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cultivo de meristemos[1]

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Producción de Tubérculos-Semillas de Papa Manual de Capacitación

Fascículo4.2

Cultivo de Tejidos para la Eliminación de Patógenos con fines de Producción de Semilla de Papa
Ana Panta, Ali Golmirzaie

Introducción
Los patógenos vegetales, tales como nematodos, hongos, bacterias, micoplasmas, virus y viroides pueden ser transmitidos de plantas enfermas y plantas sanas de papa. Sin embargo, no todas as células resultan infectadas; los tejidos meristemáticos se encuentran algunas veces libres de patógenos por lo que es posible recobrar plantas no infectadas mediante técnicas de cultivo de meristemas in vitro, y lograr su crecimiento coma plantas sanas. La termoterapia, tratamiento de las plantas y temperaturas altas, también se aplica en la erradicación de virus. Desde hace muchos años se utiliza con éxito en la erradicación de virus de claveles, geranios, fresas y cítricos; para ella, las plantas son tratadas y temperaturas altas bajo condiciones de invernadero o cámara de crecimiento. Actualmente el método estándar para erradicar virus en muchos cultivos propagados vegetativamente es la termoterapia combinada con el cultivo de meristemas.

S. • Fasc. 4.2 - 97 • 1

CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP)

especialmente la humedad y la temperatura que juegan un papel importante en el desarrollo de una enfermedad.Este documento describe los métodos que pueden aplicarse para eliminar los patógenos del material infectado y producir plantas “libres de patógenos. Los virus que se ubican tan solo en el floema (PLRV) no pueden invadir los tejidos meristemáticos debido y la ausencia de diferenciación celular. el virus del enrollamiento de la hoja de la papa (PLRV) y los micoplasmas están restringidos al tejida vascular de una planta. solamente la cúpula y los primeros primordios foliares se encuentran libres de virus. libres de ellos. Erwinia carotovora y el virus X de la papa (PVX). Naturaleza de los Patógenos Los patógenos que afectan y la papa pueden ser transmitidos de plantas enfermas y plantas sanas por vectores y través de la semilla. Se desconoce la razón exacta de este problema. El tamaño relativo de estos patógenos varia mucho. los virus no pueden tornar el control de la maquinaria biosintética del mismo. Este es un proceso lento por lo quo resulta relativamente difícil que los virus infecten en su totalidad y las células que vienen dividiéndose rápidamente. En esta zona meristemática. La distribución de los diferentes patógenos dentro de y planta enferma varia también mucha. invaden tanto el tejido vascular coma el resto de los tejidos de la planta. Los virus y viroides son los más pequeños y se requiere de la ayuda de un microscopio electrónico para su observación. se cree que uno ó más de los siguientes factores podrían ser responsables de ello: Alta actividad metabólica: Los virus se multiplican acompañando el curso del metabolismo del huésped. Por ejemplo. para la distribución internacional y propagación en programas de producción de semillas de papa. La enfermedad. sino también de las condiciones ambientales. sin embargo. La ocurrencia de una enfermedad no sólo depende de la presencia del huésped. los virus que infectan los tejidos no vasculares se diseminan de célula y célula y través de los conductos intercelulares (plasmodesmos). No todas las células en una planta enferma llegan y ser infectadas con patógenos. Entre los patógenos vegetales los nematodos son los más grandes y pueden ser observados fácilmente con un microscopio estereoscópico. • Fasc. por tanto. el patógeno y el ambiente. 4. Alta concentración de auxinas: Los tejidos meristemáticos de las plantas tienen una concentración S. puede definirse coma el producto de y interacción del huésped. Carencia de tejido vascular: Los virus se diseminan rápidamente y través del sistema vascular. En algunas ocasiones.2 . Los tejidas meristemáticos de la raíz y brotes terminales de una planta infectada están. algunas veces. tal como sucede en la papa con el PVX y el TRV (Tobacco Rattle Virus). Pseudomonas solanacearum.97 • 2 CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) . Debido y la gran actividad metabólica en las células meristemáticas del huésped.

La termoterapia antes descrita se puede aplicar y plántulas in vitro. al igual que y aplicada y tubérculos ya brotados. Posiblemente no es solo una. 1970:Pennazio y Redolfi. la unión entre estas subunidades se vuelve más débil. coma de las yemas apicales. los meristemas apicales se aislan y siembran en un medio de cultivo apropiado. • Fasc. Quak. Se ha observado una reducción en la concentración de virus.2 . tan solo utilizando termoterapia. Al cabo de un mes. 1991). et al. 1973). La termoterapia ha sido aplicada y tubérculos de papa en reposo. En el procedimiento estándar empleado en el CIP.97 • 3 CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) . portador de su información genética. sino una combinación de ellas la responsable de y reducción en la concentración de virus. ha sido exitosamente utilizada para la eliminación de muchos virus de y papa (StaceSmith y Mellor. Otra es y del ácido nucleico del virus. Algunos autores indican que estas auxinas inhiben y multiplicación de los virus. tanto de las yemas axilares. 1957. seguida por cultivo de meristemas. especialmente del virus del enrollamiento de la hoja (PLRV). 4.. Las cajas se incuban baja las condiciones antes reportadas (Espinoza. es posible recobrar plantas no infectadas mediante técnicas de cultivo de meristemas in vitro. los mejores resultados se han obtenido cuando la planta es decapitada antes de ser tratada por termoterapia. Las cajas son selladas con cinta adhesiva cuando las plantas alcanzan aproximadamente 3 cm de altura y presentan un buen sistema radicular. habiéndose logrado eliminación total de este virus. Se han dado diferentes explicaciones para este fenómeno. y mantenerlos hasta S. 1977]. y las yemas axilares se encuentran creciendo mientras reciben el tratamiento de calor Un régimen de temperatura diana de 3600 por 16 horas. Entre estas explicaciones está la de la competencia entre las células del huésped que se encuentran en proceso de rápida división y las partículas del virus por lugares de síntesis de ácidos nucleicos y proteínas lo cual puede llevar y un cambio en el balance entre la síntesis y degradación de las partículas del virus. son aisladas y cultivadas coma se muestra más adelante. La termoterapia aplicada y la planta entera. se pueden abrir aberturas temporales. y 30 C por 8 horas. este está protegido del ataque de enzimas degradantes por una cubierta compuesta de muchas subunidades de proteína. baja luz continua de alta intensidad (10000 lux = 108 mEm-2s-1) mejoró las tasas de eliminación de virus. lo que inactive al virus y disminuye la concentración del mismo. Meristemas. Termoterapia Experimentos llevados y cabo con huéspedes y sus virus han demostrado que el tratamiento de plantas con temperaturas elevadas (termoterapia) lleva y una reducción en la concentración del virus en la planta (Kassanis. y permitir el ataque de las nucleasas. Nudos (20 nudos/caja) con una yema se colocan en cajas de plástico (Magenta GA-7) que contienen medio semisólido de propagación (Espinoza. et al. A altas temperaturas. Las plantas son mantenidas baja estas condiciones por cuatro semanas. 1991). sometiéndolas luego al tratamiento de termoterapia antes mencionado.más alta de auxinas que los tejidos de otras partes de las mismas. Cultivo de Meristemas Debido y quo los tejidos meristemáticos algunas veces se encuentran libros de patógenos.

Esterilización de superficie. la solución esterilizadora resultante debe contener no menos de 05% de NaOCl. el material tratado debe ser lavada cuidadosamente con varios cambios de agua destilada. Etanol de 70% es más efectiva cama agente esterilizador que el de 95-100%. Cuando el material vegetal proviene de in vitro no es necesaria la esterilización de superficie. contaminada con patógenos y saprofitas dada que algunas de as contaminantes crecen rápidamente y pueden matar al tejido y órgano (explante) de la planta sembrada en un medio de cultivo. Bicloruro de mercurio. Tiene una baja tensión superficial por la cual puede penetrar fácilmente entre las pilosidades foliares y mojar la superficie de la planta. Por lo tanto: no recomendamos su uso como agente esterilizador! Bactericidas y fungicidas. ésta es eliminada y el material vegetal lavado por agitación en agua destilada estéril 3 d 4 veces durante 5 minutas cada vez . Para material altamente contaminado.obtener plantas adultas sanas. El cultivo de meristemas incluye un proceso de esterilización de superficie. queda esterilizada después de una exposición de 10-15 minutes. Estas productas comerciales contienen normalmente 5. Hipoclorito de sodio o de calcio.25% de NaOCl coma producta active. Debido y la disociación completa. La sal de calcio es preferida porque es menos fitotóxica. Luego del tratamiento con hipoclorito. Alcohol (etanol). 4. pueden ser eliminados del material vegetal utilizando un agente esterilizador apropiada. Es un agente esterilizador común de la superficie para eliminar bacterias y hongos. para eliminar completamente el desinfectante. • Fasc. Cuando se es diluye con agua (1 parte de lejía 9 partes de agua).0 y es más efectiva fijando la solución y alrededor de pH 6.0.97 • 4 CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) . La superficie del material vegetal también puede ser esterilizada con soluciones acuosas de hipoclorito de sodio (NaOCl) y de hipoclorito de calcio (CaOCl). Baja condiciones asépticas.2 . La solución de bicloruro de mercurio es volátil y temperatura ambiente y puede provocar un envenenamiento por mercurio. El bicloruro de mercurio (HgCl2) ha sido utilizado coma desinfectante pese y que es extremadamente toxica. el hipoclorito tiene una actividad relativamente baja y un pH superior y 8. y frecuentemente es utilizada para un lavado breve (30’) antes de aplicar otros tratamientos de esterilización de superficie. Muchas laboratorios utilizan lejía (hipoclorito de sodio) de uso doméstico tal como el Clorox. La superficie del tejido recientemente disecado y sumergido completamente en la solución de hipoclorito (de Ca ó Na). y su cultivo en un medio baja condiciones adecuadas. se recomiendan el lavado en una mezcla S. la solución esterilizadora normalmente se aplica por 10-15 minutas. la escisión y aislamiento del meristema. El lavada es muy importante para eliminar el exceso del agente esterilizador el cual puede inhibir el crecimiento de la planta. La mayoría de las contaminantes de la superficie del tejida. Es necesaria esterilizar y superficie del material vegetal en case esté. 1.

pueden llegar a la zona meristemática del ápice sólo moviéndose lentamente de célula en célula. • Fasc. sin embargo. La nutrición de los tejidos de la sección disecada es proporcionada por el medio artificial. S. El meristema es el punto activo de crecimiento del ápice de la planta. permite el desarrollo de plántulas.97 • 5 CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) . que este tratamiento no tiene efecto sobre infecciones sistémicas. El aislamiento del punto meristemático en condiciones asépticas y su cultivo en un medio nutritivo aséptico. Debido a que los tejidos vasculares más diferenciados se encuentran alejados de los meristemas (hacia los tejidos más viejos del tallo). Aislamiento y cultivo de meristemas. Las células del meristema se dividen y continua la diferenciación de tejidos nuevos. y no han hecho aún contacto con la parte principal del sistema vascular en el tallo. Debe recordarse.2 .comercial bactericida / fungicida antes de proceder a la esterilización de su superficie. las partículas de virus que puedan estar presentes en el sistema vascular. 4. La disección aséptica del meristema es un proceso delicado y requiere muchas horas de práctica. en una planta infectada la concentración de los virus disminuye desde la base hacia los meristemas tanto del ápice como de las yemas axilares. Esta es una de las razones principales del porqué. Por lo tanto. El desarrollo del meristema en condiciones in vitro se lleva acabo en forma similar al que se realiza en una planta normal. Es una zona pequeña compuesta de células (meristemáticas) dividiéndose rápidamente. los elementos vasculares de los primordios foliares son incipientes. El domo de la yema apical contiene las verdaderas células meristemáticas V está rodeada por primordios foliares y hojas primarias. 2.

• Fasc. Después de 6-8 semanas de cultivo se obtienen plántulas. El medio de cultivo utilizado para este trabajo esta basado en las sales de Murashige y Skoog (1962) y S.97 • 6 CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) . 4. El meristema disecado se transfiere semanalmente a medio fresco. 4. Escisión de meristemas: Bajo un microscopio binocular de disección. se eliminan las hojuelas que rodean el punto de crecimiento hasta que solamente quede la cúpula de la yema apical y unos cuantos primordios foliares (generalmente dos).3. las cuales deben ser micro propagadas para su indexación. Cultivo del meristemas: La cúpula y dos primordios foliares se disecan y transfieren a! medio de cultivo de meristemas.2 .

Estos compuestos son caros y no existe ninguno que será efectivo para controlar todos los organismos contaminantes. W.suplementado con 2 mg/L de glicina. Dodds. 5. Roca.. M.4 mg/L de tiamina. Cultivo de tejidos: Micro propagación. 1991]. Centro Internacional de la Papa. 1991. Vancomicina HCI + Mycostatin and Streptoinicina + Carbenicilina. y Mroginski.M. Perú. Bactericina y Sparsomicina (Lizárraga et al. los antibióticos solo son empleados cuando los microorganismos no pueden ser eliminados par otros métodos.5 mg/L.. Rifampicina. Siguenas. 1991. Espinoza.5 mg/L de piridoxina. Para bacterias se utiliza Rifampicina (Rimactan 300-) a una concentración de 60 mg/L.. 0. 1993). prueba serológica de ELISA y prueba de plantas indicadoras (International Potato Center. L. p. 0. S. Cuando la infección es con levaduras se añade al medio de cultivo 0. Pruebas de indexación: Las plantas desarrolladas a partir de meristemas. N..1 mg/L de ácido giberélico.A. Cefatoxine (Mefoxin) también puede ser utilizado a la concentración de 200 mg/L. F. Estreptomicina. son probadas para detectar cualquier infección persistente de virus. Griffiths. Usa de Antibióticos En cultivo de tejidos vegetales. R. 0.. de Amphotericin B. feds.2 . Lima.5 % de sacarosa. 12100.97 • 7 CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) . xii. durante 15 minutos. En el CIP las pruebas que se realizan son: NASH para la detección de PSTVd. 970. Existen reportes de toxicidad causada en algunos cultivos par: Penicilina. C. A. Antes de decidir utilizar antibióticos se recomienda eliminar todas las posibles fuentes de contaminación (Reed and Tanprasert. La búsqueda de partículas virales mediante el microscopio electrónico se realiza en forma opcional. Effect of chemical and heat therapy on virus S. Cultivo de tejidos en la Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. 0 Cefatoxime sódica (Claforan) 200 mg/L. Todas estas pruebas se pueden realizar en un periodo de 2 meses. 1990. Guía de investigación CIP 1.. Para ella los productos antibióticos son añadidos al medio de cultivo a las concentraciones que se indican a continuación.04 mg/L de kinetina y 2. Bibliografía CIAT (Centro International de Agricultura Tropical). Nystatina + Carbenicilina. Dodds. conservación y exportación de germoplasma de papa.5 mg/L de ácido nicotínico 0. • Fasc. En el dR las infecciones con bacterias y levaduras pueden ser eliminadas satisfactoriamente.H. 1995). Gentamicina + Amphotericina B. H.) Cali. J. 4. Colombia. Las siguientes combinaciones de antibióticos se han aplicado con éxito en cultivo de tejidos de plantas: Cefotaxime. H. Lizarraga.25 a 0. Gentainicina. Buitrón. Slack and . 0.6%) y se esteriliza en autoclave a 15 lb de presión. 19 p. El medio es gelificado con agar (0.I.

H. 68: 1515-1521. Jayashinge. Berlin Heidelberg New York..). In: Plant Cell. 118-119. R. Basic techniques in plant virology. pp. F. F. W. Kassanis. L. 1980.F.. 1962.. Tissue culture for elimination of pathogens. Murashige. Research for the potato in the year 2000. B. Reinert and Y. Lizarraga. Roca. A. Dodds.E.E..M. Phytopathology 70: 754-755. R. Jayashinge. 1957. Annals of Applied Biology 45: 422-427. Salazar. International Potato Center (CIP). fed. W. L.F. Physiologia Plantarum 15: 473-497. 199 pp. Lime. 1952.J. G. Tissue. and R. Bot. R. Bajaj. T. feds. Skoog.2 . (Technical Training Unit 1). edited by J.. 1977. y J. The use of tissue culture to produce virus free clones from infected potato varieties. Panta. Virus -free potatoes by tissue culture. Stace-Smith. U. L. 1962. Effect of meristem size on eradication of potato spindle tuber viroid.. Martin.C. • Fasc. International Potato Center. S. and Organ Culture. Elimination of potato spindle tuber viroid by low temperature and meristem culture. Lizárraga. L. Perú. 1991.PS. A revised medium for rapid growth and bioessays with tobacco tissue cultures. Can. 235: 1324-1325. In Hooker. International Potato Center (CIP). Comptes rendus hebdomaire des seances de IAcademie des Sciences. Paris.97 • 8 CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA (CIP) . Schilde-Rentscheler. Morel. Salazar.). J. Salazar..concentrations in vitro potato plantlets. Peru. Mellor. Lima. 4.. pp. 1993. Lizárraga. F. U. C. CIP Lima. C. 6 16635.H. DIP Research Guide 3. Guerison de dahlias atteints d’une maladie virus. Springer-Verlag.

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