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Memorias del Curso-Taller Internacional

Patógenos de los Vectores del Dengue: Aedes aegypti (L.) y Aedes albopictus (Skuse)

Othón Javier González Gaona Filiberto Reyes Villanueva EDITORES

Memorias del Curso-Taller Internacional

Patógenos de los Vectores del Dengue: Aedes aegypti (L.) y Aedes albopictus (Skuse)

Othón Javier González Gaona Filiberto Reyes-Villanueva EDITORES
DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN SUPERIOR TECNOLOGICA INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD VICTORIA
Ciudad Victoria, Tamaulipas, México. 2009

Memorias del Curso-Taller Internacional Patógenos de los Vectores del Dengue: Aedes aegypti (L.) y Aedes albopictus (Skuse)

DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN SUPERIOR TECNOLÓGICA DR. CARLOS ALFONSO GARCÍA IBARRA DIRECTOR GENERAL

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD VICTORIA ING. FRANCISCO RUVALCABA GONZÁLEZ DIRECTOR

CONSEJO TAMAULIPECO DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA DR. JULIO MARTÍNEZ BULNES DIRECTOR

Memorias del Curso-Taller Internacional Patógenos de los Vectores del Dengue: Aedes aegypti (L.) y Aedes albopictus (Skuse)

PRIMERA EDICIÓN D.R. LOS EDITORES DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN SUPERIOR TECNOLÓGICA INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD VICTORIA Boulevard Emilio Portes Gil Nº 1301 Pte. Ciudad Victoria, Tamaulipas, México. 87010

ISBN 03-2009-021013440600-01

Coordinación Editorial: Othón Javier González Gaona y Filiberto Reyes Villanueva

Colaboración en la Edición: M.C. Martha Isabel Benavides Martínez

Esta publicación no puede ser reproducida, almacenada o transmitida en forma alguna ni por ningún medio electrónico, mecánico, químico, óptico o de grabación o fotocopia, sin permiso previo y por escrito de los autores.

Impreso por el Instituto Tecnológico de Ciudad Victoria, El Consejo Tamaulipeco de Ciencia y Tecnología, con el apoyo del FONDO MIXTO DE FOMENTO A LA INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA. CONACYT-GOBIERNO DEL ESTADO DE TAMAULIPAS

Agradecimiento

La publicación de estas memorias fue financiada por el Fondo Mixto de Fomento a la Investigación Científica del CONACyT-Gobierno del Estado de Tamaulipas, mediante proyecto clave 055297- 2006-C11. A las autoridades de la Secretaría de Salud del Estado de Tamaulipas, por financiar parcialmente los gastos para la asistencia de patólogos de insectos expertos de Canadá, Estados Unidos de América y Holanda, al “Curso-Taller Internacional sobre Patógenos de los Vectores del Dengue: Aedes aegypti y Aedes albopictus”. A las autoridades del Instituto Tecnológico de Ciudad Victoria (ITCV): Ing. Francisco Rubalcaba González e Ing. Gaspar Nolasco Antonio, Director y Subdirector Académico respectivamente, por el apoyo y facilidades para el evento y la terminación de estas memorias. Al Dr. Jorge Horta Vega, por su entusiasta apoyo a este evento Curso-Taller, en su calidad de Jefe de la División de Estudios de Postgrado e Investigación del ITCV. A la C. M.C. Martha Isabel Benavides Martínez por la revisión ortográfica y forma. A los autores quienes con sus aportaciones al conocimiento de los patógenos del dengue se debe este libro.

PRÓLOGO
La circulación de los cuatro serotipos del virus del dengue, más las abundantes poblaciones de su vector primario, el mosquito Aedes aegypti en todo el país y la presencia de poblaciones del vector secundario, A. albopictus en el noreste y sur del territorio nacional, crean las condiciones ideales para que anualmente se presenten epidemias de esta enfermedad en México. El dengue es una arbovirosis reemergente en toda América Latina, y nuestro país es endémico para este problema, dados los altos índices de mortalidad y morbilidad que ocasiona en la sociedad. Este escenario existe porque los programas de control vectorial sólo se basan en la aplicación de insecticidas químicos contra ambos transmisores y en la educación comunitaria. Los químicos, aparte de ser caros, se aplican de una manera desorganizada espacialmente, y no garantizan el 100% de mortalidad porque ya hay poblaciones resistentes del vector a estos productos. Por otro lado, la comunidad se muestra apática para ser educada en la aplicación de medidas preventivas en los grandes centros urbanos. Lo anterior, más la ausencia de cursos sobre combate vectorial mediante microorganismos patógenos y parásitos de ambos vectores, en las universidades y centros de educación superior en México, fueron los factores que motivaron la organización del “Curso-Taller Internacional sobre Control Microbiano de los Vectores del Dengue, Aedes aegypti y Aedes albopictus”, por parte de Instituto Tecnológico de Cd. Victoria celebrado del 6 al 8 de Octubre de 2006 en esta ciudad del estado de Tamaulipas, México. El propósito de este evento fue el de concentrar a expertos mundiales sobre patógenos de mosquitos, para actualizar en esta especialidad, a todos aquellos estudiantes y profesionales que se desempeñan en el área de la salud pública, y dar a conocer nuevas alternativas de control del vector, más eficientes, más económicas y más amigables ecológicamente. Ésta es una compilación de las presentaciones de los expertos participantes. Tenemos la esperanza de que estas memorias funcionen como fuente bibliográfica educativa y plataforma para que a un futuro inmediato, se incentive la investigación y conducción de proyectos sobre parásitos y patógenos para regular y controlar a los vectores del dengue en México.

Dr. Filiberto Reyes Villanueva Cd. Reynosa, Tamaulipas, México Octubre, 2009

I. Aedes aegypti , Aedes albopictus y el Dengue: Una Amenaza para la Salud Pública en América Latina
Filiberto Reyes-Villanueva1 y Gary S. Clark2
1

Instituto Politécnico Nacional. Centro de Biotecnología Genómica, Laboratorio de Biomedicina Molecular. Boulevard del Maestro S/N esquina Elías Piña. Col. Narciso Mendoza, 88710, Apdo. Postal 152, Reynosa, Tamaulipas, México. Email: frv65@hotmail.com 2 Center for Medical, Agricultural and Veterinary Entomology, USDA/ARS/CMAVE, Gainesville, Fl, 32604, P.O. Box 14565, USA. E-mail: Gary.Clark@ars.usda.gov

1.1 Introducción e Historial Epidemiológico La palabra Dengue tiene su origen en el dialecto africano swahili: ki denga pepo (enfermedad causada por malos espíritus) (Seijo 2001). Es una enfermedad causada por un Flavivirus de cadena simple de ARN con una fuerte variación expresada en la existencia de cuatro serotipos: DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4 y por la consecuente ausencia de una vacuna. La circulación de los cuatro serotipos facilita la ocurrencia de infecciones repetidas en la misma persona, ocasionando así el cuadro clínico mortal del dengue hemorrágico. Las cuatro variantes virales son transmitidas por el mosquito Aedes aegypti como vector primario (Fig. 1), y por A. albopictus como vector secundario a nivel mundial (Gubler 1988).

Fig. 1. El mosquito Aedes aegypti, vector primario del Dengue a nivel mundial. En los años 40´s y 50´s, 21 países latinoamericanos lograron la erradicación de A. aegypti, empero la falta de recursos y/o el abandono de las campañas trajeron como resultado la reinfestación y se perdió el esfuerzo realizado en años anteriores. En 1985, la Organización Panamericana de la Salud (OPS) intentó revitalizar la lucha contra el vector, pero la situación del dengue y del dengue hemorrágico empeoró. Para los 90´s, prácticamente todos los países ya estaban infestados de nuevo por el vector (Fig. 2) y el dengue adquirió otra vez

el status de un grave problema para la salud pública (Gubler y Clark 1995). Según datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS), más de 100 países han sido afectados por epidemias de dengue o de dengue hemorrágico. Anualmente ocurren más de 50 millones de casos de ambos tipos de dengue, con alrededor de 500,000 hospitalizaciones y 20,000 defunciones. Las tasas de ataque llegan a 64 por 1,000 habitantes y los niños constituyen el 95% de los casos (Halstead 1992). Además del sufrimiento que produce la enfermedad, su control es costoso y las epidemias tienen un efecto negativo importante en el desarrollo socioeconómico de los países. En las Américas, la reemergencia de esta enfermedad se empezó a manifestar en los años 60´s con epidemias en Venezuela, Jamaica y Puerto Rico. A fines de los 70´s el dengue se reintrodujo en forma pandémica que afectó a El Salvador, Guatemala, Honduras, México, y en Texas en los Estados Unidos de América (Rigau-Perez et al. 1994). De 1978 a 1980 se notificaron 700,000 casos, pero se estima que la pandemia afectó a muchas más personas, probablemente a varios millones. En los 80´s hubo varias epidemias importantes en países endémicos y el DEN-1 se expandió hacia Sudamérica, con brotes en Bolivia, Brasil, Ecuador, Paraguay y Perú, países que hacía muchos años no experimentaban la enfermedad o que jamás la habían notificado. En esos brotes enfermaron millones de personas y algunas murieron. Costa Rica y Panamá, los dos últimos países tropicales infestados por A. aegypti pero exentos de dengue, informaron en 1993 que en sus territorios ya había comenzado la transmisión autóctona de la enfermedad (Pinheiro y Corber 1997).

Fig. 2. Distribución de la infestación de Aedes aegypti en los países Latinoamericanos desde antes de 1981 hasta 1995 (Modificado de Gubler y Clark 1995). En 1994 se introdujo el DEN-3 en la región. Ese serotipo fue detectado simultáneamente en Panamá y Nicaragua, y en este último país se originó una epidemia de dengue y dengue hemorrágico (CDC 1995). En 1995, el DEN-3 se diseminó a otros países de Centroamérica excepto Belice y México. Debido a que el DEN-3 no circulaba en las Américas desde 1978 (16 años de ausencia), se estimó que hay 200 millones de personas susceptibles en riesgo en las áreas infestadas por A. aegypti y que existía el peligro de grandes epidemias. En 1995 fuertes epidemias de dengue azotaron Centroamérica, el Caribe y Suramérica (Brasil, en particular) y 41 países informaron de 284,483 casos, o sea, la mayor incidencia de dengue desde 1981. En 1996 se registraron 250,707 casos, de los cuales alrededor de 80% correspondieron a Brasil (OPS 1995, Pinheiro y Corber 1997).

Puede afirmarse que hoy día en México existen condiciones epidemiológicas y sociales similares a las que favorecieron el agravamiento del dengue hemorrágico en Asia durante los 50´s. No obstante, podemos decir que ahora es peor por los procesos de invasión que está llevando a cabo el vector secundario A. albopictus. En el noreste, este vector ya tiene poblaciones bien establecidas en las principales ciudades fronterizas como Piedras Negras en Coahuila, Nuevo Laredo, Reynosa y Matamoros en Tamaulipas, y en 22 municipios de Nuevo León (Jorge Orta Pecina, Secretaria de Salud de Nuevo León, comunicación personal). El vector ya está bien establecido en Tapachula, Chiapas, y todo indica que se va dispersando hacia el norte por el corredor de la zona del Soconusco (Rogelio Danis López, INSP, comunicación personal). Es decir, se encuentran altas densidades de ambos vectores junto con la circulación de los cuatro serotipos del virus y hacinamiento de poblaciones humanas marginadas en los cinturones de pobreza de las grandes ciudades. La primera y más grave epidemia de dengue hemorrágico en las Américas fue causada por DEN-2 en Cuba en 1981. Se notificaron 344,203 casos de dengue y dengue hemorrágico, incluidos 10,312 casos graves y 158 defunciones (Gubler y Trent 1994). La segunda epidemia más importante ocurrió en Venezuela de 1989 a 1990, con 5,990 casos y 70 muertes. En esa ocasión circularon los serotipos DEN-1, DEN-2 y DEN-4, pero en los casos mortales se detectó solamente el DEN-2. Alrededor del 66% de los casos y defunciones por dengue hemorrágico en Cuba y Venezuela ocurrieron en menores de 14 años. La extensa difusión del dengue hemorrágico que ha tenido lugar desde la epidemia de Cuba en 1981 es muy preocupante. Hasta 1996 se notificaron casos todos los años, con excepción de 1983. En ese período, 25 países registraron 41,669 casos de dengue hemorrágico (Gubler y Clark 1994). La creciente hiperendemicidad del dengue, con la circulación de los cuatro serotipos, constituye un serio factor de riesgo para que la situación llegue a agravarse aún más (Lancioti et al. 1994).

1.2 Algunas Fallas en la Situación Actual de los Programas de Control de Aedes aegypti A lo largo de los años, las actividades de los países contra A. aegypti se han visto obstaculizadas por factores económicos, políticos, sociales y administrativos de distintos grados de complejidad. Uno de los problemas principales ha sido la falta de aplicación de medidas de prioridad oficial a la prevención y el control del dengue. Las actividades de lucha contra el vector no se han sostenido de forma apropiada debido a que no se han institucionalizado los programas, no hay integración intra ni intersectorial y no se ha logrado la participación de las comunidades (Sánchez et al. 2004). La mayoría de los programas se han incorporado a los ministerios de salud como servicios de A. aegypti o se han combinado con los de malaria o de control de vectores. Por lo general hay poca o nula comunicación y colaboración entre programas y otras entidades relacionadas, sean gubernamentales, no gubernamentales o universidades y centros de investigación. Los programas son dirigidos por profesionales de la medicina con escaso o nulo conocimiento en bionomía de vectores, y de ahí la explicación de algunas fallas principalmente las asociadas al uso de insecticidas químicos. Las fallas existen porque un medico debe trabajar en equipo con personal con perfil en entomología médica a nivel posgrado, lo cual lamentablemente no ocurre. Además, el personal recibe poco adiestramiento y no lleva a cabo investigaciones operacionales. La principal medida contra el vector es la aplicación de insecticidas. Errónea y frecuentemente se aplican larvicidas a recipientes que podrían destruirse o removerse y encima de eso se usan excesivamente los adulticidas a ultrabajo volumen (UBV) en las áreas donde no hay transmisión de dengue. Estas fallas obedecen a que la aplicación de insecticidas químicos no

se ha diseñado sobre un esquema de muestreo estadístico de las poblaciones larvales y de adultos del vector a nivel urbano, para poder aplicar un control químico estratificado espacialmente y sistematizado estacionalmente, sobre focos endémicos perfectamente caracterizados. Además, el control químico es útil para la supresión de epidemias, pero no es apropiado para el control vectorial (PAHO 1994). En la mayoría de los países, las estrategias propuestas y los recursos asignados han sido inadecuados e insuficientes para llevar a cabo programas de lucha con miras a la erradicación de A. aegypti. El control y la erradicación, a veces considerados indistintamente, son dos estrategias con metodologías y metas diferentes. La erradicación implica cobertura universal de todos los criaderos del mosquito en todas las casas de todas las localidades infestadas en el país, hasta eliminar totalmente el vector y montar vigilancia permanente contra la reinfestación. Esto se realiza en cuatro fases consecutivas: preparatoria, de ataque, de consolidación y de mantenimiento. Los países suelen avanzar a ritmo distinto de una fase a otra, ya que ello depende de las condiciones locales y de los recursos disponibles. El costo inicial de esta estrategia es alto, pero una vez eliminado el mosquito, los gastos en vigilancia contra la reinfestación son mucho menores y se evita totalmente la transmisión. Por otro lado, la estrategia de control es el uso eficiente de recursos limitados para evitar epidemias y mortalidad. Los esfuerzos se concentran en las zonas determinadas de mayor riesgo para reducir, pero no erradicar, al vector. El costo de la estrategia de control es menor que el de la fase de ataque de la erradicación, pero mayor que el de la fase de mantenimiento o vigilancia contra la reinfestación. Después de algunos años en marcha, la estrategia de control puede costar más que la de erradicación (OPS 1995).

1.3 El Plan Continental de la Organización Panamericana de la Salud (OPS) versus Aedes aegypti El control de recipientes artificiales como los envases desechables, llantas y barriles donde se cría el mosquito A. aegypti es la piedra angular para prevenir el dengue. Sin embargo, junto con el control de los criaderos, hay que implantar el saneamiento ambiental, la participación social, la comunicación, la educación para la salud, el control químico y el control biológico. Por lo tanto, una estrategia efectiva exige el concurso de varias disciplinas, tales como la entomología, la ingeniería, la psicología, la comunicación y la educación sanitarias así como la sociología y antropología médicas. Desde luego, cualquier acción tiene que fundamentarse en el conocimiento de la distribución de los criaderos principales de una localidad y de los factores que contribuyen a su existencia. Al mismo tiempo, hay que asegurarse de la calidad de los servicios básicos de saneamiento ambiental y modificar el comportamiento humano (Lloyd et al. 1992). Entonces, hay que aclarar que el combate químico es sólo un componente complementario a la eliminación de los criaderos de A. aegypti.

1.4 Saneamiento Ambiental Las actividades de saneamiento, que en este caso se refieren a la eliminación de criaderos del vector, tienen que ver principalmente con el control del agua y de los residuos sólidos. En lugares donde no hay suministro de agua a domicilio o el agua es de mala calidad, es común almacenar agua en tanques, barriles y otros recipientes, en los que pueden producirse grandes cantidades de mosquitos. De igual modo, cuando la recolección de basura es irregular o deficiente, la acumulación de materiales desechados en los patios como latas, botellas y llantas, en los que se

acumula el agua de lluvia, provee una variedad de criaderos para los mosquitos. Se necesita también prestar atención a los recipientes y llantas abandonados en áreas públicas y en basureros improvisados a orillas de los ríos y carreteras, así como en los almacenamientos de materiales para algunas industrias, por ejemplo la de renovación de llantas (Leontsini et al. 1993). En un programa de eliminación de A. aegypti, las principales medidas de saneamiento son mejorar el sistema de abastecimiento de agua, manejar adecuadamente la recolección y el reciclaje de desechos sólidos, eliminar los criaderos artificiales y naturales, y gestionar el sistema de vigilancia ambiental. Otras obras importantes relacionadas son arreglar el alcantarillado y el drenaje urbano y controlar los roedores. Por supuesto que éstas deben ser consideradas medidas fundamentales para mejorar la calidad de vida de la población y no sólo para controlar endemias. Según datos de la OPS, en 1997 en América Latina, el 80% de los municipios de zonas urbanas contaban con agua potable, y un porcentaje igual tenía recolección de basura, pero sólo el 59% tenía eliminación adecuada de los desechos urbanos como criaderos potenciales de A. aegypti. Estas cifras son sólo aproximaciones, ya que en cada país varían las coberturas de servicios y los elementos involucrados en la formación de criaderos, según las condiciones locales. Además, los datos municipales no significan necesariamente que dentro de cada uno de ellos, todas las casas tengan los servicios de agua y recolección de basura.

1.5 La Participación y Comunicación Social La participación de una comunidad debe formar una parte integral y continua de cualquier programa de lucha contra A. aegypti, sobre todo de los componentes de saneamiento ambiental y control químico. Esta participación requiere una comunicación continua entre las comunidades y el personal encargado de ejecutar el programa, con objeto de poner en marcha actividades tendientes a modificar los comportamientos humanos que propician la proliferación y el mantenimiento de criaderos potenciales de A. aegypti. Los criaderos no pueden eliminarse con sólo mejorar los servicios básicos; también es esencial modificar las prácticas y comportamientos humanos que favorecen su existencia. En muchos casos, esas prácticas se relacionan con el aprovisionamiento de agua, ya sea la de uso doméstico, que se acumula en materiales desechados como llantas, botellas y latas; a la que se mantiene en bebederos para los animales domésticos, y la que se estanca en recipientes que contienen plantas (Fernández et al. 1998, Sanders et al. 2004). También es importante contar con la participación de personas influyentes de alta credibilidad, como veterinarios y botánicos. La colaboración del sector privado es importante. Éste puede patrocinar programas de comunicación y actividades comunitarias, poner mensajes o instrucciones en las latas, platos para plantas y otros productos que suelen convertirse en criaderos, y promover el reciclaje de materiales y el uso de productos antimosquitos, como larvicidas, tapas para barriles y tela metálica (Lloyd et al. 1992).

1.6 El Control Químico Junto con la participación comunitaria, el tratamiento químico focal por trabajadores de salud es la operación fundamental de la fase de ataque de un programa contra A. aegypti. Cada trabajador debe inspeccionar las áreas peridomiciliares y el interior de las viviendas y aplicar larvicidas en los depósitos de agua que no se hayan podido destruir o eliminar. Debe

emplearse una cantidad mínima de un insecticida seguro, con un grado de toxicidad muy bajo, que no represente un peligro de contaminación para el ambiente. Los trabajadores de salud, además del tratamiento focal, tienen la tarea de educar a los moradores en la forma de colaborar para que el larvicida surta el efecto esperado (OPS 1995).

1.7 Control de Emergencias Durante los brotes epidémicos, como medida de emergencia es importante utilizar compuestos químicos que eliminen a los mosquitos adultos. Por lo tanto, cada programa debe mantener en buen estado algunas unidades de equipo pesado portátil e insecticidas. Las aplicaciones de insecticidas fríos (de ultrabajo volumen) o calientes (por nebulización térmica) son las medidas adecuadas para disminuir rápidamente la densidad del mosquito dando muerte a las hembras infectadas e infecciosas. Los insecticidas se aplican desde la calle, con las máquinas instaladas sobre vehículos. Deben aplicarse en ciclos de corta duración (de 3 a 5 días) que se repitan sucesivamente hasta que haya una disminución estable del número de enfermos en la zona. Esos tratamientos espaciales a volumen ultrabajo son apropiados para áreas urbanas en ciudades de tamaño mediano o grande, con calles planas pavimentadas. En las áreas inaccesibles al vehículo, se realizan aplicaciones con equipo portátil como medida de apoyo a las aplicaciones con equipo pesado. Los tratamientos se llevan a cabo dentro de todas las habitaciones de las casas, en los patios y corrales. Otro tratamiento adulticida de emergencia se aplica en el exterior e interior de los recipientes que no se pueden destruir, como apoyo al tratamiento con larvicidas. Se usa insecticida de efecto residual en forma de suspensión en las zonas de mayor densidad del vector (Guzmán y Kouri 2002).

1.8 La Vigilancia Entomológica Esta actividad tiene cuatro metas: 1) establecer los índices de infestación o reinfestación en cada localidad, 2) determinar la importancia relativa de los diferentes tipos de recipientes como criaderos de mosquitos, 3) investigar la presencia de otros vectores (como Aedes albopictus) que representan factores de riesgo en la transmisión del dengue, y 4) vigilar el grado de susceptibilidad de los mosquitos Aedes a los insecticidas. La vigilancia entomológica se realiza en dos etapas. En la primera es preciso conocer la distribución espacial de los mosquitos a fin de definir el riesgo de transmisión del dengue. En la segunda etapa se establecen los métodos de vigilancia para determinar los grados de infestación y detectar nuevas infestaciones. Los métodos principales de vigilancia son la inspección de casas y el empleo de ovitrampas y larvitrampas (OPS 1995). Con el primer método se examinan todos los recipientes dentro y fuera de las casas y se hace una identificación microscópica de las lar-vas encontradas. Los resultados se expresan como el índice de casas (porcentaje con estadios larvarios de A. aegypti) y el índice Breteau (número de recipientes infestados por cada 100 casas inspeccionadas). Las ovitrampas son recipientes con agua colocados por los inspectores en las casas para atraer a los mosquitos a depositar huevos en ellos. Se hacen comúnmente con secciones radiales de llantas y frascos de plástico o de vidrio. Son especialmente útiles para detectar nuevas infestaciones o reinfestaciones y resultan económicas en función del tiempo que invierten en ello los inspectores. Los resultados se expresan como un porcentaje de las trampas positivas. Para determinar el grado de infestación, no es necesario inspeccionar todas las casas de una localidad. Según las indicaciones publicadas por la OPS, dependiendo del tamaño del área donde se realiza la

encuesta y la precisión deseada en el índice, se puede tomar una muestra generalmente de 10 a 33% de las casas distribuidas uniformemente en el lugar (OPS 1995). Para detectar nuevas infestaciones, se visitan periódicamente los lugares con mayor probabilidad de convertirse de nuevo en focos de infestación para el resto del lugar, como cementerios, talleres de cambio de llantas y cementerios de automóviles (Kittayapong y Strickman 1993).

1.9 La Vigilancia Epidemiológica El objetivo de este sistema es la detección temprana de casos de dengue de manera que puedan aplicarse medidas de control lo más rápido posible, para interrumpir la transmisión y prevenir epidemias. Para ello es necesario realizar búsquedas activas de casos y estudios epidemiológicos. En todo ello se ha de tener en cuenta la situación epidemiológica particular de la zona de que se trate. De acuerdo a la OPS (OPS 1995) las etapas de vigilancia epidemiológica son: • Sistematizar y dar prioridad a la vigilancia activa como instrumento principal en la detección temprana de casos o brotes epidémicos. • Fortalecer la vigilancia activa en todas las instituciones de salud, estatales y privadas, locales y municipales, con personal debidamente capacitado. • Establecer puntos o centros centinela para vigilar la enfermedad y conocer los serotipos que circulan. Es especialmente importante poder reconocer el serotipo DEN-3 del dengue en las zonas donde no se había detectado antes. • Actualizar los conocimientos del personal médico de los diversos niveles de atención de la salud para que perfeccione su capacidad de diagnóstico diferencial, clasificación clínica y tratamiento del dengue. • Hacer análisis integrales del curso de los síndromes febriles y de la situación entomológica local para intensificar la búsqueda activa de casos. • Estratificar las diferentes zonas urbanas por factores de riesgo basados en la densidad poblacional de larvas y adultos del vector, la distribución espacial de los casos que se hayan presentado, el saneamiento ambiental, el abastecimiento de agua y los antecedentes de dengue. • Aplicar las normas técnicas divulgadas por la OPS para consolidar la vigilancia serológica y virológica de casos sospechosos. • Informar a los centros locales de los resultados de laboratorio. • Incrementar la cobertura y mantener el control de la calidad de la red de laboratorios y des-centralizar el diagnóstico serológico teniendo en cuenta las características epidemiológicas, de comunicaciones, de las vías de acceso y socioeconómicas de cada país. La vigilancia epidemiológica requiere la búsqueda activa y toma de muestras de casos febriles o comprobación del diagnóstico clínico en las comunidades, acompañada de información sobre el inicio de la fiebre y el lugar de residencia de cada paciente. Las

muestras tienen que procesarse en el laboratorio para identificar el serotipo viral infeccioso y para que sea inmediata la notificación a los centros de atención médica. La vigilancia epidemiológica se apoya en la entomológica para determinar el tipo de mosquito presente. Además, exige investigación sobre los mejores métodos de control del dengue para las distintas localidades y estudios de factores sociales que influyen en el comportamiento de la comunidad ante los criaderos de mosquitos, situaciones de alerta epidemiológica, etc. La ejecución adecuada de la vigilancia requiere sistemas de información y adiestramiento del personal involucrado en diagnóstico clínico, técnicas de laboratorio, tratamiento de casos y otros aspectos. La evaluación periódica es esencial para mantener el nivel de excelencia (OPS 1998).

1.10 Conclusiones El dengue, es una enfermedad viral con variación genética manifiesta en cuatro serotipos (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4) los cuales, al circular conjuntamente, permiten la ocurrencia de infecciones repetidas en la misma persona, ocasionando el cuadro clínico mortal de dengue hemorrágico. Las cuatro variantes son transmitidas por Aedes aegypti como vector primario y Aedes albopictus como secundario. En los países Latinoamericanos, el abandono de las campañas contra esta enfermedad provocó a partir de los 60´s, la reinfestación de A. aegypti y con ello el resurgimiento de este problema de salud pública. Actualmente esta situación tiende a agravarse, dadas las altas densidades del vector, aunado a la circulación de los cuatro serotipos y el hacinamiento de poblaciones marginadas que viven en condiciones de pobreza e insalubridad generando así las condiciones epidemiológicas para ello. Consecuencia aparte, es el efecto negativo en el desarrollo socioeconómico de los países. A. albopictus ya está bien establecido en el noreste de México, en Tamaulipas y Nuevo León; y todo indica que su invasión proveniente de U.S.A. seguirá expandiéndose hacia lo largo de la costa del Golfo de México. El vector también se encuentra en Chiapas, a donde llego proveniente de Guatemala. La presencia de este vector significa un factor que viene a complicar más la situación epidemiológica del dengue, porque es altamente competente para transmisión transovarica del virus. El plan contra A. aegypti debe ser integral. Considerando que el uso de insecticidas es sólo complementario, debe realizarse éste de manera sistematizada y en base a un programa de muestreo del vector con tamaños de muestra optimizados a niveles conocidos de probabilidad. El muestreo puede hacerse con ovitrampas, captura de adultos (media aritmética), % de recipientes positivos para larvas o pupas por cuadra, pero enfocando la medida como el estadístico p de la distribución binomial para poder inferir con poder probabilístico sobre los parámetros del vector y su estratificación poblacional; y esto hasta la fecha no existe. El uso de los índices aedicos ha sido la medida clásica poblacional para A. aegypti pero no son confiables. Ya existen estudios serios en la literatura en donde se ha demostrado que estos índices no están correlacionados con la fluctuación poblacional de adultos del vector. Esto se debe a que los índices fueron diseñados para la fiebre amarilla, y se extrapolaron empíricamente para usarlos con dengue. Hacen falta estudios para muestreo estadístico de las poblaciones de A. aegypti y A. albopictus.

Una vez que se tengan estos programas de muestreo estadístico del vector, ya se podrán estimar poblaciones o densidades criticas por localidades y ciudades, para monitoreo del vector, detección temprana de casos de dengue, eficacia del control químico por zonas o colonias, susceptibilidad a insecticidas y otras medidas adecuadas para prevenir una epidemia.

1.11 Literatura Citada Centers for Disease Control and Prevention. 1995. Dengue type 3 infection-Nicaragua and Panama, October-November 1994. MMWR 44:21-24. Fernández EA, Leontsini E & Sherman C. 1998. Trial of a community-based intervention to decrease infestation of Aedes aegypti mosquitoes in cement washbasins in El Progreso, Honduras. Acta Tropica 70: 171-183. Gubler DJ. 1988. Dengue. In: Monath TPM (ed.) Epidemiological of Arthropod-Borne Viral Disease. Boca Raton (FL), CRC Press, 380 p. Gubler DJ & Clark GG. 1994. Community-based integrated control of Aedes aegypti: a brief overview of current programs. Am J Trop Med Hyg 50: 50-60. Gubler DJ & Trent DW. 1994. Emergence of epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health problem in the Americas. Infect Agents Dis 2: 383-393. Gubler DJ & Clark GG. 1995. Dengue/dengue hemorrhagic fever: The emergence of a global health problem. Emerg Infect Dis 2: 55-57. Guzmán MG & Kouri G. 2002. Dengue: an update. The Lancet Infect Dis 2: 33-42. Halstead SB. 1992. The XXth century dengue pandemic: need for surveillance and research. Rapp Trimest Statist Sanit Mondo 45:292-298. Kittayapong P & Strickman D. 1993. Three simple devices for preventing development of Aedes aegypti larvae in water jars. Am J Trop Med Hyg 49: 158-165. Lanciotti RS, Lewis JG, Gubler DJ & Trent DW. 1994. Molecular evolution and epidemiology of dengue-3 viruses. J Gen Virol 95: 65-75. Leontsini E, Gil E, Kendall C & GG Clark. 1993. Effects of a community-based Aedes aegypti programme on mosquito larval production sites in El Progreso, Honduras. Trans Royal Soc Trop Med Hyg 87: 267-271. Lloyd LS, Winch P, Ortega-Canto J & Kendall C. 1992. Results of a community-based Aedes aegypti control program in Merida, Yucatan, Mexico. Am J Trop Med Hyg 46: 635-642. OPS. 1995. Dengue y Dengue Hemorrágico en las Américas: Guías para su Prevención y Control. Washington DC: Organización Panamericana de la Salud (Publicación científica 548).

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II. Competencia Vectorial de Aedes aegypti: El Vector del Dengue
Filiberto Reyes-Villanueva
1

Instituto Politécnico Nacional. Centro de Biotecnología Genómica, Laboratorio de Biomedicina Molecular. Boulevard del Maestro S/N esquina Elías Piña. Col. Narciso Mendoza, 88710, Apdo. Postal 152, Reynosa, Tamaulipas, México. Email: frv65@hotmail.com

2.1 Introducción El dengue es la arbovirosis más importante en las Américas por su resurgencia marcada en las últimas décadas (Seijo 2001). Es causada por un Flavivirus de cadena simple de ARN muy variable y definido en cuatro serotipos (DEN-1, DEN-2, DEN-3 Y DEN-4) para los cuales no existe vacuna. Todos ellos producen la fiebre de dengue clásico (FD), mientras que las infecciones secundarias asociadas al DEN-2 (Monath 1995) producen la expresión grave y letal conocida como fiebre hemorrágica del dengue (FHD) (Gubler 2006). El virus es primitivo y se especula que originalmente era patógeno de mosquitos para después adaptarse a los primates y al hombre (Gubler 1997). Se ha estimado que el 20% de la población mundial está en riesgo de infección, con una incidencia de 100 millones de casos de FD y 250,000 de FHD (Monath 1995). Estas incidencias ocasionan la muerte de hasta 10,000 niños anualmente debido al FDH (Rico-Hesse et al. 1997). En México, dado que circulan los 4 serotipos (Ibáñez-Bernal et al. 1997) y que el vector primario Aedes aegypti está ampliamente distribuido, la situación también es muy grave con más de 30,000 casos por año. En el noreste, el número de casos fue de 5,000 en Nuevo León en el 2003, en el 2005 rebasó los 10,000 en Tamaulipas, y en el 2007 hubo 5,000 casos en Nuevo León, con al menos 500 de FDH (MMWR 2008). 2.2 La Competencia Vectorial de Aedes aegypti Aedes aegypti transmite horizontal y verticalmente los cuatro serotipos del virus DEN y en México ya circulan todos (Gunther et al. 2007). Desde 1899, Carlos Finlay propuso que el virus de la fiebre amarilla era transmitido verticalmente por A. aegypti (Finlay 1899). Los primeros reportes comprobados para el DEN datan desde 1983, cuando fue identificado en el sureste de Asia (Burma) y en Trinidad y Tobago para América Latina, donde aislaron el virus a partir de larvas de A. aegypti colectadas en casas donde habían ocurrido casos recientes de dengue (Khin y Than 1983, Hull et al. 1984). En México, ya se reportó la transmisión vertical (no se sabe si es transovum o transovarica) de los serotipos 2, 3 y 4 que fueron aislados de adultos recién emergidos de larvas colectadas en dos zonas endémicas de Oaxaca; es un estudio reciente y el único en la literatura para A. aegypti en México (Gunther et al. 2007). Esta transmisión vertical es una adaptación del virus al vector para sobrevivir los períodos interepidémicos o el invierno, por lo que A. aegypti es el reservorio natural del virus (Tesh 1984). Y esto ya fue demostrado en laboratorio cuando el virus fue mantenido hasta la 7ª generación en A. aegypti con una tasa de infección vertical de 15% (Cuadro 1) (Joshi et al. 2002). La susceptibilidad del vector a la infección viral está asociada a las tasas de transmisión vertical que presente una determinada población. A mayor transmisión

vertical la susceptibilidad del vector a la infección se incrementa (Mourya et al. 2001). Por lo tanto, A. aegypti es el vector primario del dengue a nivel mundial por su capacidad de transmisión más sus hábitos altamente antropofílicos, endofágicos y endofílicos (Hawley 1988). Ahora bien, la competencia vectorial se define como la capacidad innata de un vector para infectarse con un patógeno, permitir su reproducción y/o replicación en él y luego transmitirlo eficientemente hacia la población huésped expuesta, y es una expresión de factores intrínsecos y extrínsecos respecto al vector (Hardi et al. 1983). Cuando una hembra queda infectada por una picadura sobre una persona viremica y que después se torna infecciosa, es el resultado de la interacción de la estructura genética del mosquito, del serotipo viral, la respuesta inmune del humano virémico sobre el cual el mosquito se alimentó, más el efecto potencial del ambiente. Cuadro 1. Mosquitos Positivos (%) para el Virus Dengue en Siete Generaciones Sucesivas de Aedes aegypti* (Tomado de Joshi et al. 2002). Machos Números positivos Probados (%) 123 3 (2.4) 158 12 (7.6) 258 22 (8.5) 122 8 (6.6) 154 14 (9.1) 145 13 (9.0) 157 16 (10.2) Hembras Números positivos positivo Probados (%) 167 5 (3.0) 144 14 (9.7) 173 34 (19.7) 125 21 (16.8) 166 23 (13.9) 120 18 (15.0) 176 26 (14.8)

Total (%) 2.8 8.6 13.0 11.7 11.6 11.7 12.6

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7

* P = 0.0088 por la prueba exacta de Fisher, en donde la proporción de machos y hembras fueron comparadas

El tiempo (días) que transcurre desde la ingesta de sangre virémica hasta que el virus infecta glándulas salivales, se conoce como Período de Incubación Extrínseca (PIE) (Fig. 2), mientras que los días que transcurren entre dos alimentaciones a repleción o bien entre dos oviposiciones, se llama ciclo gonotrófico (CG) (Clements 1992). Cuando existe una congruencia de una sola comida de sangre-una oviposición para un CG, se dice que ese mosquito posee concordancia gonotrófica y es “concordante”. Si no exhibe esa tendencia o hay varias alimentaciones parciales o completas (“pregravidez”) o bien varias oviposiciones, se ha propuesto el concepto de discordancia gonotrófica y el mosquito es “discordante” (Swelengrebel 1929, Rao 1947, Gillies 1955). A. aegypti es un mosquito discordante porque la ingestión de comidas múltiples ya está bien documentada en la literatura desde hace mucho tiempo (MacDonald 1956). Puede ingerir hasta 5 l de sangre pero si ingiere 2 l o menos, la hembra va a digerir la sangre en 36-48 h y se tornará hambrienta nuevamente (Klowden 1994). Procesando hembras histológicamente se ha registrado una alta incidencia de comidas múltiples parciales (Scott et al. 1993). También se sabe que la longitud alar se relaciona directamente con el volumen de sangre ingerida y que cuando la longitud

alar es menor de 2.7 mm, esa hembra requerirá una 2da comida en 24-36 h (Klowden y Lea 1979, Feinsod y Spielman 1980). El tamaño corporal es muy variable en las poblaciones naturales y afecta la duración del PIE y del CG. El tamaño del adulto dependerá de la densidad larval en los criaderos. Se considera que de una densidad de 200 larvas/L emergerán adultos grandes con longitud alar de 3.0 – 3.7 mm, una densidad de 400 larvas/L producirá adultos con longitud alar de 2.4 – 3.3 mm, y finalmente los criaderos con “hacinamiento extremo” de más de 1000 larvas/L producirán adultos pequeños en el rango de 2.1 – 2.9 mm (Briegel 1990). Por lo tanto, entre los diferentes factores extrínsecos, el tamaño corporal es importante porque afecta al tamaño del inóculo viral, al producto del título viral y al volumen de sangre ingerida (tamaño del mosquito), y ello a su vez determina la probabilidad para que el virus se disemine dentro de la hembra hasta llegar a la infección de glándulas salivales (Rosen et al. 1985).

Fig. 2. Estructuras que funcionan como barreras de competencia vectorial en un mosquito contra la invasión de un patógeno. En el caso del virus Dengue éste tiene que pasar por membrana peritrófica (C), epitelio estomacal y lámina basal (D), y glándulas salivales (H). El tiempo que transcurre desde la ingestión de la sangre virémica hasta que el virus está en glándulas salivales, se conoce como Período de Incubación Extrínseca (PIE) (Tomado de Beerntsen et al. 2000).

Las hembras grandes ingieren el doble de sangre que las pequeñas y su fecundidad se cuadruplica; también presentan una mayor agresividad de picadura conforme aumenta su longevidad (Steinwascher 1982), lo cual sugiere que estas hembras pueden ser más peligrosas epidemiológicamente. No obstante, las hembras pequeñas son más propensas a ingerir comidas múltiples completas o parciales en el mismo CG por ser adultos débiles nutricionalmente (Nasci 1991). En nuestros estudios llevados a cabo con las poblaciones de A. aegypti en la zona metropolitana de Monterrey, NL, hemos observado que la población de adultos exhibe una curva bimodal en el año con el pico mayor durante el período agostonoviembre en congruencia con las lluvias de origen ciclónico (Salas-Luévano y ReyesVillanueva 1994). También hemos registrado que las comidas múltiples son un evento común en las poblaciones vectoriales locales con lo cual aumenta el riesgo de infección. En otro estudio demostramos que la longitud alar de las hembras de Monterrey, NL, varían de 1.8 hasta 3.3 mm y que las pequeñas (longitud alar < 2.9 mm) son más propensas a ingerir 2-3 alimentaciones de sangre en 36 horas (Reyes-Villanueva 2004). Este escenario es muy peligroso porque cada comida significa una picadura por una hembra que puede ser infecciosa al tener el virus en glándulas salivales. Mediante un modelo logístico (Fig. 3)

observamos que las hembras grandes tienen una probabilidad para comidas múltiples de 0.20 la cual se eleva hasta 0.60 para el caso de las pequeñas (Reyes-Villanueva y RodríguezPérez 2004). En resumen, la longitud alar es una variable clave a registrar en las poblaciones de A. aegypti cuando se está conduciendo un estudio sobre competencia vectorial, tanto en laboratorio como en campo. El PIE se acorta a mayor temperatura. A 30oC se ha reportado que fluctúa entre 12 y 15 días, para mosquitos infectados con una dosis viral alta y baja respectivamente (Watts et al. 1987). Aquí es importante la dosis con que se infecta el mosquito porque ésta determina el tiempo en días de la viremia en los enfermos (Halstead 2008). En los estudios pioneros sobre este tópico y llevados a cabo con humanos, se determinó que el PIE duraba entre 4.5 y 7 días, extendiéndose en algunos casos hasta 10 días, y que ocurrió cuando los mosquitos se infectaron al alimentarse sobre enfermos a las 6–18 h antes de período febril (Simmonds et al. 1931). Recientemente se publicó que independientemente de la temperatura, el PIE tiene una duración de entre 8 y 10 días, si las hembras se alimentan sobre sangre virémica cuyos títulos sean superiores a 105 – 107/ml (Monath 1995). En general, el PIE es muy variable y se necesita que la dosis infecciosa media para mosquitos (DIM50) se eleve hasta un título de 108 partículas por ml, sin mencionar el efecto del serotipo, porque en un experimento se registró que cuando los mosquitos se alimentaron sobre humanos enfermos con el DEN-1 (poco adaptado a humano) el PIE se alargó a 14 días (Sabin 1952). En un estudio se infectaron mosquitos con DEN-2 y con dosis ascendentes de títulos virales; se encontró que a los 14 días postalimentación, la tasa de mosquitos positivos para el virus fue de 3% a la dosis más baja de DIM50/ml de 105.2, mientras que la proporción llegó hasta el 100% cuando se alimentaron con una DIM50 DE 109.2 (Fig. 4). Por lo tanto, en este estudio los autores concluyeron que una dosis de 108 era suficiente para infectar al 90% de los mosquitos con el DEN-2 (Vazeille-Falcoz et al. 1999). En un estudio reciente con DEN-2 se encontró que el número de copias de ARN del DEN-2 alcanzó un máximo a los 8 días postinfeccion fluctuando entre 6 y 9 días mediante el uso de PCR en laboratorio (Richardson et al. 2006). En conclusión pensamos que un estimador promedio para el PIE es de 10 días, en la consideración de que a menudo, los mosquitos infecciosos fallan para transmitir el virus a una persona sana (Bancroft et al. 1982). Otra variable clave de competencia vectorial es estimar el CG.

Fig. 3. Regresión logística para estimar la probabilidad de que una hembra de A. aegypti permanezca como gonoinactiva (= pregravida) después de alimentarse de sangre a repleción, en función de la longitud alar, para las poblaciones vectoriales de Monterrey, NL (Reyes-Villanueva y Rodríguez-Pérez 2004). El intervalo entre dos oviposiciones (o entre dos alimentaciones a repleción “teóricamente”) es relevante porque permite estimar la probabilidad para que una hembra llegue a transmitir al virus. El CG se ha estudiado en este vector desde hace mucho tiempo. A nivel de laboratorio el CG se ha estimado con un intervalo de 3 a 5 días, pero en estudios usando la técnica de marcaje-recaptura se ha estimado en 4 días en Tanzania, África a una temperatura promedio de 24oC (McClelland y Conway 1971). Estos autores reportaron que una hembra fue recapturada al 4to día y luego otra vez al 5to día, evidenciándose que la ingesta múltiple son comunes hasta también el 2do CG. Nuevamente, la incidencia de comidas múltiples complica el cálculo del CG. En los estudios de laboratorio de CG al menos el 50% de las hembras se alimentan por segunda ocasión al primer día y en el campo se ha encontrado que una proporción significativa de hembras capturadas, tiene sangre fresca en el estómago o bien son semi o grávidas completas (MacDonald 1956), tal y como lo hemos encontrado en Monterrey. Otro método para calcular el CG en campo es mediante el análisis con correlaciones cruzadas de una serie de tiempo de capturas diarias (Mutero y Birley 1987). Este método se basa en la correlación por mínimos cuadrados que existe entre las paridas y totales de una población al analizarse con diferentes días de retraso (lags). Nosotros colectamos una serie de tiempo de 20 días consecutivos y al aplicar este método pero con estimadores de máxima verosimilitud con SAS, el CG resultó ser de 5 días para A. aegypti de Monterrey (Cuadro 2). Pensamos que este método es más confiable y más práctico para la estimación del CG a partir de poblaciones de campo del vector. El CG está asociado a otra variable de competencia vectorial para estimar la probabilidad de infección, que es la tasa diaria de sobrevivencia. Esta variable se expresa como una fracción a nivel de centésimas porque se refiere a un valor de probabilidad y su símbolo es P. Los experimentos para determinar el valor de P en campo son notoriamente variables pero si hay

consenso en que el estimador para una población se ubica entre 0.87 y 0.91 con un promedio de 0.89 para los estudios en áreas endémicas de Asia (Focks et al. 1993).

Fig. 4. Proporción de hembras de A. aegypti infectadas con DEN-2 a los 14 días postalimentación y a dosis ascendentes de partículas virales (DIM 50) (Modificado de Vazeille-Falcoz et al. 1999).

El valor integral de P = 0.89 resulta en una longevidad promedio de 8.6 días. Debido a que la población declina exponencialmente con la edad y aunque la mayoría de las hembras muere a edad temprana, la cola de esta distribución contiene las raras hembras más viejas (e infecciosas) que son capaces de transmitir al virus. No obstante la mayoría de las hembras no son infecciosas antes de morir. Tradicionalmente se ha considerado que P se mantiene constante en la vida del mosquito (Service 1993), pero estudios recientes señalan que P aumenta con la edad del vector. Mediante marcaje-recaptura de A. aegypti en campo en Puerto Rico, encontraron que P sí aumenta con la edad, ya que sus valores fueron de P = 0.75 para hembras jóvenes de 3 días (edad de liberación de marcadas), y de 0.84 para hembras de 13 días de edad (edad de liberación de marcadas) (Harrington et al. 2001). La técnica de marcaje-recaptura es recomendable para estimar sobrevivencia en poblaciones vectoriales.

Día Lag -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Correlaciones Cruzadas Covarianza Correlación -1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 -0.786265 -0.00605 | . | . | -3.266613 -0.02512 | . *| . | 8.054254 0.06195 | . |* . | 8.176998 0.06289 | . |* . | -5.245652 -0.04035 | . *| . | -33.908800 -0.26080 | . *****| . | 1.782453 0.01371 | . | . | 42.800442 0.32919 | . |******* . | 10.129850 0.07791 | . |** . | -45.005990 -0.34615 | . *******| . | -28.727923 -0.22095 | . ****| . | 0.501575 0.00386 | . | . | 104.670 0.80504 | . |**************** | 2.727815 0.02098 | . | . | -71.125933 -0.54705 | ***********| . | -43.083926 -0.33137 | . *******| . | 46.301484 0.35612 | . |******* . | 69.888476 0.53753 | . |*********** | -20.704669 -0.15924 | . ***| . | -50.379272 -0.38748 | . ********| . | -8.203819 -0.06310 | . *| . | 25.149308 0.19343 | . |**** . | 26.969411 0.20743 | . |**** . | -42.095753 -0.32377 | . ******| . | -6.889695 -0.05299 | . *| . | "." 2 ES

Cuadro 2. Determinación del ciclo gonotrófico para poblaciones de A. aegypti en la zona de Monterrey, NL, mediante análisis de correlaciones cruzadas (método de Birley modificado para máxima verosimilitud) de series de tiempo con SAS para una serie de tiempo de 20 días de captura con cebo humano (Reyes-Villanueva F, material inédito). Note como el primer pico del índice R después del día 0 se ubica al día 5, estimándose el CG en 5 días). Una vez que el virus se disemina a las glándulas salivales la probabilidad de transmisión varía con la frecuencia de picadura, lo cual ya mencionamos se relaciona con la duración del CG. Éste es el punto clave. Las hembras que toman 2 ó 3 comidas parciales (interrumpidas) después de una comida a repleción en el mismo CG, pueden ser comidas infecciosas y aún más si las toman sobre diferentes personas. Epidemiológicamente el mayor número de comidas parciales debido a un aumento en la temperatura en 2 ó 3 oC, equivale a que la densidad de A. aegypti se duplique (Halstead 2008). Por lo tanto, porque las comidas parciales son más incidentes en las hembras pequeñas, es necesario registrar la proporción de las pequeñas como variable de competencia y estimar cuál es su proporción en el sector de las hembras más viejas. Aparte de la técnica de marcaje-recaptura, una forma empírica y práctica de estimar el % de hembras viejas es midiendo el grado de desgaste mediante una escala ordinal en los bordes posteriores de las alas de las hembras capturadas en campo (Service 1993).

2.3 Fecundidad La fecundidad de A. aegypti se ha trabajado desde los estudios clásicos de Paul A. Woke en 1937. En un estudio posterior se reportó que la sangre humana era la mejor para la

fecundidad del vector en comparación a la de otros siete vertebrados, incluyendo anfibios (una rana) (Woke et al. 1956). Sin embargo, estos estudios pioneros se llevaron a cabo sin controlar otras variables independientes clave como lo son la densidad larval y el tamaño corporal del adulto. Woke determinó la fecundidad “máxima” de A. aegypti porque usó una densidad de sólo 50 larvas/L y aunque no registró tamaño corporal seguramente trabajó con hembras muy grandes y nutricionalmente óptimas en sus estudios. En otro estudio clásico se pesó el volumen de sangre ingerida (mg) por cada hembra y se correlacionó con el número de huevos puestos, y se calculó la ecuación de regresión Y = 15.2 + 28.2X, pero curiosamente no mencionaron nada acerca de la densidad larval usada para obtención de los adultos (Hien 1976). Aunque la fecundidad está limitada por el número de ovariolas que tiene cada ovario (100–120 ovariolas/ovario) en A. aegypti (Christophers 1960), sí disminuye marcadamente con la edad fisiológica en los mosquitos (Hurd et al. 1995). El número de huevos varía entre 72 y 158/hembra, de manera que la mediana del número de ovariolas (113) es muy similar a la mediana de huevos/hembra (115). Hembras jóvenes (3 días de edad) que se alimentaron sólo de sangre de pollo produjeron una media de 60± 3 huevos, mientras que hembras viejas (12 días) alimentadas de azúcar y sangre de pollo pusieron 75± 5 huevos respectivamente (Nayar y Sauerman 1977). La isoleucina es un aminoácido esencial para la vitelogénesis en mosquitos (Briegel 1990). La sangre de aves y roedores tiene mayores niveles de este aminoácido que la sangre humana (Day et al. 1994). No obstante paradójicamente cuado A. aegypti se alimenta sólo de sangre humana es más fecundo y longevo que cuando se alimenta sobre aves o roedores. Lo anterior se debe a que la ingestión de sangre pobre en isoleucina induce en las hembras la movilización de nutrientes de sus propias reservas para completar la ovogénesis (Briegel 1990). En Puerto Rico, adultos grandes de 2.95 mm de longitud alar y confinados en jaulas, se alimentaron con sangre humana, y sangre humana más azúcar; reportaron una media de 18 huevos/día en aquellos con sólo sangre humana, y de 13 huevos/día para aquellos con dieta combinada (Naksathit y Scott 1998). Este estudio de Puerto Rico puede ser útil como referencia para estudios de fecundidad. Es necesario medir la longitud alar cuando se va a estimar fecundidad en mosquitos alimentados solo con sangre humana, tal y como sucede en las poblaciones urbanas de A. aegypti que usualmente no ingieren azúcares (Edman et al. 1992, Scott et al. 1997), aunque en el sur tropical de México sí se ha reportado hasta un 21% de mosquitos positivos para azúcares en campo (Martínez-Ibarra et al. 1997). Dada la controversia en este tópico, es aconsejable controlar también la densidad larval de cría de la colonia experimental, lo cual permitirá una mayor confiabilidad en los estimadores de fecundidad si se registra el tamaño corporal independientemente de la dieta, y luego correlacionarlo con el número de huevos puestos por cada hembra, tal y como lo manejó Briegel (1990). Según este autor, como ya se mencionó anteriormente, la densidad larval puede ser de 200, 400 y 1000 larvas/l y la longitud alar estará en el rango de 3.0–3.7 mm, 2.4–3.3 mm y 2.1–2.9 mm respectivamente. Este criterio también es confiable para aplicarlo experimentalmente en estudios de fecundidad de A. aegypti. En nuestros estudios hemos encontrado hembras muy pequeñas en el rango de 1.8 – 2.0 mm para Monterrey, así la mediana del rango 1.8 –3.3 mm es 2.6 mm para la localidad (Reyes-Villanueva 2004). 2.4 Dispersión de adultos Debido a que A. aegypti es altamente sinantrópico, sus poblaciones de adultos tienden a permanecer en o muy cerca de los sitios (o cuadras) en donde se criaron como larvas (Edman et al. 1998). Estudios clásicos en base a marcaje-recaptura han demostrado que aunque los

adultos se pueden desplazar hasta 500 m o más (en África), la mayoría de la población se queda en un diámetro no mayor de 50 m a partir del punto de liberación, en zonas urbanas (Sheppard et al. 1969, Trpis y Haussermann 1986, Trpis et al. 1995). Se debe a que su comportamiento altamente endofágico y endofílico hace que las hembras permanezcan dentro de las casas en la vecindad inmediata de sus sitios de cría, y además los machos también tienden a entrar a las casas para buscar y copular con las hembras. No obstante, el comportamiento de oviposición determina en parte el grado de dispersión de los adultos; si en un sitio o en las casas de una cuadra urbana se eliminan los criaderos larvales y de oviposición, los adultos van a tender a desplazarse a las cuadras vecinas en busca de sitios de oviposición. El grado de abundancia y características de los criaderos larvales como sitios de oviposición, son variables en función de la estación, localidad, colonia y nivel socioeconómico de los habitantes de las casas. En la medida que haya pocos criaderos es que las hembras de A. aegypti tenderán a estar fuera de las casas dispersándose en busca de sitios de oviposición. Por lo tanto se requiere hacer una inspección muy cuidadosa de los criaderos larvales potencialmente disponibles para oviposición, en las casas de la colonia o localidad donde se llevará a cabo un estudio sobre dispersión de este vector. También la técnica de marcajerecaptura es la aconsejable en este tipo de estudios (Edman et al. 1998). 2.5 Literatura Citada Bancroft WH, Scott RM, Brandt WE, McCown JM & Eckels KH.1982. Dengue-2 vaccine: infection of Aedes aegypti mosquitoes by feeding on viremic recipients. Am J Trop Med Hyg 31: 1229-1231. Beerntsen BT, James AA & Christensen BM. 2000. Genetics of mosquito vector competence. Microbiol & Mol Biol Rev 64: 115-137. Briegel H. 1990. Metabolic relationship between female body size, reserves, and fecundity of Aedes aegypti. J Insect Physiol 36: 165-172. Christophers SR. 1960. Aedes aegypti (L.) The Yellow Fever Mosquito: its Life History, Bionomics and Structure. Cambridge University Press. 738 pp. Clements AN. 1992. The Biology of Mosquitoes. Vol.1, Reproduction. London: Chapman & Hall. Development, Nutrition and

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III. Control de Mosquitos con Aplicaciones de Spinosad: Un Nuevo Bioinsectida
Juan Guillermo Bond Compean1, Carlos F. Marina 1, Claudia M. Pérez2 y Trevor Williams 2,3
1

Centro de Investigación de Paludismo- INSP, Tapachula, Chiapas; México, Email: gbond@insp.mx . 2El Colegio de la Frontera Sur (ECOSUR), Tapachula, Chiapas, México, 3Instituto de Ecología, A.C., Veracruz, México.

3.1 Introducción El control de los insectos vectores de importancia médica en México se realiza principalmente a través de la aplicación de insecticidas órganofosforados y piretroides (Arredondo-Jiménez et al. 1993, WHO 1995). Sin embargo, existe evidencia desde hace años de que el uso excesivo de estos insecticidas provocan daños a la salud del hombre y al ambiente (Attaran et al. 2000, Walker 2000). Por otra parte, los mosquitos han desarrollado resistencia hacia los insecticidas sintéticos (Sina y Aultman 2001, Braga et al. 2004). Estos problemas han causado que la Organización Mundial de la Salud (OMS) considere necesario el desarrollo de nuevos métodos de control, que sean menos dañinos a la salud humana debido a la persistencia y bioacumulación de compuestos xenobióticos persistentes en los ecosistemas, así como a los organismos no blanco y al ambiente. En este contexto, la OMS considera de gran importancia la identificación y evaluación de nuevos métodos de control alternativos en la lucha antivectorial (WHO, 1991; 1995).

3.2 El Spinosad: Un Insecticida Biorracional El spinosad es una mezcla de dos moléculas macrólidos tetracíclicas, spinosina A y D, producidas durante la fermentación de un actinomiceto del suelo Saccharopolyspora spinosa (Thompson et al. 1999). Su modo de acción se caracteriza por la excitación del sistema nervioso central de los insectos, mediante la activación de los receptores acetilcolínicos nicotínicos post-sinápticos y los receptores GABA, causando contracciones involuntarias de los músculos, temblores y la muerte (Salgado1997). Este bioinsecticida presenta muy baja toxicidad para mamíferos y aves, mientras que se considera ligeramente tóxico para peces (Thompson et al. 1999) y poco tóxico para la mayoría de los insectos depredadores que funcionan como enemigos naturales (Williams et al. 2003). Debido a estas características, la Agencia de Protección al Ambiente de los Estados Unidos (EPA) lo ha clasificado como un material de bajo riesgo (Thompson et al. 2000). El spinosad, se ha utilizado principalmente para el control de plagas de cultivos de los órdenes Lepidóptera, Coleóptera y Díptera (Thompson et al.1999, Watson 2001). Las investigaciones sobre la toxicidad de spinosad hacia los dípteros son escasas y principalmente están enfocadas al control de las moscas de la fruta (Adán et al. 1996, McQuate et al. 2005). 3.3 Toxicidad del Spinosad en Laboratorio Existen pocos estudios realizados con vectores de importancia médica. Debido a la aparición de la resistencia a insecticidas sintéticos en varias especies de mosquitos (Sina y Aultman 2001, Braga et al. 2004) y a la búsqueda de nuevas opciones para el control de estos insectos,

varios trabajos de investigación se han enfocado a realizar experimentos en laboratorio para conocer el potencial del spinosad como larvicida. En general, se puede observar que es altamente tóxico para la mayoría de los vectores estudiados (Cuadro 1), con valores de concentración letal 50% (CL50) de 0.006 a 0.3 partes por millón (p.p.m.). Sin embargo, existen algunas diferencias en la susceptibilidad intra e interespecífica. Estas diferencias pueden deberse a algunas condiciones genéticas entre las especies o a diferencias entre cepas de la misma especie de vector. Por otra parte, Paul et al. (2006) reportaron una CL50 muy alta (160 p.p.m.) para Aedes aegypti, con una exposición de 72 h. Este resultado contrastante no tiene explicación dada la alta toxicidad demostrada del spinosad en el control de mosquitos en campo (Cuadro 1).

3.4 Spinosad en el Control de Mosquitos: Pruebas de Campo Estudios realizados en campo confirman la eficiencia del spinosad en el control de larvas de mosquitos comparado con el insecticida órganofosforado temefos y el insecticida microbiano Vectobac, Bacillus thuringiensis israelensis (Bti). Recipientes tratados con spinosad a 10 p.p.m. inhibieron por 22 semanas el establecimiento de estadios inmaduros de A. aegypti, Culex spp. y chironómidos (Cuadro 2). Los tratamientos de spinosad a 1 y 5 p.p.m. impidieron el establecimiento de larvas de A. aegypti en recipientes en condiciones seminaturales por 8 y 13 semanas, y se observó un porcentaje de inhibición de 55 y 84%, respectivamente (Bond et al. 2004). El tratamiento de temefos tuvo una eficiencia para impedir la cría de A. aegypti entre 8 y 11 semanas. Por otra parte, el spinosad a 1 y 5 p.p.m. demostró mayor eficiencia con Culex spp. debido a que inhibió la cría de larvas por 15 y 17 semanas, respectivamente. El tratamiento de Bti (Vectobac), realizó una pobre protección con sólo dos semanas de inhibición contra el establecimiento de inmaduros de A. aegypti y redujo la reproducción en sólo un 22% comparado con el control. Sin embargo, durante el curso del experimento se pudo observar un pequeño número de larvas muertas que sugieren que el patógeno persistió y siguió causando mortalidad en las larvas de mosquito. El Vectobac no fue efectivo contra Culex spp. (Bond et al. 2004). En un estudio reciente llevado a cabo durante las estaciones de sequía y lluvia en cementerios en el sur de Chiapas, se comparó la eficiencia del spinosad a 1 y 5 p.p.m. con la de temefos y Bti (Pérez et al. 2006). El spinosad a 1 p.p.m. inhibió completamente la cría de A. aegypti por 8 semanas mientras que a 5 p.p.m. la impidió hasta por 11 semanas (Cuadro 2). En cambio el tratamiento de temefos resultó en un control absoluto de 11 a 14 semanas, mientras que el Vectobac mostró un desempeño similar al que se observó en el estudio de Bond et al. (2004) pues inhibió la cría del mosquito durante sólo dos semanas.

Cuadro 1. Toxicidad Aguda del Spinosad en Estudios de Laboratorio en Larvas de Diferentes Especies de Mosquitos.

Especie

Tiempo de Exposición al Spinosad

CL50 (p.p.m.*) Referencia

Aedes albopictus A. aegypti

24 h 1h 1h 24 h 24 h 72 h 1h 24 h 24 h 24 h 24 h 24 h

0.2 – 0.4 0.025 0.026 0.0096 0.32 – 0.35 160 0.024 0.01 – 0.011 0.039 0.0064 0.027 0.093 – 0.12

Anopheles albimanus A. gambiae A. stephensi Culex pipiens C. quinquefasciatus C. quinquefasciatus Cepa VBFmcq** Cepa HAmCq** Cepa MAmCq** Cepa S-Lab**

Liu et al. (2004a) Bond et al. (2004) Pérez et al. (2006) Romi et al. (2006) Darriet et al. (2005) Paul et al. (2006) Bond et al. (2004) Darriet et al. (2005) Romi et al. (2006) Romi et al. (2006) Cetin et al. (2005) Darriet et al. (2005) Liu et al. (2004b)

24 h 24 h 24 h 24 h

0.3 0.07 0.3 0.1

* p.p.m. = partes por millón (1 mg/litro = 1 p.p.m.). ** Cepas con resistencia a los insecticidas sintéticos.

Por otra parte, tanques sépticos turcos tratados con 100 y 200 g de spinosad por hectárea tuvieron una eliminación de las larvas de C. pipiens por siete días y un alto nivel de control (>80%) hasta 14 días post-tratamiento (Cetin et al. 2005). La breve duración del control observado en los tanques sépticos probablemente fue debido a la dilución continua del material activo y la degradación microbiana en este tipo de hábitat. En un estudio reciente, el spinosad fue formulado con sacarosa y aplicado por pulverización a árboles de acacia en un oasis aislado del desierto de Israel (Muller y Schlein 2006). Los adultos de Anopheles sergentii y A. caspius utilizan los flores de acacia como su principal fuente de azúcares y la aspersión de spinosad resultó en una disminución muy importante del número de mosquitos capturados, hasta casi eliminar la poblaciones de estos vectores. Finalmente, en la mosca tsetse (Glossina palpalis gambiensis y G. morsitans morsitans) se evaluó la toxicidad por vía tópica y se encontró que el spinosad es extremadamente tóxico para dicho insecto, pudiendo llegar a ser una alternativa al uso de insecticidas como el endosulfán y la deltametrina en las aspersiones aéreas en países africanos (Deken et al. 2004).

Cuadro 2. Tiempo (en semanas) de inhibición absoluta de establecimiento de inmaduros de Aedes aegypti, Culex spp. y chironómidos en recipientes tratados con spinosad, temefos y Vectobac (Bacillus thuringiensis israelensis) en tres estudios de campo.

Especie Estudio y tratamientos

A. aegypti 3.5 Persist encia de Spinos ad y Respu esta de Ovipo sición de Aedes aegypt i Estudio 1- Bond et al. (2004) No. de larvas + pupas en el control Tiempo de inhibición absoluta Spinosad 1 p.p.m. Spinosad 10 p.p.m. Temefos Estudio 2- Bond et al. (2004) No. de larvas + pupas en el control Tiempo de inhibición absoluta Spinosad 5 p.p.m. Vectobac Temefos Estudio 3- Pérez et al. (2006) No. de larvas + pupas en el control Tiempo de inhibición absoluta Spinosad 1 p.p.m. Spinosad 5 p.p.m. Vectobac Temefos 5286

Culex spp.

Chironómidos

646

1014

8 > 22 8 2326

15 > 22 13 203

8 > 22 2 934

13 2 11

17 0 16

7 3 2

La 527- 2814 persist encia del 7 -8 spinos 9 -11 ad 2 puede 11 -14 ser afectada por la radiación solar. Soluciones de spinosad fueron expuestas a la radiación solar directa y comparada con tratamientos establecidos en condiciones de sombra y laboratorio. Los resultados de este estudio indican que la desactivación del spinosad expuesto al sol fue aproximadamente diez veces mas rápida comparada con condiciones de sombra (Pérez et al. 2006). La vida media del tratamiento expuesto al sol fue de aproximadamente 2 días comparado con >20 días en la sombra. Hubo una correlación importante entre la dosis acumulativa de radiación ultravioleta (UV) y la actividad residual insecticida de las soluciones de spinosad expuestas al sol. Por otra parte, se realizó un experimento en jaulas con recipientes de agua pura y tratados con spinosad para investigar la atracción-repelencia de mosquitos adultos. Las hembras grávidas de A. aegypti fueron más atraídas por el tratamiento de 20 p.p.m. de spinosad comparado con agua sola. Este efecto no se detectó a una concentración menor (5 p.p.m.). Sin embargo, las hembras ovipositaron un número similar de huevos en ambos tratamientos con spinosad (5 ó 20 p.p.m.) comparados con sus respectivos tratamientos control. La eclosión de los huevos no fue afectada por el spinosad aunque el 94-100% de las larvas que eclosionaron en los tratamientos con spinosad murieron dentro de 24 h, debido a la presencia de residuos del bioinsecticida en la superficie de los huevos y en el papel filtro que se empleó como sustrato de oviposición (Pérez et al. 2006).

3.6 Discusión y Conclusiones Los experimentos realizados en laboratorio con spinosad han demostrado que este producto es altamente tóxico contra larvas de diferentes especies de mosquitos de importancia médica.

Estos estudios hacen suponer que este producto puede ser una valiosa alternativa en el control de larvas de moquitos culícidos y puede ser incluido dentro de los programas de manejo integrado de plagas de insectos vectores. Para maximizar la eficiencia de este bioinsecticida es necesario realizar estudios sobre formulación de liberación lenta y su validación en diversas condiciones de campo. En los pocos estudios de campo realizados hasta la fecha se ha observado que la persistencia del spinosad a concentraciones bajas (1 y 5 p.p.m.) es similar a la de temefos, y notablemente mejor que la del Bti. El spinosad es aún más efectivo a una concentración de 10 p.p.m. Sin embargo, hay que tomar en cuenta que este producto es afectado por la radiación solar (Pérez et al. 2006) y podría disminuir notablemente su eficiencia y/o la duración del control en criaderos de mosquitos como Anopheles albimanus y A. pseudopunctipennis que, por lo general, se encuentran expuestos al sol. Es interesante notar que durante estos experimentos de campo hemos observado una gran cantidad de huevos de mosquito en las paredes de los recipientes, indicando que el spinosad no repele la oviposición. Sin embargo, en estos recipientes no se observaron larvas emergidas durante los muestreos, lo cual indica un efecto ovicida o larvicida del spinosad. Las propiedades ovicidas del spinosad han sido reportadas para especies de lepidópteros (Bret et al. 1997, Peterson et al. 1998) aunque al parecer la actividad ovicida del spinosad es menor en ambientes acuáticos comparados con los causados por solventes orgánicos (Pineda et al. 2000). El spinosad es un compuesto que presenta muy baja toxicidad a los vertebrados. En el caso de los mamíferos la DL50 es mayor a 5000 mg/Kg en ratones. Para las aves, la toxicidad es casi nula, en tanto que para los peces se clasifica de ligera a moderada y una CL 50 entre 5 y 30 p.p.m., dependiendo de la especie (Thompson et al. 2000). Asimismo, los riesgos hacia la salud humana son mínimos y eso puede ser una ventaja para su uso en el control de mosquitos. Sin embargo, el impacto del spinosad sobre organismos acuáticos no blanco ha sido poco estudiado. Este compuesto es tóxico para varias especies de invertebrados acuáticos como lo son Daphnia spp., chironómidos, camarones y moluscos (Pest Management Regulatory Agency 2001). Se ha observado que la exposición continua de Daphnia pulex a spinosad a >0.01 p.p.m, puede llevar a la extinción de la población, aunque el insecticida órganofosforado diazinón fue cinco veces mas tóxico (Stark y Vargas 2003). En conclusión, el bioinsecticida spinosad debido a sus propiedades tiene muy buenas posibilidades para ser tomado en cuenta como herramienta en los programas de control de los estadios acuáticos de vectores de importancia médica. Será necesario emplearlo cuidadosamente en combinación con otros insecticidas biorraccionales, como el metopreno y el Bti, para evitar el desarrollo de resistencia en las poblaciones de vectores. Además, se requiere de estudios más detallados que corroboren los resultados de nuestras investigaciones y también el desarrollo de formulaciones de liberación lenta para ser utilizadas en tanques, tambos y otro tipo de recipientes que son utilizados para almacenar agua en las casas. Consideramos que el spinosad tiene el potencial de ser un larvicida muy eficiente en el control de insectos vectores de importancia médica.

3.7 Literatura Citada Adán A, Del Estal P, Budia F, González M & Viñuela E. 1996. Laboratory evaluation of the novel naturally derived compound spinosad against Ceratitis capitata. Pest Sci 48: 261-268.

Arredondo-Jiménez JI, Rodríguez MH, Brown DN & Loyola EG. 1993. Indoor low-volume insecticide spray as a method for the control of Anopheles albimanus in southern México. J Am Mosq Control Assoc 9: 210-220. Attaran A, Roberts DR, Curtis CF & Kilama WL. 2000. Balancing risks on the backs of the poor. Nature Medicine 6: 729-731. Bond JG, Marina CF & Williams T. 2004. The naturally derived insecticide spinosad is highly toxic to Aedes and Anopheles mosquito larvae. Med & Vet Entomol 18: 50 -56. Braga IA, Pereira-Lima JB, Da Silva-Soares S & Valle D. 2004. Aedes aegypti resistance to temephos during 2001 in several municipalities in the states of Rio de Janeiro, Sergipe, and Halagaos, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 99: 199 – 203. Bret BL, Larson LL, Schoonover JR, Sparks TC & Thompson GD. 1997. Biological properties of spinosad. Down to Earth 52: 6-13. Cetin H, Yanikoglu A& Cilek JE. 2005. Evaluation of the naturally – derived insecticide spinosad against Culex pipiens L. (Diptera: Culicidae) larvae in septic tank water in Antalya, Turkey. J Vector Ecol 30: 151 – 154. Darriet F, Duchon S & Hougard JM. 2005. Spinosad: a new larvicide against insecticideresistant mosquito larvae. J Am Mosq Control Assoc 21: 495-496. Deken R, Speybroeck N, Gillain G, Sigue H, Batawi K & Bossche V. 2004. The macrocyclic lactone “spinosad,” a promising insecticide for Tsetse fly control. J Med Entomol 41: 814818. Liu H, Cupp EW, Guo A & Liu N. 2004a. Insecticide resistance in Alabama and Florida mosquito strains of Aedes albopictus. J Med Entomol 41: 946 – 952. Liu H, Cupp EW, Miche KM, Guo A & Liu N. 2004b. Insecticide resistance and crossresistance in Alabama and Florida strains of Culex quinquefaciatus (S.). J Med Entomol 41: 408 – 413. McQuate GT, Sylva CD & Jang EB. 2005. Mediterranean fruit fly (Dipt., Tephritidae) suppression in persimmon through bait sprays in adjacent coffee plantings. J Appl Entomol 129: 110 – 117. Muller G & Y Schlein. 2006 Sugar questing mosquitoes in arid areas gather on scarce blossoms that can be used for control. International J Parasitol. 36:1077-1080. Pest Management Regulatory Agency. 2001. Spinosad. Success 480SC Naturalyte Insect Control Product. Conserve 480 SC Naturalyte Insect Control Product. Regulatory Note REG2001-10 Pest Management Regulatory Agency, Health Canada. Ottawa, Canada. Pérez CM. 2006. Spinosad, a naturally-derived insecticide, for control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae): efficacy, persistence and oviposition response. Tesis de Maestría. El Colegio de la Frontera Sur, Tapachula, Chiapas.

Peterson LG, Herzog GA, DuRant JA, Pilsner PF, Micinski S & Larson LL. 1998. Ovicidal activity of Tracer against heliotine species in convencional cotton. Down to Earth 53: 22-25. Pineda S, Budia F, Schneider MI, Gobbi A, Viñuela E & De Estal P. 2000. Efectividad biológica de spinosad y del regulador de crecimiento RH-2485 sobre huevos de Spodoptera littoralis (Boisduval, 1833) Lepidoptera: Noctuidae). Boletín de Sanidad Vegetal Plagas 26: 483-493. Paul A, Harrington LC & Scott JG. 2006. Evaluation of novel insecticides for control of dengue vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J Med Entomol 43: 55-60. Romi R, Proietti S, Di Luca M & Cristofaro M. 2006. Laboratory evaluation of the bioinsecticide spinosad for mosquito control. J Am Mosq Control Assoc 22: 93-96. Salgado VL. 1997. Studies on the mode of action of spinosad: insect symptoms and physiological correlates. Pest Biochem & Physiol 60: 91 – 102. Sina BJ & K Aultman. 2001. Resisting resistance. Trends Parasitol 17: 305-306. Stark JD & Vargas RI. 2003. Demographic changes in Daphnia pulex (Leydig) after exposure to the insecticides spinosad and diazinon. Ecotoxicol & Environ Safety 56: 334-338. Thompson GD, Hutchins SH & Sparks TC. 1999. Development of spinosad and attributes of a new class of insect control products. The University of Minnesota. Pagina Web: http://ipmworld.umn.edu/chapters/hutchins2.htm Thompson GD, Dutton R & Sparks TC. 2000. Spinosad a case study: an example from a natural products discovery programme. Pest Management Sci 56: 696 – 702. Walker K. 2000. Cost-comparison of DDT and alternative insecticides for malaria control. Med & Vet Entomol 14: 345-354. Watson GB. 2001. Actions of insecticidal spinosyns on γ -aminobutyric acid receptors from small-diameter cockroach neurones. Pest Biochem & Physiol 71:20-28. WHO. 1991. Tropical disease. Progress in research 1989-1990. Biological Control Vectors. Chapter 10. World Health Organization. Geneva. WHO. 1995. Vector Control for Malaria and Other Mosquito Borne Diseases. Report of the WHO Study Group. Technical Report Series No. 857. World Health Organization. Geneva. Williams T, Valle J & Viñuela E. 2003. Is the naturally-derived insecticide spinosad compatible with insect natural enemies? Biocontrol Sci & Technol 13: 459-475.

IV. El Uso de la Bacteria Bacillus thuringiensis contra los Mosquitos Aedes aegypti y Aedes albopictus
Alejandra Bravo de la Parra
Instituto de Biotecnología UNAM. Apdo. Postal 510-3, Cuernavaca, Morelos, 62250, México. Email: bravo@ibt.unam.mx

4.1 Introducción
Una de las principales preocupaciones a nivel mundial es el control de insectos que constituyen plagas agrícolas y vectores de enfermedades. Las estadísticas muestran que alrededor del 30% de los cultivos agrícolas se pierden en campo o durante su almacenamiento debido a la presencia de insectos plagas. Además, muchas enfermedades como la malaria y el dengue, las cuales son trasmitidas por mosquitos, cobran cada año la vida de decenas de miles de personas, fundamentalmente niños (Porter et al. 1993). Los insectos del orden Díptera, como mosquitos, son vectores de muchas enfermedades infecciosas de amplia distribución mundial, como el dengue, virosis transmitida mediante la picadura del mosquito Aedes aegypti. Esta enfermedad es un problema de salud pública, debido a que es endémica en más de 100 países tropicales. Desgraciadamente, a la fecha, no existen vacunas ni medicamentos que puedan prevenir o curar la enfermedad, por lo que el mejor método para controlar el dengue es combatir al mosquito vector A. aegypti. Hasta el momento, el control de este tipo de insectos está basado en el empleo indiscriminado de insecticidas químicos, lo que ha provocado que se generen un sinnúmero de efectos adversos a nivel ambiental y de salud pública. Desde el punto de vista ambiental el uso de plaguicidas químicos ha contribuido en gran medida a la contaminación de las aguas, la alteración del equilibrio ecológico por destrucción de insectos y otras especies benéficas y el surgimiento de plagas agrícolas y vectores nuevos. Además se ha generado la selección de organismos altamente resistentes. Es por estas razones que se requieren nuevas estrategias para el control de vectores de enfermedades en humanos. La utilización de microorganismos en el control biológico de insectos es una alternativa atractiva. En este capitulo se cubren los mecanismos de acción de las toxinas insecticidas producidas por la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) y el desarrollo de tecnologías para la producción masiva de este microorganismo y su utilización en el control de mosquitos vectores.

4.2 Mecanismo de Acción de las Toxinas de Bacillus thuringiensis en el Control Biológico de Insectos Lepidópteros. Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva que produce inclusiones cristalinas durante la fase de esporulación. El factor fundamental que determina la toxicidad de Bt a un amplio rango de insectos, es la presencia de proteínas insecticidas ( -endotoxinas) contenidas en las inclusiones cristalinas parasporales. Existen dos superfamilias de toxinas: Cry y Cyt. Las proteínas Cry son muy específicas, cada toxina tiene su organismo blanco, son inocuas a

humanos, y son biodegradables. Se han utilizado como bioinsecticidas en agricultura durante los últimos 40 años. Actualmente se han descrito más de 200 toxinas Cry de Bt, sin embargo, los productos comerciales se han desarrollado con un número muy reducido de cepas de Bt y aun existe una enorme cantidad de insectos plaga contra las cuales no existe una toxina Cry definida, por lo que es necesario desarrollar más productos hacia plagas importantes a nivel comercial (de Maagd et al. 2003). Por otro lado, resulta interesante que las proteínas Cyt de Bt subsp. israelensis (Bti) potencian sinérgicamente la actividad de las toxinas Cry y retrasan la aparición de insectos resistentes a Cry. En nuestro laboratorio nos hemos dedicado a entender cómo funcionan las toxinas Cry y cuáles son las bases que explican el sinergismo entre toxinas Cyt y Cry. El entender cómo funcionan estas toxinas podrá proporcionar herramientas para tener productos basados en estas proteínas que sean más eficientes y poder garantizar su inocuidad hacia otros organismos. Las proteínas Cry son sintetizadas como protoxinas que cristalizan formando inclusiones de hasta 1 m de longitud. Cuando un organismo susceptible ingiere los cristales, éstos son solubilizados en el ambiente alcalino del intestino medio. La protoxina soluble es activada mediante digestión proteolítica. La toxina activa se une a receptores localizados en las microvellosidades de las células del epitelio intestinal. Posteriormente, la toxina o parte de ella se inserta en la membrana formando poros iónicos, llevando eventualmente a la lisis celular. Recientemente se propuso que la interacción de la toxina con el primer receptor caderina induce cambios conformacionales en la estructura de la toxina que expone nuevos sitios para digestión proteolítica. Después de que la toxina Cry se une al receptor caderina se produce un segundo corte proteolítico que elimina a la hélice -1, este procesamiento expone residuos hidrofóbicos del dominio I que permite la formación de un oligómero de 4 subunidades (Gómez et al. 2002). El oligómero es competente para la inserción en la membrana y es capaz de formar poro. El oligómero incrementa 200 veces su afinidad hacia el segundo receptor, la aminopetidasa N, la cual se encuentra y/o se moviliza hacia microdominios de membrana (lipid rafts) donde la composición lipídica de la membrana es favorable para la inserción del oligómero y formación del poro (Bravo et al. 2004). El poro formado por la toxina es poco selectivo permitiendo el paso de diversos cationes monovalentes hacia el interior de las células columnares, provocando la despolarización de la membrana plasmática y la entrada de agua hasta la lisis celular (Fig. 1). El mecanismo de acción de las toxinas Cry es muy complejo, se necesitan varios pasos y sería imposible que esta toxina evolucionara para tener efecto en mamíferos, en otros animales o en plantas.

4.3 Mecanismo de Acción de las Toxinas de Bacillus thuringiensis en el Control Biológico de Mosquitos. En el caso de las toxinas Cry activas contra mosquitos, Bti es una bacteria que produce inclusiones cristalinas compuestas por las proteínas Cry (4Aa, 4Ba, 10Aa y 11Aa) y Cyt (1Aa y 2Ba) activas contra larvas de mosquitos, vectores de diversas enfermedades humanas (Goldberg y Margalit 1977). La toxina Cyt1Aa es particularmente importante debido a que suprime la resistencia obtenida en laboratorio hacia toxinas Cry (Wirth et al. 1997) además de sinergizar la toxicidad de las mismas contra diferentes subespecies de mosquitos (Wu y Chang 1985, Wu y Federici 1994).

Bti se ha utilizado por más de 25 años en África y Asia, y aún no se reportan casos de mosquitos resistentes. Pero ¿por qué no se ha generado resistencia a este insecticida? Se ha propuesto que la presencia de ambas toxinas, Cry y Cyt, evita la resistencia, ya que se han podido aislar poblaciones de mosquitos resistentes a las toxinas Cry, pero cuando se les administran las toxinas Cry junto con Cyt se recupera la toxicidad por completo.

Fig. 1. Modelo del Mecanismo de Acción de las Toxinas de B. thuringiensis Activas contra Insectos Lepidópteros. Las toxinas Cry y Cyt matan al mosquito porque interaccionan con la membrana de las células del intestino y se insertan en esta membrana formando un poro que termina por romper las células y posteriormente matar al insecto. Cuando un insecto se vuelve resistente, es porque se modificó la proteína que la toxina Cry utiliza como receptor en las células del insecto, es decir la toxina Cry ya no se puede unir a las células y por lo tanto no puede formar el poro. En nuestro grupo de investigación encontramos que el mecanismo molecular del sinergismo entre las toxinas Cry y Cyt involucra la interacción entre estas dos toxinas. Se propone que la toxina Cyt se incorpora en la membrana y desde ahí sirve como sitio de unión o receptor para las toxinas Cry. Por eso cuando se genera una población de mosquitos resistentes a las toxinas Cry, la resistencia es totalmente abolida cuando se administran estas toxinas Cry junto con Cyt. Se han identificado las regiones exactas de las toxinas Cry11A y Cyt1A que participan en esta interacción. Se han aislado mutantes puntuales en ambas toxinas y se demostró que cuan-do se afecta la unión entre estas dos se abate por completo el efecto sinérgico (Pérez et al. 2005). También se demostró que la toxina Cyt se inserta a la membrana de los mosquitos muy eficientemente y desde ahí une a la toxina Cry permitiendo que esta forme oligómeros que interaccionan con la membrana y forman el poro, es decir que la proteína Cyt funciona como un receptor proteico para las toxinas Cry (Fig. 2). Este mecanismo explica la falta de aparición de insectos resistentes a Bti en la naturaleza y también el mecanismo del sinergismo entre estas toxinas. Éste es el primer ejemplo de una bacteria patógena cuya virulencia se basa en toxinas formadoras de poro y que ella misma

produce una proteína que funciona como receptor de sus toxinas. Sin duda Bti se puede considerar una bacteria muy interesante ya que desarrolló un mecanismo que le permite aumentar su actividad tóxica y además evitar la aparición de insectos resistentes a sus toxinas.

Fig. 2. Modelo del Mecanismo de Acción de las Toxinas de B. thuringiensis Activas contra Mosquitos.

4.4 Utilización de Bti en control de mosquitos En el año de 1983, la Organización Mundial de la Salud (OMS) implementó un programa en 11 países africanos, de utilización de Bti en el control de Simulium (vectores de oncocercosis) ya que aparecieron poblaciones de Simulium resistentes al insecticida químico que se utilizaba (Guillet et al. 1990). Este programa ha sido uno de los más exitosos en el control de esta enfermedad. En Alemania existe un programa ambicioso para el control en el río Rhin del mosquito Aedes vexans utilizando Bti, también por la aparición de poblaciones de mosquitos resistentes al insecticida químico Temefos (Becker 1997). En los últimos años se está utilizando Bti en Brasil para controlar las poblaciones de Aedes aegypti en la región de Río de Janeiro, debido a la aparición de poblaciones resistentes a insecticidas químicos y por un repunte en los casos de dengue hemorrágico en esta región (Regis et al. 2000). En todos estos casos, Bti ha mostrado que es un insecticida biológico eficiente en el control de estas poblaciones de insectos vectores de enfermedades humanas. Una de las ventajas más importantes de Bti para su aplicación en programas de control de poblaciones de mosquito es su alta especificidad y su inocuidad hacia el hombre, animales e incluso otras poblaciones de insectos. Las formulaciones de Bti se pueden aplicar a reservorios de agua que se utilizan en consumo humano, lo que no es factible con los insecticidas químicos. Otra ventaja es la falta de aparición de insectos resistentes. Después de más de 20 años de aplicación masiva de productos basados en Bti, no hay reportes de aparición de poblaciones de mosquitos resistentes a Bti. De hecho Bti se ha ocupado tradicionalmente en regiones donde las poblaciones de mosquitos han generado resistencia a insecticidas químicos. El éxito en la aplicación de Bti para el control de mosquitos depende en gran medida de tener una formulación efectiva adecuada al lugar en donde será aplicada. Como se explicó anterior-mente, Bti es activo contra el estado larvario de los mosquitos. Es por esto que su aplicación se tiene que dar en los reservorios de agua donde se desarrollan las larvas. En la actualidad existen formulaciones de Bti comerciales que garantizan el acceso de la toxina a

las larvas de Aedes aegypti sin enturbiar el agua. La Dra. Regis desarrolló una formulación donde el tiempo de actividad insecticida es de un mes a mes y medio, dependiendo si el reservorio de agua a tratar está expuesto a luz solar (Regis y Nielsen-Le Roux 2000). Otro aspecto importante para poder tener éxito en el control de A. aegypti utilizando Bti, es la participación activa de la comunidad. Esta tiene que ser la responsable de la aplicación de la formulación de Bti y permitir el acceso a sus casas y reservorios de agua al personal encargado de monitorear la efectividad y la aplicación de Bti. Por lo anterior cualquier programa de aplicación de Bti requiere una campaña de información y una convocatoria amplia de la sociedad para su aplicación. En nuestro laboratorio hemos desarrollado un producto formulado con Bt como componente activo, que fue evaluado a nivel laboratorio. La cepa de Bt utilizada es una cepa mexicana que presenta grandes semejanzas a Bti (Ibarra et al. 2003). El crecimiento de esta bacteria se realizó en la planta piloto del Instituto de Biotecnología UNAM. Éste es un formulado sólido al que se añadieron atrayentes para la larva, es activo durante un mes, matando el 100% de las larvas y no se disuelve en el agua por lo que permanece en el reservorio de agua. Este último punto es muy importante ya que implica que este formulado no se diluye cuando se presenta recambio de agua constante. El siguiente paso es realizar una prueba piloto en casas para evaluar la efectividad de este formulado y determinar si es necesario hacer nuevas modificaciones.

4.5 Conclusiones
En esta presentación se describió a detalle el mecanismo de acción de las toxinas Cry de la bacteria Bacillus thuringiensis, en donde se observa que la alta especificidad se basa en la interacción con diferentes receptores y se mostró que la bacteria Bt israelensis produce una proteína (Cyt) que funciona como receptor de sus otras toxinas (Cry). De esta manera Bti desarrolló un mecanismo que le permite aumentar su actividad tóxica y evitar la aparición de insectos resistentes a sus toxinas. Finalmente, se presentó el desarrollo de sistemas de producción y de formulaciones efectivas que permiten tener una estrategia alternativa para controlar al mosquito transmisor del dengue en nuestro país.

Podemos decir que el desarrollo de estrategias para el control de plagas utilizando B. thuringiensis, tiene potencial para sustituir paulatinamente el uso de insecticidas y biocidas químicos, lo que podría proteger a la población de infecciones de dengue y permitirá tener un medio ambiente limpio a través del uso de sustancias no tóxicas y biodegradables. 4.6 Literatura Citada Becker N. 1997. Microbial control of mosquitoes: management of the Upper Rhin mosquito population as model. Parasitol Today 13: 485-487.

Bravo A, Gómez I, Conde J, Muñoz-Garay C, Sánchez J, Miranda R, Zhuang M, Gill SS & Soberón M. 2004. Oligomerization triggers binding of a Bacillus thuringienis Cry1Ab pore-forming toxin to aminopeptidase N receptor leading to insertion into membrane microdomains. Biochim Biophys Acta 1667:38-46. De Maagd RA, Bravo A, Berry C, Crickmore N & Schnepf HE. 2003. Structure, diversity and evolution of protein toxins from spore-forming entomopathogenic bacteria. Ann Rev Genet 37:409-433. Goldberg LJ & Margalit J. 1977. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univitattus, Aedes aegypti and Culex pipiens. Mosq News 37:355–358. Gómez I, Sánchez J, Miranda R, Bravo A & Soberon M. 2002. Cadherin-like receptor binding facilitates proteolytic cleavage of helix -1 in domain I and oligomer pre-pore formation of Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin. FEBS lett. 513: 242-246. Guillet P, Kurstack DC & Meyer BR. 1990. Use of Bacillus thuringiensis israeliensis for Onchocerciasis control in West Africa. In: H. de Barjac, DJ Sutherland (eds) Bacterial Control of Mosquitoes and Blackflies, Rutgers Univ Press, New Jersey, 187-190. Ibarra JE, del Rincón MC, Ordúz S, Noriega D, Benintende G, Monnerat R, Regis L, de Oliveir CMF, Sánchez J & Bravo A. 2003. Diversity of Bacillus thuringiensis strains from Latin America with insecticidal activity against different mosquito species. Appl Environ Microbiol 69:5269-5274. Pérez C, Fernandez LE, Sun J, Folch JL, Gill SS, Soberón M & Bravo A. 2005. Bti Cry11Aa and Cyt1Aa toxins interactions support the synergism-model that Cyt1Aa functions as membrane-bound receptor. Proc Natl Acad Sci (USA) 102:18303-18308. Porter AG, Davidson EW & Liu JW. 1993. Mosquitocidal toxins of Bacilli and their genetic manipulation for effective biological control of mosquitoes. Microbiol Rev 57, 838–861. Regis L, da Silva SB & Melo-Santos MA. 2000. The use of bacterial larvicides in mosquito and black fly control programes in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 95:207-210. Regis L & Nielsen-LeRoux C. 2000 Management of Resistance to Bacterial Vector Control. In: E Charles J-F, Délecluse A & LeRoux N (eds.) Entomopathogenic Bacteria: From Laboratory to Field Application. Kluwer Academic Publishers.The Netherlands. p 410440. Wirth MC, Georghiou GP & Federici BA. 1997. CytA enables CryIV endotoxins of Bacillus thuringiensis to overcome high levels of CryIV resistance in the mosquito Culex quinquefasciatus. Proc Natl Acad Sci. (USA) 94:10536–10540. Wu D & Chang FN. 1985. Synergism in mosquitocidal activity of 26 and 65 kDa proteins from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis crystal. FEBS Lett. 190:232–236.

Wu D, Johnson JJ & Federici BA. 1994. Synergism of mosquitocidal toxicity between CytA and CryIVD proteins using inclusions produced from cloned genes of Bacillus thuringiensis. Mol Microbiol. 13:965–972.

IV. El Uso de la Bacteria Bacillus thuringiensis contra los Mosquitos Aedes aegypti y Aedes albopictus
Alejandra Bravo de la Parra
Instituto de Biotecnología UNAM. Apdo. Postal 510-3, Cuernavaca, Morelos, 62250, México. Email: bravo@ibt.unam.mx

4.1 Introducción
Una de las principales preocupaciones a nivel mundial es el control de insectos que constituyen plagas agrícolas y vectores de enfermedades. Las estadísticas muestran que alrededor del 30% de los cultivos agrícolas se pierden en campo o durante su almacenamiento debido a la presencia de insectos plagas. Además, muchas enfermedades como la malaria y el dengue, las cuales son trasmitidas por mosquitos, cobran cada año la vida de decenas de miles de personas, fundamentalmente niños (Porter et al. 1993). Los insectos del orden Díptera, como mosquitos, son vectores de muchas enfermedades infecciosas de amplia distribución mundial, como el dengue, virosis transmitida mediante la picadura del mosquito Aedes aegypti. Esta enfermedad es un problema de salud pública, debido a que es endémica en más de 100 países tropicales. Desgraciadamente, a la fecha, no existen vacunas ni medicamentos que puedan prevenir o curar la enfermedad, por lo que el mejor método para controlar el dengue es combatir al mosquito vector A. aegypti. Hasta el momento, el control de este tipo de insectos está basado en el empleo indiscriminado de insecticidas químicos, lo que ha provocado que se generen un sinnúmero de efectos adversos a nivel ambiental y de salud pública. Desde el punto de vista ambiental el uso de plaguicidas químicos ha contribuido en gran medida a la contaminación de las aguas, la alteración del equilibrio ecológico por destrucción de insectos y otras especies benéficas y el surgimiento de plagas agrícolas y vectores nuevos. Además se ha generado la selección de organismos altamente resistentes. Es por estas razones que se requieren nuevas estrategias para el control de vectores de enfermedades en humanos. La utilización de microorganismos en el control biológico de insectos es una alternativa atractiva. En este capitulo se cubren los mecanismos de acción de las toxinas insecticidas producidas por la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) y el desarrollo de tecnologías para la producción masiva de este microorganismo y su utilización en el control de mosquitos vectores.

4.2 Mecanismo de Acción de las Toxinas de Bacillus thuringiensis en el Control Biológico de Insectos Lepidópteros. Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva que produce inclusiones cristalinas durante la fase de esporulación. El factor fundamental que determina la toxicidad de Bt a un amplio rango de insectos, es la presencia de proteínas insecticidas ( -endotoxinas) contenidas en las inclusiones cristalinas parasporales. Existen dos superfamilias de toxinas: Cry y Cyt.

Las proteínas Cry son muy específicas, cada toxina tiene su organismo blanco, son inocuas a humanos, y son biodegradables. Se han utilizado como bioinsecticidas en agricultura durante los últimos 40 años. Actualmente se han descrito más de 200 toxinas Cry de Bt, sin embargo, los productos comerciales se han desarrollado con un número muy reducido de cepas de Bt y aun existe una enorme cantidad de insectos plaga contra las cuales no existe una toxina Cry definida, por lo que es necesario desarrollar más productos hacia plagas importantes a nivel comercial (de Maagd et al. 2003). Por otro lado, resulta interesante que las proteínas Cyt de Bt subsp. israelensis (Bti) potencian sinérgicamente la actividad de las toxinas Cry y retrasan la aparición de insectos resistentes a Cry. En nuestro laboratorio nos hemos dedicado a entender cómo funcionan las toxinas Cry y cuáles son las bases que explican el sinergismo entre toxinas Cyt y Cry. El entender cómo funcionan estas toxinas podrá proporcionar herramientas para tener productos basados en estas proteínas que sean más eficientes y poder garantizar su inocuidad hacia otros organismos. Las proteínas Cry son sintetizadas como protoxinas que cristalizan formando inclusiones de hasta 1 m de longitud. Cuando un organismo susceptible ingiere los cristales, éstos son solubilizados en el ambiente alcalino del intestino medio. La protoxina soluble es activada mediante digestión proteolítica. La toxina activa se une a receptores localizados en las microvellosidades de las células del epitelio intestinal. Posteriormente, la toxina o parte de ella se inserta en la membrana formando poros iónicos, llevando eventualmente a la lisis celular. Recientemente se propuso que la interacción de la toxina con el primer receptor caderina induce cambios conformacionales en la estructura de la toxina que expone nuevos sitios para digestión proteolítica. Después de que la toxina Cry se une al receptor caderina se produce un segundo corte proteolítico que elimina a la hélice -1, este procesamiento expone residuos hidrofóbicos del dominio I que permite la formación de un oligómero de 4 subunidades (Gómez et al. 2002). El oligómero es competente para la inserción en la membrana y es capaz de formar poro. El oligómero incrementa 200 veces su afinidad hacia el segundo receptor, la aminopetidasa N, la cual se encuentra y/o se moviliza hacia microdominios de membrana (lipid rafts) donde la composición lipídica de la membrana es favorable para la inserción del oligómero y formación del poro (Bravo et al. 2004). El poro formado por la toxina es poco selectivo permitiendo el paso de diversos cationes monovalentes hacia el interior de las células columnares, provocando la despolarización de la membrana plasmática y la entrada de agua hasta la lisis celular (Fig. 1). El mecanismo de acción de las toxinas Cry es muy complejo, se necesitan varios pasos y sería imposible que esta toxina evolucionara para tener efecto en mamíferos, en otros animales o en plantas.

4.3 Mecanismo de Acción de las Toxinas de Bacillus thuringiensis en el Control Biológico de Mosquitos. En el caso de las toxinas Cry activas contra mosquitos, Bti es una bacteria que produce inclusiones cristalinas compuestas por las proteínas Cry (4Aa, 4Ba, 10Aa y 11Aa) y Cyt (1Aa y 2Ba) activas contra larvas de mosquitos, vectores de diversas enfermedades humanas (Goldberg y Margalit 1977). La toxina Cyt1Aa es particularmente importante debido a que suprime la resistencia obtenida en laboratorio hacia toxinas Cry (Wirth et al. 1997) además de sinergizar la toxicidad de las mismas contra diferentes subespecies de mosquitos (Wu y Chang 1985, Wu y Federici 1994).

Bti se ha utilizado por más de 25 años en África y Asia, y aún no se reportan casos de mosquitos resistentes. Pero ¿por qué no se ha generado resistencia a este insecticida? Se ha propuesto que la presencia de ambas toxinas, Cry y Cyt, evita la resistencia, ya que se han podido aislar poblaciones de mosquitos resistentes a las toxinas Cry, pero cuando se les administran las toxinas Cry junto con Cyt se recupera la toxicidad por completo.

Fig. 1. Modelo del Mecanismo de Acción de las Toxinas de B. thuringiensis Activas contra Insectos Lepidópteros. Las toxinas Cry y Cyt matan al mosquito porque interaccionan con la membrana de las células del intestino y se insertan en esta membrana formando un poro que termina por romper las células y posteriormente matar al insecto. Cuando un insecto se vuelve resistente, es porque se modificó la proteína que la toxina Cry utiliza como receptor en las células del insecto, es decir la toxina Cry ya no se puede unir a las células y por lo tanto no puede formar el poro. En nuestro grupo de investigación encontramos que el mecanismo molecular del sinergismo entre las toxinas Cry y Cyt involucra la interacción entre estas dos toxinas. Se propone que la toxina Cyt se incorpora en la membrana y desde ahí sirve como sitio de unión o receptor para las toxinas Cry. Por eso cuando se genera una población de mosquitos resistentes a las toxinas Cry, la resistencia es totalmente abolida cuando se administran estas toxinas Cry junto con Cyt. Se han identificado las regiones exactas de las toxinas Cry11A y Cyt1A que participan en esta interacción. Se han aislado mutantes puntuales en ambas toxinas y se demostró que cuan-do se afecta la unión entre estas dos se abate por completo el efecto sinérgico (Pérez et al. 2005). También se demostró que la toxina Cyt se inserta a la membrana de los mosquitos muy eficientemente y desde ahí une a la toxina Cry permitiendo que esta forme oligómeros que interaccionan con la membrana y forman el poro, es decir que la proteína Cyt funciona como un receptor proteico para las toxinas Cry (Fig. 2). Este mecanismo explica la falta de aparición de insectos resistentes a Bti en la naturaleza y también el mecanismo del sinergismo entre estas toxinas. Éste es el primer ejemplo de una bacteria patógena cuya virulencia se basa en toxinas formadoras de poro y que ella misma

produce una proteína que funciona como receptor de sus toxinas. Sin duda Bti se puede considerar una bacteria muy interesante ya que desarrolló un mecanismo que le permite aumentar su actividad tóxica y además evitar la aparición de insectos resistentes a sus toxinas.

Fig. 2. Modelo del Mecanismo de Acción de las Toxinas de B. thuringiensis Activas contra Mosquitos.

4.4 Utilización de Bti en control de mosquitos En el año de 1983, la Organización Mundial de la Salud (OMS) implementó un programa en 11 países africanos, de utilización de Bti en el control de Simulium (vectores de oncocercosis) ya que aparecieron poblaciones de Simulium resistentes al insecticida químico que se utilizaba (Guillet et al. 1990). Este programa ha sido uno de los más exitosos en el control de esta enfermedad. En Alemania existe un programa ambicioso para el control en el río Rhin del mosquito Aedes vexans utilizando Bti, también por la aparición de poblaciones de mosquitos resistentes al insecticida químico Temefos (Becker 1997). En los últimos años se está utilizando Bti en Brasil para controlar las poblaciones de Aedes aegypti en la región de Río de Janeiro, debido a la aparición de poblaciones resistentes a insecticidas químicos y por un repunte en los casos de dengue hemorrágico en esta región (Regis et al. 2000). En todos estos casos, Bti ha mostrado que es un insecticida biológico eficiente en el control de estas poblaciones de insectos vectores de enfermedades humanas. Una de las ventajas más importantes de Bti para su aplicación en programas de control de poblaciones de mosquito es su alta especificidad y su inocuidad hacia el hombre, animales e incluso otras poblaciones de insectos. Las formulaciones de Bti se pueden aplicar a reservorios de agua que se utilizan en consumo humano, lo que no es factible con los insecticidas químicos. Otra ventaja es la falta de aparición de insectos resistentes. Después de más de 20 años de aplicación masiva de productos basados en Bti, no hay reportes de aparición de poblaciones de mosquitos resistentes a Bti. De hecho Bti se ha ocupado tradicionalmente en regiones donde las poblaciones de mosquitos han generado resistencia a insecticidas químicos. El éxito en la aplicación de Bti para el control de mosquitos depende en gran medida de tener una formulación efectiva adecuada al lugar en donde será aplicada. Como se explicó anterior-mente, Bti es activo contra el estado larvario de los mosquitos. Es por esto que su aplicación se tiene que dar en los reservorios de agua donde se desarrollan las larvas. En la actualidad existen formulaciones de Bti comerciales que garantizan el acceso de la toxina a

las larvas de Aedes aegypti sin enturbiar el agua. La Dra. Regis desarrolló una formulación donde el tiempo de actividad insecticida es de un mes a mes y medio, dependiendo si el reservorio de agua a tratar está expuesto a luz solar (Regis y Nielsen-Le Roux 2000). Otro aspecto importante para poder tener éxito en el control de A. aegypti utilizando Bti, es la participación activa de la comunidad. Esta tiene que ser la responsable de la aplicación de la formulación de Bti y permitir el acceso a sus casas y reservorios de agua al personal encargado de monitorear la efectividad y la aplicación de Bti. Por lo anterior cualquier programa de aplicación de Bti requiere una campaña de información y una convocatoria amplia de la sociedad para su aplicación. En nuestro laboratorio hemos desarrollado un producto formulado con Bt como componente activo, que fue evaluado a nivel laboratorio. La cepa de Bt utilizada es una cepa mexicana que presenta grandes semejanzas a Bti (Ibarra et al. 2003). El crecimiento de esta bacteria se realizó en la planta piloto del Instituto de Biotecnología UNAM. Éste es un formulado sólido al que se añadieron atrayentes para la larva, es activo durante un mes, matando el 100% de las larvas y no se disuelve en el agua por lo que permanece en el reservorio de agua. Este último punto es muy importante ya que implica que este formulado no se diluye cuando se presenta recambio de agua constante. El siguiente paso es realizar una prueba piloto en casas para evaluar la efectividad de este formulado y determinar si es necesario hacer nuevas modificaciones.

4.5 Conclusiones
En esta presentación se describió a detalle el mecanismo de acción de las toxinas Cry de la bacteria Bacillus thuringiensis, en donde se observa que la alta especificidad se basa en la interacción con diferentes receptores y se mostró que la bacteria Bt israelensis produce una proteína (Cyt) que funciona como receptor de sus otras toxinas (Cry). De esta manera Bti desarrolló un mecanismo que le permite aumentar su actividad tóxica y evitar la aparición de insectos resistentes a sus toxinas. Finalmente, se presentó el desarrollo de sistemas de producción y de formulaciones efectivas que permiten tener una estrategia alternativa para controlar al mosquito transmisor del dengue en nuestro país.

Podemos decir que el desarrollo de estrategias para el control de plagas utilizando B. thuringiensis, tiene potencial para sustituir paulatinamente el uso de insecticidas y biocidas químicos, lo que podría proteger a la población de infecciones de dengue y permitirá tener un medio ambiente limpio a través del uso de sustancias no tóxicas y biodegradables. 4.6 Literatura Citada Becker N. 1997. Microbial control of mosquitoes: management of the Upper Rhin mosquito population as model. Parasitol Today 13: 485-487.

Bravo A, Gómez I, Conde J, Muñoz-Garay C, Sánchez J, Miranda R, Zhuang M, Gill SS & Soberón M. 2004. Oligomerization triggers binding of a Bacillus thuringienis Cry1Ab pore-forming toxin to aminopeptidase N receptor leading to insertion into membrane microdomains. Biochim Biophys Acta 1667:38-46. De Maagd RA, Bravo A, Berry C, Crickmore N & Schnepf HE. 2003. Structure, diversity and evolution of protein toxins from spore-forming entomopathogenic bacteria. Ann Rev Genet 37:409-433. Goldberg LJ & Margalit J. 1977. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univitattus, Aedes aegypti and Culex pipiens. Mosq News 37:355–358. Gómez I, Sánchez J, Miranda R, Bravo A & Soberon M. 2002. Cadherin-like receptor binding facilitates proteolytic cleavage of helix -1 in domain I and oligomer pre-pore formation of Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin. FEBS lett. 513: 242-246. Guillet P, Kurstack DC & Meyer BR. 1990. Use of Bacillus thuringiensis israeliensis for Onchocerciasis control in West Africa. In: H. de Barjac, DJ Sutherland (eds) Bacterial Control of Mosquitoes and Blackflies, Rutgers Univ Press, New Jersey, 187-190. Ibarra JE, del Rincón MC, Ordúz S, Noriega D, Benintende G, Monnerat R, Regis L, de Oliveir CMF, Sánchez J & Bravo A. 2003. Diversity of Bacillus thuringiensis strains from Latin America with insecticidal activity against different mosquito species. Appl Environ Microbiol 69:5269-5274. Pérez C, Fernandez LE, Sun J, Folch JL, Gill SS, Soberón M & Bravo A. 2005. Bti Cry11Aa and Cyt1Aa toxins interactions support the synergism-model that Cyt1Aa functions as membrane-bound receptor. Proc Natl Acad Sci (USA) 102:18303-18308. Porter AG, Davidson EW & Liu JW. 1993. Mosquitocidal toxins of Bacilli and their genetic manipulation for effective biological control of mosquitoes. Microbiol Rev 57, 838–861. Regis L, da Silva SB & Melo-Santos MA. 2000. The use of bacterial larvicides in mosquito and black fly control programes in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 95:207-210. Regis L & Nielsen-LeRoux C. 2000 Management of Resistance to Bacterial Vector Control. In: E Charles J-F, Délecluse A & LeRoux N (eds.) Entomopathogenic Bacteria: From Laboratory to Field Application. Kluwer Academic Publishers.The Netherlands. p 410440. Wirth MC, Georghiou GP & Federici BA. 1997. CytA enables CryIV endotoxins of Bacillus thuringiensis to overcome high levels of CryIV resistance in the mosquito Culex quinquefasciatus. Proc Natl Acad Sci. (USA) 94:10536–10540. Wu D & Chang FN. 1985. Synergism in mosquitocidal activity of 26 and 65 kDa proteins from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis crystal. FEBS Lett. 190:232–236.

Wu D, Johnson JJ & Federici BA. 1994. Synergism of mosquitocidal toxicity between CytA and CryIVD proteins using inclusions produced from cloned genes of Bacillus thuringiensis. Mol Microbiol. 13:965–972.

VI. Protozoarios y Microsporidios Entomoparásitos de Aedes aegypti
Filiberto Reyes Villanueva1 y James J. Becnel2

1

Instituto Politécnico Nacional. Centro de Biotecnología Genómica, Laboratorio de Biomedicina Molecular. Boulevard del Maestro S/N esquina Elías Piña. Col. Narciso Mendoza, 88710, Apdo. Postal 152, Reynosa, Tamaulipas, México. Email: frv65@hotmail.com 2 Center for Medical, Agricultural and Veterinary Entomology, USDA/ARS/CMAVE, Gainesville, Fl, 32604, P.O. Box 14565, USA. E-mail: jbecnel@gainesville.usda.ufl.edu

6.1 Introducción Los miembros del subreino Protozoa representan un grupo heterogéneo de protistas que pertenecen al reino Protoctista (Sleigh 1989). El termino “Protozoo” fue usado por primera vez por Goldfuss en 1817, según Dobell (1911) y citado por Cox (1991). Estos organismos unicelulares comprenden un grupo antiguo que se originó, antes de que aparecieran las levaduras y animales simples como poríferos y celenterados. En general poseen una fase móvil con cilios, flagelos o pseudópodos. Las células vegetativas tienen membrana y carecen de una pared estructural rígida como en hongos y plantas. En muchos casos la membrana está cubierta por el glicocalix, una película que contiene los dominios de glicolípidos y glicoproteínas, ambos responsables por las funciones del reconocimiento y adhesión a la célula huésped, además de funcionar como barrera química y albergar a varias enzimas. Debido a su naturaleza hidrocarbonada, el glicocalix se puede observar fácilmente con varias pruebas de lectina. La estructura dinámica del glicocalix proporciona una alta capacidad de sobrevivencia a los protozoarios cuando están dentro del huésped, para evitar ser reconocidos por el sistema inmune (Boucias y Pendland 1998). Son básicamente acuáticos y la mayoría son anaerobios aerotolerantes capaces de desarrollarse en un ambiente reducido de oxígeno. Usan la ruta metabólica de la glicólisis para catabolizar azúcares y excretar ácidos orgánicos. Carecen de un tracto digestivo por lo que ingieren y translocan moléculas pequeñas como aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, etc. mediante sistemas de transporte activo compuestos por membranas proteínicas. Las moléculas grandes y materiales sólidos son ingeridas como solutos (pinocitosis) o como partículas (fagocitosis), en vacuolas alimenticias que se fusionan a lisosomas donde son hidrolizados a compuestos más simples. Los taxa más grandes de protozoarios contienen especies que van desde aquellas de vida libre hasta endocomensales obligados. En estos últimos existen especies que viven en asociación íntima con eucariontes y exhiben un rango amplio de relaciones simbióticas. Por ejemplo, los que viven en el tracto digestivo de insectos pueden ser mutualistas, con una función clave en proporcionar los nutrientes necesarios para el insecto; otros protozoarios son parásitos y usan al insecto como huésped primario o secundario (Brooks 1988). Muchos son parásitos intracelulares obligatorios como los microsporidios. Estos agentes infecciosos

poseen la capacidad de poder entrar a la célula huésped, multiplicarse, afectar o no las funciones básicas de la célula y después salir de ella. Los protozoarios son el grupo de entomopatógenos con mayor diversidad específica y numérica. Existen seis Phyla (Apicomplexa, Ciliophora, Rhyzopoda, Zoomastigina, Haplosporidia y Microsporidia) que contienen especies entomopatógenas. Debido a los cambios constantes en la taxonomía y a que Boucias y Pendland (1998) revisaron las generalidades de protozoarios patógenos de insectos, aquí sólo se tocarán los grupos de gregarinas y microsporidios, los cuales tienen el mayor potencial como agentes de biocontrol de insectos plaga. Cabe aclarar que en el pasado ambos grupos fueron ubicados por Kudo (1954) en la clase Sporozoa, la cual fue propuesta por Butschli (1883-1889). 6.2 Apicomplexa – Gregarinas La taxonomía de este grupo ha sido ambigua porque los protozoarios, en general, están formados por grupos parafiléticos (grupos con ancestro común pero que no incluyen todos sus descendientes) (Lipscomb 1991), y por lo mismo, varios esquemas han sido propuestos. Uno, el más aceptado y actualmente vigente, es el de Levine (1985), quien propuso el phyllum Apicomplexa para las gregarinas en general y después lo divide en dos clases: Perkinasida (con sólo una especie parásita de ostras, Perkinsus marinus) y Sporozoasida. Esta última la divide en tres subclases: Gregarinasina, Coccidiasina y Piroplasmasina. Según Levine, Apicomplexa agrupa ~ 4,000 especies y más de 300 géneros, y para gregarinas señala que hay ~ 218 géneros. Al nivel de orden, Levine adoptó el criterio de Grassé (1953), dividiendo la clase Gregarinasina en tres órdenes: Archigregarinida (4 géneros y ~ 15 especies), Neogregarinida (14 géneros y ~ 50 especies) y Eugregarinorida (~ 200 géneros y 1,400 especies). Otra propuesta ha sugerido la clase Gregarinea, phyllum Sporozoea y reino Protista (Sleigh 1989). Con un enfoque más natural, se ubican a los microsporidios en un phyllum aparte (Microspora) debido a sus peculiares características. Posteriormente, con un ángulo artificial y basado en el criterio anterior, otro zoólogo (Cox 1991) propuso una clasificación para los protozoarios, ordenándolos en siete grupos y diez phylla dentro del Reino Protista. Aquí, las gregarinas también quedan en la clase Gregarinea, phyllum Sporozoea y en el grupo 7: los Esporozoarios–sin medios obvios de locomoción. Aquí se adopta el sistema de los cinco Reinos para los seres vivos (Whittaker 1959) que después fue modificado (Grant 1963) en: Monera (procariontes unicelulares), Protista (eucariotes unicelulares), Fungi (hongos), Animalia (animales) y Plantae (plantas). El Cuadro 1 muestra algunos reportes de nuevas especies en las últimas décadas, como fuente de información para el lector interesado en la taxonomía de estos protozoarios. A pesar del pobre conocimiento del grupo, la mayoría de las especies conocidas de gregarinas se han encontrado en insectos. Por ejemplo, se han encontrado en 850 (<0.31%) de las más de 277,000 especies conocidas de escarabajos (Levine 1988). Así, dentro del total de los invertebrados conocidos, sólo se conoce una tercera parte del 1% correspondiente a las gregarinas. La descripción de nuevas especies se basa en la morfometría de los diferentes estados del ciclo biológico, asumiendo que existe especificidad del huésped. Sin embargo, mediante un análisis electroforético de los polipép-tidos (Schrevel y Philippe 1993), patrones de isoenzimas y el secuenciado de la pequeña subunidad de DNA ribosómico se han podido separar especies íntimamente relacionadas.

Cuadro 1. Algunos Nuevos Géneros y Especies de Gregarinas Entomoparásitas Reportadas en la Literatura de los Ultimos 30 Años. Gregarina Amoebogregarina nigra Huésped Autor Kula y Clopton Año 1999

Melanoplus differentialis
Gregarina triboliorum Actinocephalus longus Mukundaella vannusus Odonaticola truncatus Gregarina blattarum Leydiana migrator Gregarina termitis Tribolium confusum Enallagma pervum Onychogargia atrociana Pseudagrion decorum Blatella humbertiana Gromphadorhina portentosa Reticulotermes flavipes R. virginianus Elyptocystis triboli Ascogregarina bostrichidorum Farinocystis tribolii Anisolobus indicus Gregarina ovata Gregarina forficulae Ascogregarina geniculati Brutiospora indicola Diplocystis tipulae Monoica apis Apigregarina stammani Acuta rousseaui Leydiana apis Con la biología molecular ya se está buscando una clasificación menos artificial. Las sequencias genómicas en el ARN ribosómico de las gregarinas, difieren de las secuencias de los otros grupos de Sporozoea y se ha postulado que comprenden un grupo monofilético (Carreño et al. 1999). Se especula que este grupo se originó como una rama primigenia dentro del árbol filo-genético del resto de los grupos conocidos como “esporozoarios”. Una posible explicación es el tipo de gamogonia que presentan (formación de gametos a partir de Aedes geniculatus Stethorus spp. Tipula paludosa Munstermann y Levine Kundu y Haldar Scherlock Stejskal 1983 1981 1979 1972 Tribolium castaneum Sengupta et al. Purrini y Keil 1991 1989 Bhoopaty Clopton Hall y Hostettler 1996 1995 1993 Wattwood et al. Sarkar 1997 1997

Prostephanus truncatus
Tribolium castaneum Coccinella septempunctata Forficula auriculata Rabindra et al. Haldar et al. Ball et al. 1989 1988 1986

Apis mellifera

gamontes) con un rara unión de gamontes o formas sexuales, llamada syzygy (del griego syn = junto, zygon = huevo). En este fenómeno, numerosos gametos masculinos y femeninos se diferencian dentro de cada “tipo” o “sexo” de gamonte, en lo que es el gamotocito. Las gregarinas son parásitos monoxenos o estenoxenos de cavidades corporales de invertebrados, con trofozoitos (gamontes) y fases sexuales grandes extracelulares (Cox 1991). Artificialmente, las gregarinas se dividen en dos grupos por la morfología del trofozoito. El primero son las gregarinas Cefalinas (Cephaline), en donde el trofozoito o gamonte se divide en tres partes: el epimerito (órgano apical para adhesión), protomerito (sección anterior de la célula) y deuteromerito (sección posterior de la célula). El segundo es las gregarinas Acefalinas (Acephaline) con sólo dos partes: el protomerito y el deuteromerito. La división celular múltiple o esquizogonia sirve para una clasificación de las gregarinas en los tres órdenes ya mencionados: Orden Archigregarinida – Sin esquizogonia y trofozoitos con microtúbulos subpeliculares y movimientos pendulares. Parásitos de invertebrados marinos. Ej. Selenidioides. Orden Eugregarinorida – Sin merogonia y trofozoitos que se deslizan mediante ondas a lo largo de la célula. Parásitos de insectos y otros invertebrados. Ej. Ascogregarina spp. común en Díptera (Insecta). Pueden ser aseptadas (Acephalinas) o septadas (Cephalinas). Orden Neogregarinida – Merogonia presente y parásitos de insectos. Se pueden reproducir por merogonia en epitelio o cuerpo graso del huésped, y por lo mismo son más virulentas que las Eugregarinas. Ejemplo, Mattesia grandis, parásito de Anthonomus grandis (plaga del algodonero). Son más pequeñas que las eugregarinas y tienen gamonte aseptado. Actual-mente, existen 214 géneros y ~1,450 especies de estas gregarinas que parasitan insectos (Levine 1985). Respecto a la merogonia (división celular múltiple), existen dos tipos en las neogregarinas y son las siguientes: Micronuclear. Ocurre en esporozoitos cuando se transforman en parásitos intracelulares. En Mattesia trigodermae, una vez que sus oocistes son ingeridos y dan lugar a los esporozoitos, estos emigran al cuerpo graso de su huésped, Trigoderma granarium (una plaga de granos almacenados) (Canning 1964). Macronucelar. En la misma interacción parásito/huésped, los merozoitos pequeños a su vez, por esquizogonia, dan lugar a núcleos más grandes (~ 2 m diámetro) apareciendo ~20 merozoitos (Ormieres et al. 1971). 6.3 Ciclo de Vida y Morfología Una vez que los oocistes (usualmente en forma de un balón de futbol americano) están en el estómago del huésped, cada uno origina ocho (o más) esporozoitos (Åbro 1976). Se transforman en parásitos intracelulares o merozoitos mediante esquizogonia, como sucede en la neogregarina Lipocystis polyspora en su huésped Panorpa communis (Corliss 2000). Otra opción es que como parásitos intracelulares en fase de trofozoito temprano, no tienen reproducción esquizogónica, como se observa en la eugregarina Ascogregarina taiwanensis en su huésped Aedes albopictus (Reyes-Villanueva 2001a). En este caso, la fase parásita intracelular dura las primeras 60–72 horas después que ocurre la infección vía oral, para después romper la célula huésped y salir al lúmen mesentérico larval (Walsh y Gallaway 1969). También existe la modalidad de que los esporozoitos recién eclosionados pasen a la cavidad

corporal (hemocele) o sólo se adhieran como parásitos extracelulares a las células epiteliales mesentéricas, como se ha reportado en la eugregarina Leydana canadensis en su larva huésped, el lepidóptero Lambdina fiscellaria (Lucarotti 2000), o en Gregarina blattarum parasitando el estómago de la cucaracha Blatella humbertiana (Bhoopathy 1996). Después de crecer un tiempo, como endo o ecto-parásitos celulares, los trofozoitos se despren-den del epitelio y se transforman en gamontes, los cuales son formas libres que se desplazan en el espacio ectoperitrofico (Fig. 1). Los gamontes son formas sexuales (haploides) idénticas morfológicamente, por lo que al encontrarse dos de diferente “signo” o “sexo”, se fusionan en una “syzygy” (Fig. 2). Después ambos se rodean de una cubierta protectora y se trans-forman en un gametocito que es excretado en ~ dos semanas después de la infección como ocurre en Hoplorhynchus spp. parásito del odonato Enallagma boreale (Åbro 1974).

Fig. 1. Infección doble inducida en una larva de Aedes albopictus. Los dos gamontes de color claro (izquierda) son de Ascogregarina culicis, y el de citoplasma color café (derecha) es de Ascogregarina taiwanensis. La línea inferior izquierda es una escala de 100 micras (Foto tomada por el Dr. Filiberto Reyes-Villanueva). En el gametocito, cada gamonte o forma sexual entra en una serie de divisiones múltiples o gametogonia (= gamogonia) para originar gametos masculinos (biflagelados) y femeninos (no flagelados – redondeados). Cada par de gametos se fusiona para dar origen a un oociste o forma infecciosa (también la forma de resistencia). Así, el gametocito se transforma en un esporocito, el cual libera cientos de oocistes que van a dar al medio ambiente para reiniciar el ciclo (Fig. 2). De un oociste (= espora) emergen ocho esporozoitos, pero a veces emergen 16, 32 y hasta 64 esporozoitos a través de canales que salen del oociste, como se ha reportado en Ascogregarina bostrichidorum que ejerce una fuerte patogenicidad en Prostephanus truncatus (Purrini y Keil 1989). Los esporozoitos pueden ser parásitos intracelulares tempranos, como se observa en la eugregarina A. taiwanensis en larvas del mosquito Aedes albopictus, donde no hay una merogonia vegetativa (Chen et al. 1997). Sin embargo, en la neogregarina Ophryocystis electroscirrha si existe una merogonia cuando los esporozoitos invaden las células epiteliales de las larvas de Danaus plexippus (la mariposa monarca), para la cual es altamente patogénica. A lo largo de los cinco estadios larvales de D. plexippus, el parásito completa dos

ciclos merogónicos. Después de la pupación, el parásito termina una fase sexual (gametogonia) y forma el oociste alrededor de las escamas de la mariposa en formación en el capullo pupal. La mayor densidad de oocistes se encuentra en el abdomen (Leong et al. 1992). Otra opción es que los esporo-zoitos sólo se adhieren a las células epiteliales, como sucede con G. blattarum en Blatella germanica (Clopton y Gold 1996).

Fig. 2. Diagrama del ciclo de vida (todo intracelular) de Ascogregarina taiwanensis en Aedes albopictus, mostrando las tres partes del ciclo: la esporogonia después de la ingestión de oocistes y penetración de los esporozoitos en las celulas epiteliales de la larva. La gamogonia, en que los trofozoitos haploides se desarrollan en pares de gamontes que producen gametos por merogonia, y donde pares de isogametos producen cigotos (la única fase diploide), en la que se producen oocistes y cada uno con ocho esporozoitos (11–15), listos para reiniciar el ciclo en un nuevo huésped (tomado de Tseng 2004 ).

6.4 Rutas de Infección para el Huésped en el Ciclo de Transmisión Las gregarinas son diseminadas en las poblaciones de sus huéspedes, principalmente mediante ingestión de su fase infecciosa que es el oociste (= espora), aunque en casos raros se presenta una transmisión vertical transovum. Las diferentes rutas que sigue el oociste en el ciclo de transmisión son: 6.4.1 Transmisión Horizontal (de individuo a individuo por ingestión de la forma infecciosa del parásito). Esta ruta es la común en la epizootiología de enfermedades de insectos y tiene cinco formas de infección: Vía oral desde el agua - El oociste puede estar en el fondo lodoso de los criaderos larvales de mosquitos, a donde llega al descomponerse el cuerpo de adultos infec-tados con Ascogregarina que mueren sobre la superficie del agua (Reyes-Villa-nueva et al. 2001b).

También se ha postulado esta ruta infecciosa para las gregari-nas Monoica apis y Apigregarina stammeri que reducen la longevidad de la abeja Apis mellifera L. en Venezuela (Stejskal 1972). Vía heces fecales - La infección ocurre por ingestión de heces fecales con oocistes, como sucede con G. blattarum en la cucaracha B. germanica (Clopton y Gold 1996). Vía presa - El oociste es ingerido cuando está dentro del cuerpo de su huésped y éste es devorado por algún depredador, el cual termina infectado por la gregarina. Como en los adultos de Enallagma boreale (Odonata: Coeanegrionidae), donde las hembras se infectan con la gregarina Hoplorhynchus spp., cuyos oocistes están adheridos a las patas de moscos Chironomidae, presas comunes de Odonota (Åbro 1974). También mediante el canibalismo se sabe que ocurre transmisión en acrídidos (Watson 1915). Autoinfección - Watson (1915) recuperó oocistes en todas las fases de desarrollo, incluyendo aquella con esporoductos bien desarrollados, a partir del intestino de grillos infectados con Leidyana eratica y creyó que los gametocitos podían expul-sar los oocistes maduros estando dentro del mismo huésped. Tambien encontró oocistes bien desarrollados en el intestino de saltamontes en Sudáfrica, y observó una tendencia a grandes asociaciones en la parte anterior del mesenterón del hués-ped y agrupaciones pequeñas en la parte posterior. Se ha sugerido que la autoinfección puede ocurrir regularmente en las eugregarinas en la medida que los oocistes son retenidos por un tiempo largo en el estómago y que liberen esporo-zoitos. Una vez que los oocistes pasan al proctodeo es improbable que ocurra la eclosión e infección debido a la membrana peritrófica (capa de quitina) que protege al epitelio en ese lugar. Vía venérea - O. electroscirrha también se transmite entre macho y hembra de D. plexippus durante la cópula, cuando el macho infectado transmite mecánicamente los oocistes que trae sobre su aparato reproductor a la hembra sana (Altizer y Oberhauser 1999). 6.4.2 Transmisión vertical (la forma infecciosa del parásito pasa de los padres a la progenie). Usualmente tiene tasas bajas de transmisión en la población huésped, y existe la hipótesis de que el parásito puede evolucionar hacia la extinción si infringe algún efecto nocivo (virulento) significativo sobre el huésped (McLaughlin y Myers 1970). Si estos parásitos evolucionan hacia formas benignas, pueden tomar la ruta evolutiva del simbionte. Las modalidades de infección son: Transovum – En mosquitos, las hembras también depositan oocistes sobre el corion de los huevos, vía recto, sobre el agua al momento de la oviposición. Los oocistes están en los túbulos de Malpighi y son desplazados al proctodeo cuando la hembra contrae los músculos abdominales para ovipositar (Beier y Craig 1985). Lo mismo pasa para la neogregarina Ophryocystis electroscirrha en la mariposa monarca, D. plexippus. Los oocistes son transmitidos cuando hembras infectadas diseminan oocistes sobre el corion de los huevos puestos en la superficie de las plantas hospederas (Asclepiadáceas) (McLaughlin y Myers 1970). La alta incidencia de Leidyana canadensis en larvas de Lambdina fiscellaria fiscellaria (Lepidoptera: Geometridae), demuestra que las infecciones son adquiridas de manera temprana, posiblemente cuando emergen las larvas del huevo e ingieren los oocistes sobre la superficie coriónica (Lucarotti et al. 1998). Las larvas también se pueden infec-tarse al contaminarse en el ambiente que rodea el sitio de oviposicion, alrededor del túnel de los descortezadores de la madera o en los musgos o líquenes que están en la corteza del tronco

(Carrol 1956). Las superficies se contaminan con los oocistes que salen vía anus a partir de las hembras huésped. Transovárica - Una verdadera transmisión vertical o transovárica, ocurre cuando el parásito/patógeno está dentro de los huevos (u oocitos) al momento de la oviposi-ción, y esta no está documentada para el caso de gregarinas de insectos.

6.5 Rango de Huésped, Patogenicidad y Síntomas Las gregarinas entomoparásitas no matan al huésped salvo pocas excepciones. Su impacto negativo se expresa sobre el grado de adaptabilidad del huésped (fitness), como disminución del tamaño corporal, longevidad y fecundidad, además de cambios en la coloración e inducir aletargamiento en el huésped. Por lo mismo, el efecto se espera que ocurra a largo plazo en las poblaciones (Beier y Craig 1985). Otra cualidad es que tienen un rango estrecho de huéspedes, y la mayoría tienden a tener un huésped específico natural, sobre el cual el efecto patogénico es mínimo. En cambio, cuando una gregarina infecta de manera cruzada a un huésped no natural o extraño, también se puede observar que el ciclo del parásito se trunca por respuestas inmunológicas del huésped, o contrariamente, que su patogenicidad se incrementa dramáticamente. Aunque existe poca información respecto a la fisiología de la infección de estos parásitos, la gregarina Farinocystis tribolii disminuyó los niveles de proteínas libres y lípidos totales en los individuos de Tribolium castaneum (Herbst). Las gregarinas Cephaline varían en su rango de huéspedes, con algunas especies monoxénicas. Por ejemplo, Gregarina polymorpha, G. cuneata, y G. steini están restringidas a larvas del escarabajo de la harina Tenebrio molitor, y G. niphandrodes infecta exclusivamente al adulto de T. molitor (Clopton 1992). En contraste, Corbel (1968) estudió las infecciones cruzadas de seis especies de gregarinas entre 24 especies de ortópteros y concluyó que la especificidad sólo se presenta al nivel de superfamilia dentro del Orden. Johny et al. (1999) también estudiaron el rango de huéspedes en tres gregarinas parásitas de acrídidos y conclu-yeron que Leidyana subramanii, Retractocephalus dhawanii y Hentschelia gillii infectan 17, 8 y 3 especies de saltamontes, respectivamente. Estudios in vivo inoculando esporozoitos de nueve especies de gregarinas (cuatro especies de Stylocephalus, tres de Xiphocephalus y dos de Cystocephalus) en el lumen de larvas de ocho especies de Tenebrionidae (Coleoptera), demostraron que sólo cinco gregarinas fueron capaces de producir oocistes viables, lo cual confirmó la especificidad de huésped de estos protozoarios (Patil et al. 1985).

6.6 Patogenicidad Celular Las gregarinas causan su más severa patología durante su desarrollo intracelular. Por ejemplo, Leydana subramanii afecta las cavidades de las células, degenera sus núcleos y las células se tornan fuertemente basófilas durante las tinción. El daño a las células epiteliales altera la función digestiva en saltamontes. La célula infectada se torna más corta pero no pierde la capa de microvellosidades en la superficie externa epitelial. Es probable que disminuya de tamaño al perder su contenido por el parasitismo. El último estadío ninfal de saltamontes logra sobrevivir a fuertes infecciones, quizás porque reemplaza el epitelio perdido en cada muda. La presencia de células epiteliales infectadas en un saltamontes

moderadamente infectado, sugiere que sólo las células sanas fueron seleccionadas para ser parasitadas por los nuevos esporozoitos y que la tasa de infección es irrelevante. La exposición prolongada a la infección induce tumora-ciones por la hipertrofia de las células en el tejido conectivo externo del mesenterón (Pushkala y Muralirangan 1997).

6.7 Patogenicidad en el Huésped Algunas eugregarinas son patogénicas a insectos. La mayoría de éstas están en las familias Gregarinidae, Leidyanidae, Didymorphidae, Stylocephalidae y Actinocephalidae (Tanada y Kaya 1993). Reportes antiguos de gregarinas patógenas (Harry 1970, Dunkel y Boush 1968) se han mencionado por Zuk (1987) sobre gregarinas de los grillos Gryllus veletis y G. pennsylvanicus. Además, se reportó que la longevidad y peso fueron disminuidos significativamente y que los machos altamente infectados produjeron menos espermatóforos que los sanos. También se ha reportado que Gregarina spp. al infectar plagas de la raíz (Levine 1979), aumenta la mortalidad del adulto e inhibe el desarrollo ovárico y el crecimiento del cuerpo graso en la catarinita Diabrotica virgifera virgifera. Infecciones iniciales con más de 2,000 oocistes por insecto causaron un 100% de mortalidad en machos en los primeros tres días de vida, aún con buen alimento y condiciones óptimas de insectario (Brooks y Jackson 1990). En la langosta Schistocerca gregaria, a menudo se encuentran cientos de trofozoitos que dañan el epitelio de los ciegos gástricos y comúnmente se observan gamontes en los restos de las células destruidas. Los trofozoitos libres y los gamontes maduros forman grandes hacinamientos por tigmotaxis, que consisten en una barrera que bloquea el mesenterón en los saltamontes infectados (Canning 1964), o cuando destruyen el epitelio mesentérico facilitan la penetración de bacterias patogénicas al hemocele. Leidyana gryllorum Watson y Gregarina cuneata Stein son patogénicas a sus huéspedes Gryllus domesticus y Tenebrio molitor respectivamente, al evitar el paso de alimento por el tracto digestivo. Casos de una alta patogenicidad son descritos para A. bostrichidorum, la cual mata a su huésped, el barrenador Prostephanus truncates, a cuyas larvas les destruye el epitelio mesentérico (Purrini y Keil 1989). Recientemente, se he renovado el interés por usar gregarinas para el control de saltamontes (Pushkala y Muralirangan 1997, Muralirangan et al. 2000, Johny et al. 2000). Se ha evaluado la patogenicidad contra saltamontes de tres gregarinas de la India: Leidyana subramanii Retractocephalus dhawanii y Hentschelia gillii (Pushkala et al. 2000) (Johny et al. 2000). El impacto patogénico de L. subramanii redujo la tasa de consumo alimenticio (peso ganado por insecto) en el saltamontes Atractomorpha crenulata. La tasa de consumo de alimento en machos fue de 17, 12 y 6 mg después de infectarse con las concentraciones de 0, 2×10 3 y 2×104 oocistes/saltamonte, respectivamente. En hembras, la tasa de consumo disminuyó cuando se infectaron con 2×103 y 2×104 oocistes/saltamonte, en comparación a los insectos sanos. Se obtuvieron resultados similares cuando se infectó al saltamonte A. crenulata con oocistes de Retractocephalus dhawanii). Asimismo, el peso promedio en los machos fue de 22, 19 y 13 mg, y en las hembras de 56, 32 y 29 mg, para las infecciones con 0, 2×10 3, 2×104, respectivamente. Finalmente, el periodo de oviposición de hembras infectadas se prolongó en 30-35 días contra 8-10 días en las hembras control (Johny et al. 2000).

6.8 Producción en Masa La propagación de protozoarios en laboratorio esta limitada a dos factores: la disponibilidad del huésped y la facilidad para que ocurra la transmisión del parásito al huésped. Los oocistes pueden ser ingeridos junto con el alimento preferido del huésped, por lo que es necesario primero determinar la dosis óptima de oocistes para obtener la máxima producción de ellos. En L. subramanii, los gametocitos son cosechados a los 12-15 días postingestión de oocistes, de los individuos infectados del saltamontes Eyprepocnemis alacris alacris. Si las heces fecales con los gametocitos son tratadas con ácido propiónico al 0.5 % durante 10 minutos, secadas bajo condiciones de laboratorio e incubadas a una temperatura de 35o C, después de 48 a 72 h los oocistes en largas cadenas espiraladas, seran liberados de los gametocitos presentes en las heces fecales. Tales oocistes son aislados y almacenados a 4 o C y permanecen viables por más de un año para infectar poblaciones de saltamontes. Para aislar los oocistes de las heces fecales, éstas se ponen con agua destilada (1 parte de la mezcla: 3 partes de agua destilada) y se mezclan con un agitador magnético para separar las cadenas de oocistes. Después el extracto se filtra en doble tela fina de nylon (40 m); y luego es pasado a través de un algodón húmedo (2-5 cm) mediante una jeringa. Posteriomente, la suspensión es centrifugada a 750 g por 20 min en una suspensión de 50% percoll en agua destilada. Los oocistes se sedimentan en el fondo de donde son removidos con agua destilada por tres veces para sacar el percoll del fondo. Así, la suspensión es pura en un 90% y se almacena a 4o C. La concentración de oocistes se hace según la descripción de Undeen y Vavra (1997) con un hemocitómetro bajo un microscopio de contraste de fase. Antes de inocular los oocistes en un experimento, la concentración deseada se puede establecer a partir de una suspensión stock con agua destilada. La producción de gametocitos de G. garnhami a partir de Schistercerca gregaria llegó a un máximo al día 12 y 13 y descendió drásticamente al día 16. Se recuperaron alrededor de 3,000 gametocitos de 19 saltamontes, con un promedio de 350 gametocitos/saltamonte. Hubo un promedio de 15,000 500 esporas por gametocito y un promedio de 7 a 10 oocistes por día de colecta después de inocular con oocistes de L. subramanii a una concentración de 3,500 oocistes por insecto (Johny et al. 1999). Los oocistes de L. subramanii son rutinariamente almacenados en heces fecales refrigeradas, sin limpiar los oocistes antes del almacenaje. El ácido propiónico es usado como un antimicótico que evita el crecimiento del micelio en el excremento durante el periodo de incubación. En el caso de Ascogregarina culicis en el mosquito Aedes aegypti, las larvas de 24 h de edad se pueden infectar con una concentración de 100 oocistes/larva. Alrededor del día 9 postinfección se inicia la emergencia de adultos en las jaulas, a los cuales de les debe proporcionar uvas secas como fuente de carbohidratos mas agua. Los oocistes se pueden cosechar de estos adultos a los ocho días de vida porque después se empiezan a morir. Una muestra de ~ 200 mosquitos (machos y hembras) anestesiados con CO 2 se maceran en un homogeneizador de vidrio con unos 15 ml de agua destilada. Después el extracto se pasa a través de un algodón húmedo (2-3 cm) dentro de una jeringa grande de 20 cm3 sobre un tubo Eppendorf, el cual se centrifuga a 5,000 rpm por 10 minutos. El paquete es resuspendido en 5 ml de agua destilada y de ahí se puede calcular la concentración de oocistes/ml con un hemocitómetro. Es recomendable hacer tres conteos y obtener una media. En el caso de A. taiwanensis en A. albopictus se sigue el mismo procedimiento, excepto que curiosamente aquí los adultos tardan más días en morir en las jaulas, por lo que los oocistes se pueden cosechar hasta ~12 días postinfección (Reyes-Villanueva 2001a).

6.8.1 Gregarinas y Control de Insectos Pushkala y Muralirangan (1997) reportaron 70% de mortalidad en el tercer instar del saltamontes Eyprepocnemis alacris alacris cuando fue tratado con oocistes de L. subramanii en el laboratorio. No obstante sus estudios no especificaron la concentración de oocistes. Muralirangan et al. (2000) observaron tasas de mortalidad de 22, 57, 73 y 83% cuando se infectó a E. alacris alacris con L. subramanii a las concentraciones de 2×102, 2×103, 2×104 y 2×105 oocistes/saltamontes, respectivamente. En el caso de Atractomorpha crenulata (Fab.) la tasa de mortalidad registrada fue de sólo 15% a una infección de 2×10 4 oocystes/ saltamontes, indicando que E. alacris alacris es más susceptible a L. subramanii que A. crenulata. También se estudió el efecto de L. subramanii sobre E. alacris alacris en jaulas en el campo (Muralirangan et al. 2000). Se observó que hubo un 100% de infectividad en L. subramanii a los 10 días postaplicación en todas las jaulas con saltamontes, a excepción de las del control, pero la tasa de mortalidad fue de 48, 32 y 56% respectivamente par las dosis 2×104, 2×105 y 2×106 oocistes/ml después de 20 días. Ascogregarina taiwanensis es un parásito patogénico común en el mosquito Aedes albopictus en Malasia, con una CL50 de 3,790 oocistes por larva. También Ascogregarina culicis ataca a A. albopictus y, aunque produce oocistes viables en este huésped, se producen tasas muy bajas de infección (Sulaiman et al. 1993). En EUA, A. taiwanensis es un parásito con altos niveles de prevalencia (~70%) en las poblaciones silvestres del mosquito Aedes albopictus. A pesar de que puede infectar larvas del vector primario del dengue, Aedes aegypti, a veces no se completa el ciclo de la gregarina porque los gametocitos se quedan en los seis túbulos de Malpighi del mosquito adulto, y no maduran a oocistes (Reyes-Villanueva 2001b). Sin embargo, en un estudio con infecciones experimentales, A. taiwanensis infectó al 42% de las larvas del mosquito A. epactius y al 90% de las larvas de A. atropalpus. En ambos huéspedes, el parásito exhibió un desarrollo anormal y se observó melanizacion de trofozoitos y gametocitos. Los mismos efectos se observaron en los trofozoitos al infectar a larvas de A. aegypti y Culex restuans. Después de infecciones cruzadas, se recuperaron algunos oocistes sólo de A. aegypti y A. atropalpus, los cuales fueron infecciosos para A. albopictus. La infección fue muy baja (25%, 1–2 trofozoitos por larva) en A. triseriatus, y no hubo desarrollo de gametocitos ni de oocistes (Munstermann y Wesson 1990). Cuando se expusieron larvas mezcladas de A. aegypti y A. albopictus de 24 h de edad a concentraciones iguales de oocistes de sus respectivas gregarinas A. culicis y A. taiwanensis, las larvas de cuarto instar de ambos huéspedes presentaron en sus tractos digestivos, diferentes intensidades de infección (número de gamontes de cada parásito por larva). A. aegypti exhibió una intensidad de infección de A. culicis, que fue el doble de la de A. albopictus infectado con A. taiwanensis. Además, las larvas de A. albopictus prácticamente no presentaron gamontes de A. culicis, mientras que las de A. aegypti si aparecieron infectadas cruzadamente con gamontes de A. taiwanensis (Reyes-Villanueva et al. 2003). Estas interacciones huésped/parásito en las infecciones cruzadas pueden tener una relación con el fenómeno de que A. aegypti ya fue virtualmente desplazado por A. albopictus en todo el sureste de EUA. Para Ascogregarina chagasi, parásito del vector de la leishmaniasis, Lutzomyia longipalpis, existe una transmisión vertical transovum. Bajo condiciones de insectario, el parásito reduce la longevidad y fecundidad de su huésped. En Inglaterra se le considera responsable por la

destrucción de las colonias de este díptero. Si se lavan los huevos del huésped con una solución de formol al 0.1%, se eliminan a los oocistes del parásito (Dougherthy et al. 1991). Cuando se infectaron con esta gregarina a cepas brasileñas (no naturales) de L. longipalpis en el laboratorio, se indujeron tasas bajas de infección que como quiera reducen su longevidad en comparación a las cepas colombianas (Wu y Tesh 1989). En Venezuela, se observó que las gregarinas Monoica apis, Apigregarina stammeri, Acuta rousseaui y Leydiana apis, parásitas de Apis mellifera, destruyeron el epitelio estomacal, causando la muerte de las obreras y la desaparición de colmenas enteras. Esto no es extraño ya que una sola abeja puede tener 200 oocistes y albergar hasta 800,000 gamontes (Stejskal 1972). Finalmente, la neogregarina Ophryocyistis elektroscirrha, la cual pasa por dos ciclos merogónicos en las células epiteliales de la mariposa monarca, Danaus plexippus, causa un fuerte daño celular cuando las larvas son inoculadas con una dosis de 1,000 esporas/larva. Las larvas infectadas dejan de alimentarse a los pocos días de la infección, se tornan pálidas, aletargadas y mueren, mientras que las sobrevivientes también mueren durante la muda. Preparaciones de larvas agonizantes con tinción de Giemsa, muestran abundancia de bacterias en el mesenterón y epitelio, sugiriéndose que una septicemia es la causa de la muerte. Los adultos sobrevi-vientes de infecciones ligeras, aparte de los problemas para desplegar las alas durante la emergencia, tienen el abdomen húmedo y con grandes zonas descamadas (McLaughlin y Myers 1970).

6.9 Microsporidia Los microsporidios son un grupo raro de eucariontes carentes de mitocondrias, que son pará-sitos intracelulares obligatorios de otros eucariontes incluyendo al hombre. Han evolucionado de una manera muy sofisticada ya que son altamente efectivos en su sobrevivencia, pero sus adaptaciones han ido hacia la simplicidad tanto morfológica, como fisiológica y genómica. El genoma de los microsporidios varía de 2.3 Mpb a 19.5 Mpb (Méténier y Vivarès 2001). Tienen todas las características de eucariontes como son: cromosomas lineales, telomeros, y segregación por mitosis. No obstante, el aparato de Golgi se ha modificado en una estructura tubular (filamento polar) que es usada en el proceso de infección del huésped. El agente causal de la pebrina en las abejas, Nosema bombycis es el primer registro de un microsporidio en la literatura y fue descrito por Nageli en 1857, pero colocado en el grupo de las levaduras. Después fue Balbiani (1882) quien lo revisó y lo colocó en un nuevo grupo, al que llamo Microsporidia. Por el filamento polar que es el aparato de Golgi modificado (Vavra 1965, Cali y Takvorian 1994), por el genoma que tiene todas las características de eucarion-tes, y por los diferentes tipos de esporas en los ciclos biológicos, los taxónomos modernos han colocado a estos entomopatógenos en su propio phylum: Microspora. Para una historia más detallada de la sistemática y evolución de este grupo, se sugiere consultar a Sprague et al. (1992), y Keeling y Fast (2002). Actualmente existen ~150 géneros y más de 1,200 especies descritas de microsporidios (Sprague y Becnel 1999). Hasta ahora, los microsporidios sólo infectan a animales, incluyendo a ciliados y gregarinas (Vivier 1975). Dada la diversidad de especies que se conoce hoy en día, es probable que el número real de especies quizás se aproxime al número

de especies totales en la escala zoológica (Keeling y Fast 2002). Estos parásitos son más prevalentes en artrópodos y peces, aunque también Encephalitozoon cuniculi originalmente descrito en 1922, infecta conejos y otros mamíferos (Wright y Craighead 1922), mientras que entre las 13 especies que infectan al hombre, E. bieneusi causa diarreas fatales en los enfermos de SIDA (Sandfort et al. 1994).

6.10 Espora y Procesos de Infección La espora es la característica típica de este grupo de parásitos intracelulares, ya que por su morfología y función, es la única fase extracelular reconocible para la identificación y diagnóstico, y además responsable por la infección del huésped y sobrevivencia del grupo (Fig. 3). Aunque la espora es la fase de resistencia ambiental, pueden morir al exponerse por 30 minutos a etanol 70%, formaldehído 1% o peróxido de hidrógeno al 1%, o en una autoclave a 120 ºC por 10 min. El rango del tamaño de la espora varía desde 1 micra en E. bieneusi hasta 40 micras en Bacillidium filiferum (Vavra y Becnel 1999). La forma puede ser esférica, ovoide o bacilar, aunque la mayoría son ovoides. La forma esporal puede ser uniforme dentro de la misma especie, pero también puede haber diferentes tipos de esporas en el mismo ciclo (polimórfico).

Fig. 3. Estructura de la espora de un microsporidio. A, es el disco de anclaje del filamento o tubo polar [Fp]. El polaroplasto tubular [Pt]. El polaroplasto lamelar [Pl], y el disco de anclaje se usan en la taxonomía del grupo. D, es el núcleo que puede ser simple o doble (como diplocarión en Nosema). En, es la endospora y la región más ancha interna. Ex, es la exospora. P, es la membrana plasmática que separa la cubierta de la espora del esporoplasma (Sp). Vp, es la vacuola posterior. R, son los ribosomas arreglados helicoidalmente. La espora está rodeada de una membrana y dos paredes rígidas. La pared de la exospora esta compuesta de una matriz proteínica densa y granulofibrosa (Bigliardi et al. 1996). La pared de la endospora está compuesta de alfa-quitina y proteínas. Dentro de la espora está el

esporoplasma o citoplasma de la espora, el cual es el material infeccioso de los microsporidios. El esporoplasma contiene uno o dos núcleos arreglados como un diplocarión, mientras que el citoplasma es rico en ribosomas. Hay tres estructuras relacionadas con la infección: el polaroplasto, el filamento o tubo polar, y la vacuola posterior. El polaroplasto es un complejo membranoso en la parte anterior de la espora. El tubo polar es el organelo responsable por la infección, formado por una membrana y capas de glicoproteínas, y con un diámetro de 0.1–0.2 micras y longitud de 50–500 micras. En su parte apical tiene una estructura en forma de paraguas llamada disco de anclaje (anchoring disk) del cual se extiende el tubo a la parte posterior de la espora. El tubo es recto de un tercio hasta la mitad de su longitud y el resto esta arreglado helicoidalmente en el esporoplasma, hasta llegar a la vacuola posterior. El número de giros, el arreglo de uno al siguiente, guardan una posición fija y por lo mismo son características taxonómicas en el grupo al nivel de especie (Sprague et al. 1992). La germinación de la espora de los microsporidios es uno de los eventos subcelulares más curiosos e interesantes en biología, que involucra generar una cantidad alta de energía y una liberación controlada de la misma. Todos ello en una serie de eventos extremadamente rápidos y concatenados que termina con la liberación del esporoplasma dentro de la célula huésped. El proceso se inicia con un factor ambiental que depende de las especies y del hábitat (Undeen y Epsky 1990), pero que también es pobremente conocido (Keohane y Weiss 1998). El pri-mer signo de germinación en una espora es una hinchazón generalizada tanto del polaroplasto como de la vacuola posterior; esto debido a que aumenta la presión osmótica de la espora por las acuaporinas que transportan agua a través de la membrana del esporoplasma (Frixione et al. 1997). No se saben los detalles de este proceso pero se ha observado un descenso drástico de trealosa durante la germinación (Undeen et al. 1987). Se ha especulado que la trealosa se puede hidrolizar a dos moléculas de glucosa, aumentando así el número de moléculas solubles que atraen las moléculas de agua al interior (Undeen y Vander Meer 1994). No obstante en las especies de Nosema no bajan los niveles de trealosa, por lo que se han sugerido otros modelos para explicar la germinación como el de la concentración de iones Ca+ en el interior del polaro-plasto. Este modelo asume que durante la ruptura de la membrana en la activación de la espora, se libera Ca + de la endomembrana hacia el esporoplasma. Estos iones inducen la entrada de agua y la activación de la trealosa, la cual mejora el cambio hipertónico en el esporoplasto (Keohane y Weiss 1998). Esta fuerza interna rompe la parte apical de la espora, por donde es expulsado el filamento polar que se transforma en un tubo por las glicoproteínas, para que el esporoplasto pueda pasar a través de él, y sea depositado en el citoplasma de la célula huésped. Durante la expulsión, el tubo funciona como un arpón que perfora la membra-na de las células cercanas ocurriendo así la infección. Un proceso interesante es que el esporoplasma entra a la célula huésped con una nueva y recién formada membrana plasmática, quedando su membrana original en la espora vacía. De esta manera, el parásito evita ser reconocido como invasor por la célula huésped. Al inicio de la germinación, la membrana del polaroplasto es empujada por el tubo hacia el huésped y ésta es responsable por la síntesis de la nueva membrana plasmática de la fase intracelular parásita (Weidner et al. 1999) (Fig. 4). El filamento polar es el aparato de Golgi modificado (Vavra 1965, Cali y Takvorian 1994). Una vez que el aparato de Golgi se transforma en el tubo polar, la espora disminuye de tamaño y se forma la capa interna quitinosa de la espora madura. Una vez dentro del citoplasma del huésped, las fases vegetativas pueden tener dos arreglos nucleares en sus células: células uninucledas llamadas esquizontes, y células binucledas llamadas merontes. De ahí se inicia la fase de crecimiento vegetativo que puede ser esquizogónica o merogónica, hasta entrar a la segunda fase reproductiva que es la esporulación. La

reproducción de esquizontes o merontes puede ocurrir por fisión binaria o múltiple, en cuyo caso se forma un plasmodio. Éste es el resultado de divisiones nucleares repetidas sin que haya citoquinesis en las células involucradas.

Fig. 4. Desarrollo intracelular de Encephalitozoon bieneseu (arriba) y E. intestinales (descripción abajo). Descripción de la Fig. 4. Fase 1- la forma infecciosa de microsporidios es la espora resistente y puede sobrevivir por largos períodos de tiempo en el ambiente. Fase 2- la espora expulsa su filamento polar e infecto la célula huésped. Fase 3- la espora inyecta el esporoplasma infeccioso en la célula huésped eucariótica a través del filamento polar. Fase 4- dentro de la célula el esporo-plasma entra en una multiplicación intensa ya sea por merogonia (división binaria) o esquizogonia (división múltiple). Fase 5- este desarrollo puede ocurrir en contacto directo con el citoplasma huésped como en E. bieneusi, o dentro de una vacuola llamada vacuola parasitófora como en E. intestinalis. Libre en el citoplasma o dentro de la vacuola, el microsporidio desarrolla esporas maduras por una esporogonia. 6- durante la esporogonia se forma una pared gruesa alrededor de la espora que es responsable por la resistencia a un ambiente adverso. Cuando las esporas aumentan en número y llenan el citoplasma de la célula huésped, se rompe la membrana celular y se liberan las esporas. Estas esporas maduras pueden infectar nuevas células huésped y continuar el ciclo. Estos plasmodios pueden dividirse en otros más pequeños (plasmotomía) o en células indivi-duales por fisión múltiple. Eventualmente, al final de la esquizogonia o merogonia, el patógeno entra en esporogonia da origen a esporontes. Estos se dividen hasta llegar a la fase final de la esporogonia que son los esporoblastos. El número de divisiones en los esporontes depende de la especie y varía de una esporogonia bispórica (donde dos esporoblastos se forman como en Nosema) a una polispórica (cuando se forman tipos diferentes de esporas como en Vavria). La esprogonia se puede llevar a cabo en contacto directo con el citoplasma del huésped, o dentro de una membrana que se origina del huésped llamada vacuola parasitorófora, o en una membrana que origina el propio patógeno y que recibe el nombre de vacuola esporófora. La esporogonia en algunos géneros como Amblyospora involucra meiosis y

origina ocho esporas en una vacuola esporófora. La morfogénesis de la espora es el último evento en la esporulación y se inicia con la transformación de esporontes en esporoblastos y la polarización de los organelos para producir esporas maduras (Hendrick et al. 1991). La mayoría de los microsporidios se han descrito sobre la base de sólo un tipo de espora, usualmente la espora ambiental. Hazard y Weiser (1968) descubrieron una especie de Nosema sp. y otra de Thelohania sp., infectando diferentes tejidos de un mosquito, con lo que demostraron que cada patógeno producía más de un tipo de espora. El tipo “Nosema” era responsable de la transmisión vertical, y lo único que se sabía acerca de las esporas tipo “Thelohania” era que ellas sólo infectan larvas de mosquitos. Las esporas “Thelohania” infectaron copépodos como huéspedes intermediarios, de los que emergió un tercer tipo de espora que completó el ciclo al infectar larvas de mosquitos. Desde entonces, se han identificado varios huéspedes intermediarios para varios microsporidios de mosquitos, que exhiben un ciclo de vida que incluye dos generaciones de mosquitos y el copépodo como intermediario, y por lo tanto tres tipos distintos de esporas (Fig. 5). Es interesante aclarar que en el pasado estas esporas pertenecían a diferentes géneros de microsporidios. Aunque los únicos microsporidios para los cuales existen huéspedes intermediarios, han sido identificados a partir de mosquitos (Amblyospora, Parathelohania), esta situación puede ser más común. Nosema necatrix y Thelohania diazoma fueron considerados por tener infecciones duales en larvas de lepidópteros. Finalmente se comprobó, que había dos tipos de esporas en Vairimorpha necatrix, desarrollándose en los tiempos adecuados en el mismo huésped (Fowler y Reeves 1974). La espora del tipo “Nosema” parece ser responsable por la transmisión al huésped original, con cierta duda respecto a la función de las meiosporas. Así basándose en pocos ciclos conocidos se pueden hacer algunas generalizaciones, pero lo que ahora ya se sabe es que muchos microsporidios son capaces de producir más de un tipo de espora y que éstas juegan un papel específico en el ciclo vital. Amblyospora californica (Fig. 5) es un ejemplo de un ciclo de desarrollo complejo en el que dos generaciones de mosquitos y un copépodo son necesarios para completarlo (Becnel 1992). En este ciclo heteroxeno se pro-ducen dos tipos de esporas en la progenie del mosquito hembra infectado: esporas binucleadas en las larvas que darán origen a hembras y que infectan a otras larvas, y las meiosporas que resultan de las larvas determinadas para originar machos, y éstas sólo pueden infectar a copépodos. Este ciclo es un ejemplo de excelente adaptación del patógeno porque le permite sobrevivir en la ausencia de insectos, más el mejoramiento que ocurre en su pool génico por el proceso de meiosis.

6.11 Ciclos de Desarrollo Los ciclos de desarrollo se pueden ver en preparaciones de los especímenes infectados, con tinción de Giemsa y observados al microscopio de contraste de fase. Los patrones en la división celular, son variables entre los microsporidios y útiles para la identificación. Eventualmente se produce una nueva generación de esporas, y dependiendo de la especie, puede ser del mismo tipo que inicio la infección o de otro, que es estructuralmente diferente incluyendo la función. A continuación se presenta una lista de los tipos más comunes de esporas que existen en este grupo de entomopatógenos.

Fig. 5. Ciclo biológico heteróxeno y polimórfico de Amblyospora californica en el mosquito Aedes aegypti y un copépodo como huésped intermedio.

6.11.1 Esporas Externas. A menudo llamadas “esporas ambientales”; éstas son producidas en grandes números y liberadas del huésped para infectar a otro. Éstas poseen una pared gruesa y son resistentes a una variedad de factores ambientales. Hay varios subtipos: a. Esporas diplocarióticas (binucledas). Son producidas asexualmente a partir de esporontes diplocarióticos y usualmente infectan oralmente (per os) a otros miembros de la especie en donde se formaron. b. Esporas uninucleadas. Son formadas por reproducción sexual a partir de esporontes uninucleados. Éstas infectan a huéspedes distintos a aquellos donde se formaron. c. Esporas de disociación. Se originan de estructuras diplocarióticas por disociación de la fase diplocariótica al inicio de la esporogonia. Se conocen sólo en mosquitos y transmiten al patógeno horizontalmente. d. Meiosporas. Se forman a partir de la fase diplocariótica por meiosis. En mosquitos ellas sólo infectan copépodos como huésped intermediario. Se observan comúnmente en paquetes de ocho esporas, llamadas “octosporas”. e. Esporas uninucleadas. Se forman asexualmente en un huésped intermediario; estas esporas son incapaces de infectar al huésped donde se formaron y las únicas conocidas hasta ahora son de copépodos e infectan mosquitos.

6.11.2 Esporas Internas. Este tipo se produce usualmente en pequeños números; tienen pared delgada y germinan dentro del huésped en el cual se desarrollan. a. Esporas tempranas. Recientemente llamadas “esporas primarias”, son diplocarióticas que aparecen después de una infección oral a partir de las esporas ambientales. Germinan inmediatamente después de la maduración, aún dentro del huésped para diseminar la infección en el organismo infectado. b. Esporas uninucleadas. Aquellas que germinan en el ovario para infectar a los huevos. En mosquitos, este tipo se origina a partir de la unión de gametos, con los núcleos permaneciendo apareados en fase diplocariótica en las divisiones siguientes. En algunas especies, estas esporas ocurren repetidamente de generación en generación a partir de huéspedes hembras por transmisión vertical.

6.12 Patología, Síntomas y Rango de Huésped En general, las microsporidiosis, resultan en infecciones crónicas que progresan lentamente hacia la muerte. Los efectos patológicos y síntomas se expresan a nivel de anormalidades en los tejidos y órganos, malformaciones, cambios de color y desarrollo lento en los insectos enfermos, hasta cambios etológicos. Los dos tejidos comúnmente infectados son el cuerpo graso y el epitelio mesentérico. En larvas de insectos acuáticos, las infecciones se observan a través de la cutícula transparente, como manchas color porcelana en el cuerpo graso de segmentos toráxicos y abdominales, o en las células epiteliales. Los segmentos pueden verse deformados por la acumulación de grandes cantidades de esporas, además de que estas infecciones son comunes en el cuerpo graso que aparece lobulado en las zonas cercanas a o en los ciegos gástricos, y también en los túbulos de Malpighi. En insectos de cuerpo esclerotinizado, se tienen que hacer disecciones para poder ver estos síntomas. Fuertes infecciones pueden inducir la aparición de manchas o puntos melanizados en la cutícula que se ve hinchada o entumecida por las reacciones del sistema inmune del huésped. Las larvas, pupas y adultos infectados, son más pequeños que los insectos sanos de la misma edad. Los adultos, pueden mostrar alas deformes y tener movimientos lentos, pero su mayor susceptibilidad se exhibe al acortarse su longevidad y fecundidad. Nosema muscidifuracis cuando infecta al parasitoide pteromálido Muscidifurax raptor, reduce en un 50% la longevidad y hasta en un 90% la progenie de este parasitoide comercial al atacar larvas de moscas (Geden et al. 1995). Edhazardia aedis redujo en un 98% la capacidad reproductiva del mosquito Aedes aegypti. A veces se produce una secuencia de síntomas acorde a los diferentes tipos de esporas como sucede en Amblyospora sp., donde la infección se inicia en los ciegos gástricos y de ahí se disemina a los oenocitos o cuerpo graso, en la medida que progresa el ciclo del patógeno. Ya se mencionó que la asociación íntima entre el patógeno y la (s) célula (s) huésped se llama xenoma y según Weiser (1976) existen dos tipos en insectos: el sincisial y el neoplásico. El primero resulta de la fusión de las células huésped con un plasmodio grande multinucleado del patógeno, cuyos núcleos no son numerosos sino que están hipertrofiados. Un ejemplo de

este es el patógeno A. bracteata en larvas del simúlido Odagmia omata. El xenoma neoplásico es una hiperplasia celular inducida por el patógeno y hay de dos categorías: en una, la hiperplasia contiene células donde cada una tiene un parásito y la célula huésped se llama “xenocito”. El número original de células se puede incrementar de 20 a 30 veces debido a la infección, como ocurre en larvas de Simuliidae infectadas por Janacekia debaisieux (Weiser 1976). La otra categoría de xenoma neoplásico es del tipo quiste-Glugea, comúnmente reportado en peces (Canning y Hazard 1986). Aquí el núcleo de la célula huésped está hipertrofiado y aparece ramificado o fragmentado en numerosos núcleos pequeños. Este xenoma puede crecer hasta 13 mm de tamaño, y este xenoma ha sido observado en un microsporidio nuevo reportado en la langosta migratoria. Se ha asumido que esta categoría de xenoma es una adaptación mutualística porque protege al patógeno de sistema inmune del huésped, pero también lo limita a infecciones localizadas dentro del huésped. El lector puede consultar a Brooks (1988) para una revisión muy completa acerca del rango de huéspedes de microsporidios con fines de control de plagas. Sin embargo, los microsporidios que más se han estudiado con este enfoque han sido Nosema algerae y N. locustae. Es importante aclarar que N. locustae es el único microsporidio aprobado por la Agencia de Protección Ambiental (EPA) en EUA para aplicarse como bioplaguicida contra saltamontes. Este patógeno es exclusivo de Ortóptera, donde infecta a casi 90 especies de saltamontes, pero no infecta a otros insectos como la abeja Apis mellifera, o lepidópteros como Agrotis ipsilon y Helicoverpa zea, ni a vertebrados. Por el contrario, N. algerae infecta horizontalmente a cuatro familias de insectos y dos especies de trematodos, y aunque por inyección puede infectar ratones, en realidad no es un riesgo para vertebrados homeotermos. Existe un alto grado de especificidad de huésped en Amblyospora connecticus, un patógeno del mosquito Aedes cantator y del huésped intermediario, el copépodo Acanthocyclops vernalis. De 25 especies pertenecientes a cuatro géneros de mosquitos, sólo cuatro especies de Aedes fueron infectadas al presentar desarrollo vegetativo del patógeno, pero sólo en Aedes epactius hubo producción de esporas binucledas y en ninguno se observó transmisión transovárica (Andreadis 1989). También en el caso de Edhazardia aedis, este patógeno puede infectar y producir esporas binucleadas en ocho de 20 especies de mosquitos evaluados, pero la transmisión transovárica sólo ocurre en su huésped natural, el vector del dengue A. aegypti (Becnel y Johnson 1993). Respecto a la persistencia de la espora en el medio ambiente: la viabilidad depende de la especie, la espora en la mayoría de los microsporidios no dura más de un año, la sobrevivencia es mayor cuando la espora está asociada a heces fecales, cadáveres secos o en ambientes húmedos expuestos a temperaturas de 0–6º C, la mayoría de los microsporidios tienen esporas que no sobreviven a temperaturas de laboratorio más de 2–3 meses, la deshidratación es inmediatamente letal para los patógenos de huéspedes acuáticos, la temperatura mayor de 35º C reduce fuertemente la viabilidad de la espora, las esporas desprotegidas son inactivadas por exposición directa a luz solar en minutos o pocas horas, cualquier sustrato que proporcione humedad y protección contra la luz solar, prolongara la viabilidad de la espora, y la presencia de otros microorganismos normalmente es nociva.

6.13 Transmisión En general, los microsporidios entericos se diseminan horizontalmente vía heces fecales durante toda la vida del insecto infectado (Weiser 1961). Sin embargo, en aquellos que infectan el cuerpo graso, la liberación de esporas se lleva a cabo sólo después de que muere el huésped y su cuerpo se desintegra, como en dípteros acuáticos (Becnel 1994). También puede ocurrir por medio de regurgitación de esporas en larvas de lepidóptero infectadas (Wilson 1958) y también vía canibalismo, cuando una larva sana devora a otra infectada o su cadáver. Este proceso es usual en los insectos gregarios como en la langosta, donde Nosema locustae es un patógeno natural (Henry 1981). En himenópteros sociales como hormigas, también por medio del canibalismo, el patógeno Burenella dimorpha se dispersa en las colonias de Solenopsis geminata en los trópicos (Jouvenaz 1981). Las obreras se infectan al romper las pupas muertas y así infectan a las larvas de cuarto instar al alimentarlas por regurgitación. Sólo en este estadio se produce la infección ya que los más jóvenes se alimentan de líquidos. Los microsporidios también son transmitidos por medio de la oviposición en himenópteros parasitoides (Brooks 1993). Es común que las esporas estén sobre el ovipositor e infecten al huésped cuando ocurre la estructura es introducida en el cuerpo del huésped. También algunos parasitoides infectan transováricamente a su progenie como en el caso de Nosema heliothiodes y el parasitoide Campoletis sonorensis sobre el H. zea (Brooks 1973). La transmisión vertical transovárica es la más importante es muchos microsporidios polimór-ficos que infectan mosquitos, tales como Amblyospora, Culicospora y Edhazardia. La hembra infectada tiene al patógeno en sus oocitos y así su progenie larval queda infectada. En el caso del microsporidio monomórfico Nosema, que infecta a lepidópteros, coleópteros e himenóp-teros, existe transmisión transovárica, pero aquí las fases vegetativas o esporas se incorporan a los oocitos durante su formación, es decir, durante la oogenesis. La misma espora funciona como fase de resistencia y es responsable por transmisión horizontal y vertical (Tanada y Kaya 1993).

6.13.1 Control de Microsporidios en Colonias de Insectos Louis Pasteur, observó que Nosema bombycis se transmite verticalmente de la madre a la progenie vía huevos, así separó individualmente las hembras en la progenie y seleccionó nuevas colonias derivadas de las hembras no infectadas. Hoy todavía se usa este método para eliminar microsporidios que se transmiten verticalmente en colonias insectiles. En los casos de infección vertical, transovum, las esporas se pueden destruir esterilizando la superficie con una solución de cloro. En el caso de colonias de mosquitos, sólo se requiere eliminar los adultos muertos y lavar los huevos con agua para mantener las colonias de Anopheline libres de N. algerae. Lo anterior se lleva a cabo con los siguientes pasos: Aislar individualmente las hembras grávidas en frascos esterilizados.

Después de la oviposición, disecar las hembras y examinar los huevos para buscar síntomas de infección. Criar sólo la progenie de hembras no infectadas y hacer inspecciones para síntomas. Destruir todas las descendencias de hembras infectadas. Destruir la colonia contaminada y esterilizar todo lo que se use en la nueva colonia sana. Ahora bien, si el 100% de las hembras están infectadas, es necesario esterilizar la superficie de los huevos con hipoclorito de sodio cuya concentración debe ser ajustada de acuerdo a la susceptibilidad de los huevos. El blanqueador comercial contiene ~ 5% por lo que se recomienda iniciar con un 2%. Eclosionar huevos y criar larvas individualmente. Examinar cada hembra después de oviposición por si presenta infección y proceder como arriba. No usar drogas antimicrosporidiales. Si se tiene una infección de un microsporidio que se transmite horizontalmente, se puede con-trolar esterilizando todo el equipo usado en la cría. Todos los adultos u otros insectos muertos deben ser separados de los huevos, y éstos deben ser lavados con agua destilada. Las esporas adheridas a la superficie de los huevos se pueden matar con una solución de cloro al 5%. En la mayoría de los casos se puede observar, que la concentración y el tiempo de exposición matan al microsporidio sin dañar a los huevos. Las prácticas clásicas de limpieza en un laboratorio de bacteriología son efectivas para prevenir la contaminación. Todo el material cercano a los microsporidios debe ser esterilizado por calor o sumergido en cloro. Las esporas resistentes a la desecación son difíciles de matar al evaporarse el etanol antes de matar al patógeno. Si los procedimientos mencionados no funcionan, la enfermedad se puede controlar con algunos fármacos, que pueden ser peligrosos porque frecuentemente inhiben la producción de esporas enmascarando la infección. Es común observar que la infección recurre cuando cesa el tratamiento. El Benomil ha sido efectivo contra microsporidiosis en colonias de insectos. Las Fumagilina se usan comúnmente para controlar a Nosema apis en las colonias de abejas. Se ha evaluado el Buquinolate para tratar infecciones en cangrejos con cierto éxito (Overstreet 1975). Algunos huéspedes toleran temperaturas más altas que sus parásitos microsporidios y se pue-den desinfectar exponiéndolos a temperaturas elevadas hasta eliminar la infección. Este procedimiento fue usado contra microsporidiosis del gusano europeo del maíz, Ostrinia nubilalis. Colmenas de abejas fueron curadas de N. apis (Cantwell y Shimanku 1969), larvas de Choristoneura fumiferana fueron sanadas de Nosema fumiferanae, y el pteromálido parasitoide Muscidifurax raptor también fue desinfectado del mismo patógeno (Geden et al. 1995) con el mismo método. De cualquier manera la mortalidad del huésped es alta porque la temperatura es cercana a la letal superior para el huésped. Los huevos de Plutella xylostella son más resistentes al frío que las fases vegetativas de los microsporidios que lo infectan. Las microsporidiosis se pueden eliminar exponiendo los huevos a 4° C durante 10-12 días, además de esterilizarlos. Las esporas del patógeno de mosquitos, Edhazardia aedis se mueren en uno o dos días de exposición a 5° C. Sin embargo, las fases vegetativas en las larvas y huevos son más resistentes al frío (Undeen et al. 1993).

6.14 Conclusiones Las gregarinas entomoparásitas conocidas hasta ahora exhiben baja patogenicidad, a excepción de algunas neogregarinas. Sólo tienen un impacto de debilitamiento en el huésped. Su posible uso como agentes de biocontrol depende de tres aspectos: alta especificidad de huésped, reacciones defensivas inmunológicas en el huésped, y carecen de merogonia en el huésped (excepto las neogregarinas). Por lo tanto, su uso en control microbiológico de insectos plaga o vectores, depende de que las investigaciones se enfoquen en: estudiar la patogenicidad de las eugregarinas en huéspedes no naturales, determinar el rango de huéspedes para las neogregarinas conocidas, y llevar a cabo estudios de campo, sobre todo en los trópicos, para buscar especies nuevas de neogregarinas que parasiten insectos plaga u otros insectos nocivos, dado el pobre conocimiento que se tiene de este grupo de entomoparásitos. Es recomendable llevar a cabo estudios para buscar infecciones por microsporidios en larvas de especies de mosquitos tropicales; es factible encontrar especies nuevas o interesantes por su virulencia. Especial énfasis debe ponerse en especies de Aedes miembros de la comunidad Phytotelmata en bromeliáceas de bosques en zonas protegidas; ahí el material colectado puede albergar nuevas especies con potencial para el control de Aedes aegypti y A. albopictus.

6.15 Literatura Citada Åbro A. 1974. The gregarine infection in different species of Odonata from the same habitat. Zool Scr 3: 111–120. Åbro A. 1976. The mode of gregarine infection in zygoptera (Odonata). Zool Scr 5: 25–275. Andreadis TG. 1989. Host specificity of Ambyospora connecticus (Microsporida: Amblyosporidae), a polymorphic microsporidian parasite of the brown saltmarsh mosquito, Aedes cantator (Diptera: Culicidae). J Med Entomol 26: 140-145. Altizer SM & Oberhauser KS. 1999 . Effects of the protozoan parasite Ophryocystis elektroscirrha on the fitness of monarch butterflies Danaus plexippus. J Invertebr Pathol 74: 76–88. Balbiani G. 1882. Sur les microsporidies ou sporospermies des articules. C A Acad Sci 95 : 1168-1171. Becnel JJ & y Johnson MA. 1993. Mosquito host range and specificity of Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae). J Am Mosq Control Assoc 9: 269-274. Becnel JJ. 1994. Horizontal transmission and subsequent development of Amblyospora californica (Microsporida: Amblyosporidae) in the intermediate and definitive hosts. Dis Aquat Org. 13:17-28.

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VII. El Uso de Hongos Entomopatógenos Contra Aedes aegypti
Filiberto Reyes-Villanueva1, Ernst-Jan Scholte2 y Mario A. Rodríguez-Pérez3
1, 3

Instituto Politécnico Nacional. Centro de Biotecnología Genómica, Laboratorio de Biomedicina Molecular. Boulevard del Maestro S/N esquina Elías Piña. Col. Narciso Mendoza, 88710, Apdo. Postal 152, Reynosa, Tamaulipas, México. Email: frv65@hotmail.com. Email: mrodriguez@ipn.mx 2 Plant Protection Service, Geertjesweg 15, P.O. Box 9102, 6700 EH Wageningen, the Netherlands.

7.1 Introducción
Los primeros trabajos sobre hongos entomopatógenos se reportaron en 1835, a partir de las observaciones de A. Bassi sobre la muscardina blanca (Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin) del gusano de la seda Bombix mori L., y con el hongo Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, el cual uso Metchnikoff para el control de Anisoplia austriaca (Herbst). (McCoy et al. 1988). La mayor parte de los hongos de insectos existen en asociaciones pasivas como comensales o como saprofitos. Un pequeño número de éstos son agentes causales de enfermedades y deben ser capaces de adherirse y penetrar el huésped. Para este proceso, el hongo debe romper las barreras de protección del exoesqueleto y una vez dentro debe evadir los sistemas de defensa y propagarse extensivamente, tornando al insecto en un foco de infección para otros insectos sanos (Boucias y Pendland 1998). 7.2 El Proceso de Infección Las conidias de los hongos entomopatógenos se agrupan de acuerdo a sus características en hidrofóbicas e hidrofílicas. La cubierta externa de las conidias hidrofóbicas como los de Nomurea rileyi, M. anisopliae y B. bassiana, es la estructura inicial donde ocurre la interfase “adhesión” con la epicutícula del insecto (Boucias et al. 1984). Debido a las diferencias en composición de aminoácidos, la hidrofobicidad en la cutícula rígida (esclerotinizada), se ha estimado significativamente mayor que en las cutículas flexibles (Andersen 1979). Ensayos con tratamientos físico-químicos han demostrado la resistencia natural de esta cubierta, sin embargo, tales tratamientos reducen el número de conidias que se adhieren a la cutícula y la viabilidad de las mismas. La cubierta externa también actúa como un antisecante y adhesivo, que protege a las conidias de los polifenoles tóxicos presentes en la cutícula, lo que le confiere una actividad enzimática. La función primaria de muchas enzimas de los Deuteromicetos, es hidrolizar la capa de cera epicuticular, proporcionar los nutrientes requeridos para la formación del tubo germinativo y propiciar la penetración (Boucias y Pendland 1991). El primer tejido del huésped con el cual la mayoría de los micopatógenos se ponen en contacto, es la epicutícula. Ésta tiene una doble función: por un lado, es el sustrato en el cual las conidias se fijan, y por el otro, proporciona las señales químicas necesarias para la orientación y formación del tubo germinativo que va a penetrar. La topografía superficial como las propiedades químicas de la cutícula del huésped, juegan un papel en el proceso de fijación del hongo. De acuerdo con Fargues (1984), la adhesión con la epicutícula del hospedero está dividida en tres etapas: Adsorción (fenómeno pasivo), consolidación de la

adhesión, y germinación de la espora con crecimiento del tubo germinativo sobre la superficie cuticular, hasta la penetración (fenómeno activo). La adsorción de las conidias a la cutícula, es un proceso no específico, mediado por interacciones electrostáticas e hidrofóbicas (Quintela y McCoy 1998). La cutícula que se encuentra en las regiones intersegmentales, se caracteriza por la presencia de cantidades elevadas de proteínas ácidas y de muchas proteínas glicolizadas, que contienen más proteínas que la cutícula rígida (Cox y Willis 1985). La manosa y la N-acetil-glucosamina son los principales azúcares asociados con la glicolización de las proteínas de la cutícula flexible, sin embargo, aún no se sabe si estas diferencias reflejan variación de epicutículas o se debe a los procesos de formación en la procutícula (Boucias y Pendland 1991). Además de las proteínas estructurales, se ha detectado una variedad de actividad enzimática; aparte de las quitinasas, también están las fenoloxidasas, esterasas, fosfatasas, fosforilasas y peroxidasas. 7.3 Germinación de las Esporas Se requieren de fuentes de carbono, nitrógeno y energía para la formación del tubo germinativo; la habilidad del hongo para utilizar estos elementos está en función de su agresividad y virulencia, expresada en la cantidad de esporas requeridas para matar al insecto y en el tiempo de germinación y penetración después de su adhesión a la cutícula. Aunque algunas evidencias indican que ciertos aislados de hongos como B. bassiana, pueden germinar en agua (Lefebvre 1934), la mayoría sugiere que ellos necesitan la adición de nutrientes, como son las fuentes de carbono y de nitrógeno. Se ha observado que ocurren crecimientos masivos sobre N-acetil-glucosamina o sólo glucosamina, lo que indica que estos componentes pueden ser usados por el hongo como únicas fuentes nutritivas (C 2 y N2) y energía. Resultados similares se encontraron con M. anisopliae (St. Leger et al. 1991). De los compuestos que se han detectado sobre la superficie de la cutícula del insecto, se encuentran ácidos grasos de cadena larga, lanolina (ceras) e hidrocarburos de aceites ligeros; éstos pueden ser utilizados por B. bassiana como fuentes energéticas. La habilidad lipolítica de los hongos entomopatógenos sobre la cutícula, puede darles algunas ventajas sobre otros hongos. Las esporas de M. anisopliae y Beauveria spp., llevadas por el aire, son favorecidas en su germinación y crecimiento al adicionar lípidos al medio de cultivo no estéril (Schaerffenberg 1964). Hay poca información sobre la disponibilidad de los nutrientes en la superficie de la cutícula de los insectos. Se sabe que las conidias de M. anisopliae germinan lentamente sobre algunas regiones de la cutícula de la palomilla Cossus cossus (Hamm), tratadas previamente con solventes de lípidos, en tanto que en la cutícula intacta, el hongo crece rápidamente; mientras que los compuestos solubles en éter de la superficie de la cutícula de la langosta del desierto Schistocerca gregaria, estimulan la germinación de M. anisopliae (Veen 1968). Una germinación exitosa no sólo requiere de la asimilación de los nutrientes utilizables, sino también de la tolerancia a algunos componentes tóxicos presentes. Evidencias indirectas de la presencia de substancias inhibidoras, se desprenden de estudios donde se eliminan (por medios químicos o mecánicos), los lípidos epicuticulares, lo cual aumenta la patogenicidad del hongo o permiten la germinación e invasión de otros hongos (Pekrul y Grula 1979). Charnley (1997) utilizó extractos de lípidos de la cutícula del gusano de seda Bombix mori L. y del barrenador del tallo Chilo simples (Zincken), los cuales resultaron tener acción fungicida y fungitóxica, dependiendo de su concentración. Los más activos fueron los ácidos grasos saturados de cadena media, como el ácido cáprico y el caprílico. Las esporas están en riesgo durante el período de exposición sobre la cutícula, previo a su germinación, por lo que

no es sorprendente que la hipervirulencia en ciertos mutantes, como los de M. anisopliae patógenos del mosquito Culex pipiens, esté correlacionada con la velocidad de germinación (Al-Aïdroos y Seifert 1980). 7.4 Principales Hongos Patógenos de Insectos Se han reportado más de 700 especies de hongos entomopatógenos pero sólo 10 se han desarrollado para control de insectos (Hajek y St. Leger 1994). Se han documentado una gran variedad de biologías desde patógenos oportunistas que pueden sobrevivir saprofíticamente en la ausencia de huéspedes vivos, hasta un parasitismo obligatorio. Para la mayoría de los hongos el acceso al huésped es vía cutícula e involucra interacciones bioquímicas complejas entre el huésped y el hongo, antes de que ocurra la germinación, penetración, crecimiento, y reproducción del hongo. Los ciclos de hongos parásitos obligatorios como las especies de Coelomomyces involucran huéspedes intermedios, mientras que los hongos imperfectos (Deuteromycotina: Hyphomycetes) exhiben los ciclos más simples al carecer de reproducción sexual y tener un rango más amplio de huéspedes (Scholte et al. 2004). Muchos entomopatógenos como los Entomophtorales pueden causar epizootias que regulan las poblaciones de insectos en campo. Sin embargo, en el control biológico clásico el método más común es mediante aplicaciones inundativas, y aquí los entomophtorales son de difícil manejo porque sus conidias primarias son de corta vida y esto es un fuerte obstáculo para desarrollar métodos efectivos de producción de esporas de resistencia. Por otro lado, los hongos Hyphomicetos o Imperfectos tienen actividad contra una gama más amplia de insectos y es el grupo principal que ofrece potencialidad para ser usados contra insectos nocivos, porque se pueden producir en substratos baratos y tiene vidas de anaquel más largas (Hajek y St. Leger 1994). Existe un complejo de interacciones entre factores ambientales y bióticos para iniciar o inhibir el desarrollo de epizootias por hongos. Estos factores son susceptibilidad a la radiación solar, microbios antagonistas, comportamiento del huésped, condiciones fisiológicas, edad, vigor y edad del patógeno, y condiciones apropiadas de humedad, temperatura y umbrales de inoculo (Ferron 1985). Por lo tanto, el uso exitoso de los hongos entomopatógenos como agentes de biocontrol dependerá del uso del propágulo correcto (conidias o micelio), formulados de una manera óptima y aplicados en la dosis y tiempo apropiados. La programación dependerá de la presencia de huéspedes disponibles y condiciones ambientales favorables, más la ausencia de productos químicos. Esto también es mejorable con otras técnicas o medidas como el uso de semioquímicos. Por ejemplo, el uso de atrayentes en las trampas para que concentren los insectos y se contaminen con las esporas, no sólo matará a los insectos sino que permitirá la autodiseminación del hongo hacia hábitats difíciles como agua y suelo (Lacey et al. 2001). Existen muchos reportes en la literatura respecto a enemigos naturales que se han usado en el biocontrol de mosquitos. No obstante, son muy contados los hongos que se han empleado para el control del vector del dengue, Aedes aegypti. En un artículo reciente se incluyó una revisión muy completa sobre este tópico (Scholte et al. 2004), el cual recomendamos al lector que desee tener información más detallada. En general, los hongos más usados contra mosquitos Culicidae son el Oomiceto Lagenidium giganteum, el cual incluso ya se maneja comercialmente. También el Chytridiomiceto Coelomomyces y los Deuteromicetos Culicinomyces, B. bassiana y M. anisopliae, contra larvas de varias especies de mosquitos,

incluyendo A. aegypti. En base al artículo de Scholte et al. (2004) aquí se hará una reseña de los hongos más relevantes versus el vector del dengue. 7.5 Hongos Contra Larvas de Mosquitos Según la nomenclatura de la 9ª edición del diccionario de los hongos (Kirk et al. 2001), las especies más trascendentes históricamente versus A. aegypti se mencionan a continuación: Los hongos acuáticos (Phylum Oomycota) crecen vegetatitavemente como saprofitos sobre plantas y son parásitos facultativos de larvas de mosquito. Entre ellos destacan Leptolegnia chapmanii, el cual fue encontrado originalmente en larvas de Ochlerotatus triseriatus en Louisiana en 1971 (Seymour & Briggs 1984). Este hongo resultó muy patogénico (100% de mortalidad) para larvas de primero y segundo instar de A. aegypti a las 24 h postexposición. Otra especie interesante es Lagenidium giganteum, el cual es cosmopolita e infecta principalmente larvas de Culex y Anopheles. El ciclo biológico comprende larvas de mosquitos y copépodos como huéspedes, y la fase infecciosa esta en las zoosporas biflageladas que se adhieren a la cutícula larval para adherirse y penetrar al huésped, mientras que la fase sexual esta en las oosporas que se forman dentro del huésped. A nivel de laboratorio el hongo infecta y mata al 99% de larvas tempranas de A. aegypti pero en campo no ha resultado prometedor para este vector, principalmente por la corta vida de las zoosporas (no más de 48 h) como obstáculo de formulación. Sin embargo, un formulado a base de micelio en fermentación si mata al 40 – 60% de larvas de Culex tarsalis y Anopheles freeborni en cultivos de arroz en California (Kerwin et al. 1986). El Phylum Chitridiomycota, que también son saprobios sobre materia orgánica o suelo en cuerpos acuáticos, tienen zoosporas flageladas y quitinosas, y sólo en el orden Blastocladiales existe el género entomopatógenos Coelomomyces. Este género contiene más de 70 especies que son entomoparásitas obligatorias y con un ciclo muy complejo formado por generaciones alternas sexuales (gametofítica) y asexuales (esporofítica). El género infecta sólo dípteros acuáticos y es generalista para huéspedes. La fase de resistencia durante períodos secos o fríos es el esporangio a partir de hifas diploides dentro del huésped, y que son liberadas al ambiente a partir de los cadáveres. Este esporangio pasa por meiosis y produce meiosporas uniflageladas infecciosas para los copépodos u ostrácodos en donde ocurre la fase haploide o gametofitica en el hemocele. Para más detalle leer a Scholte et al. (2004). Al igual que L. giganteum, este hongo no tiene potencial para usarse contra A. aegypti y aún más por problemas de formulación debido a la fase que requiere la presencia de los microcrustáceos. Respecto al Phylum Zygomycota, donde están las Clases Trichomycetes y Zygomycetes con micelio cenocítico y sin esporas flageladas, no hay especies relevantes para el control de A. aegypti. Sólo esta Entomophtora culicis que como todos los de este Phylum, infecta primariamente adultos, y con reportes muy escasos para infecciones de A. aegypti en laboratorio. Dentro de este Phylum se encuentra la Clase Deuteromycetes (= Hyphomycetes), la cual es la más importante en patología de insectos. Contiene a los entomopatógenos más relevantes para el control de insectos nocivos al hombre, tanto en el ámbito agrícola como en el médico-veterinario. Estos hongos también llamados anamórficos incluyen a los géneros más importantes para el control de mosquitos vectores y son: Culicinomyces, Beauveria, Metarhizium y Tolypocladium (Scholte et al. 2004). De los cuatro géneros, Culicinomyces es curioso porque infecta larvas de mosquitos vía oral, a diferencia de los demás en donde la infección es cuticular. En Cuilicinomyces clavisporum, las conidias son ingeridas por las larvas y germinan en el tubo

digestivo para de ahí perforarlo a nivel de estomodeo o proctodeo pero no en mesenteron, e invadir el hemocele. Este hongo es un parásito facultativo de una gran variedad de dípteros incluyendo mosquitos (Legner 1995) aunque en campo no se ha reportado infectando a A. aegypti. En el laboratorio se ha observado que aislados Australianos de C. clavisporum son más virulentos para A. aegypti que los aislados Americanos (Cooper y Sweeney 1982). Problemas para formular las conidias, más el hecho de que éstas germinen solas en agua haciendo que el hongo no sea residual, han desmotivado la investigación de su potencial en biocontrol del vector del dengue. Dentro de los Deuteromycetes, se encuentra Beauveria con las especies B. bassiana y B. brongniartii. Es un hongo que infecta sólo vía cuticular y comúnmente se ha aislado de un rango muy amplio de insectos a nivel mundial, pero tampoco se ha reportado infectando a A. aegypti en campo ni en laboratorio. Si es infeccioso para adultos de A. aegypti en laboratorio (Fig. 1), causando el 100% de mortalidad en una exposición de 5 días (Clark et al. 1968). El hongo posee un arsenal de varias toxinas como la Beauvericina, Bassianina, Tenelina y otras de B. bassiana, y la Oosporeina de B. brongniartii. La Beauvericina A y B (Destruxinas) causan hasta el 86% de mortalidad larval en A. aegypti a las 48 h postexposición a la dosis de 20 g/ml (Grove y Pople 1980). Las desventajas es que se necesitan dosis altas de conidias contra larvas y además germinan solas; para adultos las conidias requieren una humedad relativa de al menos 94% para germinar pero una formulación en aceite podría mejorar su eficacia contra adultos. Finalmente esta el hongo Metarhizium anisopliae el cual contiene cuatro variedades (Driver et al. 2000), dos de las cuales son las más importantes: M. anisopliae va. acridum (antes llamado M. flavoviridae) muy común en Homoptera, y M. anisopliae var. anisopliae, más conocido simplemente M. anisopliae. Este hongo infecta a más de 200 especies de artrópodos e insectos, incluyendo mosquitos (Scholte et al. 2004). Una vez que las conidias germinan y el tubo germinal perforó la cutícula, las hifas hemocelómicas producen una variedad de toxinas como Destruxinas, Swansinonas y Citocalasina C, que matan al huésped después de un período de incubación de 4 – 16 días, dependiendo del huésped de que se trate (Strasser et al. 2000). El huésped muere finalmente por intoxicación, inanición, obstrucción física por el hongo en hemocele y deshidratación, entre otras causas.

Fig. 1. Aedes aegypti adulto infectado con Beauveria bassiana, y con micelio blanco esporulado. Desde hace tiempo existen reportes en la literatura respecto al efecto del hongo sobre larvas de A. aegypti (Roberts 1970, Daoust et al. 1982). La virulencia de los aislados se incrementa de 1.6 a 2.5 veces después de que se pasa por mosquitos; sólo para tener una idea, en estudios de campo contra larvas de Culex pipiens, se encontró que dosis de 300 a 600 mg de conidias/m2 en charcas, redujeron las poblaciones en 91 y 94% (Roberts 1974). 7.6 Hongos Contra Adultos de los Vectores del Dengue Respecto a la susceptibilidad en adultos, en laboratorio y campo se ha encontrado que Culex quinquefasciatus y Anopheles gambiae s.s. fueron afectados por conidias en aceite con un TL50 (tiempo letal medio) de 4 – 6 días (Scholte et al. 2003). Los adultos fueron atraídos a un cartón impregnado con las conidias y con una solución de sacarosa al 6%. Los mosquitos fueron expuestos a las dosis de 1.6 x 105 – 1.6 x 108 de conidias/m2, y los machos de ambas especies murieron más rápido, mientras que para ambos sexos el 100% de mortalidad se encontró al día 7 para A. gambiae s.s. y para el día 6 en C. quinquefasciatus (Scholte et al. 2003). Para A. gambiae s.s. el TL50 fluctuó entre 3 y 5 días para conidias secas y de 6 a 9 días para formulación en aceite de girasol (Cuadro 1 y 2). En el 2005 se llevo a cabo el primer experimento de campo usando hongos contra mosquitos vectores, y este fue el estudio de Scholte et al. (2005) en Tanzania, África. Impregnaron conidias de M. anisopliae sobre una manta negra de algodón la cual colocaron en el techo de las viviendas y lograron una infección de 23% en Anopheles gambiae s.s., y una disminución en 75% la transmisión de la malaria. Estos resultados son aparte de los efectos negativos que la micosis ejerce sobre la fecundidad y capacidad de ingestión sanguínea del vector. Lo anterior pone de manifiesto el potencial de estos hongos en control vectorial, porque en entomología médica no se requiere matar a la población de insectos como ocurre en el caso de una plaga agrícola. Una mortalidad no espectacular puede hacer que el hongo trunque los ciclos de transmisión viral y que haya vectores sin que se presente la enfermedad que transmiten. Uno de los efectos más visibles de una micosis es la deshidratación de los tejidos del huésped. La falta de agua en los tejidos puede evitar que el virus del dengue se replique y que finalmente no llegue a infectar glándulas salivales; esto es que se interrumpa la incubación extrínseca y esto puede suceder antes de los 10 días que en promedio dura este periodo. En un estudio de laboratorio más reciente pero ya sobre los vectores del dengue, Scholte et al. (2007), evaluaron a M. anisopliae vs Aedes aegypti y A. albopictus. Aplicaron el hongo a una dosis de 1.6 x 1010 conidias/m2 sobre una manta de color negro como sitio de reposo para los adultos en jaulas. Reportaron una mortalidad de 87 ± 2.65% en A. aegypti y de 89.3 ± 2.2% en A. albopictus. La longevidad de mosquitos infectados se redujo significativamente en comparación a los sanos. El TL50 fue de 3.1± 0.32 % y 4.1± 0.3 % días para machos y hembras de A. aegypti, respectivamente. Los valores de la TL50 para mosquitos sanos vario desde 17.7 ± 0.4 días para hembras y hasta 19.7 ± 0.6 días para machos de A. albopictus. Estos resultados indicaron que ambas especies de mosquitos son altamente susceptibles a la infección con este hongo.

Cuadro 1

Cuadro 2

El segundo estudio, también muy reciente, sobre hongos contra vectores del dengue, fue conducido en Brasil (De Paula et al. 2008). Evaluaron cuatro aislados de M. anisopliae y tres de Beauveria bassiana, y de ellos, tres del primero y uno del segundo fueron seleccionados en la primera etapa. La dosis fue de 1 x 109 conidias ml-1 (= 5 x 106 conidias/cm2) por aislado en papel filtro confinado por 48 h con 50 hembras de A. aegypti en frascos pequeños de plástico (12 x 7 cm), y también impregnando telas de algodón (30 x 20 cm) de color negro dentro de jaulas grandes (115 x 70 x 75 cm) con la misma dosis en espray (=2.2 x 107 conidias/cm2) durante un periodo de 7 dias. Para los bioensayos con papel filtro, los tres aislados más virulentos fueron dos de M. anisopliae con un TL50 de 3dias y uno de B. bassiana con 5 días, respectivamente. Para las jaulas, el 70% de los mosquitos tratados murieron, contra 20% de mortalidad en el control; el TL50 fue de 4 días y las hembras control duraron hasta 30-40 días. Este estudio conducido por investigadores Brasileños es de gran relevancia ya que demostró que M. anisopliae es capaz de reducir la sobrevivencia de una población del vector del dengue hasta un 30% en siete días después de la exposición al hongo. Esto significa que si es factible que la micosis trunque la incubación extrínseca del virus en el vector. En nuestro laboratorio llevamos a cabo un bioensayo (en prensa en una revista científica) sobre hongos contra adultos vectores del dengue, para evaluar la virulencia de tres aislados de M. anisopliae vs hembras de A. aegypti (Fig. 2).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10

Saltillo META-SIN Aislado Control-Saltillo

% sobrevivencia

ControlMETA-SIN ControlAislado

1

6

11

16

21

26

31

36

41

46

Fig. 2. Curvas de sobrevivencia de Aedes aegypti expuestas a una concentración de 6 x Tiempo (días) 109 conidias secas m-1 de tres aislados de M. anisopliae durante 48 h. Símbolos: ver texto (Filiberto Reyes-Villanueva, Alfonso Garza Hernández y Patricia Tamez-Guerra, inédito 2009). Los aislados fueron un formulado granulado comercial (META-SIN®) como control positivo, otro (“Saltillo”) que fue encontrado originalmente infectando Diabrotica spp. en campo y que se aisló en medio de papa-dextrosa-agar (Dr. Sergio Sánchez-Peña) y un tercero llamado “Aislado” pero que es el “Saltillo” después de ser pasado por A. aegypti. Como se puede observar, el aislamiento “Aislado” aumento su virulencia alrededor de 2 veces ya que su TL50 fue de cerca de 15 días antes de ser pasado por el mosquito (original) y se acortó hasta 7 días después de ser pasado por el huésped. Aunque la virulencia de estos aislados de M. anisopliae del noreste de México, es aceptable, es baja en comparación a los aislados Africanos y Brasileños ya descritos. No obstante, su efecto sobre la competencia vectorial no se puede subestimar.

Fig. 3. Una hembra de Aedes aegypti muerta por la micosis de Metarhizium anisopliae adquirida al copular con un macho impregnado con 6 x 108 conidias ml-1 (Foto de Alfonso Garza Hernández).

En un segundo estudio nuestro, ahora para estimar el efecto del aislado “Saltillo” ya pasado por el mosquito (“Aislado”), pero adquirido vía cópula, sobre fecundidad y sobrevivencia de A. aegypti, encontramos que la fecundidad en hembras se redujo en 70% en comparación a las del control. Es decir, que las hembras que se infectaron (Fig. 3) al copular con machos impregnados con una dosis de 1 x 108 conidias ml-1, exhibieron una media de huevos de 23.3 ± 6.42/hembra, mientras que la media de las del testigo fue de 76.32 ± 1.50 huevos. Cuadro 3. TL50 y tasas de esporulación en 20 hembras vírgenes expuestas a un macho virgen de Aedes aegypti, previamente expuesto a 6 x 108 conidias ml-1 de un aislado original (Saltillo) y el mismo después de pasarse por A. aegypti (Aislado) de M. anisopliae (Filiberto Reyes-Villanueva, Alfonso Garza Hernández y Patricia TamezGuerra, inédito). Aislado Saltillo Saltillo (Control) Aislado Aislado (Control) 7.7 Conclusiones Ambos sexos de Aedes aegypti y A. albopictus son muy susceptibles a Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana. Ambos hongos pueden aplicarse directamente cuando los mosquitos se posan sobre superficies de papel filtro o telas de algodón, previamente impregnadas con conidias secas o en formulaciones de aceites vegetales (de girasol). M. anisopliae es el más prometedor al existir aislados que matan al 50% de la población expuesta de mosquitos en tres días. M. anisopliae también se puede diseminar en una población de hembras vírgenes, al copular con machos impregnados con conidias, a una dosis mínima de 6 x 10 8 conidias ml-1. Estas micosis adquiridas vía copula ocasionan una reducción del 70% en fecundidad de las hembras, y el 50% mueren en menos de 10 días después de copular con machos impregnados. Exposicion (horas) 48 48 48 48 TL50 ± ES 14.21 ± 0.86 24.5 ± 0.86 9.56 ± 0.69 28.26 ± 0.52 % Esporulacion 38.3 0 26.7 0 0.001 X2 P < 0.05 0.001

7.8 Literatura Citada Al-Aïdroos KY & Seifert AM. 1980. Polysaccharide and protein degradation, germination and virulence against mosquitoes in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. J Invertebr Pathol 36: 29-34. Andersen SO. 1979. Biochemistry of insect cuticle. Annu Rev Entomol 24: 29-61.

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VIII. La Resistencia a Insecticidas en Mosquitos Transmisores del Dengue
Othón Javier González Gaona1 y Adriana E. Flores-Suárez2
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Instituto Tecnológico de Ciudad Victoria, Licenciatura en Biología, Laboratorio de Zoología. Blvd. Emilio Portes Gil N° 1301 Pte. C.P. 87010. Ciudad Victoria, Tamaulipas, México. E-mail: othonjavier@hotmail.com.mx 2 Universidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Ciencias Biológicas, Laboratorio de Entomología Médica, Apdo. Postal 391, , San Nicolás de los Garza, N. L. 66450, México. E-mail: adrflores@gmail.com.mx

8.1 Introducción El dengue y su variante clínica, que se manifiesta como dengue hemorrágico, son enfermedades que cada vez van cobrando mayor importancia en la salud pública de los países de América. Sus vectores Aedes aegypti y A. albopictus han encontrado condiciones ambientales que favorecen su presencia prácticamente por todas latitudes, facilitando con ello la diseminación de los virus, ocasionando que el mortal dengue hemorrágico se esté haciendo gradualmente endémico en América Latina y el Caribe (Dorta et. al. 2005). Los programas de lucha con miras a la erradicación de los vectores, por lo general basan el control en la aplicación de insecticidas, que usualmente se hace de manera desorganizada sobre recipientes que podrían destruirse o recogerse, mientras que para la eliminación de adultos se asperjan excesivamente a ultrabajo volumen (UBV) y en áreas donde no debería hacerse (PAHO 1994). Ello conlleva a la contaminación del ambiente, al incremento en los riesgos de intoxicaciones ya que las aplicaciones a UBV tienen más impacto en las poblaciones humanas que en las del mosquito (Horstfall 1975, citado por Gubler 1989), además de gastar los escasos recursos con los que cuentan los programas de lucha contra el vector. El problema se puede agravar, debido al desarrollo de la resistencia a los insecticidas. La presión de selección que ejercen éstos sobre las poblaciones de vectores, ha dado lugar al desarrollo generalizado de la resistencia en muchas especies y por consiguiente a la pérdida de efectividad de los productos aplicados. La resistencia de A. aegypti a temefós y malatión se ha difundido por todo el Caribe y en algunos países de América Central y Sudamérica, además de la resistencia a fenitrotión reportada en otros países (Dorta et. al. 2007, OPS 1995). También se han encontrado casos de resistencia cruzada para piretroides, órganofosforados y carbamatos (Flores et. al. 2005). El riesgo de un escenario donde no exista insecticida efectivo, cuando se presenten brotes epidémicos para controlar una emergencia, es elevado. Debido al papel que juegan los insecticidas en el control de los vectores del dengue y las implicaciones que tiene, más el empleo de estas moléculas de manera desmedida e irracional, es que se aborda este tema de la resistencia. El modo de acción, el metabolismo y los mecanismos de resistencia de los insecticidas, que se emplean en el control de los mosquitos, son aspectos que deberán considerarse para que el uso de esta herramienta de control pueda formar parte de una estrategia de manejo integrado de los vectores.

8.2 El Control Químico de Larvas Desde la II Guerra Mundial se han empleado larvicidas para controlar vectores, y estos han cambiado selectivamente según sus características y exigencias para su uso en salud pública. Se han aplicado DDT, BHC y ciclodienos, Organoclorados que actualmente son de uso prohibido o restringido. De los Órganofosforados que se han utilizado, se cuenta entre otros: malatión, fentión, fenitrotión, clorpirifos, pirimifos metil y temefos, este último de los más utilizados, por sus características deseables para un larvicida (Dorta et. al. 2005, Anónimo 1991). De los Carbamatos se menciona al propoxur y bendiocarb. Los piretroides, que es uno de los grupos de insecticidas orgánico-sintéticos más recientes, se han aplicado: permetrina, cipermetrina, ciflutrina, deltametrina, -aletrina, -fenotrina y lamdacialotrina. (Roberts 1985, Arredondo et. al. 1993, Shono et. al. 1991, Peairs y Cranshaw 2008, Flores et. al. 2005). De los insecticidas microbiales están: Bacillus thuringiensis israeliensis y B. shaericus, el primero es una bacteria específica para mosquitos y simulidos. De los reguladores del crecimiento se cuenta con: metopreno, diflubenzuron, novaluron y piriproxifén (Peairs y Cranshaw 2008; Tompson 1992; WHO 2006).

8.3 Control Químico de Adultos La Organización Mundial de la Salud (OMS) avaló, desde los años 60´s, el uso del malatión, el cual ha sido sustituido por otros organofosforados y piretroides. Las aplicaciones normalmente se hacen mediante rociados residuales peridomiciliares y en el interior de las viviendas, y en casos de la aparición de brotes epidémicos, como medida de emergencia se realizan aplicaciones generalizadas. Algunos de los organofosforados que se reportan en el control de mosquitos adultos son: clorpirifos, diclorvos, triclorfón, fentión, fenitrotión, pirimifós-metil. Del grupo de piretroides están: bioresmetrina, ciflutrina, cipermetrina, cifenotrina, d,d-trans-cifenotrina, D-fenotrina, etofenprox, cialotrina, permetrina, deltametrina, resmetrina y fenotrina (Thompson 1992, Vejar 1994, WHO 2006, Peairs y Cranshaw 2008).

8.4 El Modo de Acción de los Insecticidas que se Aplican Contra Mosquitos Una vez que el insecticida ha logrado penetrar al cuerpo del insecto, deberá translocarse hasta llegar a su sitio de acción o blanco, o puede seguir otra ruta que lo puede llevar a acumularse en tejidos, biotransformarse, metabolizarse o ser excretado. Los insecticidas sintéticos como piretroides, organofosforados y carbamatos son neurotóxicos pero afectan de diferente manera al sistema nervioso.

8.4.1 Piretroides Específicamente, los piretroides actúan sobre el sistema nervioso central o en los axones motores y sensores de neuronas del sistema periférico, se ligan a una proteína de los canales de sodio en el nervio. Normalmente esta proteína abre, induce el estímulo en el nervio, y cierra para poner fin a la señal nerviosa. Los piretroides se adhieren a esta entrada impidiendo el cierre normal, por lo que los iones entran al axón en descargas repetidas, para

causar excitación y eventualmente parálisis, es decir una continua estimulación nerviosa (Miller y Adams 1982, Valles y Koehler 2003, Ware y Withacre 2004). No se han encontrado problemas de carcinogénesis o mutagénesis con estas moléculas y son relativamente seguras para mamíferos y extremadamente tóxicas para artrópodos. Tienen coeficiente de toxicidad negativo con respecto a la temperatura, es decir, son más tóxicos a bajas temperaturas. Los efectos de intoxicación se manifiestan mediante una serie progresiva de síntomas, que incluyen hiperactividad, ataxia, convulsiones y eventualmente parálisis. La velocidad con que los síntomas se desarrollan depende de: el químico aplicado, el modo de aplicación y la temperatura. La deltametrina y cipermetrina, que son esteres -cyano-3-fenoxibenzil, no exhiben el síntoma de excitación; en cambio desarrollan un estado letárgico y ataxia, que preceden a una condición descrita como parálisis flácida (Adams y Miller 1980). La aletrina y tetrametrina afectan al insecto ocasionando una rápida y normalmente reversible parálisis a la cual se le llama efecto “knockdown” según Sawicki (1962, mencionado por Miller y Adams 1982). La velocidad de acción o eficiencia knockdown esta relacionada con la polaridad de la molécula (Briggs et al. 1974). Los piretroides más polares tienden a ser mejores agentes knockdown. Se argumenta que la porción característica (coeficiente octanolagua) de los piretroides gobierna su velocidad de transporte al sitio de acción en el sistema nervioso. La acción potencial de los piretroides sobre el sistema nervioso central y periférico va a tener una respuesta neurofisiológica que va a variar de acuerdo al tipo de nervio, al compuesto aplicado y a la temperatura (Miller y Adams 1982).

8.4.2 Organofosforados y Carbamatos En los insectos, los efectos de los organofosforados (OF´s) están confinados al sistema nervioso central (SNC), específicamente en las uniones o sinapsis neurona-neurona; ahí inhiben ciertas importantes enzimas, particularmente acetilcolinesterasa o colinesterasa verdadera (AChE). Esta enzima tiene un sitio activo compuesto de dos subunidades: un lugar aniónico conferido por el grupo carboxilo del ácido aspártico o el glutámico; esta parte es la que inicialmente atrae al OF. Un lugar esterático caracterizado por el grupo hidroxilserina, por medio de una interacción nucleofílica atrae al fósforo reactivo (P) de la molécula de insecticida y se forma un complejo que precede a la separación de una fracción hidroxilada, quedando la enzima fosforilada. De esta manera la enzima está inactivada, bloqueándose la degradación del neurotransmisor acetilcolina. La enzima se concentra en el sitio de sinapsis y promueve la hiperexcitación del SNC. Los signos de intoxicación incluyen agitación, hiperexitabilidad, espasmos, convulsiones y parálisis. La fosforilación de la acetilcolinesterasa es persistente, la reactivación puede tomar horas o días (Ware y Withacre 2004, Bloomquist 1999). La mayoría de los OF´s que se aplican contra mosquitos (temefos, clorpirifos, fentión y fenitotrión y pirimifos metil) son fosforotioatos o moléculas que tienen un azufre ligado al fósforo (P=S) por lo que, el organismo, al tratar de destoxificarse lo conduce vía citocromo P450 monoxigenasa a una desulfuración oxidativa, cambiando esta fracción a P=O, lo cual hace al metabolito más tóxico. Característica por la que son eficientes en el control (Bloomquist 1999). Los carbamatos se comportan de manera idéntica que los OF´s en los sistemas biológicos, pero tienen dos diferencias principales. Algunos son potentes inhibidores de la aliesterasa (son esterasas alifáticas misceláneas cuyas funciones exactas no son conocidas) y su selectividad algunas veces es más pronunciada contra la AChE de diferentes especies. En

otros, la inhibición de la AChE es reversible. Cuando la AChE es inhibida por un carbamato, se dice que está carbamilada. En insectos, los efectos de los OF´s y los carbamatos son principalmente el envenenamiento del sistema nervioso central, porque la unión neuromuscular de los insectos no es colinérgica, como lo es en los mamíferos. Las únicas sinapsis colinérgicas que se conocen en los insectos están en el sistema nervioso central. Se cree que la transmisión en la unión química neuromuscular de los insectos es el ácido glutámico.

8.4.3 Bacillus thuringiensis Berliner var. israelensis El uso de este insecticida microbial se ha incrementado en las últimas décadas, dada su eficacia, y a que no ocasionan problemas de contaminación en el ambiente, así como su selectividad relativa. Ésta es una variedad de bacteria especifica para mosquitos y simulidos, que tiene como ingrediente activo la endotoxina delta que se produce por fermentación del Serotipo H-14 de este microorganismo. La endotoxina delta son cristales compuestos por varias proteínas (protoxinas), que son sintetizadas durante la esporulación. Después de que las larvas ingieren los cristales, éstos reaccionan con el pH y las enzimas digestivas, formando subunidades activas que se ligan a sitios de receptores específicos en el epitelio del tubo digestivo, alterando la permeabilidad iónica para formar canal catión o poro. El movimiento de iones a través del poro perturba los gradientes de potasio y el pH, y ocasiona la lisis del epitelio, paraliza al intestino y ocasiona finalmente la muerte del insecto. Este proceso se lleva a cabo en un período de 2 a 12 horas (García et. al. 1980, Anónimo 1988). Para más detalles consulte el capítulo IV de estas memorias.

8.4.4 Insecticidas Reguladores del Crecimiento El metopreno, es una molécula que semeja a la hormona juvenil (HJ) de los insectos, se aplica contra mosquitos, para controlar los estados larvales del segundo al cuarto. Es lipofílica sesquiterpenoide que contiene grupos epoxi y metil ésteres (Ware y Withacre 2004). Es sintetizada y secretada por la corpora allata y tiene varias funciones en la vida del insecto. Tiene actividad morfogenética, al actuar junto con la hormona de la muda (ecdisona) para suprimir la diferenciación del adulto y mantener los caracteres inmaduros del desarrollo. En algunos órdenes tiene un efecto gonadotrófico en la formación del vitelo en hembras adultas y para el desarrollo de glándulas accesorias en machos. En otros casos, la aplicación de HJ a los huevecillos, en las primeras etapas, impide el desarrollo de larvas viables. En algunas especies, el tratamiento a hembras adultas con HJ ocasiona la puesta de huevos sin embrionar. El crecimiento de larvas inmaduras requiere de HJ, pero a medida que la metamorfosis avanza, la producción de hormona tiende a declinar. La presencia de HJ al pasar de inmaduro a adulto, puede causar la muerte al trastornar los cambios que se dan en esa etapa (Henrick 1982). Los modos de acción de la HJ no están bien entendidos y los diversos efectos que se conocen, sugieren que no son iguales en todos los casos. Algunos modos generales de acción son: La interferencia en parte final del desarrollo larval y la emergencia del adulto, dando como resultado individuos intermedios entre larva-pupa, pupa-adulto, individuos con órganos reproductores defectuosos o embriogénesis anormal. La morfología anormal y las consecuencias en el desarrollo son irreversibles y frecuentemente letales para el insecto blanco. La actividad biológica de un juvenoide es usualmente medida únicamente a un tiempo específico durante un estado sensitivo en el ciclo de vida del insecto;

evaluaciones más detalladas a más de una generación pueden revelar efectos imperceptibles y retardados (Henrick 1982). En el grupo de las benzoilúreas, están el diflubenzurón y el novalurón, estas molécula actúa sobre los estados larvales de los insectos, inhibiendo o bloqueando la síntesis de la quitina, la cual es una parte vital e indestructible de su exoesqueleto. Las moléculas de Nacetilglucosamina, que son los monómeros de la quitina, no pueden polimerizarse en presencia del diflubensuron. Las larvas se ven afectadas por la ruptura de la malformada cutícula, o pueden morir por hambre. Las larvas de mosquitos se controlan con tan solo 1.0 g. del difubenzurón por acre de superficie de agua (Ware y Whitacre 2004, Bloomquist 1999, Thompson 1992). El piriproxifén es un compuesto pirideno, que retarda el crecimiento de las larvas, interrumpe la metamorfosis normal, causando la muerte de las larvas y pupas. Además es usado como insecticida de contacto y veneno estomacal

8.5 Resistencia a Insecticidas en Mosquitos Aunque se reconocen varios tipos de resistencia, la resistencia fisiológica o bioquímica es la de mayor relevancia para los fines del manejo de plagas. Los insecticidas ejercen sobre la población, contra la cual se aplican, una presión de selección en la que sobreviven o son seleccionados, aquellos individuos que poseen algún mecanismo que impide o bloquea la acción tóxica del insecticida. La OMS define resistencia como “el desarrollo de una habilidad en una cepa de algún organismo a tolerar una dosis de un tóxico que probaría ser letal para la mayoría de los individuos en una población normal de la misma especie”. La resistencia es una característica genética heredable cuya frecuencia incrementa en la población como un resultado directo a los efectos selectivos de un insecticida. Este fenómeno ha tenido mayor impacto en el control de mosquitos que en otros grupos de insectos, dado que estos dípteros han estado sujetos a aplicaciones químicas intensivas, directas e indirectas, desde que aparecieron los insecticidas orgánico-sintéticos (Georghiou 1980). Para entender la evolución de la resistencia a insecticidas es necesario conocer los procesos que ocurren y que son seleccionados en los individuos resistentes. La variación genética y fenotípica que afecta la resistencia se presenta en algunos individuos de la población como resultado de mutación o duplicación genética, modificando algún aspecto fisiológico, morfológico o de comportamiento en el fenotipo normal. Estos cambios en el fenotipo usualmente aumentan el proceso de detoxificación, reducen la sensibilidad del sistema nervioso o bien, incrementan la capacidad de los insectos de evadir el contacto con el tóxico. Cuando el insecticida es aplicado, los individuos con dichas mutaciones tienen una ventaja considerable sobre los individuos más susceptibles en la población, teniendo mayor probabilidad de sobrevivir al tratamiento con insecticidas, y en promedio, contribuyen con más descendencia en la siguiente generación. Como resultado, la frecuencia del gen que confiere resistencia aumentará en la población al paso del tiempo (Hemingway y Ranson 2005). En 1946, la Organización Panamericana de la Salud (OPS) inicio el control químico con el DDT para la erradicación de Aedes aegypti. Sólo un año después, se reportaron los primeros casos de resistencia en poblaciones de esta especie (Brown 1986). A pesar de ello, para 1972, A. aegypti ya había sido erradicado en buena parte de los países en donde se reportaba. Sin

embargo, en ese mismo año, la resistencia al DDT fue reconocida como un problema serio y la campaña terminó antes que la meta de erradicación fuera alcanzada (Brown y Pal 1971). Los problemas de resistencia han continuado a pesar del uso de nuevos grupos de insecticidas. Alrededor de cien especies de mosquitos han generado resistencia a uno o más insecticidas (Hemingway y Ranson 2000). El control de la malaria y dengue han incluido algunos organoclorados (BHC, DDT), organofosforados (metil-paratión, temefós, malatión y clorpirifos), carbamatos (propoxur y carbosulfán) y piretroides (resmetrina, permetrina, fenotrina) (Ayesa et al. 2006). Algunos casos de resistencia en larvas de mosquitos son los que reportan: Lowe et. al. (1980) encontraron que la resistencia aumento164 veces a temefós en Anopheles albimanus; Boike et al. (1985) en Florida, EUA, registraron en Culex quinquefasciatus resistencia a temefós (de 1.9 a 28.4X), malatión (de 1.8 a 6.4X), naled (de 1.1 a 5.3X), fentión (de 1.9 a 8.7X) y clorpirifos (de 1.3 a 8.2). Asimismo, en Italia, Severini et al. (1993) encontraron tolerancia al clorpirifos (de 4.5 a 122.7X) y al temefós (de 1.7 a 83.3X) en C. pipiens. En America Latina, Bisset et al. (2001) detectaron resistencia a temefós, clorpirifos y pirimifos metil en larvas de A. aegypti de varias localidades de Venezuela y Cuba. Igualmente, Georghiou y Lagunes (1991) registraron 114 especies de mosquitos de varias partes del mundo con resistencia a uno o más insecticidas, las especies fueron de los siguientes géneros: 62 de Anopheles, 21de Aedes, 24 de Culex, 2 de Psorophora, 1 de Armigeres, 1 de Culiseta, y 3 de Mansonia. Esta cantidad de especies de mosquitos resistentes constituye más del 20% de todos los casos registrados en artrópodos. Una población de mosquitos resistentes a un insecticida específico, puede retornar a un cierto nivel de susceptibilidad por medio de dos formas: 1) al seleccionar una raza resistente con un insecticida de diferente modo de acción o ruta metabólica, 2) al dejar de seleccionar una raza resistente por varias generaciones (Georghiou y Metcalf 1963, Kepler, et al. 1964). La resistencia de amplio espectro a organofosforados, o la resistencia específica para malatión están presentes en las principales especies vectoras del género Anopheles (Hemingway y Ranson 2000), Culex (Hemingway y Karunaratne 1998) y también en A. aegypti (Georghiou et al. 1987; Vaughan y ffrench-Constant 1998, Rawlins 1998). A pesar de que el uso del BHC, dieldrín y DDT fue restringido desde hace muchos años, la resistencia a estos insecticidas es persistente y sigue dispersada en poblaciones de mosquitos vectores (WHO 1998). Actualmente existe un debate sobre la continuación del uso de este insecticida; la presión pública debido a los efectos adversos del DDT hacia el ambiente, exige su retiro del mercado. Por otro lado, el retiro del DDT en las campañas de control de vectores en países del tercer mundo, ha sido relacionado con el aumento en la incidencia de la malaria en países de África. (Roberts et al.1997). Ambos puntos de vista están siendo cautelosamente evaluados, antes de tomar una decisión definitiva sobre el uso de este insecticida. La resistencia a varios grupos de piretroides se ha dispersado ampliamente en culícidos y anofelinos (Chandre et al.1998, 1999). La resistencia cruzada entre piretroides y DDT en Anopheles gambie ha generado una gran preocupación, ya que los piretroides son el único grupo disponible para la implementación de la estrategia más eficaz para controlar la malaria: la impregnación de telas mosquiteras para dormir. En diversas poblaciones de A. aegypti también se ha reportado resistencia cruzada con el DDT (Hemingway et al. 1989, Brengues et al. 2003), y a otras moléculas de organofosforados y carbamatos, pero el tipo de resistencia

compartida con estos grupos, se debe a mecanismos metabólicos (Rodríguez et al. 2002, Flores et al. 2005, 2006). Respecto a la resistencia al Bacillus thuringiensis israelensis, se ha sugerido que se debe al continuo uso de este producto en condiciones de campo. Diversos investigadores han determinado en condiciones de laboratorio incrementos de tolerancia. Backer y Ludwig (1993), reportaron que se encontró un incremento de tolerancia a Bti de 5 a 7 veces, a las 32 generaciones de Culex quinquefasciatus, la cual desapareció en tres generaciones sin seleccionar. Con esa misma especie se encontraro tolerancia aumentada 11 veces, después de seleccionar por 32 generaciones (Becker y Ludwig, 1993). Es indudable que se requiere una continua presión de selección con Bti para que se desarrolle tolerancia en laboratorio; sin embargo, a decir por Backer y Ludwig (1993), a nivel de campo es difícil que esto suceda, dado que después de evaluar áreas tratadas y no tratadas por 10 años con Bti, contra Aedes vexans, no encontraron diferencias significativas; según ellos la susceptibilidad se debe a: a) el corto período de exposición de las larvas a la toxina; b) por el único y complejo modo de acción del Bti y c) por la variabilidad genética de la población. Por otra parte se trata de especies diferentes, lo que puede marcar la diferencia en la susceptibilidad.

8.6 Mecanismos de Resistencia Según Georghiou (1965), la resistencia puede ser de tres tipos: por comportamiento, morfológica y fisiológica; esta última se tiene una base bioquímica y es la más estudiada. Los insectos adquieren resistencia de dos formas: Una por adición de un mecanismo de protección y la otra por insensibilidad en el sitio de acción. Para fines de manejo, algunos autores agrupan los tipos en mecanismos metabólicos y no metabólicos. El primer grupo abarca los mecanismos que involucran cambios enzimáticos y el segundo a aquellos que promueven cambios en sensibilidad del sitio activo, en la taza de penetración, almacenamiento o excreción, y en el comportamiento de los insectos. Para Soderlund y Bloomquist (1990), los mecanismos de resistencia se dividen en cuatro categorías: penetración reducida, comportamiento, metabolismo elevado e insensibilidad del sitio blanco. Por lo general, estos mecanismos no son específicos y confieren resistencia cruzada a otros tóxicos de estructura similar y en muchos casos, a compuestos químicamente no relacionados. La penetración reducida es el mecanismo menos entendido. La mayoría de los formulados de insecticidas han sido diseñados para penetrar el insecto a través de la cutícula. Algunos insectos han desarrollado cutícula más gruesa o cutículas alteradas que reducen el grado de penetración de los insecticidas (Apperson y Georghiou 1975). Por sí sola, la penetración reducida confiere un bajo nivel de resistencia, sin embargo, en combinación con otros mecanismos de resistencia, puede potencializar la resistencia en forma no aditiva. Por otro lado, al disminuir el grado con el cual el insecticida alcanza su sitio blanco, permite que otro mecanismo pueda detoxificar más efectivamente al insecticida. Un mecanismo de resistencia por comportamiento fue identificado en moscas que evaden cebos tratados con malatión. Por otro lado, los insecticidas como el DDT y la permetrina inducen cambios de comportamiento en los insectos, por ejemplo reducen la proporción de entrada de mosquitos hacia las casas, incrementan la proporción de escape o salida de las casas o bien, inducen un cambio en los tiempos de picadura (Lines et al. 1987, Mbogo et al. 1996). Aún se desconoce si estas respuestas pueden ser consideradas como resistencia, ya que muchos otros factores pueden estar afectando al comportamiento de los insectos.

La resistencia metabólica es el resultado del incremento en la expresión de genes codificadores de enzimas que metabolizan a los principales xenobióticos. Tres familias de enzimas han sido involucradas en la resistencia a los cuatro grupos de insecticidas (OC´s, OF´s, MC´s y piretroides), sin embargo, su rol exacto aún no ha sido determinado. Las monoxidasas del citocromo-P450, glutatión-s-transferasas (GST) y carboxyl-esterasas son familias de enzimas que catalizan un gran rango de reacciones de detoxificación. Éstas constituyen la primera defensa enzimática contra los xenobióticos, son responsables de reti-rar muchos productos de desecho del metabolismo, juegan roles esenciales en rutas biosin-téticas y están envueltas en la comunicación química (Scott 1995). La actividad elevada de las enzimas detoxificativas ha sido asociada con la resistencia a insecticidas en un gran rango de especies de insectos plaga. Las esterasas usualmente están envueltas en la resistencia a organofosforados, carbamatos y en menor proporción a piretroides. Las monoxidasas están involucradas en el metabolismo de piretroides y en la activación o detoxificación de insecticidas organofosforados y en menor proporción de metilcarbamatos. La DDT-dehidroclorinasa fue reconocida recientemente como una glutatión-stransferasa en la mosca doméstica Musca domestica, posteriormente fue demostrado que esta enzima tiene un rol común en anofelinos y mosquitos Aedes (Hemingway et al. 2004). La resistencia por insensibilidad del sitio blanco se debe a mutaciones sencillas no silenciosas en genes estructurales. Para que ocurra la selección de mutaciones, el aminoácido resultante debe reducir la unión del insecticida, sin causar una pérdida de la función primaria del sitio blanco. Por lo tanto, el número de substituciones probables de aminoácidos resulta muy limitada y comúnmente pueden encontrarse las mismas mutaciones asociadas a la resistencia en taxas muy divergentes. El grado en que se afecta la función debido a la mutación resistente, puede reflejarse en la viabilidad de los individuos resistentes en la ausencia de selección. Este costo en la viabilidad tiene importantes implicaciones en la persistencia de la resistencia en el campo. Los genes de los principales sitio blancos: canales de sodio (para), receptores del ácido amino-butírico (GABA) y acetilcolinesterasa (AchE), han sido clonados y sus secuencias han sido comparadas entre insectos resistentes y susceptibles. Algunas mutaciones han sido asociadas con resistencia a insecticidas, aunque en muchos casos no se ha dilucidado el mecanismo de resistencia a nivel molecular.

8.6.1 Carboxyl-Esterasas Las carboxyl-esterasas son un grupo amplio de enzimas capaces de metabolizar una gran variedad de substratos mediante la hidrolización de los enlaces éster en presencia de agua. Las esterasas pueden clasificarse en base a su preferencia por los substratos α o β naftol (αNA y βNA), a sus patrones electroforéticos o bien, por su secuencia nucleótidica. Muchos insecticidas contienen enlaces éster, por lo cual, se espera encontrar que el principal mecanismo de resistencia en cepas de insectos resistentes se deba a la actividad intensificada o sobreproducción de esterasas. En general, los insecticidas organofosforados y metilcarbamatos actúan como inhibidores de esterasas, ya que tienen una alta afinidad por las enzimas, pero son substratos pobres. En los insectos resistentes, existe una mayor frecuencia de la interacción esterasa-insecticida, evitando que el insecticida alcance su sitio blanco (la acetilcolinesterasa). Cuando las esterasas están presentes en el misma proporción molar que el insecticida, estas son capaces

de secuestrar efectivamente a los insecticidas e hidrolizarlos lentamente (Scott 1995). El papel de las esterasas como mecanismo de resistencia puede ser inferido mediante tres formas: 1) detección de niveles elevados de productos de la hidrólisis de insecticidas en estudios de metabolismo en insectos resistentes, 2) sinergismo de la toxicidad del insecticida en insectos resistentes mediante el uso de inhibidores de esterasas no tóxicos, tales como TPP (0,0,0-trifenil fosfato), DEF (S,S,S-tributil fosforotritioato) o IBP (0,0-bis(1-metiletil)sfenilmetil posforotioato), 3) detección de niveles altos de actividad de esterasas generales (Brogdon, 1989), usando substratos simples y ensayos espectrofotométricos de homogenizados o tejidos de insectos, o bien, por electroforesis y tinción de geles (Hemingway y Karunaratne 1998). La sobreproducción de esterasas es una respuesta evolutiva contra la presión de selección por insecticidas organofosforados y carbamatos; su presencia se ha documentado en numerosas especies de artrópodos, incluyendo mosquitos, garrapatas, afidos y cucarachas. El papel de las esterasas en la detoxificación de los piretroides ha sido poco estudiado, existen varios reportes de la actividad intensificada de esterasas en poblaciones de mosquitos resistentes, entre éstas Anopheles gambiae, A. albimanus y Culex quinquefasciatus y Aedes aegypti (Rodríguez et al. 2001, Flores et al. 2005, 2006), sin embargo, los genes involucrados aún son desconocidos. Algunos estudios han demostrado que las esterasas tienen baja actividad catalítica sobre algunos piretroides, sugiriendo que los elevados niveles de esterasas presentes en cepas resistentes a piretroides, podría deberse a una preselección con organofosforados (Rodríguez et al. 2002). La principal causa de la excesiva síntesis de esterasas en insectos resistentes, se debe a la amplificación de genes dentro del genoma, aunque también la transcripción sobreregulada y expresión genética alterada han sido documentadas. El mecanismo de resistencia metabólica estudiado con más detalle en vectores de enfermedades, es el sistema de estera-sas elevadas en Culex. En este mosquito, la sobreproducción de enzimas se debe a la amplificación de uno o más genes de esterasas, variando entre 20 a 250 copias en el genoma (Mouches et al. 1990, Callaghan et al. 1998). Existen varios alelos de esterasas asociados con la resistencia, sin embargo, el genotipo más común es la coamplificación de dos genes de esterasas: estα y estβ. Alrededor del 90% de las poblaciones resistentes de Culex presentan un genotipo estα2/estβ2 (Coleman et al. 2002) aunque otras combinaciones han sido identificadas, por ejemplo la cepa Cyprus tiene entre 40 y 60 copias de los genes estα-5 y estβ-5, mientras que la cepa TEM-R de California solo presenta amplificación en el locus estβ-1. Se ha encontrado muy poca variación en la cinética de inhibición entre los distintos alelos de esterasas, por lo cual la ventaja selectiva del genotipo est-α2/est-β2 podría estar ligada a un tercer gen (aldehído oxidasa) que se coeleva solamente con este fenotipo (Hemingway et al. 2000a). Los genes homólogos a las esterasas amplificadas en el mosquito Culex, han sido identificados en la misma proximidad y orientación en A. gambiae, pero se desconoce si están involucrados en la resistencia a piretroides, ya que las esterasas son inefectivas contra los piretroides en este mosquito (Ranson et al. 2000). Los elevados niveles de esterasas no siempre son el resultado de la amplificación genética. La sobre-expresión de la estα-1 en la cepa Barriol de Cx. pipiens del Sur de Francia, se podría deber a cambios en algún elemento regulatorio no identificado y no a la amplificación del gen estα-1. Las esterasas amplificadas pueden también ser expresadas en diferentes niveles, por ejemplo, existe cuatro veces más estβ que estα en Cx. quinquefasciatus resistente, a pesar de que los genes están presentes en una proporción 1:1. Aun así, estos mecanismos no han sido identificados a nivel genético o molecular en poblaciones naturales de mosquitos (Hemingway et al. 2000).

Por otro lado, algunas especies de Anopheles tienen un mecanismo que confiere resistencia específica al malatión e involucra a carboxilesterasas con alta actividad hidrolítica. En A. stephensi, tres esterasas con actividad carboxilesterasa contra malatión han sido aisladas y caracterizadas; sin embargo, la alteración genética que genera estos cambios cualitativos no han sido identificados en poblaciones de mosquitos de campo. Datos de otros artrópodos resistentes al malatión, sugieren que una o dos mutaciones de aminoácidos en estas enzimas podrían ser responsables de este tipo de resistencia.

8.6.2 Monoxidasas del Citocromo-P450 Las monoxidasas del citocromo-P450 son una familia de enzimas encontrada en la mayoría de organismos, incluyendo a los insectos. Estas enzimas actúan en el metabolismo de xenobióticos y tienen un rol en el metabolismo endógeno. Las enzimas P450 se unen al oxígeno molecular y reciben electrones del NADPH para introducir una molécula de oxígeno en el substrato. Las monoxidasas tienen un amplio rango de substratos, pero en general, estas enzimas metabolizan substratos lipofílicos para producir moléculas con mayor solubilidad en agua, o bien con grupos funcionales que permiten las reacciones de conjugación promoviendo la excreción (Berge et al. 1998). Las monoxidasas P450 están involucradas en el metabolismo de todos los insecticidas, permitiendo la detoxificación a través de la hidroxilación alifática del DDT, deshidroxilación aromática del carbaryl y propoxur, y la epoxidación de ciclodienos, o bien, permitiendo la activación de los organofosforados a través de reacciones de oxidación. La gran diversidad de monoxidasas se debe a la existencia de múltiples isoformas de P 450, varios patrones de expresión y un amplio espectro de substratos (Scott 1995). La elevada actividad de las monoxidasas ha sido asociada con la resistencia a piretroides en A. stephensi, A. subpictus, A. gambiae y C. quinquefasciatus (Brogdon et al. 1989). El principal método para identificar este mecanismo de resistencia se basa en bioensayos con insecticidas, utilizando inhibidores de las monoxidasas del citocromo-P450 (butóxido de piperonilo). La reducción en la magnitud de la resistencia observada constituye la primera pista de la presencia de este mecanismo y su confirmación requiere de estudios bioquímicos comparando cepas resistentes y susceptibles. En la mayoría de los casos donde se ha correlacionado la actividad elevada de las monoxidasas-P450 con la resistencia a insecticidas, se ha identificado el rol de los genes Cyp pertenecientes a la familia Cyp6. La enzima Cyp6D se sobreproduce en una cepa de Musca domestica resistente a piretroides debido a la transcripción regulada; por otro lado, la Cyp6A se ha asociado con la resistencia a organofosforados en la misma especie (Feyereisen et al. 1995). En A. gambiae y C. quinfefasciatus se han identificado la sobreexpresión de uno o varios genes pertenecientes a la familia Cyp6 asociados con la resistencia a piretroides (Nikou et al. 2003, Gong et al. 2005). Otros genes pertenecientes a las familias Cyp4, Cyp12 y Cyp9 han sido observados en cepas resistentes a insecticidas en diferentes especies de insectos. Recientemente, 17 cDNAs que codifican oxidasas Cyp4 han sido identificadas en A. albimanus y 111 genes P450 han sido identificados en A. gambiae, sin embargo, aún se

desconoce si estas familias de oxidasas juegan algún papel en la resistencia del mosquito (Ranson et al. 2002).

8.6.3 Glutatión-s-Transferasas Las glutatión-s-transferasas (GSTs) son enzimas diméricas multifuncionales que juegan un rol en la detoxificación de un gran rango de xenobióticos. Las enzimas catalizan el ataque nucleofílico del glutatión reducido (GSH), en los centros electrofílicos de los compuestos lipofílicos. Múltiples formas de estas enzimas han sido reportadas en mosquitos, mosca doméstica, drosofílidos y mosca de las ovejas. Se sugiere que las GSTs juegan un rol en la resistencia, ya que muchos estudios han mostrado que los homogenizados de insectos resistentes a insecticidas presentan altos niveles de actividad de estas enzimas. El principal rol de las GSTs en la resistencia a insecticidas en mosquitos, es el metabolismo del DDT a productos no tóxicos (DDE), aunque también tienen un rol secundario en la resistencia a organofosforados. La resistencia al DDT basada en GSTs es muy común en varias especies de anofelinos, reflejando el fuerte uso de este insecticida para el control de la malaria durante varias décadas. Las glutatión-s-transferasas pertenecientes a las clases Delta y Epsilon han sido identificadas en insectos y se han asociado con la resistencia a insecticidas en mosquitos y otras especies. En Aedes aegypti al menos dos grupos de GSTs se encuentran en altos niveles en insectos resistentes al DDT (Lumjuan et al. 2005), mientras que en A. gambiae un gran número de GSTs se encuentran elevadas y algunas de ellas pertenecen a la clase-1 de GSTs. Las GSTs en Aedes aegypti y A. gambiae de insectos resistentes se sobre expresan en forma constitutiva . Las GSTs-2 de A. aegypti se sobre expresan en todos los tejidos a excepción de los ovarios. La secuencia de la clase II de GSTs de A. gambiae ha sido publicada y las principales clases de GST II en A. aegypti se ha clonado y secuenciado. En esta última especie, GST-2 es sobre expresada en la cepa GG resistente a DDT, y se piensa que la mutación resistente ocasiona la interrupción de un represor; esta mutación evita la función normal del represor llevando a niveles elevados la enzima GST-2 en mosquitos resistentes (Ranson et al. 2002). Las GSTs de la clase I son codificadas por una extensa familia de genes en A. gambiae, M. domestica y Drosophila melanogaster. La organización genómica en estas tres especies es sorprendentemente diferente. En D. melanogaster ocho genes divergentes sin intrones y se encuentran en un segmento de DNA de 14 kb. En A. gambiae, múltiples genes de la clase GST-1 se encuentran agrupados en un sólo sitio genómico (cluster). La mayoría de los genes contienen uno o más intrones, uno de estos genes, aggst-1α, tiene un empalme alternativo produciendo cuatro transcriptos distintos de mRNA. La organización de la familia de genes GST-1 es muy similar en insectos resistentes y susceptibles en A. gambiae, sugiriendo que el mecanismo de resistencia basado en GSTs es probablemente causado por un regulador cis-trans. Los productos de estos genes difieren en su habilidad para metabolizar al DDT y algunos de estos genes son regulados para activar el metabolismo en mosquitos resistentes (Enayati et al. 2005).

8.6.4 Acetilcolinesterasa Insensible Los organofosforados y carbamatos tienen su sitio blanco en la acetilcolinesterasa (AchE). La AChE hidroliza al neurotransmisor excitatorio acetilcolina en la membrana postsináptica

del nervio. La AChE de los insectos tiene una especificidad de substrato intermedio entre la AChE de los vertebrados y la butiril-colinesterasa. La forma molecular predominante en insectos es un dímero globular anfifílico que se une a la membrana mediante una ancla glipofílica. Alteraciones en la AChE en insectos resistentes a organofosforados y carbamatos resulta en una reducción o inhibición en la sensibilidad de la enzima por estos insecticidas. En Culex pipiens, la AChE-1 y AChE-2 difieren en su especificidad de sustrato, sensibilidad inhibitoria y el patrón de migración electroforético. Solo la AchE-1 parece conferir resistencia a insecticidas (Raymond et al. 1986). Hasta la fecha, se han identificado dos genes Ace con esta actividad. La única acetilcolinesterasa clonada en C. pipiens es la Ace2, la cual no está involucrada en la resistencia a insecticidas y además se encuentra ligada al sexo. Por otro lado, el gen Ace1 es autosómico y confiere resistencia a insecticidas. Los vertebrados tienen dos tipos de colinesterasas: acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa. En D. melanogaster solo un gen Ace que codifica una colinesterasa ha sido clonado. Distintas substituciones de aminoácidos en los genes Ace de Drosophila y M. domestica podrían causar resistencia, siempre y cuando los residuos asociados a la resistencia se localicen cerca o dentro del sitio activo de la acetilcolinesterasa. Hasta ahora, no ha sido registrada la resistencia basada en AChE en Anopheles stephensi, y debido a que ninguno de los casos de resistencia registrada han estado ligados al sexo, se sugiere que estos genes no representan el sitio blanco del insecticida. El análisis detallado del perfil de inhibición de la acetilcolinesterasas de Aedes aegypti sugiere que existe un sólo locus AChE en esta especie. En este caso, la resistencia basada en alteraciones de la acetilcolinesterasa podría estar ligada al sexo. Los genes AChE han sido clonados en los mosquitos A. aegypti y A. stephensi, aunque ambos genes están ligados al sexo (Anthony et al. 1995). Cinco mutaciones puntuales asociadas con la resistencia a organofosforados y carbamatos han sido identificadas en el gen de la acetilcolinesterasa en D. melanogaster (Mutero et al. 1994) y estudios dirigidos por mutagénesis del AChE ligado al sexo de A. aegypti, han demostrado que estas mutaciones también confieren resistencia en mosquitos (Vaughan et al. 1997). Las alteraciones en la AChE tienen un costo de viabilidad muy severo en las poblaciones de C. pipiens en el sur de Francia, probablemente causado por la reducción en la actividad de AChE de la enzima mutada comparada al tipo silvestre. Sin embargo, en Drosophila se ha propuesto que la presencia de múltiples mutaciones que confieren bajos niveles de resistencia podrían ser una respuesta a la selección de mutaciones con mayor viabilidad en esta enzima (Ming et al. 2004).

8.6.5 Receptores GABA La resistencia a dieldrín fue registrada en 1950, sin embargo, la participación de los receptores GABA en este tipo de resistencia fue demostrada hasta 1990. El receptor GABA en los insectos es un canal de iones de cloro heteromultimérico, con función de inhibir la neurotranmisión en el sistema nervioso central del insecto y en uniones neuromusculares. El receptor GABA de los insectos está implicado como un sitio de acción para piretroides, ivermectinas y ciclodienos. Algunos estudios muestran que los insectos resistentes a ciclodienos son resistentes a los insecticidas picrotoxina y fenilpirazole, y que el efecto de la ivermectina en neuronas cultivadas puede revertirse con el pretratamiento con picrotoxina,

sugiriendo que estos insecticidas interactúan con el ionóforo de cloro asociado con el receptor GABA de insectos. Los receptores GABA pertenecen a una superfamilia de receptores de neurotransmisores que incluyen a los receptores nicotínicos de la acetilcolina. Estos receptores están formados por oligomerización de cinco subunidades alrededor del canal central de iones de sodio. Cinco distintas subunidades han sido clonadas a partir de vertebrados. Hasta la fecha sólo tres subunidades han sido clonadas en D. melanogaster, pero éstas no entran en la clasificación de subunidades GABA de los vertebrados (ffrench-Constant et al. 1993). Se ha encontrado que una sustitución de alanina a serina en el dominio que envuelve al canal del receptor GABA, confiere resistencia a ciclodienos tales como el dieldrín. La mutación fue identificada por primera vez en Drosophila, y desde entonces ha mostrado estar en un amplio rango de insectos resistentes a dieldrín, incluyendo A. aegypti (ffrench-Constant et al. 1994). La única variación en insectos resistentes es que el residuo sustituido cambia a glicina en vez de serina. A pesar de que se ha detenido el uso de insecticidas ciclodienos para agricultura y salud pública, los alelos resistentes pueden ser encontrados en relativamente altas frecuencias en poblaciones de insectos en campo.

8.6.6 Canales de Sodio El rápido efecto de derribe que caracteriza a los insecticidas DDT y piretroides, es ocasionado por la activación persistente de los canales de sodio. Esta activación se debe a la forma en que los insecticidas se unen al poro del canal, prolongando el mecanismo de inactivación dependiente de voltaje. La reducción en la sensibilidad del canal de sodio dependiente de voltaje a la unión de los insecticidas es la causa del fenotipo resistente conocido como “kdr” presente en varias especies de insectos. Debido a que el canal de sodio es el sitio blanco del DDT y piretroides, muchos estudios en la década de los 80´s y 90´s se enfocaron en esta proteína. El canal de sodio dependiente de voltaje de los insectos, es una proteína transmembranal que contiene alrededor de 2,108 aminoácidos plegados en cuatro dominios homólogos e hidrofóbicos (dominio I, II, III y IV), separados por uniones hidrofílicas. Cada dominio se compone de seis segmentos transmembranales (s1-s6). Diversas especies de insectos resistentes al DDT y piretroides presentan alteraciones en el gen del canal de sodio. La asociación entre la resistencia kdr con modificaciones en el canal de sodio fue confirmada mediante estudios de unión de neurotoxinas y mediante estudios de mapeo genético. En estos últimos, se identificó una sola mutación en el dominio II segmento transmembranal 6 (DIIS6), asociada con la resistencia tipo kdr en Musca domestica (Williamson et al. 1993). La mutación kdr consistió en un cambio de nucleótidos de adenina a timina en el residuo Leucina1014, confiriendo un cambio de aminoácidos de leucina (Leu) a fenilalanina (Phe). Posteriormente, la misma mutación fue identificada en varias especies de mosquitos, tales como A. gambiae, A. stephensi, A. sacharovi y C. pipiens (Martínez-Torres et al. 1998, Enayati et al. 2003, Martinez-Torres et al. 1999, Luleyap et al. 2002). Otras mutaciones en el segmento DIIS6 se han identificado. Una nueva mutación de T-›A en el residuo Leu1014 de A. gambiae y C. pipiens (Ranson et al. 2000, Luleyap et al. 2002) confiere una substitución a serina, sin embargo, estas cepas fueron más resistentes al DDT que a los piretroides.

Por otro lado, algunos insectos dípteros (múscidos) con el fenotipo “super kdr”, además de contener la mutación Leu1014Phe, presentaron una segunda mutación (Met918Thr) que ocurre en el puente de unión de los segmentos transmembranales 4 y 5, del dominio II (Williamson et al. 1996). Se ha sugerido que la segunda mutación intensifica el fenotipo kdr en cepas de moscas resistentes, sin embargo, esta mutación no ha sido identificada en poblaciones de moscas de campo, ni en mosquitos vectores. En forma interesante, las alteraciones del canal de sodio asociado con la resistencia, son mucho más variables que las alteraciones identificadas en los receptores GABA, sin embargo, se siguen limitando a un pequeño número de regiones en la proteína. La mayoría de las alteraciones de la proteína del canal de sodio ocurren en una región que forma parte de la cobertura del canal de sodio (DIIS6). Se ha sugerido que los canales de sodio alterados permiten una rápida disociación del insecticida, confiriendo resistencia a los efectos tóxicos del insecticida (Soderlund y Knipple 2003). La mutación leucina-›fenilalanina en anofelinos puede detectarse mediante pruebas diagnóstico-moleculares basadas en PCR, para discriminar entre individuos homocigotos susceptibles, homocigotos resistentes y heterocigotos (Martínez-Torres et al. 1998). Debido a que la resistencia kdr es semirecesiva o completamente recesiva, la capacidad de identificar organismos heterocigotos es de vital importancia para la detección temprana y manejo de resistencia en campo. Actualmente existe una tendencia a investigar la resistencia a piretroides mediante PCR en regiones donde otras mutaciones kdr han sido encontradas, sin embargo, cambios en otras regiones podrían estar asociados a la resistencia.

8.7 Resistencia kdr en el Mosquito Aedes aegypti La resistencia tipo kdr (knockdown resistance) es un mecanismo de resistencia seleccionado por insecticidas piretroides y DDT. La forma, para detectar este mecanismo es mediante bioensayos, donde los insectos son expuestos a DDT o piretroides en conjunto con inhibidores de enzimas o sinergistas, tales como PBO y DEF, para descartar resistencia por mecanismos enzimáticos. El primer reporte de resistencia tipo kdr en A. aegypti, ocurrió en Tailandia en 1975, después de la falla en una campaña de control utilizando bioresmetrina. Los estudios genéticos de una cepa seleccionada de esta población, demostró la presencia de un solo factor de resistencia a piretroides (Rpy) presente en el cromosoma III. Este factor fue incompletamente dominante en herencia (Soderlund y Bloomquist 1990). Este mecanismo de resistencia ha sido reportado en diversas poblaciones del mosquito transmisor del dengue A. aegypti hacia una variedad de insecticidas piretroides. Un estudio reciente, identificó siete mutaciones en el dominio II, segmento transmembranal S6 del canal de sodio en cepas de A. aegypti resistentes a permetrina. Ninguna de estas mutaciones corresponde al residuo 1014 presente en otros dípteros, sin embargo, si en cercana proximidad a esta región. Una de estas mutaciones ocurre en la primera posición del codón Iso1011, donde un cambio de adenina a guanina (A-›G) ocasiona una substitución del aminoácido de isoleucina por metionina (Met); esta mutación fue encontrada en cepas resistentes a permetrina de América del Sur (Brengues et al. 2003). Una segunda mutación asociado a la resistencia kdr en mosquitos de Tailandia fue identificada en el aminoácido Val1016, donde una substitución de nucleótidos de timina a

guanina (T-›G) en la segunda posición del codón, ocasiono un cambio de aminoácido de valina (silvestre) a glicina (Brengues et al. 2003, Prapanthadara et al. 2002). Otro caso fue una mutación de nucleótidos de guanina a adenina en la primera posición del codón 1,016 del gen para, confirió una substitución de valina a isoleucina (Val,1,016Iso). Esta sustitución fue encontrada en el dominio II, segmento transmembranal 6. La frecuencia del alelo mutante Iso1,016 fue detectada en cerca de 16 poblaciones de A. aegypti de varios países de América. Además, la selección con piretroides de una cepa de Islas Mujeres, México y Santiago de Cuba, Cuba, resultó en un incremento en la frecuencia del alelo Iso1,016 después de varias generaciones de selección (Saavedra et al. 2007).

8.8 Conclusiones La resistencia a los insecticidas es un fenómeno que está ampliamente documentado para los mosquitos transmisores del dengue: Aedes aegypti y A. albopictus, y en la medida que crezca el número de poblaciones tolerantes y resistentes a los insecticidas que se usan en el control, se pone en riesgo la salud de millones de personas en el mundo. Para el combate de los mosquitos en etapas larvales, se han empleado DDT, BHC y ciclodienos; Organoclorados que actualmente son de uso prohibido o restringido. Del grupo de organofosforados que se han utilizado son: malatión, fentión, fenitrotión, clorpirifos, pirimifos metil y temefos, este último es de los más utilizados, por sus características deseables como larvicida. En cuanto a Carbamatos se menciona al propoxur y bendiocarb, y para piretroides son la permetrina, cipermetrina, ciflutrina, deltametrina, -aletrina, fenotrina y lamdacialotrina. De los insecticidas microbiales están: Bacillus thuringiensis israeliensis y B. shaericus, y de los reguladores del crecimiento, se reporta al metopreno. En el combate a los adultos, desde los años 60´s se había venido usando el malatión, mismo que ha sido sustituido por otros organofosforados y piretroides. Del primer grupo se cuentan el clorpirifos, diclorvos, triclorfón, fentión, fenitrotión, pirifós-metil. Del grupo de piretroides están la permetrina, deltametrina, resmetrina, fenotrina y lamdacialotrina. Los sitio blancos donde actúan los principales grupos toxicológicos de insecticidas orgánicosintéticos, que se aplican contra mosquitos son: canales de sodio (para) en piretroides, receptores del ácido aminobutírico (GABA) en ciclodienos, y acetilcolinesterasa (AchE) en organofosforados y carbamatos. Los mecanismos de resistencia pueden ser: penetración reducida, comportamiento, metabolismo elevado e insensibilidad del sitio blanco. La resistencia metabólica o fisiológica tiene una base bioquímica y es la más estudiada. Los insectos adquieren resistencia de dos formas: una por adición de un mecanismo de protección y la otra por insensibilidad en el sitio de acción. Por lo general, estos mecanismos no son específicos y confieren resistencia cruzada a otros tóxicos de estructura similar y en muchos casos, a compuestos químicamente no relacionados. En los piretroides, los mecanismos de resistencia identificados son: metabolismo del insecticida por oxidasas (monoxidasas del citocromo P450) y esterasas, insensibilidad en el sitio de acción o kdr y penetración reducida.

En organofosforados, los principales mecanismos de resistencia son: metabolismo por monoxidasas, glutation transferasas, esterasas y carboxiesterasas. En este grupo de insecticidas, las reacciones metabólicas de activación pueden deberse a la acción de oxidasas que ocasionan una desulfuración oxidativa al cambiar P=S por P=O; en OF´s que tienen grupo tioéter, la oxidación metabólica de los sulfuros conduce a la formación de sulfóxidos y sulfonas. En el caso de las carboxiesterasas, éstas hidrolizan la fracción carboetoxi del metabolito del malatión, malaoxón, dando como resultado metabolitos solubles en agua; esto ocurre en mamíferos, es por ello que el malatión es relativamente seguro para este grupo de animales, mas no para algunos insectos.

8.9 Literatura Citada Adams ME & TA Millar. 1980. Neural and behavior coorrelates of pyrethroid and DDTtype poisoning in the house fly Musca domestica. Pestic. Biochem. Physiol. 13, 137-147. Anónimo. 1991. Entomología con Énfasis en Vectores. Secretaria de Salud. Vol. I-II, S.S.S.D.G.M.P.-O.P.S. Anónimo. 1988. Vectobac: Una alternativa biológica para el control de mosquitos y moscas negras. Bol. Tec. Abbott Laboratorios. E.U.A. Anthony N, T Rocheleau, G MoceliN, L Hwa-Jung & R ffrench-Constant. 1995. Cloning, sequencing and functional expression of an acetylcholinesterase gene from the yellow fever mosquito Aedes aegypti. FEBS Letters. 368: 461-465. Arredondo JJI, MH Rodríguez, DN Bown & EG Loyola. 1993. Indoor low-volume insecticide spray for the control of Anopheles albimanusin southern Mexico. Village-scale trials of bendiocarb, deltametrina and cyflutrin. J. Am. Mosq. Control Assoc. 9: 210-220. Ayesa P, LC Harrington & JG Scott. 2006. Evaluation of Novel Insecticides for Control of Dengue Vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 43: 55-60. Backer N & M Ludwig. 1993. Investigationson possible resistence in Aedes vexans field populations after 10 year applications of Bacillus thuringiensis israeliensis. J. Am. Mosq. Control Assoc. 9: 221-224. Berge JB, R Feyereisen & M Amichot. 1998. Cytochrome P450 monooxygenases and insecticide resistance in insects. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 353, 1701-1705. Bloomquist JR. 1999. Insecticides: Chemistry www.Redcliffe´s IPM word textbook Home page. and Characteristics. En linea,

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