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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

REA INTERDISCIPLINARIA DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO DE INGENIERA EN PESQUERAS

T E S I S INCLUSIN DE ENSILADO DE PESCADO COMO FUENTE DE PROTENA Y DE PROBITICO EN LA DIETA DEL CAMARN BLANCO (Litopenaeus vannamei)

Que para obtener el ttulo de INGENIERO EN PESQUERAS Presenta Andrs Garca Rodrguez Director de tesis Ph.D. Maurilia Rojas Contreras

La Paz, Baja California Sur, Mxico

Abril, 2010

DEDICATORIA

$PLIDPLOLD

AGRADECIMIENTOS

A Dios por permitirme lograr este objetivo en mi vida y espero me permita hacer realidad otros ms.

A la Universidad Autnoma de Baja California Sur (en especial al Laboratorio de Ciencia y Tecnologa de Alimentos del rea Interdisciplinaria de Ciencias Agropecuarias) y al Laboratorio de Nutricin Acucola del CIBNOR, por darme las facilidades para desarrollar mi tesis.

A la Dra. Maurilia Rojas por creer en m para la realizacin de este trabajo, as como por todo su apoyo recibido y su amistad que me ha brindado incondicionalmente.

Al Dr. Marco Antonio Cadena Roa, al Dr. Ricardo Vzquez Jurez, al Dr. Ernesto Goytorta y al Dr. Roberto Civera por todo el apoyo y las facilidades otorgadas.

A la empresa Acuacultora Mahr, por su apoyo mediante el donativo de gran parte de organismos que se usaron a lo largo de este trabajo.

A todos mis compaeros de laboratorio.

CONTENIDO

RESUMEN .......................................................................................................................................................... 6 LISTA DE TABLAS ............................................................................................................................................. 8 1. INTRODUCCIN ............................................................................................................................................ 9 2. OBJETIVOS.................................................................................................................................................. 11 3. HIPOTESIS................................................................................................................................................... 11 4. REVISION DE LITERATURA ....................................................................................................................... 12 4.1 Ensilado de pescado ............................................................................................................................... 12 4.2 Ensilado biolgico de pescado en la acuacultura ................................................................................... 16 4.3 Fuentes de protenas para camarn ....................................................................................................... 19 4.4 Sistema digestivo del camarn ............................................................................................................... 27 4.5 Microflora intestinal del camarn ............................................................................................................ 34 4.6 Bacterias cido lcticas........................................................................................................................... 36 4.7 Probiticos en acuacultura del camarn................................................................................................. 40 5. MATERIALES Y MTODOS ........................................................................................................................ 44 5.1 Elaboracin del EBP ............................................................................................................................... 44 5.2 Anlisis del EBP ...................................................................................................................................... 45 5.3 Elaboracin de los alimentos .................................................................................................................. 46 5.4 Anlisis de los alimentos......................................................................................................................... 47 5.5 Evaluacin de los alimentos en juveniles de camarn blanco................................................................ 47 5.6 Anlisis estadstico.................................................................................................................................. 48 6. RESULTADOS.............................................................................................................................................. 49 6.1 Anlisis del EBP ...................................................................................................................................... 49 6.2 Anlisis de los alimentos......................................................................................................................... 53 6.3 Evaluacin de los alimentos en juveniles de camarn blanco................................................................ 56 7. DISCUSIONES ............................................................................................................................................. 58 7.1 Anlisis del EBP ...................................................................................................................................... 58

7.2 Anlisis de los alimentos......................................................................................................................... 61 7.3 Evaluacin de los alimentos en juveniles de camarn blanco................................................................ 64 8. CONCLUSIONES ......................................................................................................................................... 68 9. RECOMENDACIONES................................................................................................................................. 69 10. BIBLIOGRAFA ........................................................................................................................................... 71 11. ANEXOS ..................................................................................................................................................... 80 Anexo 1 ......................................................................................................................................................... 80 Anexo 2 ......................................................................................................................................................... 81

RESUMEN

Los alimentos y los tratamientos para enfermedades son los principales insumos en las empresas dedicadas al cultivo de camarn y constituyen fracciones significativas dentro de los costos de operacin. De los alimentos, la protena es el componente ms importante en una dieta para la acuacultura debido al costo y al requerimiento nutricional de los organismos. En esta investigacin se evalu el efecto de la inclusin de un ensilado biolgico de pescado (EBP) como fuente de protena y de una bacteria probitica en la dieta de juveniles de camarn blanco (Litopenaeus Vannamei; LV). El EBP se elabor con materias primas locales y como cultivo iniciador probitico se utiliz la bacteria cido lctica (BAL) Lactobacillus plantarum TD23 autctona del camarn blanco LV. Dicho EBP se adicion en una dieta en reemplazo de la protena proveniente de la harina de pescado (HP, 21.45%) en 4 niveles de inclusin: 0% control interno, 50% ensilado de pescado (50% EBP), 50 y 100% ensilado de pescado liofilizado (50% EBPL y 100% EBPL) y un control externo (dieta comercial). Se llevo a cabo un bioensayo en juveniles de camarn blanco LV en tanques con 100 litros, con 30 organismos de aproximadamente 0.1 g cada uno, por triplicado, por 30 das, con un diseo completamente aleatorio. Las dietas se ofrecieron a saciedad cada tres horas y recambios de agua diarios al 50%. El EBP obtenido presento una humedad 68.3%, protena 14%, lpidos 2.3%, carbohidratos 14.1% y un crecimiento de BAL de 2X10 UFC/g. La liofilizacin del EBP presento una humedad 4.3%, protena 38.7%, lpidos 7.6%, carbohidratos 45% y BAL de 2X10 UFC/g. En las dietas experimentales el pH bajo alrededor de 6.74 a 4.86 conforme se increment la inclusin del EBP. Las UFC/g de BAL se encontraron en el mismo orden 10 para las dietas 50% EBP y 50% EBPL. Sin embargo en 100% EBPL se obtuvo tan solo 10 UFC/g. La composicin qumico proximal entre los alimentos evaluados no muestran diferencias significativas (p<0.05) en protenas; exceptuando el control externo el cual presento la mayor cantidad de protena; lpidos y energa bruta. La estabilidad del alimento fue inversamente proporcional al nivel de inclusin del EBP; a mayor inclusin mayor prdida de materia seca (PMS) y capacidad de absorcin de agua (CAA), a diferencia de los controles que obtuvieron las menores PMS y los mayores porcentajes en CAA. Los resultados fueron similares entre las inmersiones de una y tres horas. Durante el ensayo in vivo la tasa de sobrevivencia fue del 100%. En la evaluacin biolgica, no se detectaron diferencias significativas (p<0.05) entre peso inicial, peso final y peso ganado de los tratamientos.
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La viabilidad de las BAL en los organismos fue acumulativa pero distinta en cada tratamiento. En los tratamientos 50% EBP y 50% EBPL iniciaron la primera semana con 10 y la cuarta semana con 10 y 10
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respectivamente, en 100% EBPL no se obtuvo crecimiento en las cuantas viables indicando que las UFC de BAL en el alimento no fueron suficientes para permanecer detectarse en los organismos. El EBP es un medio propicio para hacer crecer e incluir probiticos en la dieta de los camarones; convirtindolo as en un alimento funcional por sus funciones adicionales a las de su valor nutritivo. Los resultados anteriores permiten concluir que los alimentos que contenan ensilado de pescado; a pesar de la lixiviacin; presentaron parmetros productivos similares a los obtenidos por los alimentos controles.

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Caractersticas fsicas de los EBP................................................................................................... 49 Tabla 2. Composicin qumico proximal de los principales ingredientes ...................................................... 50 Tabla 3. pH y UFC de BAL en los alimentos ................................................................................................. 53 Tabla 4. Composicin qumico proximal de los alimentos............................................................................. 54 Tabla 5. Estabilidad de los alimentos en el agua .......................................................................................... 55 Tabla 6. Resultados de la evaluacin biolgica ............................................................................................ 56 Tabla 7. Sobrevivencia de las BAL en UFC de los organismos .................................................................... 57 Tabla 8. Sobrevivencia de las BAL en UFC/g del organismo........................................................................ 57 Tabla 9. Composicin porcentual de las dietas ............................................................................................. 81 Tabla 10. Composicin qumico proximal pretendida en los alimentos ........................................................ 82 Tabla 11. Premezclas de minerales para crustceos (MINCRUS0409) ....................................................... 82 Tabla 12. Premezclas de vitaminas para crustceos (VITCRU0604) ........................................................... 83 Tabla 13. Composicin qumica proximal del resto de los ingredientes en la dieta...................................... 84

1. INTRODUCCIN

Los alimentos y los tratamientos de enfermedades son de los principales insumos en las empresas dedicadas al cultivo de camarn, que constituyen fracciones significativas dentro de los costos de operacin. La protena es el componente ms importante en una dieta para acuacultura, debido al costo y el requisito nutricional de los organismos (Garca et al., 1996).

Histricamente la HP es la principal fuente de protenas en la mayora de las dietas acucolas (Cruz, 1996). A pesar de ser una fuente proteica muy completa, su fabricacin es un proceso sumamente costoso (Padilla et al., 1996). El EBP resulta ms econmico y de fcil elaboracin, con cualidades antimicrobianas (contra bacterias patgenas y putrefactivas) conserva en mayor grado la calidad de la protena presente en el producto fresco al no ser sometido el pescado a las altas temperaturas del proceso de produccin de la HP (Berenz, 1994). El EBP es un mtodo de conservacin basado en dos fenmenos; que se complementan; una corresponde a la acidificacin misma que conlleva a la otra la hidrlisis licuefaccin. Los estudios de estabilidad del EBP muestran que es factible almacenar este producto por perodos prolongados de tiempo a temperatura ambiente (mayores a 6 meses sin requerir de refrigeracin) sin que se reduzca su valor nutricional ni la calidad higinica (Kjos, 2001; Bello, 1994).

El EBP se ha estado utilizando a nivel comercial desde hace tiempo en la alimentacin de animales terrestres (mascotas, aves, cerdos, ovejas, rumiantes, etc.) en pases como Dinamarca, Finlandia, Polonia, Argentina, Costa Rica, Trinidad y Tobago, Uruguay, Paraguay, etc. (Parin y Zugarramurdi, 1994). El aprovechamiento del EBP como fuente de protenas en dietas para diferentes organismos acucolas ha dado origen a una gran cantidad de trabajos publicados; como: Padilla et al. (2000), Gonzlez et al. (2007), Nwanna (2003), Lessi (1994), Agudelo et al. (2004), Balsinde et al. (2003), Borghesi et al. (2008), Fagbenro et al. (1997), Fagbenro y Jauncey (1998) y Meire et al. (2002); sin embargo ninguno de estos trabajos utilizo bacterias candidatas a probiticos propios de los organismos a alimentar, elaborar el EBP, incluir en la alimentacin y evaluar su efecto in vivo.

El EBP se caracteriza por la produccin de cido lctico por fermentacin microbiana de carbohidratos. Los microorganismos pueden ser adicionados por inoculacin de cepas seleccionadas de BAL; (Bello, et al, 1992). El mtodo descrito en Ottati et al. (1990) para elaborar EBP se distingue por utilizar mnimos ingredientes a adicionar al pescado y ha sido utilizado y evaluado en diferentes trabajos de investigacin como Ottati y Bello (1990ab), Cordova et al. (1990), Guevara et al. (1991), Martnez et al. (1991), Meire et al. (2002) y Gonzlez y Marn (2005) con resultados satisfactorios. En el camarn se han detectado y reportado BAL que tienen potencial para usarse como probiticos destacndose el Lactobacillus plantarum (TD23) (Garca, 2003 y 2006). Utilizar bacterias candidatas a probiticos de los organismos a alimentar para elaborar EBP le otorga una cualidad extra por sus funciones adicionales a las de su valor nutritivo; convirtindolo en un alimento funcional.

Los probiticos son una alternativa prometedora al uso de antibiticos, reduciendo las posibilidades de colonizacin y desarrollo de potenciales bacterias patgenas; bajo el principio de exclusin competitiva y la estimulacin del sistema inmune (Fuller, 1989; Gatesoupe, 1999). El uso de antibiticos se ha estado restringiendo reduciendo debido a que hacen ms resistentes a los patgenos, su efecto al medio ambiente crean problemas ecolgicos y por las restricciones en las exportaciones por presencia de residuos en los tejidos de camarones y su incidencia en la salud humana (Alday, 1999).

Los objetivos de este trabajo es el de evaluar la inclusin de EBP en dos formas fresco y liofilizado en la dieta del camarn blanco LV in vivo, para esto se evaluaran las respuestas nutricionales de los organismos. De presentar xito alguno de los alimentos con inclusin de EBP, sera una excelente alternativa en la produccin de alimento para camarn, y al alojarse las bacterias con potencial probitico en el tracto digestivo significara en menos espacios a ocupar por potenciales bacterias patgenas para instalarse y multiplicarse, esto repercutira en menos nulo uso de tratamientos contra enfermedades por parte de la empresa acuacultura.

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2. OBJETIVOS

Objetivo general

Evaluar el efecto de la inclusin de ensilado de pescado como fuente de protena y de bacteria probitica en la dieta de juveniles de camarn blanco (Litopenaeus vannamei).

Objetivos especficos

1. Elaborar un ensilado biolgico de pescado inoculado con Lactobacillus plantarum TD23 nativa del tubo digestivo del camarn blanco (Litopenaeus vannamei) y seleccionada por su potencial probitico. 2. Elaborar alimentos con diferentes grados de inclusin del ensilado fresco y liofilizado, cumpliendo con los requerimientos nutricionales del camarn blanco (Litopenaeus vannamei). 3. Realizar el experimento in vivo en juveniles de camarn blanco (Litopenaeus vannamei).

3. HIPOTESIS

1. El ensilado de pescado elaborado con una bacteria probitica mejorar la calidad de la protena de la dieta y aportar un probitico vivo al tubo digestivo de los camarones. 2. Los camarones alimentados con dietas complementadas con el ensilado de pescado elaborado con una bacteria probitica presentarn una mejor respuesta nutricional que el control.

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4. REVISION DE LITERATURA

4.1 Ensilado de pescado

El ensilado de pescado es un mtodo de conservacin basado en dos fenmenos; que se complementan; una corresponde a la acidificacin misma que conlleva a la otra la hidrlisis licuefaccin. La acidificacin depende del cido empleado para este fin el cual puede ser aadido (ensilado qumico) producido in situ por bacterias (ensilado biolgico microbiano; EBP). La hidrlisis de las protenas se alcanza por enzimas proteolticas presentes naturalmente (provenientes del pescado y de las bacterias presentes) en conjunto con aadidas (ensilado enzimtico). Estas enzimas presentan su mayor actividad cuando el pH se reduce a valores prximos de 4; por efecto de la acidificacin. Tambin a ese pH inhibe el crecimiento de organismos putrefactivos y patgenos (Borghesi et al, 2008; Bello, 1994; Parin y Zugarramurdi, 1994; Crdova y Bello, 1990; Ojeda, 1993; Torres, 2007).

El ensilado qumico es elaborado por la adicin de cidos minerales y/ orgnicos al pescado triturado. Los cidos se han empleado solos; como el frmico, sulfrico, clorhdrico, propinico; combinados; como mezclas de actico, frmico y fosfrico, frmico y sulfrico propinico y sulfrico. El ensilado qumico aunque ms sencillo en su elaboracin es costoso por la adquisicin de los cidos, se requiere equipo anticorrosivo y representa un peligro en su manipulacin y almacenamiento. Adems los cidos antes mencionados a excepto del frmico requieren neutralizacin; antes de su empleo en la alimentacin animal; por el excesivo descenso del pH en el producto (Bello, 1994; Parin y Zugarramurdi, 1994; Cordova y Bello, 1986; Ojeda, 1993). Goddard et al. (2001) y Borghesi et al. (2008) elaboraron ensilado qumico con cidos frmico y propinico, con utilizacin de ethoxyquin butylhydroxytoluene para reducir la oxidacin lipdica obteniendo buenos resultados.

El EBP se caracteriza por la produccin de cido lctico por fermentacin microbiana de carbohidratos. Los microorganismos pueden ser los presentes en el pescado (autofermentado), adicionados por un fermento biolgico por cepas seleccionadas de BAL (inoculacin) (Bello, et al, 1992). Se han utilizado bacterias tipo

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homofermentativos de los gneros Lactobacillus, Pediococcus Streptoccoccus (Bello, 1994). La ruta de fermentacin homofermentativa es ms eficiente que la heterolctica ya que garantiza una menor prdida de materia seca y una disminucin rpida de pH.

De entre los Lactobacillus utilizados como cultivo iniciador se destaca el Lactobacillus plantarum; una de las bacterias preferidas por un gran nmero de investigadores en la elaboracin de EBP inoculado; es heterofermentativa facultativa y frecuentemente es aislado de material de plantas, de varios alimentos fermentados y encontradas en el tracto gastrointestinal de humanos y animales (Ottati et al., 1990; Bello, 1994; Bello et al., 1993; Berenz, 1994; Parin y Zugarramurdi, 1994; Borghesi et al., 2007, Cordova et al., 1990; Fagbenro et al., 1997; Fagbenro y Jauncey, 1998; Meire et al., 2002; Nwanna, 2003; Garca, 2006; Torres, 2007).

Cordova et al. (1990) realizo pruebas de obtencin de varios tipos de EBP concluyendo que la especie de pescado afecta la velocidad de produccin del ensilado, siendo mayor en las magras, de igual forma, la adicin de frutas y el mantenimiento del mismo a temperaturas superiores a las del ambiente.

Existen varios mtodos de producir EBP con inoculacin de un fermento biolgico, se destacan los utilizados en FAO (1985), en Lessi (1994), y Lessi et al. (1992). Donde en general al pescado triturado se le aade: harina de trigo como fuente de carbohidratos, como agentes antimictico vinagre y sal, vegetales que aporten mas carbohidratos que contienen enzimas proteolticas; y el fermento biolgico; cultivo iniciador autofermentado; en base a vegetales ricos en BAL y de enzimas proteolticas como el repollo (Brassica oleracea), cambur (Musa sapientum), lechosa (Carica papaya), pia (Ananas comosur), etc.

El uso de un fermento biolgico se puede aplicar al resto de los ensilados biolgicos; donde al producto obtenido de un ensilado posterior funciona tambin como fermento biolgico para producir nuevo ensilado; como cultivo iniciador (Parin y Zugarramurdi, 1994). Lessi (1994) realizo comparaciones entre la harina de trigo y el azcar refinada como fuente de carbohidratos en la elaboracin de ensilados; en reduccin de pH y acidez lctica alcanzada; resultando que las formulaciones con base en azcar cristal presentan mejores

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resultados a los de la harina de trigo. La azcar como sustrato fermentable para las bacterias tiene igual aceptacin que la melaza en plantas industriales de EBP (Parin y Zugarramurdi, 1994).

El EBP producido por autofermentacin fue utilizado por Cordova et al. (1990) y recientemente por Gonzlez y Marn (2005) siendo el ms sencillo en su elaboracin en comparacin con el resto de los ensilados biolgicos. Estos autores aadieron al pescado molido: melaza, cido srbico y con / sin el uso de frutas (pia y papaya; para acelerar la hidrlisis). Todo homogenizado y almacenado. Obtenindose buenos resultados.

El EBP con uso de frutas e inoculado ha sido utilizado por Cordova et al. (1990), Bello et al. (1993), Gonzlez y Marn (2005) y recientemente por Torres (2007); Todos utilizando los mismos ingredientes a adicionar al pescado triturado en cantidades similares, variando nicamente en la cepa utilizada como cultivo iniciador. El uso de frutas es una va para acelerar el proceso de hidrlisis donde Reyes et al. (1991) concluyo en utilizar de la pia madura nicamente el jugo y de la papaya solo la corteza verde; porque son los lugares donde se encuentra mayor concentracin de sus enzimas proteolticas; bromelna y papana respectivamente; as como sus niveles de inclusin optimo.

Este trabajo est basado en el mtodo descrito en Ottati et al. (1990); el cual es un EBP inoculado que se distingue por no utilizar fruta. Este autor efectu pruebas para determinar las proporciones mnimas de los ingredientes; en el cual al pescado triturado se le adiciona 15% de melaza como fuente de carbohidratos, 0.25% de cido srbico como agente antimictico y de 1 a 5% de la cepa Lactobacillus plantarum 8014 utilizada como cultivo iniciador. Todo homogenizado y almacenado a 30 en condiciones anaerbicas. Este C mtodo ha sido utilizado y evaluado en diferentes trabajos de investigacin como Ottati y Bello (1990ab), Cordova et al. (1990), Guevara et al. (1991), Martnez et al. (1991), Meire et al. (2002) y Gonzlez y Marn (2005) con resultados satisfactorios.

Una comparacin entre el EBP y el ensilado qumico mostr que en la obtencin del primero llevo solo la mitad del tiempo, y presenta un sabor y olor ms atractivo (Bello, 1994). Los estudios de estabilidad del EBP muestran que es factible almacenar este producto por perodos prolongados de tiempo a temperatura

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ambiente (mayores a 6 meses sin requerir de refrigeracin) sin que se reduzca su valor nutricional ni la calidad higinica (Kjos, 2001; Bello, 1994).

Muchos trabajos de elaboracin de EBP son similares al mtodo descrito en Ottati et al. (1990) con cambio excepcin de algn ingrediente el incluir algn paso extra. Por ejemplo el no utilizar un agente antimictico; obteniendo aun as buenos resultados (Berenz, 1994; Fagbenro et al., 1997; Fagbenro y Jauncey, 1998; Plascencia et al., 2002; Borghesi et al., 2008; Nwanna, 2003). Aunque varios autores sealan que la incorporacin de cido srbico es fundamental en este tipo de productos, ya que se sabe que la contaminacin del producto fermentado suele ser causada generalmente por levaduras que asimilan el cido lctico. Plascencia et al. (2002) utilizo azcar refinada de caa como fuente de carbohidratos para la cepa utilizada como cultivo iniciador en lugar de melaza, obteniendo buenos resultados. Berenz (1994) cita un trabajo en el cual sometieron al pescado (residuos y desechos) a coccin; para disminuir la carga microbiana presente en la materia prima utilizada; ya que debido al origen del pescado la frescura no es asegurada y esta juega un importante rol en la velocidad de reduccin del pH inicial. Esto se debe a que se establece un mecanismo de competencia entre las BAL y los microorganismos descomponedores.

El ensilado enzimtico de pescado es debido a la presencia natural de enzimas proteolticas endgenas; estas se encuentran en las vsceras y msculo del pescado (este proceso es llamado autolisis) (Ivar, 2005); sin embargo Bello (1994) seala que es recomendable solo en pescados frescos. La complementacin con la adicin de enzimas exgenas hacen al proceso hidrlitico ms rpido, controlable y reproducible (Ivar, 2005). Las enzimas comerciales preferidas por ms investigadores son preparaciones de proteasas de origen bacteriano; pero tambin las hay de origen vegetal y animal. Las enzimas proteolticas son referidas como proteasas, proteinasas peptidasas, donde el ultimo termino con frecuencia es asociada con esas enzimas que actan en pptidos, ms que en protenas (Ivar, 2005). Borghesi et al. (2008) presento en su trabajo la elaboracin de un ensilado enzimtico de pescado el cual fue elaborado adicionando al pescado molido proteasa tipo II de Aspergillus oryzae de Sigma (Corporacin Qumica) diluido en agua destilada. Esto puesto en contenedores y a incubacin; obteniendo excelentes resultados.

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Borghesi et al (2008) realizo una comparacin entre ensilados; qumico (cidos frmico y propinoico), biolgico (inoculado) y enzimtico (enzimas exgenas) de pescado; concluyendo que estos tiene un alto coeficiente de digestibilidad aparente de protenas y aminocidos, y que los ensilados enzimtico y qumico producen mejores resultados que el biolgico. El ensilado enzimtico (enzimas exgenas) produce excelentes resultados; sin ayuda de inoculacin de microorganismos y de su respectiva fuente de carbohidratos; y se puede utilizar como un complemento para mtodos biolgicos. Un ejemplo es lo mencionado por Tom et al. (1994) al trabajar en EBP con enzimas exgenas se obtiene la ventaja de comenzar a hidrolizar antes de la disminucin del pH dando un efecto paralelo lo que facilita el contacto del cido producido por los microorganismos con las partculas del pescado disminuyendo dramticamente el tiempo de liquefaccin a solo horas, evitando de esta manera una putrefaccin.

4.2 Ensilado biolgico de pescado en la acuacultura

El EBP se ha estado utilizando a nivel comercial desde hace tiempo en la alimentacin de animales terrestres (mascotas, aves, cerdos, ovejas, rumiantes, etc.) en pases como Dinamarca, Finlandia, Polonia, Argentina, Costa Rica, Trinidad y Tobago, Uruguay, Paraguay, etc. (Parin y Zugarramurdi, 1994). La protena animal obtenida mediante la utilizacin de tecnologas simples y de baja inversin para obtener productos como el EBP, minimiza los efectos de la contaminacin ambiental, sumando adems ventajas nutricionales para los productos que lo incluyen en su formulacin (Balsinde et al., 2003).

El aprovechamiento del EBP en la acuacultura como fuente de protenas en dietas ha dado origen a una gran cantidad de trabajos. Como ejemplos: Padilla et al. (2000) utilizo EBP en sustitucin de HP en raciones para juveniles de gamitana (Colossoma macropomum); Gonzlez et al. (2007) utilizo el EBP en dietas para camarn blanco (Litopenaes schmitti); Nwanna (2003) lo utilizo en la formulacin de dietas para pez gato africano (clarias gariepinus); Lessi (1994) seala su utilizacin para preparar raciones a alevines de tambaqui (Colossoma macropomum) y tambin para alimentar post-larva de camarn (Macrobrachium rosembergii), Agudelo et al. (2004) hizo ensayos en peces (Paco Piaractus brachypomus), Balsinde et al. (2003) a experimentado alimentando camarn (Litopenaeus schmitti), Borghesi et al. (2008) en tilapa (Oreocromis niloticus), Fagbenro et al., (1997) en juveniles de pez gato (Clarias gariepinus), Fagbenro y

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Jauncey (1998) en tilapa (Oreochromis niloticus), Meire et al. (2002) en peces (Pacu Piaractus mesopotamicus), etc. Obteniendo en todos buenos resultados. Sin embargo ninguno de estos ensilados utiliz como cultivo iniciador bacterias candidatas a probiticos propias de los organismos a alimentar.

El ensilado de pescado es adicionado a las dietas en fresco (hmedo; tal y como se obtiene); secado conjunto ( co-secado) y deshidratado ( desecacin). En el ensilado de pescado en fresco Balsinde et al. (2003) seala que adems de la aportacin del agua proporciona aceite de pescado por su contenido de lpidos. El secado conjunto del ensilado de pescado se ha probado principalmente con harinas de soya y de plumas; solas en combinacin; sin embargo por la humedad en el producto obtenido habitualmente continan con algn otro mtodo de deshidratacin; como el secado en horno. El secado conjunto es con la intencin de producir productos con mejor composicin qumica y balance de amino cidos en busca de similitud al de la HP (Parin y Zugarramurdi, 1994; Fagbenro et al., 1997; Fagbenro y Jauncey, 1998; Nwanna 2003).

En cuanto a la deshidratacin de ensilados de pescado; a excepcin de equipos de secado convencional de HP; hay varios mtodos que son de conservacin tanto para alimentos como para los microorganismos presentes en el. El principal beneficio de utilizar la deshidratacin con el ensilado es la reduccin de peso y volumen; por la eliminacin del agua; lo que ayuda a concentrar la protena y facilita su almacenaje y transportacin. El ensilado secado al sol es la tcnica ms barata que cualquier otro mtodo de deshidratacin pero disminuye las propiedades nutritivas del alimento y sus caractersticas organolpticas. Este fue utilizado por Lessi (1994) y Padilla et al., (2000) exponiendo por periodos de 20 y 48 horas respectivamente para obtener un producto semi seco. El ensilado secado en horno o estufa de aire forzado fue utilizado por Borghesi et al. (2008), Lessi (1994) y Nwanna (2003) a 50 - 60C por tiempos de 15 hasta 48 horas; Torres (2007) utilizo temperaturas de secado de 37 a 45C de 24 a 48 h en EBP con frutas y BAL (incluida la cepa TD23) obteniendo sobrevivencias menores a 10 UFC/gr de un inicial de 10 UFC/gr.
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En cuanto a la liofilizacin ( cro desecacin) Torres (2007) realizo pruebas en EBP con frutas y con BAL (incluida la cepa TD23) obteniendo reducciones de una a dos ordenes logartmicas. La liofilizacin consiste

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en un proceso en el que se congela el alimento para posteriormente introducirlo en una cmara de vaco para que se remueva el agua por sublimacin (el agua pasa de slido a gas, sin pasar por lquido). Es utilizado principalmente en la industria alimentaria y farmacutica. Sus pros y contras conocidos son: En conservacin de microorganismos: estabilidad gentica alta, mtodo de conservacin de largo plazo en microbiologa (Viables por 10 aos ms), solo para concentraciones celulares del orden de 10 a 10
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clulas por ml en el caso de las bacterias, comodidad de almacenamiento a temperaturas de ms de 0 C y menos de 20 C, el crioprotector a utilizar puede ser el mismo medio de cultivo, requieren guardarse al vaci para evitar la rehidratacin por medio del aire y por que el oxigeno daa las clulas por la formacin de radicales libres; ya que estn asociados con prdida de viabilidad; y requieren guardarse en oscuridad. En conservacin de alimentos: No altera las propiedades nutritivas y organolpticas del alimento, los gastos de la liofilizacin suelen ser unas cuatro veces mayores que en el caso de la deshidratacin por horno, al rehidratar el alimento se devuelven prcticamente en su totalidad las propiedades primitivas, son susceptibles a oxidarse lo cual se puede evitar envasando los alimentos en atmsferas de gases inertes.

Los mtodos utilizados para formar los pellets de alimentos con inclusin de ensilado de pescado son el peletizado y el extruido. Los alimentos peletizados son obtenidos por la compactacin y el forzado del paso del alimento mediante un molino de carne a travs de las aberturas de un dado para despus proceder a secarlos en horno elctrico desde temperaturas de 50C por 15 horas hasta 100C por 3 horas (Gonzlez et al, 2007; Borghesi et al., 2008; Lessi, 1994). Balsinde et al (2003) realizo pruebas con la extrusin con temperaturas de trabajo de 128 a 135C y sometiendo al producto obtenido aun proceso de secado a 60C por una hora; obteniendo en las pruebas de hidroestabilidad mejores resultados que un alimento peletizado comercial; este autor menciona que la tecnologa de extrusin ofrece la ventaja de poder incluir dentro de la mezcla ingredientes frescos con alto contenido de agua y que el alimento obtenido por esta va es ms digerible y con menor nivel de humedad y de microorganismos que el peletizado. La mayora de estos trabajos solo contemplan las bacterias para la obtencin del ensilado; por lo que no tenan inconvenientes en utilizar altas temperaturas para formar los pellets y aunque haba excepciones esto no fue objeto de su estudio.

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El uso de cepas probiticas en la elaboracin de EBP y su utilizacin en preparacin de dietas; lo convierten en un alimento funcional por sus funciones adicionales a las de su valor nutritivo. Sin embargo son pocos los reportes que se han encontraron sobre la adicin de cultivos iniciadores con potencial probitico al EBP y posteriormente incluir en una dieta para ser evaluada in vivo en camarn blanco (LV).

4.3 Fuentes de protenas para camarn

Las protenas, carbohidratos y lpidos son los principales nutrimentos; y son los intermediarios entre la alimentacin y el metabolismo. La cantidad y calidad de la protena en la dieta son los principales factores que influyen sobre el crecimiento de los camarones (Gutirrez, 2002). Se ha demostrado que las protenas son el principal componente de los ecosistemas bentnicos donde habitan los camarones peneidos (Rosas et al., 2000) y el componente ms importante en una dieta para acuacultura, debido al costo y el requisito nutricional de los organismos (Garca et al., 1996).

Las protenas son indispensables para la estructura y funcin; utilizadas continuamente por el animal para crecimiento y reparacin de tejidos. Varios autores trabajando con camarones LV reportan distintos niveles ptimos de protena en dietas, pero en general los valores estn alrededor del 33.5% (Tacon, 1989; Kureshy y Allen, 2000). Aunque muchos alimentos comerciales para camarn usados en Mxico rondan los 35% y hay algunos que llegan a contener hasta 40% de protena cruda (Cruz et al., 2002).

Las protenas son molculas complejas constituidas por aminocidos. Los aminocidos se dividen en esenciales y no esenciales. Los aminocidos esenciales (AAE) son aquellos que el organismo no puede sintetizar al menos no en cantidades suficientes. Se ha sugerido que la composicin de aminocidos de los alimentos debera ser muy similar al de los animales ha alimentar (Mente et al., 2002). Tacon (1989) menciona que en las dietas se recomienda que incluyan a los 10 aminocidos considerados como esenciales para los crustceos: treonina, valina, metionina, isoleucina, leucina, fenilalanina, lisina, triptfano, histidina y arginina.

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En el caso de los crustceos y, especialmente en los estadios larvarios y de juveniles, es ampliamente reconocido que los AAE deben ser aportados por el alimento para mejorar el crecimiento y sobrevivencia de los organismos en cultivo (Gutirrez, 2002). En general, entre ms se aproxime el patrn de AAE de la protena a los requerimientos dietticos de AAE de la especie en cuestin, mayor ser su valor nutricional y utilizacin (Tacon, 1989).

Las protenas se clasifican de acuerdo a su origen: animal, vegetal y microbiana. Las protenas ms utilizadas comercialmente en la preparacin de alimentos para camarn se presentan como harinas y principalmente son de origen animal marino (Cruz, 1996). Histricamente, la HP es la principal fuente de protena en casi todas las dietas comerciales sobre todo para camarn, debido a que es muy atractante, muy digestva y rica en AAE, principalmente en lisina y otros aminocidos bsicos (Cruz, 1996).

El rendimiento de la materia prima para producir HP es variable; dependiendo en gran parte de las condiciones de la misma y de la eficiencia tecnolgica del proceso en cada planta; por lo que flucta entre 5.5 y 6 unidades de materia prima para la obtencin de una unidad de HP (Rodrguez et al., 1996). Un rendimiento ms optimista es reportado en Tornes (1973) de entre 4 a 4.5 unidades de materia prima por unidad de HP.

Una HP de buena calidad suele contener de 65 a 75% de protena de alta digestibilidad, buen perfil de aminocidos; debe tener pocos lpidos y cenizas, un bajo ndice de peroxidacin de lpidos y no debe contener histamina (Cruz, 1996; Akiyama y Dominy, 1989, Kjos, 2001). La calidad de la protena y la composicin nutricional de las harinas de pescado vara dependiendo de su frescura y del tipo de materia prima, as como de la temperatura de secado. En Mxico generalmente las harinas de pescado se fabrican a partir de subproductos de pescado y pocas son de pescado de buena calidad (Gutierrez, 2002).

La HP nominalmente contienen 10% aproximadamente en lpidos; la cual es particularmente propensa a la oxidacin debido al alto contenido de cidos grasos poli-insaturados (Ackman, 1996). Un valor mayor al de 10% anuncia menor palatabilidad y menor crecimiento en camarn con respecto a una harina hecha con pescado de mayor frescura (Ricque et al., 1996). La HP necesita ser estabilizada con antioxidantes (como el

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BHT) solo as tendr pocos cambios posteriores en los cidos grasos. En ausencia de su proteccin hay una prdida considerable a travs de la oxidacin de los cidos grasos de cadena larga altamente insaturados n3 (omega-3); el calentamiento producido puede daar seriamente a la protena y representar un riesgo de incendio por autooxidacin (Ackman, 1996). Los cidos grasos n3 de la grasa de pescado disfrutan de una favorable reputacin entre los dietistas, nutricionistas y escritores, un factor favorable para el mercadeo ya que estos son considerados como esenciales para la nutricin de camarones (Ackman, 1996).

Estudios sobre el perfil de aminocidos en harinas preparadas con diferentes peces, sugieren que la especie es una variable tan importante como el proceso (Ackman, 1996). La fabricacin de la HP es un proceso sumamente costoso (Padilla et al., 1996), presentan gran variabilidad en su composicin nutricional y un alto porcentaje de estas harinas tienen problemas de sobre-cocimiento durante su procesamiento causando desnaturalizacin de las protenas con la respectiva disminucin en la cantidad de aminocidos disponibles, la produccin de txicos como la mollerosina; por lo que no conserva la calidad de la protena presente en el producto fresco (Tacon, 1989; Berenz, 1994; Kjos, 2001). Aun las mejores harinas de pescado en el caso de dietas para Penaeus vannamei no deben de ser incluidas en niveles que excedan un 40%, para que no haya una depresin del crecimiento; las razones de este efecto no son bien conocidas (Cruz, 1996).

Se puede obtener un efecto benfico de otras fuentes de protenas como son: los solubles concentrados proteicos de pescado, las harinas de camarn y de calamar. El uso de protenas tales como harina de carne y sangre est limitado principalmente por su contenido en cidos grasos saturados (Cruz, 1996).

El EBP como fuente de protenas resulta muy econmico en su fabricacin, es de fcil elaboracin, tiene cualidades antimicrobianas (contra bacterias patgenas y putrefactivas), conserva en mayor grado la calidad de la protena presente en el producto fresco, tiene mayor valor nutricional comparado con el producto obtenido por adicin de cidos inorgnicos y los estudios de estabilidad del ensilado muestran que es factible almacenar este producto por perodos prolongados de tiempo a temperatura ambiente (mayores a 6 meses) sin que se reduzca su valor nutricional ni la calidad higinica (Berenz, 1994; Parn y Zugarramurdi, 1994; Kjos, 2001; Bello, 1994).

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En el EBP inoculado y sin fruta el pescado compone desde el 80 hasta el 85% (Ottati et al., 1990; Cordova et al., 1990; Gonzles y Marn, 2005; Ottati y Bello, 1990ab; Guevara et al., 1991; Martnez et al., 1991; Meire et al. ,2002). Mientras que en la HP para obtener una unidad se requiere desde 4 hasta 6 unidades de materia prima (Rodrguez et al., 1996; Tornes, 1973). Sin embargo la composicin qumica proximal del ensilado hmedo indica elevados porcentajes de agua (60 a 80%) y variables porcentajes de protena bruta (12 a 19%) de elevado valor nutricional adems de mantener las vitaminas intactas (Parin y Zugarramurdi, 1994).

El EBP al ser almacenado en condiciones anaerbicas y por la presencia de lquido reduce el contacto con el oxgeno del aire lo que ayuda a mantener la estabilidad de las vitaminas; as mismo se debe evitar el contacto con agentes catalticos como el hierro y el cobre (Campabadal y Celis, 1996).

Los valores calricos y de carbohidrato; reportados por diversos autores; para el EBP hmedo son variables, pero en promedio son de 1.80 kcal/g; pudiendo alcanzar 5 kcal/g y 10% a 20%; respectivamente (Bello, 1994; Parin y Zugarramurdi, 1994, Lessi et al., 1992, Padilla et al., 1996). Sin embargo los carbohidratos tienen poca participacin en el metabolismo energtico de los camarones peneidos, y en general de los crustceos (Gutirrez, 2002); su capacidad de utilizacin es muy reducida comparada con las protenas (hay menos amilasas que proteasas). Sin embargo, su uso es muy aconsejado para disminuir los requerimientos de protenas como fuente de energa (Cruz, 1996).

El contenido de lpidos en el EBP hmedo reportados por diversos autores tambin es bastante variable, generalmente alrededor de 5% pero abarcando desde 1 hasta 15% (Balsinde et al., 2003; Lessi, 1994; Cordova et al., 1990; Gonzles y Marn, 2005; Mattos et al. 2003; Nwanna, 2003; Padilla et al., 2000; Plascencia et al., 2002).

La utilizacin de diferentes tcnicas y materias primas utilizadas en la elaboracin de los EBP, muestran mucha divergencia en su composicin (Padilla et al., 1996). Por esta razn existen controversias entre autores sobre la eficiencia alimenticia; ya que hay quienes aseguran que la digestibilidad del ensilado es cerca del 100 % y la de la HP flucta entre 75 y 80% (Padilla et al., 2000).

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La protena presente en el EBP debe tener una excelente digestibilidad y eficiencia alimenticia por presentarse ya hidrolizada; gracias a la actividad proteoltica de enzimas como la pepsina y la tripsina (Bello et al., 1993). Estas enzimas ayudan a la digestin de las protenas y la tripsina representa por s sola el 60% de la actividad proteasa del hepatopncreas en los crustceos peneidos. Esta enzima corta especficamente los aminocidos bsicos que son esenciales en la nutricin de crustceos (Cruz, 1996).

En el ensilado gran parte de la protena ha sido hidrolizada a fragmentos solubles y aminocidos libres (Parn y Zugarramurdi, 1994). Estos compuestos actan como atractantes y/ estimulantes alimenticios y favorecen el crecimiento de acuerdo con el nivel de inclusin en el alimento (Gutirrez, 2002; Cruz, 1996; Borghesi et al., 2008). Sin embargo se ha declarado que el uso de ingredientes que contienen altos niveles de aminocidos libres y pequeos pptidos, pueden causar reduccin en la disponibilidad biolgica de la lisina y de otros aminocidos (Padilla et al., 2000).

Tacon (1989) resume experiencias en juveniles de peces y camarones alimentados con raciones en las que una porcin significativa de la protena diettica es suministrada en forma de aminocidos libres dando como resultado un crecimiento subptimo y una eficiencia de conversin alimenticia baja, comparada con animales alimentados con protena entera con protenas en las que los aminocidos son elementos constitutivos de estas. Sin embargo tambin menciona que en general, los aminocidos incorporados a la dieta en forma libre, son asimilados ms rpidamente por los peces, en comparacin con los aminocidos que integran la protena.

Kjos et al. (2000) sealan que el perfil de aminocidos presentes en el EBP contiene niveles ms bajos de lisina, metionina y triptfano que las harinas de pescado de alta calidad. Sin embargo estos mismos autores en el 2001 mencionan que las variaciones en el contenido de aminocidos dependen del origen del producto; pudiendo ser debido a que los msculos del pescado en general tienen mejor composicin de aminocidos, mientras que las protenas encontradas en huesos y piel (restos) tienen menor contenido de los aminocidos lisina, metionina y cistina. Siendo los restos de pescado de otras industrias el producto

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usualmente utilizado para ensilar en la mayora de los trabajos realizados; como cabezas de camarn, restos de fileteadoras, enlatadoras, etc.; ya que los distintos autores buscan el aprovechamiento de esos recursos.

Borghesi et al (2008) evalu ensilados; qumico, enzimtico y biolgico; de pescado en alimentos para tilapa (Oreocromis niloticus) concluyendo que estos tienen un alto coeficiente de digestibilidad aparente de protenas y aminocidos, y que los ensilados enzimtico y qumico producen mejores resultados que el biolgico. Tacon (1989) menciona que bajo ciertas condiciones cuando las protenas en la dieta estn parcialmente digeridas algunos de los aminocidos pueden no estar disponibles. En el caso del EBP el cultivo iniciador hace uso de los nutrientes rpidamente; en su crecimiento y produccin de cido; dado que se establece un mecanismo de competencia entre las BAL y los microorganismos descomponedores.

Una evaluacin del perfil de cidos grasos del EBP, indica que posee todos los cidos grasos presentes en el pescado, mostrando una menor proporcin de cidos grasos saturados (aproximadamente 40%) con prevalencia de los cidos Palmtico (C16:0) y Esterico (C18:0), al igual que un elevado porcentaje de cidos grasos saturados (mono y poli-insaturados; aproximadamente 60%), la mayora de estos de ms de 20 tomos de carbono, resaltando los cidos C20:5 n3 (cido eicosapentanico) y C22:6 n3 (cido docosahexaenico) (Ottati et al., 1990); estos cidos tienen un carcter esencial para estas especies ya que numerosos estudios han demostrado que los crustceos no pueden sintetizar cidos poli-insaturados de cadena larga al menos no en cantidades suficiente como para satisfacer sus requerimientos (Forrellat et al., 2004). Se afirma que estos cidos grasos son los que favorecen una buena tasa de crecimiento y un mayor ndice de mudas en camarn (Pacheco y Snchez, 2003).

La mayora de los estudios en camarones indican que los cidos grasos de la serie del linolnico (n3) tienen un mayor carcter esencial que los cidos grasos de la serie del linolico (n6) (Tacn, 1987). Los cidos grasos de la serie n3 tienen un mayor grado de insaturacin y esta caracterstica favorece la estructura de las membranas biolgicas hacindolas ms fluidas, flexibles y permeables a bajas temperatura; condicin que generalmente predomina en el ambiente acutico (Forrellat et al., 2004). Una comparacin realizada por Berenz (1994) en contenido de cidos grasos entre un ensilado biolgico de residuos de sardina y de la HP

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dio como resultados valores aproximados entre ambos; Observndose que predominan los cidos grasos insaturados en el ensilado.

En pruebas del cido tiobarbitrico hechas al EBP reportado en Ottati et al. (1990); como ndice de oxidacin lipdica; muestran que son muy bajos los productos de oxidacin; Esto puede deberse a las condiciones anaerbicas del proceso y la presencia del lquido en el cual estn inmersas las grasas reduciendo su contacto con el oxgeno del aire. Ackman (1996) seala que el aceite es protegido de la oxidacin por el uso de contenedores cerrados; tal y como sucede en el ensilado; otras formas de proteccin pueden ser aadiendo un antioxidante utilizar contenedores que puedan ser llenado con un gas inerte. Una comparacin hecha entre el EBP y el ensilado qumico concluye que en los ensilados biolgicos la grasa es un poco ms estable a la oxidacin que en los ensilados qumicos (Parin y Zugarramurdi, 1994).

En comparaciones de costos relativos de la produccin del ensilado con la HP, se han observado ventajas muy importantes para el costo unitario de protena para alimento balanceado, an en pases con altos costos internos. La produccin de ensilado industrial compite favorablemente con la HP, principalmente como resultado de una menor inversin de capital. Esto es porque el precio de una planta de ensilado biolgico con equipo separador de aceite es aproximadamente la mitad del correspondiente a una planta de HP con la misma capacidad (Parin y Zugarramurdi, 1994).

Balsinde et al. (2003) obtuvieron en su trabajo un EBP con humedad de 70% y con protena de 16.9% sealando que tiene las caractersticas bromatolgicas adecuadas para ser utilizado en la sustitucin de la HP en la elaboracin de dietas para el camarn de cultivo. Bello (1994) menciona que el EBP tiene un alto contenido proteico; similar a la HP; y puede ser utilizado como sustituto de la HP en la elaboracin de raciones de alimentos concentrados, directamente como un complemento en la alimentacin animal. Parin y Zugarramurdi (1994) mencionan que el ensilado se usa del mismo modo que la HP en los alimentos para animales. Meire et al., (2002) es factible de utilizar en la acuacultura y una adecuada fuente de protenas en alimentos para peces. Nwanna (2003) concluye; basado en estimaciones del beneficio econmico e ndice de utilizacin de nutrientes; la harina producida de EBP puede remplazar efectivamente a la HP. Berenz (1994) seala que es factible de ser utilizado en formulaciones de alimentos para animales y es que

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se sabe que en muchos pases donde no se procesa HP, los ensilados han sido empleados como un sustituto de la misma, obteniendo buenos resultados.

El EBP al utilizarse en fresco en la elaboracin de las dietas aporta agua, proporciona aceite de alta calidad por su contenido de lpidos y carbohidratos (Balsinde et al., 2003); sin embargo Parin y Zugarramurdi (1994) mencionan que se requiere aproximadamente cuatro veces ms ensilado para la misma entrada de protena de la HP. Cifras ms optimistas reportan que la relacin de reemplazo del EBP (elaborado con residuos) por la HP en dietas de animales es de 3 a 1 (3 Kg. de ensilado por Kg. de harina), pero que si se tratara de un ensilado integral (usando todo el pescado como resulta en el proceso de HP), la relacin es de 2 a 2.5 unidades de ensilado por unidad de harina (Balsinde et al., 2003). En el ensilado deshidratado; con humedad menor al 10%; su porcentaje de protena bruta aumenta significativamente a rangos de 35 a 45% (Gonzles y Marn, 2005). Tambin se ha probado el secado conjunto ( co-secado) con harinas de soya y de plumas; solas en combinacin; para producir productos secos con composicin qumica y balance de amino cidos similares al de la HP (Parin y Zugarramurdi, 1994; Fagbenro et al., 1997; Nwanna 2003).

Otra buena fuente de protenas son los vegetales que son usadas en menor grado en las dietas para camarn porque son menos atractantes, su composicin en aminocidos es menos balanceada y muchas contienen productos txicos como el factor antitripsico de la soya, el gosypol del algodn etc.; aflatoxinas u otros hongos muy txicos. En la prctica solo las mejores protenas vegetales son utilizadas; como la harina de pasta de soya (Cruz, 1996). Tambin estn las protenas de origen microbiolgico como las levaduras desprovistas de factores antinutricionales y las bacterias fermentadoras de alcoholes. Substituciones de hasta un 30% se han revelado eficaces, mientras que porcentajes mayores requieren suplementacin con aminocidos libres (Cruz, 1996).

La elaboracin de alimentos de alta calidad es una necesidad vital para el desarrollo de la industria acucola (Campabadal y Celis, 1996). La calidad de estos alimentos est determinada por el tipo, calidad y composicin de ingredientes que se utilicen, la formulacin de la dieta, y los mtodos de procesamiento empleados en su elaboracin, ya que pueden influir en la atractabilidad, palatabilidad y disponibilidad de nutrientes (Campabadal y Celis, 1996). La calidad de las protenas se resume esencialmente en dos

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caractersticas: coeficiente de utilizacin digestiva y valor biolgico (equilibrio de aminocidos esenciales y principalmente del valor relativo del aminocido esencial menos abundante con respecto a los requerimientos: aminocido limitante) (Cruz, 1996).

La medicin precisa de la digestin de los nutrientes y la eficiencia de asimilacin de los componentes en una dieta, denominadas comnmente digestibilidad, es esencial para lograr una buena formulacin biolgica y econmicamente optima. Algunos investigadores han estimado la digestibilidad de los alimentos sus eficiencias de asimilacin a partir de datos experimentales de crecimiento (Cabanillas et al., 2001). El anlisis de las enzimas digestivas es tambin otra herramienta analtica que se utiliza para evaluar la digestin de los crustceos marinos (Cabanillas et al., 2001).

La medicin directa de la digestibilidad aparente de las dietas en los camarones es difcil por los problemas que representa medir en el medio acutico la ingesta total y las heces (Akiyama y Dominy, 1989). Sin embargo, estudios previos de digestibilidad en camarn LV reportan que los coeficientes de digestibilidad de la dieta y de las protenas son influenciados por las diferentes fuentes proteicas de la dieta, as como por la edad de los animales estudiados (Cabanillas et al., 2001).

El crecimiento es una respuesta integradora en la cual se resumen las adaptaciones fisiolgicas, bioqumicas y moleculares de los organismos por lo que ha sido de gran utilidad en los ensayos nutricionales para determinar el tipo de dieta que es ptima para el cultivo de una especie (Rosas et al., 2000). La tasa de crecimiento de un animal, es un indicador bastante sensible de la calidad protenica; as bajo condiciones controladas la ganancia en peso est en proporcin a los aminocidos esenciales suministrados.

4.4 Sistema digestivo del camarn

El conocimiento de los aspectos fisiolgicos y bioqumicos de la nutricin son necesario para comprender la mejor forma de satisfacer los requerimientos nutricionales de los camarones en cultivo y as poder disear dietas que sean adecuadas y reduzcan su efecto contaminante al ambiente (Rosas et al., 2000).

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La nutricin de camarones implica procesos qumicos y fisiolgicos que proveen nutrientes al animal para sus funciones normales, de mantenimiento y crecimiento. Una parte importante de estos procesos es la digestin, que involucra descomposicin mecnica, solubilizacin y absorcin de nutrientes, el cual depende de la anatoma y fisiologa del sistema digestivo de cada especie (Molina et al., 2002).

El camarn detecta el alimento a distancia por quimiorecepcin, mediante los receptores antenales, y una vez que se ha dirigido a l, por contacto, lo degusta con los receptores presentes en pereiopodos y apndices bucales, dando como respuesta la aceptacin el rechazo del alimento. Por lo que el alimento debe ser atractante (atraiga al camarn) y palatable (le guste el sabor). Siendo el color del alimento irrelevante, pero si debindose presentar uniforme (Cruz, 1996).

El uso de sustancias atractantes permite que los alimentos sean localizados y consumidos ms rpido por los animales. Estos compuestos son molculas muy solubles en agua y son de bajo peso molecular; como: aminocidos, compuestos cuaternarios de amonio, trimetilamina, betaina (trimetilglicina), nucletidos, aminas biognicas y cidos orgnicos. De manera comercial se encuentran disponibles en el mercado harinas, solubles y aceites de pescado, moluscos crustceos; que funcionan como excelentes atractantes (Cruz, 1996).

Los principales nutrientes alimenticios; carbohidratos, protenas y lpidos; son requeridos por los animales, no solo como materiales esenciales para la formacin de tejidos, sino adems como fuentes de energa qumica almacenada, que ser el combustible requerido para la realizacin de esos procesos. Por lo tanto, la capacidad que tenga un alimento para proporcionar energa, es de gran importancia en la determinacin del valor nutricional para los animales (Tacon, 1989).

La formulacin de alimentos no solo tiene que llenar los requerimientos de los animales; debe tambin producir un alimento muy estable en el agua porque los camarones se alimentan lenta y continuamente. La estabilidad en el agua es de suma importancia en la alimentacin de camarn, ya que una gran cantidad de nutrientes se disuelven en las primeras dos tres horas despus de su distribucin. Sin embargo, la estabilidad optima en el agua es dependiente del manejo del alimento, es decir entre ms veces se alimente

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al camarn menos estabilidad en el agua ser requerida y viceversa. Adems el pellet necesita ser lo suficientemente pequeo para poder ser llevado a la boca y permitir al camarn cargarlo mientras nada (Cruz, 1996).

En los camarones el sistema digestivo se compone de boca, estomago, hepatopncreas; situados en el cefalotrax; un intestino, una glndula intestinal en el abdomen y el ano situado ventralmente donde comienza el telson (Cruz, 1996). Los crustceos decpodos se consideran filtradores intensos en virtud de la presencia de mltiples filtros en su aparato digestivo, de ah la importancia de una buena molienda de los insumos utilizados en los alimentos (Cruz, 1996).

La digestin comienza en la cavidad cardiaca del estmago y se contina en los tbulos del hepatopncreas. Es a nivel de sta glndula que la digestin se hace ms activa, con la participacin de enzimas producidas por clulas especializadas (Molina et al., 2002).

La produccin de enzimas digestivas en el hepatopncreas de los crustceos se encuentra controlada, en parte, por hormonas del pednculo ocular (Molina et al., 2002). El hepatopncreas a diferencia del intestino y estmago, presenta una mayor actividad enzimtica, esto sugiere la importancia de ste rgano en la sntesis y secrecin de enzimas digestivas (Molina et al., 2002).

En camarn LV al igual que en otras especies de peneidos, se ha determinado la presencia de enzimas endgenas tales como, tripsina, quimotripsina, aminopeptidasa, lipasas, carbohidrasas, carbopeptidasa A y B (Molina et al., 2002). La colagenasa quitinasa y celulasa, son enzimas tambin identificadas pero se cree que son de fuente exgena (Molina et al., 2002).

Nutrientes como protenas, carbohidratos y lpidos son componentes esenciales de una dieta balanceada e inciden sobre aspectos como la palatabilidad del alimento, la digestibilidad (acceso de enzimas digestivas a sitios de hidrlisis en el alimento) y la absorcin (Molina et al., 2002). Los organismos en cultivo toman componentes de la dieta y los utilizan para formar las molculas de construccin de su cuerpo. Otras son usadas como combustible para dar energa a actividades como movimiento, reproduccin, defensa contra

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parsitos y depredadores, etc. (catabolismo). La sntesis de molculas para la construccin del cuerpo del organismo se realiza utilizando la energa derivada del catabolismo (anabolismo). Catabolismo y anabolismo forman el metabolismo. Este est dirigido y modulado por enzimas especficas para cada una de las reacciones qumicas (Garca et al., 1996).

La digestin qumica de protenas se realiza por un conjunto de enzimas proteolticas (proteasas) que estn constituidos de dos grupos: endopeptidasas, que cortan los enlaces peptidicos en el interior de las cadenas proteicas y las exopeptidasas, que cortan los enlaces peptidicos aminoterminales, carboxiterminales y los dipeptidos. La tripsina representa por s sola el 60% de la actividad proteasica del hepatopncreas en los crustceos peneidos. Esta enzima es especifica hacia los aminocidos bsicos que son esenciales en la nutricin de crustceos (Cruz, 1996). Dada la importancia de la tripsina, mientras ms aminocidos bsicos tenga la protena, la capacidad de hidrlisis ser mayor y por lo tanto, la digestibilidad y la eficiencia alimenticia. La complementacin de protenas con aminocidos puros no es recomendable en organismos acuticos por su gran solubilidad en el agua (Cruz, 1996).

Tambin existen enzimas que digieren los glcidos (carbohidrasas): amilasas, maltasas, sacarasas, algunas veces celulasas (Cruz, 1996). El glucgeno es la molcula de almacenamiento de carbohidratos en los crustceos decpodos, y es la glndula digestiva el sitio donde principalmente se acumula (Rosas et al., 2000). De acuerdo con numerosos autores el glucgeno en crustceos es utilizado principalmente como materia prima para la formacin de la quitina; la cual puede llegar a ser hasta el 35% del peso seco de los camarones (Rosas et al., 2000);, cidos nucleicos y en la formacin de esteroides y de cidos grasos (Cruz, 1996).

Se asegura que las protenas pueden ser convertidas en carbohidratos, ya que los camarones contienen la maquinaria enzimtica necesaria para llevar a cabo la gluconeognesis (Rosas et al., 2000). Sin embargo el uso de carbohidratos es recomendable; 30 a 40% de la materia seca del alimento; para disminuir los requerimientos de protenas como fuente de energa ahorrando as cantidades sustanciales (Cruz, 1996).

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La digestin de los lpidos est asegurada por las lipasas y esterasas. Los lpidos alimenticios deben sufrir dos tipos de transformaciones para poder ser absorbidos: una emulsificacin; que conduce a una microemulsin; y una hidrlisis. Las lipasas actan sobre los lpidos emulsionados y las esterasas continan la digestin enzimtica sobre los productos hidrosolubles obtenidos. Tambin se han encontrado en crustceos enzimas como la desoxiribonucleasa, la ribonucleasa y fosfatasas alcalinas (Cruz, 1996).

Se ha sugerido que los niveles de lpidos recomendados en los alimentos comerciales para camarones deben estar en un intervalo de 6,0 a 7,5% y que no deben excederse del 10%, ya que valores por encima influyen en la reduccin del crecimiento (Lista y Velasquez, 2003). Uno de los factores que se asocia a estos bajos requerimientos de lpidos es la baja actividad de las lipasas en los crustceos, por lo que niveles elevados de lpidos en las dietas (> 10%) no son aprovechados por stos organismo (Lista y Velasquez, 2003).

Se sabe que los crustceos usan generalmente bien las grasas como fuente de energa y como una fuente de cidos grasos esenciales, necesarios para el crecimiento normal y la sobrevivencia de los animales. Los lpidos sirven adems como vehculos de las vitaminas liposolubles y proveen otros compuestos, como esteroles y fosfolipdos, que son esenciales para el buen funcionamiento metablico del camarn. Las actividades enzimticas digestivas varan en funcin del ciclo de muda, ciclo circadiano, desarrollo (larvario, de crecimiento, de reproduccin), tipo de alimento y factores ambientales. La acidez del sistema digestivo de crustceos es mnima, ya que el pH es aproximadamente 5 - 7. (Cruz, 1996).

Los cidos grasos poli-insaturados de cadena larga no pueden ser sintetizados por los crustceos y por lo tanto son considerados como esenciales; por lo que las fuentes de lpidos usadas deben contener cidos grasos linoleico (18:2 n6), linolenico (18:3 n3), ecosapentaenoico (20:5 n3) y docohexaenoico (22:6 n3) (Cruz, 1996); la mayora de los estudios indican que los cidos grasos de la serie del linolnico (n3) tienen un mayor carcter esencial que los cidos grasos de la serie del linolico (n6) (Tacn, 1987). Los cidos grasos de la serie n3 tienen un mayor grado de insaturacin y esta caracterstica favorece la estructura de las membranas biolgicas hacindolas ms fluidas, flexibles y permeables a bajas temperatura; condicin que generalmente predomina en el ambiente acutico (Forrellat et al., 2004).

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La expresin de las enzimas digestivas es afectada por una serie de factores limitantes como son: Parmetros fsico-qumicos del agua (pH, oxgeno, salinidad y temperatura), edad y tamao del camarn, cambios ontogenticos, ayuno, ingredientes de la dieta, nivel y fuente proteica, nivel y tipo de aglutinantes, aditivos promotores de crecimiento, cantidad y frecuencia de alimentacin, ritmos circadianos, ciclo de muda e incluso ha sido reportado que el agua de cultivo ejerce un efecto estimulante sobre la actividad enzimtica digestiva (Molina et al., 2002).

La habilidad de los camarones para utilizar diferentes sustratos energticos est estrechamente relacionada con las necesidades de materia y energa, la capacidad de almacenamiento y la capacidad adaptativa de las enzimas digestivas (Rosas et al., 2000).

La energa es definida como la capacidad para hacer un trabajo, y es derivada por los animales a travs del catabolismo de los carbohidratos, lpidos y protenas dentro del cuerpo (Tacon, 1990). La energa digestible de ingredientes no ha sido determinada para camarones. En general se considera que los organismos acuticos tienen requerimientos energticos menores que los animales terrestres, debido a varios factores: son poiquilotermos, requieren menos energa para mantener su posicin y para moverse en el agua en comparacin con los animales terrestres y adems los desechos nitrogenados son excretados en forma de amoniaco en vez de urea cido rico, perdiendo menos energa en el catabolismo proteico y en la excrecin de desechos nitrogenados (Cruz, 1996).

Los camarones utilizan preferentemente la protena como fuente de energa (Cruz, 1996); sin embargo es relativamente ineficiente en comparacin con lpidos (Kureshy y Allen, 2000) y los factores abiticos como temperatura y salinidad pueden afectar el requerimiento proteico (Kureshy y Allen, 2000).

Un mtodo simple para proveer niveles adecuados de energa en alimentos para camarn es mantener una proporcin protena lpidos de aproximadamente 6:1 (Akiyama y Dominy, 1989). En promedio; segn datos de diversos autores; el nivele optimo de energa para camarn debe rondar los 4 Kcal/g sin embargo hay

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varios alimentos comerciales usados en Mxico que llegan a contener desde 4.6 hasta 5 Kcal/g (Cruz et al., 2002).

Varios autores han determinado los requerimientos de protena y energa digestibles para camarn L. vannamei sealando como ptima; en medio controlado y en ausencia de produccin natural; 24% y 3.6 Kcal/g respectivamente dando la relacin protena-energa de 67 mg/Kcal digestible (Cruz et al., 2000; Cruz et al., 2002).

Conforme a estudios in vivo realizados en camarn LV por Cruz et al. (2002) a varios alimentos comerciales; adicionando oxido de cromo; al analiza las heces y comparar los valores de protena bruta y digestible se observo que la protena disponible (bruta) fue en promedio 10 puntos menor y la energa disminuyo en un punto. De acuerdo a lo anterior los valores protena-energa brutos deberan estar en 74 mg/Kcal (34% y 4.6 Kcal/g) para aproximarse a la relacin de 67 mg/Kcal de protena-energa digestibles considerada como ptima. Sin embargo estas estimaciones solo son validas y efectivas en los alimentos que presentan caractersticas similares en composicin a los alimentos evaluados por Cruz et al. (2002).

Kureshy y Allen (2000) encontraron que para camarn LV se induce un mayor crecimiento con 32% en protena cruda, 4.02 Kcal/g en energa bruta y con relacin de 12.57 Kcal/g energa-protena comparado con dietas con 16% y 48% de protena, 4.0 y 4.3 Kcal/g de energa bruta y con relacin protena-energa de 25.1 Kcal/g y 8.9 Kcal/g respectivamente. Aunque la dieta optima presento la relacin de 12.57 Kcal/g energaprotena brutas esta es utiliza por diversos autores pero con unidades invertidas, de tal forma se obtendran 79.6 mg/Kcal de protena-energa bruta.

Velasco et al. (1996) seala que el contenido de protena del alimento debe ser mnimo por dos razones: 1) Para evitar el uso de la protena como fuente de energa y asimismo reducir la cantidad de Nitrgeno liberada al agua en forma de amonio, y 2) Para reducir el costo del alimento.

En los camarones el fsforo se encuentra principalmente asociado al Calcio en el exoesqueleto. Tambin, es un componente de fosfolipdos y de compuestos de alto contenido energtico como: el adenosin trifosfato

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(ATP), cidos nucleicos (como el cido desoxirribonucleico; ADN) y el cido ribonucleico (ARN), coenzimas, intermediarios metablicos, y tiene un papel importante como regulador de pH de los fluidos intra y extracelulares (Velasco et al., 1996). Aunque los camarones son capaces de asimilar minerales directamente del agua las concentraciones de fsforo son generalmente muy bajas en el agua (Velasco et al., 1996). Consecuentemente, el fsforo es uno de los principales componentes de la fraccin inorgnica de los alimentos (Velasco et al., 1996).

La acuacultura se visualizo como una actividad no contaminante durante sus primeras etapas de desarrollo. Sin embargo, con la rpida expansin e intensificacin de la industria, hay una creciente preocupacin sobre la sustentabilidad a largo plazo de la acuacultura con relacin a su impacto ambiental (ejemplo: las descargas de los efluentes) y el desarrollo de polticas ambientales (Velasco et al., 1996). Las agencias gubernamentales ya han establecido acciones regulatorias en varios pases con respecto a los estndares de calidad de agua y a las limitaciones de descarga (Velasco et al., 1996).

En los efluentes de agua de descarga de las operaciones de acuacultura el Nitrgeno y el fsforo han sido considerados como dos de los ms importantes agentes contaminantes del medio natural. La introduccin del Nitrgeno es de particular preocupacin porque es generalmente un nutriente limitante en los ecosistemas marinos. Como los alimentos se han identificado como la principal fuente de estos elementos en los efluentes de acuacultura, debe realizarse investigacin para optimizar los niveles de protena dietara (aminocidos esenciales) y de fsforo para obtener buena sobrevivencia, crecimiento y al mismo tiempo minimizar la descarga de Nitrgeno y fsforo en el agua (Velasco et al., 1996).

4.5 Microflora intestinal del camarn

En animales terrestres la microflora intestinal ayuda al mantenimiento del equilibrio en el tracto digestivo e inhibe el establecimiento y el crecimiento de microorganismos patgenos. Se ha sugerido que cada especie de animal posee una flora microbiana autctona, donde la mayor parte de la flora estara compuesta por organismos anaerbicos (McCartney, 1994).

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En el ambiente marino las bacterias Gram negativas predominan y en menor proporcin las Gram positivas; estas usualmente constituyen la mayora de las bacterias que normalmente se presentan en la microflora asociada a los camarones silvestres y de cultivo (Morales, 2000; Garca, 2003). La gran mayora de los microbios presentes en el ambiente marino (bacterias, virus, hongos o parsitos) son inocuos o son controlados exitosamente por los mecanismos internos de defensa de los organismos en cultivo (Morales, 2000). Las etapas tempranas del ciclo de vida de los organismos suelen ser ms susceptibles a los ataques de dichos agentes, sobre todo cuando se llevan cultivos larvarios en forma intensiva, que por efecto del estrs provocado por las altas densidades, reduce el potencial de defensa de los organismos (Morales, 2000).

La ruptura del equilibrio dinmico de la flora intestinal es provocada por el estrs que se genera por las condiciones intensivas de la produccin animal. Cuando descienden las concentraciones de bacterias beneficiosas, aparece la oportunidad para las bacterias menos deseables para que los patgenos potenciales se instalen y se multipliquen (Zazueta, 2003). En camarones el estrs est determinado por la calidad del agua, la alimentacin, variacin drstica de los parmetros (oxigeno, temperatura, salinidad, pH, etc.) y las practicas de manejo (Morales, 2000). Las principales manifestaciones de estrs en un camarn peneido son: Bacterias filamentosas y/ protozoos epibiotes, presencia de bacterias en la hemolinfa, enfermedad del caparazn, opacidad anormal de la musculatura, retrazo de la muda, movimientos desorientados desordenados, y branquias negras (Siderman, 1984). El estrs causa alteraciones en el metabolismo del animal, el cual se ve reflejado en el aprovechamiento de los nutrientes y por lo tanto, en el destino metablico de estos ltimos (Lista y Velasquez, 2003).

La mayora de las enfermedades que asechan a los camarones son especies de Vibrio principalmente V. parahaemolyticus, V. alginolyticus y V. harveyi presentando muy altas mortandades cuando en los camarones se rompe su equilibrio se encuentran con su sistema inmune suprimido (Morales, 2000; Garriques y Arevalo, 1995). Los vibrios son agentes que forman parte de la microflora natural del camarn al encontrarse en camarones sanos, razn por la cual se les considera patgenos oportunistas al desencadenar enfermedades cuando el organismo presenta estrs (Morales, 2000). Es ampliamente reconocido que los probiticos son capaces de mejorar la salud del hospedador por recuperacin del

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equilibrio microbiano intestinal (Fuller, 1989; Gatesoupe, 1999) y que el gnero Lactobacillus contiene los principales microorganismos utilizados como probiticos (Axelsson, 1990; Ivar, 2005). Estudios realizados a camarones demostraron que el gnero Lactobacillus es parte de la flora microbiana natural que se encuentran acompandolo en todos sus estadios de vida y parte de dichas bacterias tienen potencial para usarse como probiticos en la acuacultura (Garca, 2003).

4.6 Bacterias cido lcticas

Las BAL se caracterizan por ser Gram positivas, no forman esporas, catalasa generalmente negativas, carecen de citocromos, son anaerobias pero aerotolerantes, de forma bacilar, comnmente se asocian en cadenas cortas, cidotolerantes y estrictamente fermentativas, teniendo como producto principal de su metabolismo de carbohidratos el cido lctico. Son organismos importantes en la preservacin de la comida y alimentos fermentados por cultivos lcticos conocidos como el yogurt, queso, etc. (Axelsson, 1990, Estela et al. 2007). Las vas bioqumicas de la fermentacin son: las homofermentativas; que conducen a un producto principal (c. lctico) y las heterofermentativas estrictos; que dan dos o ms productos (c. lctico, c. actico y CO2) (Estela et al. 2007). El cido lctico es de amplio uso en la industria; debido a sus caractersticas benficas, se utiliza en la industria alimentaria (en bebidas y como conservante), en farmacia, medicina, textilera, en la industria del cuero y para la produccin de plsticos bo-degradables. El Food Chemical Codex (compendios en qumica de alimentos) en el ao 1996 especifica el uso del acido lctico en alimentos con una pureza del 88% (Estela et al. 2007).

Hoy los gneros ms importantes de BAL son: Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Etragenococcus, Vagococcus, y Weissella (Ivar, 2005). Las Bifidobacterias son consideradas parte de BAL sobre una base fisiolgica; por que producen cido lctico como producto principal de la fermentacin. Sin embargo por taxonoma, morfologa y criterio gentico las Bifidobacterias son distintas de las BAL (Ivar, 2005).

Muchas BAL principalmente el gnero Lactobacillus tiene el estatus GRAS por la FDA (GRAS generally regarded as safe; generalmente consideradas como seguras; FDA food and drug administration;

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administracin de alimentos y medicamentos; Notice No. GRN 000049) por su natural ocurrencia en el cuerpo humano y en una gran variedad de productos alimenticios. Su asociacin positiva con la salud humana es de gran inters en la industria de los alimentos y farmacutica (Ivar, 2005).

Las BAL son consideradas importantes bacterias probiticas, esto es: microorganismos vivos, que cuando son ingeridos en cierto nmero, ejercen beneficios en la salud del hospedador mas all de la inherente nutricin (Ivar, 2005). Desde una perspectiva prctica el Lactobacillus por ser importante en el tracto gastrointestinal se destaca de las BAL. Varias cepas de las siguientes especies de Lactobacillus son reconocidas como probiticos: L acidophilus, L. plantarum, L. casei, L. fermentum, L. reuteri, L. lactis, entre otros (Ivar, 2005; Axelsson, 1990).

La actividad antimicrobiana del Lactobacillus se encuentra directamente asociada con su produccin de varios productos como cidos orgnicos (lctico y actico), produccin de otros productos finales del metabolismo, produccin de bacteriocinas, pptidos inhibidores del crecimiento microbiano y produccin de sustancias antimicrobianas de bajo peso molecular (Axelsson, 1990). Algunas especies del gnero Lactobacillus son heterofermentativos facultativos; en condiciones de anaerobiosis y microaerobiosis se comportan como homofermentativos, y en condiciones aerbicas forman adems de cido lctico, cido actico, acetoina y perxido de hidrgeno. La temperatura ptima de crecimiento de los Lactobacillus est entre 30 a 40 C y nutricio nalmente son fastidiosas por necesitar medios complejos para su crecimiento (Estela et al., 2007; Ivar, 2005). Lactobacillus Plantarum es reconocida como heterofermentativo facultativo y frecuentemente es encontrado en material de plantas, de varios alimentos fermentados, en el tracto gastrointestinal de humanos y utilizado en la elaboracin de pescado ensilado que se utiliza para complementar dietas para animales de importancia acucola (Garca, 2006; Martn, 2005; Landete, 2005).

En el tracto digestivo de camarones sanos se han encontrado BAL y en particular el gnero Lactobacillus probando que son parte de la flora natural microbiana que acompaan al camarn en todos sus estadios de vida y parte de dichas bacterias tienen potencial para usarse como probiticos en la acuacultura (Garca, 2003). Este mismo autor en el ao 2006 reporto distintas cepas como potenciales probiticos en camarn blanco (LV) incluyendo la cepa TD23 utilizada en el presente trabajo. De acuerdo con la identificacin

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molecular la cepa TD23 presento 99% de identidad con la especie Lactobacillus plantarum AB102857 ya reportada anteriormente como potencial probitico.

Torres (2007) utilizo la cepa TD23 en la elaboracin de diferentes EBP que incluan frutas en su composicin, realizando anlisis microbiolgicos y registrando las variaciones del pH por 72 h. La BAL en los EBP presentaron cinticas de crecimiento con fases de latencia de alrededor de 3 h, fases exponenciales con duracin aproximada de 81 h, tasas especifica de crecimiento de 0.3 h , pH 5.8 inicial promedio, pH 5 final al crecimiento exponencial y una produccin de cido lctico en la fase exponencial del crecimiento estimada entre 2.2 y 2.8 g/l/h (20 g/l / 81 h; 2% cido lctico); de acuerdo a valores presentados en las graficas en Torres (2007) y acidez lctica reportado en cordova et al. (1990) en EBP de composicin semejante e inoculado con Lactobacillus plantarum.
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Estela et al. (2007) realizo pruebas de produccin de cido lctico con Lactobacillus plantarum L10, en medios sintticos, en cultivos batch y continuo. Encontrando en batch tasas especificas de crecimiento de 0.2 h
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y una produccin de cido lctico en la fase exponencial del crecimiento de 6.5 g/l/h mientras en
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cultivo continuo obtuvo la mejor productividad (en cido lctico y biomasa) con diluciones de 0.46 a 0.51 h . Sealando la influencia esencial que tiene la presencia de sales de manganeso, fosfatos y la concentracin de fuente de carbono, cumplen un rol importante en la conversin completa de la glucosa y en los dems parmetros de produccin de cido lctico. Tambin menciona que los factores limitantes en la produccin de cido lctico por la va fermentativa son principalmente, la baja concentracin de BAL en el sistema y la inhibicin del crecimiento por el producto. Torres (2007) con los EBP con frutas, independientemente de la concentracin de las BAL inicial (0 h), en la fase exponencial de crecimiento estas alcanzan o tienden hacia 10 UFC/ml y durante la fase estacionaria continan produciendo cido lctico hasta un pH final estacionario de 4.1 al tiempo 36 h, tiempo en que tambin comenzaron a descender las UFC/ml de BAL.
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En promedio los EBP inicialmente (0 h) presentan pH 5.7 (rango 5.4 - 5.9) y cido lctico 0.7% (rango 0.6 0.8) despus de 3 das (72 h) muestran pH 4.4 (rango 4.9 - 4.1) y cido lctico 3.6% (rango 2.7 - 5%) posterior a las 72 h las variaciones son mnimas; sin importar la composicin o los inoculos utilizados; suero de leche, BAL seleccionadas, yogurt, fermento biolgico; de los EBP (Lessi, 1994; cordova et al., 1990;

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Gonzles y Marn, 2005; Padilla et al., 2000; Padilla, 1996, Torres, 2007; Plascencia et al, 2002). La cantidad de cido lctico producido inicialmente en el pescado est relacionado con la cantidad de carbohidrato almacenado (glucgeno) en el tejido vivo. En general, el msculo de pescado contiene un nivel relativamente bajo de glucgeno, comparado con los mamferos y por esta razn se genera mucho menos cido lctico despus de la muerte (gluclisis), lo que origina un pH post mortem alto; aproximadamente entre 5.8 a 6.1; y mientras ms agotado y desnutrido este el pescado este contendr menos glucgeno (Huss, 1998).

El EBP se puede definir como un cultivo batch de medio complejo; dado que aporta las sustancias fundamentales para el crecimiento de BAL (fuentes de carbono y nitrgeno) pero de composicin qumicamente indefinidas y variables; al ser rico en compuestos nutritivos eso explicara las diferencias entre el batch de Estela et al. (2007) y el EBP con fruta de Torres (2007) en cuanto a las tasas especificas de crecimiento, aunque en la produccin de cido lctico Estela et al. (2007) obtuvo ms producto con menos BAL. Sin embargo el EBP inoculado es una tcnica que consiste en incrementar en una poblacin mixta, el nmero de microorganismos de inters en relacin al resto, por lo que existe una competencia inicial por hacer uso de los nutrientes. Dicha competencia por los nutrientes no se dio en Estela et al. (2007) dado que sus medios eran esterilizados previamente.

L. plantarum ha demostrado actividad bactericida frente a E. coli in vitro (Gutirrez et al., 2008). Torres (2007) realizo pruebas en EBP con fruta inoculado con L. plantarum TD23 de la viabilidad de bacterias patgenas del pescado; al inicio registro poblaciones por el orden de 10 UFC/ml y al siguiente conteo (al lapso de 72 h) obtuvo para Staphylococcus aureus un efecto bacteriosttico mientras en Salmonella y coliformes totales fue bactericida. Gonzles y Marn (2005) obtuvieron en sus EBP efectos bacteriostticos en mesfilos aerobios y S. aureus; mientras en E. coli, mohos, levaduras, coliformes totales y fecales mostraron efecto bactericida.
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Varios autores concluyen que el mayor efecto inhibidor de las BAL es debido al pH, por la produccin de cidos orgnicos; principalmente el cido lctico; sobre todo en bacterias Gram+ como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes (Martn et al., 2008, Gutirrez et al., 2008). Sin embargo tambin se ha comprobado que en algunos casos la presencia de las BAL tambin

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inhiben a los patgenos, mientras que un efecto inhibidor diferente al de disminuir el pH y la presencia de las BAL son muy escasas; las llamadas bacteriocinas (Martn et al., 2008). Un pH de 5 es muy desfavorable para el desarrollo de un gran nmero de bacterias patgenos y causantes de alteracin en alimentos como: Salmonella, S. aureus, Listeria spp., L. monocytogenes, Clostridium botulinum, Enterobacteriacea, Enterococcus spp., Pseudomonas, Enterobacter, Micobacterium thermosphactum y E. coli (Martn, 2005).

La disminucin a pH 4 produce una accin bacteriosttica cuando no bactericida sobre la mayora de las bacterias patgenas autctonas y no autctonas del pescado (Perz, 1985; Huss, 1997); sin embargo en el caso de los virus entricos (intestinal; adjetivo medico) todos son resistentes al pH cido, a las enzimas proteolticas y a las sales biliares del intestino (Huss, 1997). Las bacterias patgenas autctonas son los que normalmente se encuentran en el pescado y se encuentran limitadas en su crecimiento a partir de un pH mnimo: C. botulinum 5-4, Vibrio sp. 5, V. cholerae 6, V. parahaemolyticus 4.8, V. vulnificus 5, Aeromonas sp. 4, Plesiomonas sp. 4 y Listeria monocytogenes 5 (Huss, 1997). Las bacterias patgenas no autctonas del pescado son de origen principalmente de aguas residuales o del mal manejo despus de la captura y se encuentran limitadas en su crecimiento a partir de un pH mnimo: Salmonella 4, Shigella 5.5, E. coli 4.4, Staphylococcus aureus 4, Staphylococcus aureus produccin de toxinas 5 (Huss, 1997).

En general la flora bacteriana de los peces es dominada por las bacterias Gram negativas mientras los Gram positivos (como los Bacillus y Lactobacillus) son encontrados en menores proporciones; sin importar si son peces de aguas templadas, tropicales o fras. Los microorganismos se encuentran en todas las superficies externas (piel y branquias) y en los intestinos de los peces vivos saludables y recin capturados; el msculo es estril hasta que el pez muere, el sistema inmunolgico colapsa y las bacterias proliferan libremente. Los microorganismos depende ms del medio ambiente de captura que de la especie; por ejemplo en pescados capturados en aguas contaminadas se encuentra en piel >10 ufc/cm y branquias e intestinos >10 ufc/g (Huss, 1998). La adicin de pequeas cantidades de sal y cido cambia la microflora dominante, de manera que pasa a estar formada principalmente por especies bacterianas Gram positivas (Huss, 1997).
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4.7 Probiticos en acuacultura del camarn

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Una definicin de probitico es suplemento alimenticio microbiano que al administrarse permanecen vivos dentro del hospedador y son capaces de mejorar la salud de este por recuperacin del equilibrio microbiano intestinal (Fuller, 1989; Gatesoupe, 1999). Esta definicin ms concreta fue necesaria por la confusin en el uso del trmino probitico utilizndose en varias ocasiones para referirse a bacterias y algas mejoradoras de la calidad del agua y suelo del cultivo, sin tomar en cuenta el paso por tracto digestivo y el concepto de la colonizacin del mismo en el hospedador. La colonizacin es el proceso por el cual los microorganismos al ingresar al tracto digestivo del hospedador se mantienen viables (Fuller, 1989) siendo tambin importante la capacidad de adherirse y multiplicarse (Gatesoupe, 1999; Zazueta, 2003).

En la acuacultura se haba vuelto de uso comn la utilizacin de antibiticos sin requerirse como una forma de prevencin ante cualquier signo considerado de patgenos. ltimamente se est presentado la tendencia de restringir reducir el uso de antibiticos debido a la transferencia horizontal de factores de resistencia los cuales hacen ms resistentes a los patgenos, su efecto al medio ambiente creando problemas ecolgicos, por las restricciones en las exportaciones debido a la presencia de residuos en los tejidos de camarones y su incidencia en la salud humana (Alday, 1999).

Los probiticos son una alternativa prometedora al uso de antibiticos, reduciendo las posibilidades de colonizacin y desarrollo de potenciales bacterias patgenas, bajo el principio de exclusin competitiva (Fuller, 1989; Gatesoupe, 1999). La exclusin competitiva es un mecanismo de proteccin que ayuda al hospedador y es una propiedad que se puede investigar in vivo (huspedes en el hospedador), con el fin de demostrar la capacidad probitica de las bacterias en estudio. Los autores mencionados sugieren que en este mecanismo est involucrada la produccin de compuestos antimicrobianos (antagonismo), la competicin por nutrientes por sitios de adhesin. La propiedad antagnica tambin ha sido estudiada en pruebas de desafi in vitro (patgeno versus probitico); este proceso generalmente se debe a la produccin de antibiticos, bacteriocinas, siderforos, lizosimas, enzimas digestivas (proteasas) y cidos orgnicos. Otro mecanismo de accin de los probiticos que ayudan al hospedador es estimulando el sistema inmune (Fuller, 1989). La propiedad antagnica disminuye la accin patgena dndole la capacidad al sistema inmune del hospedador para resistir y defenderse de su agresin, atenuando o anulando sus efectos, que generalmente le produciran enfermedad.

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En general existen cuatro formas de obtener bacterias candidatas a probiticos en la acuacultura para ser evaluadas: utilizando las ya reportadas con efecto probitico en animales terrestres (resultados confusos, mencionan Avendao y Riquelme 1999), del agua de mar (Nogami y Maeba, 1992; Direkbusarakom et al., 1997; Rengpipat et al., 1998; Tanasomwang et al., 1998), de los alimentos naturales consumidos por los organismos y de su tracto digestivo (Garca, 2003; Wang et al., fide; Rengpipat et al., 2000).

La mayora de las bacterias aisladas por diferentes autores corresponden al gnero Vibrio. Se han reportado el uso de las siguientes especies: Vibrio alginolyticus (Garriques y Arevalo 1995; Griffith 1995), Vibrio fluvialis y Vibrio campbellii (Wang et al., fide). Tambin se han utilizado cepas de bacillus spp. (Ziaei et al., 2005; Vaseeharan and Ramasamy, 2003; Garca, 2006; Moriarty, 1998; Rengpipat et al., 1998; Rengpipat et al., 2000), levaduras y hongos (Intriago et al., 1998). Y tambin hay que considerar los varios presuntos probiticos; que incluyen todo tipo de microorganismos; citados en el trabajo de Verschuere et al. (2000) lo cual incrementa significativamente el nmero de estudios realizados al respecto.

En el tracto gastro-intestinal de animales terrestres se destacan los Lactobacillus de las BAL y varios son reconocidos como probiticos (Ivar, 2005; Axelsson, 1990). Estudios del tracto digestivo de camarones sanos prueban que las BAL y en particular el gnero Lactobacillus son parte de la flora microbiana natural que se encuentran acompaando al camarn en todos sus estadios de vida y parte de dichas bacterias tienen potencial para usarse como probiticos en la acuacultura (Garca, 2003).

Garca (2006) reporta distintas cepas como potenciales probiticos en camarn blanco LV incluyendo la cepa TD23 utilizada en el presente trabajo. La cepa TD23 en retos in vivo fue la que mejor colonizo el tubo digestivo de camarones de entre otras BAL independientemente de la presencia de Vibrio, tambin se demostr in vivo la interaccin antagnica entre TD23 y Vibrio observando que las UFC de vibrio en general; incluyendo V. Alginoliticus; disminuyen cuando TD23 estuvo presente (independientemente de la salud del camarn). Sealando el autor que ser necesario optimizar la dosis de TD23 para lograr efectos ms significativos.

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Aunque una interaccin antagnica entre las cepas TD23 y Vibrio V22 con concentraciones celulares similares no logra efectos significativos, varios autores sealan que la mayora de las bacterias que asechan a los camarones son oportunistas en espera de que se rompa su equilibrio microbiano intestinal se suprima su sistema inmune (Morales, 2000; Garriques y Arevalo, 1995). Es ampliamente reconocido que los probiticos son capaces de mejorar la salud del hospedador por recuperacin del equilibrio microbiano intestinal (Fuller, 1989; Gatesoupe, 1999).

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5. MATERIALES Y MTODOS

5.1 Elaboracin del EBP

Se elabor ensilado biolgico a nivel laboratorio basado en el mtodo descrito en Ottati et al. (1990) con modificacin. Composicin: 5% de cultivo iniciador, 15% de azcar blanca refinada 0.25% de cido srbico y pescado comnmente llamado cadernal (Paranthias colonus) adquirido en un mercado local. El pescado fue fileteado, lavado con agua fra estril, congelado (-20C por 24h) y triturado en molino de carne con cr de iba 1.5 mm de dimetro. Todos los ingredientes se mezclaron y se colocaron en un contenedor estril, llenado hasta topar con la tapa y cerrado hermticamente. Este permaneci en incubacin a 30C durante 72 horas. El producto resultante se guardo en refrigeracin hasta su utilizacin y anlisis; caractersticas fsicas, qumico proximal, pH, acidez lctica y de viabilidad de las BAL.

La cepa que se utilizo como cultivo iniciador fue la denominada con la clave TD23 esta BAL se encuentra almacenada en caldo MRS (DIFCO) ms 40% de glicerol como crioprotector a -85C, bajo el resguardo del Laboratorio de Ciencia y Tecnologa de Alimentos del rea Interdisciplinaria de Ciencias Agropecuarias de la UABCS. La cepa fue reactivada al 1% en caldo MRS (DIFCO) (Anexo 1) incubando a 30C de 12 a 24 horas, posteriormente se inoculo por estra cruzada en Agar Rogosa (DIFCO) (Anexo 1) incubando a la misma temperatura y periodo de tiempo en condiciones anaerbicas, posteriormente se tomo una colonia aislada para inocular caldo MRS incubando a 30C hasta la fase de crecimiento logartmica mxima (aproximadamente 12 horas, 10 UFC/ml). El paquete celular fue recuperado centrifugando a 3500 rpm por 5 minutos a 4C; lavando 2 veces con buffer de fosfatos (PBS)(Anexo 1) estri y centrifugando nuevamente l en las mismas condiciones, El paquete celular fue resuspendido en PBS al mismo volumen inicial. Esta suspensin se adiciono al resto de los ingredientes.
9

Parte del ensilado obtenido se liofilizo en un equipo marca Labconco a un vaci de 133X10

-3

mBAR y

temperatura de -40C El producto resultante se moli en un mortero, hasta obtener un polvo fino el cul se . guardo en bolsas de plstico y en refrigeracin hasta su utilizacin y anlisis; igual que el ensilado fresco.

44

5.2 Anlisis del EBP

Anlisis sensorial: color, olor y consistencia. Determinacin del pH. Mediante un potencimetro con 1 g de muestra en 5 ml de agua destilada. Acidez total titulable (expresado como porcentaje de cido lctico). 10 g de muestra diluido en 10 ml de agua destilada aadiendo 3 gotas de solucin alcohlica fenolftalena y titulado con hidrxido de sodio 0.1N.

Anlisis qumico proximal:

S Protena cruda: Se determino por triplicado en un d


factor de conversin 6.25

LJHVWRU \ GHVWLODGRU PDUFD % FKL PRGHORV .

-424 y B-

324 respectivamente por el mtodo Kjeldahl (A.O.A.C., 2002). Usando 0.5 g de muestra por tubo y como

S Lpidos (contenido de extracto etreo): Por triplicado en equipo de extraccin


como solvente destilando durante 4 horas.

% FKLPRGHOR%

-811 por el

mtodo de extraccin Soxhlet (A.O.A.C., 2002). Se coloco 1 g de muestra por cartucho y ter de petrleo

S Humedad: Por triplicado por el mtodo gravimtrico (A.O.A.C., 2002), en estufa de aire por conveccin
mecnica, utilizando 1 g de muestra la cul fue colocada en charolas de aluminio (puestas previamente a peso constante), por cuatro horas a 100 C.

S Ceniza: Se coloco 1 g por muestra utilizando crisoles a peso constante, se calcinaron por triplicado en
una mufla (Felisa) a 550 C por 4 horas (A.O.A.C., 2002).

S Extracto libre de nitrgeno (ELN): Medida indirecta de los carbohidratos solubles o digeribles. Calculado
por diferencia del 100% y la sumatoria de los valores porcentuales de humedad, protena, lpidos, ceniza.

S Energa bruta: Calculada por la sumatoria de los productos de los contenidos energticos gruesos
promedios para Carbohidratos 4.1 Kcal/g (17.2 KJ/g), Lpidos 9.5 Kcal/g (39.8 KJ/g) y Protenas 5.6 Kcal/g (23.4 KJ/g); valores tomados de Tacon (1989).

Anlisis de la viabilidad de las BAL. Se realizaron cuentas viables. Se diluyo 1 g de muestra en 9 ml de solucin de PBS al 0.1% las diluciones de 10 hasta 10 se sembraron por vaciado placas con agar Rogosa y se incubaron a 30C de 24 a 48 horas.
-5 -9

45

5.3 Elaboracin de los alimentos

Las dietas experimentales estn basadas en una dieta que cubre los requerimientos nutricionales para camarn blanco LV y que ha sido utilizada y evaluada en el Laboratorio de Nutricin Acucola del CIBNOR. Se realizaron los niveles de inclusin para las dietas experimentales de 0% control interno, 50% ensilado de pescado fresco (50% EBP), 50 y 100% ensilado de pescado liofilizado (50% EBPL y 100% EBPL) en reemplazo de la cantidad de protena proveniente de la HP. Las operaciones de reemplazo se efectuaron en una hoja de clculo (Excel MC) de acuerdo a la composicin qumica proximal de los ingredientes. La ecuacin utilizada para calcular la cantidad de nutriente aportado por el ingrediente en la dieta (NiD): NiD = (Ni) (iD) / 100; donde: Ni porcentaje del nutriente en el ingrediente iD porcentaje que constituye el ingrediente en la dieta; ambas en BH. La ecuacin utilizada para convertir el contenido de nutrientes de base seca (BS) a base humedad (BH): BH = (BS) (MS) / 100. La materia seca (MS) fue calculada mediante la siguiente ecuacin: MS = 100 (Humedad). Detalles de las dietas vase anexo 2.

La elaboracin de los alimentos peletizados se realizo en el Laboratorio de Nutricin Acucola del CIBNOR y su preparacin se llevo a cabo segn la metodologa descrita en Goytorta, (1993). Se inicio tamizando las harinas (de pescado, trigo y soya) a travs de una malla de 0.25 mm, despus se pesaron las cantidades requeridas, luego se mezclan por separado los macro ingredientes (MI) y micro ingredientes (mi); mezclando ambos posteriormente. En seguida se mezclaron los micro ingredientes lquidos (mil) junto con el antioxidante Butyl-hydroxy-toluene (BHT); mezclando todo despus. En el caso del EBP fresco por su alto contenido de humedad se aadi al final. Durante la mezcla final se le fue aadiendo agua de a poco hasta conseguir la consistencia adecuada (no arenoso al tacto ms similar a una masa; alrededor de 50% del peso de los ingredientes en agua aadida, excepto 50% EBP con 30%). El pellet se obtuvo en un molino de carne con salida de 2 mm de dimetro dando dos pasadas por l, una rpida y otra lenta, las tiras se cortaron manualmente mediante una esptula; verificando que la superficie fuera lisa y no presentara escamaciones. Los pellets con inclusin de ensilado fueron secados en un horno elctrico a 37C por 48 horas, para el control interno a 60C por 24 horas. Finalmente los alimentos fueron empacados en bolsas plsticas, cerradas y puestos en refrigeracin hasta su uso y anlisis.

46

5.4 Anlisis de los alimentos

Anlisis qumico proximal: Protena cruda (A.O.A.C., 2002), Lpidos (A.O.A.C., 2002), Humedad (A.O.A.C., 2002), Ceniza (A.O.A.C., 2002), ELN y Energa. Detalles vase seccin 5.2 Anlisis del EBP. Determinacin del pH. Mediante un potencimetro con 1 g de alimento molido en 3 ml de agua destilada. Anlisis de la viabilidad de las BAL. Se efectuaron como se describe en la seccin 5.2 Anlisis del EBP.

Anlisis de estabilidad de los alimentos. Se realizaron pruebas de prdida de materia seca; PMS% = (antes de lixiviar despus de lixiviar) * 100 / (antes de lixiviar), alimento en BS; y capacidad de absorcin de agua; CAA% = (despus de sumergir antes de sumergir) * 100 / (antes de sumergir), alimento en BH; con 1 g de muestra, en agitacin constante (aproximadamente 2 Hz) en tubos falcn con 20 ml de agua de mar sinttica (Anexo 1) a 28C, con tiempos de inmersin de 1 y 3 horas por triplicado.

5.5 Evaluacin de los alimentos en juveniles de camarn blanco

Condiciones y parmetros para los bioensayos. Los camarones juveniles fueron proporcionados por la empresa acuacultura Mahr los cuales fueron transportados hasta la unidad Pichilingue de la UABCS y mantenidos en un tanque de 5000 litros con aireacin y alimentacin comercial por 3 das como aclimatizacin. Los bioensayos se llevaron a cabo en el rea de peces de dicha unidad utilizando tanques de 150 litros llenados con 100 litros de agua de mar. El agua utilizada fue pasada por dos filtros de arena, filtros de cartucho de 15 hasta 1 m y luz ultravioleta. La aireacin fue suministrada por la bomba de aire de la unidad; a travs de tuberas de polietileno con llaves de regulacin y difusores en cada tanque. La iluminacin fue natural e indirecta y temperatura ambiente. El experimento se efectu con un diseo completamente aleatorio. Los tratamientos constan de las 3 dietas experimentales, un control interno y otro externo (dieta comercial) racionado de 9, 12, 15 y 18 horas. Tambin se llevo otro tratamiento con el control externo con alimentacin automtica racionando a cada hora. La alimentacin inicial fue al 10% del peso de la biomasa; despus a saciedad. Cada tratamiento se evalo por triplicado con 30 organismos por tanque.

47

Se realizaron recambios de agua diarios al 50% por sifoneo antes de alimentar, ayudando a retirar el material sedimentado. El bioensayo tuvo una duracin de 30 das, en el mes de mayo.

Evaluacin biolgica; atravs de la respuesta nutricional de los organismos: Tasa de sobrevivencia (%); como parmetro de salud; Ts = Nf * 100 / Ni donde: Nf es nmero de organismos final y Ni es nmero de organismos inicial; Ganancia en peso; como parmetro de consumo y crecimiento; Gw = Pf Pi donde Pf es el peso final promedio de los organismos y Pi es el peso inicial promedio de los organismos; porcentaje de peso ganado; %W = Gw * 100 / Pi; y tasa especifica de crecimiento (% / da); Tec = (Ln Pf Ln Pi) * 100 / t donde t es el tiempo total en das.

Anlisis de la viabilidad de las BAL en los organismos. Se realizaron muestreos cada 7 das antes de hacer recambios de agua, un organismos por tratamiento, registrando el peso del organismo previamente secado, posteriormente se enjuago en PBS (0.1%) para realizar cuentas viables, El tubo digestivo se extrajo se homogenizo en 900 l de PBS (0.1%) se hicieron diluciones y se sembraron las de 10 vaciado en placas con agar Rogosa y se incubo a 30 C de 24 a 48 horas.
-5

hasta 10

-9

por

5.6 Anlisis estadstico

Los datos fueron sometidos a una prueba de homogeneidad de varianzas (Chi-cuadrado de Bartlett). Cumplidos los supuestos se procedi a un anlisis de varianza de una va (ANDEVA) y en existencia de diferencias significativas a una prueba de comparacin mltiple de Duncan. No cumplidos los supuestos se llevo a cabo un anlisis de varianza no paramtrico de Kruskal-Wallis (K-W). En todos los casos alfa a 0.05. El programa estadstico utilizado fue Statistica 7.0 de Stat Soft Inc (2004).

48

6. RESULTADOS

6.1 Anlisis del EBP

La Tabla 1 presenta caractersticas fsicas evaluadas sensorialmente, pH, Acidez lctica y de viabilidad de las BAL que presento el EBP (fresco) y el EBPL (liofilizado). El EBP presento un inusual color debido a que no se utilizo melaza como sustrato fermentable para las bacterias; lo que hubiera dado el caracterstico color marrn; si no azcar blanca refinada lo que dejo ver un color amarillo claro en el producto, este color se intensifico al liofilizarse, lo contrario ocurri con el olor ya que el ensilado fresco presentaba un olor dulce cido el cual disminuyo al liofilizarse. El aroma dulce-cido es debido a la produccin de cido lctico por fermentacin microbiana del azcar. La consistencia obtenida en el EBP fue cremosa, la cual al liofilizarse y molerse quedo como polvo. El pH y la acidez lctica entre ambos fueron idnticos. En el EBP fresco el conteo de colonias se obtuvieron alrededor 10 UFC/g de BAL las cuales disminuyeron en dos rdenes al liofilizarse.
9

Tabla 1. Caractersticas fsicas de los EBP Ensilado EBP EBPL Color Amarillo claro Amarillo intenso Olor Dulce cido Dulce cido ligero Consistencia Cremosa Polvo pH 4 4 Acidez lctica % 3.1 3.1 BAL UFC/g 2X10 2X10
9 7

Bello et al. (1993) sealan que el pH es uno de las variables de mayor importancia; ya que refleja el desarrollo del proceso, la calidad del ensilado y manifiesta cualquier cambio que pueda afectar el producto. El descenso del pH a 4 es inversamente proporcional al ascenso de la acidez llegando a 3.1%. Este comportamiento est acorde con el hecho de que la produccin de cido es de naturaleza microbiana y depende de un adecuado contenido de carbohidratos fermentables que son utilizados rpidamente por las BAL en la produccin de cido.

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Existe una correlacin entre el pH y el nitrgeno no proteico, ya que a medida que disminuye el pH, se favorece la actividad proteoltica de ciertas enzimas (pepsina, tripsina), las cuales actan sobre las protenas del tejido muscular del pescado produciendo la hidrlisis (Bello et al., 1993). A medida que transcurre el tiempo (das), el ensilado se va tornando ms lquido. Lo que est estrictamente relacionado con el proceso de solubilizacin de las protenas y el proceso de licuefaccin, consecuentemente a la par del mismo, el nitrgeno comienza a ser soluble (Bello et al., 1993).

La Tabla 2 presenta las caractersticas qumicas proximales del pescado utilizado en la elaboracin del ensilado, del ensilado obtenido, del ensilado liofilizado y de la HP que se utilizo en la elaboracin de la dietas. Esta muestra como el EBP mantiene semejanza proteica al de la materia prima, en cuanto a sus dems propiedades muestra un aumento significativo a excepcin de la humedad. Al liofilizar el ensilado su composicin de protena, lpidos, cenizas, ELN y MS se concentro aproximadamente tres veces (EBPL / EBP) obtenindose as una buena reduccin de peso y volumen; por la eliminacin del agua. En contenido de ceniza y lpidos la HP presento los mayores ndices seguido por el EBPL y este por el EBP.

Tabla 2. Composicin qumico proximal de los principales ingredientes Composicin Humedad % Protena % Lpidos % Ceniza % ELN % EB Kcal/g MS Pescado 82.810.12 14.460.12 0.790.14 0.550.06 1.400.10 5.200.03 EBP 68.310.49 14.040.17 2.330.05 1.210.07 14.110.07 3.760.03 EBPL 4.320.21 38.700.01 7.610.49 4.330.50 45.040.13 4.870.05 HP 1.700.61 64.830.42 10.940.09 16.480.05 6.060.12 5.000.08

Resultados expresados en base hmeda. Promedio desviacin estndar. ELN extracto libre de nitrgeno. EB energa bruta. MS materia seca.

El EBP debera presentar 71.40% en humedad; humedad del pescado 66.25% (80 * 82.81 / 100; donde: 80 cantidad de pescado en el EBP y 100 = 82.81% humedad del pescado) + inoculo 5.0% (suponiendo 0% MS);

50

sin embargo la humedad obtenida en el EBP fue de 68.31% lo que da una leve diferencia entre las cifras de apenas 3.09% (71.40 68.31; en contra de la humedad obtenida); parte del 3% contiene error de clculo; lo que demuestra que en realidad no hay una cantidad significativa de agua perdida en el proceso. La disminucin en el porcentaje de la humedad entre el pescado y el EBP es debido principalmente al azcar por ser hidrosoluble altera el contenido de agua y posiblemente hay una insignificante perdida de humedad menor al 3% a causa del congelamiento del pescado y su respectiva trituracin en el molino de carne.

El EBP debera presentar 11.57% en protena (80 * 14.46 / 100; donde: 80 cantidad de pescado en el EBP y 100 = 14.46% protena del pescado) sin embargo la protena obtenida en el EBP fue de 14.04% lo que da una leve diferencia de apenas 2.47% (14.04 11.57; a favor de la protena obtenida). El EBP debera mostrar una cantidad de protena un poco menor o aparentemente igual al de 11.57% por que las bacterias hacen uso de las protenas para su crecimiento. Sin embargo tambin hay que tomar en cuenta el error entre las cifras obtenidas (2.47%), adems de que el mtodo de determinacin de protena tambin incluye a las mismas bacterias; por lo que una pequea porcin de protena debe provenir de las BAL y consecuentemente no estar completamente disponible en el alimento. Sin embargo los clculos de sustitucin de protena en las dietas se realizaron en base a una protena de 15.6% del EBP (14 + 1.6; donde: protena EBP + porcentaje en base al error entre las cifras).

El contenido de lpidos en el EBP son muy altos respecto a lo determinado en el pescado; sin embargo en el EBP el pescado se encuentra bien homogenizado por la trituracin en el molino por lo que su resultado debe ser ms representativo; mientras que en el pescado las muestras fueron tomadas sobre el filete de este. En el contenido de ceniza del EBP el pescado solo aporta el 0.44% (80 * 0.55 /100; donde: 80 cantidad de pescado en el EBP y 100 = 0.55% ceniza del pescado) menos lo obtenido de ceniza en el EBP 1.21% se obtiene una diferencia de 0.77% lo que posiblemente es ceniza aportada por la azcar.

Se requiri de aproximadamente 0.80 unidades de pescado para obtener una unidad de EBP con un porcentaje de protena de 14% y altos niveles de humedad, 68%. Mientras que en el caso de la HP presento un porcentaje de protena cerca de 65%; un valor prximo a una harina de calidad como es sealado en Kjos (2001) y Akiyama y Dominy (1989); y un porcentaje de lpidos de casi 11%; donde el 10% de lpidos en la HP

51

se considera el lmite mximo para que tenga una buena calidad porque un valor mayor anuncia menor palatabilidad y menor crecimiento en camarn (Ricque et al., 1996) y niveles de humedad muy bajos 1.7%.

Al calcular cunto se requiere de EBP para la misma cantidad de protena de la HP se obtiene 4.62 veces ms ensilado (64.83 HP / 14.04 EBP). Al comparar la materia prima requerida para una entrada de protena igual al de la HP se obtiene que el EBP solo utiliza 3.67 unidades (0.80 * 4.62; cantidad de pescado en una unidad de EBP por EBP requerido para obtener la misma cantidad de protena de la HP). Mientras Tornes (1973) y Rodrguez et al. (1996) reportan de 4 a 4.5 y de 5.5 a 6 unidades de materia prima para fabricar una unidad de HP; respectivamente.

Dado que se mantiene semejanza proteica entre el pescado y el EBP se podra pensar que el EBP al deshidratarse se obtendra aproximadamente la misma cantidad de protena al de la HP, no obstante se observa en la Tabla 2 una gran diferencia de 26.13% en protena a favor de la HP (64.83 HP 38.70 EBPL); ya que el contenido de humedad entre ambos son muy bajos la diferencia debera ser mnima. Esto es debido a que el azcar ocupa una porcin importante en la composicin del EBPL por lo que para obtener una cantidad de protena igual al de la HP se requiere 1.67 unidades de EBPL (64.83 HP / 38.70 EBPL). Sin embargo la MS se concentro al liofilizarse 3.02 veces (95.68 EBP / 31.69 EBPL; donde: ambos MS) por lo que se deba obtener 42.12% de protena en el EBPL (14.04 * 3.02; donde: protena en el EBP por veces en que se concentro la MS) sin embargo se obtuvo 38.70% dando una leve diferencia de apenas 3.42% (42.12 38.70). Observada la diferencia entre ambas cifras y las posibles complicaciones que puede presentar como sucedi en el EBP, los clculos de sustitucin de protena en las dietas se realizo en base a una protena de 46.30% en el EBPL (42.1 + 2.6 + 1.6; donde: protena estimada EBPL + error entre cifras + error utilizado en el EBP).

Dado que el EBPL contiene 3 veces la MS del EBP tambin debera presentar lo triple en UFC/g de BAL esto es 6X10 (3 * 2X10 ); sin embargo solo presenta 2X10 UFC/g dos rdenes por debajo del EBP como se observa en la Tabla 1.
9 9 7

52

6.2 Anlisis de los alimentos

Las mediciones de pH y UFC de BAL en los alimentos se muestran en la Tabla 3. Se puede observar la disminucin del pH dada en las dietas conforme se incrementa la inclusin del EBP. Las UFC de BAL se muestran cercanas entre 50% EBP y 50% EBPL; sin embargo en 100% EBPL no se obtuvo lo esperado por problemas durante el secado del alimento en el horno elctrico sufriendo una sobre exposicin de calor a 60C dejndolo tan solo con 10 UFC/g de BAL.
2

Tabla 3. pH y UFC de BAL en los alimentos Alimento Control interno 50% EBP 50% EBPL 100% EBPL Control externo pH 6.74 5.46 5.67 4.86 5.99 BAL UFC/g 0 5x10 1x10 1x10 0
5 5 2

En el alimento 50% EBP se utilizo 66.87% de EBP (en BH) y cada gramo de EBP contiene 2x10 UFC/g de BAL; por lo que un gramo de alimento debera contener en BAL 1.3x10 UFC/g (2x10 UFC/g * 0.6687). Sin embargo contiene 5x10 UFC/g en BAL; 4 ordenes logartmicas menos de lo que debera contener; significa que hubo una alta mortalidad de BAL. Posiblemente este alimento tambin sufri variaciones drsticas de temperatura durante el secado del pellet afectando la viabilidad de las BAL.
5 9 9

En el alimento 50% EBPL se utilizo 22.57% de EBPL (en BH) y cada gramo de EBPL contiene 2x10 UFC/g de BAL; por lo que un gramo de alimento debera contener en BAL 4.5x10 UFC/g (2x10 UFC/g * 0.2257). Sin embargo contiene 1x10 UFC/g en BAL cayendo solo 1 orden logartmica de lo que debera contener; significa que hubo una buena sobrevivencia de BAL.
5 6 7

53

En el alimento 100% EBPL se utilizo 47.13% de EBPL (en BH) y cada gramo de EBPL contiene 2x10 UFC/g de BAL; por lo que un gramo de alimento debera contener en BAL 9.4x10 UFC/g (2x10 UFC/g * 0.4713). Sin embargo contiene 1x10 UFC/g en BAL cayendo 4 ordenes logartmicas de lo que debera contener; significa que hubo una alta mortalidad de BAL. Este alimento sufri una sobre exposicin de calor a 60 C durante el secado del pellet.
2 6 7

La composicin qumico proximal de los alimentos se presenta en la Tabla 4. En esta se observa que la humedad vario entre ellos presentndose solo una similitud entre el control interno y 50% EBPL. El nivel de protena no muestran diferencias significativas (P>0.05) entre las dietas a excepcin del control externo que supero a los dems y presenta similitud con 50% EBPL. En cuanto a sus niveles de lpidos no hay diferencias significativas (KW); sin embargo el mayor porcentaje lo presento el control interno seguido por 50% EBP, 50% EBPL, control externo y el menor 100% EBPL. El contenido de ceniza fue diverso presentando los controles los mayores porcentajes. En ELN solo se presento similitud entre los controles y 50% EBP. La energa bruta se presento homognea. La relacin protena-energa se encuentran en valores brutos presentndose solo similitud entre el control interno y 50% EBPL.

Tabla 4. Composicin qumico proximal de los alimentos Composicin Humedad % Protena % Lpidos % Ceniza % ELN % EB Kcal/g MS PC/EB mg/Kcal Control interno 3.140.01 a 33.580.48 a 8.771.70 a 9.380.01 a 46.752.12 a 4.680.12 a 71.971.04 a 50% EBP 6.680.37 b 34.010.57 ab 7.620.83 a 7.480.02 b 47.500.12 a 4.600.06 a 73.631.91 b 50% EBPL 3.160.28 a 33.130.03 a 7.500.28 a 7.290.08 c 50.440.44 b 4.640.01 a 71.400.10 a 100% EBPL 4.500.57 c 32.101.50 a 6.360.20 a 5.030.10 d 53.971.61 c 4.620.04 a 69.552.69 c Control externo 5.600.11 d 36.100.49 b 7.200.10 a 8.770.07 e 45.250.34 a 4.570.02 a 78.701.01 d

Resultados expresados en base seca. Promedio desviacin estndar. Letras iguales entre columnas sugieren que no existen diferencias significativas (P>0.05). ELN extracto libre de nitrgeno. PC protena cruda. EB energa bruta. MS materia seca.

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La dieta control debera presentar 35% de protena sin embargo solo se obtuvo en los anlisis 33.58% una diferencia de apenas 1.42% (35 33.58). Para que una dieta tenga xito nutricional, adems de estar balanceada debe presentar una serie de propiedades, tales como tamao de las partculas, estabilidad en el agua, ser atrayente y de buena apetencia (Lista y Velasquez, 2003).

La estabilidad del alimento se define como la perdida de materia seca en el agua. La determinacin de la estabilidad de los alimentos (Tabla 5) dio como resultado que a mayor inclusin de ensilado mayor PMS y CAA. Los controles obtuvieron la menor PMS y altos porcentajes en CAA. Los resultados obtenidos durante la primera hora de inmersin se mantuvieron prximos a los obtenidos en la prueba de tres horas de duracin.

La CAA se pude malinterpretar como que el alimento absorbi menos agua sin considerar la PMS.; por esto se deben evaluar en conjunto (Cruz et al., 2002). Un ejemplo drstico fue lo sucedido en el alimento 100% EBPL que aunque resulto con CAA de 73.3% llego a una PMS de 25.1%. Comparando los alimentos de 50% EBP y 50% EBPL en CAA se observan diferencias drsticas, mientras que en PMS se mostraron prximos.

Tabla 5. Estabilidad de los alimentos en el agua Alimento Control interno 50% EBP 50% EBPL 100% EBPL Control externo CAA% 1H 77.420.87 a 66.780.85 b 81.410.63 c 73.300.24 d 100.492.11 e CAA% 3H 91.480.74 a 68.642.55 b 82.010.65 c 73.910.64 d 105.480.70 e PMS% 1H 8.140.51 a 14.190.09 b 15.580.44 c 25.100.11 d 11.090.34 e PMS% 3H 10.260.07 a 15.920.53 b 16.850.82 b 25.190.65 c 13.010.52 d

Promedio desviacin estndar. Letras iguales entre filas sugieren que no existen diferencias significativas (P>0.05). CAA capacidad de absorcin de agua; PMS perdida de materia seca. 1H y 3H duracin en horas de cada prueba.

55

6.3 Evaluacin de los alimentos en juveniles de camarn blanco

No se observaron rechazos en ninguno de los tratamientos por la dieta suministrada. Durante el experimento la tasa de sobrevivencia de los camarones fue de 100%. La Tabla 6 muestra los resultados de la evaluacin biolgica. Entre los tratamientos no se detectaron diferencias significativas (p<0.05) en peso inicial, peso final y en peso ganado; Sin embargo 50% EBP presento el mayor porcentaje seguido de cerca por 100% EBPL, Control externo, 50% EBPL y por ltimo el Control interno; Este resultado no es decepcionante ya que al parecer el EBP ofrece resultados anlogos al de la HP.

Tabla 6. Resultados de la evaluacin biolgica Tratamiento Control interno 50% EBP 50% EBPL 100% EBPL Control externo Control externo 1h Peso inicial g. 0.110.049 0.080.042 0.120.072 0.110.049 0.100.034 0.090.029 Peso final g. 0.470.133 0.420.159 0.510.149 0.590.139 0.480.093 0.400.067 % Peso ganado 374.64123.651 487.7987.199 377.86170.507 480.09156.994 417.63108.964 373.3569.597 TEC % / da 5.120.820 5.880.519 5.051.341 5.780.895 5.430.693 5.160.514

Promedio desviacin estndar. TEC Tasa especifica de crecimiento. 1h Alimentacin a cada hora.

La tasa especfica de crecimiento (TEC) es un indicador bastante sensible de la calidad protenica; denota el crecimiento promedio por da en trminos de porcentaje suponiendo que el incremento en peso es de forma exponencial; as bajo condiciones controladas la ganancia en peso est en proporcin a los aminocidos esenciales suministrados. (Rosas et al., 2000).

En la Tabla 7 se muestra la sobrevivencia de las BAL en los organismos en donde los muestreos hechos entre los controles reportaron crecimiento cero revelando que no hubo contaminacin entre tratamientos. La viabilidad de las BAL en los organismos fue acumulativa pero distinta en cada tratamiento. El tratamiento 50% EBP en el ultimo muestreo alcanzo el orden 10 contenido en el alimento por gramo originalmente, lo
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cual no fue alcanzado por el 50% EBPL que solo llego a 10 . En el caso de 100% EBPL no se obtuvo crecimiento en las cuantas viables; indicando las UFC en el alimento no fueron suficientes para permanecer detectarse en los organismos.

Tabla 7. Sobrevivencia de las BAL en UFC de los organismos Tratamiento Control interno 50% EBP* 50% EBPL 100% EBPL* Control externo Muestreo. 1 0 8.4X10 4.2X10 0 0
1 1

2 0 1.4X10 3.1X10 0 0
4 1

3 0 1.2X10 2.0X10 0 0
4 1

4 0 1.8X10 7.5X10 0 0
5 2

Lapso entre muestreos 7 das. * Sobre exposicin de calor a 60 C

La Tabla 8 muestra la sobrevivencia de las BAL expresados en UFC/g del organismo. Dado que el tubo digestivo fue extrado para homogenizar y realizar las cuentas viables; con las puras UFC no se tiene suficiente informacin para lograr una adecuada comparacin entre los tratamientos; es por ello que se recurri a dividir las UFC entre el peso de los organismos que se muestrearon.

Tabla 8. Sobrevivencia de las BAL en UFC/g del organismo Tratamiento Control interno 50% EBP* 50% EBPL 100% EBPL* Control externo Muestreo 1 0 6.0 X10 2.1 X10 0 0
2 2

2 0 5.6 X10 1.4 X10 0 0


4 2

3 0 3.5 X10 5.7 X10 0 0


4 1

4 0 3.4 X10
5

1.1 X10 0 0

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7. DISCUSIONES

7.1 Anlisis del EBP

Se elaboro EBP a nivel laboratorio basado en el mtodo descrito en Ottati et al. (1990) el cual se distingue por utilizar cultivo iniciador y no usar fruta. Las caractersticas de olor, consistencia, pH y acidez lctica del ensilado obtenido concuerdan con varios trabajos reportados; inclusive con los de otros mtodos biolgicos; (Ottati y Bello, 1990ab; Cordova et al., 1990; Guevara et al., 1991; Martnez et al., 1991; Meire et al., 2002; Gonzlez y Marn, 2005; Plascencia et al., 2002; Nwanna, 2003; Torres 2007). La nica variacin que presento es debido al color ya que no se utilizo melaza; lo que hubiera dado el caracterstico color marrn; si no azcar blanca refinada lo que dejo ver un color amarillo en el producto. La azcar como sustrato fermentable para las bacterias ya haba sido utilizado por Lessi (1994) y Plascencia et al. (2002) en sus formulaciones (alrededor del 10%) obteniendo excelentes resultados; y tiene igual aceptacin que la melaza en plantas industriales de EBP (Parin y Zugarramurdi, 1994). Sin embargo el mtodo de elaboracin del EBP utilizaba 15% de melaza originalmente (Ottati et al., 1990). La melaza de caa es un subproducto de la manufactura o refinado de la sacarosa de la caa de azcar; esta contendr alrededor de 50% en azcar total (Tacon, 1989). Tomando en cuenta esta informacin se debi utilizar alrededor de 7.5% de azcar refinada; dejando as ms espacio para la protena. Sin embargo es recomendable hacer una optimizacin del azcar que se debe agregar al ensilado.

En las cuentas de las BAL en el EBP y EBPL se obtuvieron reducciones por los ordenes reportados por Torres (2007) (10 y 10 UFC/gr respectivamente) utilizando esta misma cepa como cultivo iniciador pero en formulaciones de ensilados con uso de frutas. La BAL TD23 se ha destacado por su potencial probitico en camarones LV y se ha identificado molecularmente presentando 99% de identidad con la especie Lactobacillus plantarum AB102857 ya reportada anteriormente como probitico potencial (Garca, 2006). Aunque varios Lactobacillus son reconocidos como probiticos, el Lactobacillus Plantarum se destaca sobre todo por su actividad antimicrobiana asociada con cidos orgnicos y productos finales del metabolismo (Ivar, 2005; Axelsson, 1990; Garca, 2003). El Lactobacillus plantarum es una de las bacterias preferidas por
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un gran nmero de investigadores en la elaboracin de EBP inoculado (Ottati et al., 1990; Bello, 1994; Bello et al., 1993; Berenz, 1994; Parin y Zugarramurdi, 1994; Borghesi et al., 2007, Cordova et al., 1990; Fagbenro et al., 1997; Fagbenro y Jauncey, 1998; Meire et al., 2002; Nwanna, 2003; Torres, 2007). Sin embargo en ninguno de estos trabajos se utilizaron cepas autctonas con potencial probitico de los organismos para incluirse y probarse en la dieta.

El EBP con uso de frutas ha sido utilizado por varios autores; Cordova et al. (1990), Reyes et al. (1991), Bello et al. (1993), Gonzlez y Marn (2005) y recientemente por Torres (2007); todos utilizando los mismos ingredientes a adicionar al pescado triturado en cantidades similares. El uso de frutas es con el propsito de acelerar el proceso de hidrlisis. Sin embargo las cantidades utilizadas (generalmente de 10 a 15%) dejan menos espacio para el pescado dando una disminucin en el contenido de protena del EBP obtenido en comparacin con un EBP sin fruta; como sucedi en comparaciones realizadas por Gonzles y Marn (2005) y en Cordova et al. (1990).

La composicin qumica proximal del EBP obtenido es comparable al de otros trabajos. Padilla et al., (1996) explica que la utilizacin de diferentes tcnicas y materias primas utilizadas (especie de pescado, poca de captura y tipo de residuos) en la elaboracin de los EBP, muestran mucha divergencia en su composicin. Lo anterior concuerda con varios trabajos donde los EBP muestran elevadas cantidades de agua desde 60 hasta 80%, porcentajes de protena bruta desde 12 hasta 19%, lpidos alrededor del 5% pero abarcando desde 1 hasta 15%, valores calricos que en promedio aportan alrededor de 1.80 kcal/g; pudiendo alcanzar 5 kcal/g; y carbohidratos por alrededor del 10%; pudiendo alcanzar 20% (Balsinde et al., 2003; Cordova et al., 1990; Gonzles y Marn, 2005; Mattos et al. 2003; Nwanna, 2003; Plascencia et al., 2002; Bello, 1994; Parin y Zugarramurdi, 1994, Lessi et al., 1992; Lessi, 1994; Padilla et al. 2000; Padilla et al., 1996).

La liofilizacin; a comparacin de otros mtodos de deshidratacin; es un mtodo de conservacin de largo plazo en microbiologa (microorganismos viables por 10 aos ms), no altera las propiedades nutritivas y organolpticas, concentra la protena y facilita su almacenaje. Pero los gastos de la liofilizacin suelen ser unas cuatro veces mayores que en el caso de la deshidratacin por horno. Sin embargo es prctico para la

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transportacin de la cepa y su correspondiente uso como cultivo iniciador en la produccin de EBP tanto a nivel artesanal como a escala industrial.

Diversos autores han demostrado que el EBP es factible de almacenar por perodos prolongados de tiempo a temperatura ambiente (mayores a 6 meses sin requerir de refrigeracin) sin que se reduzca su valor nutricional ni la calidad higinica (Kjos, 2001; Bello, 1994). Sin embargo por su alto contenido de agua hace difcil su almacenaje y transportacin. En el mejor de los casos la liofilizacin del ensilado hizo que su protena se concentre aproximadamente 3 veces respecto al ensilado fresco; valor aproximado a los ensilados deshidratados en estufa de aire forzado de Gonzlez y Marn (2005) que estuvieron alrededor de las 3.3 veces de concentracin de protena respecto a su ensilado fresco.

La cantidad de EBP necesario para obtener la misma cantidad de protena de la HP (4.62 veces) est acorde a lo reportado por Parin y Zugarramurdi (1994) (4 veces). Cifras ms optimistas reportan que la relacin de reemplazo del EBP (elaborado con residuos) por la HP en dietas de animales es de 3 a 1 (3 Kg. de ensilado por Kg. de harina), pero que si se tratara de un ensilado integral (usando todo el pescado como resulta en el proceso de HP), la relacin es de 2 a 2.5 unidades de ensilado por unidad de harina (Balsinde et al., 2003).

El EBP requiri 3.67 unidades de materia prima para una cantidad de protena igual a la de HP; aproximadamente lo reportado por Tornes (1973) y Rodrguez et al. (1996). Estos investigadores encontraron que para fabricar una unidad de HP se requiere de 4 - 4.5 y de 5.5 - 6 unidades de materia prima respectivamente. Sin embargo se necesitan realizar anlisis ms objetivos dada la diferencia de especies utilizadas como materia prima en cada producto. Adems de que en Mxico generalmente las harinas de pescado se fabrican a partir de subproductos de pescado y pocas son de pescado de buena calidad (Gutierrez, 2002). Tambin el mal manejo y el sobreprocesamiento que sufren en las plantas reductoras son causas de perdidas en su rendimiento y de protenas.

No obstante dado que el EBP conserva la protena presente de la materia prima es lgico que la cantidad de EBP necesario para obtener la misma cantidad de protena que la HP sea semejante a la materia prima

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requerida para fabricar una unidad de HP. Esto puede explicar las coincidencias que se observan entre diversos autores; Tornes (1973), Parin y Zugarramurdi (1994) y el presente trabajo. Dado lo anterior posiblemente no exista protena conservada en el EBP en comparacin con la reduccin a HP; ya que para obtener la misma cantidad de protena ambos mtodos utilizaran la misma cantidad de materia prima. Sin embargo la forma de obtener la protena es lo importante. El EBP en comparacin con la HP se obtiene con una tecnologa simple y de baja inversin que minimiza los efectos de la contaminacin ambiental, sumando adems ventajas nutricionales para los productos que lo incluyen en su formulacin (Nwanna, 2003; Parin y Zugarramurdi, 1994; Balsinde et al., 2003).

La protena de la materia prima conservada en el EBP ha sido una de las caractersticas ms sealada por varios autores (Berenz, 1994; Gonzles y Marn, 2005; Meire et al., 2002) y ha sido nombrada por muchos como el sustituto perfecto de la HP (Balsinde et al., 2003; Bello, 1994; Parin y Zugarramurdi, 1994; Meire et al., 2002; Nwanna, 2003; Berenz, 1994).

El EBP con probiticos confiere por su forma de produccin y su contenido de compuestos antimicrobianos antagonismo contra Vibrio y una fuente de protena de excelente calidad convirtindolo en un alimento funcional por sus funciones adicionales a las de su valor nutritivo. El uso de EBP con bacterias probiticas en bioensayos permitir conocer sus niveles de inclusin en el alimento de LV, cuya finalidad es la de lograr un mejor crecimiento, disminuir anular el uso de tratamientos contra enfermedades, incrementando la rentabilidad del cultivo, y as lograr el aprovechamiento de esta tecnologa para su uso en la acuacultura.

7.2 Anlisis de los alimentos

Los alimentos presentaron una disminucin del pH conforme se incrementa la inclusin del EBP. Esto es normal debido al cido lctico presente en el EBP (pH 4). Cruz (1996) seala que en los crustceos la acidez del sistema digestivo es mnima, ya que el pH es aproximadamente 5 7. El alimento 100% EBPL tuvo el menor pH con 4.86 mientras que el mximo fue con el Control interno alcanzando un pH de 6.74. El alimento comercial (Control externo) presento un pH de 5.99; lo que vendra siendo la acidez media del sistema digestivo en los crustceos. Las cuentas de las BAL en los alimentos muestran que 50% EBP y 50% EBPL

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estn en el mismo orden 10 UFC/g pero en 100% EBPL solo se obtuvo 10 UFC/g; los alimentos 50% EBP y 100% EBPL sufrieron una sobre exposicin de calor a 60 durante el secado del pellet. C

Las raciones que poseen un elevado contenido de humedad (>10%) las hace propensas al ataque microbiano (Tacon, 1989). Los niveles de humedad en dietas comerciales varan desde 6.4 a 8.4% (Cruz et al., 2002). El alimento 50% EBP es el nico que se encuentra dentro de este rango, mientras que los dems alimentos incluyendo controles contenan porcentajes por debajo de 5.6% en humedad.

Los niveles de protena en los alimentos variaron desde 33 hasta 36%; muy prximos al 33.5% en el cual estara alrededor de este, el nivel optimo de protena en dietas para camarones LV (Tacon, 1989; Kureshy y Allen, 2000). Aunque muchos alimentos comerciales para camarn usados en Mxico contienen aproximadamente 35%; pero abarcan desde 34.8 a 40% (Cruz et al., 2002).

Los niveles de lpidos en los alimentos variaron desde 6 hasta 9%. Se ha mencionado que los niveles de lpidos recomendados en los alimentos comerciales para camarones deben estar en un intervalo de 6,0 a 7,5% y que no deben excederse del 10%, ya que valores por encima influyen en la reduccin del crecimiento (Lista y Velsquez, 2003). La mayora de los alimentos comerciales contienen 8%; con rangos de 5.8 a 12.4% (Cruz et al., 2002).

En lo referente al contenido de ceniza los alimentos presentaron niveles por debajo a los mximos recomendados (15%); este valor es importante porque un exceso tiende a disminuir la digestibilidad de los alimentos (Cruz et al., 2002). La mayora de los alimentos comerciales contienen 9%; con rangos de 7 a 10.4% (Cruz et al., 2002). Los niveles de carbohidratos (ELN) en los alimentos superan los recomendados por Cruz (1996) de 30 a 40% incluso por los controles. En este rango se mantienen la mayora de los alimentos para camarn usados en Mxico con un promedio de 34% (Cruz et al., 2002). El contenido energtico grueso de las dietas se aproximaron al que varios autores aseveran estara el nivel optimo de energa para camarn; 4 Kcal/g (Cruz et al., 2002; Cruz, 1996; Alvarez et al., 2003). Sin embargo la mayora de los alimentos comerciales para camarn usados en Mxico se mantienen entre 4.6 a 5 Kcal/g (Cruz et al., 2002).

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Para camarn L. vannamei la relacin protena-energa de 67 mg/Kcal digestible ( 14.92 Kcal/g protena digestible) (24% y 3.6 Kcal/g) es sealada como ptima en medio controlado y en ausencia de produccin natural (Cruz et al., 2002). Una aproximacin a la relacin de 67 mg/Kcal protena-energa digestible a valores brutos se obtendra 74 mg/Kcal (34% y 4.6 Kcal/g). De acuerdo a Cruz et al. (2002) la protena y la energa disponible es en promedio 10 puntos y un punto menor respectivamente a valores digestibles; cifra aproximada a lo encontrado por Kureshy y Allen (2000) de 79.6 mg/Kcal protena-energa bruta (32% y 4.02 Kcal/g) que para camarn L. vannamei indujo mayor crecimiento. Aunque los datos obtenidos en las dietas evaluadas efectivamente estn alrededor de las cifras sealadas es necesario que se confirmen con pruebas de digestibilidad; ya que estas estimaciones no son totalmente efectivas.

La estabilidad de los alimentos muestran que a mayor inclusin de ensilado mayor PMS y CAA. La perdida sucedi durante la primera hora de inmersin. Lo mismo se dio en Gonzlez et al. (2007) y Nwanna (2003) al aumentar el porcentaje de inclusin de EBP paralelamente aumentaba la PMS. A Gutierrez (2002) le sucedi con el extracto de langostilla liofilizado que afect negativamente la estabilidad de los alimentos en el agua conforme se aument el nivel de inclusin de langostilla en las dietas; el extracto de langostilla es un prensado del cuerpo completo del animal, definindose como el material liquido que contiene todos los fluidos corporales (principalmente del cefalotrax). A Durazo y Viana (2001) les sucedi en alimentos para abuln evaluando el efecto de tres ficocoloides (agar, alginato y carragenano) en diferentes concentraciones y con dos fuentes de protenas; HP y ensilado qumico de vsceras de abuln. Los resultados muestran que tanto la estabilidad como la dureza se vieron influenciadas por el tipo de fuente de protena ms que por el tipo y concentracin del enlazante.

La protena hidrolizada es difcil de enlazarse con los dems ingredientes. Esto indica la importancia de que un alimento que va a estar sumergido en agua tenga estabilidad y sea sellado adecuadamente, para evitar que durante las primeras horas sufra un lavado de nutrientes que, consecuentemente, no estarn disponibles para los organismos. Sin embargo como seala Cruz (1996) la estabilidad optima en el agua es dependiente del manejo del alimento, es decir entre ms veces se alimente al camarn menos estabilidad en el agua ser requerida y viceversa.

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Cruz et al. (2002) seala que alimentos en que su CAA (de 70 140%) produzca una textura suave tipo gel hace que el consumo del alimento aumente y con ello el crecimiento en comparacin con alimentos con menor CAA. En anlisis a alimentos comerciales para camarn usados en Mxico realizados por Cruz et al. (2002) se observa que la CAA con duracin de una hora es de 70 a 85%; presentndose el caso en la mayora de los alimentos evaluados; excepto por 50% EBP con 66.78% y el control externo con 100.49% el cual se trata de un alimento comercial. Entre los alimentos 50% EBPL y 50% EBP presentaron CAA notablemente diferentes entre s debido seguramente a que en el primero el ensilado se agrego deshidratado y pulverizado mientras en el segundo en fresco (es decir cmo se obtiene) a las dietas, sin embargo presentan PMS semejantes. El alimento 100% EBPL presento una alta CAA y PMS entre las dietas con inclusin de ensilado; seguramente porque en esta dieta se sustituyo totalmente a la HP.

7.3 Evaluacin de los alimentos en juveniles de camarn blanco

No se observaron rechazos en ninguno de los tratamientos por las dietas suministradas. En el ensilado la protena intacta ha sido hidrolizada a fragmentos ms pequeos y aminocidos libres solubles como lo mencionan Parn y Zugarramurdi (1994); estos compuestos actan como atractantes y/ estimulantes alimenticios y favorecen el crecimiento de acuerdo con el nivel de inclusin en el alimento (Gutirrez, 2002; Cruz, 1996; Borghesi et al., 2008).

Los alimentos con inclusin de EBP durante el ensayo in vivo ofrecieron resultados anlogos a los obtenidos por los controles. Este suceso es recurrente en distintos trabajos en que se evalan dietas con inclusin de EBP en diversos organismos de inters comercial acucola. No se logra obtener suficiente evidencia entre los alimentos con inclusin de EBP y los controles manejados (generalmente interno y/ comercial; con base en HP) de que las primeras brindaran mejores resultados. En varios casos solo se observo un efecto comparable y equitativo con el comportamiento biolgico de los organismos alimentados con los controles. No afecto que fueran ensilados distintos entre s, tanto por los ingredientes que los constituyen como por la forma de incluirlo a la dieta; en fresco, co-secado y deshidratado (Gonzlez et al., 2007; Nwanna, 2003; Lessi, 1994; Agudelo et al., 2004; Balsinde et al., 2003; Borghesi et al., 2008; Meire et al., 2002).

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Es posible que no se obtenga una respuesta biolgica rotunda en los organismos alimentados con dietas con EBP debido al lavado de nutrientes sufrido durante la primera hora de inmersin; en comparacin con los controles que se mantuvieron muy estables. Este es un efecto negativo descrito por varios autores al utilizar protena hidrolizada en dietas acucolas (Gutirrez, 2002; Cruz, 1996;). Esto resulta evidente en el alimento 100% EBPL en el cual el EBPL compone el 45% de la dieta y que presento la mayor PMS (25%); una prdida importante de la fraccin proteica.

Un alimento con EBP con su estabilidad optimizada quizs requiera menos protena que al utilizar HP. Aunque tericamente ambos mtodos utilizan la misma cantidad de materia prima para obtener una misma cantidad de protena, la calidad de la protena obtenida en cada caso marcara la diferencia. Cruz (1996) resume la calidad de las protenas esencialmente en dos caractersticas: coeficiente de utilizacin digestiva y valor biolgico (equilibrio de aminocidos esenciales y principalmente del valor relativo del aminocido esencial menos abundante con respecto a los requerimientos: aminocido limitante); los cuales no fueron objeto de este trabajo.

Son varios los autores que sealan mltiples virtudes del EBP como bioconservador; al conservar en mayor grado la calidad de la protena presente en el producto fresco, mantener las vitaminas intactas, poseer todos los cidos grasos presentes en el pescado, inhibir el crecimiento de microorganismos putrefactivos y patgenos; y presentar enzimas proteolticas como la pepsina y la tripsina (Berenz, 1994; Parn y Zugarramurdi, 1994; Kjos, 2001; Bello, 1994; Ottati et al., 1990; Bello et al., 1993). La tripsina representa por s sola el 60% de la actividad proteasica del hepatopncreas en los crustceos peneidos y es especifica hacia los aminocidos bsicos que son esenciales en la nutricin de crustceos (Cruz, 1996).

Se ha sealado que la digestibilidad del ensilado es cerca del 100% y que en la HP flucta entre 75 y 80% (Padilla et al., 2000). Tacon (1989) menciona que los aminocidos incorporados a la dieta en forma libre, son asimilados ms rpidamente por los peces, en comparacin con los aminocidos que integran la protena. Cruz (1996) seala que mientras ms aminocidos bsicos tenga la protena, la capacidad de hidrlisis ser mayor y por lo tanto, la digestibilidad y la eficiencia alimenticia.

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Tacon (1989) resume experiencias en juveniles de peces y camarones alimentados con raciones en las que una porcin significativa de la protena diettica es suministrada en forma de aminocidos libres dando como resultado un crecimiento subptimo y una eficiencia de conversin alimenticia baja, comparada con animales alimentados con protena entera con protenas en las que los aminocidos son elementos constitutivos de estas. Cruz (1996) seala que la complementacin de protenas con aminocidos puros no es recomendable en organismos acuticos por su gran solubilidad en el agua. Tambin se ha reportado que el uso de ingredientes que contienen altos niveles de aminocidos libres y pequeos pptidos, pueden causar reduccin en la disponibilidad biolgica de la lisina y de otros aminocidos (Padilla et al., 2000). Se ha reportado que al haber carencia de uno varios aminocidos en la dieta del LV, los dems aminocidos no pueden ser aprovechados en su totalidad para la sntesis de protenas, por lo que parte de ellos pueden ser desminados y el nitrgeno excretado, sin haber sido utilizados para el crecimiento (Gutirrez, 2002). La desaminacin se produce cuando la protena es deficiente en uno ms aminocidos esenciales hay un pobre balance de aminocidos, cuando se ingieren cantidades excesivas de protenas, cuando la cantidad de energa derivada de los lpidos y carbohidratos es insuficiente para mantener los procesos vitales. Desafortunadamente en este estudio no se midieron los compuestos nitrogenados excretados, por lo que no se puede llegar a una conclusin al respecto.

Borghesi et al. (2008) evalu diferentes ensilados; qumico, enzimtico y biolgico; de pescado en alimentos para tilapa (Oreocromis niloticus) concluyendo que estos tienen un alto coeficiente de digestibilidad aparente de protenas y aminocidos; y que los ensilados enzimtico y qumico producen mejores resultados que el biolgico. Tacon (1989) menciona que bajo ciertas condiciones cuando las protenas en la dieta estn parcialmente digeridas algunos de los aminocidos pueden no estar disponibles.

En el caso del EBP, el cultivo iniciador hace uso de los nutrientes del pescado rpidamente en su crecimiento, estableciendo un mecanismo de competencia inicial entre las BAL y los microorganismos descomponedores; la cual debido a la cantidad del inoculo y su produccin de acido lctico es rpidamente ganada por las BAL (Borghesi et al., 2008; Bello, 1994; Parin y Zugarramurdi, 1994; Crdova y Bello, 1990).

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La BAL TD23 es simbiotica al camarn dado que se favorecen mutuamente; la BAL encuentra en el tracto digestivo del camarn un ambiente adecuado para su desarrollo y el camarn se beneficia de su accin probitica. Por lo anterior se opina que la BAL TD23 si bien utiliza los nutrientes del pescado en el EBP esta no debe causar deficiencias como para desfavorecer la nutricin de su hospedero y los presentes resultados in vivo lo confirman al obtenerse resultados anlogos entre los alimentos con inclusin de EBP y los controles; aun con la marcada lixiviacin presentada en los primeros. Sin embargo sern necesarios anlisis de aminocidos entre la materia prima y el ensilado, teniendo en cuenta que las BAL no formaran parte nutricionalmente del alimento (deber realizarse una diferenciacin) para resultados ms precisos.

La viabilidad de las BAL en los organismos fue acumulativa pero distinta en cada tratamiento, los alimentos con 50%EBP y 50%EBPL iniciaron con el mismo orden de BAL tanto en el alimento como en los organismos, sin embargo al transcurrir del tiempo se observa como 50%EBP se distancia de 50%EBPL. Se encuentra con frecuencia que las bacterias liofilizadas presentan una fase de retardo demasiado extendida requiriendo tiempo para salir del estado latente, pasar al estado de adaptacin e iniciar el crecimiento. Se sugiere que las BAL no completan su activacin durante el paso del alimento por el sistema digestivo; mientras que en el alimento 50%EBP las bacterias siempre se encontraron activas sufriendo solo el secado del pellet; logrando permanecer activas un mayor numero en el tracto digestivo del camarn LV.

Esta bacteria probitica es una alternativa prometedora al uso de antibiticos, reducen las posibilidades de colonizacin y desarrollo de potenciales bacterias patgenas, bajo el principio de exclusin competitiva; produccin de compuestos antimicrobianos (antagonismo), competicin por nutrientes por sitios de adhesin y la estimulacin del sistema inmune (Fuller, 1989, Gatesoupe, 1999). El EBP es una fuente de protena de excelente calidad y un medio propicio para hacer crecer e incluir probiticos en la dieta de organismos; ayudando a disminuir anular el uso de tratamientos contra enfermedades, incrementando as la rentabilidad del cultivo. Convirtindolo as en un alimento funcional por sus funciones adicionales a las de su valor nutritivo.

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8. CONCLUSIONES

La produccin de EBP resulta ser una tecnologa simple, un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de BAL (TD23) con potencial probitico, es una adecuada fuente de protenas; que presenta similitud al de la materia prima utilizada; y un medio propicio de incluir probiticos en la dieta de camarn blanco LV. Aunque en la prctica la composicin del ensilado va a depender de la fuente de carbohidratos y principalmente del pescado (especie, poca de captura y tipo de residuos; estos son factores a los que tambin responde la composicin de la HP).

En el EBP gran parte de la protena ha sido hidrolizada a fragmentos ms pequeos y aminocidos libres solubles que actan como atractantes; sin embargo su enlace con los dems ingredientes de la dieta se vuelve difcil. Lo anterior tiene como consecuencias altas PMS comparados con los controles. Aunque en el bioensayo se obtuvieron resultados biolgicos equiparables entre los tratamientos; optimizar la estabilidad de alimentos con EBP posiblemente har que se requiera menos protena que la utilizada con la HP.

La liofilizacin; a diferencia de otros mtodos de deshidratacin; es un mtodo de conservacin de largo plazo, concentra la protena, facilita su almacenaje, mantiene viable a la bacteria probitica, no altera las propiedades nutritivas y organolpticas. Sin embargo encarece demasiado el producto final; ya que es el mtodo de deshidratacin ms caro. Las bacterias liofilizadas presentaron una fase de retardo demasiado extendida. Este mtodo es prctico para el almacenamiento y traslado de la cepa, para su uso como cultivo iniciador en la produccin de EBP (como es el caso con BAL comercializadas para elaborar quesos).

El utilizar la cepa con potencial probitico (TD23), en la elaboracin de ensilado biolgico y su inclusin en la preparacin de dietas para juveniles de camarn; lo convirtieron en un alimento funcional por sus beneficios adicionales a las de su valor nutritivo lo cual favoreci el crecimiento y la salud, confiriendo a los organismos la capacidad de resistir enfermedades.

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9. RECOMENDACIONES

Se deben probar nuevas formulaciones de EBP donde se utilicen niveles menores de azcar del 15%, al reducir su concentracin aumenta el espacio disponible para la protena. Adems el azcar es hidroscpica lo que permite la entrada de humedad en los pellets almacenados suavizndolos antes de ser usados en el agua (Tacon, 1989).

Comparar entre el EBP vs. HP; en sus anlisis qumicos proximales, de aminocidos y de cidos grasos; para conocer las diferencias en cuanto al rendimiento de la materia prima, conservacin y calidad en la protena obtenida de manera clara y objetiva. Determinar cual mtodo ofrece mayores beneficios econmicos y es amigable con el medio ambiente.

Se deben efectuar nuevas formulaciones de EBP en que se prueben otras fuentes de carbono con disponibilidad y costo reducido como algunos granos, melazas, suero de queso, celulosas, etc. Tambin deben considerarse las de origen marino (algas y fitoplancton) contienen importantes niveles de hidratos de carbono; (algunas se aproximan al 50% ELN en BS; Tacon, 1989) y cantidades significativos de protenas, vitaminas y minerales. Por lo anterior tambin se podra utilizar como materia prima en lugar del pescado obteniendo ensilados biolgicos de algas fitoplancton como fuente de protena y de probitico.

El EBP hace difcil su inclusin al alimento; al utilizarlo como fuente de probiticos no se pueden utilizar altas temperaturas para obtener el pellet; lo que hace necesario realizar pruebas en condiciones de laboratorio y en estanquera, donde se integren nuevas metodologas (probadas), que le proporcionen a los pellets una mayor estabilidad en el agua sin afectar a las bacterias probiticas contenidas.

Se deben continuar los estudios de optimizacin de la composicin del alimento artificial y prcticas de alimentacin en el cultivo de la especie en sistemas semi e intensivos. Adems es necesario conocer la digestibilidad in vivo de las dietas utilizadas aqu, para poder calcular los valores la protena digestible, energa digestible, coeficientes de digestibilidad aparente de protena, de carbohidratos y lpidos.

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Se sugieren estudios para saber si las sustancias antagnicas producidas por la bacteria probitica y contenidas en el EBP sean suficientes para inhibir el crecimiento de bacterias patgenas y se determine su concentracin mnima inhibitoria (originalmente probitico se refera a los microorganismos o sus sustancias que contribuyen al equilibrio microbiano intestinal; definido por Parker en 1974). Si se diera el caso se podran elaborar alimentos sin la restriccin de las altas temperatura; como la extrusin lo que mejorara inmensamente su estabilidad en el agua. Adems las protenas de origen microbiolgico se han revelado eficaces en substituciones de hasta un 30%.

Se sugieren realizar pruebas con pellet extruido en que se le incorpore el EBP por inmersin (debido a su bajo volumen y naturaleza porosa, el pellet extruido presenta CAA de 200 a 300%; Tacon, 1989); sin embargo el EBP es demasiado espeso posiblemente no pueda ser absorbido por el pellet por lo que se debera disolver este en ms agua. La ventajas que presenta la extrusin es que son extremadamente estables en agua; ideales para los camarones por sus hbitos alimenticios lentos; y son estables en estado seco; se pueden almacenar por largos perodos de tiempo sin degradacin de los nutrientes (Tacon, 1989).

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11. ANEXOS

Anexo 1

Agua de mar sinttica Cloruro de sodio 24 g, cloruro de potasio 0.7 g, cloruro de magnesio 5.3 g, sulfato de magnesio 7 g, disolver en 1 litro de agua destilada.

Buffer de fosfatos (PBS) Cloruro de sodio 8.5 g, Fosfato de potasio dibsico 1.21 g, Fosfato de potasio monobsico 3.9 g, Disolver en agua destilada aforar a 1 L, Ajustar pH a 7.2. Finalmente esterilizar a 121C por 15 minutos.

Caldo MRS (DIFCO) Suspender 55 gramos en un litro de agua destilada y disolver completamente. Finalmente esterilizar a 121C por 15 minutos.

Agar rogosa (DIFCO); Agar selectivo para Lactobacillus Suspender 75 gramos en un litro de agua destilada, calentar para disolver, adicionar 1.32 ml de cido actico glacial, mezclar y hervir de 2 a 3 minutos. No necesita esterilizacin.

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Anexo 2

Composicin porcentual de las dietas Tabla 9. En donde a partir de la segunda columna en la primera fila se encuentra la clave utilizada para identificar cada dieta y a partir de esta de forma descendente el porcentaje que lo constituye de cada ingrediente.

Tabla 9. Composicin porcentual de las dietas Ingredientes MI MI MI MI HP (HP0607) EBPL Harina integral de Trigo (HIT0607) Pasta de Soya (PSoy0607) Control interno 33.00 0.00 0.00 25.30 20.00 0.92 2.00 12.98 2.00 1.80 1.20 0.50 0.20 0.09 0.004 50% EBP 16.50 22.57 0.00 25.25 20.00 1.63 2.00 6.25 2.00 1.80 1.20 0.50 0.20 0.09 0.004 50% EBPL 100% EBPL 16.50 0.00 22.57 25.25 20.00 1.63 2.00 6.25 2.00 1.80 1.20 0.50 0.20 0.09 0.004 0.00 0.00 45.13 24.72 20.00 2.36 2.00 0.00 2.00 1.80 1.20 0.50 0.20 0.09 0.004

MIL EBP*

mil Aceite de hgado de bacalao (AcHiBac 0704) mil Lecitina de soya (LSoy0607) MI mi mi mi mi mi mi Almidn de maz (Sigma S-0876) cido algnico (Sigma A-7128) Premezcla de vitaminas (VITCRU0604) Fosfato dibsico sodio (S-0876) Premezcla de minerales (MINCRUS0409) Cloruro de colina Vitamina C (Stay-C 35% aa)

mil BHT (ICN101162)

Ingrediente en base hmeda. En parntesis claves de uso interno del Laboratorio de Nutricin Acucola del CIBNOR. MI y mi: macro y micro ingredientes respectivamente. MIL y mil: macro y micro ingredientes lquidos respectivamente. * En el EBP la protena contenida en 66.87% equivale a la cantidad de protena contenida en 22.57% del EBPL; pero no en volumen por el contenido de agua; dado que el total de ingredientes sumaran 100% en la composicin de la dieta se le considero al EBP como al EBPL pero no al momento de elaborarlo.

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La composicin qumico proximal que se pretenda en los alimentos se muestra en la Tabla 10. Se determino a travs de una hoja de calculo (Excel MC) en base a anlisis proximales y el porcentaje que lo constituye de cada ingrediente en las dietas.

Tabla 10. Composicin qumico proximal pretendida en los alimentos Nutrientes %. Protena cruda Lpidos Fibra cruda Cenizas ELN EB Kcal/g Control interno 35.00 7.00 2.40 8.82 46.78 4.54 50% EBP 35.00 7.00 2.40 6.10 49.50 4.65 50% EBPL 35.00 7.00 2.40 6.10 49.50 4.65 100% EBPL 34.92 7.00 2.39 3.37 52.32 4.76

Expresados en base seca. ELN extracto libre de nitrgeno. EB energa bruta.

Composicin de premezclas de minerales y vitaminas para crustceos, Tabla 11 y 12 respectivamente; facilitados por el Laboratorio de Nutricin Acucola del CIBNOR.

Tabla 11. Premezclas de minerales para crustceos (MINCRUS0409) Minerales Cobalt chloride Cupric sulfate pentahydrate Ferrous sulfate Magnesium sulfate heptahydrate Manganous sulfate monohydrate Potassium iodide Sodium selenite Zinc sulfate heptahydrate Filler (alfa-cellulose) Catlogo SIGMA C - 2644 C - 6917 F - 7002 M - 9697 M -3634 P - 4286 S - 1382 Z - 0501 C- 8002 g/100 g de premezcla 0.004 0.25 4 28.398 0.65 0.067 0.01 13.193 53.428

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Tabla 12. Premezclas de vitaminas para crustceos (VITCRU0604) Premezcla de Vitaminas Vit. A Acetate (20,000 UI/g) Vitamin D3 (850,000 UI/g) dl-alfa-tocopheryl acetate (250 UI/g) Menadione Thiamin-HCl Riboflavin (B2) Pyridoxine-HCl (B6) DL Ca-Pantothenate Nicotinic acid Biotin Inositol Vitamin B12 Folic acid Filler (alfa-cellulose) ICN ICN SIGMA ICN ICN ICN ICN ICN ICN ICN ICN ICN ICN SIGMA Catlogo 160079 160107 T-3376 102259 103029 102813 102777 101228 102446 101023 102052 103271 101725 C- 8002 g/kg de premezcla 5 0.001 8 2 0.5 3 1 5 5 0.05 5 0.002 0.18 865.266

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Composicin qumico proximal del resto de los ingredientes que constituyen a las dietas; facilitados por Laboratorio de Nutricin Acucola del

CIBNOR se muestran en la Tabla 13.

Tabla 13. Composicin qumica proximal del resto de los ingredientes en la dieta. MS 95.61 94.85 99.5 99.46 98.17 85.52 100 100 100 100 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 53.43 0 0 0 0 96.141 0.56 0 0.01 0 0 0 3.8 89.24 0 6.96 0 24.31 0 100 46.57 0 0 0.71 99.5 0.14 0 50.58 0.93 1.59 6.46 16.15 2.18 0.41 1.63 Protena Lpidos Fibra cruda Cenizas E.L.N. 79.62 40.44 0 0 100 75.2 0 0 0 0 0 EB Kcal/g 3.92 4.32 8.95 8.35 4.00 0 0 0 0 0 0

Ingrediente \ Nutriente %

Harina integral de Trigo

Pasta de Soya

Aceite de hgado de bacalao

Lecitina de soya

Almidn de maz

cido algnico

Premezcla de vitaminas

Fosfato dibsico sodio

Premezcla de minerales

Cloruro de colina

Vitamina C

100 0 0 0 0 0 0 En base seca. MS materia seca. Claves de los alimentos de uso interno del Laboratorio de Nutricin Acucola del CIBNOR omitidas por espacio.

BHT