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Técnicas histológicas y coloraciones

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TÉCNICAS HISTOLÓGICAS Y COLORACIONES

En este capítulo estudiaremos: D1. Generalidades D2. Técnicas histológicas D3. Técnicas especiales D4. Las coloraciones empleadas en histología

D1. GENERALIDADES
Técnicas histológicas es el conjunto de procedimientos utilizados para el estudio microscópico (histológico) de las piezas anatómicas. Estos procedimientos complejos, que van desde la recepción de una pieza anatómica hasta el diagnóstico microscópico de la misma, si bien es cierto que no van a ser realizados ni por el estudiante ni por el médico que no se dediquen a la investigación histológica e histopatológica, pero es necesario el que ellos conozcan sus fundamentos, su ejecución, la interpretación de los resultados para una mejor comprensión del estudio histológico, por lo que aquí se los trata de una manera resumida. Todas las técnicas tienen en común el que requieren de un corte muy delgado del tejido (llamado corte histológico), y el montarlo en una lámina muy fina de vidrio, la cual se la somete a diversas coloraciones antes de observarla al microscopio, ya que luego se la cubre por una laminilla.

D2. TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
Hay dos técnicas principales para proceder a la preparación y tinción de los cortes histológicos de los tejidos: la de la parafina y la de la congelación. La importancia y la utilización de cada una de ellas, tiene su justificación precisa, como se verá a continuación. D2.1. LA TÉCNICA DE LA PARAFINA: se inicia siempre por la obtención de la muestra, la que pasa luego, por los siguientes procedimientos: fijación, deshidratación, aclaración, inclusión, sección y finaliza con el montaje y la tinción.
a. LA OBTENCIÓN DE LA MUESTRA: es el tomar un pequeño fragmento de órgano o tejido, lo cual se verifica ya en el cadáver (necropsia), o ya en el vivo (biopsia), en este caso, ya en un acto operatorio, o ya mediante métodos especiales, por los cuales y sin que se haga una verdadera intervención quirúrgica, se obtienen fragmentos de tejido para su estudio microscópico. En los dos casos, este paso debe ser realizado mediante movimientos delicados y usando instrumental bien afilado, para no producir cambios artificiales en las estructuras a observar, ya por presiones indebidas o ya por secciones realizadas con instrumentos en mal estado.

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En una necropsia se tratará de obtener las muestras lo más rápidamente posible para que los órganos no sufran lesiones postmortem, ésto es, las que necesariamente ocurren una vez que se ha producido la muerte; como la muestra así obtenida debe ser sometida a los siguientes pasos, para que los procedimientos de éstos actúen bien, el fragmento debe ser de pocos milímetros de espesor. b. FIJACIÓN: la muestra obtenida es de un tejido blando y a veces demasiado blando, por ello, este paso de la técnica tiene por finalidad endurecerlo, a la vez que detiene las degeneraciones postmortem. El fundamento de este paso es el coagular las proteínas del tejido para que se enduren; para conseguir ésto, se acude al aldehído fórmico en solución al 4%. Al endurecer las proteínas por coagulación, éstas aprisionan a algunos de los demás elementos de los tejidos y realmente causan la fijación del mismo. Los fijadores son antisépticos, por lo que matan a cualquier agente patológico que contenga el fragmento. c. DESHIDRATACIÓN: como para realizar los cortes de las muestras es necesario incluir a éstas en una sustancia que se endure completamente, se emplea para este fin, la parafina, pero ésta necesita tener en la muestra un espacio para ocupar; los técnicos entonces idearon al conocer que el tejido tenía mucha cantidad de agua (aproximadamente el 65%), el eliminar ésta y reemplazarla por la parafina líquida, con lo cual se cumple el paso de la deshidratación. Para ésto, se lava la muestra con alcoholes de grado cada vez superiores hasta llegar al alcohol absoluto, que elimina completamente el agua del tejido. d. ACLARACIÓN: luego de eliminada el agua, la muestra queda con alcohol en el que tampoco se disuelve la parafina, por lo que los investigadores debieron buscar un solvente común de cera de parafina y de alcohol, y para este efecto se emplea el xilol, a cuya acción se somete a la muestra, con lo que se elimina de ella a todo el alcohol. e. INCLUSIÓN: realizada la aclaración, la muestra se incluye en parafina líquida, la que penetra en el fragmento y sustituye al xilol. f. SECCIÓN: al enfriarse la parafina, ésta se endura y con ella se endura también el fragmento orgánico de la muestra, constituyendo un bloque compacto de parafina que fácilmente se presta para ser cortado. Para cumplir con este paso, debió investigarse mucho y mejorar los instrumentos que se empleaban, ya que se necesitaban hacer cortes de pocas micras de espesor (entre 5 y 10 micras); por ello, se ideó el aparato llamado MICROTOMO (Fig. D-1 y D-2), que por una parte dispone de una cuchilla muy fina y por otra de un sistema con movimiento, de modo que, cada vez que la cuchilla realiza una sección, hace avanzar a la muestra una cantidad fija de micras que se pueden graduar a voluntad. De este modo, se logra obtener una verdadera cinta de cortes sucesivos, en los cuales, el borde uno se adhiere al borde del siguiente.

Fig. D-1. Fotografía que muestra a un técnico utilizando un ultramicrotomo, aparato que está en funcionamiento.

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g. MONTAJE Y TINCIÓN: una vez que se ha obtenido la cinta de los cortes, se procede a montar uno de ellos sobre una laminilla portaobjetos para proceder y someterlo a la tinción. Como el corte del tejido tiene en su interior parafina y como la mayor parte de los colorantes más usuales no son solubles en la parafina y si en agua (ver sobre ésto más adelante en este mismo libro), hay que volver a hidratar al corte, de modo que permita colorearlo. Luego, y una vez montado el corte en a placa, se procede a realizar los pasos inversos que se han analizado hasta llegar a la inclusión; por ello, primero se lavará en xilol, con lo cual se disuelve la parafina, luego se lavará en alcoholes decrecientes de grado para eliminar el xilol y finalmente, se lo lavará con agua, para que ésta ocupe las partes anteriormente llenas de ella y así pueda ser teñido con colorantes solubles en agua. Realizada la coloración, se procederá nuevamente al lavado con alcoholes crecientes y luego con xilol, para finalmente proceder a la observación del corte microscópico (Fig. D-3).

Fig. D-2. Fotografía de un ultramicrotomo, que en primer plano muestra el cuchillo para los ultradelgados cortes de tejido. D2.2. LA TÉCNICA DE LA CONGELACIÓN: es la otra técnica más usada para realizar estudios histológicos y sobre todo histopatológicos, pues de ella nos valemos cuando el cirujano necesita por ejemplo, un diagnóstico histopatológico de un supuesto tumor canceroso durante el curso de una intervención quirúrgica; con el diagnóstico del tejido obtenido durante la cirugía, él sabrá que conducta seguir durante la operación, ya que si se comprueba que es maligno, deberá hacer resecciones quirúrgicas mayores, caso contrario, solo extirpará el tumor o solo la parte extraída par la observación y no proseguirá su intervención; como en el ejemplo indicado, tenemos infinitos de los que se vale la cirugía para sus intervenciones, mediante el uso de la técnica de la congelación. La técnica en mención consiste en realizar la solidificación del fragmento de muestra mediante la congelación. Este procedimiento se realiza de varias maneras, siendo la más usada, la que se vale de una corriente de bióxido de carbono, que se conecta al portapiezas, mediante un dispositivo, cuya espita o válvula sobresale sobre la pieza para producir el llamado hielo seco, luego de lo cual se realiza enseguida el corte y la observación al microscopio. Actualmente, se usa mucho el aparato llamado CRIOSTATO (Fig. D-4), que permite la congelación de la muestra y su corte a igual temperatura, con lo cual se abrevia el tiempo de preparación.

D3. TÉCNICAS ESPECIALES

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Es necesario que el estudiante conozca por lo menos los fundamentos y la importancia de los resultados de las más modernas técnicas, aunque no las vaya a ver o a realizar. De estas técnicas, las más trascedentales son la radioautografía, la microscopia electrónica, la microscopía de fase o de interferencia, los métodos inmunohistoquímicos, que incluye la inmunohistoquímica indirecta y otras técnicas.

Fig. D-3. Serie de fotografías que muestran algunas de las fases en la preparación de un frotis de material patológico para su observación con el microscopio. (1) Toma de la muestra; (2) Extensión sobre un portaobjetos; (3) Fijación mediante calor; (4) Coloración del material; (5) Lavado; y, (6) Observación al microscopio. D3.1. LA RADIOAUTOGRAFÍA: su fundamento radica en la introducción de isótopos radiactivos en los elementos estructurales de los tejidos, a los isótopos se los observará posteriormente formando parte de los tejidos en estudio, gracias a la propiedad de dichos isótopos de convertirse en fuentes de energía capaces de impresionar las emulsiones fotográficas, pudiendo de este modo ser detectados en sus diversos trayectos. Es una técnica que a esta época del 2006, data de hace unos 45 años y que se aprovechó de la física nuclear para la producción de cierto tipo de isótopos radiactivos mediante el ciclotrón y la pila atómica. Estos isótopos, que al comienzo fueron muy pocos (inicialmente uno solo), posteriormente han aumentado considerablemente en su número y en la actualidad hay una gran variedad para el estudio de los más diversos componentes celulares. Estos componentes celulares denominados «piedras de construcción» reciben un radioisótopo y pasan a denominarse «precursores» y «producto» al elemento resultante con el precursor. Uno de los elementos radioactivos más empleados es el TRITIO, que se constituye en la piedra de construcción usada para proteínas, como sucede con la leucina; en el caso de los ácidos nucleicos, la TIMIDINA se emplea para el DNA y la URIDINA para el RNA. Para los lípidos el 3HOLEICO y el 3H-PALMÍTICO; para fosfatos de calcio, se emplean los isótopos radioactivos de calcio y fósforo; para los carbohidratos, se emplea la glucosa marcada con el mismo tritio, y así

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sucesivamente. Así, la radioautografía se basa sobre dos principios fundamentales: (1) la radiación ionizante tiene el mismo efecto sobre una emulsión fotográfica que la luz visible; y, (2) un precursor biológico con marca radiactiva, por ejemplo, un aminoácido, tiene exactamente iguales propiedades biológicas y destino metabólico en el organismo que la molécula correspondiente sin marca. Por marca radiactiva se entiende que un átomo de una molécula determinada es reemplazada por su isótopo radiactivo correspondiente, por ejemplo el reemplazo de hidrógeno por tritio 3H.

Fig. D-4. Ilustración que muestra el corte de trozos de tejido preparado en un criostato. Los resultados que se obtienen son extremadamente importantes, ya que solo mediante esta técnica se pueden hacer estudios histológicos en el tiempo y puesto que todas las demás técnicas nos presentan las imágenes de los tejidos hasta cierto punto estáticos y no se los puede estudiar en relación con el tiempo de desarrollo, como sucede con la vida de la célula, el ciclo de un epitelio, etc., o bien en los procesos activos, como son la síntesis de productos, el paso de ellos de una estructura a otra, el período de su producción, su eliminación, etc., todas estas situaciones se han hecho posibles gracias a la radioautografía. Insistiendo, con esta técnica es posible obtener información directa respecto al sitio dentro de la célula donde se sintetiza un producto y los componentes químicos que lo forman, además de sus eventuales desplazamientos dentro de la célula o hacia otras localizaciones del organismo, después de salir de la célula. Además, es posible seguir los desplazamientos de toda la célula y su posterior destino en el organismo. Por lo tanto, la radioautografía provee de información referida a los aspectos dinámicos de la morfología de las células y los tejidos. El procedimiento radioautográfico puede ser el siguiente, por ejemplo: en un animal de experimentación se inyecta una molécula de importancia biológica marcada con un isótopo radiactivo, por ejemplo 3H-leucina, que interviene en la formación de varias proteínas. Las moléculas con marca radiactiva son integradas rápidamente a las macromoléculas, que se pueden conservar en los cortes de tejido al hacerlas insolubles por fijación. Las moléculas inyectadas son solubles y se eliminan por lavado durante la preparación de los cortes histológicos, a menos que hayan sido incorporadas al producto de síntesis macromolecular antes de ser sacrificado el animal. Después del montaje de los cortes, se les agrega en cámara oscura una capa muy delgada de emulsión fotográfica (cristales de bromuro de plata en emulsión de gelatina) (Fig. D-8). Durante el posterior período de exposición, que puede durar algunos días o semanas, de acuerdo al trabajo experimental, desde los sitios radiactivos del tejido se emiten partículas o rayos gamma. Algunos de ellos atraviesan la emulsión fotográfica e inciden en los cristales de bromuro de plata, que se transforman entonces, en parte, de iones plata a plata metálica. Después de un período prudencial de exposición se aplica un revelador químico que transforma todos los cristales incididos por los rayos en plata metálica. Por último se eliminan todos los cristales no incididos mediante una solución de tiosulfato (fijación fotográfica). A continuación, se puede tratar el corte de la misma manera que cualquier otro,

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por ejemplo teñido de manera adecuada, con posterior deshidratación e inclusión. En la observación con el microscopio se distinguen los granos de plata metálica como pequeñas manchas o puntos negros en los sitios de localización de la sustancia radiactiva en el corte del tejido subyacente (Fig. D-6).

Fig. D-5. Esquema de un preparado radioautográfico para uso con ME. Parte superior: el preparado durante la exposición; parte inferior: el preparado tras el revelado y la fijación. El poder de resolución, entendido como la exactitud de la localización del isótopo radiactivo, es de alrededor de una micra con el microscopio óptico, pero si se utiliza el microscopio electrónico (Fig. D-7), es posible obtener un poder de resolución de alrededor de 0,1 micras. En las imágenes obtenidas por microscopio electrónico a menudo los gránulos ocultan varias estructuras y el estudio más exhaustivo de las radioautografías puede requerir un análisis estadístico.

Fig. D-6. Microfotografía de un preparado radioautográfico de tejido renal para ME. Se inyectó timidina tritiada que se incorporó a todos los núcleos celulares que muestran puntos negros correspondientes a los gránulos de plata metálica. El método sólo demuestra sustancias que se incluyen en los componentes tisulares, mientras que el material marcado se encuentra dentro del organismo. Precisamente por ello es posible obtener información sobre las relaciones dinámicas de los procesos metabólicos. Una importante aplicación de la radiautografía es el marcado de los núcleos celulares (Fig. D-6), tras el cual se puede seguir el desplazamiento y el destino de las células marcadas dentro del organismo. Si, por ejemplo, se inyecta timidina marcada con tritio (que en el organismo se incluye como la base timina en el DNA) en un feto, será incluido en el núcleo de todas las células que sintetizaban DNA en el momento de la inyección, como paso previo para la división celular. En la actualidad el método es muy importante para el estudio de la histogénesis (el desarrollo de las células embrionarias indiferenciadas a células especializadas en un tejido).

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Fig. D-4. Imagen de un preparado radioautográfico de Fig. D-7. Imagen de un preparado radioautográfico de eritrocitos (E) y reticulo-citos (R) capatada con ME. Las eritrocitos (E) y reticulo-citos (R) capatada con ME. Las células fueron incubadas con in Vitro con leucina tritiada. Se células fueron incubadas con in Vitro con leucina tritiada. Se observa una gran cantidad de gránulos de plata por sobre observa una gran cantidad de gránulos de plata por sobre un R, pero ninguno sobre los E, debido a que la leucina un R, pero ninguno sobre los E, debido a que la leucina radiactiva se incorporó durante la formación de radiactiva se incorporó durante la formación de D3.2. LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA: como con el microscopio de luz (ML) no se podían alcanzar mayores aumentos que los conocidos, debido fundamentalmente a la longitud de onda de la luz, se buscó la forma de resolver este problema y se ideó la fabricación de lentes de cuarzo y ya no de cristal, toda vez que en estos se detenía la luz ultravioleta (UV) que siendo de mucha menor longitud de onda permitía mayor resolución de las imágenes y obviamente, mayor amplitud de las mismas; así se inventó el ULTRAMICROSCOPIO, que si bien no permitía la visualización de imágenes por ser la luz UV invisible, si impresionaba las emulsiones fotográficas y se podían obtener microfotografías con una ampliación hasta del doble de la que ofrecía la luz normal. La longitud de onda no había sido disminuída lo suficiente hasta que se inventó el microscopio electrónico (ME), en el cual ya no existe la longitud de onda, por estar éste fundamentado en el principio de los campos magnéticos o electrostáticos a manera de haces de electrones que reemplazarían a los lentes de cristal o de cuarzo, electrones que al acelerarse convenientemente convertían a la longitud de onda en factor despreciable de modo de poder obtener grandes ampliaciones de las imágenes. Desde entonces se han venido utilizando los electrones en reemplazo de la luz y así desde 1938, año en el cual Knoll y Ruska crean el primer ME hasta 1950, cuando se lo perfeccionó y comercializó, se ha pasado por varias etapas de investigación y estudio para actualmente transformarlo en un valioso elemento de ayuda en las investigaciones histológicas e histofisiológicas, así como para la docencia y sus prácticas, puesto que en los antiguos microscopio de luz se obtenían aumento de hasta 500 diámetros o algo más y en los ultramicroscopios de hasta el doble, ésto es más de 1.000 diámetros, en el microscopio electrónico se obtienen aumentos de hasta 500.000 diámetros, estando los más comúnmente usados entre los 10.000 y los 80.000 diámetros. Las diferencias importantes entre el ML y el ME, es que en el primero, las observaciones son individuales, a colores y móviles, y el ME entrega solamente imágenes fotográficas y en negro y blanco. Es importante reconocer las imágenes obtenidas con el ME, pues ellos servirá primero al estudiante, que sin necesidad de ME tendrá a su alcance el estudio de microfotografías, y luego en la vida profesional, continuará observándolas con los nuevos estudios y experimentos de la ciencia médica.

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D3.3. LA MICROSCOPÍA DE FASE O DE INTERFERENCIA: es así mismo un método moderno y útil, sobre todo para el estudio de los tejidos en fresco, lo que es difícil solamente con el ML, ya que son tan pocas las diferencias de las densidades entre los diferentes elementos de cada célula, por ejemplo entre el núcleo y el citoplasma, de tal manera que atravesándolas una igual onda luminosa, no se obtendría casi ningún contraste, por lo que sería necesario que algunos rayos luminosos de diferente longitud de onda atraviesen estas diferentes estructuras, de modo que las visualice a unas más claras y a otras más oscuras. Es justamente este fenómeno el que se cumple con el microscopio de fase o de interferencia, el que causa que los rayos sumisos se separen y penetren en el corte con diferencia de longitud de onda, lo que se obtiene en este tipo de microscopios con un separador de haz, insertado debajo del objeto y otro haz es desviado (que se conoce como haz de referencia), pasando un poco al lado del objeto; consecuentemente, los dos haces no atraviesan los mismos materiales, lo que conde a obtener imágenes con diferentes tonalidades debido al paso de de los dos haces D3.4. LOS MÉTODOS INMUNOHISTOQUÍMICOS: el organismo está en condiciones de reaccionar ante sustancias extrañas o antígenos, y formar anticuerpos específicos, que se unen con los antígenos. Por lo general actúan como antígenos las macromoléculas proteicas o polisacáridas. Los anticuerpos son proteínas producidas por las denominadas células plasmáticas y circulan por la linfa y la sangre. Las células productoras de anticuerpos pertenecen al sistema inmune del organismo, que protege al individuo contra las macromoléculas extrañas que intentan ingresar, por ejemplo, como componentes de bacterias o virus. Así, los anticuerpos son un eslabón importante en la defensa del organismo contra las enfermedades infecciosas. La reacción entre un antígeno y su anticuerpo es en extremo específica. Los métodos inmunohistoquímicos se basan sobre la utilización de un anticuerpo específico, que se marca mediante un enlace químico en una sustancia que se puede transformar en visible, sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antígeno. El principio se ilustra con la denominada técnica de anticuerpo fluorescente. Para localizar la proteína muscular miosina se inyecta en un conejo miosina purificada de músculo de pollo. Al cabo de cierto tiempo, el suero del conejo contendrá anticuerpos contra el antígeno miosina de pollo. A continuación se extrae el anticuerpo del suero del conejo y se adosa a fluoresceína. Cortes histológicos extraídos de pollo se bañan en una solución del anticuerpo fluorescente (antimiosina), que se une específicamente con la miosina del corte. El anticuerpo en exceso se elimina por lavado y se analiza el preparado con el microscopio de fluorescencia (Figs. D-8, D10 y D-11).

Fig. D-8. Microfotografía captada con micros-copía de fluorescencia de un corte de músculo de pollo. Primero se colorea el corte con anti-cuerpo fluorescente contra miosina de pollo; En lugar de marcar el anticuerpo con fluoresceína se puede adosar a la enzima peroxidasa, por la antimiosina se une a las bandas A lo que se pueden identificar complejos antígeno-anticuerpo mediante la determinación ricas en mi-osina por lo que se ven enzimohistoquímica de la peroxidasa (Fig. D-9). De esta manera es posible utilizar el método para la microscopia electrónica. Además, se puede acoplar el anticuerpo a la proteína electrondensa que contiene hierro, ferritina, o a partículas de oro, que también se puede identificar con el microscopio electrónico (Fig. D-10).

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Fig. D-9. Microfotografía de neuronas teñidas mediante inmunohistoquímica con anticuerpos contra la molécula transmisora serotonina (5-hidroxitrip-tamina), unida a peroxidasa. La especificidad de los métodos inmunohistoquímicos depende totalmente de que el antígeno utilizado se aísle sin mezclas con otras sustancias, para que sea posible producir anticuerpos puros con la inmunización. En consecuencia, la investigación del grado de pureza del antígeno es un importante control del método. Se obtiene un antígeno totalmente puro cuando se lo sintetiza, por ejemplo un polipéptido de secuencia de aminoácidos conocida. Es esencial señalar que no es necesario aislar el anticuerpo primario específico de la fracción mezclada de anticuerpos en el conejo inmunizado ni los anticuerpos específicos anticonejo en la cabra.

Fig. D-10. Dibujo esquemático del principio de la inmunohistoquímica; se presentan los tres métodos más usuales de determinación histoquímica de proteínas específicas mediante anticuerpos marcados. D3.5. LA INMUNOHISTOQUÍMICA INDIRECTA: el método inmunohistoquímico antes descrito también se denomina método directo, hoy reemplazado casi totalmente por una técnica más sensible, llamada método indirecto. En principio es un procedimiento que consta de dos pasos: primero se hace reaccionar el preparado a analizar con un anticuerpo primario no marcado dirigido contra el componente que se desea demostrar. Cuando el anticuerpo primario reacciona con el preparado se elimina el exceso, no fijado, y se hace reaccionar el preparado con un anticuerpo secundario marcado (p. ej., fluorescente), dirigido contra el anticuerpo primario. Por ejemplo, si se obtuvo el anticuerpo primario contra una proteína X del preparado por inyección de X en un

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conejo, el anticuerpo secundario podría ser un anticuerpo de cabra dirigido contra anticuerpos de conejo en general, obtenido por inyección del anticuerpo de conejo en una cabra. Este método es más sensible porque cada molécula del anticuerpo primario reacciona con varias moléculas del anticuerpo secundario marcado, y la reacción se refuerza. En los últimos años ha sido posible obtener gran cantidad de moléculas de anticuerpo totalmente iguales, los denominados anticuerpos monoclonales. La técnica para formarlos implica una fusión celular de células de mieloma (una línea celular tumoral transformada) murinos con los denominados linfocitos B, productores de anticuerpo, del timo de ratones previamente inmunizados por la inyección del antígeno que se desea demostrar con el anticuerpo monoclonal. Después de la fusión celular, las denominadas células de hibridoma (híbridas de mieloma) formadas han adquirido la capacidad de las células del mieloma de desarrollar un crecimiento prolongado en cultivos celulares y la capacidad de los linfocitos B de producir determinado anticuerpo. Después de la clonización de las células híbridas individuales, cada clon produce grandes cantidades de anticuerpo monoclonal idéntico (Fig. D-11). Los métodos inmunohistoquímicos son uno de los más importantes utilizados en las investigaciones histológica y biológica celular. En principio es posible demostrar la localización de cada una de las proteínas que se forman en el organismo. Por ejemplo, en muchos casos se ha podido establecer cuáles son las células que forman determinada hormona. Los anticuerpos también se pueden formar contra otras moléculas, distintas de las proteínas, ya sea antígenos en sí mismos o, en los casos de moléculas pequeñas, compuestos que se acoplan a sustancias antigénicas como las proteínas, a veces debido a otro tratamiento. Por ejemplo, se ha podido demostrar la existencia de pequeñas moléculas transmisoras como la serotonina (5-hidroxitriptamina) (Fig. D-9).

Fig. D-11. Microfotografía de un microtúbulo dentro del citoplasma de fibroblastos provenientes de un cultivo de tejido. Se demuestra mediante inmunohistoquímica por l< utilización de un anticuerpo fluorescente monoclonal contra proteína tubulina que conforma el D3.6. OTRAS
TÉCNICAS:

incluyen la histoquímica con lecitinas y la hibridación in situ.

LA HISTOQUÍMICA CON LECITINAS: las lecitinas son proteínas (en su mayor parte extraídas de vegetales, por ejemplo, de porotos rojos), que poseen sitios de unión específicos para hidratos de carbono. Distintas lecitinas se unen con diferentes moléculas de hidratos de carbono o secuencias de éstas con notable especificidad. Así, existen lecitinas que se unen a glucoproteínas y glucolípidos específicos de la superficie externa de las membranas celulares y a determinados proteoglucanos del tejido conectivo. La utilización histoquímica de las lecitinas se debe a que, al igual que a los anticuerpos, se las puede marcar, por ejemplo con un colorante fluorescente o con la enzima peroxidasa, que permiten su localización en un corte de tejido. La histoquímica

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con lecitinas tiene amplia aplicación para demostrar la existencia de determinadas secuencias de hidratos de carbono en las moléculas de las membranas celulares. LA HIBRIDACIÓN IN SITU: se basa sobre la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, es decir, la capacidad de unirse entre sí que presentan las monocadenas de ácidos nucleicos que tienen secuencias de bases complementarias. La hibridación puede ser de DNADNA, DNA-RNA, o RNA-RNA. Debido a la característica muy específica de la hibridación es posible demostrar con gran especificidad la presencia de determinadas secuencias de DNA o de RNA en su localización en la célula. Para la técnica de hibridación in situ se utiliza una sonda (del inglés sonde, probe), formada por un ácido nucleico monocatenario con una secuencia de bases conocida, complementaria de la secuencia de bases que se desea demostrar. Las sondas son producidas en laboratorios (por ejemplo, mediante técnicas de donación de genes), y se marcan con un isótopo radiactivo (para ser demostradas por radioautografía, como se indicó antes), o con una ramificación adosada, que permite identificar la sonda mediante otras téc nicas, por ejemplo la inmunohistoquímica. Estas sondas varían en longitud, desde 10-15 bases hasta varios miles de bases. Por ejemplo, si se desea demostrar la existencia de determinada secuencia de DNA en un cromosoma de las células de un corte histológico o en un preparado especial de cromosomas, primero se expone el preparado a un pH elevado (básico), que induce la separación de la doble cadena de la molécula de DNA por desnaturalización. Después se agrega la sonda, que puede poseer la secuencia complementaria de DNA o de RNA. Una vez hibridada la sonda con las zonas complementarias del DNA de los cromosomas se transforma en visible la localización en los núcleos celulares, por ejemplo, mediante radioautografía o inmunohistoquímica. Si se desea demostrar la presencia de moléculas específicas de RNA, no se efectúa ningún tratamiento previo de los cortes histológicos con pH elevado, dado que precisamente se desea que las cadenas dobles de las moléculas de DNA no se separen y, en consecuencia, no se unan a la sonda. En este caso, es suficiente incubar los cortes de tejido con la sonda (después de una fijación suave del tejido), que puede contener una secuencia complementaria de DNA o de RNA. Así, mediante la hibridación in situ es posible demostrar las secuencias de ácidos nucleicos correspondiente a determinados genes, además de la expresión de determinados genes por la demostración de la presencia de secuencias específicas de RNA mensajero (mRNA).

D4. LAS COLORACIONES EMPLEADAS EN HISTOLOGÍA
Si no colorearan o tincionaran los tejidos, éstos simplemente no se podrían ver al microscopio, ya que aparecerían todo blancos y algunos hasta trasparentes. Por ello, los investigadores han tenido que idearse muchas maneras de «pintar» los tejidos para poder apreciar sus características microscópicas. Las técnicas de coloración que son muchas también han atravesado por varias etapas para llegar a los perfeccionado métodos modernos de tinción, con los que se cuentan en la actualidad; inicialmente se utilizaba un solo colorante, lo que daba al tejido, como es natural, una sola coloración, con algunos pequeños cambios de matices y con partes sin coloración, es decir, como una foto en negro y blanco, o como una pantalla de televisión con los dos colores. Posteriormente se vio que se podía colorear los cortes, primero con un colorante y luego con otro, y así se obtenía el mismo corte con varios colores, aproximándose al efecto de la fotografía a colores; de este modo, elementos morfológicamente iguales podían verse con diferente coloración según su estructura histológica y su composición química (como analizamos en los párrafos siguientes). Estas tinciones combinadas generalmente usan dos tipos de colorantes, uno de naturaleza ácida y otra básica, aprovechando el hecho de que generalmente el núcleo toma los colorantes básicos y el citoplasma los colorantes ácidos. ¿Por qué se observan de colores los cortes histológicos en general? En las siguientes líneas trataremos de explicar el porque unos tejidos se observan de color azul y otros de color rosado o rojo.

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Cuando se examinan preparados frescos con el microscopio ordinario de luz, hay muy poco contraste entre los diversos componentes titulares. Por lo mismo, ha habido necesidad de recurrir a los llamados COLORANTES PARA TEÑIR LOS TEJIDOS, técnica que empezó aproximadamente a mediados del siglo XIX. Al principio, solía utilizarse un solo colorante para teñir el corte, y por ello, con este colorante todos los elementos adoptaban el mismo color, pero como los diferentes componentes los tomaban con diversas intensidades, podían distinguirse unos de otros, lo cual se basaba en la intensidad de su coloración. Esta técnica proporcionaba, aproximadamente, el mismo tipo de contraste que se puede obtener con una televisión de blanco y negro. Cuando se incrementó el desarrollo de la industria de los colorantes se dispuso de un número mayor de colorantes, tanto naturales como sintéticos, y algunos de los colorantes más nuevos resultaron ser mucho más selectivos en su acción que los empleados hasta entonces. Se comprobó, por ejemplo, que podía utilizarse la tinción de un color para teñir algunos componentes tisulares (por ejemplo, en azul), y luego la pieza podía someterse a una segunda coloración que impregnaría los materiales que no se habían teñido con la primera tinción, dándoles otro color (por ejemplo, rojo). Las ventajas logradas fueron, aproximadamente, las que brinda la televisión de color en comparación con la de blanco y negro, permitiendo distinguir a los jugadores de fútbol que llevan uniformes azules, de los que llevan uniformes rojos, aunque ambos tengan más o menos la misma forma. Diversos perfeccionamientos de los métodos de noción, que no procede mencionar aquí, aumentaron la selectividad, ayudando a los histólogos no sólo a distinguir cada vez más entidades en los tejidos, sino también estimulando la investigación productiva. D4.1. PRINCIPIO BIOQUÍMICO DE LOS DISTINTOS TIPOS DE COLORANTES: la mayor parte de colorantes utilizados en histología son sales solubles que se ionizan en el agua. Aunque son sales, se dice que son colorantes ácidos o colorantes básicos. Para distinguirlos, recordemos que en una sal, por ejemplo, el NaCl, el Na contiene carga positiva y se denomina catión o radical básico, y Cl tiene carga negativa y se llama anión o radical ácido. En un colorante (que es una sal), si el radical que proporciona el color ocupa la posición, digamos, del Na en el NaCl, el colorante se denomina colorante básico porque el radical que proporciona el color es el radical básico (el catión). Si el radical que proporciona el color ocupa la posición que tiene el Cl en el NaCl se dice que el colorante es ácido, porque el color lo lleva el radical ácido o anión. La mayor parte de cortes usuales que se emplean para la observación directa con el microscopio, están teñidos con un colorante básico y con un colorante ácido, uno después de otro. Actualmente, estos colorantes se conocen como ácidos y básicos o de acidofilia y basofilia. Las técnicas de tinción que tiñen específicamente componentes de las células y los tejidos son denominadas técnicas de tinción histoquímica. Estas técnicas (entre las que está la tinción de Schiff), son de valor incalculable para comprender la estructura y la función de la célula y del tejido, y para hacer un diagnóstico en tejidos enfermos. Consideraremos las siguientes coloraciones: de hematoxilina y eosina, reacción de Schiff, coloración tricrómica de Mallory, de azul de toluidina, de metacromasia, método de Feulgen y colorantes de Sudán negro y osmio, tricrómico de Masson, azul alcián, Van Gieson, tinción de reticulina, de Azán, de Giemsa, métodos de plata y oro, de alumbre de cromo / hematoxilina, de azul de isamina / eosina y métodos de Nissl y de azul de metileno. D4.2. LOS COLORANTES DE HEMATOXILINA Y EOSINA: la combinación más empleada de colorantes es la de hematoxilina y eosina; es la técnica más frecuentemente usada en histología animal y en la rutina anatomopatológica. Un corte teñido con este método se denomina un corte de H y E (o simplemente HE). La hematoxilina es un producto natural; para que actúe como colorante debe oxidarse hasta constituir una substancia denominada hemateína. Las reacciones físicas y químicas que íntervienen en la tinción por hematoxilina no se conocen muy bien, pero, en general, actúan sobre un tejido bien fijado en forma muy similar a la de un colorante básico, aunque algunos de sus efectos colorantes no puedan explicarse en esta formas La hematoxilina proporciona color azul purpúreo a los constituyentes tisulares con los cuales se combina (Fig. D-12, arriba, izquier-da).

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Por lo tanto, los materiales teñidos de color azul en un corte coloreado con hematoxilina se dice que son basófilos porque quieren o apetecen un colorante básico (Fig. D-12), como sucede con los núcleos, los ribosomas y el retículo endoplásmico rugoso, que tienen una gran afinidad por este colorante debido a su alto contenido de ADN y ARN, respectivamente. La eosina es un colorante sintético que da color rosa o rojo a los constituyentes tisulares con los cuales se combina. Es un colorante ácido; en consecuencia, los constituyentes de los tejidos que se tiñen en color rosa o rojo con este producto se dice que son acidófilos o eosinófilos (Fig. D-12, arriba, izquierda), como ocurre con la mayoría de las proteínas citoplásmicas que son básicas y por ello el citoplasma generalmente se tiñe de rosa o de rojo rosado.

Fig. D-12. Arriba a la izquierda se observa una célula hepática, coloreada con HE, donde el núcleo muestra un borde color azul, dependiente del DNA y sensible a la hematoxilina. El citoplasma se pinta de rosado, por la proteína que se tiñe con la eosina. Los espacios vacíos dependen del depósito de glucógeno. Arriba a la derecha se observa la misma célula tenida con la técnica de PA-Schiff (que tiñe algunas macromoléculas e hidratos de carbono de color carmesí) y hemato-xilina. La De lo expresado en tiñe de rojo. La imagen de abajo muestra a varias células epiteliales sinuadas sobre tejido proteína del citoplasma selíneas anteriores, se deduce que la tinción de algún ingrediente tisular — pongamos, por ejemplo, con un colorante básico— Dos de las células que el ingrediente del y secretan conectivo laxo, teñidas con la técnica de PA-Schiff y hematoxilina. no depende de quese ven son caliciformes tejido moco (que es una glucoproteína).el colorante sino de que el ingrediente del tejido contenga en toda su absorba en forma difusa

sustancia radicales con carga negativa que se combinen firmemente con los radicales del colorante que proporcionan color básico, que tienen carga positiva. En forma similar, un colorante que actúa por sus radicales colorantes cargados negativamente se combina con grupos cargados positivamente de los componentes tisulares. En resumen, el colorante básico, la hematoxilina, tiñe las estructuras ácidas de azul purpúreo; en contra posición, la eosina es un colorante ácido que tiñe las estructuras básicas de rojo o rosa. En general, cuando la técnica de tinción de HE es aplicada a células animales, los núcleos se tiñen de azul y el citoplasma se tiñe de rosa o rojo.

D4.3. LA REACCIÓN DE SCHIFF: ya que los hidratos de carbono, que son tan importantes, se tiñen tan mal con los colorantes de HE, la técnica ha obligado a utilizar otra tinción sistemática, para

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preparar cortes donde se hallen estos componentes. Un hidrato de carbono abundante es el glucógeno (que es un polímero, no es muy soluble en agua y por lo cual, no se disuelve fácilmente al preparar un corte teñido), que no se tiñe ni por hematoxilina ni por eosina; por lo tanto, es transparente, y los lugares donde existían las células aparecen en los cortes HE como zonas claras (Fig. D-12, arriba, izquierda). Pero estas zonas claras de las células difieren de las zonas claras que quedan en ellas al disolverse la grasa cuando se prepara un corte, porque los espacios que antes estaban ocupados por la grasa son redondos, mientras que las zonas claras del citoplasma que contienen o contenían glucógeno son irregulares y desgarradas. Para colorearlos se emplea una técnica alternativa, denominada REACCIÓN DE SCHIFF DEL ÁCIDO PERYÓDICO, suele abreviarse con el nombre de PAS o, mejor, de técnica de PA-Schiff. La técnica PA-Schiff es un método en dos tiempos basado en la aplicación a la histología de dos reacciones bien conocidas de los químicos. Durante la primera etapa, el ácido peryódico reacciona con los grupos glicol I, II (—CHOH— CHOH—), que existen en cada uno de los residuos de la glucosa, constituyendo la cadena del glucógeno. Al tratar cortes que contienen glucógeno con ácido peryódico, ambos miembros de cada grupo glicol proporcionan un grupo aldehído (—CHO), de manera que la cadena polisacárida de glucógeno se transforma en una cadena polialdehídica. La segunda etapa estriba en tratar los cortes con un reactivo bien conocido de los aldehídos; se trata de un colorante denominado fucsina básica que puede palidecer intensamente con ácido sulfuroso y entonces recibe el nombre de reactivo de Schiff. Los aldehídos se combinan con el colorante descolorado para producir un complejo de color carmesí o púrpura (Fig. D-12, arriba, derecha), que se observa fácilmente con el microscopio. En el caso del glucógeno se observa una reacción de color púrpura brillante. En consecuencia, se dice que el glucógeno es una sustancia PA-Schiffpositiva. La reacción del PAS tiñe carbohidratos complejos de un color rojo oscuro, descrito tradicionalmente como magenta. La mucina producida por las células caliciformes de los aparatos gastrointestinal y respiratorio se tiñe de magenta con esta técnica (y es además denominado PAS positivo). Las membranas basales y los bordes en cepillo de los túbulos renales y del intestino delgado y grueso son también PAS positivos, como el cartílago y hasta cierto punto el colágeno. El glucógeno, el almacén intracelular formado por carbohidratos que se localiza en células como hepatocitos y células musculares, también es PAS positivo. D4.4. LA COLORACIÓN TRICRÓMICA DE MALLORY: esta coloración utiliza varios colorantes, todos ácidos, que tiñen distintas estructuras tisulares. Se desconoce el fundamento químico de la unión entre los colorantes y los componentes tisulares, debido a que estos métodos no son específicos (a diferencia de los selectivos que tiñen determinados componentes tisulares), desde el punto de vista histoquímico. Sin embargo, y como se muestra en la fig. D-13, se obtienen interesantes observaciones de los tejidos.

Fig. D-13. Fotomicrografía de la cápsula de un órgano coloreado por el método de Mallory. Se observa una tinción selectiva, puesto que las numerosas fibras colágenas del tejido conectivo, se colorean de azul in-tenso.

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D4.5. DE AZUL DE TOLUIDINA: ésta es una técnica básica que tiñe componentes ácidos en varios grados de azul. Se emplea comúnmente en muestras muy finas incluidas en resina. Algunos componentes tisulares son capaces de virar el colorante azul a rojo, un fenómeno conocido como metacromasia. D4.6. LA METACROMASIA: cuando se tiñen ciertos componentes tisulares, como por ejemplo, la matriz cartilaginosa, con el colorante azul de toluidina, se modifica el color azul a púrpura o rojo violáceo por unión con el tejido. Esta variación cromática se denomina metacromasia (del griego, meta, variación y, kroma, color) y los colorantes capaces de sufrir esta transformación se denominan colorantes metacromáticos. Pertenecen a este tipo de agentes ciertos colorantes básicos, de los cuales los más importantes son los derivados tiazínicos azul de toluidina y tionina.

Fig. D-14. Fotomicrografía de un corte de tráquea teñido con hematoxilina-eosina, que muestra un ejemplo de metacromasis. La ancha zona, intensamente rojo vilácea de la mitad inferior, de la imagen es cartílago hialino, cuya sustancia basal se tiñe por metacromasia.

Una solución diluida de un colorante tiazínico es azul, debido a que se encuentra como monómero. Si la solución es concentrada, el colorante se agrega y forma polímeros, por lo que el color vira al rojo. Así, un colorante tiazínico puede presentar distinto color, de acuerdo con el estado de agregación de las moléculas y es precisamente este estado de agregación, el que puede ser modificado por los componentes tisulares, y el que produce la metacromasia. Si se tiñe un corte con una solución diluida de azul de toluidina, este colorante catiónico forma enlaces electrostáticos con los sitios aniónicos y, por los componentes tisulares capaces de ser teñidos metacromáticamente, se agregan las moléculas del colorante (Fig. D-14). En consecuencia, el colorante vira a rojo. Los componentes tisulares que se colorean por metacromasia son, en su mayor parte, los muy ácidos glucosaminoglucanos sulfatados de la matriz cartilaginosa (Fig. D-14) y los mastocitos del tejido conectivo, que contienen la sustancia polianiónica heparina. Las nucleoproteínas presentan metacromasia moderada. D4.7. EL MÉTODO DE FEULGEN: es un método específico para la determinación histoquímica de DNA, sobre la base del contenido de desoxirribosa en el DNA (por lo general, los materiales positivos para Feulgen se limitan a la cromatina nuclear). Se eliminan los grupos purínicos del DNA por medio de una hidrólisis ácida suave. De esta manera se abre el anillo de la desoxirribosa y se forma un grupo aldehído, que reacciona con el reactivo de Schiff, con aparición del color rojo característico en el sitio que corresponde al DNA (Fig. D-15). Como control se utilizan cortes tratados con la enzima desoxirribonucleasa antes de la tinción de Feulgen.

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Fig. D-15. Fotomicrografía de un preparado del extremo de la raíz de la cebolla, teñida con el método de Feulgen, específico para DNA, ya que solo se tiñe de rojo, la cromatina del núcleo que con-tiene DNA.

D4.8. COLORANTES DE SUDÁN NEGRO Y OSMIO: estos colorantes tiñen las estructuras que contienen lípidos, como la mielina, de un color negro-pardo. Después de la fijación de los lípidos con formalina se cortan secciones congeladas, para evitar la extracción de los lípidos mediante solventes orgánicos. Para la demostración histoquímica se utilizan muy a menudo los denominados colorantes Sudán. Son casi insolubles en agua, por lo que se utilizan disueltos en alcohol diluido, que no disuelve las grasas. La “tinción” se produce cuando las moléculas del colorante se distribuyen entre los lípidos y el solvente, en relación correspondiente o la solubilidad en los dos medios. Pare evitar la extracción del colorante y de los lípidos, los cortes se incluyen, después de la tinción, en un medio acuoso. De este modo, los colorantes Sudán tiñen con intensidad los triacilgliceroles, como por ejemplo, en la tinción de los adipocitos con rojo Sudán (Fig. D-16). El negro Sudán tiene gran utilidad en la tinción de las vainas de mielina de las fibras nerviosas, compuestas por lipoproteínas.

Fig. D-16. Fotomicrografía de un corte congelado de tejido adiposo, teñido con rojo Sudán para los lípidos de los adipositos.

D4.9. TRICRÓMICO DE MASSON: esta técnica se llama de tejido conectivo porque se usa para demostrar elementos del tejido de soporte, principalmente colágeno. Como su nombre implica, la técnica de tinción produce tres colores: núcleos y otras estructuras basófilas se tiñen de

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azul, el colágeno se tiñe de verde o azul, dependiendo de qué variante de la técnica se utiliza, y el citoplasma, el músculo, los eritrocitos y la queratina se tiñen de rojo brillante.

D4.10. AZUL ALCIÁN: el azul alcián es una tinción de mucinas que puede ser usada en unión con otros métodos de tinción como la HE o el van Gieson (ver a continuación). Ciertos tipos de mucinas, pero no todos, se tiñen de azul con el método del azul alcián, como el cartílago. Cuando la técnica es combinada con el van Gieson, el color del azul alcián se hace verde.

D4.11. VAN GIESON: éste es otro método de tejido conectivo, en el cual el colágeno se tiñe de rojo, los núcleos son azules y los eritrocitos y los citoplasmas amarillos. Cuando se usa en combinación con una tinción elástica, la elastina se tiñe de negro / azul además de los resultados descritos arriba. Esta técnica de tinción es particularmente útil para vasos sanguíneos y piel. D4.12. TINCIÓN DE RETICULINA: este método demuestra las fibras de reticulina del tejido de sostén, que se tiñen de negro I azul con esta técnica. Los núcleos pueden ser contrastados en azul con hematoxilina o en rojo con el colorante rojo neutro.

D4.13. DE AZÁN: esta técnica es considerada tradicionalmente un método de tejido conectivo, pero es excelente para demostrar detalles citológicos finos, especialmente en epitelio. Los núcleos se tiñen de rojo brillante; colágeno, membrana basal y mucinas se tiñen de azul; músculo y hematíes se tiñen de naranja a rojo.

D4.14. DE GIEMSA: esta técnica es un método estándar para tinción de células sanguíneas y otras extensiones de células, por ejemplo, médula ósea. Los núcleos se tiñen de azul oscuro a violeta, el citoplasma de fondo de azul pálido y los eritrocitos de rosa pálido.

D4.15. MÉTODOS DE PLATA Y ORO: estos métodos fueron muy populares al final del siglo XIX y hoy son utilizados ocasionalmente para demostrar estructuras finas, como prolongaciones celulares, por ejemplo, en neuronas, placas motoras y uniones intercelulares. Dependiendo del método usado, el producto final es negro, marrón o dorado.

D4.16. ALUMBRE DE CROMO / HEMATOXILINA: este método se usa raramente y es, en principio, similar al método de HE, en el cual los núcleos son teñidos de azul y los cito plasmas de rojo. Empíricamente este método tiñe las células secretoras de glucagón del páncreas en rosa y las células secretoras de insulina en azul.

D4.17. AZUL DE ISAMINA / EOSINA: este método es también similar al método de HE pero el componente azul es bastante más intenso. D4.18. MÉTODOS DE NISSL Y DE AZUL DE METILENO: estas técnicas usan un colorante básico para teñir el retículo endoplásmico rugoso que se encuentra en neuronas; cuando éste se ve en grumos es llamado sustancia de Nissl.

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