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Modelos animales en el estudio de la malaria

Modelos animales en el estudio de la malaria

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Publicado porCristobal Gallardo
En este trabajo se describen todos los aspectos relacionados con el estudio de la malaria en modelos animales, haciendo especial incapié en el estudio en primates y en ratones.

This paper describes all aspects related to the study of malaria in animal models, with particular stress upon the study in primates and mice.
En este trabajo se describen todos los aspectos relacionados con el estudio de la malaria en modelos animales, haciendo especial incapié en el estudio en primates y en ratones.

This paper describes all aspects related to the study of malaria in animal models, with particular stress upon the study in primates and mice.

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Published by: Cristobal Gallardo on Jun 07, 2011
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Contribución de los modelos animáles a la compresión de la histiopatogénesis de la malaria

Crístóbal Gallardo Alba
Trabajo de métodos y técnicas experimentales en biología animal

Introducción
La malaria es la enfermedad tropical más importante en humanos, siendo la causa de una enorme debilitación y mortalidad en las áreas donde es endémica. Globalmente, en número de casos que se recogen en los aproximadamente los 90 paises donde es común se estima en 250-500 millones , con un mayor impacto en el África subsahariana, donde provoca la muerte de 1'5 - 2 millones de niños cada año. La enfermedad esta causada por un parásito prozotoo del género Plasmodium, transmitido através de la mordedura de el mosquito hembra Anopheles. Cuatro especies de Plasmodium son causantes de enfermedades en humanos, P. vivax, P. ovale, P.malarie y P.falciparum, siendo éste último el más virulento y el que causa una mayor mortalidad, provocando la llamada malaria cerebral, caracterizada por el secuestro de globulos rojos parasitados, sobretodo en las profundidades de los lechos vasculares cerebrales, y por niveles elevados de citoquinas proinflamatorias.

Otras células huesped tales como leucocitos, y las plaquetas también se encuentran en las lesiones del cerebro y parecen estar implicados en la patogénesis de la enfermedad. El estado de diferenciación y desarrollo de los esporocitos (la forma infectiva) se genera en el mosquito vector y la transferencia de los esporocitos al interior del huésped humano ocurre durante la succión de la sangre. Los esporocitos migran al hígado y dentro de las células parenquimáticas inician la fáse hepática de la enfermedad. Dentro de los hepatocitos, los parasitos se desarrollan al estado de esquizontes maduros, cada uno de los cuales contiene aproximadamente 40.000 merozoitos. Cada merozoito es capaz de invadir un glóbulo rojo para iniciar la fase eritrocítica de la infección. Esta es la fase cíclica en que los merozoitos desarrollan dentro de los globulos rojos inicialmente como formas de anillo, progresando a trofozoitos y eventualmente a esquizoitos maduros, los cuales liberarán una nueva generación de merozoitos que continuarán la invasión de los eritrocitos.

Imagen 1: Ciclo vital de Plasmodium

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Contribución de los modelos animáles a la compresión de la histiopatogénesis de la malaria

Para P. falciparum la duración de cada ciclo eritrocítico es aproximadamente 48h. La ruptura de los eritrocitos provocada por los esquizontes esta acompañada por la liberación de toxinas dentro de la circulación y la activación de respuestas inmunes, lo que provoca los signos y síntomas de la enfermedad. Tras una serie de ciclos eritrocíticos, y presumiblemente cuando el ambiente del hospedador se vuelve hostil para el parásito, los merozoitos se diferencian en gametocitos preparados para ser absorbidos por la picadura de los mosquitos y completar así su ciclo de vida.

humano, los diferentes modelos permiten representar fielmente ciertos aspectos de la malaria cerebral humana.

Monos como modelos de estudio
Las infecciones de malaria en los hospedores primates naturales son usualmente leves y sin implicaciones cerebrales. Por ejemplo, P.knowlesi y P.coatneyi llegan a producir infecciones moderadas en macacos (Macaca facicularis) pero, las infecciones de P.knowlesi, P.coatneyi o P.fragile son severas en los macacos rhesus (M.mulatta), el huesped experimental. P. knowlesi en los macacos rhesus induce un síndrome cerebral, pero es atribuido a la liberación de quininas y otras aminas vasoactivas que provoca la ruptura de la barrera hematoencefálica y el subsecuente edema cerebral. Este escenario no es comun en la malaria cerebral humana, aunque puede ocurrir durante los estadios terminales. Sin embargo, P. coatneyi en los macacos rhesus exhibe algunas de las características comunmente asociadas con la patologia en humanos. Algunos otros modelos monos-parásitos han sido ya desarrollados . La regulación al alza de las moleculas de adhesión (CD36, trombospodin y ICAM-1) es una de las características comunes a todos los modelos. La implicación multiorganica ha sido también demostrada en el modelo de P. coatneyi-mono rhesus.

Malaria cerebral
La malaria cerebral es definida como un coma irreversible no atribuible a otras causas en pacientes con P. falciparum. En los niños africanos, el coma suele estar acompañado de fiebre, convulsiones, acidosis metabólica e hipoglucemia. Una proporción significante de los supervivientes presentan permanentes complicaciones neurológicas incluyendo desordenes cognitivos y del habla, anormalidades motoras y ceguera cortical.

Modelos experimentales para la malaria
Los modelos de la malaria cerebral han sido desarrollados en monos, ratas y ratones y, aunque ninguno de ellos mimetiza exactamente el síndrome

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Contribución de los modelos animáles a la compresión de la histiopatogénesis de la malaria Tabla 1: Modelos experimentales de la malaria cerbral en monos y sus característics

Tabla 1: Modelos experimentales de la malaria cerbral en monos y sus característics

El estudio más reciente de P.coatneyi en los monos rhesus mustra una clara asociación entre el desarrollo de malaria severa en animales, altos niveles de citoquinas proinflamatorias (IL-1B, TNF y IFNgamma) y la inducción de iNOS en el cerebro y el cerebelo. Sin embargo, solo uno de los animales realmente se volvió comatoso. Estos recientes desarrollos en los modelos en monos muestran fuertes similaridades con la malaria cerebral humana, sin embargo , la naturaleza impredecible de la malaria cerebral en monos es un problema para el desarrollo de estudios cinéticos, que son cruciales para entender los eventos moleculares que llevan a la patología cerebral. Género Aotus como modelo de estudio El género Aotus esta compuesto por nueve especies de monos ámpliamente distribuidas por Améria central y Sudamerica. Aunque no se han encontrado en la naturaleza ningun individuo infectado con parasitos que provocan la malaria en humanos, son áltamente susceptibles a infecciones experimentales. Desde las primeras infecciones con P.vivax y P.falciparum que fueron realizadas en 1960, diferentes especies de Aotus han sido usadas para el screening de fármacos antimaláricos, para el desarrollo de vacunas y más recientmente como modelos para la fisiopatología de la malaria. No todos los Plasmodum crecerán en los monos Aotus: sin embargo, una vez que el parásito aislado ha sido adaptado a una especie puede ser facilmente transmitida a las demás. La esplectenomía (extracción del bazo) es esencial para la adaptación y el manteniminto de infecciones a largo plazo así como para la producción de un gran número de gametocitos infectivos. Las esquizogonias hepáticas pueden ser fácilmente obtenidas con P.falciparum sin necesidad de adaptación previa de los monos, sin embargo, el desarrollo de la parasitémia desarrollada tras el estado esporocito ,ya sea via inyección intravenosa o por picadura de mosquito ,son inferiores a las alcanzadas después de la inoculación intravenosa del estado sanguíneo de la infección , y no todos los animales inoculados con esporozoitos se tornan infectados.

El desarrollo de la forma hepática de parásito ha sido demostrada 6 y 7 dias despues de la inyección directa de esporozoitos dentro del hígado, así como despues de la inoculación intravenosa de 10 6 esporozoitos de P.falciparum. Además,la transmisión de la malaria de mono a mono a sido conseguida con éxito através de mosquitos infectados con esporozoitos. Muchas especies de mosquito y de diferentes parásitos aislados son capaces de transmitir la infección a Aotus, sin embargo, la infección de Aotus lemurinus griseimembra con la cepa de P. falciparum adaptada Santa Lucia a mostrado ser muy reproducible. Este parásito no se desarrolla bien en cultivos pero es capaz de producir gran cantidad de gametocitos maduros e infectivos en la sangre periferia en Aotus. En contraste, P.falciparum NF54, que produce fácilmente gametocitos in vitro ,no ha podido ser adaptada a los monos. También se ha conseguido exitosamente desarrollar el estado hepático de P.falciparum en cultivos primarios de hepatocitos de monos Aotus y Saimiri. Aunque A.l.griseimembra, A. vociferans y A.lemurinus lemurinus son susceptibles de la infección con esporocitos, algunas de esas especies requieren esplectomias para desarrollar infección sanguinea despues de la inoculación con esporozoitos. Estos modelos han permitido demostrar que las respuestas citolíticas mediadas por linfocitos CD8+ son críticas para la protección contra el desarrollo de formas hepáticas de la malaria. Dado que el bazo es uno de los organos donde los linfocitos se acumulan, los animales con bazos intactos permitirian una evaluación mas fiables de las respuestas inducidas por vacunación. Muchas especies de Aotus son también susceptibles a infección con P.vivax El tránsito cíclico de P. vivax de mono a mono, humano a mono y viceversa ha sido logrado por inoculación de esporozoitos obtenidos por disección de mosquitos o por infección por una picadura. Después de la inoculación de los esporozoitos, la infección se produce en periodos que oscilan entre 11 y 55 dias dependiendo de la especie de mono. Es bien conocido qu la invasión de los eritrocitos humanos requiere la interacción de muchos ligandos de los parásitos con multiples receptores del huesped.

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El hecho de que P. falciparum y P. vivax pueden invadir a células de primates no humanos lleva a la asución que la la estructura de las moléculas implicadas puede ser la misma o estar estrechamente relacionada a la de los humanos, lo que otorga una mayor bondand a estos. Es sabido que ,mientras P.falciparum usa muchos receptores para invadir a los globulos rojos, la invasión del merozoito de P.vivax depende completamente de la presencia del receptor Duffy y su interacción por la proteina de unión a Duffy del parásito. La diversidad genética del parásito y del huesped puede explicar porque todos los parásitos humanos no pueden ser facilmente adaptados a los monos Aotus. P.falciparum tiene un ciclo de 48 h. en los individuos del género Aotus,semejante a lo que se da en humanos, pero existen marcadas diferencias tanto en el desarrollo de la parasitémia como en el desarrollo de los gamtocitos infectivos, dependiendo de la cepa de parásito y de la especie de Aotus. La infección con ciertas cepas de parásitos puede ser asincrónica y todos los etapas sanguíneas del parásito puede ser vistas en la sangre periférica. Muchas cepas de P.falciparum como Vietnam Oak Knoll, Santa Lucia, Uganda Palo Alto, Indochina 1/CDC, Malayan IV, Camp, Cambodian I, FCH/4, Montagnard S-1, West Africa I, Haitian I/II o Panama II han sido adaptadas en los monos Aotus. En individuos A.l. grisemembra , la cepa P. falciparum Vietnam Oak Knoll desarrolla un patron de infección muy reproducible, con un rápido incremento de la parasitémia hasta niveles letales (10%), apartir del sexto dia de infección, las cepas P.falciparum Palo Alto producen periodo de parasitémia prolongado y ligero. La susceptibilidad de las diferentes subespecies de Aotus a morir despues de la infección también es variable. Así, en A.l. Griseimembra el riesgo de morir de parasitémia es aproximadamente del 5%, mientras que en otras especies puede exceder el 90%. El ciclo de P.vivax en Aotus tiene variaciones en cuanto al tiempo de desarrollo, los niveles de parasitémia y la infectividad de los gametocitos, lo cual depende de la cepa, de la especie de mono y de si al animal se le ha extirpado el bazo. Las infecciones inducidas por inoculación de 105 eritrocitos parasitados de la cepa P.vivax Salvador I, y/o P.vivax VCC4 han mostrado un prepatente periodo a los 12 dias en la mayoría de los animales, un periodo similar al observado en infecciones en humanos. Otras cepas de P.vivax han sido exitosamente adaptadas en Aotus: Chesson, Brazil I, AMRU-1, Indonesia XIX, Indonesia I Mauritania I/II Vietnam Palo Alto, Thai III, etc. El desarrollo de maduros e infectivos gametocitos de P.falciparum y P. vivax los monos Aotus permite su uso para iniciar el ciclo de esporogonias en mosquitos alimentados experimentalmente. La transmisión de P.vivax y P.falciparum ha sido conseguida con muchas especies de mosquito: Anopheles albimanus, An. Freeborni, An. Maculatus y An. Stepensi. El desarrollo de gametocitos maduros e infectivos de P.falciparum y P.vivax en los monos Aotus permite también el ensayo de la inmunogenididad y la eficacia de vacunas. 4

Limitaciones en el uso de primates no humanos en investigaciones biomédicas El desarrollo de vacunas esta obstaculizado por el descenso de la disponibilidad de primates para investigaciones biomédicas. Varias razones contribuyen a ello. En primer lugar, los primates estan sujetos a una gran presión en sus habitats naturales debido al progreso de las comunidades humanas. En segundo lugar, serias restricciones para la exportación de animales han sido introducidas en algunos países. En tercer lugar, hay una falta de instalaciones adecuadas y de entrenamiento científico en los paises tropicales de donde los monos son originarios, para llevar a cabo las invstigacions bajo las normas de Buenas Practicas de Laboratorio (GLP) necesarias para el desarrollo de fármacos. Por último, muchos países ,principalmente en Europa, han incrementado la regulación para la importación y el uso de primates para investigaciones biomédicas y las organizaciones proteccionistas ejercen fuerte presión contra ello. Con todo ello, la mayoría de los modelos disponibles de pequeños primates, particularmente Aotus, representan los sistemas disponibles para probar vaculas contra la malaria, componentes antimaláricos y para entrender las interacciones parásito hospepador y consecuentemente para proporcionar una visión acerca de los mecanismos involucrados en la fisiopatogénesis.

Malaria cerebral murina
La disponibilidad de diferentes cepas de ratones, incluyendo varios cepas knockout, ha permitido profundizar en los mecanismos moleculares implicados en la patología cerebral. La mayor contribución a la investigación de la quimioterápia de la malaria fué dada en 1948 por el parasitólogo belga Ignace Vincke, y fué el descubrimiento de un parásito en las ratas de matorran de la región de Katanga del entonces Congo Belga. Éste parásito, Plasmodium berghei, que puede ser infectivo para ratones de laboratorio, ratas y hamster, ha sido ampliamente explotado en los ultimos 50 años, no solo para investigación quimioterápica, sino también para inmunología. Este parasito, sin embargo, difiere de P. vivax y P.ovale en qu no posee un estado hipnozoito en el higado, con lo que para el estudio de la actividad hipzoitocidal , el único model válido es P. cynomolgi en los monos rhesus (Macaca mulatta). Así, las malarias en roedores han sido aprovechadas principalmente para el estudio de los esquizoitos sanguineos. Posteriormente se descubrieron otras especies infectivas de roedores, como P. yoelii. Los experimentos de malaria cerebral se desarrollaron por primera vez en roedores en 1960, con la demostración de una asociación entre las células T y la neuropatología. La timectonia neonatal previene de la malaria cerebral en hamster mientras que el tratamiento con anticuerpos anti-timocitos previene de la enfermedad tanto en hamster como en ratas.

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Los estudios murinos siguieron en 1980, y establecieron firmemente dos caracteristimas muy importantes de la malaria cerebral. Primero, mostraron una asociación entre los signos clínicos (ataxia, convulsiones y coma) y el secuestro de leucocitos dentro de la microvasculatura del cerebro. En segundo lugar, y en acuerdo con los tempranos estudios con hamsters y ratas, establecieron el rol de las células T en la neuropatología. Los ratones BALB/C nu/nu deficientes en celulas T eran resistentes a las malaria celebral, mientras que 10-70% de las camadas normales nu/+ eran altamente susceptibles. En ambos estudios, el taponamiento vascular y la presencia de microhemorragias en lesiones cerebrales de animales con malaria cerebral fueron descritos. Mantenimiento y tratamiento de los animales La infección de malaria en los ratones resulta en una rápida caída de su temperatura corporal, lo cual debe ser contrarrestado por el mantenimiento de una suficientemente alta temperatura ambiental y humedad, preferiblemente entre 20 ± 2 ºC y humedad relativa de 55% . La naturaleza de la dieta es muy importante dado que debe contener una cantidad adecuada de ácido paminobenzoico para permitir el desarrollo de los parásitos, pero no tan elevada como para antagonizar la acción de componenten tales como sulfonamidas o sulfonas.

Aunque no es necesario el uso especifico de animales SPF, es esencial que los ratones deban proceder de colonias de cría bien controladas en las que no exista contaminación por orgnismos como Eperythrozoom coccides, Haemobartonella muris u otros patógenos víricos o bacterianos comunes de ratones. E.coccides, que es transmitido por ectoparásitos del raton, es un patógeno particularmente indeseable , ya que puede estar presente en las colonias de ratones sin ser detectado y solo sale a la luz cuando los animales son infectados con malaria. Los organismos son frecuentemente confundidos por el investigador cuando emplea la tinción de Romanowsky. Si la sangre infectada de malaria procedente de un raton contaminado con E.coccoides es usado para infectar un nuevo animal o es criopreservado, los contaminantes seran llevados con el plasmodio y se extenderán a los nuevos huespedes. El efecto más obvio que provocan en el huesped es la hemolisis de los eritrocitos a los que se adjuntan. También actúan como un estimulante del sistema inmune. Dado que el curso de la infección de la malaria intraeritrocitaria está influenciada por las proporciones de normocitos y de los reticulocitosen la circulación, los animales contaminados con E.coccides o H. muris muestran una gran diversidad en los niveles de parasitemia entre un raton y otro. Revisiones críticas de muchas publicacionse recientes en quimioterápia y inmunidad en malaria murina sugieren que muchos resultados extraños son probablemente atribuibles al desconocimiento de los autores acerca de la presencia de estos contaminantes.

Tabla 1: Modelos experimentales de la malaria cerbral en monos y sus característics

Tabla 2: Especies de Plasmodium utilizadas como modelo para investigación en roedores

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Modelos de malaria cerebral murina El empleo de Plasmodium parásitos de roedores como modelo para el estudio de la malaria humana ofrece muchas ventajas frente a modelos similares, como el hecho de que estos animales son baratos y fáciles de mantener, poseen un sistema inmune bien caracterizado, además del hecho de que una gran cantidad de estudios no son eticamente admisibles de realizar en seres humanos, o factibles en primates no humanos. Existen importantes diferencias entre los modelos de estudio de la malaria cerebral murina y la humana, siendo la mas importante el hecho de que P.falciparum , la especie que en humanos provoca la patología, no es infecciosa en ratones, con lo que en éstos se emplean otras especies de Plasmodium, como P. berghei o P.yoelii. La diferencia clave entre esos parásitos y P.falciparum es que su infección en ratones produce primariamente la adherencia de leucocitos al endotelio vascular, mientras que P.falciparum en humanos induce la adherencia de los globulos rojos infectados. Otras diferencias de estos modelos son los signos clínicos y neurológicos que los parásitos provocan en su huesped, lo cual ha sido parcialmente solventado mendiante el uso de combinaciones de especies específicas de Plasmodium (PbA) y de cepas específicas de ratón. Sin embargo, el 100% de los ratones que contraen la malaria cerebral mueren, mientras que la tasa de mortalidad en humanos ronda el 40%; se han desarrollado modelos en los que los que ratones de la cepa DBA son inoculados con PbA, desarrollando síntomas neurológicos como la parálisis transitoria de los miembros, pudiendo recuperarse de la enfermedad, sin embargo, esos ratones nunca desarrollan coma, el síntoma distintivo de la malaria cerebral humana.

Así, la imperfecta aproximación clínica, las diferencias en la infección de las especies de Plasmodium y las diferencias entre los sistemas inmunes de ratones y humanos conllevan que la extrapolación de los resultados de los resultados obtenidos mediante estudios en malaria murina deba hacerse con cautela. La enorme mejora de los estudios de la malaria cerebral murina se han centrado en comparaciones entre cepas de ratones resistentes (ejemplo BALB/c) y susceptibles (ejemplo CBA, C57BL) (tabla 3). La susceptibilidad a la malaria cerebral es altamente dependiente del fondo genético del raton. Los fenotipos susceptibles y resistentes se piensa que estan determinados por diferencias en la sensibilidad del endotelio microvastular al a la activación por TNF, el cual regula al alza la presenciad de receptores de membrana (p55 y p75) en las células del endotelio microvascular del cerebro en ratones suceptibles pero no en los resistentes. Interesantemente, los ratones (BALB/c x C57BL/6)F1 constitiyen una cepa de gran interés debido a que en los ratones infectados se desarrolla un secuestro generalizado de globulos rojos parasitados en la microvasculatura cerebral, además de exhibir tanto fenotipos resistentes como susceptibles dependiendo de la edad, siendo evidente el efecto de TNF y ICAM-1 en los cerebros de los ratones que desarrollan la malaria cerebral . Aunque éste modelo parece ideal para el estudio de la inmunopatogénesis de la malaria cerebral, el modelo PbA-C57BL/6 ha sido el modelo elegido en la mayoría de los laboratorios.

Imagen 2: Ejemplos de los efectos patológicos de la infección por Plasmodium berghei ANKA en modelos de roedorse

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Los ratones DBA/2 desarrollan una versión más suave de los síntomas neurológicos, pero mueren despues de una severa anémia. El parásito más empleado ha sido P.berghei (cepas ANKA [Pba] o K173 [Pbk]) debido a su habilidad para secuestrar globulos rojos parasitados en el interior de la microcirculación. Ratones susceptibles infectados con P.berghei desarrollan signos neurológicos y síntomas típicos de la malaria cerebral humana (como el estado de coma), y mueren despues de 8-10 dias después de la infección. El analisis histiopatológico revela taponamiento vascular, hemorragias petequiales y secuestro de leucocitos con un secuestro relativamente bajo de globulos rojos infectados. Cepas no susceptibles de ratones a la que se les suministra la misma dosis de infección no desarrollan los la malaria cerebral pero mueren despues de 21 dias debido a una severa anemia y hiperparasitemia. La anemia cerebral inducida por P.berguei esta limitada a cepas de raton (CBA, C57BL/6) que se saben que estan genéticamente predeterminadas a generar una intensa respuesta proinflamatoria, confirmando la asociación en humanos entre las citoquinas proinflamatorias y la malaria cerebral. Otras especies de Plasmodium empleadas para los modelos de malaria murina son P.chabaudi (subespecies chabaudi y adami), P.vinckei y P.yoelii (tabla 2). P. chabaudi chabaudi es un parásito particularmente apropiado para los estudios de la respuesta inmune del estado sanguineo de la malaria, dado que presenta algunas características muy similares a P. falciparum: la etapa sanguinea infecta a normocitos, muestra sincronía de su ciclo vital in vivo, provoca la retirada periférica de los glóbulos rojos infectados mas maduros, trofozoitos tardios y esquizoitos, y las en las cepas de ratones resistentes que se recuperan de una parasitemia aguda aparecen uno o mas reapariciones de la enfermedad por parásitos con una antigenicidad diferente al fenotipo de la infección inicial. Existen otras limitaciones que hacen que los modelos en roedores sean muy útiles frente a los modelos en humanos, siendo una de las razones obvias la enorme posibilidad de estudiar la enfermedad en distintas estadios de desarrollo. Sin embargo,como ya hemos apuntado, esos modelos no reproducen de forma precisa la mayoría de las características histiopatológicas de la malaria cerebral en humanos, como en secuestro de dentro del cerebro de globulos rojos infectados. Esta característica

ha sido recientemente observada en la ya nombrada (BALB/c x C57BL/6) F1, que muestran una susceptibilidad relacionada con la edad a la malaria cerebral. También es interesante anotar que algunas especies de Plasmodium que no secuestran globulos rojos infectados tambien dan lugar a malaria cerebral en algunas cepas, como por ejemplo, la cepa letal P.yoelii 17XL induce la enfermedad en ratones Swiss y BALB/c. En el caso de la malaria cerebral inducida en ratones BALB/c por P.yoelii 17XL esta caracterizada por convulsiones, ataxia y coma, y acompañada por una alta parasitemia. Sin embargo, la obstrucción microvascular parece ocurrir en ausencia de inflamación en el cerebro, siendo útil en el estudio del fenómeno de citoadherencia. Así, existen muchas similitudes entre la malaria cerebral humana y la murina con especial atención a las lesiones patológicas (secuestración, hemorragias e infarto, y síntomas clínicos), ataxia y coma. Sin embargo, en la malaria murina el secuestro de los globulos rojos infectados tiende a ocurrir en ausencia de las protusiones en la superficie, que son evidentes en los globulos rojos infectados humanos. Knockout de genes en la investación de la malaria La primera investigación de knockout de genes en la malaria cerebral murina mostro que ratones defectuosos en TNF/LTA (linfotoxina A, un miembro relacionado de la familia TNF, que existe como un homodímero soluble y como un heterodímero LTA/LTB asociado a la membrana, y permite la unión de los receptores TNF) infectados con P. berghei eran completamente resistentes a la patología letal. Debido a la estrategia del doble knockout, la resistencia no podia ser atribuida especificamente a uno de los dos genes ausentes. Poco después el rol de los receptores TNF en la malaria cerebral de raton fué estudiado, y una significante regulación al alza del receptor TNF-2 (TNFR2), pero no de TNFR1, fue encontrado en ratones susceptibles. Los mismos estudios examinaron el desarrollo de la malaria cerebral en ratores deficientes en TNFR2 y TNFR1, usando la misma cepa de ratoes y parásitos que en los estudios con TNF/LTA, y demostraron que los ratones que carecian de TNFR2, pero no TNFR1, estaban protegidos contra la malaria cerebral.

Tabla 1: Modelos experimentales de la malaria cerbral en monos y sus característics

Tabla 3: Modelos experimentales de la malaria cerebral murina y las características de varias combinaciones raton-parásito

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Curiosamente, la TNF de membrana, pero lo la soluble, y su intracción con TNRF2 era crucial para la regulación al alza mediada por TNF , de las moleculas de adhesión en las células del endotelio microvascular. Un estudio relevante en ratones deficientes en TNF o LTA mostró que LTA, y no TNF, era el principal mediador en la malaria cerebral en ratones. Este descubrimiento llamó la atención de los investigadores y llevó sugerir un rol crítico para LTA en el control de la malaria letal en los humanos. Un estudio reciente de ratones deficientes en TNF infectados con P.chabaudi apoya el papel de TNF en el control de la parasitemia. Los ratones deficientes mostraton los mayores niveles de parasitemia, indicando que la producción de TNF puede controlar la proliferación de el parasito en el torrente sanguineo, como habia sido sugerido previamente in analisis genéticos en humanos. Apesar de todo, teniendo en cuenta la naturaleza de los parasitos de humanos y de ratones, la comparación de la asociación de TNF con el control de la parasitemia debe ser analizado en mas profundidad. Así, los estudios de knockout de genes en ratons puede ser usado en analisis comparativos con los datos en humanos, y sugiren nuevas estrategias para entender los tratamientos de la malaria, permitiendo confirmar o sugerir el rol de mediadores potenciales de la malaria cuando los resultados son adecuadamente interpretados y apoyados con estudios adicionales en humanos y ratones. Los estudios de knockout ofrecen también la oportunidad de medir severas defectos en parámetros y niveles de expresión de proteinas que no pueden ser medidos en humanos. Ratones transgénicos en el estudio de la malaria La generación de animales transgénicos es otra de los métodos empleados para el estudio de los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de la malaria; un ejemplo es el empleo de ratones trasgénicos con elevados niveles del enzima cobre/zinc superoxido dismutasa (CuZnSOD), la cual cataliza la conversión del ión superóxido a peróxido de hidrógeno, como un modelo para analizar el efecto de las especies reactivas de oxigeno en el desarrollo de la enfermedad. Así, a partir de cepas TgHS 69 y TgHS se generaron ratones trasngénicos para el gen humano CunSOD, por microinyección de huevos en pronucleos masculinos de embriones tempranos de un fragmento lineal de DNA de 14,5 kb que contenía el gen completo de la cobre/zing superoxido dismutasa, incluyendo las secuencias reguladoras. Para el experimento se emplearon tanto machos como hembras, los cuales se mantuvieron en condiciones libres de patógenos. Todos los experimentos fueron llevados a cabo simultaneamente con Tg-CuZnSOD y con ratones con edades emparejadas a los individuos control. Ambas cepas estudiadas, TgHS 69 y TgHS 70, contenian de 2 a 4 copias del gen humano CuZnSOD en su genoma y expresaban el transgen como una enzima activa.

Los ratones fueron infectados por inyección de 106 eritrocitos parasitados con P.bergei anka, existiendo al menos 8 animales en cada grupo experimental, y los experimentos fueron repetidos dos veces con resultados similares.

En este estudio se demostró que las dos lineas distintas de ratonse Tg-CuZnSOD eran más vulnerables a la infección por Plasmodium que los individuos control . Aunque la tasa de mortalidad de Tg-CuZnSOD era significativamente mayor que en los ratones control, los niveles de parasatemia observados eran similares, y de acuerdo con esto, el desarrollo de Plasmodium en ratones transgénicos parasitados era inhibido por el extress oxidativo en la misma medida qu los ratonres control infectados, lo cual indica que la mayor vulnerabilidad de los ratones trasngénicos a la infección no era debida a un desarrollo acelerado de la invasión parasitaria, sino a un incremento de la sensibilidad del husped a la infección, debido a diversos factores, dado que los elevados niveles de SOD pueden afectar a la homeostasis del cobre y del zinc, que pueden resultar en la alteración de varios enzimas que utilizan esos metales como cofactores. Otro ejemplo del empleo de animales transgénicos para el estudio de la malaria lo encontramos en un nuevo modelo de diseñado por el National Institute for Medical Research de Londres, basado en la modificación genética del parásito de rodedores Plasmodium berguei para MSP119 (el fragmento de 19kDa de la proteína 1 expresada en la superficie de los merozoitos de P.falciparum) . Este parásito transgénico fué inyectado dentro de un raton también habia sido modificado geneticamente para expresar receptores de anticuerpos humanos FcγRI . Los investigadores también crearon un anticuerpo humano específico para P.falciparum, generados a partir de sangre de adultos de Gambia con inmunidad natural para la malaria. Cuando los investigadores injectaron los anticuerpos en el raton transgenicos, éstos se unian específicamente a la proteina de P. falciparum del parásito del roedor, así como a los receptores de antucuperpos humanos de las células del raton, pudiendose comprobar que los ratones transgénicos eran capaces de destruir y eliminar al parásito, mientras que en el grupo control los parásitos crecian sin impedimentos. Los resultados obtenidos permitieron poner de manifiesto la importancia de la eliminación mediada por FcγRI de los parásitos opsonizados por IgG1 específica para MSP119 .

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Contribución de los modelos animáles a la compresión de la histiopatogénesis de la malaria

Estudios similares han permitido estudiar la potencial importancia de antigenos como AMA-1 (apical membrane antigen-1), EBA-175 (erythrocytebinding antigen 175), y PfEMP1 (Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1). Vacunas de DNA en modelos animales Las vacunas de ADN consisten en un plásmido bacteriano diseñado para expresar un gen (o genes) de interés que codifiquen, por ejemplo, para una proteína inmunogénica de un patógeno determinado, contra la cual se desea inducir una respuesta inmune protectora en el individuo vacunado. Las secuencias de interés se insertan en el vector plasmídico que vehiculizará la introducción de la información genética de interés al interior de las células del hospedador, de manera que se logre su expresión, procesamiento y presentación al sistema inmune, en lo que sería una imitación de lo que ocurre durante la infección con el patógeno completo. Los componentes básicos de un vector que garantizan la óptima expresión en células eucarióticas, pero no la multiplicación del plásmido en el hospedero son: origen de replicación procariótico para la amplificación y propagación del plásmido en bacteria; gen de resistencia a antibióticos (generalmente kanamicina o ampicillina), como marcador de selección de las células bacterianas que portan el plásmido; promotor eucariótico fuerte que garantice altos niveles de transcripción del gen de interés en la célula eucariota (se han empleado exitosamente promotores virales como el promotor inmediatamente temprano del citomegalovirus humano); sitio de múltiple clonaje inmediatamente después del promotor para insertar la secuencia de interés; secuencia de terminación de la transcripción y secuencia estabilizadora del ARN mensajero transcrito, dada por una cola de poliadenina derivada del virus simio 40 o del gen que codifica para la hormona de crecimiento bovina. La inmunización puede llevarse a cabo utilizando la inyección con aguja (parenteral) o por métodos biolísticos con pistola de genes. Este último método garantiza una mayor eficiencia, puesto que el ADN penetra al interior celular, a diferencia de la inyección donde queda en el medio intersticial y por tanto expuesto a la acción de nucleasas. Debido a ello se requieren dosis hasta 100 veces menores cuando se inmuniza con pistola de genes . Además se ha empleado la microencapsulación del ADN, lo cual estimula la respuesta inmune tanto celular como humoral En 1994 se publicó el primer trabajo demostrando que la inmunización en ratones con DNA plasmidico podía proteger contra un patógeno parásito complejo. En dicha investigación los investigadores inmunizaron un razon con un plasmido de DNA que codificaba un antigeno de Plasmodium yoelii perteneciente a una etapa pre-eritrocítica, PyCSP, lo cual inducía a los linfocitos T citotóxicos CD8+ antígeno-específicos (CTL) y la respuesta de anticuerpos, conferiendo protección contra los esporozoitos. 9

Además también se vió que los niveles de la respuesta de CD8+ CTL y IFN-γ inducida por la inmunización por DNA era significativamente superior a los niveles inducidos por inmunización proactiva con esporozoitos irradiados. También se provó que la inmunización de los ratones con un plasmido de DNA que codificaba para otro antígeno, PyHEP17, podía tambien proteger contra el estado esporozoito; además la inmunización con una mezcla de plásmidos de DNA podía eludir la restricción genética de la protección observada tras la inmunización con cada vacuna. Todos estos datos proporcionaron un soporte experimental para el desarrollo de una vacuna multivalente contra la malaria, y la base para el enfoque basado en el DNA para el desarrollo de una vacuna antimalárica. Posteriormente, se estableció la inmunogenicidad para cuatro vacunas diferentes de DNA para cuatro estadios pre-eritrocíticos de distintas especies de Plasmodium en ratones y en monos rhesus , solas y en combinación, observando que no existia un efecto importante de la mezcla de vacunas, ni en la inducción de las respuestas de CTL, ni en la producción de anticuerpos. Estos datos proporcionaron las bases para la transición de una serie de ensayos clínicos en humanos. Las diferncias interespecificas en el uso de los codones son el principal obstaculo para el desarrollo de vacunas de DNA, lo que requiere modificación de la secuencia de DNA de la vacuna de para que la información sea traducida de forma correcta en los mamíferos (optimización de codones). Ventajas y limitaciones de los modelos en roedores La principal ventaja de la malaria en roedores esta relacionada con los paralelismos de sus ciclos de vida con los de las especies de Plasmodium que afectan a humanos, así como consideraciones prácticas como el coste y la facil manipulación. Así, los ciclos de ciclos de vida de todas las especies que afectan a roedores es esencialmente el mismo, tanto en la duración como en las diferentes etapas, con P. falciparum y P.malarie, pero difiere de P.vivax y P.ovale en la ausencia de un estado hipnozoito. La identificación de nuevos antimaláricos efectivos contra P.falciparum resistente a farmacos múltiples es uno de los objetivos principales, y la disponibilidad de diferentes cepas fármaco-resistentes derivadas de P.berguei , P. yoelii y P.chabaudi es una marcada ventaja de estos modelos. Además , la facilidad o dificultad para desarrollar líneas resistentes a nuevos compuestos se ha demostrado como una valioso instrumento para el pronóstico de la potencialidad de desarrollar resistencia a los fármacos en los parásitos que afectan a la especie humana. La facilidad para mantener y manejar los ratones es otra clara ventaja respecto a otros huéspedes vertebrados. Los parásitos malaricos de aves, los cuales tienen un ciclo de vida diferente, han sido ya abandonados debido a estas y otras razones.

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Los modelos en roedores tienen severas desventajas también, particularmente relacionadas con el metabolismo de los fármacos. Un ejemplo clásico es el proguanil, que es rápidamente ciclado en el higado a una triazina activa, el cicloguanil. A diferencia de lo que ocurre en humanos, la vida media del suero del cicloguanil en el raton es mucho mayor que la del proguanil, mientras que en humanos en cicloguanil es rápidamente excretado. Un segundo ejemplo que muestra la situación contraria es la mefloquina, que tiene una prolongada vida media biológica en los humanos, mientras que en los ratones la duración de su actividad es corta. Otra desventaja adicional es que la respuesta a fármacos de varias especies de roedores a ciertos tipos de antimaláricos puede ser diferente. Un ejemplo son los queladores de hierro y los inhibidores de síntesis de fosfolípidos. Todo ello puede requerir el empleo de más de una especie de Plasmodium que afecte a roedores a la hora de realizar un screening.

Transfección de parásitos como modelo de estudio
La transfección estable de parásitos permite el análisis funcional de genes y ofrece posibilidades para la generación de parásitos atenuados através de manipulaciones especificas del genoma por expresión de transgenes, knockout o modificación de genes in situ. Promotores y marcadors de selección La selección de parásitos P.berguei y P.knowlesi recombinantes esta basada en la introducción

del gen dihidrofolato reductasa timidilato sintasa (DHFR/TSR ) procedente de P. berghei o Toxoplasma gondii con mutaciones puntuales ques confiere resistencia al antimalárico pirimetamina (pyr). El gen DHFR/TSR de T.gondii es preferido generalmente por reducir la posibilidad de recombinación no deseada con el gen DHFR/TS endógeno, y porque confiere resistencia a mayores niveles de resistencia a pyr. La expresión del gen marcador seleccionable en asexual P.berghei puede ser controlado por el 5'( delecciones de la región del promotor de 3.5 y 2.2 kb ) y en 3' ( delecciones progresivas de 1.0 y 0.55 kb en 3') UTR del gen DHFR/TS de P.berghei y por una región truncada (0.6 kb) del promotor de DHFR/TS de P. chabaudi. Además, una región promotora truncada de 0.5 kb de P.berghei del antigeno de superfície Pbs21 del estado sexual al que le falta el control estadoespecífico puede también ser incorporado dentro de construcciones para la transfección de las etapas asexuales de P. berghei. Una larga región del promotor (1.4 kb) sexo y estadio específica para Pbs21 ( equivalente al gen Pgs28) es también disponible, facilitando la expresión específica del transgén en gametocitos femenitos. Por otro lado, una región de 1.5 kb del gen AMA-1 de P.berghei puede ser usado también para la expresión directa en el último estado de esquizogonia. Para P. knowlesi, las secuencias útiles en los experimentos de transfección son enteramente heterólogas ( y por lo tanto no deberian recombinar fálsamente en el genoma del parásito), y incluye las regions regulatorias de la proteina rica en histidina (hrp) y el DHFR/TS UTRs de P. berghei descrito anteriormente.

Imagen 3: Vectorse de expresión para la transfección estable de Plasmodium berghei y Plasmodium knowlesi

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Vectores para la transfección Una serie de nuevos vectores ha sido desarrollado para P.berghei y P.knowlesi. Estos vectores permiten la expresión génica mediante las secuencias reguladoras descritas en el apartado anterior y se ensamblan en una estructura de cassette para que cada uno de los componentes puedan ser reemplazados fácilmente por secuencias de prueba. Pueden ser de dos tipos: vectores para la selección (pS vectors) o vectores para la selección y la expresión (pSE vectors) de una segundo marco abierto de lectura (ORF). El vector pS contine un gen marcador seleccionable flanqueado por diferentes elementos de control y son útiles para probar supuestos marcadores de selección y genes reporteros, para diseccionar secuencias reguladoras y para integrar construcciones o vectores de reemplazamiento para manipulación genética. Esos vectores ha sido usados para la integración directa dentro del genoma de P.berghei. Además de el cassete de marcador de selección , el vector pSE contiene elementos que permiten la expresión o sobreexpresión constitutiva de un segundo ORF. Los parásitos transformados con la construcción circular pueden mantener hasta 20 copias del vector de replicación episomal en el núcleo y transcribir el gen marcador en niveles elevados. Por contra, cuando un vector se ha integrado dentro del genoma de P.berguei , el marcador de selección es transcrito en patrones etapa-específicos de forma similar a la copia del gen de los parásitos salvages. Algunos de esas construcciones pSE serán útiles para la construcción de bibliotecas de expresión de Plasmodium. Recientemente, el DHFR/TS ORF de T.gondii ha sido mutagenizado para eliminar los sitios de restricción EcoRI y KpnI para facilitar la clonación y la manipulación. Debido a que el vector pS pD B.DTm.DB permite la transfección estable tanto de P.berghei como de P.knowlesi y el vector pDT.Tg23 permite la transfección estable de P. falciparum y P.knowlesi, el primer vector transbordador entre diferentes especies de Plasmodium es ahora posible. El valor de estos vectores en la investigación de la malaria es considerable, permitiendo comparaciones de la biología de componentes genéticos idénticos en diferents fondos genéticos de parásitos y huespedes.

entre si, y ayudando a decidir quien era admitido en el proyecto y a quien se le podia otorgar la libertad condicional anticipada como resultado de su participación. La idea fué propuesta inicialmente por Michel Foucault, cuya idea de un “transparente” y sutil estilo de castigar llevó al arquitecto Jeremy Benthams a diseñar un estilo de prisión en la cual las celdas se disponian alrededor de una torre de vigilancia.

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Prisioneros como modelo de estudio
En un proyecto de investigación militar iniciado durante la segunda guerra mundial, presos de la penitenciaría Stateville en Illinois fueron infectados con malaria y tratados con fármacos experimentales que en muchas ocasiones provocaron graves efectos adversos. Ellos se convirtieron en reservorios de la enfermedad y proporcionaron un aporte alimenticio para el cultivo de mosquitos, actuando como secretarios y técnicos, recopilando datos entre ellos, contando las picaduras de mosquitos, administrandos los fármacos 11

J.

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