LAPORAN PRAKTIKUM ENDOKRINOLOGI DAN REPRODUKSI HEWAN ACARA V ANALISA HORMON DENGAN METODE ELISA

OLEH LALU ACHMAD TAN TILAR WSK. 10/306157/PBI/00959

PROGRAM PASCASARJANA S2 FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS GADJAH MADA 2011 ACARA V

ANALISA HORMON DENGAN METODE ELISA 1. Tujuan Mempelajari langkah-langkah penting dalam analisa hormon dengn menggunakan metode Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
2. Bahan dan Alat

a. Bahan

Antigen yang dimurnikan Antibodi yang dimurnikan Larutan standard Sampel yang ingin dites Cairan pencuci (buffer) Antibodi atau antigen yang tertaut dengan enzim signal Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal. Microtiter Micropipet ELISA reader (spektrofotometer) untuk pengukuran kuantitatif

a. Alat

1. Cara Kerja

Tentukan jumlah microtitter yang akan digunakan kemudian letakkan pada penahannya. Masukkan masing-masing 25 sebagai larutan standar, kontrol dan sampel L Masukkn 200 L enzim conjugate ke dalam setiap sumuran dan diaduk selama 10 detik Inkubasi selama 60 menit dalam suhu ruangan Mengeluarkan seluruh isi sumuran dan dicuci 3 kali menggunakan larutan pencuci sebanyak 400 L setiap sumuran Menghentakkan sumuran dengan keras di atas kertas penyerap untuk menghilangkan gumpalan residu Menambahkan 200 L substrat solution pada setiap sumuran Inkubasi selama 15 menit pada suhu ruangan

Menghentikan reaksi enzimatik dengan menuangkan 100 L stop solution pada setiap sumuran Membaca penyerapan pada setiap sumuran menggunakan microtitter plate reader, 10 menit setelah penambahan stop solution.

1. Tinjauan Pustaka

ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay) atau 'penetapan kadar imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai pelapor (reporter label) (Lequin, 2005). ELISA tradisional secara khusus memiliki reporter dan substrat yang menghasilkan beberapa bentuk perubahan warna yang dapat diamati untuk mengetahui kehadiran antigen atau analyte. Bentuk teknik ELISA terbaru seperti teknik flurogenic, electrochemiluminescent, dan real-time PCR dibuat untuk mengetahui sinyal kuantitatif. Metode ini dapat memberikan berbagai keuntungan diantaranya sensitifitas yang tinggi dan bersifat multiplexing (Leng et al, 2008). Teknik ELISA merupakan teknik kuantitatif yang sangat sensitif, penggunaannya sangay luas, memerlukan peralatan yang sedikit, reagen yang diperlukan sudah tersedia dan dijual secara komersial dan sangat mudah didapat. Tes ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi antigen maupun antibodi Pemeriksaan ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi antibodi dalam tubuh manusia maupun hewan. Terdapat berbagai teknik dalam pemeriksaan ELISA. Tes ini dapat dilakukan dengan kit yang sudah jadi atau dapat juga dilakukan dengan menggunakan antigen yang diracik sendiri (Setiawan, 2007).
2. Hasil Pengamatan

Tabel hasil pembacaan hormon menggunakan ELISA reader (spektrofotometer) Kadar Testosteron Absorbansi 0 0.807 0.2 0.665 0.5 0.179 1 0.108 2 0.024 6 0.399 16 0.402

Grafik hasil pembacaan hormon menggunakan ELISA reader (spektrofotometer)

3. Pembahasan Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) atau dalam bahasa indonesianya disebut sebagai uji penentuan kadar imunosorben taut-enzim, merupakan teknik pengujian serologi yang didasarkan pada prinsip interaksi antara antibodi dan antigen. Pada awalnya, teknik ELISA hanya digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi dalam suatu sampel seperti dalam pendeteksian antibodi IgM, IgG, & IgA pada saat terjadi infeksi (pada tubuh manusia khususnya). Namun seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan, teknik ELISA juga diaplikasikan dalam bentuk lain termasuk menganalisis kadar hormon yang terdapat dalam suatu organisme. Secara singkat dapat dikatakan bahwa teknologi ELISA yang digunakan untuk asai hormon dalam cairan tubuh adalah sistem competitive enzyme immunoassay yang analog dengan teknik RIA. Antigen yang berlabel dan antigen yang tidak berlabel saling bersaing untuk berikatan dengan tapak pengikatan antibodi yang terdapat dalam jumlah terbatas. Saturasi antibodi terjadi secara simultan bila semua reaktan diinkubasikan bersama sama. Contoh reaksi seperti ini adalah ELISA untuk mengukur progesteron, estradiol, dan kortisol. Pengukuran hormon kortisol dalam saliva menggunakan teknik ELISA dapat mengetahui tingkat stres yang di alami oleh organisme (Haussmann et al., 2007). Teknik ini tidak membutuhkan peralatan yang banyak.

Hormon hormon reproduksi seperti estrogen, progesteron, dan testosteron, merupkan hormon yang tersusun dari steroid. Steroid tidak bersifat imunogenik secara alami karena senyawa ini mempunyai berat molekul yang rendah sehingga untuk dapat menghasilkan respons imun steroid harus diikatkan pada senyawa dengan berat molekul yang lebih tinggi. Dari hasil pengamatan diketahui bahwa kadar hormon testosteron sangat erat kaitannya dengan absorbansi yang dihasilkan. Testosteron dengan konsentrasi yang lebih rendah cenderung memiliki tingkat absorbansi yang lebih tinggi. Sedangkan kadar hormon yang lebih tinggi (konsentrasi 6 dan 16) memiliki absorbansi yang relatif stabil. Hasl ini mungkin dipengaruhi oleh banyak faktor terutama faktor kelemahan dari teknik ELISA yang digunakan. Kelemahan yang dapat diketahui antara lain:

Immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi pada percobaan yang berbeda. Amplifikasi signal hanya sedikit. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan untuk uji ELISA direct.

1. Kesimpulan Dari hasil pengamatan serta pembahasan yang dilakukan dapat diambil beberapa kesimpulan penting antara lain:
a. Secara singkat dapat dikatakan bahwa teknologi ELISA yang digunakan untuk

asai hormon dalam cairan tubuh adalah sistem competitive enzyme immunoassay yang analog dengan teknik RIA.

b. Steroid tidak bersifat imunogenik secara alami karena senyawa ini mempunyai

berat molekul yang rendah sehingga untuk dapat menghasilkan respons imun steroid harus diikatkan pada senyawa dengan berat molekul yang lebih tinggi.
c. Dari hasil pengamatan diketahui bahwa kadar hormon testosteron sangat erat

kaitannya dengan absorbansi yang dihasilkan.

Daftar Pustaka Haussmann, M. F., C. M. Vleck, and E. S. Farrar. 2007. A laboratory exercise to illustrate increased salivary cortisol in response to three stressful conditions using competitive ELISA. Adv. Physiol. Educ. 31: 110115. Leng, S. J. McElhaney, J. Walston, D. Xie, N. Fedarko, G. Kuchel (October 2008). "Elisa and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging Research". J Gerontol a Biol Sci Med Sci 63 (8): 879884. PMC 2562869. PMID 18772478. Lequin, RM (2005). "Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)". Clinical Chemistry 51 (12): 24152418. Setiawan, I Made. 2007. Pemeriksaan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) untuk diagnosis Leptospirosis . EBERS PAPYRUS.