PRÁCTICA 1

EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO DE ALIMENTOS

ANTECEDENTES
El muestreo de alimentos destinado al análisis microbiológico es la operación que
consiste en separar un número determinado de muestras de un lote, remesa, partida,
etc, con el fin de obtener unos resultados analíticos fiables. Se pretende con ello
obtener una muestra representativa del total.

El número de muestras destinadas a un análisis microbiológico está en relación con la

precisión que se desee obtener en los resultados. Este número se suele fijar cuando se
dispone de muchas unidades, sobre todo en forma de lote. Se suele sugerir que el
número de muestras corresponda con la raíz cuadrada del número total de unidades
constituyentes del lote. También que, teniendo en cuenta el volumen del lote, se tome 1
por 100 del total cuando el lote es grande y el 10 por 100 cuando el lote es pequeño.
Estos sistemas citados son aplicables a lotes procedentes de industrias cuyo control se
desconoce. Si se trata de productos sometidos a un control regular, es suficiente
analizar 5-10 muestras de cada lote.

La finalidad del muestreo en microbiología de alimentos es, principalmente, obtener

una muestra representativa del alimento para su análisis inmediato y conseguir
resultados fiables sobre su estado higiénico sanitario, es necesario que el producto, en
el momento de su análisis, reúna las mismas condiciones microbiológicas que tenía al
ser muestreado. Por esta razón, son necesarias unas pautas para conseguir la muestra
idónea; el Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-109-SSA1-1994, indica los
procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su
análisis microbiológico.

Si existe alguna razón para sospechar que un alimento ha sido el causante de una
enfermedad o se ha descompuesto, se debe usar el producto original o una dilución del
mismo y se prepara un frotis para un examen microscópico directo. La reacción de

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Práctica 1 Examen microscópico directo de alimentos

Gram y la morfología celular de la bacteria en el frotis puede indicar la necesidad de

otro tipo de evaluaciones. Un examen microscópico debe realizarse incluso si el
alimento sufrió tratamiento térmico y los microorganismos podrían ya no estar viables.
Un gran número de cocos Gram positivos en el frotis podría indicar la presencia de
enterotoxina estafilococia, la cual no se destruye por los tratamientos térmicos que
destruyen las cepas de Staphylococcus aureus enterotoxigénico.

Un gran número de bacilos Gram positivos esporulados en un alimento congelado

podría indicar la presencia de Clostridium perfringens, un organismo que es sensible a
bajas temperaturas. Otros bacilos Gram positivos esporulados como Clostridium
botulinum o Bacillus cereus también podrían estar presentes en el alimento. Cuando el
examen microscópico del alimento en cuestión revele la presencia de numerosos
bacilos Gram negativos, considere los síntomas y periodos de incubación reportados
para la enfermedad bajo investigación y seleccione el método de examen específico
para el aislamiento de uno o más de los siguientes géneros: Salmonella, Shigella,
Escherichia, Yersinia, Vibrio o Campylobacter.

OBJETIVO GENERAL

El alumno observará microscópicamente muestras de alimentos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Realizar la toma, el transporte y el manejo de muestras de alimentos para su

análisis microbiológico de acuerdo al Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM
-109-SSA1-1994.

• Realizar diluciones de los alimentos a analizar de acuerdo a la Norma Oficial

Mexicana NOM-110-SSA1-1994.

• Preparar un frotis y la tinción de Gram correspondiente, para cada muestra

diluida de alimento. Observar microscópicamente los frotis teñidos de las
muestras de alimento.

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Práctica 1 Examen microscópico directo de alimentos

METODOLOGÍA
Para la realización de la presente práctica se requieren los siguientes materiales y
equipos:

Material 1 Mechero.
1 Probeta de vidrio de 100 ml. 1 Puente de vidrio para tinción de Gram.
1 Vaso de precipitados de 600 ml. 4 Matraces Erlenmeyer de 250 ml.
10 Portaobjetos. 2 Espátula.
2 Asas microbiológicas. 2 Pipetas de 10 ml.
2 Cajas petri 1 Propipeta
Equipo 1 Piseta
Balanza granataria. Reactivos y Medios de cultivo
Microscopio óptico. Peptona
Olla de presión. Cloruro de sodio
Material biológico Colorantes para la tinción de Gram.
Leche pasteurizada, carne molida. Etanol al 95%.
Atún enlatado, agua de frutas. Alcohol-cetona
Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1. Manejo de alimentos

1.1 Antes de realizar la sesión experimental, consultar el Proyecto de Norma Oficial

Mexicana NOM -109-SSA1-1994, Bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y
transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

1.2 Realizar el proceso de toma, manejo y transporte de las muestras de carne molida, atún
enlatado, leche pasteurizada y agua de frutas, con base en la norma antes mencionada.

2. Preparación de diluciones (NORMA Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994).

2.1 Dilución de leche pasteurizada y agua de frutas. Medir en condiciones asépticas

10 ml del alimento líquido y diluir en 90 ml de agua peptonada estéril contenida en un
matraz Erlenmeyer de 250 ml. Homogeneizar agitando vigorosamente.

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Práctica 1 Examen microscópico directo de alimentos

2.2 Dilución de carne molida y atún enlatado. Pesar en condiciones asépticas

(utilizando una caja de Petri estéril) 10 g del alimento sólido y diluir en 90 ml de agua
peptonada estéril contenida en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Homogeneizar
agitando vigorosamente.

3. Preparación de los frotis

3.1 Lavar los portaobjetos con agua y jabón, enjuagar varias veces con etanol al
95%, ponerlos a secar y flamearlos 2 o 3 veces.

3.2 Esterilizar el asa a la flama del mechero, colocándola ligeramente inclinada

hasta que el extremo esté al rojo vivo y después de manera vertical, hasta lograr que
todo el alambre se ponga al rojo vivo, posteriormente flamear el vástago.

3.3 Etiquetar cada portaobjetos con el nombre de la muestra correspondiente,

utilizando una tira de masking tape.

3.4 Tomar por el extremo inferior al matraz Erlenmeyer con la dilución de la muestra
correspondiente; con la mano derecha (que sostiene el asa estéril) girar la torunda
hasta que salga el tapón, flamear la boca del matraz manteniéndola cerca de la flama
del mechero.

3.5 Introducir el asa en el matraz, apoyarla en la pared interna hasta que se enfríe,
proceder a tomar una asada del sobrenadante y sacarla del matraz.

3.6 Flamear la boca del matraz y taparlo.

3.7 Aplicar el asa al portaobjetos marcado y extender la muestra en la zona central.

3.8 Esterilizar el asa a la flama del mechero.

3.9 Dejar secar al aire el frotis y fijarlo a la flama, pasándolo 4 o 5 veces sobre ella.

4. Tinción de gram

4.1 Cubrir el frotis con cristal violeta y dejarlo actuar durante un minuto. Utilizando
una pinza de madera, mover suavemente el portaobjetos para favorecer el contacto del
colorante con las células. Al cabo de un minuto escurrir el exceso de colorante y lavar
con agua destilada.

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Práctica 1 Examen microscópico directo de alimentos

4.2 Cubrir la preparación con lugol de Gram y dejarlo actuar durante un minuto,
escurrir el exceso de reactivo y lavar.

4.3 Decolorar agregando alcohol-acetona (5 – 10 gotas) a la preparación, mientras

se sostiene ligeramente inclinada para que el decolorante resbale lentamente por ella.
Tan pronto como las gotas de esta solución ya no arrastren color, lavar con agua.

4.4 Cubrir la preparación con zafranina y dejarla actuar por un minuto. Escurrir el
exceso, lavar con agua y dejar secar al aire.

4.5 Observar cada frotis al microscopio con el objetivo para aceite de inmersión
(100X); registrando en la bitácora los tipos de microorganismos predominantes.

RESULTADOS

1. Describe paso a paso el procedimiento que seguiste para la toma, el transporte y el

manejo de cada alimento analizado en laboratorio, de acuerdo al Proyecto de Norma
Oficial Mexicana NOM -109-SSA1-1994; incluye la información de “identificación de la
mustra”.

2. Observaciones microscópicas. Esquematiza las observaciones efectuadas, dibujálas

en color y anota los datos importantes.

Fecha:
Muestra:
Tinción:
Aumento:
Descripción:

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es la tinción de Gram?

2. Describe paso a paso el procedimiento que seguirías para la toma, el transporte y

el manejo de fresas congeladas; de acuerdo al Proyecto de Norma Oficial Mexicana
NOM -109-SSA1-1994.

3. ¿Qué modificación realizarías al procedimiento de análisis, si en el frotis de la

muestra de carne molida no observaras microorganismos?