Prosiding Seminar Tantangan Penelitian Kimia

ISOLASI SENY A WA AKTIF ANTIBAKTERI DARI MENIRAN (PHYLLANTUS NIRURI L.)

Astri Balistika, Lenny Sutedja dan Herlina Agustina.

Pusat Penelitian Kimia -LIPI Bandung Jalan Cisitu Sangkuriang, Bandung 40135

ABSTRAK

Dalam rangka i_solasi senyawa aktif antibakteri, serbuk kering Phyllantus niruri L. (430 gram) diperkolasi dengan metanol selanjutnya difraksinasi dengan pelarut heksan, metilen klorida, etil asetat, dan butanol. Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak Phyllantus niruri L., terhadap bakteri B. subtilis (ATCC 6633), Siaureus (ATCC 6538), E. coli (ATCC 25922) dan P. aeruginosa dengan metode difusi agar menunjukkan ekstrak etil asetat memiliki aktivitas paling tinggi. Pemisahan ekstrak etil asetat dengan kromatografi kolom menghasilkan 11 fraksi. Fraksi ke-6 dimumikan dengan kolom kromatografi dan dikristalisasi kembaIi dengan kloroform-aseton, diperoleh kristaI kuning (F6-2 Pn) sebanyak 15 mg dengan titik leleh antara 201,3-202,1 Dc. Hasil uji fitokimia dan anaIisa spektroskopi (UV dan IR) menunjukkan bahwa F6-2 Pn adalah senyawa fenol aromatik yang mengandung gugus karbonil dan tersubstitusi metil. Senyawa ini rnemiliki konsentrasi hambat minimum terhadap S aureus, B. subtilis, E. coli dan P. aeruginosa berturut-turut pada kadar 769,63 ppm, 824,71 ppm, 815,99 ppm dan 948,86 ppm. Nilai banding terhadap ampisilin masing-masing sebesar 1,24.10-1 %, 3,37.10.3%,8,61.10-3 % dan 9,84.10-3 %.

ABSTRACT

In the framework of antibacterial compound isolation., 430 grams of the • powdered PhyJ/antus niruri L. was percolated with methanol. The extract was further fractionated with n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate and buthanol. Antibacterial activity against B. subtilis (ATCC 6633), S aureus (ATCC 6538), E. coli (ATCC 25922) and P. aeruginosa indicated that ethyl acetate extract was most

174

Prosiding Seminar Tantangan Penelitian Kimia

active compared to the other extracts. Fractionation of the ethyl acetate extract by column chromatography using silica gel as adsorbent and hexane-ethyl acetate as eluent produced II fraction. The most active fraction (fraction 6) was purified by column chromatography, followed by recrystallyzation with chloroform-acetone, producing pale yellow needle crystals (F6~2 Pn) with melting point 20 1,3~202, 1°C. Phytochemical, UV and IR. spectroscopic analysis indicated that F6~2 Pn was aromatik phenol compound, containing carbonyl group substituted with methyl. Its minimum inhibition concentration against S. aureus, B. subtilis, E. coli and P. aeruginosa was 769,63 ppm, 824,71 ppm, 815,99 ppm and 948,86 ppm respectively, and its activity compared to standard arnpiciline was 1,24.10-1 %, 3,37.10-3%,8,61.10'3 % and 9,84.10-3 % successively.

PENDAHULUAN

Indonesia merupakan salah satu negara yang kaya sumber daya alam terutarna tumbuh-tumbuhan yang banyak tersebar diseluruh kepulauan Indonesia. Sejak jaman dahulu masyarakat kita sudah terbiasa memanfaatkan tumbuhtumbuhan berkhasiat obat untuk pengobatan tradisional. Pengobatan tradisional pada umumnya adalah pengobatan menggunakan rarnuan dari tumbuh-tumbuhan yang berkhasiat atau diperkirakan berkhasiat sebagai obat, khasiat dan kegunaannya diketahui berdasarkan pengalaman turun-temurun, tetapi belum dibuktikan secara ilmiah.

Keadaan negara kita yang masih terpuruk pada saat ini mengakibatkan teIjadinya beberapa perubahan disetiap segi kehidupan. Rendahnya tingkat ekonomi dan sosial, pendidikan, kesehatan lingkungan serta kondisi nutrisi yang buruk memicu teIjangkitnya berbagai macam penyakit. Penyakit yang paling banyak ditemukan adalah penyakit infeksi. Penyakit infeksi adalah penyakit yang disebabkan oleh masuknya mikroorganisme patogen ke dalam tubuh, salah satunya adalah infeksi karena bakteri.

Penelusuran khasiat antibakteri tumbuhan merupakan salah satu pemecahan permasalahan obat atau bahan baku obat modem yang sangat mahal karena masih merupak~ produk impor, Penelusuran senyawa aktif antibakteri dalarn tumbuhan dilakukan untuk membuktikan khasiat dati tumbuhan yang diteliti, sebingga menaikkan nilai tambah dari tumbuhan tersebut sebagai obat penanggulangan infeksi dalam bentuk fitofarmaka.

175

Presiding Seminar Tantangan Penelitian Kimia

Salah satu tanaman yang mempunyai potensi sebagai antibakteri adalah Phyllantus niruri L. Yang dikenal dengan nama daerah meniran (Jawa) atau

I

memeniran (Sunda) tennasuk ke dalam famili Euphorbiaceae diperoleh dari hutan

Kalimantan Barat. Tanaman famili Euphorbiaceae banyak dilaporkan mengandung senyawa-senyawa bioaktif sebagai antibakteri, antioksidan dan antikanker. Heyne(4) telah melaporkan bahwa genus Phyllantus niruri L. banyak digunakan sebagai obat tradisional bahkan dalam suatu pustaka disebutkan tanaman ini telah tersedia dalam bentuk obat kanker hati yang dikenal dengan nama Chanca Piendra(5). Tumbuhan tema Phyllantus niruri L. dilaporkan banyak digunakan sebagai obat tradisional pada setiap bagiannya. Daunnya digunakan untuk mengobati ayan, malaria, sembelit, tekanan darah tinggi, sariawan dan gangguan haid. Akamya digunakan untuk mengobati nyeri perut dan sakit gigi. Seluruh bagian dari Phy/lantus niruri L. biasa digunakan untuk disuria, kencing nanah, rajasinga, nyeri ginjal, diare, demam,. tetanus, pembersih darah, antikonvulsan, kencing batu, dan albuminuria.

Berdasarkan informasi etlmomedisinal dan dalam rangka penelusuran senyawa aktif antibakteri dari tumbuhan hutan Indonesia, maka dilakukan isolasi senyawa aktif serta pengujian potensi antibakteri tanaman Phyllantus niruri L. terhadap bakteri kelompok gram positif dan gram negatif yaitu Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa.

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi nilai tambah bagi Phyllantus niruri L. dengan diperolehnya ekstrak atau senyawa aktif sehingga khasiat Phyllantus niruri L. sebagai antibakteri dapat dibuktikan secara ilmiah,

BAHAN DAN METODA

Bahan

Tanaman Phyllantus niruri L. (Euphorbiaceae) - meniran diperoleh dari hutan Kalimantan di daerah Tanjung Lokang desa Beringin Jaya, kecamatan Kedamin, Putu Sibau Kalimantan Barat, dan dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Bogor. Pelarut yang digunakan adalah pelarut organik yang didestilasi ulang,

176

Prosiding Seminar Tantangan Penelitian Kimia

Metoda

Ekstraksi dan Fraksinasi

Seluruh bagian sampel dikumpulkan dan dikeringkan di dalam oven tiup dengan suhu 45-50°C dan digiling, diekstraksi dengan metanol dengan cara perkolasi, Ekstrak metanol kental yang diperoleh seteJah pelarut diuapkan, diekstraksi berturut-turut dengan pelarut n-heksana, metilen kIorida., etil asetat, dan butanol. Fraksinasi ekstrak aktif (ekstrak etil asetat) dilakukan dengan kromatografi kolom vakum, sehingga diperoleh beberapa fraksi. Fraksi aktif dimumikan lebih lanjut sampai diperoleh senyawa rnurni yang aktif sebagai antibakteri.

Serbuk kering tumbuban rneniran (Phyllantus niruri L.)

Perkolasi metanol Diuapkan pada suhu 40°C

f

Ekstraksi dengan n-heksana

t +

~

Ekstrnksi deogan ( MeOH: CH:tCh)

+

Fraksi n-heksana

Fraksi CH,CI.

Residu

...

Ekstraksi dengan etil asetat

t

~

E~UOH

Fraksi EtOAc

Residu akhir

Kromatografi Kolom

G5 db c£ [fu db dJ cib

Bagan Ekstraksi dan Fraksinasi Phyllantus niruri L.

177

Prosiding Seminar Tantangan Penelitian Kimia

Penapisan Fitokimia

Ekstrak metanol dan ekstrak etil asetat diuji terhadap golongan senyawa kimia (alkaloid, fenol, flavonoid, steroid, terpenoid, triterpenoid, saponin, dan tanin) menurut cara Harbone'", Fransworth'" dan Materia Medika Indonesia'!',

Uji Aktivitas Antibakteri

Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metoda difusi agar menggunakan Iubang berdiameter 6 mm(6). Sejumlah 10 mikroliter larutan sampeI dalam DMSO 10 % dimasukkan ke dalam lubang pada lapisan agar nutrient (DIFCO) yang mengandung 100 mikroliter suspensi bakteri (A: 0,1 pada A. 560 nm), Bakteri uji yang digunakan ialah Bacillus subtlis (ATCC 6633), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Escherichia coli (ATCC 25922), dan Pseudomonas aeruginosa (koleksi BIOF ARMA). Larutan 1 % ampisilin dari SIGMA digunakan sebagai kontrol positif dan DMSO 100 % digunakan sebagai kontrol negatif. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30°C, diameter hambatan yang berupa daerah bening di sekitar lubang diukur.

Penentuan KHM dan Nilai Banding

Penetapan konsentrasi hambatan minimal (KHM) dilakukan dengan metode difusi agar seperti pengujian aktivitas antibakteri dengan variasi konsentrasi, Sebagai pembanding dibuat kurva baku Ampisilin antara Log konsentrasi (ppm) terhadap diameter hambatan (nun). Kurva ini digunakan sebagai pembanding sampel dengan aktivitas antibakteri tertinggi. Diameter sampel tersebut diplot pada kurva standar sehingga diperoleh konsentrasi sampel. Nilai banding diperoleh menggunakan persamaan :

Nil i b di Konsentrasi sampel darikurva baku 1000'"

1 at an mg = x 70

Konsentrasi sampelsebenarnya

Analisis Senyawa Hasillsolasi

Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi yang berupa kristal diuji kemurniannya menggunakan plat KLT (elusi beberapa pelarut) dan uji titik leleh. Selanjutnya analisis diteruskan mengunakan spektrofotometer UV -VIS dan IR

178

Prosiding Seminar Tantangan Penelitian Kimia

BASIL DAN DISKUSI

Ekstrak kental metanol sebanyak 82,0 gram diperoleh dati hasil ekstraksi 430 gram serbuk kering tumbuhan Phyllantus niruri L. Partisi dengan pelarut terhadap ekstrak metanol menggunakan beberapa pelarut dengan berbagai polaritas seperti heksana, metilen klorida, etil asetat dan butanol (Bagan 1), serta pengujian aktivitas memberikan gambaran bahwa ekstrak etil asetat merupakan ekstrak yang paling aktif antibakteri dengan jumlah rendemen yang cukup banyak di antara ekstrak-ekstrak lainya seperti terlihat pada Gambar 1. dibawah ini

Eill .. ,,01 -

Butanol

Residu

MTC

l0r-------------------------------------,

, .

.! 115 5 14 :: II ! ,.

~ U a

mtitD.oi

c1i1uclll

builDOI

MTC

, ......

Gambar 1: Histogram Rendemen Ekstrak-Ekstrak Hasil Pemisahan serta Aktivitas Antibakteri Terhadap Keempat Bakteri Uji.

Ekstrak etil asetat dengan persentase rendemen sebesar 13,5 % (terhadap ekstrak metanol) mempunyai diameter hambatan sekitar 18 dan 17 rum terhadap bakteri gram positif dan negatif kecuali terhadap bakteri P. auroginosa sebesar 11 mm.

179

Prosiding Seminar Tantangan Peneiitian Kimia

Hasil skrining fitokimia terhadap ekstrak metanol dan etil asetat tumbuhari Phyflantus niruri L. menunjukkan beberapa golongan senyawa yang terdeteksi yaitu alkaloid, flavonoid, fenol dan tannin.

Hasil kromatografi kolom vakum terkumpul sebanyak II fraksi. Fraksi yang terkumpul diuji aktivitas antibakterinya. Dari hasil pengujian yang dilakukan sebanyak duakaIi ulangan (Tabel 2), terlihat bahwa fraksi ke-6 (21-25) dengan berat 159 mg Yang berupa minyak bercampur serbuk, pada kadar 1% memberikan aktivitas yang' cukup besar hampir sepertiga dari standar ampisilin pada kadar 0,5%. Artinyafraksi ini mengandung molekul yang memberikan kontribusi yang besar dalam aktivitas antibakteri Phyllantus niruri L dan mempunyai potensi untuk dikembangkan ke arab pencarian senyawa antibakteri.

Tabel 2. Hasil Uji Antibakteri Fraksi Etil Asetat Hasil Pemisahan Kromatografi Kolom Vakum.

Fraksi ke- Konsentrasi Hambatan (mm) terhadap bakteri uji
sampel (%) Bisub tilis S. aureus E. coli P. aeruginosa
1 1 6,0 9,0 7,0 8,0
2 1 9,0 9,0 8,0 10,0
3 1 10,0 9,0 10,0 8,0
4 1 8,0 6,0 8,0 6,0
5 1 12,0 10,0 10,0 9,0
6 1 13,0 13,0 12,0 10,0
7 1 10,0 10,0 9,0 8,0
8 1 9,0 7,0 8,0 6,0
9 1 9,0 10,0 10,0 12,5
10 1 8,5 9,0 9,0 9,0
11 1 7,5 6,0 9,0 10,0
Ampisilin 0,05 30,0 27,0 28,0 26,5
DMSO 100 6,0 6,0 6,0 6,0 180

Prosiding Seminar Tantangan Penelitian Kimia

Fraksi keenam dimurnikan kembali dengan kromatografi kolom lanjutan dan diperoleh enam fraksi. Pada fraksi ke-2 (pn F6-2) diperoleh kristal jarum kuning kehijauan seberat 25 mg yang keluar pada eluen heksana : etil asetat (7:3). Kristal ini larut dalam pelarut polar (metanol dan aseton).

Penentuan nilai KHM: F6-2 Pn dan analisis perbandingan aktivitas F6-2 Pn terhadap standar ampisilin diketahui dari kurva diameter hambatan ampisilin terhadap keempat bakteri uji memberikan hasil bahwa senyawa F6-2 Pn mempunyai aktivitas paling efektif terhadap bakteri S. aureus dengan nilai KHM sebesar 769,63 ppm dan nilai banding terhadap standar ampisilin sebesar 0,124 % (Tabe13.)

Tabel 3. Hasil Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum dan Nilai Banding F6-2 Pn Terhadap Standar Baku Ampisilin.

Senyawa F6-2Pn KHM:F6-2Pn Nilai banding F6-2 Pn
terhadap (ppm) terhadap Ampisilin (%)
B. subtilis 824,71 3,37. lO-3
S. aureus 769,63 1,24 10-1
E. coli 815,99 8,6110-3
P. aeruginosa 948.86 9.8410-3 Gambar 2. Hasil Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Nilai Banding terhadap standar ampisilin senyawa F6-2 Pn

181

Prosiding Seminar' Tantangan Penelitian Kimia

Hasil rekristalisasi memberikan senyawa mumi berupa kristal kuning muda, yang mempunyai titik leleh pada 201,3 -202, 1°C. didukung dengan hasil KL T menggunakan tiga pelarut yang berbeda. Pelarut CRCI3 : MeOH (I: 1) dengan RF sebesar 0,6081. Pelarut campuran aseton : heksana (3:2) memberikan RF sebesar 0,4419 dan dengan pelarut etil asetat : heksana (2: 1) spot yang terbentuk mempunyai RF sebesar 0,4575 menunjukkan bahwa kristal jarum kuning (F6-2 Pn) merupakan senyawa murni.

Analisis spektrum UV dari F6-2 Pn memberikan spektnun yang terdiri dari dua puncak atau pita (Gambar 3). Pita pertama pada panjang gelombang 259,2 run dengan absorban sebesar 0,3780 dan pita yang kedua muncul pada panjang gelombang 213,6 nm dengan absorban 1.2190. Spektum UV mengalami pergeseran setelah penambahan pereaksi geser terutama pereaksi basa. Menurut Markham!" pergeseran ini diduga merupakan pergeseran suatu senyawa turunan fenol yaitu flavonoid jenis flavon. Kedudukan gugus hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid dan pola oksigenasinya dapat ditentukan dengan penambahan pereaksi geser,

f~ .. ·r •••••••••• - ••••••• _ ••• ··~ •• ~ r ••••••••••••••••••• -.- ••••••• r' •••••• OT ••••••••••••••••••• _ ••• - ··········f

!/~ I

·0 \ 1

Y \ i

L.. \,'-.-- .. - .. /.- .. - .... ----~~=::::~-::~::-::,.::::::,,:::::::::::;:::::::::;:::::>~--, .... -j

Spektrum IR senyawa F6-2 Pn dalam pelet KBr (Gambar 4). memberikan pita serapan yang sangat jelas di beberapa daerah IR pertengahan (4000-600 em"), Data-data spektrum IR yang diperoleh memberikan infonnasi bahwa senyawa murni berupa kristal jarum kuning muda adalah mengandung gugus OR C=C. aromatik tersubstitusi, C-O dan C=O.

182

Presiding Seminar Tantangan Penelitian Kimia

Tabel 4. Dugaan Gugus Fungsi Pada Spektrum Inframerah (IR)

Pita Serapan Pada .Bilangan Gelombang (em")

Dugaan Gugus Fungsi

3479,3 3031,9

Ulur O-H untuk fenol VIur C-C aromatik.

Tekuk C-H luar bidang, aromatik. disubstitusi (meta) atau trisubsitusi

VIur C=C aromatik.

Ulur C=O karbonil UIurC-O

Aromatik. tersubsitusi metal (Ar-CH3)

767,6-702,0

1550,7-1500,0 1697,2 1253,6-1203,5 dam 1386,7 1450,4-1386,7 dan 2933,5

Gambar 4: Spektrum Inframerah F6-2 Pn dalam pelet KBr

Data-data UV dan IR mendukung kesimpulan bahwa F6-2 Pn adalah senyawa fenol aromatik. yang mengandung karbonil tersubstitusi metil.

183

Prosiding Seminar Tantangan Penelitian Kimia

KESIMPULAN

Dari hasil penelitian yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa:

1. Tanaman Phyllantus niruri L. memiliki aktivitas terhadap bakteri patogen dari kelompok gram positif maupun gram negatif, seperti Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa

2. Ekstrak etil asetat memiliki aktivitas yang lebih besar dibandingkan dengan ekstrak awal metanol dan ekstrak lainnya,

3. Fraksinasi ekstrak etil asetat menghasilkan senyawa murni berupa kristal jarum kuning muda (F6-2 Pn) yang memiliki aktivitas paling efektif terhadap bakteri Staphylococcus aureus.

4. Hasil analisis spektroskopi UV, m. dan didukung oleh data hasil penapisan fitokimia senyawa F6-2 Pn merupakan suatu senyawa flavonoid jenis flavon.

DAFTAR PUSTAKA

1. Ditjen POM Depkes. RI., Materia Medika Indonesia, jilid II, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, 1978, 77-82.

2. Farnsworth N. R, Biological and Phytochemical Screening of Plants, J.

Pharm. Sci. 1966,245-254.

3. Harbone, 1. B., Metode Fitokimia, tetjemahan Padmawinata K., edisi kedua, 11'8, Bandung, 1996,8, 19,49-147,234-244.

4. Heyne K., Tumbuhan berguna Indonesia, Jilid II, tetjemahan Badan Puslitbang Kehutanan, Yayasan Sarana Wana Jaya, Departeman Kehutanan, Jakarta, 1987, 1138 - 1140.

5. http://www.rain-tree.comJplant.image/phyUanthus_niruri.P4JPS JK .

184

Prosiding Seminar Tantangan Penelitian Kimia

6. Jawetz, Melnick & Adelberg, Mikrobiologi Kedokteran, terjemahan Em Nugroho, RF Maulany, Edisi 20, EGC, Jakarta, 1995.

7. Kimghom, A.D., Phytochehemical Approach to Bioscreening of Natural Products, in Thompson E.B., "DRUG BIOSCREENING, fundamental of Drug Evaluation Techniques in Pharmacology", Graceway Publishing Co., New York, 1985.

8. Markham K.R, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, Penerbit ITB, Bandung 1988.

9. Sale, A. J., Fundamental Principles of Bacteriology, second edition, Mc.

Graw. Hill. Co., New York, 1961,604-820.

185