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Espectrofotometria

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(Cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer y análisis de mezclas) ______________________________________________________________________________________ ____

Práctica de espectrofotometría UV-Visible

FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA
Como es sabido, las técnicas espectroscópicas se basan en la interacción de la radiación electromagnética con la materia. A través de esta interacción las moléculas pueden pasar de un estado energético, m, a otro estado energético distinto, l, absorbiendo una cantidad de energía radiante igual a la diferencia energética existente entre los dos niveles: que:

E l − Em . Para conseguir esto, las moléculas absorben un fotón de una radiación tal ∆E = hν = κ

hc

∆E

El Em

h = Constante de Planck= 6.63.10-34 J.s

ν = Frecuencia de la radiación= κ

c

c = velocidad de la luz=3.1010 cm.s -1 λ = longitud de onda Estos tránsitos energéticos son los que dan origen a los espectros que, en definitiva, no son mas que el registro de las distintas µ(o κ ) a las que se producen estos tránsitos energéticos. Debido a la existencia de diferentes tipos de energía: de los electrones en si, de los movimientos vibracionales de las moléculas, de la rotación de las mismas...etc, las moléculas pueden interaccionar con radiaciones electromagnéticas de un rango muy amplio de longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de espectroscopías según las diferentes regiones. Un esquema podría ser el siguiente:

λ / nm

10 10 10 10 10 10 10 Rayos γ Rayos x UV VIS INFRARROJO MICROONDAS ONDAS RADIO
Transitos electrones internos nucleares
400

1

2

3

4

5

6

9

electrones externos
500 600

Vibraciones
700

Rotaciones

RMN

violeta añil azul verde amarillo naranja rojo

La espectroscopía UV-Visible (espectros electrónicos), se debe a la transición de los electrones mas externos de los átomos de las moléculas, desde niveles fundamentales a niveles mas altos de energía.

Si se opera. también se denomina “coeficiente de extinción molar” si. Existen. especialmente a concentraciones elevadas. que es un valor constante para cada sustancia a cada longitud de onda λ y en unas condiciones experimentales determinadas. obteniendo la curva de calibrado que relaciona las absorbancias con las concentraciones. distintos factores que afectan al cumplimiento de la ley de Lambert-Beer.Espectrofotometría página 2 LEY DE LAMBERT-BEER Si se hace incidir radiación monocromática sobre una muestra con una concentración “C” de una sustancia que absorbe a esa longitud de onda “λ”. lo que constituye el fundamento del análisis espectrofotométrico cuantitativo. por la expresión : I = I 0 ∃10 − ε l c aplicando logaritmos: reordenando términos: logI = log I 0 − ε l c logI 0 − log I = ε l c I log I0 = ε l c pudiéndose escribir : I I0 se denomina “transmitancia” de la muestra y se suele Habitualmente. está relacionada con la intensidad incidente I 0 y con el espesor de la muestra. c. por tanto. se define la “absorbancia” de la muestra como: A = log(1/T). la intensidad de la radiación que la atraviesa.l . Por otra parte. Por ello antes de proceder al análisis de una muestra es preciso comprobar experimentalmente el rango de concentraciones en que dicha ley se cumple. queda finalmente la siguiente expresión que se conoce con el nombre de la ley de Lambert-Beer: A=εlc donde ε es la “absortividad molar” (una medida de la radiación absorbida). la concentración se expresa en moles por litro. I. l . medible directamente. la absorbancia A. sin embargo. Segun estas definiciones. es proporcional a la concentración molar de la muestra. Tanto la absorbancia como la transmitancia son magnitudes que se obtienen directamente en el espectrofotómetro. como es frecuente. el cociente I expresar como porcentaje de luz transmitida: I0 ∃100 . . a una longitud de onda dada y con una cubeta de un determinado espesor.

b) Ambos espectros presentan solapamiento en una zona determinada de longitudes de onda. A y A . ε 2 . Así. se cumplirá que: A = A 1 + A 2 = ε 1 l c1 + ε 2 l c2 Supongamos. ε 2 . Con estos datos se pueden determinar las concentraciones de los dos componentes de la mezcla a partir de las medidas de la absorbancia de la misma a las longitudes de onda de trabajo seleccionadas. λ1 y λ2. a sendos análisis por separado. entonces. con disoluciones de las sustancias puras. 1 y 2. y obtener. El problema se reduce. cada uno en la zona del espectro en donde cada componente de la mezcla se presenta como único absorbente. de tal forma que la absorbancia total de una mezcla es la suma de cada uno de los componentes. En este caso se han de seleccionar dos longitudes de onda diferentes. entonces. siempre que sus respectivos espectros de absorción sean lo suficientemente distintos. para una mezcla de dos componentes. El procedimiento se basa en que la absorbancia es una propiedad aditiva. las respectivas κ1 κ2 κ1 κ2 absortividades molares a cada longitud de onda: ε 1 . con lo que nos podremos encontrarnos en una de las dos situaciones siguientes: a) Ambos espectros no presentan solapamiento en el margen de longitudes de onda de trabajo. ε 1 . que absorben radiación de una misma longitud de onda. que nuestro problema es el análisis de una mezcla de dos sustancias.Espectrofotometría página 3 La ley de Lambert-Beer puede también aplicarse al análisis cuantitativo de mezclas de dos o más sustancias. El cálculo se realiza resolviendo el siguiente sistema de 2 ecuaciones con 2 incógnitas: κ1 κ2 A A κ 1 κ 2 = ε = ε κ 1 1 κ 2 l c l c 1 1 + ε + ε κ 1 2 2 l c l c 2 2 κ 2 1 CARACTERÍSTICAS DE UN ESPECTROFOTÓMETRO UV-VISIBLE . En primer lugar se habrá de registrar el espectro de absorción de cada una de ellas por separado.

Las cubetas empleadas en el espectrofotómetro (1.Ajuste del 100% de transmitancia (0 de absorbancia) con la referencia. 3..Leer el valor de Absorbancia/Transmitancia de la muestra. La radiación no absorbida se detecta y mide convenientemente. 5.Ajuste del cero de transmitancias (tapa levantada) con ayuda del mando “Ajuste del cero”.00 cm de espesor) deben estar escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras esmeriladas u opacas. APLICACIONES DE LA TÉCNICA Una de las aplicaciones prácticas de mayor interés de la espectrofotometría de absorción UV-Visible es la del análisis cuantitativo. Lámpara de Deuterio (zona del UV. No es conveniente secarlas o limpiarlas con papel ordinario por el carácter abrasivo de éste sino con un papel suave.. atendiendo al rango de longitud de onda de trabajo (sólo en los espectrofotómetros no automáticos).. hasta que aparezca CERO en la pantalla. utilizando para ello el mando “A-T”. 1. La absorbancia de la muestra se compara con la de una “referencia” que consta estrictamente de disolvente.). 340 a 200 nm aprox.Seleccionar el valor de longitud de onda con el mando correspondiente. 6.2. que normalmente es el disolvente de la muestra. basada en la aplicación de la ecuación de Lambert-Beer OBJETIVO DE LA PRÁCTICA .. que en esencia consta de un monocromador (prisma o red de difracción) que controla la longitud de onda de la radiación que se hace incidir sobre la muestra. Las instrucciones generales de manejo de un espectrofotómetro serían: 1. necesita un calentamiento previo.1. 4..Encendido de lámparas : 1.Adaptación del espejo a la lámpara adecuada. 2. encendido instantáneo. 900 a 340 nm). Lámpara de tungsteno (zona del Visible.Espectrofotometría página 4 Lámpara a Lente Rendija de entrada Fototubo a l l Rendija de salida t Objetivo (m n ul ti ) a (mono ) Prisma P Filtro Cubeta La medida de la absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotómetro..

10-5 M Disolución de Azul de Bromotimol en medio básico (A-) de concentración 5. Matraces aforados de 10 mL Vasos de precipitados de 100 mL Pipetas graduadas de 10 mL y de 5 mL. { y y y y Nota: El pKa del azul de bromotimol es 7.10-5 M en medio ácido (HCl). { Disolución B: En un matraz de 10 mL pipetear 6 mL de disolución de partida enrasar con diluyente ácido. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL a) Preparación de disoluciones de la forma ácida del Azul de Bromotimol: Tomando como base una disolución de partida.00. al encontrarse en medio ácido no hay duda de que el indicador se encuentra totalmente bajo su forma ácida: HA λ A− + H + (pKa=7. facilitada por el profesor. { Disolución C: En un matraz de 10 mL pipetear 4 mL de disolución de partida enrasar con diluyente ácido. de Azul de Bromotimol 5. Las propiedades espectrofotométricas del Azul de Bromotimol en ambas formas son diferentes. . Disolución diluyente básica: NaOH 10-2 M. Disolución de Azul de Bromotimol en medio ácido (HA) de concentración 5. 4 Frascos de almacenamiento. { Disolución D: En un matraz de 10 mL pipetear 2 mL de disolución de partida enrasar con diluyente ácido.Espectrofotometría página 5 Se trata de analizar la composición de una disolución que contiene una mezcla del indicador Azul de Bromotimol en su forma molecular HA (ácida) y disociada A (básica).30.10-5 M en medio básico (NaOH 10-2M). prepárense por dilución las siguientes disoluciones: Disolución A: En un matraz de 10 mL pipetear 8 mL de disolución de partida enrasar con diluyente ácido (HCl). de Azul de Bromotimol 5. las cuales presentan absorción en la región VISIBLE del espectro.30) b) Preparación de disoluciones de la forma básica del Azul de Bromotimol: Tomando ahora como base una disolución de partida. Para ello habrá que registrar los espectros de absorción de las dos formas (ácida y básica) y obtener las correspondientes rectas de calibrado a dos longitudes de onda seleccionadas. prepárense por dilución las mismas disoluciones que en el apartado anterior pero ahora enrasando con diluyente básico (NaOH). lo que permite su cuantificación en disoluciones en las que aparecen mezcladas.10-5 M Disolución diluyente ácida: HCl 10-2M. facilitada por el profesor.00. MATERIALES Y REACTIVOS ‰ ‰ ‰ ‰ ‰ ‰ ‰ ‰ ‰ Espectrofotómetro UV-Visible y 6 cubetas de plástico.

ajustando previamente el cero de absorbancia a cada longitud de onda con la referencia adecuada. Es importante tener en cuenta que.000 Forma básica Forma ácida 0. Con los datos de Absorbancia se elaboran las dos tablas correspondientes. A continuación. Finalmente.Espectrofotometría página 6 Nota: Como el pKa del indicador es 7. iremos midiendo el valor de la absorbancia de la muestra a distintas longitudes de onda entre 400 y 680 nm. una para la forma ácida y otra para la forma básica. Elegidos estos valores de longitud de onda como los mas idóneos. se representan los datos en papel milimetrado. se apreciará un máximo para la forma básica en torno a 620 nm y un máximo para la forma ácida alrededor de 440 nm. de manera que figure la absorbancia “A” en ordenadas frente a longitud de onda “λ” en abcisas: A 1.30 no hay duda de que éste se encuentra totalmente bajo su forma básica en NaOH 10-2 M . llenaremos una cubeta con la referencia adecuada y otra con la muestra a medir. c) Obtención de los espectros de la forma ácida y básica del indicador: Para ello vamos a utilizar las disoluciones “A” respectivas preparadas anteriormente. haciendo las medidas a intervalos de 10 nm. hay que ajustar de nuevo el cero de absorbancia con la referencia. que serán del tipo: Disolución C / mol L-1 Absorbancia a 440 Absorbancia a 620 A B C D . cada vez que se modifique el valor de la longitud de onda. se mide la absorbancia de cada una de las disoluciones preparadas en el apartado a) (disoluciones de la A a la D). En cada caso.000 400 500 600 700 Longitud de onda / nm d) Obtención de las rectas de calibrado para las formas ácida y básica del Azul de Bromotimol: A la vista de los espectros de absorción de la forma ácida y básica del indicador.

0 1 2 3 4 c /10 M Las rectas que se obtienen son del tipo y = ax.00 cm se obtiene el valor de ε en M-1cm -1.8 A 0. Por tanto habremos determinado las cuatro absortividades molares que estabamos buscando: ε 440 HA .6 0. ε 440 .. de forma que al compararlas con la ley de Lambert-Beer se deduce que: -5 pendiente = ε ∆y ∆x = y2 −y 1 x2 −x 1 = ε l de donde: = pendiente l Como la longitud de la cubeta es de 1. [A − ] [A− ] .Espectrofotometría página 7 A continuación se representan en papel milimetrado los datos de las dos tablas anteriores (absorbancia frente a concentración) y se obtienen las 4 rectas de calibrado que confirman el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer: 0. f) Comprobación del pKa del azul de bromotimol Con los datos obtenidos en el apartado anterior y recordando la ecuación de Henderson-Hasselbalch se puede calcular el valor del pKa del indicador: pH = pKa + log [HA] υ pKa = pH − log [HA] por tanto sabiendo las concentraciones de HA y A. ε 620 .4 0. Para ello se medirá la absorbancia de la muestra a 440 y 620 nm y a partir de las ecuaciones correspondientes se obtendrán las concentraciones de HA y A.que hay en la muestra. ε 620 HA A− A− e) Análisis de una muestra desconocida de azul de bromotimol A partir de una muestra facilitada por el profesor se trata de determinar las concentraciones de HA y A.2 0.y midiendo el pH de la muestra se puede calcular el pKa.

1980. 1978.A. . podría discutir la validez de nuestras suposiciones y calcular los errores relativos cometidos por el experimentador. Círculo editor Universo. "Manual de técnicas instrumentales".30. Bibliografía CONNOR.. K.. J.Espectrofotometría página 8 Si la suposición de que la absorbancia era aditiva es correcta. Ed. Sabiendo que el valor tabulado es de 7. el pKa así obtenido ha de cerrar con el pKa determinado potenciométricamente para este indicador. Reverté. "Curso de análisis farmacéutico". MIÑONES.

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