ALGAS CAPACES DE PRODUCIR BIODIESEL

Las algas están compuestas básicamente por proteínas,

carbohidratos, ácidos nucleicos y ácidos grasos. Los ácidos grasos
se encuentran en las membranas, en los productos de
almacenamiento, metabolitos, etc. El porcentaje de ácidos grasos
varía según la especie, aunque hay especies cuyos ácidos grasos
representan 40% de su peso seco. Estos son los ácidos grasos que
luego son convertidos en biodiésel. Para la producción de estos se
buscan algas que contengan un alto contenido en lípido y que sean
fácilmente cultivables.

los tipos de algas que tiene suficiente lipidos y que son facilmente
cultivables son las siguientes:

• Scenedesmus obliquus Scenedesmus quadricauda

• Chlamydomonas rheinhardii

• Chlorella vulgaris

• Chlorella pyrenoidosa

• Spirogyra sp.

• Dunaliella salina

• Euglena gracilis

• Prymnesium parvum

• Tetraselmis maculata

• Botryococcus braunii

las especies ma utilizadas son:

• Scenedesmus dimorphus – Esta es una de las preferidas por el

alto rendimiento de aceites para biodiésel, pero uno de los
problemas es que produce gruesos sedimentos si al cultivo no se
lo agita con frecuencia

• Dunaliella tertiolecta – Esta cepa produce cerca de 37 % de

aceites. Es una cepa que crece rápido lo que significa que tiene
una alta tasa de absorción de CO2.

• Bacilliarophyta (diatomea) – Es una de las favoritas del ASP. El

problema es que necesita silicona en el agua, mientras que las
Clorofita necesitan nitrógeno para crecer

• Chlorofita - Algas verdes tienden a producir almidón, en vez de

lípidos. Tienen tasas de crecimiento muy altas a 30 ºC con alta
intensidad de la luz agua de tipo en 55 mmho/cm.

Publicado por carmen fuentes en 10:51

g) Composicion de acidos grasos.

Muchos cultivos producen semillas oleaginosas cuya composicion en acidos

grasos no es la ideal para el uso al que se destinan. La aplicacion de
los metodos tradicionales de mejora, reforzados con la mutagenesis
quimica, ha permitido la obtencion de nuevas variedades con
alteraciones en la composicion de acidos grasos de la semilla, en
bastante especies. Son ejemplos destacables las nuevas variedades de
colza bajas en acido euricico y las reducciones en los niveles de acidos
grasos poli-insaturados en soja, girasol y lino (linaza). La mayor parte
de la variacion genetica en la composicion de acidos grasos en semilla
parece implicar la presencia de un alelo de un gen que rompe el
metabolismo normal de acidos grasos y conduce a la acumulacion de
productos intermedios en los lipidos de la semilla. Sin embargo, parece
probable que dadas las limitaciones geneticas de este abordaje, muchos
otros cambios deseables en la composicion de acidos grasos podrian
requerir la aplicacion directa de los metodos de ingenieria genetica.
Existen dificultades como por ejemplo las lagunas en el conocimiento de
la bioquimica y la regulacion del metabolismo de los lipidos (que se van
enmendando con los estudios exhaustivos en Arabidopsis thaliana ), y el
hecho de que muchas enzimas claves estan ligadas a membrana, por lo que
los intentos dirigidos a su solubilizacion y purificacion no han tenido
exito.

Se estan disen~ado varias estrategias encaminadas a modificar la

composicion en acidos grasos de semillas oleaginosas, basadas los
progresos en el conocimiento de la bioquimica y genetica de la sintesis
de los lipidos. A partir de los mutantes actualmente disponibles en
Arabidopsis se puede profundizar en el conocimiento de que genes,
entre los actualmente disponibles provenientes de E. coli y de
mamiferos, juegan un papel mas importante en el metabolismo de los
acidos grasos, de cara a su aislamiento, clonaje e incorporacion al
genoma de las plantas cultivadas. Aunque la sintesis de acilgliceridos
participa de rutas relativamente complejas, el conocimiento de su
bioquimica y, en particular, los analisis con mutantes pueden ser de
gran utilidad en el disen~o de alteraciones del metabolismo lipidico con
fines de mejora.

• 

TÉCNICAS BÁSICAS

1.- Recolección y almacenamiento de muestras.

2.- Extracción de ácidos nucleicos.

3.- Separación de aann mediante electroforesis en gel.

4.- Modificación enzimática de aann (generalmente tratamiento con endonucleasas de restricción)

5.- Inmovilización del aann mediante transferencia a soportes sólidos.

6.- Preparación de sondas marcadas.

7.- Hibridación de las sondas con aann inmovilizados.

8.- Otras técnicas: PCR, secuenciación, clonación de ADN.

• EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS

Las fuentes de ácidos nucleicos son variadas:

1.- ADN celular total (cromosómico), en bacterias, células, tejidos,…

2.- ADN plasmídico o extracromosómico.

3.- ADN de orgánulos: mitocondrias o cloroplastos. Primero se separa el orgánulo por centrifugación y
después extraer el ADN.

4.- ADN viral.

5.- ARN.

Para hacer la extracción del ADN celular total el primer paso es la lisis celular, tiene que ser suave para que el
ADN no se degrade. Se puede utilizar un detergente como el SDS, utilizando un alcali o hirviéndolo. Tenemos
un extracto que tiene el ADN y más compuestos.

Para separar el ADN del resto de los compuestos se hace una centrifugación concreta y tenemos un extracto
celular con ácidos nucleicos y también otros contaminantes. Después se hace un tratamiento enzimático con
proteasas que degradan algunas proteínas contaminantes.

El siguiente paso es la extracción del ácido nucleico por solubilización diferencial. Se basa en que los ácidos
nucleicos tienen propiedades diferentes a las de las proteínas. Tienen una carga negativa y son hidrofílicos.
Las proteínas son más hidrofóbicas, por eso añadimos al extracto un solvente orgánico, que suele ser el fenol,
mezclamos y en el fenol se quedan retenidas las proteínas porque son hidrofóbicas y los ácidos nucleicos se
quedan en la fase acuosa, que se queda arriba. Debajo está la fase fenólica mas densa, donde están las
proteínas y hay una interfase donde hay proteínas coaguladas.

Para la concentración de los ácidos nucleicos se añaden sales y etanol absoluto. El ADN precipita y forma una
maraña blanquecina. Con una varilla de vidrio se saca el ADN que tiene mucha afinidad por el vidrio. Se pone
en un tubo con agua y se vuelve a resuspender.

La extracción del ARN es prácticamente igual.

Una vez extraídos los ácidos nucleicos se hace la caracterización de estos. Nos fijamos en tres cosas:

1.- En su concentración.

2.- En su pureza.

3.- En su tamaño.

Para la medida de la concentración se mide la absorbancia a 260 nm. La absorbancia da idea de su

concentración. La relación es que a una absorbancia a 260 nm que sea igual a 1 le corresponde una cantidad
de ADN de cadena doble de 50 µg/ml. Si es ADN de cadena simple o ARN este valor varía.

Para la medida de la pureza se mide la absorbancia a 260 nm y a 280 nm, y se calcula el cociente entre las
dos. Para un valor entre 1,8 y 2 es una muestra pura o con pocos contaminantes. Para valores menores de
1,8 indica que la muestra está contaminada por proteínas. Y para valore mayores que 2 quiere decir que la
muestra está contaminada por ARN.

La absorbancia a 280 nm da una idea de las cantidades de proteínas que hay en la muestra. A una relación
de 1,5 le corresponde una contaminación de proteínas del 30%.

Para medir el tamaño, se mide con la electroforesis.

• ELECTROFORESIS EN GEL.
Las moléculas de ácidos nucleicos tienen carga negativa, y si se someten a un campo eléctrico se mueven del
polo negativo al positivo, y este movimiento depende de dos factores:

1.- La forma de la molécula.

2.- La relación carga/masa.

En solución todas las moléculas de ADN tienen la misma forma. La relación carga/masa también es
equivalente entre todas las moléculas. Se ponen moléculas diferentes en solución y se mueven todas igual y
no se pueden separar en tamaños.

Necesitamos un factor que nos permita que las moléculas se separen en función a su tamaño, o sea, una
matriz. Esta puede ser de Acrilamida o de Agarosa.

La acrilamida nos permite separar moléculas de ácidos nucleicos con pesos muy parecidos. La agarosa tiene
mayor resolución para moléculas más grandes.

En una matriz el ADN migra en función de su forma, su relación carga/masa y de su tamaño.

La matriz de agarosa está formada por polímeros de arabinosa. Un vez que se gelifica se van quedando
poros, y por esos poros es por donde migra el ADN. Las moléculas pequeñas se mueven más rápido que las
moléculas más grandes. Para poder ver el ADN hay que teñir el gel con un colorante intercalar, es una
sustancia que se mete entre las dos hebras de ácidos nucleicos (por eso son altamente cancerígenos). Si no
hay ácidos nucleicos no hay colorante. Estos colorantes se pueden excitar con luz ultravioleta y emiten
fluorescencia.

Para averiguar el tamaño de la molécula hay que utilizar un marcador de peso molecular, que son soluciones
de ADN lineal de cadena doble que tienen tamaño conocido.

Hay diferentes factores que afectan a la migración del ADN:

 Tamaño de la molécula; la relación que hay entre el tamaño y la migración no es lineal, la distancia es
inversamente proporcional al logaritmo del tamaño de la molécula (y se hace lineal). Se calcula la gráfica para
el marcador que hemos puesto en el gel con la muestra. Medimos la distancia que ha recorrido nuestra
muestra y en la gráfica extrapolamos. Todo esto teniendo en cuenta que el marcador y la molécula muestra
tienen que ser del mismo tipo, porque hay otros factores que afectan a la migración del ADN.

 Concentración de la agarosa; cuanto mayor es la concentración de la agarosa los huecos que quedan
para que pase el ADN es mucho menor. Si está muy concentrado, las moléculas muy pequeñas se pueden
mover más fácilmente que las grandes, de manera que nos permite mayor resolución en las moléculas más
pequeñas. Cuando la agarosa está muy diluida o si está muy concentrada no nos da una buena separación.
La agarosa muy concentrada es para separar fragmentos mas pequeños, si está menos concentrada separan
fragmentos mas grandes.

 Conformación del ADN; una molécula de ADN puede ser lineal, circular y circular enrollada. Estas tienen el
mismo tamaño y todas se deberían mover igual. En general se cumple que el ADN superenrrollado va mas
rápido que el ADN circular y este mas rápido que el lineal. Si la agarosa esta muy diluida puede ser que la
lineal sea más rápida que la circular.

 Presencia de colorantes intercalares; al meterse entre las hebras de ADN afectan a su movilidad en un gel
de agarosa. Normalmente primero se hace la electroforesis y después se añade el bromuro.

 Composición del tampón de electroforesis; hay dos tampones básicamente, el TAE y el TBE. El TBE tiene
mejor capacidad de tamponamiento, pero normalmente tiene más inconvenientes. El TAE tiene mejor
resolución en moléculas de peso molecular bajo, en relación al TBE que es mejor para moléculas de mayor
tamaño.
 Voltaje; si el voltaje es muy alto no se da tiempo a las moléculas a que se separen en función de su
tamaño. Para moléculas de alto peso molecular hace falta voltajes muy pequeños.

 Dirección del campo eléctrico; hay veces en las que conviene ir cambiando la dirección del campo eléctrico
y nos permite separar moléculas de alto peso molecular.

• APLICACIÓNES DE LA ELECTROFORESIS EN GEL.

1.- Aplicación analítica: para calcular el tamaño de ADN por comparación con un marcador de peso molecular
hay que correr el marcador junto con el ADN, se representa el tamaño en relación con la distancia recorrida
del marcador, y después se compara con las distancias. Si se representa el logaritmo del tamaño frente al
tiempo sale una recta.

2.- Averiguar la calidad de la muestra de ADN. Si está degradada, si está contaminada con ARN, como de
concentrada está, etc.

3.- Estudio de interacciones entre moléculas de ácidos nucleicos o entre ácidos nucleicos y proteínas. Si hay
interacción de la proteína con el ADN se pega a él y el ADN ya no migra igual, migrará mucho menos que las
moléculas que no están unidas a proteínas, es el análisis de retardo en gel de agarosa, que es para estudiar
este tipo de interacciones.

4.- Aislamiento de moléculas de tamaño determinado. Queremos separar de un plásmido un fragmento de

este que nos interesa, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina. Cortamos los fragmentos y lo
tenemos todo mezclado en un tubo de ensayo, hacemos electroforesis y cortamos el fragmento del gel que
nos interesa y hacemos una solución.