MATERIALES

&
METODOS
FXYD3 Protein Involved in Tumor Cell Proliferation Is Overproduced in
Human Breast Cancer Tissues
Inmunohistoquímica
Las muestras de tejidos humanos se fijaron en una solución de
formaldehído, basada en la fijación durante la noche a 4 ° C, incluidos
en parafina y cortada en secciones gruesas m-4-m.
Rebanados, Deparafinados y rehidratados fueron sometidos a un
antígeno recuperación hirviendo durante 45 minutos en el
Immunosaver (Nisshin EM, Tokio, Japón), seguido de un tratamiento
con H2O2 al 3% en metanol durante 20 minutos a temperatura
ambiente. Las láminas fueron lavadas en solución salina tamponada
con fosfato (PBS), y luego se incubaron con el anticuerpo monoclonal
anti-FXYD3a/3b anticuerpos durante la noche a 4 ° C. Las láminas
fueron lavadas en PBS, y luego se incubaron con un conjugado con
peroxidasa anti-IgG de ratón (Nichirei Bioscience, Tokio, Japón)
durante 30 min a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, la
unión fue detectada por diaminobencidina (DAB) solución (Nichirei
Bioscience, Tokio, Japón). Las secciones de tejido fueron contrastados
con hematoxilina.
Inmunohistoquímica
El cDNA de la clonación humana FXYD3a (NM_005971) y FXYD3b
(NM_021910) fueron preparados a partir cDNA de estomago humano
de la biblioteca (Clontech Takara Bio, Otsu, Japón) por PCR con los
cebadores, que son 5-TGAACCACACAGGCCAGCG- 3 para FXYD3a y
5-CTCTCAGCCCAGCGAGATG-3 para la cartilla FXYD3b y para
revertir con
5-CTTGCGAGAGGTGAGATGAGG-3 tanto para FXYD3a y FXYD3b,
respectivamente. El cDNA fue clonado en pCRscript SK (?) vector
(Stratagene, Tokio, Japón), y el secuenciado de ADN fue verificado
por el método de terminación didesoxi con el secuenciador de ADN
ABI 3100 (Applied Biosystems, Tokio, Japón).
Cada cDNA fue clonado en pcDNA3.1 (?) Y pcDNA3.1-mycHisB
vectores, respectivamente.
Transfección y construcción de líneas
celulares estables
Las células HEK-293 fueron transfectadas con el cDNA
pcDNA3.1(?)-FXYD3a elaborado usando un reactivo de
transfección (QIAGEN, Tokio, Japón), y líneas celulares estables
seleccionadas con presencia de 0,9 mg / ml de Geneticina.
Las colonias individuales aisladas, ampliadas y mantenidas en
presencia de 0,5 mg / ml de Geneticina.
La clonación se llevó a cabo por dilución limitada en
microplacas de 96 pozos. Para las células transfectadas
con la pcDNA3.1 (?)-cDNA humano FXYD3a construido,
la expresión de FXYD3 se verificó principalmente por
RT-PCR.
Preparación del RNA y PCR cuantitativas de
RT-PCR
El RNA total de muestras de tejidos humanos normales se obtuvieron de BD Biosciences
(Tokio, Japón) como la Prima Humanos ARN total (vejiga, cerebro, colon, corazón, hígado,
pulmón, glándula mamaria, páncreas, próstata, músculo esquelético, intestino delgado,
bazo, estómago, útero).

El total de muestras de ARN de las líneas de células cultivadas en placas de 60 mm se

prepararon utilizando un kit de RNeasy Mini (QIAGEN, Tokio, Japón) siguiendo las
instrucciones del fabricante.

En el proceso de preparación, el ARN las muestras fueron tratadas con DNasa libre de RNasa
para reducir al mínimo la contaminacion con ADN genómico. La muestra de ARN total
fueron inversamente
transcrito utilizando un oligo d (T) 6 primer para preparar algunos cDNA con un kit de
Omniscript RT (QIAGEN, Tokio, Japón).

Las muestras de DNA fueron utilizadas como plantillas para cuantitativos

RT-PCR.
Preparación del RNA y PCR cuantitativas de
RT-PCR
El RT-PCR cuantitativo para FXYD3a humano y gliceroaldehido 3-fosfato
deshidrogenasa (G3PDH) se llevó a cabo utilizando el TaqMan Universal PCR Master
Mix, y los siguientes cebadores específicos de genes y sondas, usados por la Secuencia
del sistema de detección ABI Prism 7000, después de las instrucciones del fabricante
(Applied Biosystems, Tokio, Japón).

Para FXYD3a humano, de avance y reversa, los primers fueron de 5

AGGTTGGCGGGCTCATC-3 y el 5 CATTTGCATTTTGCACTCATGAC-3,
respectivamente, y la sonda fue de 5-FAM-TTCTGTGCGCCATGGGCATCAT-TAMRA 3.

Para G3PDH humanos, las cartillas de avance y retroceso son 5-

AAGGACTCATGACCACAGTCCAT-3 y el 5-CCATCACGCCACAGTTTCC-3,
respectivamente, y la sonda es
5-FAM CCATCACTGCCACCCAGAAGACTGTGTAMRA-3.
Preparación del RNA y PCR cuantitativas de
RT-PCR
El RT-PCR cuantitativo para FXYD3b humano se realizó a través de CYBR
Premix Ex Taq (Takara Bio, Otsu, Japón) y los siguientes cebadores
específicos de genes.
El de avance y retroceso primers fueron 5 -TCAGCTCTCCCCAACAGGTG-3 y 5-
AAATTGAACAAAGAGACCCTCTTGC-3, respectivamente.
Para cuantificar el número de copias de FXYD3a y mRNAs 3b, se conocen la
concentración de pcDNA3. 1 ()-FXYD3a y pcDNA3.1 ()-FXYD3b elaborados
se utilizaron para la preparación de las curvas de calibración.

La expresión de los niveles de FXYD3a y 3bmARN se normalizaron

para el nivel de expresión de G3PDH, y representado como numero de copia
copia/G3PDH. Amplificados los productos del PCR para FXYD3a, 3b,
y G3PDH fueron verificados mediante agarosa o gel de poliacrilamida en
electroforesis.
La transfección de siRNA
Un siRNA tanto para FXYD3a y 3b (SiRNA1; 5
CGCCAATGACCTAGAAGATAA-3) y el control no silenciador siRNA (5
AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3) fueron adquiridos de QIAGEN
(Tokio, Japón).

Un siRNA para FXYD3b (siRNA2; 5ATGAGTGAGTGGAGGAGCTTT-3)

se adquirió de NIPPON EGT (Toyama, Japón). Las células fueron
transfectadas con el Lipofectamine 2000 reactivo (Invitrogen, Tokio,
Japón).
Proliferación Celular
La proliferación celular se evaluó por ensayo MTT
como se describe en el manual.
Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos a
una densidad de 2 103 células / pocillo en 100 mL
de medio completo. (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-
difenil bromuro de tetrazolio) (MTT) se añadió a una
concentración final de 0,25 mg / ml. Después de 4 h de
incubación, los productos de coloración intensa fueron
solubilizadas con dimetilsulfóxido (DMSO), y la
densidad óptica se midió a 570 nm.
Preparación de la membrana
Las fracciones del crudo de la membrana de las líneas de células cancerosas
humanas se prepararon según la bibliografia.
Las células cultivadas en un plato de 100 mm se lavaron con PBS, y se
incubaron con 2 ml de tampón de baja en sal iónica compuesta 0,5 mM de
MgCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 a 0 ° C durante 10 min. Después de la adición
de fluoruro fenilmetilsulfonilo 1mM y 0,09 unidades / ml de aprotinina, las
células fueron homogeneizadas con un homogeneizador Dounce,
homogeneizado y se diluyó con el un volumen igual de una solución compuesta
de 500 mm de sacarosa y 10 mM Tris-HCl, pH 7,4. El homogeneizado se
centrifugó a 800? g durante 10 minutos para precipitar una fracción que
contiene núcleos. El sobrenadante se centrifuga a 10.000? G durante 30
minutos para precipitar una fracción que contiene mitocondrias y los
lisosomas. El sobrenadante se centrifuga a más 100.000? G durante 90 minutos
para precipitar una fracción microsomal. El sedimento se resuspendió en una
solución compuesta por sacarosa de 250 mm y 5 mm de Tris-HCl, pH 7,4.
Analisis Western Blot
La prieba de Sodio dodecil sulfato (SDS) - electroforesis en gel de poliacrilamida se realizó
como describe la bibliografia.
Las muestras de la proteína se incubaron en un tampón de muestra compuesta de 2% SDS,
10% de glicerol, 2% b - meracaptoethanol, 10 mM Tris-HCl, pH 6,8 a 100 ° C durante 3
minutos, y se separaron en gel de poliacrilamida-SDS. Las proteínas se transfirieron a una
membrana de nitrocelulosa, Hybond ECL (Bioscience GE Healthcare, Tokio, Japón). Las
membranas se bloquearon con el Bloque 4% de la solución As, seguido mediante la
incubación con el anticuerpo anti-FXYD3a/3b o anticuerpo anti-FXYD3b. Después de la
incubación con un rábano anticuerpo anti-ratón conjugada con peroxidasa, las bandas se
visualizados con el kit de ECLplus (GE Healthcare Bioscience, Tokio, Japón) y escaneado
con un analizador de imágenes luminosas LAS-1000plus (Fuji Film Tokio, Japón).
NuPAGE se realizó como se describe elsewhere.15) Proteínas muestras se disuelve en una
solución tampón de muestra NuPAGE SUD (Invitrogen, Tokio, Japón) y se incuba a 70 ° C
durante 10 min después de la adición de 2% b-mercaptoetanol. Las muestras fueron
sometidas de 4 a 12% en gel de gradiente SDS-PAGE (NuPAGE Bis- Tris gel), y en
electrotransferred polyvinylidenedifluoride (PVDF) membranas (Invitrogen, Tokio, Japón).
Posteriormente, la membrana se incubó con los anticuerpos.
Immunofluorescencia
Las células fueron fijadas durante 7 minutos en frío metanol
(-20 ° C) y se lavó tres veces con PBS que contenía 0,1 mM CaCl2 y MgCl2 1 mM
(PBS). Las células fueron permeabilizadas en un tampón de permeabilización
del 0,3% Triton X- 100 y 0,1% BSA en PBS+ durante 15 minutos a temperatura
ambiente. La proteína de unión no específica fue bloqueada por pre-
incubación en una solución de suero de caballo tampón de dilución (16%
caballo suero, 0,3% Triton X-100, de sodio al 0,9% de NaCl y 20 mM solución
tampón fosfato (pH 7.4) durante 1 h. Todo anticuerpo incubación se llevó afuera
utilizando el suero de caballo tampón de dilución en solución. Las células se
incubaron durante la noche a temperatura ambiente con el anticuerpo anti-
FXYD3a/3b o el anti-Na+, K+ - ATPasa santicuerpo subunidad-alfa (Santa
Cruz, CA, EE.UU.), seguido de tres lavados con el tampón de permeabilización.
Las muestras se incubaron con el conjugado con Alexa 633- anti-ratón de
inmunoglobulina G (IgG) o anticuerpos secundarios Texas Red conjugado anti-
conejo IgG secundario 1 hora a temperatura ambiente a una dilución de 1: 200.
Después de lavar con PBS + tres veces, la imagen de inmunofluorescencia se
visualizado en un microscopio confocal de barrido láser FV1000 (Olympus,
Tokio, Japón).