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recuento microbiano

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EXPOSICIÓN

MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO A) MEDIDAS DE MASA BACTERIANA y Determinación Del Peso Húmedo  Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra.  La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa.  La cantidad de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular. Para corregir el peso húmedo se determina la cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.  Se utiliza una centrífuga; se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante; se determina el peso del sedimento.  Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc. y Determinación Del Peso Seco  El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante.  Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias.  Método de cuantificación utilizado en cultivos de gran densidad sobre todo para hongos y levaduras, como los cultivos se someten a varios procesos (filtración, lavado, secado) se pueden causar pérdidas importantes de biomasa y errores en la cuantificación.  La desventaja de éste método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca puede

 Escala de MacFarland: Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados. principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. toda la noche). Cuanta más luz se refleje en una determinada muestra mayor será la densidad de partículas.  Nefelómetro: Es un instrumento para medir partículas suspendidas en un líquido. por lo tanto en cada tubo se origina un precipitado de Ba SO4. Esto lo hace empleando una fotocelda colocada en un ángulo de 90° con respecto a una fuente luminosa. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.recobrar humedad durante el pesado. pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105ºC.  Cuantas más células estén presentes. y Método Turbidimétrico  La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo. NTU o UTN.  2) Determinación del peso seco: como el anterior. La turbidez puede medirse con aparatos como el nefelómetro. La unidad de turbidez para un nefelómetro calibrado se llama Unidad de Turbidez Nefelométrica. hasta peso constante. mayor será la luz dispersada. La densidad de partículas es entonces una función de la luz reflejada por las partículas a la fotocelda. la cual se relaciona con un número de células/ mL. . el que da origen a la turbidez. Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente cerrados que contienen 1% de BaCl2 + cantidades crecientes de H2 SO4al 1%.  Un método muy rápido y útil de obtener estimaciones del número de células son las medidas de turbidez. La densidad de partículas depende de las propiedades de las partículas como su forma. y por lo tanto mayor será la turbidez. color y reflectividad.  La dispersión de la luz es proporcional a la masa del cultivo.  Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio.

4 0.5x109 1.8 9.2x109 1.6 0. Ha sido desplazado por los métodos espectrofotométricos.c/ml 3.4x109 2.2 0.1x109 2.5 9. Inconveniente: es un método poco preciso.6 9.1 0.0x108 6.4 9.0 SO4H2 1% 9.0x108 1.f. TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Cl2Ba 1% 0.0x108 9.1 9.7 9.8x109 2.0x109 MEDICIÓN DE LA TURBIDEZ: MÉTODOS ESPECTOFOTOMÉTRICOS .7x109 3. que sólo se emplea cuando no hace falta exactitud.7 0.3 0.0 u.9 1.8 0.2 9.9 9.5 0.3 9.

02 mm de profundidad Área de 1 mm2. dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes.00 x 10-2 4. que son portas excavadas modificados. Area Tipo de cuadro Cuadrado total Cuadrado grande Cuadrado pequeño [cm2] 1. Cámara De Recuento De Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas: y - Excavación con 0.00 x 10-4 2.50 x 10-5 Volumen [ml] 2. Cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños.00 x 10-5 8. sobre cuya superficie de vidrio está marcada una rejilla con pequeños cuadrados de área conocida. Con las muestras se deben usar cámaras de conteo especiales.25 x 106 2.00 x 10-7 5. la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).B) MEDIDA DEL NÚMERO DE INDIVIDUOS 1. Recuento Total De Células El número de células de una población se puede determinar contando una muestra con el microscopio mediante el método de recuento directo.00 x 104 1.00 x 10-8 Factor [1/Volumen] 5. como la Cámara De Recuento De Petroff-Hauser. el cual se puede hacer de dos formas: - En muestras secas sobre el porta o En muestras líquidas. O sea.00 x 107 .

Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas. de modo que el líquido de la muestra se pueda absorber. pero presenta ciertas limitaciones: y y No se distinguen células vivas de las muertas. Las células que son pequeñas son difíciles de ver en el microscopio y algunas se pueden perder en el microscopio. El método que usualmente se utiliza para realizar una determinación de células viables se basa en contar el número de células de la muestra que es capaz de formar colonias sobre un medio sólido adecuado. El recuento directo por microscopia es un método rápido para conocer el número de células. .Un cierto volumen de cultivo diluido. Hay dos maneras de realizar un recuento en placa para células viables: el método de extensión en placa y el método de vertido en placa. y Por esta razón el recuento de células viables también se llama ³Recuento en placa o recuento de colonias´. Recuento De Células Viables y y Una célula viable es aquella capaz de dividirse y dar lugar a una descendencia.1 ml. . se extiende sobre la superficie de una placa con medio sólido utilizando una asa estéril de extensión. y Si una suspensión tiene menos de 106 células bacterianas por mililitro es posible que no se vean bacterias en el campo del microscopio. En el método de extensión en placa .La placa se incuba después hasta que aparecen las colonias y se cuenta su número. la concentración celular es fácil de establecer: n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml y y Este método tiene la ventaja de ser muy rápido y económico.Para esto es importante que la superficie del medio este seca.La muestra. y se cuenta el número de células en varias celdillas. que no suele ser superior a 0. se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos. Entonces. y En este recuento se supone que cada célula viable puede formar una colonia. . 2. una vez dispensada entre el porta y el cubre.

0 ml) de cultivo en una placa petri estéril - Sobre la que se añade el medio con agar fundido y se mezcla bien mediante un suave movimiento giratorio de la placa sobre la superficie de la mesa. - Sin embargo. dificultando su recuento. En el método del vertido en placa o método de vaciado en placa - Se pipetea un volumen conocido (normalmente 0. sin perder su viabilidad. y puede ser la causa de que las colonias se unan al formarse.1-1.1 ml porque el exceso de líquido no es absorbido. para poder hacer uso de este método. También es importante que el numero de colonias no sea demasiado bajo para que el cálculo sea estadísticamente significativo. el organismo que se cuenta debe ser capaz de resistir brevemente la temperatura del agar fundido a 45ºC. se pueden usar volúmenes de inoculo mayores que en el método de recuento por extensión. el número de colonias por placa oscila entre 30 y 300. . provocando cálculos erróneos. En la práctica.. es importante que el numero de colonias que aparezcan en las placas no sea demasiado grande. Dilución De Las Suspensiones Celulares Antes De La Siembra En La Placa En los métodos anteriormente mencionados. 3. y Para obtener el número apropiado de colonias casi siempre se diluye la muestra.No se suelen usar volúmenes mayores de 0. ya que en placas muy atestadas algunas colonias se podrían fusionar. - Como la muestra se mezcla con el medio fundido. antes de dejar que se solidifique.

9 ml. 8. y Por otra parte. Existen muchos tipos de cámaras de recuento. se puede lograr haciendo tres -2 diluciones sucesivas de 10 seis sucesivas de 10-1. una dilución 10-2 se puede hacer de modo seriado haciendo sucesivamente dos diluciones de tipo 10-1. y En la mayoría de casos se realizan dichas diluciones seriadas para alcanzar la dilución final que se desea.4 Recuento directo Un recuento directo es un recuento de las células individuales de una población microbiana.4. Para hacer una dilución de 10-1 se mezclan 0. se puede y mezclar 0. llamada así .y Como raramente se sabe de antemano el número de células viables. utilizando un microscopio y un porta especial denominado cámara de recuento. El recuento directo puede hacerse visualmente. es posible usar soluciones estériles de sales inorgánicas o un amortiguador de fosfatos.5 ml de la muestra con 4. aunque por economía. y Cuando se hacen diluciones es importante que se utilice una pipeta diferente para cada dilución. pero la cámara de Petroff-Hauser. normalmente se hace más de una dilución. aun cuando sea de la misma muestra. Si se necesita una dilución de 10-2.5 ml de diluyente o 1 ml de la muestra con 9 ml del diluyente. por ejemplo si se requiere una dilución 10-6. Es común usar varias diluciones decimales de la muestra.95 ml del diluyente o 0.1 ml con 9.05 ml de la muestra con 4. y o El líquido usado para hacer las diluciones es importante y lo mejor es que sea idéntico al líquido utilizado para preparar el medio solidificado.

Puesto que las células vivas y las muertas tienen un aspecto parecido observadas al microscopio. si las células son las únicas . la conductividad del circuito disminuye y la presencia de la célula es detectada electrónicamente en el contador. mediante una bomba de vacío.dan resultados semejantes. no muy cara. Se puede calcular cuántas células están presentes en 1 ml o en cualquier otro volumen del cultivo.001 µl). pero se usan en situaciones muy diferentes. Por el contrario. tal vez sea la más utilizada en los laboratorios de microbiología (Figura 8. el recuento electrónico requiere un equipo caro. El recuento electrónico es posible porque las células microbianas no conducen la electricidad tan bien como el medio en el que están suspendidas. por ejemplo. De esta manera.microscópico y recuento electrónico . tan sólo se necesita una cámara de recuento. de manera que cada vez que pasa una célula a través del mismo. pero es muy rápido y preciso. El recuento directo también puede hacerse electrónicamente. Pero es un proceso tedioso y lento.en honor de los que la desarrollaron. un microlitro (0. contando las células de varios cuadrados y haciendo la media. El poro forma parte de un circuito eléctrico.8). cada cuadrado que observamos al microscopio representa un volumen determinado de líquido. además del microscopio óptico que existe en cualquier laboratorio de microbiología. Los dos métodos principales de recuento directo . con un instrumento denominado contador Coulter. Se coloca en una cámara del contador un volumen determinado del cultivo y se hace pasar a través de un pequeño poro (de unos 15 µm de diámetro) a otra cámara. el recuento directo es un recuento total de células. Todas las cámaras de recuento poseen una profundidad conocida y tienen marcados unos cuadrados de dimensiones también conocidas. El recuento microscópico no requiere de un equipo caro.

Ademas. el recuento en placa no requiere un equipo complicado.02 mm de profundidad). El recuento en placa es un recuento de viables. El recuento microscópico es necesario si la muestra contiene partículas extrañas. pero si tienen aproximadamente el mismo tamaño. el volumen total de la rejilla es de 0. porque la precisión depende del recuento de un número elevado de . Consta de un porta que tiene unos pocillos superíiciales (de 0. Figura 8. para realizar un recuento directo de células. A continuación. La ventaja del método de recuento en placa es su gran sensibilidad. se seleccionan para el recuento de colonias las placas en las que éstas están bien separadas. Si se utiliza un medio y unas condiciones de incubación adecuadas.02 (un quinceavo) mm3. empleados para cultivar los microorganismos. La cámara de recuento de Petroff-Hauser se usa.partículas presentes (el recuento electrónico también se usa en los laboratorios clínicos para contar las células sanguíneas). que se describieron en el Capítulo 3. generalmente después de un día. De esta manera. como células sanguíneas o fragmentos de suelo. puede detectarse incluso una única célula viva. cada uno de los cuales está dividido en 16 cuadrados más pequeños.5 Recuento en placa Para realizar un recuento en placa se utilizan los métodos de extensión o de vertido en placa. Se basa en el principio de que una única célula viable originará una colonia visible. Las placas que tienen entre 30 y 300 colonias ofrecen una buena relación entre la rapidez del recuento y la precisión en el resultado obtenido. Un inconveniente es que el recuento en placa es lento y tedioso y no es muy preciso. una muestra del cultivo y luego sembrar una pequeña cantidad de cada dilución en una placa o bien mezclarla con el medio a sobrefusión. La técnica consiste en diluir de manera seriada. junto a un microscopio.8 Recuento microscópico directo. En el fondo del porta hay grabada una rejilla de 1 mm2. el contador electrónico las contará como células. dividida en 25 cuadrados grandes. y cada cuadrado grande es un veinticincoavo de esta cantidad. nos permite calcular la concentración de células presente en la muestra original (Figura 8. 8.9). cuando se siembre en una placa de agar.4. la placa debe ser incubada en las condiciones adecuadas. El número de colonias de una placa. Una vez que se han formado colonias visibles. Una persona que realiza un recuento microscópico puede discriminar entre las células microbianas y las partículas extrañas. generalmente diez veces por cada dilución. junto con la dilución de la muestra que se inoculó en ella.

9 Un recuento en placa es una medida directa y proporciona un recuento de viables. En primer lugar. La precisión aumenta con el número de colonias que se recuentan. En este ejemplo.1 ml a una placa de agar nutritivo. bien extendiéndolo en la superficie de la misma (método de extensión en placa) o mezclándolo con el medio (método de vertido en placa). 1:100000 (10-5). Este proceso se repite basta obtener una dilución apropiada en este ejemplo.colonias. . Debido a razones estadísticas. la muestra se diluye seriadamente. Posteriormente se añade 0. Las placas se incuban y se recuentan las colonias que se desarrollan. ya que disminuye el error debido al muestreo. Figura 8. transfiriendo 1 ml de la muestra a 9 ml de medio estéril y se mezclan adecuadamente. las placas deben contener entre 30 y 300 colonias. la placa tiene 225 colonias.

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