estes ataques podem conduzir a alteraes na sua composio qumica e consequentemente nas suas propriedades mecnicas, aspecto visual e odor. Em 19901 surgem as primeiras referncias a defeitos em vinhos associados a metabolitos secundrios provenientes da cortia. Os bolores do gnero Streptomyces, Aspergillus e Penicillium, que se podem desenvolvem superfcie das rolhas de cortia, podem provocar a degradao qumica dos seus constituintes e originar a formao de metabolitos secundrios susceptveis de provocar defeitos ao nvel sensorial. Os mais estudados tm sido o guaiacol26 e alguns compostos organoclorados, tais como o 2,4,6tricloroanisole27. Muitos outros compostos tm sido referidos como resultantes da actividade de fungos sobre alimentos, tais como 2-metilisoborneol, geosmina, 1-octeno-3ol, 1-octeno-3-ona e metilcetonas24. A microflora da cortia, bem como do ambiente fabril, ao longo do processo de transformao tem vindo a ser objecto de vrios estudos28,29. Verifica-se que a cortia um meio muito complexo, que pode suportar o desenvolvimento de grandes e variadas populaes de microrganismos sendo os bolores os mais frequentes, seguindo-se as bactrias e por fim as leveduras26. Estes podem-se encontrar nas lenticelas, desenvolvendo-se superfcie do tecido suberoso quando as condies de temperatura e humidade forem favorveis.
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Dentro das situaes de ataques microbiolgicos consideram-se duas particularmente relevantes, dadas as consequncias nefastas que da podem advir: cortia contaminada com bolor (B) e cortia com mancha amarela (MA). Estes tipos de cortia apresentam composio qumica distinta (Tabela 5).
Tabela 5. Composio qumica de cortia normal (N), bolor (B) e mancha amarela (MA)3. Parmetro Cortia normal (N) Suberina Lenhina Polissacardeos Acares livres20 Extractveis Diclorometano Etanol gua Substncias pcticas12 Extractveis em soluo etanol/gua (12%) a) Pranchas de cortia colocadas em lugar hmido, durante 2 meses. 37,3 22,9 25,9 1,43 13,4 7,3 4,0 2,1 1,5 2,9 % (m/m) Cortia bolora) (B) 40,2 22,8 19,4 0,26 11,5 6,3 3,5 1,7 2,1
Cortia mancha amarela (MA) 38,0 20,0 20,4 1,13 17,0 6,6 4,7 5,7 0,5 5,5
Apesar de ser uma rea pouco estudada, verifica-se que a diferena entre a cortia N e B se situa mais ao nvel dos polissacardeos, acares livres e compostos extractveis, com alteraes ao nvel da fraco voltil, enquanto que em relao cortia MA, alm das alteraes ao mesmo nvel se verificam ainda indcios de alteraes suplementares ao nvel da lenhina. Este facto responsvel pela alterao da estrutura celular observada para a cortia MA (ponto 1.1.5.2.).
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1.1.5.1. Cortia contaminada com bolores O crescimento dos bolores nas pranchas de cortia pode causar diferenas significativas no seu aroma, dependendo das espcies que se desenvolvem, pois diferentes espcies levam produo de diferentes metabolitos secundrios20. A anlise comparativa de placas de cortia recolhida em condies normais de fabrico e outras colocadas durante dois meses em local hmido promovendo assim o crescimento de bolores, conclui que a actividade dos bolores sobre a cortia acentuada ao nvel dos polissacardeos e de uma fraco dos compostos extractveis, principalmente nos polifenlicos3, 20. A fraco voltil da cortia contaminada altera-se, apresentando uma menor quantidade de aldedos alifticos e, pelo contrrio, uma maior quantidade de lcoois alifticos, nomeadamente: o 1-butanol, o 3-metil-1-butanol, o 1-pentanol e o 1-undeceno-4-ol. Isto ocorre por aco de dehidrogenases, reduzindo os aldedos derivados dos cidos gordos aos lcoois correspondentes. Este tipo de cortia apresenta igualmente uma maior proporo de hidrocarbonetos alifticos, sendo notrio o incremento em metilalcanos, nomeadamente o 2-metil-heptano, o 3-metil-heptano, o 3-metiloctano, e, igualmente, uma maior proporo de terpenides, sendo formado o 2-metilisoborneol, que apresenta aroma desagradvel a terra/mofo20. O aparecimento de compostos aromticos clorados, nomeadamente o 1,4-
diclorobenzeno e o 2,4,6-tricloroanisole (TCA), parece ter origem na metilao microbiolgica de clorofenis25,30,31,36, cuja presena poder igualmente estar associada a actividade microbiolgica, uma vez que existem referncias para a biognese de compostos aromticos clorados em ambientes naturais32. Os compostos organoclorados pertencem ao mais importante grupo de poluentes prioritrios da agncia americana de proteco ambiental (EPA), tendo a Unio Europeia estabelecido j limites para a concentrao destes analitos em gua destinada ao consumo humano. A sua presena em cortia pode ter diferentes origens, incluindo o uso de fungicidas, herbicidas, preservantes de madeira ou produtos de lavagem contendo 2,4,6-triclorofenol, 2,3,4,6-tetraclorofenol e pentaclorofenol, seja no ambiente de desenvolvimento transformao. do sobreiro seja por contaminao durante o processo de
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Estudos anteriores25,33 efectuados em pranchas de cortia concluram que, apesar dos nveis se encontrarem abaixo do LPS, a presena de TCA resulta de uma contaminao ambiental externa durante o perodo de crescimento da cortia (9 anos), uma vez que as quantidades detectadas na regio junto ao solo e na parte exterior da prancha foram significativamente maiores do que nas partes superiores da rvore e na parte junto ao tronco. A identificao dos compostos formados por cada uma das espcies que fazem parte da microflora da cortia ou quais as espcies que produzem determinado compostos qumico, tm sido as duas formas de abordagem dos efeitos da actividade microbiolgica sobre a cortia. No primeiro pode-se referir o isolamento de 10 espcies de microrganismos dos gneros: Penicillium (3 estirpes), Trichoderma (2 estirpes), Aspergillus (2 estirpes), Mucor, Monillia e Streptomyces (1 estirpe de cada) de pranchas de cortia sem qualquer processamento industrial, que foram cultivados num meio de cultura de extracto de malte e outro com p de cortia esterilizado, sendo os compostos volteis produzidos analisados por DHS-TD, sendo identificados por GC-MS34. Os compostos volteis produzidos por crescimento das estirpes em cortia foram: sesquiterpenos (-santaleno, cariofileno, e -bergamoteno, isocariofileno, -bisaboleno e -curcumeno) com aromas balsmico, floral ou frutado, anisole, compostos aromticos clorados (clorobenzeno e 1,3-diclorobenzeno), 1-octeno-3-ol, com aroma a cogumelos, e 3-octanona, que apresenta descritores de aroma: floral, verde, frutado e a mofo. Em relao a compostos qumicos especficos produzidos pela microflora da cortia, os estudos tm sido orientados para a produo de TCA27,30 e guaiacol26. Em termos de estrutura celular, e por anlise por microscopia electrnica de varrimento, no se verificam diferenas entre clulas de cortia N e cortia B, seja ao nvel da degradao por bolores das lamelas da parede celular seja na alterao da sua espessura12.
1.1.5.2. Cortia classificada como mancha amarela O ataque por fungos, como a Armillaria mellea, provoca na cortia alteraes qumicas e fsicas, e consequentemente modificaes nas suas propriedades mecnicas e caractersticas visuais. Este tipo de cortia pode estar na origem do aparecimento de aromas indesejveis em vinho em contacto com esta cortia. A A.mellea pode
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desenvolver-se nos solos das florestas e actua como parasita em plantas vivas e como saprfita em tecido mortos. Como parasita, este fungo causa a reduo do crescimento, a decrepitude e fragilizao, predispondo-as para o ataque por outros fungos e insectos, podendo mesmo provocar a sua morte. Como saprfita, o microrganismo presente na podrido branca dos troncos e cascas. Na cortia, aps uma fase inicial em que se desenvolve um miclio de cor branca, comea a aparecer zonas com colorao amarela, e que se verifica principalmente na produo de cortia do Norte de Africa2,20,35. A cortia com desenvolvimento de colorao amarelada industrialmente separada e classificada como defeituosa, com mancha amarela11. Estudos sobre cortia com sinais evidentes de mancha amarela (MA)3,20 indicam a presena de maior quantidade de terpenides do que as registadas em cortia N. Verificou-se igualmente um incremento dos teores de benzaldeido, lcool benzlico, 2hidroximetil-acetofenona e vanilina na cortia MA, o que dever estar associado degradao da fraco fenlica da cortia. Neste tipo de cortia foram igualmente identificados compostos organoclorados, nomeadamente o TCA 20. A cortia MA apresenta um aroma diferente da cortia N. Quando seca apresenta um aroma adocicado que dever estar relacionado com os compostos fenlicos volteis, quando hmida tem um aroma a bolor, podendo neste caso revelar os descritores de aroma associados ao TCA. Esta cortia apresenta uma estrutura celular heterognea, apresentando zonas com estrutura celular irregular. Na zona das manchas, as clulas tornam-se enrrugadas, apresentando separao ao nvel da lamela mdia, com diminuio da espessura da parede celular (0,6-0,9 m de espessura)12. Estes efeitos devem-se ao facto dos fungos solubilizarem e removerem a fraco pctica de polissacardeos da lamela mdia e atacarem a lenhina.
1.1.6. Influncia da cortia sobre as caractersticas organolpticas do vinho A aplicao mais comum da rolha de cortia a vedao de vinho. A rolha completamente introduzida no gargalo de garrafas de vidro, que so de seguida deitadas ou invertidas, estando assim o vinho em contacto com a cortia. A sua utilizao remonta a pocas anteriores ao nascimento de Cristo mantendo-se ainda actualmente como o vedante de eleio, especialmente para vinhos de qualidade e aqueles que vo estar em
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garrafa durante perodos longos36, que por vezes podem chegar aos 30 anos, e at mais. Em todo o mundo so anualmente vendidas 12 a 13 mil milhes de garrafas de vinho com rolha de cortia19. As caractersticas de teor em lcool, tipicamente entre 8 e 13%, e de acidez, com pH entre 3,2 e 4, tornam o vinho uma soluo de extraco, ocorrendo a migrao de compostos da cortia para o vinho. Utilizando uma soluo etanol/gua a 12 %, os compostos extractveis de cortia normal (N) representam um valor da ordem dos 2,9% m/m (Tabela 5), podendo ser solubilizados compostos aromticos derivados de substncias fenlicas, acares livres, triterpenos, n-alcanos, n-alcois e cidos gordos. Estudos de migrao efectuados em vinho37,38 indicam que os compostos volteis que podem migrar de cortia normal para vinho pertencem ao grupo dos lcoois (o 2butoxietanol, o 4-vinilguaiacol, o guaiacol, 2-feniletlico, lcool benzilico, carbitol, 2fenoxietanol e butilcarbitol), dos terpenides (-terpineol e linalol) cidos (com um nmero de tomos de carbono entre C6 e C9) e compostos carbonlicos (furfural, 5metilfurfural, benzaldeido, vanilina, acetovanilona, etilvanilina e cnfora. Por outro lado, uma das caractersticas da cortia apresentar alguma permeabilidade ao vapor de gua e a outras molculas em estado de vapor. Assim, os compostos volteis, sejam metabolitos sejam contaminantes ambientais, penetram atravs dos buracos da estrutura celular e so adsorvidos pela superfcie interna da cortia, reduzindo assim a sua presso de vapor. A sua posterior difuso da cortia para o vinho est condicionada pela presso de vapor dos compostos adsorvidos. Ao ser introduzida no gargalo da garrafa, a rolha sofre uma compresso, que ir aumentar a presso das substncias gasosas dentro das clulas. Por outro lado, as molculas de gua ou etanol que penetram na rolha vo competir com os compostos volteis para os mesmos locais de adsoro, favorecendo a sua passagem para o exterior. Assim, a difuso de compostos volteis para o exterior continuar at que as suas actividades no interior da cortia e no vinho, sejam as mesmas3. Os compostos volteis podem ser formados na cortia ou adsorvidos durante o perodo de tempo em que a cortia processada, fica armazenada ou est em contacto com o vinho, podendo ocorrer alteraes que podem levar ao aparecimento de problemas que vo influenciar a composio qumica da cortia e, em consequncia as caractersticas organolpticas do vinho.
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Uma destas alteraes a ocorrncia de uma falha na vedao, quer seja causada por problemas de processamento da cortia, quer pela existncia de defeitos estruturais ou erros de engarrafamento, que leva introduo anmala de ar no interior da garrafa com consequentes fenmenos de oxidao do vinho. Estes problemas podem ainda levar sada de vinho do interior da garrafa e sua deposio no topo exterior da rolha, criando um substrato favorvel ao ataque por bolores, quando as condies ambiente (humidade e temperatura) forem favorveis, com a consequente degradao de compostos e aparecimento de compostos de aroma anmalo. Outra deve-se ao facto da cortia poder estar sujeita ao ataque por microrganismos durante o processamento industrial: cortia B e cortia MA, levando alterao da sua composio qumica normal, especialmente na fraco de compostos volteis e compostos extractveis (Tabela 5), com evidncias de alterao organolptica de vinhos3. A cortia MA industrialmente considerada de elevado risco e eliminada durante o processamento industrial11. Desde que foi estabelecida uma ligao entre o aparecimento de gostos estranhos em bebidas e o TCA39 que este tem sido referido como sendo o grande e nico problema, como metabolito secundrio de aco de microrganismos aparecendo como contaminante em diversos materiais, alimentos e bebidas, incluindo gua de consumo40. Ao longo do tempo, um nmero limitado de outros compostos (Figura 3) tem vindo a ser associado em casos de vinho identificados com problemas de gostos estranhos26,41 sendo o guaiacol, a geosmina, o 1-octeno-3-ol, a 1-octeno-3-ona, o 2-metilisoborneol e, mais recentemente derivados de metoxipirazina42, nomeadamente a 2-isopropil-3metoxipirazina, 2-isobutil-3-metoxipirazina, 2,5-dimetil-3-metoxipirazina43, e ainda o 2,4,6tribromoanisole44. O tipo de aromas apresentado (mofo, terra, bolor) leva a concluir que a sua origem est relacionada com actividade fngica, nomeadamente o 1-octeno-3-ol, o metilisoborneol e a geosmina24. O guaiacol um composto formado a partir da degradao microbiolgica da vanilina por microrganismos normalmente encontrados na microflora da cortia26. As pirazinas so compostos igualmente referidos como causadores de aromas indesejveis em vinhos, surgindo devido a problemas de vinificao42. O 2,4,6-tribromoanisole surge como potencial causa para o aparecimento de aromas a mofo em vinhos, mas com uma provvel origem relacionada com a contaminao ambiental dos locais de armazenamento de garrafas de vinho44.
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Como se pode verificar na Figura 3, os limites de percepo sensorial dos compostos referidos so muito baixos (de 2 ng/L a 20 g/L), o que leva a que as correspondentes metodologias analticas necessitem de ter sensibilidade adequada quantificao destes compostos em to baixos nveis.
O
HO
CH3
CH3
CH3
O
Cl Cl Br
O
Br
Cl
Br
Guaiacol DA: fumado, madeira LPS: 20 g/L

H3C O
2,4,6-Tricloroanisole DA: mofo LPS: 4 ng/L

CH2 H3C
2,4,6-Tribromoanisole DA: mofo LPS: 4 ng/L

CH2 OH
1-Octeno-3-ona DA: cogumelos LPS:

H3C CH3
1-Octeno-3-ol DA: cogumelos LPS: 20 g/L

CH3
H 3C CH3
OH
OH CH3
2-Metilisoborneol DA: terra, mofo, bolor LPS: 30 ng/L

CH3
Geosmina DA: terra, mofo LPS: 25 ng/L
N N
O
CH3
N N
O
CH3 CH3
H3C
N N
CH3 O CH3
CH3
CH3
2-Isopropil-3-metoxipirazina DA: terra, vegetal, batata LPS: 2 ng/L
2-Isobutil-3-metoxipirazina DA: vegetal, pimenta verde LPS: 2 ng/L
2,5-dimetil-3-metoxipirazina DA: bolor, mofo LPS: 2 ng/L
Figura 3. Compostos qumicos susceptveis de provocar defeitos em vinhos, associados cortia. DA: Descritor de aroma; LPS: Limite de percepo sensorial.
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1.2. Micro-extraco em fase slida

A micro-extraco em fase slida (SPME) foi introduzida no final dos anos 80 para anlise de poluentes em gua45. Apresentou-se como uma alternativa aos mtodos tradicionais de extraco em espao de cabea dinmico, extraco lquido-lquido e outras tcnicas de extraco46. Trata-se de uma tcnica de extraco e pr-concentrao simultnea de compostos volteis e semi-volteis, sem solvente. Envolve a exposio de uma fase estacionria amostra e a partio dos analitos entre fases. Posteriormente so termicamente desorvidos no injector de um instrumento analtico, como por exemplo um cromatgrafo. A tendncia actual de evoluo da tcnica o desenvolvimento de fases estacionrias altamente selectivas e novas metodologias de micro-extraco capilar em sol-gel (sol-gelCME: capillary microextraction) que permitem atingir limites de deteco de partes por quatrilio (pg/L), por cromatografia com detector de ionizao de chama47.
1.2.1. Fundamentos tericos O modelo de fundamentao terica da extraco dos analitos por SPME depende do processo de soro envolvido. No caso de se tratar de uma fase estacionria lquida (extraco por absoro), o princpio base a partio do analito entre fases6. No caso de revestimentos slidos (por adsoro) o modelo baseado na isotrmica de adsoro de Langmuir48. A tcnica de SPME pode funcionar segundo um sistema de 2 fases6 (amostra - fase estacionria) ou 3 fases7 (amostra - espao de cabea - fase estacionria), como esquematizado na Figura 4. A fase estacionria colocada em contacto com a matriz da amostra durante um determinado tempo e sob condies especficas. Se o tempo for suficiente ocorre o equilbrio entre a fase estacionria e a amostra, no caso de um sistema de 2 fases, ou entre a fase estacionria, a regio de espao de cabea e a amostra, no caso de um sistema com 3 fases. Assim, a quantidade de analito sorvida na fase estacionria, pode ser relacionada com a concentrao de equilbrio dos analitos nas fases do sistema.
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fase 1 fase 3 fase 2
fase 1
fase 2
Figura 4. Sistemas de extraco por SPME com 3 fases e 2 fases. Fase 1: fase estacionria de SPME, fase 2: amostra slida ou lquida, fase 3: regio de espao de cabea.
Considerando um sistema de trs fases, no equilbrio, a quantidade total de analito acumulada na fase estacionria igual quantidade de analito em equilbrio nas trs fases:
C0V2 = C1V1 + C2 V2 + C3 V3
(eq.1) so a
em que C0 a concentrao inicial de analito na amostra, C1 , C2 , C3
concentrao de equilbrio do analito na fase estacionria, amostra e espao de cabea, respectivamente, e V1, V2, V3 o volume de fase estacionria, soluo amostra e espao de cabea, respectivamente. Utilizando o conceito de coeficiente de partio entre fase estacionria - espao de cabea, K1=C1 /C3 , e entre espao de cabea - soluo aquosa K2=C3 /C2 , a quantidade de analito acumulada pela fase estacionria, denominada capacidade do revestimento, n= C1 V1, pode ser expressa como:
n=
K 1K 2V 1V 2 C0 K 1K 2V 1 + K 2V 3 + V 2
(eq.2)
Assim, dependendo dos coeficientes de partio entre as fases e dos volumes de cada fase, pode ser traada uma relao de proporcionalidade entre a concentrao inicial do analito na amostra e a quantidade de equilbrio do analito acumulada na fase estacionria.
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No caso de um sistema de 2 fases, no equilbrio, a quantidade total de analito acumulada na fase estacionria igual quantidade de analito em equilbrio nas duas fases:
n=
KV 1V 2 C0 KV 1 + V 2
(eq.3)
Sendo K o coeficiente de partio entre a fase estacionria e a amostra, podemos estabelecer uma relao entre K e a constante de Henry do analito na fase estacionria KF e na soluo aquosa KH.
K = K1 K 2 =
KH KF
(eq.4)
A equao 3 descreve a massa sorvida aps o sistema ter atingido o equilbrio. Na maioria das determinaes analticas o coeficiente de partio entre a fase estacionria e a amostra, K, relativamente pequeno quando comparado com razo entre os volumes da amostra e de revestimento (V1<<V2), resultando assim numa relao linear muito simples (eq.5) no sendo necessrio que a amostra tenha um volume exactamente definido, uma vez que a quantidade de analito extrada independente do volume da amostra (KV1<<V2).
n = KV 1C 0
(eq.5)
Se, pelo contrrio, o coeficiente de partio for muito grande, o termo KV1, ser muito maior que V2 (KV1>>V2 ) ficando ento n=V2C0, o que indica que o analito totalmente extrado pela fase estacionria. A extraco pode ser interrompida e a fase estacionria analisada antes do equilbrio. No entanto, para se obterem dados com reprodutibilidade, devem ser mantidas as condies de realizao do ensaio, especialmente a agitao e o tempo de extraco.
1.2.2. Dispositivos de extraco O dispositivo de SPME mais utilizado pode ser descrito esquematicamente como uma seringa com agulha e septo e mbolo exteriores46. A agulha encerra um suporte de slica fundida revestido com a fase estacionria polimrica. Este suporte pode ento ser
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introduzido na matriz lquida da amostra - extraco directa, ou na fase gasosa acima da amostra headspace regio de espao de cabea, podendo neste caso tratar-se de uma matriz de amostra lquida ou slida. Outras configuraes foram sendo desenvolvidas (Figura 5): a fase estacionria pode ser colocada nas paredes do recipiente ou num tubo por onde a amostra passada (C e F), na forma de partculas suspensas na soluo (D), como revestimento de um agitador (G) ou sob a forma de disco ou membrana (H). Caso a matriz da amostra apresente caractersticas muito adversas pode ser protegida com a utilizao de uma membrana porosa que impea o contacto de substncias sem interesse com a fase estacionria (B).
A: Seringa (Extraco directa)
B: Com membrana
C: Em tubo (amostra liquida ou gasosa)
D: Partculas suspensas.
E: Seringa (Extraco no espao de cabea)
F: Nas paredes do recipiente
G: No agitador
H: Em disco ou membrana Amostra.
Figura 5. Exemplos de disposio de extraco por SPME.
Fase estacionria
1.2.3. Modos de extraco A seleco do modo de extraco, directa ou em espao de cabea (HS-SPME), deve ser feita em funo da volatilidade do analito e solubilidade ou afinidade dos compostos para a fase orgnica6. No caso de analitos semi-volteis (presso de vapor> 10-7mm Hg a 25C), normalmente aconselhvel que a fase estacionria seja imersa na soluo da amostra49.
34
No caso de valores de elevada partio entre a fase lquida e a fase gasosa (constante de Henry> 90 atm.cm3/mol) e solubilidade em solventes orgnicos (logaritmo do coeficiente de partio octanol/gua< 4), a extraco deve ser efectuada na regio de espao de cabea. A superfcie de interface entre a matriz lquida e a fase gasosa grande e os coeficientes de difuso de compostos na regio de espao de cabea so maiores do que num sistema de duas fases, tipicamente por um incremento superior a 4 ordens de grandeza7. A extraco na regio de espao de cabea apresenta vantagens em relao proteco da fase estacionria de efeitos adversos causados por compostos no volteis de peso molecular elevado existentes na matriz da amostra, conferindo maior durabilidade na utilizao e ainda a possibilidade de se proceder ao ajuste das condies de extraco da amostra (pH, fora eluotrpica, fora inica) sem causar efeitos nefastos na fase estacionria. As fases estacionrias encontram-se comercialmente disponveis em suporte de slica fundida com comprimento de 1 ou 2 cm. A sua seleco deve ser efectuada de forma a haver uma forte afinidade para os compostos que se pretende extrair. Comercialmente, classificam-se de acordo com o mecanismo de extraco (absoro ou adsoro), e a polaridade: podendo ser polares, apolares ou bipolares (Tabela 6. ).
Tabela 6. Fases estacionrias comercialmente disponveis por tipos (Supelco, Inc). Tipo Absorventes Polaridade Apolares Polares Adsorventes Bi polares Fase estacionria PDMS: Polidimetilsiloxano PA: Poliacrilato DVB/PDMS: Divinilbenzeno em polidimetilsiloxano CAR/PDMS: Carboxen em polidimetilsiloxano DVB/CAR/PDMS: Divinilbenzeno/Carboxen polidimetilsiloxano Polares CW/DVB: Divinilbenzeno em Carbowax em
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Implicitamente escolha da fase estacionria adequada para o analito est um processo de soro6: adsorvente ou absorvente. As fibras do tipo absorvente extraem por partio do analito na fase estacionria lquida, por vezes como efeito de uma esponja (Figura 6A). Os analitos migram para dentro e para fora do revestimento sendo a capacidade de reteno e libertao do analito dependente da sua espessura e tamanho do analito49. Regra geral, quanto maior for a espessura maior ser a capacidade de absoro da fibra. As propriedades de extraco da fase estacionria no se alteram substancialmente at que a quantidade extrada seja aproximadamente cerca de 1% da massa de fase estacionria, pelo que, a temperatura constante, a relao entre concentrao da amostra e massa extrada linear numa grande gama de concentrao de analitos e interferentes, sendo cerca de 4 ordens de grandeza superior ao tipo adsorvente. Esta caracterstica torna este tipo de fase estacionria aconselhvel para a anlise de analitos de pequena dimenso e em gamas de concentrao esperada com grande amplitude, desde algumas partes por milho a alguns pontos percentuais.
A- Extraco por absoro
B- Extraco por adsoro, com micro e meso poros*
C- Extraco por adsoro, com meso e macro poros*
Figura 6. Representao esquemtica de um corte de uma fibra de SPME durante o processo de extraco, usando fibras do tipo absorvente (A) e adsorvente (B e C)48. * Micro-poros (2-20), meso-poros (20-500 ) e macro-poros (> 500).
No caso de utilizao de polmeros slidos como fase estacionria, as interaces que representam o papel mais importante so intermoleculares e fracas (e interaces hidrofbicas quando a extraco efectuada a partir de matriz aquosa)48, ocorrendo a extraco por um mecanismo do tipo adsorvente. O nmero de stios superficiais onde a adsoro ocorre limitado, pelo que quando todos so ocupados nenhum analito pode posteriormente ser captado (Figura 6). Desta forma, a relao entre a concentrao de
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analito extrado de uma amostra por um revestimento slido pode no ser linear numa gama alargada de concentraes. A sua vantagem em relao s de absoro a elevada selectividade e capacidade para compostos polares e compostos volteis48,49,50.
1.2.4. Fases estacionrias A sensibilidade melhorada por uma rigorosa seleco do tipo de fase estacionria (Tabela 7) e modo de extraco (directa ou em espao de cabea). No caso de analitos volteis e semi-volteis no polares dever sempre optar-se por anlise em espao de cabea pois, alm dos analitos se poderem difundir mais rapidamente, conseguem eliminar-se interferncias de matriz e uma maior durabilidade dos dispositivos de extraco. Para compostos semi-volteis, a relao de polaridade com a fase estacionria crtica.
Tabela 7. Fases estacionrias SPME comercialmente disponveis para GC (de Supelco, Inc, Bellefonte, PA, EUA). Fase estacionria PDMS Espessura do filme (m) 100 30 7 Uso recomendado Compostos volteis. Compostos semi-volteis no polares. Compostos no polares ou moderadamente polares com elevado peso molecular. PDMS/DVB PA CAR/PDMS 65 85 75 Compostos volteis polares, aminas e nitroaminas. Compostos semi-volteis polares. Gases e compostos de baixo peso molecular, em quantidades vestigiais. 85 CW/DVB 65 65 DVB/CAR/PDMS 50/30 Compostos de natureza bipolar. lcoois e compostos polares. Compostos moderadamente polares. Aromas (compostos volteis e semi-volteis).
37
Assim, para se desenvolverem metodologias de SPME importante conhecer as caractersticas fsico-qumicas dos analitos (como a polaridade, grupos funcionais, presso de vapor, estrutura e massa molecular) e os efeitos de matriz. Para assegurar nveis adequados de reprodutibilidade, importante manter fixos os parmetros experimentais que influenciam a extraco do analito.
1.2.5. Influncia das condies experimentais 1.2.5.1. Na extraco Estimando a influncia dos parmetros que afectam a termodinmica do processo de extraco, podemos optimizar os parmetros e, assim, controlar a sensibilidade e reprodutibilidade da tcnica. Conceitos tericos podem ser usados para optimizar as condies de extraco, permitindo igualmente a sua correco. Os parmetros que afectam a constante de distribuio so o pH, a temperatura de extraco, a fora inica, a fora eluotrpica, a agitao e a razo (volume de espao de cabea/volume de amostra). O tempo para atingir o equilbrio afectado igualmente pela constante de distribuio e ainda pela agitao, pela espessura da fase estacionria e pela forma como o suporte colocado na amostra (imerso ou na regio de espao de cabea). semelhana do que se verifica na extraco lquido-lquido, para garantir que, pelo menos 99% da forma neutra de um composto extrada, o pH da soluo deve ser ajustado a, pelo menos, 2 unidades inferior ou superior ao pKa do analito, caso se trate de um cido ou de uma base, respectivamente6. Mais importante o ajuste e controlo do pH de forma a manter-se constante em todas as amostras em anlise. O efeito da temperatura sobre a rea cromatogrfica dos compostos presentes na matriz est relacionado com 3 factores. Por um lado, e uma vez que o processo de absoro dos compostos pela fase estacionria exotrmico, o aumento da temperatura provoca a difuso das molculas de compostos absorvidas pela fase estacionria para a fase gasosa, o que contribui para a reduo do coeficiente de partio fase estacionria/fase gasosa (k1). Por outro lado, o aumento da temperatura tambm aumenta a solubilidade dos compostos na matriz o que causa uma reduo no coeficiente de partio fase gasosa/fase lquida (K2). Por outro lado o aumento de temperatura pode levar a um aumento da volatilidade dos compostos presentes na matriz, o que contribui para o
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aumento do coeficiente de partio fase gasosa/fase lquida (K2)51. O equilbrio entre os diversos factores faz com que prevalea um deles, contribuindo assim para um efeito positivo ou negativo sobre a quantidade de composto extrada. Em relao fora inica, e de um modo geral, a presena de um electrlito pode influenciar o processo de extraco de duas formas, alterando as propriedades de interface situada na fronteira entre a fase lquida e o espao de cabea e pela diminuio da solubilidade dos compostos hidrofbicos na fase aquosa, promovendo a deslocao do equilbrio da fase aquosa (amostra) no sentido da fase de espao de cabea ou para a fase estacionria do suporte SPME7. Normalmente, os compostos volteis polares em matrizes polares (amostras aquosas) sentiro maiores efeitos no coeficiente de partio aps adio de sal amostra. A alterao da fora eluotrpica resulta da existncia de solventes orgnicos na matriz aquosa da amostra, como etanol. Estes provocam uma alterao significativa na fora eluotrpica da soluo6, funcionando como co-solventes relativamente s fases estacionrias de SPME. Variaes da ordem de 0,5% do volume causam uma reduo significativa (mais de 60%), na recuperao de compostos polares semi-volteis52, pelo que ao analisar compostos em matrizes alcolicas, como vinhos, deve ser tido especial cuidado com o teor em lcool quando se comparam resultados. Relativamente razo , como o volume de fase estacionria constante, a alterao do volume de amostra altera directamente a quantidade de composto extrada. A observao da equao 2 permite verificar que, ao diminuirmos o volume do espao de cabea, V3, a quantidade de analito extrada pela fase estacionria aumenta, aumentando a sensibilidade do mtodo, dentro de uma concentrao correspondente gama de linearidade do mtodo. O modo como a extraco efectuada tem tambm um impacto elevado na cintica do processo. Quando se usa o modo de espao de cabea, o tempo para os compostos atingirem a fase estacionria depende muito da sua volatilidade e capacidade de passagem fase gasosa (constante de Henry). A agitao e a temperatura podem ter um efeito favorvel no processo6,7, com reduo no tempo necessrio para se atingir condies de reprodutibilidade.
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Uma vez que a anlise das amostras extradas por SPME pode ser efectuada por cromatografia gasosa (GC), cromatografia lquida de alta presso (HPLC) e electroforese capilar (CE), os analitos so desorvidos nos sistemas de injeco dos equipamentos, tratando-se de desoro trmica no GC ou por solvente no HPLC e CE.
1.2.5.2. Na desoro Na desoro trmica em GC, os parmetros analticos a considerar so o ponto de ebulio do analito, a espessura da fase estacionria e a temperatura do injector. Assim, do ponto de vista instrumental, os parmetros a controlar so a temperatura do injector, a posio e profundidade de insero da fibra no injector e o tempo de desoro6. A utilizao de sistemas automticos de injeco permite um maior controlo das condies de injeco (posio e profundidade da fibra) e o tempo, melhorando a reprodutibilidade da metodologia.
1.3. Metodologias SPME na anlise de 2,4,6-tricloroanisole em cortia e em vinho

A maioria dos estudos sobre defeitos de aroma associados rolha de cortia tem incidido quase exclusivamente sobre o TCA. Isto porque o TCA tem vindo a ser reconhecido como sendo o principal problema da rolha de cortia, presente em mais de 80% dos casos de desvio organolptico25,53. Assim, os esforos de controlo da qualidade da cortia, tm vindo a ser investidos essencialmente no desenvolvimento de metodologias nesta rea, incluindo na normalizao de mtodos de ensaio em rolhas de cortia pela Organizao Internacional de Normalizao (ISO)54. Na Tabela 8 apresenta-se a evoluo das metodologias SPME para a anlise de TCA. A primeira publicao sobre anlise de TCA por SPME, procedeu extraco directamente a partir de pedaos de cortia55. Os resultados foram considerados pouco animadores, com baixa reprodutibilidade. Pelo contrrio em vinho55,56 os resultados demonstram que a tcnica de SPME apresentava bons resultados ao nvel da reprodutibilidade e linearidade, com limites de deteco (entre 0,5 e 2,9 ng/L) inferior ao limite de percepo sensorial (LPS de 4 ng/L).
40
Assim, devido s caractersticas da cortia e da sua utilizao, tm surgido dois conceitos: TCA total e TCA que potencialmente pode migrar para o vinho57,58. Da que a anlise de TCA na cortia possa ser realizada directamente sobre a cortia ou ento aps a extraco prvia da cortia com uma matriz lquida simulante de vinho. A anlise faz-se sobre a matriz lquida, sendo o resultado definido como TCA libertvel (TCA releasable).
Tabela 8. Metodologias de SPME aplicadas a vinho e cortia para anlise de compostos volteis presentes ou transmitidos pela cortia (TCA e cloroanisis). Ano de publicao 1997 Metodologia Extraco Anlise Limite deteco 2,9 ng/L
Matriz
Ref. 55
Vinho e Vinho: SPME-PDMS. Rolhas: fraca GC-MS, Mtodo de Cortia reprodutibilidade adio padro Vinho HS-SPME, com PDMS a 45C. GC-MS, PI: TCA deuterado.
0,5-2 ng/L LQ 5ng/L 1-5 ng/L
56
1999
Cortia As rolhas em soluo 24 horas GC-ECD, PI: TCA em deuterado. sendo o extracto analisado por soluo HS-SPME com fibra PDMS100m. Vinho Vinho SBSE: Extraco por soro em barra HS-SPME. Melhor fase estacionria PDMS em reprodutibilidade e DVB/CAR/PDMS em sensibilidade. HS-SPME-PDMS. Extraco por soro em barra agitadora (SBSE) HS-SPME: Comparao de fibras, selecciona a DVB/CAR/PDMS HS-SPME: Comparao de fibras, selecciona a PDMS MHS-SPME Mltiplo HS-SPME com fibra DVB/CAR/PDMS GC-MS GC-ECD, PI: 2,3,6triclorotolueno. Mtodo de adio padro. GC-ECD, PI: 2,4,6tribromoanisole. GC-ECD GC-MS GC-MS GC-MS
57
2000 2002
1-5 ng/L 1ng/L
59 61
2003 2004
Vinho Vinho Vinho Vinho
0,15 - 5,4 ng/L LQ= 1,08 pg/L. 2,5 ng/L 0,1 ng/L 2,5 ng/L
58 60 62 63 64
2005
Cortia
LQ: limite de quantificao; PI padro interno
41
As publicaes que se seguiram tm-se centrado na optimizao das condies para a sua anlise em vinho, de modo a conhecer a influncia de diferentes dispositivos de extraco, por exemplo SBSE59,60, novas fases estacionrias (DVB/CAR/PDMS)61,62 e diferentes condies experimentais58,60,63. Muito recentemente surgiu a metodologia de mltipla extraco na regio de espao de cabea, MHS-SPME64, aplicvel para a anlise directa de cortia como matriz slida, que consiste na extraco sucessiva dos analitos do mesmo vial, por HS-SPME, que, por aplicao de modelos tericos desenvolvidos, apresenta uma estimativa da concentrao total dos analitos.
42
1.4. Enquadramento e objectivos do trabalho

Os estudos de caracterizao sensorial de cortia e do vinho, no sentido de verificar a sua qualidade organolptica, tm assentado quase exclusivamente na deteco do TCA, seja do ponto de vista instrumental seja sensorial. A presena de TCA tem sido mundialmente aceite como indicador de contaminao sensorial sendo estabelecidos critrios de aceitao/rejeio de lotes de rolhas entre as partes interessadas, com base neste critrio. conhecido, tanto do ponto de vista de anlise de lotes industriais de rolhas53 como atravs de estudos cientficos36, que a correlao entre o defeito sensorial e a quantidade de TCA detectada aps extraco completa da rolha relativamente baixa. Assim, importante desenvolver metodologias que permitam quantificar em simultneo o TCA e outros compostos susceptveis de provocar defeitos sensoriais associados cortia, e identificar potenciais factores que interfiram na quantificao do TCA. No presente trabalho ser utilizada a metodologia de HS-SPME-GC-MS, uma vez que actualmente o mtodo internacional em fase final de normalizao para anlise de TCA na cortia. O presente trabalho tem 2 objectivos principais: i) Desenvolver uma metodologia de HS-SPME para identificar e quantificar compostos volteis susceptveis de provocar defeitos sensoriais em vinhos em contacto com cortia; ii) Pesquisar os compostos padro estudados em simulantes de vinho que estiveram em contacto com cortia normal e cortia com defeitos (bolor e mancha amarela).
A seleco dos compostos a analisar baseou-se num estudo de identificao de compostos encontrados em vinhos que apresentavam desvios organolpticos causados pela cortia41: o 2,4,6-tricloroanisole (TCA), o 1-octeno-3-ol (1-Oct-3), o guaiacol (Gua), o 2-metilisoborneol (MIB) e a geosmina (Geo), e outros encontrados na cortia sujeita a ataque por microorganismos20: o 3-metil-1-butanol (3-MB) e 1-octanol (1-Oct).
43
No estabelecimento de uma metodologia de SPME muito importante a escolha da fase estacionria, uma vez que a quantidade e tipo de compostos que so extrados da amostra depende da espessura e caractersticas fisico-qumicas do filme. A opo de seleco de uma fase estacionria no polar de 100 m de PDMS teve a ver com o facto de esta ser indicada para analitos no polares, nomeadamente compostos volteis, sendo utilizada na anlise de aromas em alimentos e bebidas65,66 e fragncias21, tendo vindo a ser utilizada na determinao de TCA em vinho e em rolhas (Tabela 8), sendo igualmente esta fase a indicada no mtodo internacional normalizado para anlise de TCA na cortia54. Relativamente ao modo de extraco, seleccionou-se a extraco na regio de espao de cabea dadas as caractersticas da matriz relativamente ao valor de LogP (oct/ag) dos compostos a analisar e pelo facto de ser o mtodo de referncia em normalizao pela ISO. Os compostos volteis tm coeficientes de difuso na fase gasosa tipicamente de 4 ordens de grandeza superiores aos registados nos lquidos7, encontrando-se grande parte dos mesmos na fase gasosa antes do incio da extraco. Alm disso, esta tcnica protege a fibra do efeito adverso de substncias no volteis de elevado peso molecular que possam estar na matriz. Relativamente aos parmetros experimentais: razo 1/55,61, adio de sal 55, agitao51 e tempo de desoro56,61, foram utilizados valores da literatura obtidos na optimizao de metodologias HS-SPME para anlise de TCA em vinho. O estudo de optimizao da metodologia incidiu sobre: i) temperatura de extraco, ii) linearidade global, iii) linearidade e reprodutibilidade relativamente a cada padro e estimativa dos Factores Relativos de Resposta da metodologia de SPME e iv) avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz.
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Parte II Materiais e Mtodos
2.1. Materiais
2.1.1. Reagentes e padres Foram utilizados os seguintes padres: 3-metil-1-butanol (98,5%), guaiacol ( 98%), 1octeno-3-ol (98%) e 1-octanol (99%) (Sigma-Aldrich, EUA), 2,4,6-tricloroanisole (99%) (Sigma-Aldrich, Alemanha), geosmina (98%) e 2-metilisoborneol (98%) (Wako, Alemanha), encontrando-se na Figura 7 as respectivas frmulas e estruturas qumicas, nmeros CAS, descritores de aroma e limites de percepo sensorial. Usou-se, ainda, cloreto de sdio (Merck, Alemanha), etanol p.a. (Riedel-deHaen) e cido L-(+) tartrico (Panreac, Barcelona).
H3C
H3C CH3 OH
CH2 OH
H3C
OH
3-Metil-1-butanol (3-MB) CAS 123-51-3 C5H12O DA: whisky LPS: 300 mg/L
CH3
1-Octeno-3-ol (1-Oct-3) CAS 3391-86-4 C8H16O DA: cogumelos LPS: 20 g/L

CH3
CH3
1-Octanol (1-Oct) CAS 111-87-5 C8H18O DA: cera LPS: H3C CH3
O
HO
O
Cl Cl
OH
Cl
CH3
H3C CH3
OH
Guaiacol (Gua) CAS 90-05-1 C 7 H 8 O2 DA: fumado, madeira LPS: 20 000 ng/L
2,4,6-Tricloroanisole (TCA) CAS 87-40-1 C7H5Cl3O DA: bolor, mofo LPS: 4 ng/L
Geosmina (Geo) CAS 19700-21-1 C12H22O DA: terra, mofo LPS: 25 ng/L
2-Metilisoborneol (MIB) CAS 2371-42-8 C11H20O DA: terra, mofo, bolor LPS: 30 ng/L
Figura 7. Estrutura e frmula qumica, nmero CAS, descritor de aroma (DA) e limite de percepo sensorial (LPS) dos padres em estudo.
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Tabela 9. Dados fisico-qumicos dos padres em estudo67. MM p.e. (C) 131,1 174,5 195,1 205 241 270 Presso de vapor* (10-3 mmHg) 2370 79,4 103 32,0 22,8 2,14 Constante de Henry* (atm.cm3/mol) 14,0 24,5 1,2 8,9 130 11,8 Solubilidade em gua* (mg/L) 2,67x104 Insolvel 540 1,87x104 305 10 (20C) 157 LogPa) (oct/ag) 1,16 3,00 1,32 3,31 4,11 3,57
Composto 3-MB 1-Oct-3 1-Oct Gua MIB TCA Geo
88,15 128,21 130,23 124,14 168,28 211,47 182,31
a) Log P octanol/gua: coeficiente de partio do composto entre octanol e gua * a 25C
A soluo simulante de vinho foi sempre preparada antes da realizao dos ensaios, consistindo numa soluo etanol/gua a 10% (v/v), com adio de cido tartrico at pH 3,5.
2.1.2. Preparao de rolhas de cortia (N, B e MA) e posterior engarrafamento As rolhas de cortia foram fabricadas numa unidade industrial, encontrando-se o esquema de preparao representado na Figura 8. Seleccionaram-se duas pranchas de cortia provenientes da regio do Alto Alentejo, com calibre marca (31/40 mm) e classe de qualidade visual de 1/3. Uma das pranchas no apresentava qualquer tipo de defeito visual, sendo industrialmente classificada como normal (N), e a outra classificada industrialmente como cortia com mancha amarela (MA). Estas pranchas foram cozidas separadamente, sendo a primeira (N) cozida junto com o 1 lote de cortia da semana, tendo assim gua renovada, e a segunda (MA) junto com o lote seguinte, de forma a no haver contaminao cruzada. Aps a cozedura foram deixadas em repouso na zona industrial de estabilizao, mas separadamente das outras pranchas de cortia em curso de produo.
48
Ao fim de duas semanas iniciou-se a fabricao, utilizando as especificaes tcnicas para produo de rolhas de calibre 45X24 mm, ou seja, na operao de rabaneao foram cortadas em bandas de 47,0 mm de largura, seguindo-se a brocagem com tubos cilndricos ocos de 24,7 mm de dimetro interno. As rolhas fabricadas a partir da prancha MA apresentavam manchas amarelas, caractersticas do defeito localizadas nos topos.
Cortia de provenincia conhecida (Alentejo) Classe: 1/3 Calibre: Marca 31/40 mm
Prancha sem defeito
Prancha com defeito: mancha amarela
1 Cozedura da semana
2 Cozedura da semana
Rabaneao
Rabaneao
Brocagem
Brocagem
Secagem <8%
Contacto da cortia c/ bolores
Secagem <8%
Cortia normal (N) Engarrafamento
Cortia bolor (B) Engarrafamento
Cortia mancha amarela (MA) Engarrafamento
Figura 8. Esquema de preparao das amostras de cortia usadas nos engarrafamentos.
As rolhas resultantes da prancha N foram ainda divididas em 2 grupos:
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i) o primeiro, classificado como normal (N), foi imediatamente seco a humidade inferior a 8%, para evitar o crescimento de microrganismos; ii) o segundo, classificado como amostra bolor (B), foi deixado com a humidade de processamento (12-15%) durante 7 dias entre pranchas de cortia em processo de estabilizao industrial (j com notrio crescimento de microrganismos). No foram identificados os microrganismos presentes, mas constituem a flora do ambiente fabril. De cada um dos 3 tipos de amostras, N, B e MA, e sem que tenha sido efectuado qualquer processo de lavao/desinfeco ou tratamento de superfcie, 20 rolhas foram colocadas em garrafas de 750 mL de capacidade, do tipo bordalesa de cor verde, onde previamente se tinham introduzido 750 mL do simulante de vinho, resultando assim 20 rplicas para cada tipo de cortia. O rolhamento foi efectuado no mesmo dia, recorrendo a uma rolhadora de 4 maxilas, com compresso cilndrica a 15,5 mm. Aps um perodo de cerca de 1 hora para recuperao dimensional da cortia, as garrafas foram deitadas em repouso em ambiente de pouca luminosidade com temperatura amena, durante 13 meses, at realizao da anlise por SPME.
2.1.3. Equipamentos A determinao analtica foi efectuada utilizando um cromatgrafo de gs Varian CP3800 com detector de massa/massa Saturn 2000 (Varian, EUA) de captura de ies, equipado com coluna capilar CPSil 8CB low bleed/MS 30mx0,25mmx0,25m (Varian, Holanda), dotado de um amostrador automtico Combipal (CTC Analytics, Suia), com forno de incubao e com agitao. De forma a obter uma boa resoluo cromatogrfica, foi desenvolvido o seguinte programa: temperatura inicial do forno de 35C durante 2 minutos, seguindo-se um programa de 35 a 250C a 8C por minuto, com um tempo final de 3 minutos. A temperatura do injector foi de 260C e o fluxo do gs de arraste (hlio) fixou-se em 1 mL/min.
50
A injeco foi efectuada em modo splitless (5 minutos), sendo feito uma anlise de um branco por cada grupo de 5 amostras. O branco consistia num vial com soluo simulante de vinho e cloreto de sdio (2g/L). Os espectros de massa foram obtidos por ionizao por impacto electrnico com energia de 70eV e uma corrente de emisso de 50A, com um varrimento entre 30 e 250 m/z. Os dados foram adquiridos com o software DS-MS Workstation verso 6.3.0 (Varian, USA). A fase estacionria, PDMS com 100 m de espessura (Supelco, Bellfonte, EUA), foi condicionada durante 2 horas a 250C (indicao do fabricante 30 minutos a 250C), sendo utilizada no dispositivo automtico Combipal. Foram utilizados vials de 20 mL com septo de 8 mm PTFE/Silicone e tampa magntica.
51
2.2. Optimizao da metodologia de HS-SPME

Os parmetros relativos a volume de espao de cabea/volume de amostra (razo ), adio de sal, tempo de soro e tempo de desoro foram estabelecidos com base na literatura: i) Razo 1/=0,6, alquotas de 7,5 mL de padro ou extracto de soluo de amostra nos vials de 20 mL55,61; ii) Adio de cloreto de sdio: 0,2 g/mL55; iii) Tempo de extraco: 45 minutos51, sob agitao a 1000 r.p.m; iv) Desoro a 260C durante um perodo de 3 minutos56,61. Seguidamente foram realizados os seguintes estudos: - Temperatura de extraco; - Linearidade global da metodologia; - Linearidade e reprodutibilidade relativamente a cada padro e estimativa dos Factores Relativos de Resposta da metodologia de SPME; - Avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz.
2.2.1. Efeito da temperatura de extraco Seleccionando um composto para cada nvel de concentrao (ng/L, g/L e mg/L), procedeu-se ao estudo de efeito da temperatura de extraco sobre a quantificao de 3MB, Gua e TCA. Para cada composto foram preparadas solues-padro nas concentraes indicadas na Tabela 10, em soluo simulante de vinho. Os compostos foram analisados individualmente. As temperaturas testadas foram de 30, 40 e 50C, sendo a anlise efectuada em quintuplicado.
52
Tabela 10. Gama de concentrao ensaiada para o estudo do efeito da temperatura para o 3metil-1-butanol, guaiacol e 2,4,6-tricloroanisole. Composto 3-MB (mg/L) Gua (g/L) TCA (ng/L) 54,0 4,7 5,8 104,0 11,8 14,5 Concentrao 155,0 23,6 29,0 201,0 35,3 43,5 273,0 47,1 58,0
2.2.2. Linearidade global da metodologia de HS-SPME Tomando como referncia as gamas de concentrao em estudo, seleccionadas de acordo com os respectivos limites de percepo sensorial19,41, prepararam-se 5 soluespadro com os 7 compostos presentes em 5 nveis de concentrao (Tabela 11). Assim, a concentrao total varia entre 41,5 mg/L e 275,2 mg/L. A anlise foi efectuada em quintuplicado, com temperatura de extraco de 30C.
Tabela 11. Concentraes usadas nos ensaios de linearidade global da metodologia de HSSPME. Concentrao Soluo 3-MB (mg/L) 41,5 75,7 106,4 152,0 275,0
1-Oct-3
1-Oct (g/L) 20,1 20,2 60,3 80,4 100,5
Gua (g/L) 5,3 5,3 19,4 38,7 51,6
(g/L) 10,2 20,4 30,6 40,8 51,0
MIB (ng/L) 30,0 60,0 120,0 240,0 480,0
TCA (ng/L) 14,5 29,0 43,5 87,0 130,5
Geo (ng/L) 42,0 84,0 126,0 252,0 378,0
Concentrao total (mg/L) 41,5 75,8 106,5 152,2 275,2
A B C D E
53
2.2.3. Reprodutibilidade e linearidade da metodologia e estimativa dos Factores Relativos de Resposta (FRR) Para o estudo da reprodutibilidade da metodologia foram preparadas solues padro de 1 a 5 (Tabela 12), sendo estes ensaios tambm usados para preparar as curvas de calibrao para cada composto e para estimar os Factores Relativos de Resposta (FRR) relativos metodologia de SPME. A reprodutibilidade foi avaliada atravs do coeficiente de variao calculado para 5 rplicas. A linearidade foi avaliada pela anlise do coeficiente de regresso das curvas de calibrao. As solues padro foram preparadas em simulante de vinho e analisadas em quintuplicado.
Tabela 12. Concentraes usadas para estudo da reprodutibilidade, linearidade e estimativa dos Factores Relativos de Resposta (FRR). Composto 3-MB (mg/L) 1-Oct-3 (g/L) 1-Oct (g/L) Gua (g/L) MIB (ng/L) TCA (ng/L) Geo (ng/L) Concentrao total (mg/L) Soluo-padro 1 47,7 10,7 20,8 5,7 8,0 2,0 8,4 47,7 2 71,6 21,4 41,6 12,9 20,0 5,0 21,0 71,7 3 95,4 26,7 78,0 19,4 30,0 7,4 31,4 95,5 4 143,0 32,0 156,0 38,7 60,0 14,8 63,0 143,2 5 191,0 42,7 208,0 51,6 80,0 19,8 84,0 191,3
2.2.4. Avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz Com o objectivo de avaliar possveis efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz, foi preparada uma soluo base contendo os 7 compostos e vrias outras solues-padro
54
nas quais apenas se varia a concentrao de um composto (Tabela 13). Seguidamente comparou-se a rea cromatogrfica obtida para cada composto na soluo base em relao s reas cromatogrficas que sofreram modificaes na concentrao apenas de 1 composto. A anlise foi efectuada em quintuplicado, numa gama de concentrao total entre 47,7 e 190,9 mg/L.
Tabela 13. Gamas de concentrao usadas para avaliao dos efeitos de interferncia. Composto 3-MB 1-Oct-3 1-Oct Gua MIB TCA Geo Soluo base Concentrao 95,4 mg/L 26,7 g/L 78,0 g/L 19,4 g/L 30,0 ng/L 7,4 ng/L 31,4 ng/L Factor de variao de concentrao em relao soluo-base 0,5 0,4 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,8 0,8 0,5 0,7 0,7 0,7 0,7 1,5 1,2 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 1,6 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7
2.3. Pesquisa dos compostos-padro nos simulantes de vinho rolhados com cortia N, B e MA
De acordo com os resultados da seco anterior (2.2.) estabeleceu-se a metodologia de anlise HS-SPME/GC-MS que pareceu ser a mais adequada: i) Razo 1/=0,6, alquotas de 7,5 mL do extracto de cada rplica nos vials de 20 mL; ii) Adio de cloreto de sdio: 0,2 g/mL; iii) Temperatura de extraco 30C; iii) Tempo de extraco: 45 minutos, sob agitao a 1000 r.p.m; iv) Desoro a 260C durante um perodo de 3 minutos.
55
Esta metodologia foi aplicada na pesquisa dos compostos padro em simulantes de vinho rolhados com cortia N, B e MA. Antes de se retirar a rolha, as garrafas foram agitadas para homogeneizao do seu contedo. As rolhas foram retiradas e, de cada garrafa, transferindo-se o extracto para o vial onde se procedeu extraco HS-SPME.
2.4. Tratamento de dados

2.4.1. Temperatura de extraco Para cada composto, e cada temperatura, foi estabelecida a correlao entre a rea cromatogrfica e a concentrao. O coeficiente de variao foi calculado como a razo do desvio padro das determinaes efectuadas em relao mdia, expresso em percentagem. Para cada temperatura de extraco, foram efectuadas 5 determinaes de cada composto para cada nvel de concentrao (Tabela 10), resultando num total de 75 determinaes por composto, 25 para cada nvel de temperatura. Os FRR foram calculados para cada composto e cada temperatura como a razo mi/me, na qual mi representa o quociente entre a rea cromatogrfica do composto i e a sua concentrao, e me representa o quociente entre a rea cromatogrfica do etanol e a sua concentrao (7,9 g/L), a qual se manteve constante em todos os ensaios.
2.4.2. Linearidade global da metodologia HS-SPME Para cada uma das solues (Tabela 11), foi determinada a rea cromatogrfica correspondente a cada um dos 7 compostos em estudo, tendo sido efectuadas 5 rplicas de cada soluo, resultando num total de 175 determinaes. A rea total foi calculada como sendo a soma das reas de todos os compostos em cada uma das solues, e a concentrao total, resultante da soma das concentraes de todos os compostos em cada uma das solues. Seguidamente verificou-se se as reas cromatogrficas totais variam, ou no, de forma linear (R2) com a concentrao total da matriz.
56
2.4.3. Reprodutibilidade e linearidade da metodologia HS-SPME A reprodutibilidade foi avaliada pela anlise do coeficiente de variao, calculado como a razo do desvio padro das 5 rplicas em relao ao valor mdio, expresso em percentagem (solues-padro indicadas na Tabela 12). A linearidade foi avaliada atravs da anlise do coeficiente de correlao das curvas de calibrao efectuadas (reas cromatogrficas vs. concentrao, para cada composto).
2.4.4. Estimativa dos Factores Relativos de Resposta Os FRR da metodologia de SPME foram calculados para cada composto como a razo mi/me, na qual mi representa o quociente entre a rea cromatogrfica do composto i e a sua concentrao, e me representa o quociente entre a rea cromatogrfica do etanol e a sua concentrao (7,9 g/L), a qual se manteve constante em todos os ensaios. Pelo facto dos valores dos FRR dos 7 compostos em estudos apresentarem entre si diferenas de vrias ordens de grandeza foram tambm calculados os respectivos Log(FRR). Foram efectuadas 5 determinaes de cada composto para cada nvel de concentrao, resultando num total de 25 determinaes por composto (gama de concentrao usada indicada na Tabela 13).
2.4.5. Avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz Foram utilizadas duas metodologias para estudar o efeito da composio da matriz sobre a resposta obtida por SPME. Para cada composto foram efectuadas 25 determinaes, resultando em 175 determinaes. Na primeira metodologia foi realizada uma anlise do efeito da variao individual. Para cada composto foi calculado o valor de Ax/A0, em que A0 representa a rea do composto i na soluo base e Ax a rea do mesmo composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao. Para verificar a relevncia estatstica deste efeito foi aplicado o teste de t-Student, com nvel de confiana de 95%.
57
No caso do 1-Oct verificou-se um efeito significativo pelo que se procedeu ao clculo da concentrao estimada para as reas resultantes e respectivo coeficiente de variao, atravs das curvas de calibrao estabelecidas para cada um dos compostos (2.4.3.). Uma vez que a concentrao adicionada (soluo base) se manteve constante e as reas resultantes foram significativamente diferentes, procedeu-se, para cada um dos compostos, ao clculo da mdia de concentrao de todas as determinaes (n=25) como se o efeito do 1-Oct no fosse conhecido. O intervalo de confiana (IC) dos resultados foi calculado atravs da seguinte frmula:
IC =
sendo s o desvio padro, t
s t 95%, 24 n
95%,24
o parmetro de t-Student, com um grau de confiana de
95% e 24 graus de liberdade, e n o nmero de rplicas. Para cada valor de concentrao de 1-Oct, foi efectuada uma anlise da diferena entre as varincias (teste de Fisher) e analisada a significncia da varincia dos resultados, com 95% de confiana e (4, 4) graus de liberdade. Na segunda metodologia foi efectuada uma anlise de regresso, comparando as reas de todos os compostos para todas as concentraes, atravs da anlise de dados do programa Excel for Windows da Microsoft, verso 2000, com nvel de confiana de 95%.
2.4.6. Pesquisa dos compostos-padro nos simulantes de vinho rolhados com cortia N, B e MA Foi pesquisada a presena dos padres em estudo nos cromatogramas obtidos, sendo confirmada a presena dos compostos de acordo com o tempo de reteno e com o espectro de massa dos padres puros. Confirmada a presena de um dado composto, foi determinada a sua rea cromatogrfica, sendo a quantificao efectuada por recurso respectiva curva de calibrao.
58
Parte III Resultados e Discusso
3.1. Optimizao da metodologia HS-SPME

Na Tabela 14 encontram-se os tempos de reteno relativos a cada um dos compostos seleccionados para pesquisa e quantificao. As Figuras 9 a 15 apresentam os espectros de massa dos padres utilizados, os quais, juntamente com os respectivos tempos de reteno, permitiram confirmar a identificao destes nos simulantes de vinho engarrafados com cortias N, B e MA.
Tabela 14. Tempos de reteno e ies (m/z) caractersticos para os compostos padro. Tempo de reteno (min) 4,2 9,3 11,3 11,6 14,4 16,6 18,2 Composto 3-MB 1-Oct-3 1-Oct Gua MIB TCA Geo Ies (m/z) 41, 42, 55, 70 43, 57, 69, 72 55, 56, 69, 83 53, 81, 109, 124 67, 95, 121, 136 167, 195, 197, 210 81, 97, 112, 126
Figura 9. Espectro de massa do 3-metil-1-butanol, tempo de reteno 4,2 minutos.
61
Figura 10. Espectro de massa do 1-octeno-3-ol, tempo de reteno 9,3 minutos.
Figura 11. Espectro de massa do 1-octanol, tempo de reteno 11,3 minutos.
Figura 12. Espectro de massa do guaiacol, tempo de reteno 11,6 minutos.
62
Figura 13. Espectro de massa do 2-metilisoborneol, tempo de reteno 14,4 minutos.
Figura 14. Espectro de massa do 2,4,6-tricloroanisole, tempo de reteno 16,6 minutos.
Figura 15. Espectro de massa da geosmina, tempo de reteno 18,2 minutos.
63
3.1.1. Efeito da temperatura de extraco O efeito da temperatura sobre a rea cromatogrfica dos compostos presentes na matriz pode ser influenciado por 3 factores. (i) sendo a absoro dos compostos pela fase estacionria um processo exotrmico, o aumento da temperatura provoca a difuso das molculas de compostos absorvidas pela fase estacionria para a fase gasosa, o que contribui para a reduo do coeficiente de partio fase estacionria/fase gasosa (k1); (ii) o aumento da temperatura tambm aumenta a solubilidade dos compostos na matriz o que causa uma reduo no coeficiente de partio fase gasosa/fase lquida (k2); (iii) o aumento de temperatura pode levar a um aumento da volatilidade dos compostos presentes na matriz, o que contribui para o aumento do coeficiente de partio fase gasosa/fase lquida (k2)51. O efeito da temperatura de extraco sobre as reas cromatogrficas depender de um equilbrio entre estes trs factores. Quando os dois primeiros efeitos (i e ii) prevalecem sobre o aumento da volatilidade dos compostos com o aumento da temperatura (iii), ocorrem redues nas reas cromatogrficas. Quando o efeito da temperatura sobre a volatilidade se sobrepe aos efeitos na absoro pela fase estacionria e na solubilidade, verificam-se aumentos nas reas cromatogrficas. Seguidamente ser analisado de forma separada o efeito da temperatura de extraco sobre as reas cromatogrficas do 3-MB, GUA e do TCA, assim, como sobre a linearidade e sensibilidade da metodologia. Os resultados relativos ao efeito da temperatura sobre a reprodutibilidade encontram-se na Tabela 15.
Tabela 15. Gamas de concentrao e coeficientes de variao para o 3-metil-1-butanol, guaiacol e 2,4,6-tricloroanisole a diferentes temperaturas (n=75). C.V. Coeficiente de variao (%) Composto Concentrao Mdia 3-MB Gua TCA 54,0 273,0 mg/L 4,7 47,1 g/L 5,8 58,0 ng/L 7,3 5,3 4,8 30C Min-Mx 4,4 10,8 3,7 9,9 3,7 8,4 Mdia 12,4 8,9 9,7 40C Min-Mx 4,4 - 17,8 5,1 16,6 5,3 16,4 Mdia 16,3 12,2 14,8 50C Min-Mx 7,6 - 29,6 5,5 18,9 8,3 17,4
64
Verifica-se que os coeficientes de variao das reas cromatogrficas duplicam para o Gua e quase triplicam para o 3-MB e TCA com o aumento da temperatura, em todas as gamas de concentrao usadas (Tabela 15). Resultados similares j observados na anlise de lcoois, steres, compostos volteis e semi-volteis em vinho68, indicam que em termos de reprodutibilidade, a temperatura de extraco de 30C a mais adequada. O efeito da temperatura sobre as reas cromatogrficas ser analisado, individualmente para cada composto.
3.1.1.1. Sobre as reas do 3-metil-1-butanol Para o 3-MB verifica-se um aumento das reas cromatogrficas com o aumento da temperatura, o que se traduz pelo aumento do seu Log(FRR) de 1,0 para 1,2. Este resultado est de acordo com trabalhos anteriores que referem que a extraco em regio de espao de cabea a temperaturas superiores temperatura ambiente (> 20C) mais eficiente para compostos de elevada volatilidade49,51, como o caso do 3-MB. Observa-se no entanto uma diminuio da linearidade da resposta com o aumento da temperatura (R2 varia de 0,9852 para 0,9306). Este facto deve-se ao aumento da variabilidade das reas cromatogrficas com o aumento da temperatura (ver barras de erro da Figura 16).
30C rea cromatogrfica

5,0E+08 4,0E+08 3,0E+08 2,0E+08 1,0E+08 0,0E+00
40C
50C
54,0
104,0
155,0
201,0
273,0
Concentrao (mg/L)
Figura 16. Efeito da temperatura de extraco na resposta obtida por HS-SPME para o 3-metil-1butanol (os valores indicados na figura correspondem s concentraes adicionadas ao simulante de vinho/matriz).
65
Verifica-se um aumento na sensibilidade da metodologia, avaliada pelo declive da equao da curva de calibrao (Tabela 16) com o aumento da temperatura, o qual passa de 92408 para 164757 (incremento de ca. 78%).
Tabela 16. Parmetros estatsticos relativos ao efeito da temperatura de extraco, para o 3-metil1-butanol (n=75). T (C) 30 40 50 R2 0,9852 0,9488 0,9306 Declive 92408 118429 164757 FRR 9,3 10,7 14,9 Log(FRR) 1,0 1,0 1,2
R2: coeficiente de regresso linear; FRR: Factor relativo de resposta.
O aumento da temperatura aumenta a quantidade de 3-MB extrada e a sensibilidade da metodologia. O facto de causar um efeito negativo na variabilidade dos resultados obtidos e na linearidade, indica que a temperatura de extraco de 30C parece ser a mais adequada.
3.1.1.2. Sobre as reas cromatogrficas do guaiacol O aumento da temperatura no parece ter qualquer efeito sobre a quantidade de Gua extrada, avaliado a partir do valor de Log(FRR), que se mantm em ca. 3,9 (Tabela 17). Resultado similar foi referido para o Gua em estudos de SPME usando uma fase estacionria de poliacrilato69. Observa-se uma diminuio da linearidade da resposta com o aumento da temperatura (R2 varia de 0,9609 para 0,9326). Este facto deve-se ao aumento da variabilidade das reas cromatogrficas com o aumento da temperatura (ver barras de erro da Figura 17).
66
30 C
8,0E+07
40 C
50 C
rea cromatogrfica
6,0E+07 4,0E+07 2,0E+07 0,0E+00 4,7 11,8 23,6 35,3 47,1
Concentrao ( g/L)
Figura 17. Efeito da temperatura de extraco na resposta obtida por HS-SPME para o guaiacol (os valores indicados na figura correspondem s concentraes adicionadas ao simulante de vinho/matriz).
Verifica-se igualmente que no existe um efeito significativo do aumento da temperatura de extraco sobre a sensibilidade da metodologia (Tabela 17), avaliada pelo declive, o qual varia de forma irregular entre 234152 e 293379.
Tabela 17. Parmetros estatsticos relativos ao efeito da temperatura de extraco, para o guaiacol (n=75). T (C) 30 40 50 R2 0,9609 0,9446 0,9326 Declive 293379 234152 279685
FRR
8870 6545 8426
Log(FRR)
3,9 3,8 3,9
R2: coeficiente de regresso linear; FRR: Factor relativo de resposta.
O aumento da temperatura no tem efeito sobre a quantidade de Gua extrada nem sobre a sensibilidade da metodologia. O facto de causar um efeito negativo na variabilidade dos resultados obtidos e na linearidade, indica que a temperatura de extraco de 30C parece ser a mais adequada.
67
3.1.1.3. Sobre as reas cromatogrficas do 2,4,6-tricloroanisole Para o TCA verifica-se que o aumento da temperatura causa uma diminuio acentuada na rea cromatogrfica e consequentemente sobre a quantidade extrada (Figura 18), o que est de acordo com a diminuio do Log(FRR) de 2,4 para 2,1 (Tabela 18). Resultados semelhantes foram j referidos na literatura com a mesma fibra58,61. Este comportamento pode dever-se ao facto de o TCA apresentar uma constante de Henry elevada (130 atm.cm3/mol). A 30C, o TCA j se encontra na fase gasosa em percentagem elevada. Assim, o efeito do aumento da temperatura para 40C e 50C no dever ter uma influncia muito significativa sobre a sua passagem para a fase gasosa, tendo no entanto efeito sobre o aumento da solubilidade na matriz e diminuio da absoro na fase estacionria.
30C
1,2E+07 1,0E+07 8,0E+06
40C
50C
rea
6,0E+06 4,0E+06 2,0E+06 0,0E+00 5,8 11,6 23,2 46,4 58,0
Concentrao (ng/L)
Figura 18. Efeito da temperatura de extraco na resposta obtida por HS-SPME para o 2,4,6tricloroanisole (os valores indicados na figura correspondem s concentraes adicionadas ao simulante de vinho/matriz).
Observa-se uma diminuio acentuada da linearidade da resposta com o aumento da temperatura (R2 varia de 0,9930 para 0,8902). Este facto deve-se ao aumento da variabilidade das reas cromatogrficas com o aumento da temperatura (ver barras de erro da Figura 18).
68
Verifica-se igualmente que existe um efeito negativo do aumento da temperatura de extraco sobre a sensibilidade da metodologia (Tabela 18), avaliada pelo declive, o qual passa de 31075 para 17778 (decrscimo de ca. 43%).
Tabela 18. Parmetros estatsticos relativos ao efeito da temperatura de extraco, para o 2,4,6tricloroanisole (n=75). T (C) 30 40 50
2
R2 0,9930 0,9361 0,8902
Declive 31075 26795 17778
FRR 224 190 131
Log(FRR) 2,4 2,3 2,1
R : coeficiente de regresso linear; FRR: Factor relativo de resposta.
O aumento da temperatura reduz a quantidade de TCA extrada. Afecta, tambm, de forma negativa a variabilidade, sensibilidade e linearidade da metodologia, o que indica que a temperatura de soro de 30C parece ser a mais adequada. Devido ao facto de, para todos os compostos, se verificar que o aumento da temperatura tem um efeito negativo sobre a variabilidade e a linearidade da metodologia e uma vez que diminui de forma muito acentuada a rea cromatogrfica do TCA, a temperatura de extraco de 30C parece ser a mais adequada.
3.1.2. Linearidade global da metodologia HS-SPME As fases estacionrias do tipo absorvente, como a PDMS, virtualmente nunca ficam saturadas49,50 e apresentam uma resposta linear numa ampla gama de concentrao. No entanto, existem estudos que referem a possibilidade de ocorrncia de saturao das fases estacionrias do tipo absorvente6,51. Esta situao pode levar a efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz, o que pode trazer implicaes nas anlises quantitativas decorrentes. Assim, neste estudo pretende-se definir uma gama de
69
concentrao em que se verifique uma relao linear entre a rea cromatogrfica total e a concentrao total da matriz, o que permitir avaliar a linearidade global da metodologia. Posteriormente ser realizada uma avaliao para cada composto. A Figura 19 representa a variao das reas cromatogrficas totais vs concentrao total da matriz.
5 .E + 0 8 R = 0 ,9 7 8 8 rea cromatogrfica total 4 .E + 0 8 3 .E + 0 8 2 .E + 0 8 1 .E + 0 8 0 .E + 0 0

2
4 1 ,5
7 5 ,8
1 0 6 ,5 C o n c e n tra o (m g /L )
1 5 4 ,2
2 7 5 ,2
Figura 19. Variao da rea cromatogrfica total em funo da concentrao dos 7 padres na matriz (n=25).
Como se pode verificar pela Figura 19, as reas cromatogrficas totais variam de forma linear (R2 0,9788) com a concentrao total da matriz. Devido ao facto dos padres utilizados estarem presentes em gamas de concentrao muito distintas (mg, g e ng) e sendo o 3-MB o composto presente em maior concentrao, de realar que estas reas cromatogrficas totais esto dependentes principalmente deste composto. Estes resultados indicam que para uma concentrao total entre 41,5 e 275,2 mg/L, no se verifica saturao da fase estacionria.
70
3.2. Reprodutibilidade e linearidade da metodologia HS-SPME

A reprodutibilidade da metodologia foi estudada atravs dos valores dos coeficientes de variao das reas cromatogrficas dos 7 padres utilizados (Tabela 19), os quais variam entre 3,2 e 9,8%, o que se pode considerar como sendo bastante satisfatrio para este tipo de anlise. Esta variao pode estar associada a vrios factores, entre os quais a volatilidade dos compostos, a concentrao na matriz e a afinidade para a fase estacionria51.
Tabela 19. Gama de concentrao e coeficiente de variao dos compostos em estudo (n= 175). Composto 3- MB 1-Oct-3 1-Oct Gua MIB TCA Geo Gama de concentrao 47,7 191,0 mg/L 10,7 - 42,7 g/L 20,8 208,0 g/L 5,2 - 51,6 g/L 8,0 80,0 ng/L 2,0 19,8 ng/L 8,4 84,0 ng/L CV Coeficiente de variao (%) Mdia 7,7 6,5 5,8 4,8 4,9 4,9 4,7 Mnimo 6,4 4,4 5,7 4,1 3,7 4,2 3,2 Mximo 9,8 8,3 5,9 5,6 6,7 5,7 5,8
Dentro do grupo de compostos em estudo verifica-se que o Gua, MIB, TCA e Geo apresentam coeficientes de variao muito similares (4,7 - 4,9%), pelo que pode dizer-se que estes 4 compostos tm a mesma resposta em termos de reprodutibilidade. O 1-Oct e o 1-Oct-3 apresentam valores de coeficientes de variao que tambm no diferem muito entre si, 6,5 e 5,8%, respectivamente. Finalmente merece destaque o 3-MB pelo facto de ser o composto que apresenta os valores mais elevados (7,7%). Apesar deste valor ser considerado aceitvel para este tipo de anlises, este resultado pode ser explicado pelo facto do 3-MB apresentar uma menor afinidade para a fase estacionria comparativamente com os outros compostos em estudo (avaliada pelo valor de Log(FRR) apresentando no ponto 3.3). Por outro lado, pelo facto de se tratar de um composto de
71
baixo peso molecular, podendo ser absorvido e desorvido durante o tempo em que se procede extraco, aumentando assim a variabilidade do processo49. Para o estudo da linearidade prepararam-se curvas de calibrao para os 7 compostos em estudo. A Tabela 20 representa os parmetros estatsticos das curvas de calibrao dos compostos em anlise. Os coeficientes de correlao foram estabelecidos fazendo variar a concentrao do composto (Tabela 12), mantendo fixa a concentrao dos restantes compostos na soluo base (Tabela 13). Para cada um dos 7 compostos em estudo, observa-se uma relao linear entre a rea cromatogrfica e a sua concentrao, com valores para o quadrado do coeficiente de correlao (R2) situados entre 0,9517 e 0,9886, o que indica que a soluo etanol/gua capaz de formar uma matriz estvel para quantificar os compostos padro, de modo a produzir um equilbrio reprodutvel entre a fase estacionria e o espao de cabea da soluo etanlica51. Apesar de se trabalhar em 3 nveis de concentrao diferentes, mg/L para o 3-MB, g/L para o 1-Oct-3, 1-Oct e Gua, e na gama de ng/L para o MIB, TCA e Geo, no se verifica influncia deste factor quer na reprodutibilidade, avaliada pelo coeficiente de variao, que na linearidade, avaliada pelo coeficiente de regresso (Tabelas 19 e 20). As curvas de calibrao estabelecidas encontram-se representadas na Figura 20.
Tabela 20. Parmetros estatsticos das curvas de calibrao dos compostos em anlise (n=175). Composto 3-MB 1-Oct-3 1-Oct Gua MIB TCA Geo Gama de concentrao 47,7 191,0 mg/L 10,7 42,7 g/L 20,8 208,0 g/L 5,2 51,6 g/L 8,0 - 80,0 ng/L 2,0 34,8 ng/L 8,4 84,0 ng/L R2 0,9602 0,9611 0,9516 0,9849 0,9749 0,9886 0,9659 Equao da recta y= 882579x + 88118 y= 132026x + 721129 y= 139744x + 23761514 y= 82646x + 147513 y= 1829,5x + 258399 y= 1426,1x + 20205 y= 638,66x + 269789
72
1,7E+07 rea
6,5E+06 5,0E+06 3,5E+06 2,0E+06 10,0
8,5E+06 4,5E+06 47,7
97,7
147,7
rea
1,3E+07
Concentrao (m g/L)
20,0
30,0
40,0
Concentrao (g/L)
A. 3-Metil-1-butanol (47,7 a 191 mg/L)

6,0E+07 rea 4,5E+07 3,0E+07 1,5E+07 20,8
B. 1-Octeno-3-ol (10,7 a 42,7 g/L)

4,5E+06 3,0E+06 rea 1,5E+06 0,0E+00 5,2 15,2 25,2 35,2 45,2 Concentrao (g/L)
70,8
120,8
170,8
Concentrao (g/l)
C. 1-Octanol (20,8 a 208 g/L)

1,0E+06 rea
D. Guaiacol (5,16 a 51,6 g/L)
2,1E+05 rea 1,5E+05 8,5E+04 2,5E+04
7,5E+05 5,0E+05 2,5E+05 8,0 28,0 48,0 68,0 Concentrao (ng/L)
2,0
7,0 12,0 Concentrao (ng/L)
17,0
E. 2-Metilisoborneol (8,0 a 80,0 ng/L)
F. 2,4,6-Tricloroanisole (2,0 a 34,8 ng/L)
5,2E+05 4,3E+05 3,4E+05 2,5E+05 8,4 28,4 48,4 Concentrao (ng/L) 68,4
rea
G. Geosmina (8,4 a 84,0 ng/L) Figura 20. Curvas de calibrao dos compostos em estudo, em fase estacionria PDMS a 30C.
73
3.3. Estimativa dos Factores Relativos de Resposta

Os diversos tipos de fases estacionrias que podem ser utilizados na tcnica de SPME podem apresentar alguma selectividade para diferentes tipos de analitos a serem extrados. Este facto pode originar que entre uma gama de compostos presentes numa dada matriz exista um que, apesar de estar presente em menor concentrao, seja extrado de uma forma mais eficiente, o que ser traduzido por uma maior rea cromatogrfica. Assim, o FRR estabelece a relao entre a concentrao do composto na matriz lquida e as respectivas reas cromatogrficas, sendo considerado como resultado das caractersticas de cada composto, como o seu peso molecular, ponto de ebulio, estrutura molecular, solubilidade na matriz lquida e afinidade para ser absorvido pela fase estacionria51. Na Tabela 21 esto indicados os FRR e os Log(FRR) obtidos para os 7 padres, estes valores foram normalizados relativamente resposta do etanol.
Tabela 21. Factores relativos de resposta (FRR) da metodologia de SPME relativamente aos compostos em estudo, presentes numa matriz etanol/gua 10%, valores normalizados relativamente resposta do etanol (n=175). Composto Gama de concentrao FRR Mdio 10 18041 57487 8885 408 196 297 Gama 9 - 11 16032 - 22382 24943 - 122044 8252 - 9894 231 - 782 154 - 320 122 - 680 Log(FRR)
3-MB 1-Oct-3 1-Oct Gua MIB TCA Geo
47,7 191,0 mg/L 10,7 42,7 g/L 20,8 208,0 g/L 5,2 51,6 g/L 8,0 80,0 ng/L 2,0 19,8 ng/L 8,4 84,0 ng/L
1,0 4,3 4,9 3,9 2,6 2,3 2,5
De acordo com os Log(FRR) definiram-se 4 grupos (Tabela 22): grupo 1 (3-MB com Log(FRR)=1), Grupo 2 (Geo, TCA e MIB com Log(FRR) de 2 a 3), grupo 3 (Gua com Log(FRR)=4) e grupo 4 (1-Oct-3 e 1-Oct com Log(FRR)> 4).
74
Tabela 22. Caractersticas fsico-qumicas dos compostos, agrupados de acordo com os respectivos Factores Relativos de Resposta (FRR). Grupo 1 Log(FRR)=1
H3C CH3 OH
3-MB Solubilidade (gua) LogP (oct/ag) P. de vapor C. Henry (kH) Grupo 2 Log(FRR) de 2 a 3 2,67 x104 mg/L 1,16 2370 x10-3mmHg 14,0 atm.cm3/mol
CH3
CH3
O
Cl Cl
H3C
CH3
OH CH3
Cl
H3C CH3
OH
Geo Solubilidade (gua) LogP (oct/ag) P. de vapor C. Henry (kH) Grupo 3 Log(FRR)= 4 157 mg/L 3,57 2,14 x10 mmHg 11,8 atm.cm3/mol
CH3
-3
TCA 10 (20C) mg/L 4,11 22,8 x10 mmHg 130 atm.cm3/mol

-3
MIB 305 mg/L 3,31 32,0 x10-3mmHg 8,9 atm.cm3/mol
O
HO
Gua Solubilidade (gua) LogP (oct/ag) P. de vapor C. Henry (kH) Grupo 4 Log(FRR)>4
H3C OH
1,87x104 mg/L 1,32 103 x10-3mmHg 1,2 atm.cm3/mol

CH2
H3C
OH
1-Oct-3 Solubilidade (gua) LogP (oct/ag) P. de vapor C. Henry (kH) Ins. -
1-Oct 540 mg/L 3,00 79,4 x10-3mmHg 24,5 atm.cm3/mol
75
Verifica-se que no grupo 1 se encontra o composto de menor massa molecular, com volatilidade (2370x10-3mmHg) e solubilidade em gua (2,67x104mg/L) elevadas. Neste caso, do equilbrio entre o efeito da volatilidade vs solubilidade, parece ser o efeito da solubilidade a ter um papel preponderante. Estudos anteriores49 indicam existir uma relao linear entre a MM e o Log(FRR), o que pode explicar o valor de Log(FRR) determinado para o 3-MB. No Grupo 2 esto contidos os compostos com menor volatilidade (presso de vapor de 2x10-3 a 32x10-3 mmHg), o que faz com que possam necessitar de maior tempo para que ocorra a sua passagem para o espao de cabea, com excepo do TCA que por apresentar um valor de constante de Henry elevado (130 atm.cm3/mol) apresenta elevada afinidade para a fase gasosa. Estes compostos apresentam baixa solubilidade em gua (de 10 a 305 mg/L), e os valores de LogP(oct/ag)4 indicam relativa solubilidade em solventes orgnicos. Assim, o etanol pode funcionar como co-solvente. Este facto associado sua baixa volatilidade pode explicar o valor de FRR determinado para este grupo. No grupo 3 encontra-se o Gua, composto mais voltil (presso de vapor 103x10-3 mmHg) e mais solvel (1,87x104mg/L) que os compostos do grupo 2. Neste caso, do equilbrio entre o efeito da volatilidade vs solubilidade, parece ser o efeito da volatilidade a ter um papel preponderante. A este h a acrescentar a afinidade para a fase estacionria o que se traduz por um valor relativamente elevado de Log(FRR). No grupo 4 encontram-se o 1-Oct-3 e 1-Oct, compostos com maior afinidade para a fase gasosa, evidenciada por terem valores de solubilidade em gua relativamente baixo (insolvel e 540 mg/L para o 1-Oct-3 e 1-Oct, respectivamente), o que est de acordo com anteriores estudos51 que indicam que a maior afinidade com a fase estacionria se verifica para compostos com menor solubilidade em gua e menor volatilidade.
76
3.4. Avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz
No sentido de avaliar os efeitos de interferncia da concentrao de um composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz foi preparada uma soluo base contendo os 7 compostos e vrias outras solues-padro nas quais apenas se varia a concentrao de um composto (Tabela 13). Os resultados encontram-se nas Tabelas 23 a 30. A concentrao total mxima da matriz 190,9 mg/L, valor este contido na gama de linearidade da metodologia. Os resultados obtidos foram tratados de acordo com 2 metodologias. Na anlise do efeito da variao individual da concentrao de cada um dos compostos sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz, atravs da anlise de t-Student; Para anlise do efeito da variao da concentrao dos compostos constituintes da matriz sobre a rea individual de cada um dos compostos so propostos modelos de regresso linear.
3.4.1. Anlise do efeito da variao individual da concentrao de cada um dos compostos sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz 3.4.1.1. Estudo do efeito da variao da concentrao do 3-metil-1-butanol Partindo da soluo base, foram efectuadas variaes da concentrao do 3-MB (0,5 a 2,0 vezes), mantendo-se os restantes compostos com concentrao constante. Na Tabela 23 apresenta-se, para cada composto, a razo entre Ax/A0, sendo Ax a rea do composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao de 3-MB e A0 a rea do mesmo composto na soluo base. A aplicao do teste t-Student aos dados anteriores indica que no h diferena significativa entre os valores de A0 e Ax, com 95% de confiana. Assim, a variao na concentrao do 3-MB no interfere na quantificao dos outros compostos, nas gamas de concentrao em estudo.
77
Tabela 23. Efeitos de interferncia da concentrao do 3-metil-1-butanol sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz (n= 25). Variao de concentrao (x) 0,5 0,8 1,5 2,0 1-Oct-3 0,911* 0,989 0,988 0,963 1-Oct 1,001 0,997 1,010 0,985 Gua 0,988 1,004 1,002 1,020 MIB 0,995 0,972 0,976 0,984 TCA 1,022 1,011 1,038 1,010 Geo 1,028 1,018 0,999 1,013
(x) Factor de variao em relao concentrao da soluo base (95,4mg/L). * razo entre Ax/A0, sendo Ax a rea do composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao de 3-MB e A0 a rea do mesmo composto na soluo base.
. 3.4.1.2. Estudo do efeito da variao da concentrao do 1-octeno-3-ol Partindo da soluo base, foram efectuadas variaes da concentrao do 1-Oct-3 (0,4 a 1,6 vezes), mantendo-se os restantes compostos com concentrao constante. Na Tabela 24 apresenta-se, para cada composto, a razo entre Ax/A0, sendo Ax a rea do composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao de 1-Oct-3 e A0 a rea do mesmo composto na soluo base.
Tabela 24. Efeitos de interferncia da concentrao do 1-octeno-3-ol sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz (n=25). Variao de concentrao (x) 0,4 0,8 1,2 1,6 3-MB 0,971* 1,062 1,050 0,986 1-Oct 1,111 1,071 1,014 0,893 Gua 1,040 1,034 0,998 1,011 MIB 1,046 1,093 1,026 1,002 TCA 1,028 0,988 1,002 0,991 Geo 1,024 0,960 0,982 0,913
(x) Factor de variao em relao concentrao da soluo base (26,7 g/L). * razo entre Ax/A0, sendo Ax a rea do composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao de 1-Oct-3 e A0 a rea do mesmo composto na soluo base.
78
A aplicao do teste t-Student aos dados anteriores indica que no h diferena significativa entre os valores de A0 e Ax, com 95% de confiana. Assim, a variao na concentrao do 1-Oct-3 no interfere na quantificao dos outros compostos, nas gamas de concentrao em estudo.
3.4.1.3. Estudo do efeito da variao da concentrao do 1-octanol Partindo da soluo base, foram efectuadas variaes da concentrao do 1-Oct (0,3 a 2,7 vezes), mantendo-se os restantes compostos com concentrao constante. Na Tabela 25 apresenta-se, para cada composto, a razo entre Ax/A0, sendo Ax a rea do composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao de 1-Oct e A0 a rea do mesmo composto na soluo base.
Tabela 25. Efeitos de interferncia da concentrao do 1-octanol sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz (n=25). Variao de concentrao (x) 0,3 0,5 2,0 2,7 3-MB 1,355* 1,369 1,065** 1,071** 1-Oct-3 0,980** 0,983** 0,972** 0,951** Gua 1,691 1,519 0,814 0,830 MIB 1,312 1,219 0,814 0,629 TCA 1,239 1,157 0,872 0,724 Geo 1,848 1,626 0,751 0,504
(x) Factor de variao em relao concentrao da soluo base (78,0 g/L). * razo entre Ax/A0, sendo Ax a rea do composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao de 1-Oct e A0 a rea do mesmo composto na soluo base. ** No h diferena significativa entre os resultados (t-Student, 95%).
A Tabela 25 indica que variaes na concentrao do 1-Oct provocam alteraes significativas nas reas cromatogrficas do Gua, MIB, TCA e Geo. Verifica-se, ainda, que no provoca alteraes significativas na rea cromatogrfica do 1-Oct-3 para todas as concentraes estudadas e interfere nas reas cromatogrficas do 3-MB, apenas para as concentraes mais elevadas de 1-Oct (incrementos de 2,0 e 2,7 vezes)
79
Razo de rea cromatogrfica
2,0 1,8 1,5 1,3 1,0 0,8 0,5 0,3 0,0
3-MB
1-Oct-3
Gua
MIB
TCA
Geo
2,0 0,3 0,5
2,7
Variao da concentrao (x)
Figura 21. Variao das reas dos compostos com concentrao adicionada constante por interferncia da variao da concentrao do 1-octanol (0,3, 0,5, 2,0 e 2,7 vezes) a concentrao da soluo-base.
O efeito da variao da concentrao do 1-Oct sobre as reas cromatogrficas dos restantes compostos da matriz (Figura 21) est relacionado com a alterao da composio do espao de cabea e posterior soro na fase estacionria (Tabela 22). Em relao afinidade da fase estacionria, analisando os respectivos FRR (Tabela 21), verifica-se que o 1-Oct, sendo o composto que apresenta o maior FRR (Log(FRR)= 4,9), causa interferncia em todos os compostos com menor FRR mas no naquele que tem FRR prximo do seu, no caso o 1-Oct-3 (Log(FRR)= 4,3). O Gua apesar de apresentar elevado FRR (logFFR= 3,9), apresenta baixa afinidade para a fase gasosa (constante de Henry 1,2 atm.cm3/mol) onde efectuada a extraco e elevada solubilidade em gua (1,87x104 mg/L). A Geo, o MIB e o TCA so os compostos mais influenciados pela variao da concentrao do 1-Oct pois alm de apresentarem baixos valores de FRR (Log(FRR)=2,6, 2,5 e 2,3 respectivamente) esto presentes em concentraes muito baixas (ng/L). Dentro deste grupo a Geo o composto mais influenciado por apresentar menor volatilidade (presso de vapor 2,14x10-3 mmHg) e o TCA menos influenciado porque, apesar de apresentar volatilidade relativamente baixa (presso de vapor 22,8x103
mmHg), apresenta uma elevada afinidade para a fase gasosa (constante de Henry 130
atm.cm3/mol). Finalmente o 3-MB apesar de apresentar baixo FRR (Log(FRR)= 1,0) que indicaria uma elevada interferncia devido variao da concentrao do 1-Oct, s sofre alterao com diminuio de concentrao e no se verifica efeito com o aumento.
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O efeito da variao da concentrao do 1-Oct sobre os outros compostos, expresso em termos de concentrao, apresentado na Tabela 26.
Tabela 26. Interferncia da variao da concentrao de 1-octanol (23,4 a 210,6 g/L) na concentrao estimada dos restantes compostos da soluo base (n=25). 1-Oct 3-MB 1-Oct-3 Gua MIB TCA Geo
Concentrao adicionada 78,0 g/L 95,4 mg/L 26,7 g/L 19,4 g/L 30,0 ng/L 7,4 ng/L 31,4 ng/L
Concentrao estimada 20,8 g/L 41,6 g/L 156,0 g/L 208,0 g/L 129,4 (8,8)* 129,9 (8,3) 101,7 (9,4) 102,3 (10,7) 111,7 14,8** 26,1 (6,1) 26,2(5,7) 25,9 (4,3) 25,3 (6,2) 26,8 0,45 33,5 (5,8) 30,0 (5,5) 15,5 (5,9) 15,9 (4,3) 22,9 7,5 45,3 (4,9) 40,8 (5,0) 20,9 (6,4) 11,8 (4,8) 28,3 12,4 15,4 (4,6) 13,3 (5,2) 5,1 (4,1) 2,8 (4,7) 6,8 4,8 50,8 (4,8) 44,2 (4,9) 21,1 (5,3) 9,2 (5,7) 28,2 15,1
* valor de coeficiente de variao (%) ** Mdia e intervalo de confiana, t95%, 24, com 95% de confiana e 24 graus de liberdade.
Verifica-se que no h diferena significativa entre os valores de coeficiente de variao para cada valor de concentrao de 1-Oct. Assim, de modo a avaliar o impacto do efeito do 1-Oct sobre a quantificao dos restantes compostos, e uma vez que a concentrao adicionada de cada um dos restantes compostos na soluo base se manteve constante, procedemos ao clculo do valor mdio de todas as determinao e respectivo intervalo de confiana. Para cada composto resultaram 25 determinaes, independentemente da concentrao de 1-Oct variar de 23,4 a 210,6 g/L. Estes resultados podem explicar a existncia de discrepncias entre a anlise sensorial de determinado composto e a sua quantificao por HS-SPME, seja por ser detectado sensorialmente e no haver um resultado analtico que explique o aroma, quer por no ser detectado sensorialmente e o resultado encontrado por HS-SPME ser superior ao seu
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LPS, uma vez que o 1-Oct faz parte da composio qumica, quer dos vinhos quer da cortia, em quantidades que variam entre 3 e 250 g/L. Globalmente, a variao do 1-Oct causa interferncia negativa na quantificao do Gua, MIB, TCA e Geo, levando a um erro de quantificao por defeito, interferncia positiva para o 3-MB, levando a um erro de quantificao por excesso. Relativamente ao 1-Oct-3 no se verifica interferncia do 1-Oct na sua quantificao. Para o 3-MB, sendo a concentrao na soluo base de 95,4 mg/L os resultados obtidos indicam valores de (111,7 14,8) mg/L. O valor resultante sobre-estimado em ca. de 17%, com valores entre 96,9 e 126,5 mg/L. Encontram-se sempre valores estimados superiores quantidade adicionada, o que indica que mesmo que o 3-MB esteja presente em quantidade inferior ao seu LPS (300 mg/L), a interferncia do 1-Oct leva quantificao deste composto em valores superiores ao seu LPS sem haver deteco sensorial. O coeficiente de variao global dos resultados de 13,8%. Para o 1-Oct-3 no h influncia significativa para os resultados, o que e evidenciado pelos resultados obtidos para a concentrao estimada. Assim para um valor de concentrao adicionado de 26,7g/L, procedemos determinao de (26,8 0,45) g/L, o que uma muito boa estimativa da concentrao na soluo base e independente da variao da concentrao do 1-Oct. O coeficiente de variao global dos resultados de 2,7%. Para o Gua, sendo a concentrao na soluo base de 19,4 g/L os resultados obtidos indicam valores de (22,9 7,5) g/L. O valor resultante sobre-estimado em ca. de 18%, com valores entre 15,4 e 30,4 g/L. No entanto, dado o seu limite de percepo sensorial (20 g/L), a interferncia do 1-Oct pode causar uma diminuio no valor de quantificao do Gua a nveis que no explicam a sua deteco sensorial. O coeficiente de variao global dos resultados de 39,5%. Para o MIB, sendo a concentrao na soluo base de 30 ng/L os resultados obtidos indicam valores de (28,3 12,4) ng/L. O valor resultante sub-estimado em ca. de 6%, com valores entre 15,9 e 44,2 ng/L. No entanto, dado o seu limite de percepo sensorial (30 ng/L), a interferncia do 1-Oct pode causar uma diminuio no valor de quantificao do MIB a nveis que no explicam a sua deteco sensorial. O coeficiente de variao global dos resultados de 53,7%.
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Para o TCA, sendo a concentrao na soluo base de 7,4 ng/L os resultados obtidos indicam valores de (6,8 4,8) ng/L. O valor resultante sub-estimado em ca. de 9%, com valores entre 2,0 e 8,8 ng/L. Alm do erro de determinao, dado o seu limite de percepo sensorial (4 ng/L), a interferncia do 1-Oct pode causar uma diminuio no valor de quantificao do TCA a nveis que no explicam a sua deteco sensorial. O coeficiente de variao global dos resultados de 67,1%. Para a Geo, sendo a concentrao na soluo base de 31,4 ng/L os resultados obtidos indicam valores de (28,2 15,1) ng/L. O valor resultante sub-estimado em ca. de 10%, com valores entre 15,1 e 41,3 ng/L. No entanto, dado o seu limite de percepo sensorial (25 ng/L), a interferncia do 1-Oct pode causar uma diminuio no valor de quantificao da Geo a nveis que no explicam a sua deteco sensorial. O coeficiente de variao global dos resultados de 62,2%. De acordo com o coeficiente de variao, podemos dividir os compostos influenciados pela variao de concentrao do 1-Oct em 3 grupos: Grupo A, constitudo pelo TCA, MIB e Geo, com coeficientes de variao de 67,1, 62,2 e 53,7%, respectivamente; Grupo B, constitudo pelo Gua, com coeficiente de variao de 39,5% e o Grupo C, constitudo pelo 3-MB, com coeficiente de variao de 13,8%. Verifica-se que o comportamento dos compostos seguiu a mesma tendncia de agrupamento que a observada no estudo dos Factores Relativos de Resposta (ponto 3.3), verificando-se que, com excepo para o 3-MB, a variabilidade associada interferncia de um composto por HS-SPME est igualmente relacionada com os FRR, sendo inversamente proporcional ao seu Log(FRR). Verifica-se assim que quantificao de compostos por HS-SPME sensvel interferncia de compostos presentes na matriz com FRR mais elevado. Este efeito reveste-se de elevada importncia na quantificao de TCA, MIB e Geo, que apesar de apresentarem um erro por sub-estimativa entre 6 e 10%, tm um coeficiente de variao de tal maneira elevado (entre 50 e 70%) que leva a que os valores de quantificao destes compostos possam ser de tal forma diminudos em relao sua real concentrao na matriz, que estes sejam detectados sensorialmente e no detectados por HS-SPME.
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3.4.1.4. Estudo do efeito da variao da concentrao do guaiacol Partindo da soluo base, foram efectuadas variaes da concentrao do Gua (0,3 a 2,7 vezes), mantendo-se os restantes compostos com concentrao constante. Na Tabela 27 apresenta-se, para cada composto, a razo entre Ax/A0, sendo Ax a rea do composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao de Gua e A0 a rea do mesmo composto na soluo base.
Tabela 27. Efeitos de interferncia da concentrao do guaiacol sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz (n=25). Variao de concentrao (x) 0,3 0,7 2,0 2,7 3-MB 1,018* 1,036 1,027 0,089 1-Oct-3 0,976 1,013 1,034 0,952 1-Oct 0,959 1,034 1,012 1,040 MIB 1,005 0,994 1,018 0,986 TCA 1,019 0,999 1,041 1,014 Geo 1,010 1,032 1,008 0,992
(x) Factor de variao em relao concentrao da soluo base (19,4 g/L). * Razo entre Ax/A0, sendo Ax a rea do composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao de Gua e A0 a rea do mesmo composto na soluo base.
A aplicao do teste t-Student aos dados anteriores indica que no h diferena significativa entre os valores de A0 e Ax, com 95% de confiana. Assim, a variao na concentrao do Gua no interfere na quantificao dos outros compostos, nas gamas de concentrao em estudo.
3.4.1.5. Estudo do efeito da variao da concentrao do 2-metilisoborneol Partindo da soluo base, foram efectuadas variaes da concentrao do MIB (0,3 a 2,7 vezes), mantendo-se os restantes compostos com concentrao constante. Na Tabela 28 apresenta-se, para cada composto, a razo entre Ax/A0, sendo Ax a rea do composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao de MIB e A0 a rea do mesmo composto na soluo base.
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Tabela 28. Efeitos de interferncia da concentrao do 2-metilisoborneol sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz (n=25). Variao de concentrao (x) 0,3 0,7 2,0 2,7 3-MB 1,001* 1,028 1,016 1,033 1-Oct-3 1,003 0,985 0,994 0,993 1-Oct 1,020 1,056 0,988 0,991 Gua 1,006 0,998 0,978 0,987 TCA 1,003 0,992 0,990 0,987 Geo 0,960 0,968 1,007 0,984
(x) Factor de variao em relao concentrao da soluo base (30 ng/L). * Razo entre Ax/A0, sendo Ax a rea do composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao de MIB e A0 a rea do mesmo composto na soluo base.
A aplicao do teste t-Student aos dados anteriores indica que no h diferena significativa entre os valores de A0 e Ax, com 95% de confiana. Assim, a variao na concentrao do MIB no interfere na quantificao dos outros compostos, nas gamas de concentrao em estudo.
3.4.1.6. Estudo do efeito da variao da concentrao do 2,4,6-tricloroanisole Partindo da soluo base, foram efectuadas variaes da concentrao do TCA (0,3 a 2,7 vezes), mantendo-se os restantes compostos com concentrao constante. Na Tabela 29 apresenta-se, para cada composto, a razo entre Ax/A0, sendo Ax a rea do composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao de TCA e A0 a rea do mesmo composto na soluo base.
Tabela 29. Efeitos de interferncia da concentrao do 2,4,6-tricloroanisole sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz (n=25). Variao de concentrao (x) 0,3 0,7 2,0 2,7 3-MB 1,012* 0,993 1,004 1,011 1-Oct-3 0,977 0,963 1,009 0,963 1-Oct 0,987 1,031 0,984 0,994 Gua 0,950 0,984 0,976 0,983 MIB 0,957 1,013 0,905 0,996 Geo 1,029 1,018 1,050 1,003
(x) Factor de variao em relao concentrao da soluo base (7,4 ng/L). * Razo entre Ax/A0, sendo Ax a rea do composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao de TCA e A0 a rea do mesmo composto na soluo base.
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A aplicao do teste t-Student aos dados anteriores indica que no h diferena significativa entre os valores de A0 e Ax, com 95% de confiana. Assim, a variao na concentrao do TCA no interfere na quantificao dos outros compostos, nas gamas de concentrao em estudo.
3.4.1.7. Estudo do efeito da variao da concentrao da geosmina Partindo da soluo base, foram efectuadas variaes da concentrao da Geo (0,3 a 2,7 vezes), mantendo-se os restantes compostos com concentrao constante. Na Tabela 30 apresenta-se, para cada composto, a razo entre Ax/A0, sendo Ax a rea do composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao de Geo e A0 a rea do mesmo composto na soluo base. A aplicao do teste t-Student aos dados anteriores indica que no h diferena significativa entre os valores de A0 e Ax, com 95% de confiana. Assim, a variao na concentrao da Geo no interfere na quantificao dos outros compostos, nas gamas de concentrao em estudo.
Tabela 30. Efeitos de interferncia da concentrao do geosmina sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz (n=25). Variao de concentrao (x) 0,3 0,7 2,0 2,7 3-MB 1,012* 1,044 0,995 1,031 1-Oct-3 0,986 1,009 0,980 0,983 1-Oct 0,982 0,972 0,977 0,975 Gua 1,002 0,968 0,995 1,000 MIB 0,961 0,985 0,959 0,972 TCA 1,024 1,004 1,005 1,024
(x) Factor de variao em relao concentrao da soluo base (31,4 ng/L). * Razo entre Ax/A0, sendo Ax a rea do composto i na soluo em que ocorre variao da concentrao de Geo e A0 a rea do mesmo composto na soluo base.
3.4.1.8. Resumo De forma global, e relativamente aos compostos em estudo, o 1-Oct o nico que apresenta um efeito significativo na diminuio da eficcia da extraco dos compostos,
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com excepo do 1-Oct-3, causando assim uma diminuio acentuada da sensibilidade da extraco. Os compostos influenciados so aqueles que apresentam menores FRR, indicando que os compostos com maior Log(FRR) so menos influenciados por efeitos de composio de matriz. Verifica-se assim que quantificao de compostos por HS-SPME sensvel interferncia de compostos presentes na matriz com FRR mais elevado. Este efeito reveste-se de elevada importncia na quantificao de TCA, MIB e Geo, que apesar de apresentarem um erro por sub-estimativa entre 6 e 10%, tm um coeficiente de variao elevado (entre 50 e 70%) que leva a que os valores de quantificao destes compostos possam ser de tal forma diminudos em relao sua real concentrao na matriz, que estes sejam detectados sensorialmente e no detectados por HS-SPME. Este facto refora estudos anteriores que indicavam que a quantificao por SPME muito dependente da composio da matriz, sendo de considerar que a composio relativa da matriz deve ser considerada quando se comparam valores obtidos com esta metodologia51.
3.4.2. Anlise do efeito da variao da concentrao dos compostos constituintes da matriz sobre a rea individual de cada um dos compostos O objectivo da anlise de regresso descrever a relao entre variveis de forma a obter um valor estimado da resposta. Neste caso as variveis so a concentrao de cada um dos compostos e a resposta a rea cromatogrfica de um dado composto. Assim sendo, os resultados esto sempre dependentes da qualidade da amostra, nomeadamente a variabilidade de cada composto, que deve ser comparvel com aquele que se pensa encontrar nas amostras reais, de forma a diminuir o erro da estimativa dos efeitos. De seguida apresentam-se os modelos estatsticos desenvolvidos para cada um dos compostos com um nvel de confiana de 95%, cujos resultados se encontram em anexo. Os compostos encontram-se referidos pelas letras A, B, C, D, E, F, G, seguindo a ordem de eluio, ou seja 3-MB, 1-Oct-3, 1-Oct, Gua, MIB, TCA e Geo, respectivamente. Para cada um dos compostos, quanto maior for o valor de significncia (p), maior ser a influncia da concentrao desse compostos nas reas cromatogrficas. Os modelos
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propostos permitem conhecer a tendncia do efeito positivo ou negativo da variao da concentrao sobre a rea cromatogrfica do composto em estudo.
3.4.2.1. Modelo de regresso proposto para o 3-metil-1-butanol (A) A equao do modelo linear proposto para o 3-MB a seguinte:
Y A = 17291984+30133CA+ 4841CB + 52903CC - 46407CD -6810CE -17500CF- 4927CG

(p=0,07) (p=0,49) (p=0,98) (p=0,10) (p=0,72) (p=0,68) (p=0,72) (p=0,76)
De acordo com o modelo linear proposto, verifica-se que a variao da concentrao de todos os compostos (A a G) influencia a rea cromatogrfica do 3-MB. De forma positiva tem-se a contribuio do prprio 3-MB e ainda de 1-Oct-3 e 1-Oct. Tm-se contribuies negativas do Gua, MIB, TCA e Geo. Verifica-se que a significncia do efeito da variao da concentrao do prprio composto na rea cromatogrfica baixa (p=0,49), o que dever estar associado grande variabilidade dos dados obtidos para este composto. O 1-Oct com p=0,10 o composto cuja variao da concentrao tem um efeito mais significativo sobre a rea cromatogrfica do 3-MB.
3.4.2.2. Modelo de regresso proposto para o 1-octeno-3-ol (B) A equao do modelo linear proposto para o 1-Oct-3 a seguinte:
Y B = 860855+13567CA+ 132026CB + 16242CC +78912CD -8955CE -25408CF- 8382CG

(p=0,75) (p=0,28) (p=0,04) (p=0,08) (p=0,04) (p=0,06) (p=0,07) (p=0,07)
De acordo com o modelo linear proposto, verifica-se que a variao da concentrao de todos os compostos (A a G) influencia a rea cromatogrfica do 1-Oct-3. De forma positiva tem-se a contribuio do prprio 1-Oct-3 e ainda do 3-MB, 1-Oct e Gua. Tm-se contribuies negativas do MIB, TCA e Geo. Verifica-se que a significncia do efeito da variao da concentrao do prprio composto na rea cromatogrfica moderada (p=0,04). O Gua com p=0,04 o composto cuja variao da concentrao tem um efeito igualmente significativo sobre a rea cromatogrfica do 1-Oct-3.
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3.4.2.3. Modelo de regresso proposto para o 1-octanol (C) A equao do modelo linear proposto para o 1-Oct a seguinte:
Y C =21321948-23743CA-148437CB+158284CC+63132CD+1426CE+12648CF+4168CG
(p<0,01) (p=0,16) (p=0,08) (p<0,01) (p=0,21) (p=0,82) (p=0,49) (p=0,50)
De acordo com o modelo linear proposto, verifica-se que a variao da concentrao de todos os compostos (A a G) influencia a rea cromatogrfica do 1-Oct. De forma positiva tem-se a contribuio do prprio 1-Oct e ainda do Gua, do MIB, do TCA e da Geo. Tmse contribuies negativas do 3-MB e do 1-Oct-3. Verifica-se que a significncia do efeito da variao da concentrao do prprio composto na rea cromatogrfica elevada (p<0,01). A variao da concentrao dos outros compostos tem um efeito pouco significativo sobre a rea cromatogrfica do 1-Oct.
3.4.2.4. Modelo de regresso proposto para o guaiacol (D) A equao do modelo linear proposto para o Gua a seguinte:
Y D = 1998030 + 42CA - 2941CB -8946CC +66784CD + 55CE + 532CF+ 266CG

(p<0,01) (p=0,98) (p=0,74) (p<0,01) (p<0,01) (p=0,94) (p=0,79) (p =0,68)
De acordo com o modelo linear proposto, verifica-se que a variao da concentrao de todos os compostos (A a G) influencia a rea cromatogrfica do Gua. De forma positiva tem-se a contribuio do prprio Gua e ainda do 3-MB, do MIB, do TCA e da Geo. Tmse contribuies negativas do 1-Oct-3 e do 1-Oct. Verifica-se que a significncia do efeito da variao da concentrao do prprio composto na rea cromatogrfica elevada (p<0,01). A variao da concentrao do 1-Oct (p<0,01) tem igualmente um efeito significativo sobre a rea cromatogrfica do Gua.
3.4.2.5. Modelo de regresso proposto para o 2-metilisoborneol (E) A equao do modelo linear proposto para o MIB a seguinte:
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Y E = 636732 + 40CA - 1193CB - 2070CC + 58CD +1547CE - 406CF - 64CG

(p <0,01) (p =0,87) (p =0,34) (p <0,01) (p =0,94) (p <0,01) (p =0,14) (p =0,48)
De acordo com o modelo linear proposto, verifica-se que a variao da concentrao de todos os compostos (A a G) influencia a rea cromatogrfica do MIB. De forma positiva tem-se a contribuio do prprio MIB e ainda do 3-MB. Tm-se contribuies negativas do 1-Oct-3, do 1-Oct, do TCA e da Geo. Verifica-se que a significncia do efeito da variao da concentrao do prprio composto na rea cromatogrfica elevada (p<0,01). A variao da concentrao do 1-Oct (p<0,01) tem igualmente um efeito significativo sobre a rea cromatogrfica do MIB.
3.4.2.6. Modelo de regresso proposto para o 2,4,6-tricloroanisole (F) A equao do modelo linear proposto para o TCA a seguinte:
Y F = 77607 - 21CA 80 CB 554 CC 62 CD -16 CE + 1406 CF 16 CG

(p <0,01) (p =0,73) (p =0,79) (p <0,01) (p =0,72) (p =0,47) (p <0,01) (p =0,45)
De acordo com o modelo linear proposto, verifica-se que a variao da concentrao de todos os compostos (A a G) influencia a rea cromatogrfica do TCA. De forma positiva tem-se unicamente a contribuio do prprio TCA. Tm-se contribuies negativas dos restantes compostos em estudo. Verifica-se que a significncia do efeito da variao da concentrao do prprio composto na rea cromatogrfica elevada (p<0,01). A variao da concentrao do 1-Oct (p<0,01) tem igualmente um efeito significativo sobre a rea cromatogrfica do TCA.
3.4.2.7. Modelo de regresso proposto para a geosmina (G) A equao do modelo linear proposto para a Geo a seguinte:
G=
385091 - 201CA - 1092CB - 710CC - 512CD - 37CE - 167CF + 660CG (p <0,01) (p =0,30) (p =0,25) (p <0,01) (p =0,36) (p =0,61) (p =0,43) (p <0,01)
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De acordo com o modelo linear proposto, verifica-se que a variao da concentrao de todos os compostos (A a G) influencia a rea cromatogrfica da Geo. De forma positiva tem-se unicamente a contribuio da prpria Geo. Tm-se contribuies negativas dos restantes compostos em estudo. Verifica-se que a significncia do efeito da variao da concentrao do prprio composto na rea cromatogrfica elevada (p<0,01). A variao da concentrao do 1-Oct (p<0,01) tem igualmente um efeito significativo sobre a rea cromatogrfica da Geo.
3.4.2.8. Resumo Este estudo particular, efectuado em solues-modelo, e uma vez que no existem na literatura dados sobre a variabilidade dos mesmos nos produtos naturais, ou seja no vinho e na cortia, representa unicamente um modelo para as gamas de concentrao e tipos de compostos estudados, a sua aplicabilidade a amostras reais deve ser acompanhada da verificao da gama de concentrao relativa dos compostos estudados. Globalmente, verifica-se que o 3-MB apresenta elevada variabilidade, o que limita a observao dos efeitos dos outros compostos. No entanto o 1-Oct tem um efeito positivo sobre a rea cromatogrfica do 3-MB. O 1-Oct tem um efeito negativo sobre o Gua, o MIB, o TCA e a Geo. Este pode estar relacionado com a alterao das condies do espao de cabea e posterior soro pela fibra, evidenciado pelo maior Log(FRR) do 1Oct. O 1-Oct-3 influenciado de forma positiva pelo 1-Oct e Gua. Assim, e de acordo com os dados obtidos e os modelos propostos, verifica-se que as reas cromatogrficas do Gua, MIB, TCA e Geo so afectadas de forma negativa pela concentrao de 1-Oct na matriz. A quantificao destes compostos assim, dependente da quantidade de 1-Oct presente. A anlise do efeito da variao da concentrao dos compostos constituintes da matriz sobre a rea individual de cada um dos compostos atravs de anlise de regresso permite analisar a influncia simultnea de todas as variveis independentes (concentrao dos compostos presentes na matriz) sendo por isso mais sensvel anlise de vrios interferentes em simultneo.
91
Os resultados obtidos por esta metodologia esto de acordo com os resultados obtidos atravs da anlise do efeito da variao individual da concentrao de cada um dos compostos sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz (3.4.1.).
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3.5. Pesquisa dos compostos padro nos simulantes de vinho rolhados com cortia N, B e MA
Procedeu-se pesquisa dos sete compostos em estudo em simulantes de vinho rolhados com os trs tipos de cortia. Os compostos em estudo foram pesquisados em modo SIM, atravs dos ies mais abundantes (Tabela 14), verificando se estariam eventualmente presentes no tempo de reteno previsto, confirmando a deteco com anlise do espectro de massa do composto suspeito em relao ao obtido para o composto padro. A quantificao foi efectuada a partir das curvas de calibrao previamente preparadas (Tabela 20). No foi identificada a presena de 3-MB, 1-Oct-3, 1-Oct, MIB nem Geo. O TCA foi assim o nico composto identificado, sendo a sua concentrao estimada de 0,6, 0,4 e 2,4 ng/L para a cortia N, B e MA, respectivamente, com uma proporo relativa de N:B:MA de 1:0,7:4 (Tabela 31).
Tabela 31. Concentrao dos compostos padro estudados em simulantes de vinho rolhados com cortia normal (N), bolor (B) e mancha amarela (MA) (n= 60). Concentraes (ng/L) N 3-MB 1-Oct-3 1-Oct Gua MIB TCA Geo
* Nd: No detectado ** Coeficiente de variao (%)
Composto
B Nd Nd Nd Nd Nd 0,4 (152,6) Nd
MA Nd Nd Nd Nd Nd 2,4 (87,4) Nd
Nd* Nd Nd Nd Nd 0,6 (193,9)** Nd
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Existem 2 estudos publicados relativamente anlise de compostos volteis e TCA em cortia e TCA que migra para o vinho, dos tipos de cortia N, B e MA. De acordo com estudos de Rocha et al.20 na anlise de extractos de cortia por SDE com n-pentano, encontrou 3-MB, 1-Oct e Gua nos 3 tipos de cortia, MIB e TCA em cortia B e MA, 1-Oct-3 unicamente em cortia MA e ausncia de Geo. A proporo de TCA nos diferentes tipos de cortia 4:1 (
De acordo com estudos de Juanola et al.36, tanto nas cortias, analisadas por extraco com n-pentano, como no vinho rolhado com os 3 tipos de cortias, analisado por HSSPME, a maior quantidade de TCA ocorre na cortia B, seguindo-se na MA e por fim na N. Analisando a sua proporo relativa nos diferentes tipos de cortia, N:B:MA, verifica-se uma relao de 1:38:3 para o TCA presente nas rolhas e 1:15:3 para o TCA que migra para o vinho (Tabela 32).
Tabela 32. Concentrao do 2,4,6-tricloroanisole em cortia normal (N), bolor (B) e mancha amarela (MA), que migrou para vinho branco36. Concentrao (ng/L) N Rolhas* (g/kg) Vinho** (ng/L) 0,7 2,5 B 26,4 38,5 MA 1,9 6,4
Matriz
* Anlise das rolhas individualmente por extraco com n-pentano ** Anlise do vinho por HS-SPME com PDMS.
Em termos absolutos, e uma vez que as metodologias de extraco da cortia destes autores so diferentes (maior quantidade de amostras e solvente), os resultados no podem ser directamente comparados. Relativamente proporo de TCA obtida nos 3 tipos de cortia, enquanto que para as cortias N e MA se podem considerar os resultados similares, para a cortia B verificam-se tendncias diferentes. A explicao para este desfasamento, e uma vez que a causa principal para o aparecimento do TCA
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est associada ao facto de se tratar de um metabolito secundrio de microrganismos, pode ser devida forma de preparao das amostras deste tipo de cortia (B). De facto, a microflora da cortia muito varivel, ocorrendo fenmenos de competio e sinergismo, que levam ao desenvolvimento de determinadas espcies em detrimento de outras. Assim, e uma vez que no houve controlo nem estudos sobre o tipo de microflora presente em cada um dos casos, consoante as espcies de microrganismos presentes ocorrer a formao de diferentes metabolitos secundrios. Este motivo, associado diferena de metodologias de extraco de Rocha et al., pode ser a causa para o facto de no terem sido encontrados outros compostos alm do TCA, pois so todos indicados como metaboltos secundrios de microrganismos. O coeficiente de variao (Tabela 31) menor para a cortia MA (87,4%) seguindo-se a cortia B (152,6%) e finalmente a cortia N (193,9%). Esta variabilidade, encontrada em anteriores estudos de quantificao de TCA25,36, est relacionada com o facto de o clculo do desvio padro entrar em considerao com os resultados considerados nulos, aumentando assim a variabilidade em relao ao valor mdio das 20 rplicas. Se analisarmos os dados em relao ao nmero de rplicas com deteco de TCA (Tabela 33), verificamos que em 25% dos simulantes rolhados com cortia N detectada a presena de TCA, sendo o valor mdio encontrado para as 5 rplicas de 2,3 ng/L, com um coeficiente de variao de 29,0%, em 35% das rplicas de simulantes rolhados com cortia B foi detectado TCA, com um correspondente valor mdio de 1,2 ng/L e coeficiente de variao de 29,2% e finalmente, para os simulantes rolhados com cortia MA, foi encontrado TCA em 65% das rplicas, com um valor mdio de 3,9 ng/L e um coeficiente de variao de 27,5%. Verifica-se assim que se considerarmos unicamente as rplicas com deteco do composto, a variabilidade da sua concentrao muito menor que o valor calculado para a globalidade das rplicas, sendo equivalente para todos os tipos de cortia. A proporo relativa nas amostras com deteco de TCA, N:B:MA equivalente (1:0,5:2) ao valor mdio obtido para a mdia das 20 rplicas. Relativamente ao impacto da presena do TCA nos simulantes de vinho, pode-se comparar, para os diferentes tipos de cortia, o nmero de rplicas susceptveis de ser classificadas com defeito organolptico, ou seja, com valores de TCA acima do seu LPS (4 ng/L). Para os simulantes rolhados com cortia N e B nenhuma das rplicas apresenta valores acima do LPS pelo que nenhum dos simulantes seria susceptvel de apresentar defeitos de aroma associados aos descritores de aroma dos sete compostos estudados.
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No caso dos simulantes rolhados com cortia MA, verifica-se que 35% apresentam resultados acima do LPS, indicando que 35% destes simulantes so susceptveis de apresentar defeito de aroma.
Tabela 33. Concentrao de 2,4,6-tricloroanisole nos simulantes de vinho rolhados com cortia normal (N), bolor (B) e mancha amarela (MA) (n= 60). Tipo de cortia normal (N) bolor (B) mancha amarela (MA) Concentrao (ng/L) Mdia 0,6* 0,4* 2,4* Mnimo 0,0 0,0 0,0 Mximo 3,2 1,5 5,4 N de rplicas com deteco TCA 5 7 13 N de rplicas acima do LPS 0 0 7
* Mdia das rplicas em que foi detectado o TCA. LPS: Limite de percepo sensorial (4 ng/L).
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Parte IV Concluses
Os estudos efectuados permitiram concluir que a eficincia de extraco da tcnica de HS-SPME e a reprodutibilidade dos resultados obtidos so bastante influenciados pelas condies experimentais utilizadas, e dependem das caractersticas fsico-qumicas dos compostos, como a solubilidade em gua, volatilidade, presso de vapor e coeficiente de partio fase lquida vs fase gasosa, bem como da composio da matriz. O aumento da temperatura de extraco pode causar efeitos ao nvel da quantidade extrada por HS-SPME, da variabilidade das determinaes e da sensibilidade e linearidade da metodologia. Assim, para o grupo de compostos estudados, o aumento de temperatura (de 30 para 50C), conduz a um aumento de 48% da quantidade extrada para compostos mais volteis, tal como observado para o 3-MIB, mas, para compostos com elevado coeficiente de partio fase lquida/fase gasosa como o TCA, ocorre uma diminuio de 32% da quantidade extrada com o aumento da temperatura. Verifica-se tambm um aumento significativo do coeficiente de variao dos resultados analticos, e uma diminuio da linearidade da resposta com o aumento da temperatura Concluiu-se assim que das condies experimentais testadas, a temperatura de extraco de 30C a que permite as melhores condies de reprodutibilidade e linearidade. O estudo da linearidade global de resposta da fibra permitiu verificar que as reas cromatogrficas totais variam de forma linear (R2=0,9788) com a concentrao total da matriz. Devido ao facto dos padres utilizados estarem presentes em gamas de concentrao muito distintas e sendo o 3-MB o composto presente em concentrao mais elevada, de realar que estas reas cromatogrficas totais esto dependentes principalmente deste composto. Estes resultados demonstram que, para concentraes totais entre 41,5 e 275,2 mg/L, no se verifica saturao da fase estacionria. O estudo das condies de reprodutibilidade e linearidade da metodologia HS-SPME desenvolvida para cada um dos compostos, usando solues padro preparadas em simulantes de vinho seguindo os limites de percepo sensorial (LPS) dos compostos permitiu obter coeficientes de variao entre 3,2 e 8,8%, e respostas lineares com coeficientes de correlao (R2) entre 0,9516 e 0,9886. O agrupamento dos compostos de acordo com os respectivos valores de Log(FRR) levou constituio de quatro grupos de compostos. No primeiro grupo, com Log(FRR)=1,
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encontra-se o 3-MB, com menor massa molecular, volatilidade e solubilidade em gua elevadas. No grupo 2, com Log(FRR) entre 2 e 3, encontram-se os compostos com menor volatilidade que o 3-MB, o que faz com que possam necessitar um tempo mais longo para que ocorra a sua transferncia para a fase gasosa. Estes compostos apresentam baixa solubilidade em gua, e os valores de LogP(oct/ag)4 indicam alguma solubilidade em solventes orgnicos; Assim, o valor de log(FRR) determinado para este grupo pode ser explicado pela presena do etanol como co-solvente, conjugado com a sua baixa volatilidade. No grupo 3 encontra-se o Gua, com Log(FRR)=4, um composto mais voltil e mais solvel que os compostos do grupo anterior. Neste caso, do equilbrio entre o efeito da volatilidade vs solubilidade, parece ser a volatilidade o efeito preponderante, o que se traduz por um valor relativamente elevado de Log(FRR). No grupo 4, com Log(FRR)>4, encontram-se o 1-Oct-3 e o 1-Oct, compostos com maior afinidade para a fase gasosa, evidenciada por terem valores de solubilidade em gua relativamente baixa. A avaliao dos efeitos de interferncia da concentrao de cada composto sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz indica que se verifica um efeito significativo da variao da concentrao do 1-Oct sobre as reas cromatogrficas dos restantes compostos da matriz, com excepo do 1-Oct-3. Este efeito ocorre de forma positiva para o 3-MB e negativa para o Gua, MIB, TCA e Geo. O 1-Oct apresenta o maior valor de Log(FRR) (4,9), e causa interferncia em todos os compostos com valores de Log(FRR) menores mas no naquele que tem um valor de Log(FRR) prximo do seu, no caso o 1-Oct-3 (Log(FRR)= 4,3). Uma vez que o 1-Oct faz parte da composio qumica, quer dos vinhos quer da cortia, em quantidades que variam entre 3 e 250 g/L estes resultados podem explicar a existncia de discrepncias entre a anlise sensorial de determinado composto e a sua quantificao por HS-SPME, seja por ser detectado sensorialmente e no haver um resultado analtico que explique o aroma, quer por no ser detectado sensorialmente e o resultado encontrado por HS-SPME ser superior ao seu LPS. De acordo com o coeficiente de variao, podem-se dividir os compostos cuja quantificao sofre interferncias pela variao de concentrao do 1-Oct em 3 grupos: Grupo A, constitudo pelo MIB, TCA e Geo, com coeficientes de variao de 53,7, 67,1 e 62,2%, respectivamente; Grupo B, constitudo pelo Gua, com coeficiente de variao de 39,5% e o Grupo C, constitudo pelo 3-MB, com coeficiente de variao de 13,8%.
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Verifica-se que o comportamento dos compostos face variao da concentrao de 1Oct seguiu a mesma tendncia de agrupamento que a observada no estudo dos valores de Log(FRR), verificando-se que, com excepo para o 3-MB, a variabilidade associada interferncia de um composto por HS-SPME est relacionada com a afinidade para a fase estacionria, sendo inversamente proporcional ao seu valor de Log(FRR). Finalmente, a pesquisa dos compostos padro em simulantes de vinho rolhados com cortia normal (N), e com bolores (B) e mancha amarela (MA), no permitiu detectar a presena de 3-MB, 1-Oct-3, 1-Oct, MIB nem Geo. O TCA foi o nico composto identificado com concentraes 0,6, 0,4 e 2,4 ng/L para a cortia N, B e MA, respectivamente, com uma proporo relativa de N:B:MA de 1:0,7:4. Verifica-se que todos os valores determinados das cortias N e B se encontravam abaixo do LPS do TCA (4 ng/L). Estes resultados indicam que nenhum dos simulantes rolhados com cortia N e B seria susceptvel de apresentar defeitos de aroma associados aos descritores de aroma dos sete compostos estudados. Os valores encontrados para a cortia MA indicam que, com esta cortia, 35% dos simulantes de vinho apresentavam valores de TCA superiores ao seu LPS. Assim, 35 % dos simulantes rolhados com cortia MA so susceptveis de apresentar defeitos de aroma.
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Parte V Bibliografia
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110
Anexo
Tabela A1. Efeitos de interferncia da variao da concentrao do 3-metil-1-butanol sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz.
ng/L MIB 30,0 TCA 7,4 Geo 31,4 ng/L ng/L rea
mg/L Gua 19,4
g/L
g/L
Concentrao g/L
3-MB 47,7
1-Oct-3 26,7
1-Oct 78,0
71,6
95,4
143,0
191,0
3-MB 5437211 4817639 5582425 4902546 5225485 6576491 7851107 7025463 6985328 6772563 9021475 8542978 9925459 10255687 10542365 14370994 12565825 11532542 12865423 12645873 19683402 19021543 15856859 18312545 17429482
1-Oct-3 6920248 6854521 6254523 5986545 6523214 6125452 7125450 7653259 7653215 6785421 6605236 6975444 7586542 6896585 7642137 7397414 7154875 7145212 6542397 7032148 6634950 7024651 6754284 7214532 6768152
1-Oct 24587544 28515660 27865874 23658789 25212546 22251258 23833460 29154584 27658754 26457852 24585992 25232561 26458785 25568547 27545252 23611430 26494424 26254221 29854565 24512354 25867905 27587854 25545657 25565214 22852566
Gua 2531245 2412547 2500271 2432521 2565878 2365889 2545877 2612452 2551233 2568999 2486423 2515878 2503250 2515878 2568321 2547889 2496585 2510353 2543254 2512455 2584125 2615242 2586429 2543928 2513654
MIB 681023 621302 642532 695218 712546 642145 635623 676452 642545 675452 675212 641251 661253 714212 675986 685452 612545 602125 675452 712452 685456 642548 652125 698545 635489
TCA 95212 92458 94521 85458 99745 94585 96125 91252 86457 94245 80325 94575 97412 95458 89658 90120 97545 96458 91245 99654 89563 87455 97542 91254 96325
Geo 351256 347412 295717 321401 349786 341027 341021 301475 325474 340420 320125 375410 314575 297845 312457 354475 347512 297854 304121 312978 300142 370150 354751 264779 351010
Anexo Pg. 2
Tabela A2. Efeitos de interferncia da variao da concentrao do 1-octeno-3-ol sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz
Concentrao Gua 19,4
mg/L
g/L
g/L
g/L
3-MB 95,4
1-Oct-3 10,7
1-Oct 78,0
21,4
26,7
32,0
42,7
3-MB 14836583 17147671 14536585 16542854 16856985 17014559 17254512 16589747 17865432 18659878 18542121 15328852 16585451 16564524 15245788 16458146 15278663 19452545 16525452 18659543 15254555 14523689 19658542 16436521 15245686
1-Oct-3 2125254 2352125 2012563 2345212 2156989 3021466 3344709 3602354 3325655 3754521 3985452 4682540 3956254 3856458 4096565 5012021 4931254 5256857 5387758 5454521 6002135 5986541 6235212 6685453 6585457
1-Oct 24499415 28565459 25232553 22421240 23241211 22770437 25025547 23125452 26022513 22521247 24523522 20503859 19956542 22565854 24014749 24924594 20840205 24754521 20024587 22623211 21456852 20125413 19521217 20010256 18523654
Gua 2458235 2589683 2358634 2965845 2865422 2468523 2589864 2374545 2858564 2865473 2254586 2648753 2569856 2485651 2765899 2548756 2664555 2687852 2445850 2348756 2278788 2865455 2389589 2386511 2947757
MIB 675487 703256 645879 678795 689658 702454 658523 675485 695452 813254 732125 642512 609645 607845 652545 625878 701258 682125 674585 645485 608656 626554 685455 656523 675455
TCA 93124 91256 90358 87543 97654 88411 86432 92542 90212 84575 88746 91020 87514 88633 91540 82169 87124 91202 90312 97482 81241 91245 90120 86457 94577
Geo 375854 394571 345200 341210 375878 345217 367544 342011 334214 321400 342154 355417 310257 385401 387411 341210 310214 387452 354125 355212 364120 310214 300145 341021 310210
Anexo Pg. 3
Tabela A3. Efeitos de interferncia da variao da concentrao do 1-octanol sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz
Concentrao Gua 19,4
mg/L
g/L
g/L
g/L
3-MB 95,4
1-Oct-3 26,7
1-Oct 20,8
41,6
78,0
156,0
208,0
3-MB 57820124 58171480 52365255 53256521 51212431 56947708 54565996 53124212 52325401 56854580 36325045 42354455 42545212 40124525 40045299 43675469 44682921 45325452 44587853 36231239 45254542 36587544 43524512 45235457 45107269
1-Oct-3 8356718 9412490 8212421 8565450 9212455 8753514 8598340 8521255 8921244 9111413 9142174 9254658 9542154 8255457 8456320 8964645 8256656 8798525 8542132 8854525 8595875 8412351 8425457 8121100 8902926
1-Oct 26025170 27839488 28012545 24536587 25355459 29865682 27902547 31025454 32545717 31021548 32125211 36796016 35265450 32854571 35854222 45878568 41903672 41021255 44125401 47212101 56125768 50542124 51642121 53102825 57894108
Gua 4850132 4578035 3658586 4585451 4256850 3999506 3800044 3652354 4032545 4214521 2545875 2492788 2256852 2687858 2985657 1953403 2064672 2085652 2325219 2125545 1969052 2395847 2014545 2254585 2129574
MIB 845212 910254 898543 842123 862541 745785 785458 812547 875452 832564 698541 687542 645875 642350 648502 542145 577544 536547 521253 527458 412542 430121 425485 408542 412452
TCA 185452 177547 188785 199658 178854 157858 162547 155899 176545 165858 110254 102548 94585 98545 97421 82154 74521 74225 71254 75854 58785 45874 51202 47548 50254
Geo 587842 512474 569856 544525 520213 521022 504215 502140 510366 515889 492125 465007 415508 420150 415021 412514 397551 388577 371584 354785 297458 310249 300588 345212 345875
Anexo Pg. 4
Tabela A4. Efeitos de interferncia da variao da concentrao do guaiacol sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz
Concentrao Gua 5,7
mg/L
g/L
g/L
g/L
3-MB 95,4
1-Oct-3 26,7
1-Oct 78,0
12,9
19,4
38,7
51,6
3-MB 15986551 18143164 15212412 18545212 17432566 18640792 17489722 16585477 16896566 17212565 16238445 17052738 17545211 16421215 16523250 17324734 15914472 18212415 17542123 17023258 17961930 17542152 18131359 18562354 19077084
1-Oct-3 8466424 8719977 8451211 8721236 8965239 9212546 8953365 9102124 8685412 9012547 9232125 8563254 8956255 8645798 9012124 8917276 9667036 9212545 9021210 9125412 8692805 8312542 8552125 8210236 8523654
1-Oct 30631904 30539380 30210211 29865688 30532549 31127032 35385780 31865878 30569895 34652125 31350068 32896525 30885822 32547856 30545202 30431896 32594180 30986588 32548785 33585256 31954706 34856544 32125454 31625487 33997092
Gua 440754 440797 420121 402125 412542 1265459 1154524 1251251 1242355 1145872 1942126 1802124 1985657 1863654 2052121 3602125 3307090 3523250 3253256 3502547 4402121 4225452 4212410 4625211 3986587
MIB 686598 654521 625686 678565 645854 678545 612545 689545 675222 598745 587542 668545 686325 645875 685458 684574 740215 645212 676589 586452 596865 612545 675855 702127 642135
TCA 95642 94250 90312 94216 90754 98652 87454 89715 90541 89654 91854 89542 87256 90214 97542 95821 93254 98745 94212 93251 94575 91254 89352 90254 97545
Geo 352141 325474 302547 332157 397445 314587 342158 345877 397451 347545 310214 325488 341784 374589 341257 374125 354587 310244 355597 312402 357477 340124 330338 341254 310240
Anexo Pg. 5
Tabela A5. Efeitos de interferncia da variao da concentrao do 2-metilisoborneol sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da
matriz
Concentrao Gua 19,4
mg/L
g/L
g/L
g/L
3-MB 95,4
1-Oct-3 26,7
1-Oct 78,0
20,0
30,0
60,0
80,0
3-MB 15246982 16425987 19452365 18654787 16985658 18564287 18854523 19745875 15487638 16458754 17858562 14523698 16879502 17546328 19865235 18876392 16478955 16487522 18976532 17236545 19876425 18755564 18475460 15542566 16854785
1-Oct-3 854512 765821 745854 801254 712545 812021 953254 658458 686585 701250 792545 751254 756545 748458 821254 701252 754586 754585 851021 785452 701253 754211 821254 865799 701231
1-Oct 30215215 35321412 34758452 32547870 30215548 35212545 30215472 32454558 38454215 32545845 32548775 30548751 32978545 31254587 32545875 29954545 31025456 35685459 31245899 30124747 29854587 32698754 33125487 32568548 30214520
Gua 2458785 2658785 3002154 2689542 2765875 2985458 2458741 2685402 2874456 2458744 2713544 2754745 2454513 2685498 2879653 2647898 2598963 2457854 2699656 2789856 2974585 2468520 2647802 2497856 2730547
MIB 314112 301254 338545 314585 355214 404582 397417 412549 447542 410254 548541 525452 554788 591259 574258 785421 821245 892533 851254 875277 932541 978744 971235 997124 910241
TCA 99458 91245 94574 91246 87458 94212 97856 92785 84573 89754 94257 92758 90457 92120 93125 90412 91254 93301 93421 89633 87542 93754 89645 87548 98254
Geo 350212 305421 340127 321022 321449 325410 314571 345201 356459 310442 371026 310245 344713 369810 310211 312404 351020 341258 347542 365481 310214 387822 310254 301277 370128
Anexo Pg. 6
Tabela A6. Efeitos de interferncia da variao da concentrao do 2,4,6-tricloroanisole sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da
matriz
Concentrao Gua 19,4
mg/L
g/L
g/L
g/L
3-MB 95,4
1-Oct-3 26,7
1-Oct 78,0
5,0
7,4
14,8
19,8
3-MB 19856547 17054879 18564751 16745785 19421251 18487536 17458758 18564220 19745721 15654582 16485954 17548502 19485233 19452530 17565855 19685232 18659555 16458785 16522325 19566323 18754585 19856547 19487546 15758565 17685489
1-Oct-3 785458 856452 901254 785458 710214 785452 795688 754215 802896 841341 856428 865997 768996 857560 784623 784215 898564 885642 845252 756520 785458 768542 854220 798642 774501
1-Oct 32012152 30054587 30124556 36548795 32125456 36588787 34212548 31254795 30215478 35689712 34785898 31254782 30212545 35648754 31024554 34587854 30212545 31254587 34212156 30021254 30021254 35212478 31021254 30212458 35421202
Gua 2754844 2315475 2548755 2468573 2685457 2145452 2658785 2978545 2685855 2758548 2457854 2685458 2798754 2854785 2647550 2775469 2465851 2548962 2451210 2878564 2498575 2878541 2645200 2741542 2458546
MIB 687545 568545 642548 782569 645854 698565 645232 712452 764521 701225 685454 665412 878545 658545 587854 569856 645214 698545 632545 598784 593217 673125 648976 587854 612548
TCA 45236 47521 49702 44549 44013 67012 61187 69120 66474 60803 92147 93478 99712 90125 89125 158744 164215 175482 161032 170351 221452 214709 237475 209786 228014
Geo 354584 310244 314721 384110 341251 301257 347845 396417 330244 310214 397222 341017 310557 305878 301414 341252 302147 339885 397451 358745 351240 314541 354112 317457 324106
Anexo Pg. 7
Tabela A7. Efeitos de interferncia da variao da concentrao da geosmina sobre as reas cromatogrficas dos restantes constituintes da matriz
Concentrao
mg/L
g/L
g/L
g/L
3-MB 95,4
1-Oct-3 26,7
1-Oct 78,0
Gua 19,4
21,0
31,4
63,0
84,0
3-MB 16989555 20578565 16458545 19856585 19248512 19856452 18754585 17585869 19856854 20006522 18658477 19094525 18988754 17785465 17482328 19856580 17843021 16484351 19874521 17458544 18310025 18745212 19567482 18754231 19502334
1-Oct-3 754854 764582 897564 910421 854521 864521 785462 854523 985450 789656 856202 981202 754230 747401 902125 871250 764425 940121 747500 875127 852077 754542 910254 856455 795433
1-Oct 31254542 30212548 35487546 30125457 34212578 29754235 31025487 35452174 31254525 32254125 30012548 35212477 33458423 34587210 31021452 30025487 31754856 30254774 33021457 35448745 29985475 31212452 31254547 34212542 33587854
Gua 2645745 2458785 2965899 2785012 2689545 2475865 2702358 2685459 2747589 2478545 2689548 2687854 2665845 2614528 2858796 2568845 2678944 2654877 2648530 2898775 2658780 2489565 2978551 2698540 2698587
MIB 586452 598575 654525 648754 598783 648288 646647 586732 607542 675987 602158 635986 698699 676686 598986 602355 587852 658940 587854 645213 668545 612002 598551 597854 646642
TCA 94521 86457 91024 87223 97120 99471 85426 91029 87454 84021 85747 94201 90124 88002 87403 96489 80247 89719 91204 90120 94574 99870 90314 87453 84011
Geo 285472 278543 298756 301452 321458 354741 321458 361202 337412 321018 371455 341008 352019 360148 396541 478717 461023 502021 468559 477077 558212 523203 521200 550226 521207
Anexo Pg. 8
Tabela A8. Dados estatsticos para o modelo de regresso proposto para o 3-metil-1-butanol Coeficientes 17291984,2 30132,9 4841,1 52903,2 -46407,0 -6809,9 -17500,4 -4926,8 Erro-padro 9518029,6 43882,1 217895,9 31565,5 128971,3 16637,3 47808,3 15845,1 Stat t 1,82 0,69 0,02 1,68 -0,36 -0,41 -0,37 -0,31 valor P 0,07 0,49 0,98 0,10 0,72 0,68 0,72 0,76
Interceptar 3-MB 1-Oct-3 1-Oct Gua MIB TCA Geo
Tabela A9. Dados estatsticos para o modelo de regresso proposto para o 1-octeno-3-ol Coeficientes 860855,0 13567,3 132025,6 16242,1 78911,9 -8956,5 -25408,1 -8382,1 Erro-padro 2747252,0 12666,0 62892,8 9111,0 37225,9 4802,1 13799,2 4573,5 Stat t 0,31 1,07 2,10 1,78 2,12 -1,87 -1,84 -1,83 valor P 0,75 0,29 0,04 0,08 0,04 0,06 0,07 0,07
Interceptar 3-MB 1-Oct-3 1-Oct Gua MIB TCA Geo
Tabela A10. Dados estatsticos para o modelo de regresso proposto para o guaiacol Coeficientes Erro-padro Stat t valor P Interceptar 1998029,7 390985,3 5,11 8,72E-07 3-MB 42,5 1802,6 0,02 0,98 1-Oct-3 -2940,7 8950,8 -0,33 0,74 1-Oct -8946,3 1296,7 -6,90 1,03E-10 Gua 66783,9 5297,9 12,61 4,98E-26 MIB 55,2 683,4 0,08 0,94 TCA 531,6 1963,9 0,27 0,79 Geo 265,8 650,9 0,41 0,68
Tabela A11. Dados estatsticos para o modelo de regresso proposto para 2-metilisoborneol Coeficientes Erro-padro Stat t valor P Interceptar 636731,7 54724,2 11,64 2,70E-23 3-MB 40,0 252,3 0,16 0,87 1-Oct-3 -1193,1 1252,8 -0,95 0,34 1-Oct -2070,2 181,5 -11,41 1,18E-22 Gua 57,5 741,5 0,08 0,94 MIB 1546,6 95,7 16,17 5,38E-36 TCA -405,6 274,9 -1,48 0,14 Geo -64,0 91,1 -0,70 0,48
Anexo Pg. 9
Tabela A12 Dados estatsticos para o modelo de regresso proposto para o 1-octanol Coeficientes Erro-padro Stat t valor P Interceptar 21321948,0 3671143,0 5,81 3,12E-08 3-MB -23743,2 16925,5 -1,40 0,16 1-Oct-3 -148437,3 84043,4 -1,77 0,08 1-Oct 158284,0 12174,9 13,00 3,82E-27 Gua 63132,4 49744,8 1,27 0,21 MIB 1425,8 6417,1 0,22 0,82 TCA 12647,6 18439,9 0,69 0,49 Geo 4168,1 6111,5 0,68 0,50
Tabela A13. Dados estatsticos para o modelo de regresso proposto para o 2,4,6tricloroanisole Coeficientes Erro-padro Stat t valor P Interceptar 77606,5 12830,8 6,05 9,30E-09 3-MB -20,7 59,2 -0,35 0,73 1-Oct-3 -80,1 293,7 -0,27 0,79 1-Oct -553,6 42,6 -13,01 3,61E-27 Gua -61,8 173,9 -0,36 0,72 MIB -16,4 22,4 -0,73 0,47 TCA 1406,0 64,5 21,82 9,36E-51 Geo -16,0 21,4 -0,75 0,45
Tabela A14 Dados estatsticos para o modelo de regresso proposto para a geosmina Coeficientes Erro-padro Stat t valor P Interceptar 385090,9 41613,7 9,25 1,02E-16 3-MB -201,3 191,9 -1,05 0,30 1-Oct-3 -1092,1 952,7 -1,15 0,25 1-Oct -709,7 138,0 -5,14 7,51545E-07 Gua -511,9 563,9 -0,91 0,365254777 MIB -37,3 72,7 -0,51 0,609003217 TCA -166,7 209,0 -0,80 0,42633109 Geo 659,9 69,3 9,52 1,88234E-17
Anexo Pg. 10

Compostos Voláteis Associados A Defeitos de Cortiça de Quercus Suber L

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Universidade de Aveiro Departamento de Qumica 2005

Paula Maria da Costa Vieira Neto

Universidade de Aveiro Departamento de Qumica 2005

Paula Maria da Costa Vieira Neto

Prof. Dr. Armando da Costa Duarte

Prof. Dr. Armando Jorge Domingues Silvestre

Prof. Dra. Slvia Maria Rocha Simes Carrio

Compostos volteis associados a defeitos de cortia de Quercus suber L.

1.2. Micro-extraco em fase slida

2.2. Optimizao da metodologia de HS-SPME

Compostos volteis associados a defeitos de cortia de Quercus suber L.

Parte III. Resultados e Discusso 3.1. Optimizao da metodologia HS-SPME

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Figura 1. Distribuio actual da rea de plantao do sobreiro9.

Pas Portugal Espanha Arglia Marrocos Frana Tunsia Itlia Total

Fonte: APCOR dados de 2002.

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A: ampliao de 500 vezes

B: ampliao de 5000 vezes.

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Compostos carbonlicos alifticos

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Alcanos, alcenos e alcinos

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Compostos clorados e sulfurados

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Guaiacol DA: fumado, madeira LPS: 20 g/L

2,4,6-Tricloroanisole DA: mofo LPS: 4 ng/L

2,4,6-Tribromoanisole DA: mofo LPS: 4 ng/L

1-Octeno-3-ona DA: cogumelos LPS:

1-Octeno-3-ol DA: cogumelos LPS: 20 g/L

2-Metilisoborneol DA: terra, mofo, bolor LPS: 30 ng/L

Geosmina DA: terra, mofo LPS: 25 ng/L

2-Isopropil-3-metoxipirazina DA: terra, vegetal, batata LPS: 2 ng/L

2-Isobutil-3-metoxipirazina DA: vegetal, pimenta verde LPS: 2 ng/L

2,5-dimetil-3-metoxipirazina DA: bolor, mofo LPS: 2 ng/L

Compostos volteis associados a defeitos de cortia de Quercus suber L.

1.2. Micro-extraco em fase slida

Compostos volteis associados a defeitos de cortia de Quercus suber L.

fase 1 fase 3 fase 2

em que C0 a concentrao inicial de analito na amostra, C1 , C2 , C3

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