Procesos técnicos normatizados I

PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS NORMATIZADOS I

AÑO 2010
UNIDAD Nº 1: HEMOSTASIA

FISIOLOGÍA DE LA HEMOSTASIA
El sistema hemostático es un complejo sistema diseñado y balanceado para mantener el flujo sanguíneo, exponer los vasos sanguíneos, y sellar las superficies dañadas para minimizar pérdidas de sangre y promover la restauración de la angioarquitectura normal. Otro sinónimo :Es el conjunto de mecanismos la fluidez de la sangre y la integridad vascular fisiológicos que mantienen

OTRA: • Cascada de activación enzimática: Reacción en cadena. • Permite amplificar el efecto de factores de la coagulación, presentes a bajísimas concentraciones en la sangre. • Los factores de la coagulación se encuentran en forma de precursores inactivos: proenzimas o zimógenos El sistema hemostático consiste de: • Factores de la coagulación: proteínas producidas principalmente por el hígado que, a través de la cascada de la coagulación, forman fibrina; • Plaquetas: elementos celulares que se adhieren a un área lesionada y forman el tapón hemostático inicial; • Factores fibrinolíticos: enzimas que disuelven el coágulo después que el área lesionada ha sido sellada y reparada; • Inhibidores: factores de la coagulación que ayudan a localizar el coágulo en el área lesionada e impiden una propagación anormal; y • Células endoteliales: células que tapizan los vasos sanguíneos. En un estado imperturbado, contribuyen a mantener el flujo sanguíneo y en un estado alterado, liberan sustancias para promover la coagulación, activar inhibidores, y la fibrinólisis. La sangre circula a través de los vasos sanguíneos sin que se produzca activación plaquetaria o de la coagulación y sin que se produzca tampoco hemorragia apreciable. La lesión de un vaso sanguíneo desencadena el proceso hemostático, comenzando con la adhesión de las plaquetas al endotelio dañado o a las estructuras subendoteliales expuestas. Simultáneamente, proteínas de la fase fluida del plasma reaccionan con el subendotelio e inician la activación por contacto de la coagulación. Los tejidos expuestos, o los macrófagos que se hallan en la matriz extracelular del vaso, exponen factor tisular (FT) o tromboplastina a la sangre, disparándose de esta forma la fase extrínseca de la coagulación. HEMOSTASIA PRIMARIA Adhesión plaquetaria: El proceso de adhesión comprende el transporte por difusión de las plaquetas hacia la superficie reactiva y la interacción de los receptores de la membrana plaquetaria con sus ligandos en las estructuras de la pared lesionada. Entre las proteínas adhesivas de la matriz se incluyen el colágeno, la fibronectina, el factor de von Willebrand y la vitronectina. Las plaquetas no se adhieren a las células vasculares endoteliales normales, pero en áreas de disrupción endotelial sí lo hacen a varios componentes del tejido conectivo subendotelial. En los segundos siguientes a la lesión, las
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plaquetas se adhieren a las fibrillas de colágeno del subendotelio vascular a través de un receptor, la glicoproteína Ib/IIa. Esta interacción está estabilizada por el factor von Willebrand (vW), una glicoproteína adhesiva que permite a las plaquetas permanecer unidas a la pared del vaso. El factor de von Willebrand realiza esta función formando un enlace entre un receptor plaquetario situado en la glicoproteína I y las fibrillas de colágeno subendoteliales. Una vez adheridas al subendotelio, las plaquetas se extienden sobre la superficie y plaquetas adicionales aportadas por el flujo sanguíneo se unen, primero a la placa de plaquetas adheridas y, eventualmente, una a otra formando las masas de agregados plaquetarios. o Adhesión:las plaquetas se adhieren la superficie dañada o Activación:liberación de sustancias que activan más plaquetas (realimentación positiva: amplificación) o Agregación Secreción de los gránulos y agregación plaquetaria: Al igual que ocurre en otras células, la activación y secreción plaquetaria están reguladas por cambios en el nivel de nucleótidos cíclicos, por el flujo de entrada de calcio, por la hidrólisis de los fosfolípidos y por la fosforilación de proteínas intracelulares críticas. Entre los agonistas para las plaquetas que se han estudiado in vitro, los que tienen mayor relevancia fisiológica parecen ser la trombina, el ADP, la adrenalina, el colágeno, y el ácido araquidónico. Existen receptores específicos en la superficie de la plaqueta para cada uno de estos agonistas y dichos receptores están enlazados a estructuras intracelulares, conduciendo a cambios intracelulares que caracterizan a la plaqueta activada. Un mecanismo común a varios de los agonistas es una elevación en la concentración plasmática de calcio ionizado. La unión de agonistas a receptores de la superficie de las plaquetas, activa dos enzimas de la membrana: fosfolipasa C y fosfolipasa A2. La activación de la fosfolipasa A2 conlleva a la liberación de ácido araquidónico libre que se convierte por último en el potente agregante plaquetario tromboxano A2 (TxA2) facilitando el transporte de calcio a través de las membranas intercelulares, con redistribución del calcio hacia el citoplasma. La activación de la fosfolipasa C produce la hidrólisis del fosfolípido de membrana fosfatidilinositol 4.5 bifosfato (PIP2), liberando diacilglicerol (DAG) e inositoltrifosfato (IP3). El IP3 interviene en el movimiento de calcio dentro del citosol plaquetario y estimula la fosforilación de las cadenas ligeras de miosina. Esta última interactúa con la actina para facilitar el movimiento de los gránulos y el cambio de forma de las plaquetas. El resultado de todos estos mecanismos de activación tiene tres efectos principales: 1) la secreción del contenido de los gránulos intracelulares de la plaqueta; 2) la exposición de receptores de superficie para las proteínas plasmáticas (particularmente fibrinógeno y factor de vW); y 3) la alteración de la estructura lipídica de la membrana plaquetaria, que induce la aceleración de la coagulación plasmática.
Tras la activación, las plaquetas secretan al plasma su contenido en gránulos. Las plaquetas activadas se unen entre sí mediante fibrinógeno, a través de los receptores de glicoproteína IIb/IIIa, fijando plaquetas adyacentes y formando un trombo hemostático. Estos compuestos actúan como potentes inductores de la agregación plaquetaria al promover lugares de unión plaquetarios (glicoproteína IIb/IIIa) para el fibrinógeno y factor de vW, paso esencial en el proceso de la agregación. La segunda vía dependiente de la liberación de TxA2 es a través de la ciclooxigenasa y de la tromboxano-sintetasa, al actuar respectivamente en el ácido araquidónico y en los endoperóxidos cíclicos. El TxA2 promueve la movilización de calcio intracelular y también cambios en la estructura de la glicoproteína IIb/IIIa, que llevan a la exposición de lugares de unión al fibrinógeno previamente ocultos. El TxA2 no sólo es un potente agregante plaquetario, sino que también induce vasoconstricción. La tercera vía de la activación plaquetaria está mediada por la colágena y la trombina, las cuales pueden directamente estimular la liberación de factor de activación plaquetaria, favoreciendo la interacción de fibrinógeno y factor von Willebrand con el receptor glicoproteína IIb/IIIa.

Resumiendo la hemostasia primaria comprende • Fase de vasoconstricción parietal: • Liberación de factores tisulares de coagulación • Fase endotelial-trombocitaria: • Activación de plaquetas • Resultado: • Formación de un tapón inestable de plaquetas (3-5 min)

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Activación plaquetaria 5. por otro. Liberación de factores plaquetarios 7. serín proteasas en su mayor parte que. Por motivos pedagógicos se ha clasificado la hemostasia en dos grandes vías: la vía intrínseca. iniciada por el factor tisular o factor III. verdadera llave que regula la intensidad del proceso de coagulación.Hepatocitos • Factor VII (factor estable) HEPATOCITOS • Factor VIII (factor antihemofílico A) Hepat. por un lado en la formación del coágulo y. Punción o lesión vascular 2. Ambas vías se encuentran íntimamente relacionadas entre sí a la altura de la activación del factor IX y. son transformadas en enzimas.CE. factor tisular) Fibroblastos.CE • Factor IX ( factor Christmas. las proteínas plasmáticas de la coagulación se activan para iniciar la hemostasia secundaria.. factor Fizgerald) • • • Los factores de coagulación se encuentran en el plasma en forma de proenzimas que una vez activadas. en un proceso en cascada que culmina. en la activación de la fibrinólisis y disolución del mismo. cuya activación se realiza en la llamada fase de contacto. activan a otros factores. Vía Intrínseca Vía extrínseca Factor I (fibrinógeno) HEPATOCITOS Factor II (protrombina) HEPATOCITOS Factor III (tromboplastina. lipoproteínas e iones como son el factor V activado (FVa). requiere la combinación de una serie de proteínas. a su vez. generalmente mediante proteólisis parcial. mediada "in vivo" por el colágeno y demás proteínas con fuerte carga negativa. juntas. Monocitos • Factor IV (calcio) • Factor V (factor lábil) Megac. El Proc Tecn Norm I Coagulación -3- . y la extrínseca. confluyen en la activación del factor X.Procesos técnicos normatizados I • • • • • • • • SECUENCIA: 1. Inicio de la síntesis de factores de coagulación: TROMBINA 8.Megac. Vasoconstricción mediada por serotonina 3. Agregación reversible de plaquetas 6. Agregación irreversible de plaquetas dependiente de trombina HEMOSTASIA SECUNDARIA Mientras se está formando el tapón hemostásico primario. factor antihemofílico B) HEPATOCITOS • Factor X (factor Stuart ) HEPATOCITOS • Factor XI (factor antihemofílico C) HEPATOCITOS • Factor XII (factor Hageman) HEPATOCITOS • Factor XIII (factor estabilizante de la fibrina) HEPATOCITOS Otros factores: • Prekalikreina (factor Fletcher) • Kininógeno de alto peso molecular (HMWK. Adhesión de plaquetas a la matriz subendotelial expuesta 4.. La transformación del factor X en factor X activado (FXa). el calcio y los fosfolípidos.

la molécula modificada. necesaria para la transformación de protrombina en trombina.Procesos técnicos normatizados I complejo así resultante es capaz de activar. Aunque la conversión de la protrombina puede tener lugar en diversas superficies ricas en fosfolípidos. La plasmina degrada entonces el polímero de fibrina en fragmentos pequeños (pdf) que son eliminados por el sistema de limpieza de los monocitos-macrófagos. esta reacción permanece localizada porque 1) el tPA activa el plasminógeno con más eficacia cuando está absorbido en los coágulos de fibrina. también activa los factores V. forman un complejo sobre el colágeno del subendotelio vascular. una lipoproteína que está en casi todas las membranas celulares y que queda expuesta después de una lesión celular. El polímero de fibrina es estabilizado entonces por el enlace cruzado de cadenas individuales mediante el factor XIII. Existen tres activadores principales del sistema fibrinolítico: fragmentos del factor Hageman. principal activador fisiológico. en la que tres proteínas plasmáticas (el factor Hageman. VIII y XIII y estimula la agregación y secreción plaquetarias. cataliza la formación de fibrinógeno a fibrina y promueve su polimerización. además de ser un potente activador plaquetario. Tras la liberación de fibrinopéptidos A y B de las cadenas alfa y beta del fibrinógeno. tanto naturales como artificiales. absorbido en el coágulo de fibrina. el factor II o protrombina a trombina enzima eje del sistema de coagulación y fibrinólisis. el calcio y el factor tisular. urocinasa (UK) y activador tisular del plasminógeno (tPA). El tPA. La trombina tiene múltiples funciones en la hemostasia. sino también a una marcada activación de la coagulación tanto por la vía intrínseca como extrínseca. 2) toda la plasmina que penetra en la circulación es rápidamente unida y neutralizada por el inhibidor alfa2-antiplasmina y 3) las células endoteliales liberan un inhibidor del activador de plasminógeno (PAI 1). la cual. ahora denominada monómero de fibrina. De esta forma. Activación del sistema de coagulación y formación del trombo La lesión en la pared del vaso conduce no sólo a la adhesión plaquetaria a la superficie expuesta y a la consiguiente agregación plaquetaria. RESUMIENDO Fase de formación de trombina: • Cascada de activación de enzimas y factores Fase de formación de fibrina: • Producción de una red insoluble de proteína Resultado: Estabilización y fijación del coágulo (5-10 min) La sangre cambia desde un estado fluido a un estado de gel. como consecuencia del paso de fibrinógeno a fibrina: FIBRINOGENO (soluble) ---. Aunque su papel principal es la conversión de fibrinógeno en fibrina. se forma un complejo entre el factor VII. en plasmina. factor V y fosfolípidos. Proc Tecn Norm I Coagulación -4- . En la vía extrínseca o del factor tisular.FIBRINA (insoluble) Coágulo blando Coágulo estable FIBRINOLISIS FISIOLÓGICA Fibrinolisis: • Cicatrización del tejido vascular lesionado • Destrucción enzimática de la red de fibrina Resultado: • Situación hemostática normal (48-72 horas) La lisis del coágulo y la reparación del vaso comienzan inmediatamente después de la formación del tapón hemostático definitivo. que bloquea la acción del tPA. el crecimiento de la masa trombótica compuesta de plaquetas. se acelera varios miles de veces en la superficie de las plaquetas activadas. fibrina y eritrocitos puede oponerse a la fuerza del flujo sanguíneo. formándose trombina. La vía intrínseca o de contacto. La finalidad de ambas vías es la activación del factor X. difunde desde las células endoteliales y convierte al plasminógeno. precisando también la presencia de calcio. se polimeriza en un gel insoluble. por proteolisis limitada. Aunque la plasmina puede degradar también el fibrinógeno. un cininógeno de alto peso molecular y la precalicreina).

Además tiene una gran importancia en el área terapéutica por la aplicación creciente de fármacos fibrinolíticos en el tratamiento de la trombosis.Procesos técnicos normatizados I La producción de plasmina libre en la superficie del trombo conduce a la lisis de la fibrina y esto es muy importante para el mantenimiento de la permeabilidad vascular. Es un activador directo del plasminógeno Proc Tecn Norm I Coagulación -5- . 1. una propiedad importante del t-PA es su gran afinidad por la fibrina. pudiendo ser convertido por pequeñas cantidades de plasmina a formas con lisina. Por tanto. una estructura similar al factor de crecimiento epidérmico (dominio-EGF) y dos “kringles” similares a los del plasminógeno. lo que favorecería la formación local de plasmina y la degradación de la fibrina “in situ”. La activación del factor XII conduce a la generación de calicreina que va a ser un potente activador de la fibrinólisis intrínseca. su concentración plasmática es de 20 mg/dl y su vida media de 2. especialmente en el infarto agudo de miocardio (IAM). La activación del sistema fibrinolítico es esencial para eliminar depósitos intravasculares de fibrina resultantes de la activación fisiológica o patológica del sistema de coagulación.2 días. PLASMINÓGENO Es una glicoproteína monocatenaria sintetizada en el hígado. ACTIVADORES DEL PLASMINÓGENO La activación del plasminógeno a plasmina tiene lugar por escisión del enlace Arg561-Val562 en la molécula del Glu-plasminógeno por acción de los diferentes activadores. Además el plasminógeno se une a través de los LBS a la célula endotelial lo que favorece su activación a nivel local. ACTIVACIÓN INTRÍNSECA DEL PLASMINÓGENO: Fue denominada inicialmente activación por contacto o XII-dependiente. como la precalicreína o el quininógeno de alto peso molecular (HMWK) que pueden inducir la activación del plasminógeno. La cadena pesada A contiene una región denominada dominio “finger”. El centro activo está localizado en la cadena ligera. denominadas Lisplasminógeno. aprox. La fibrinolisis es un proceso específico de disolución de fibrina por proteasas sanguíneas. Por lo referente a su mecanismo de acción. También van a mediar la interacción del plasminógeno con la alfa2-antiplasmina y. siendo su vida media de 5 minutos. por tanto.000 veces. La plasmina así formada es una serín-proteasa bicatenaria compuesta por una cadena pesada derivada de la porción amino-terminal y 5 “kringles” y una cadena ligera que contiene el centro activo. La principal vía de eliminación del t-PA es a través del hígado. lo que se ha explicado por la formación de un complejo ternario entre el t-PA y el plasminógeno a nivel de la superficie de la fibrina. compuesta por dos cadenas polipeptídicas unidas por un puente disulfuro. Actualmente se ha demostrado que la calicreina puede activar una forma proenzimática de la UK. la actividad fibrinolítica plasmática puede aumentar o disminuir dependiendo de una serie de factores. supone el reconocimiento por parte del receptor hepático del dominio EGF. van a jugar un papel fundamental en la regulación de la fibrinólisis. Su concentración plasmática es aproximadamente de 1-6ng/ml. siendo la plasmina el enzima responsable de dicha degradación. Cada una de las estructuras anteriores tiene su función: la fijación del t-PA a la fibrina se hace a través de los dominios “finger” y “kringle”. la formación de complejos inactivos entre el t-PA y su inhibidor específico es debida a una interacción con el centro activo y la eliminación del t-PA de la circulación a través del hígado. valina o metionina en dicha posición. ACTIVADORES TIPO UROQUINASA (UK) Y PROUROQUINASA (u-PA y scu-PA): La UK es una proteasa serínica similar a la tripsina. En su forma nativa el plasminógeno contiene ácido glutámico en posición aminoterminal (Glu-plasminógeno). la activación del plasminógeno y la formación de plasmina. En la región amino-terminal existen cinco estructuras (kringles = anillos) que son los lugares por los que el plasminógeno va a unirse específicamente a la fibrina. mientras que ésta estimula significativamente. los cuales poseen mayor afinidad por la fibrina y se activan más fácilmente por los activadores fibrinolíticos. que induciría un cambio de conformación de la enzima y el sustrato. El t-PA es una enzima débil en ausencia de fibrina. El t-PA es sintetizado por las células endoteliales y liberado a la circulación por diversos estímulos. denominadas precursores. habiéndose sugerido que éste sería el principal mecanismo de activación de la fibrinólisis intrínseca. actualmente se sabe que existen otras sustancias en la sangre. ACTIVADOR TISULAR DEL PLASMINÓGENO (t-PA): El t-PA en su forma nativa es una proteasa serínica monocatenaria la cual puede ser convertida en una molécula de doble cadena por acción de la plasmina.

Durante la agregación plaquetar se produce un marcado aumento de los niveles de inhibidor. se podría concluir que la alfa2-AP ejerce su efecto inhibitorio sobre la fibrinólisis a tres niveles: a) inactivación rápida de la plasmina. ANTICOAGULANTES Naturales (fisiológicos)  Factores físicos (flujo alto y baja viscosidad) Proc Tecn Norm I Coagulación -6- . La prouroquinasa (scu-PA) es una glicoproteína monocatenaria.Procesos técnicos normatizados I con formación de Glu-plasmina pero.6 días y su concentración plasmática de 1 µ M. siendo su vida media de 10 minutos. INHIBIDOR DEL PLASMINÓGENO: Es una glicoproteína rica en histidina. factor XI activado y kalicreina. mientras que varios miembros de familias con déficit de PAI-1 presentaron una moderada o severa sintomatología hemorrágica. Es el principal inhibidor fisiológico de la plasmina y representa el 75% de la actividad antiplasmínica del plasma. también neutraliza a la trombina. lo que reduce la cantidad de plasminógeno que puede unirse a la fibrina durante el proceso de coagulación. está presente en los gránulos alfa de las plaquetas (90%) y en el plasma (10%) donde circula en forma activa ligado a una proteína estabilizadora (vitronectina). inhibe de forma competitiva al plasminógeno por el que tiene afinidad a nivel de los LBS. La interacción tiene lugar entre los LBS y el centro activo serina de la plasmina con los lugares correspondientes de la alfa2-AP. haciendo que ésta sea más resistente a la acción de la plasmina. Este inhibidor es sintetizado por células endoteliales y hepatocitos. ya que activa indiscriminadamente tanto al plasminógeno circulante como al unido a la fibrina. con liberación de un péptido intermedio. pudiendo ser reactivado in vivo. La porción aminoterminal contiene una región homóloga al factor de crecimiento epidérmico y otra similar a los “kringles” del plasminógeno. INHIBIDORES DE LOS ACTIVADORES DEL PLASMINÓGENO: TIPO ENDOTELIAL (PAI-1): es una glicoproteína. ALFA-2-MACROGLOBULINA: Es una glicoproteína de síntesis hepática. aunque reacciona más lentamente que la alfa2-antiplasmina. Aparte de inhibir a u-PA. y c) unión covalente con la fibrina. Su vida media es de 2. Se aisló en la orina humana y más tarde fue detectado en plasma. en donde se encuentra a una concentración de 2 µg/ml. inhibidores de los activadores del plasminógeno e inhibidores de la plasmina. de esta manera la vida media de la plasmina ligada a la fibrina es dos a tres veces superior a la de la plasmina libre. tripsina y plasmina. En cuanto a su papel fisiopatológico se han observado cifras elevadas de PAI-1 en situaciones clínicas relacionadas con fenómenos trombóticos. reacciones que se ven aceleradas en presencia de heparina. Reacciona con t-PA y uroquinasa. pero no con scu-PA ni SK. lo que quizás pudiera explicar su falta de afinidad por la fibrina. la molécula forma un complejo 1:1 con la plasmina en dos fases: una muy rápida y reversible y otra más lenta e irreversible. Es el principal inhibidor fisiológico de los activadores tipo t-PA y u-PA y juega un importante papel en la regulación de la fibrinólisis. factor X activado. El compartimento sanguíneo más importante de PAI-1 lo constituyen las plaquetas donde se almacena a nivel de los gránulos alfa y se libera por acción del colágeno y ADP. El PAI-1 plaquetar esta en forma latente. En cuanto a su mecanismo de acción. El hígado y el endotelio vascular también van a contribuir a la presencia en la sangre de este inhibidor. Esta reacción se produce mucho más lentamente cuando los LBS y el centro activo están ocupados. Este inhibidor reacciona débilmente con el Glu-plasminógeno y se une de forma covalente a la cadena alfa de la fibrina durante el proceso de la coagulación. Aproximadamente el 50% del plasminógeno se une a esta proteína. Por consiguiente. INHIBIBORES DE LA PLASMINA: ALFA2-ANTIPLASMINA: Es una glicoproteína que se sintetiza en el hígado. INHIBIDORES DEL SISTEMA FIBRINOLÍTICO Se clasifican en inhibidores competitivos del plasminógeno. b) interferencia con la unión del plasminógeno a la fibrina. La interacción del PAI-1 con los activadores tiene lugar a través de la formación de un complejo a nivel del centro reactivo. a diferencia del t-PA. Consiste en dos moléculas unidas por enlaces no covalentes y forma complejos con diversas proteasas serínicas como trombina. como sucede a nivel de la superficie de la fibrina. PAI-3: Se trata de un inhibidor de los activadores tipo u-PA. carece de afinidad específica por la fibrina. pero a diferencia del t-PA no posee un dominio “finger”. Su papel en la fibrinólisis se basa en inhibir el exceso de plasmina una vez saturada la capacidad inhibitoria de la alfa2-antiplasmina. El plasmático se encuentra fundamentalmente en su forma activa.

Esta gammacarboxilación está producida por una carboxilasa que precisa como cofactor a la vitamina K. Otra fuente muy importante de vitamina K es la proporcionada por la actividad de la flora intestinal normal. FÁRMACOS ANTICOAGULANTES Los anticoagulantes orales pertenecen a dos grandes familias de drogas: las cumarinas y las inandionas. en el hígado y endotelio vascular. principalmente. Como se ha indicado antes. merced a una vitamina K reductasa. X. Los principales factores e inhibidores de la coagulación de síntesis hepática. La vitamina K se encuentra ampliamente distribuida en los alimentos. La actividad de la vitamina K sobre dichos factores no está en relación directa con la síntesis de las moléculas.A. proteína C y S que son.Procesos técnicos normatizados I   Mecanismos fisiológicos (endotelio vascular) Fibrinolisis (disolución del coágulo) Artificiales (farmacológicos)  Quitar el calcio (sólo en el laboratorio)  Inactivar factores de la coagulación (Heparina)  Alterar la síntesis de factores de coagulación: Antagonistas de la vitamina K (Sintron®) ANTICOAGULACIÓN ORAL Todo este complejo sistema está sometido a un complejo proceso de regulaciones. lo que implica que es necesario para su absorción cierto consumo de grasas. mediante la actividad de una vitamina K epóxido reductasa. son los factores IX. II. contraregulaciones y retroalimentaciones. VII. ambos grupos actúan inhibiendo la síntesis de los factores II. dependientes de la vitamina K. La vitamina K (quinona) es transformada después de su absorción en vitamina KH2 (hidroquinona). proteína C y S. especialmente en los vegetales de hoja verde. V. El resultado es la síntesis de factores disfuncionales que son Proc Tecn Norm I Coagulación -7- . II. Los anticoagulante orales del tipo de las cumadinas actúan inhibiendo la actividad de ambas reductasas: La vitamina K reductasa y la vitamina K epóxido reductasa. La vitamina KH2 es transformada en vitamina K epóxido. VII. IX y X. antitrombina III y factor VII. además de tener un origen común. De todos ellos fijaremos nuestra atención en los factores IX. que es el cofactor de la cocarboxilasa dependiente de la vitamina K. interfiriendo con la gammacarboxilación.V.K. sino con modificaciones de última hora que multiplican por varios logaritmos su actividad. fibrinógeno.I. siendo almacenada en esta forma. Los factores no carboxilados se conocen como P. La síntesis de los factores de coagulación se realiza. de cuyo equilibrio depende la hemostasia y la permeabilidad vascular. obviaremos la fibrinolisis por quedar fuera del propósito de este trabajo. (Protein Induced by Vitamin K Absence) y poseen actividad anticoagulante por un mecanismo competitivo sobre los factores carboxilados. Para ser usada debe ser reconvertida en vitamina K de nuevo. X. Los factores vitamina K dependientes poseen un residuo de ácido glutámico en el extremo amino-terminal de la molécula y debe ser carboxilado en posición gamma para optimizar su capacidad para formar complejos activos. Es una vitamina liposoluble.

en la mayoría de los defectos de la función plaquetaria. pero pueden resumirse en una mayor semivida para la warfarina. dosis que resulta inconveniente en pacientes que necesitan dosis pequeñas del anticoagulante. A diferencia de la heparina. Tabla 1 Proteína Factor II Factor VII Factor IX Factor X Proteína C Proteína S Vida media 60 horas o superior 4 a 6 horas 20 a 24 horas 48 a 72 horas 6 horas 42 horas Presentaciones farmacéuticas En nuestro país es ampliamente utilizado el acenocumarol (Sintrom ®).000 a 450.K. Al mismo tiempo. Lo contrario que el acenocumarol. Las diferencias entre los distintos anticoagulantes han sido señaladas antes. en comprimidos de 1. determinará un riesgo tromboembólico aumentado hasta que se alcancen los niveles de anticoagulación necesarios. lo que evita oscilaciones en el nivel de anticoagulación. Como mínimo. en presentaciones de 4 y 1 mg.).000 células/mm3. EVALUACIÓN DE LA FUNCIÓN PLAQUETARIA Las plaquetas son células sanguíneas de forma discoide que circulan en una concentración de 150. En los frotis Chediak-Higashi. deberá ser considerado como un paso integral en la evaluación de todos los pacientes. Al mismo tiempo. son visible grandes gránulos de inclusión. una anisindiona: fenindiona. a cambio de presentar problemas de persistencia del efecto en caso de sobredosificación. En los países anglosajones predomina el uso de la warfarina (Marcumar ®).A. El análisis de laboratorio será dependiente del grado de tecnología disponible. se debe realizar un recuento completo de sangre con frotis de sangre periférico. pero que no muestran actividad coagulante adecuada (P. Las plaquetas pueden parecer grises o descoloridas en el síndrome de plaquetas grises. el descenso de los niveles de proteína C. en Francia es de uso habitual el anticoagulante Previscan ®. Las plaquetas comprenden el componente principal del tapón hemostático primario y son elementos críticos para el mantenimiento de una hemostasia normal. los anticoagulantes orales no tienen actividad anticoagulante per se. No obstante. La presencia de plaquetas grandes pero en cantidades disminuidas con morfología normal de glóbulos rojos y blancos podrían orientarnos a considerar procesos inmuno mediados. por lo tanto. presentada en comprimidos de 20 mg. y. lo que tiene importantes implicaciones que luego comentaremos. tales como defectos de liberación y pool de almacenamiento e incluyendo la trombastenia de Glanzsmann.Procesos técnicos normatizados I detectables con métodos inmunológicos. También disponemos de warfarina (Aldocumar ®) en presentación de 10 mg por comprimido. Las plaquetas pueden estar agrandadas en los síndromes de BernardSoulier y May-Heggelin. revisión de plaquetas y morfología de glóbulos rojos y blancos. y por el mismo motivo. Debido a que estos fármacos no alteran el catabolismo de los factores de coagulación.I. El estudio del frotis de sangre periférico puede ayudar al diagnóstico de muchos trastornos plaquetarios adquiridos. Estas pruebas básicas brindarán información importante al investigador.V. Las plaquetas son pequeñas en tamaño y se encuentran en menores cantidades en el síndrome de Wiskott-Aldrich (eccema en PE). 3 y 5 mg. con actividad inhibidora de la coagulación. Las anormalidades. los efectos anticoagulantes sólo aparecerán cuando se alcance un descenso suficiente de los niveles de dichos factores que dependerán de su tasa individual de degradación. de semivida más corta y menor persistencia del efecto anticoagulante. dada su vida media más corta. interfieren en la síntesis de las proteínas C y S. ya sea en la cantidad de plaquetas o en su funcionamiento. Por el contrario. pueden conducir a una alteración en estos pasos iniciales dando como resultado una tendencia hemorrágica. como el recuento plaquetario. la cantidad de Proc Tecn Norm I Coagulación -8- .

Los tiempos de sangría dependen del operador y deben ser realizados por un individuo con experiencia en este procedimiento.  .0125 mol/l y cloruro de sodio para una concentración final de 0. cuando se realizan con precisión. apunta a un defecto en la función plaquetaria. Los tiempos de sangría normales varían en base al método y a la edad del paciente. Los agonistas comunes empleados en los análisis de la función plaquetaria incluyen ADP.  Por lo tanto la determinación se aplica a:  . PRÁCTICAS: Estudio básico de hemostasia para enfermedades hemorrágicas • Recuento de plaquetas • Tiempo de sangría • Tiempo de protrombina (TP) • Tiempo de tromboplastina parcial activado (KPTT) Tiempo de protrombina (TP) Tromboplastina cálcica para la determinación del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick en una etapa – TP  Es una prueba global para evaluar la coagulación extrínseca.control de la terapéutica con anticoagulantes orales.  El método no detecta deficiencias de factores de la vía intrínseca (VIII. siendo sensible a: factor II o protrombina. Soluplastin: viales conteniendo tromboplastina de cerebro de conejo.5 ml de anticoagulante).estudios de rutina en los análisis prequirúrgicos. colágeno. Un tiempo de sangría prolongado de cara a un recuento plaquetario normal o casi normal. es necesaria una evaluación adicional de la función plaquetaria.5 ml de sangre + 0. se seca cada 15 segundos hasta que se note un cese de sangrado. la dirección del corte es longitudinal para minimizar la cicatriz.Procesos técnicos normatizados I plaquetas y su morfología son normales. colocado a 37oC y en presencia de un exceso de tromboplastina tisular y calcio. Generalmente se logra utilizando un aparato con una plantilla que produce un corte de una longitud y profundidad específica en el antebrazo del paciente (generalmente 5 mm de longitud y 1 mm de profundidad). Las pruebas de función plaquetaria realizadas en un laboratorio requieren equipo y personal especializado. Proc Tecn Norm I Coagulación -9- .1 mol/l. y trombina. éstas proporcionan valiosa información para la categorización de estos trastornos. pruebas de función plaquetaria (que pueden ser realizadas ya sea en sangre completa o en plasma rico en plaquetas). Si se encuentran disponibles. FUNDAMENTOS DEL METODO  Este ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado. a) Recolección: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporción 9 + 1 exacta (ejemplo: 4. pero generalmente se reportan como menos de 9 minutos.  . ristocetina. Se coloca una manga para presión sanguínea en la parte superior del brazo y se infla a 40 mm Hg. factor VII o proconvertina y factor X o Stuart-Prower. Comúnmente. el tiempo de sangría ofrece la única prueba in-vivo para evaluar la función plaquetaria. no la parte superior. Por lo tanto. IX. cloruro de calcio para una concentración final de 0. factor V o proacelerina. XI y XII). ácido araquidónico. Aunque técnicamente sensibles. Otras pruebas de laboratorio que pueden ser usadas para evaluar la función plaquetaria incluyen el tiempo de sangría. Se pueden realizar pruebas específicas de función plaquetaria utilizando evaluación de agregación a un panel de agonistas con plasma rico en plaquetas o a través de agregómetros de sangre completa. epinefrina. El costado de la herida. y retención plaquetaria en burbujas de vidrio.detección de alteraciones en los niveles de uno o más factores involucrados en la vía extrínseca.

Porcentaje de Actividad Protrombínica: 70 ..  En caso de emplear un instrumento de medición. o citrato de sodio 0. 4. Dado que el efecto de los anticoagulantes orales consiste en la reducción de los niveles de los factores vitamina K dependientes.Procesos técnicos normatizados I  Si se emplea Anticoagulante TP de Wiener lab.: 2. 2. visibles o no.100%  R.  .14 seg . Proc Tecn Norm I Coagulación . deben seguirse las instrucciones del fabricante del mismo. con la intención de uniformar el problema de la variabilidad de la expresión de resultados de laboratorio.Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick: 10 . .5 ml de sangre).2 ml de Soluplastin.2. b) Aditivos: para obtener el plasma se debe emplear Anticoagulante TP de Wiener lab.Colocar el plasma (desconocido o control) en baño de agua a 37oC durante 2-3 minutos (no más de 10 minutos).10 - .130 mol/l c) Sustancias interferentes conocidas: .I. 3. Previo al tiempo estimado de coagulación. Si la diferencia entre los replicados de una misma muestra es mayor del 5%.4 .la presencia de heparina o EDTA invalida los resultados.hemólisis visibles dificultan la medición foto-óptica de los resultados PROCEDIMIENTO 1.5 Razón Internacional Normatizada RIN – Razón Internacional Normatizada. . el tiempo de protrombina o tiempo de Quick es el ideal para ese fin. de esta manera un paciente que se controla en diferentes sitios del mundo con reactivos diferentes logramos las mismas intensidades de anticoagulación. sacar el tubo del baño. Mezclar suavemente. Los reactivos más efectivos para este fin son aquellos cuyos ISI son más cercanos al valor de 1 de la tromboplastina patrón.Pipetear 100 ul del plasma preincubado y agregar rápidamente al tubo conteniendo 0.Mantener el tubo dentro del baño y cerca de una fuente de luz. VALORES DE REFERENCIA  El rango de valores obtenidos en pacientes normales oscila  Entre:.Calcular el tiempo promedio de coagulación de la determinación por duplicado para cada plasma (desconocido o control).las contaminaciones. El médico debe exigir la expresión de los resultados del laboratorio con el indispensable valor del RIN.En un tubo de hemólisis. inclinar suavemente una o dos veces por segundo y detener el cronómetro en el momento de la aparición del coágulo 5. disparando simultáneamente el cronómetro. se aconseja repetir el procedimiento desechando los valores anteriores. surgió el concepto del RIN o Razón Internacional Normatizada. sin embargo la variabilidad de la preparación de los reactivos de laboratorio no hace recomendable el simple valor del tiempo de Quick para ese fin. El importante concepto del RIN es la uniformidad que logra en el control del efecto de los anticoagulantes orales. se requerirán7 gotas para 4.Media 12 segundos.2 ml de Soluplastin reconstituido y preincubar a 37oC durante 2-3 minutos (no más de 10 minutos). son causa de tiempos falsamente prolongados. por lo que los diferentes ISI de los diferentes reactivos serán mayores a 1. colocar 0.N. En la década del 80. La fórmula para el cálculo de RIN es la siguiente : ISI Tiempo Quick Paciente ( Seg ) RIN =---------------------------------Tiempo Quick Normal ( Seg ) El ISI o índice de Sensibilidad es la sensibilidad de cada reactivo de tromboplastina calibrado en relación a una tromboplastina patrón cuyo ISI es de 1.  Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos.

025 mol/l. PREPARACION DE LAS MUESTRAS PARA OTROS ESTUDIOS DE HEMOSTASIA Recolección: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporción 9 + 1 exacta (ejemplo: 4. no siendo así con los trastornos plaquetarios. La rapidez. activador y calcio.5 ml de anticoagulante). También permite la identificación rápida de hemofílicos en potencia. a fin de poder someterlos a tratamientos preventivos prequirúrgicos y evitar problemas hemorrágicos. o sea los factores VIII. Luego sacar el tubo del baño.  Sirve para detectar anormalidades en la vía intrínseca de la coagulación. inclinar suavemente una vez por segundo y detener el cronómetro en el momento de la formación del coágulo. FUNDAMENTOS DEL METODO El ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado. Proc Tecn Norm I Coagulación . mantener en el baño unos 25 segundos.  También detecta deficiencias severas de los factores II. Cloruro de Calcio: solución de cloruro de calcio 0. V. En un tubo de hemólisis colocar: Muestra (plasma desconocido o control) 100 ul Reactivo APTT (homogeneizado) 100 ul Mezclar e incubar 3 minutos a 37oC.5 ml de sangre + 0. Agitar brevemente para homogeneizar el contenido. VALORES DE REFERENCIA El intervalo de valores observados en individuos normales oscila entre 33-48 segundos. es una prueba sensible a la deficiencia de factores procoagulantes del plasma así como a la presencia de ciertos inhibidores de la coagulación. Niveles superiores a 3 se reservan exclusivamente para las prótesis valvulares de diseño antiguo como StarrEdwards o Bjork-Sorin. colocado en un baño a 37oC y en presencia de un exceso de cefalina. luego agregar: Cloruro de Calcio (a 37oC) 100 ul Disparar simultáneamente un cronómetro. haciendo constar estos resultados en el informe. como son los factores necesarios para la formación del activador intrínseco de la protrombina. o en casos muy específicos de pacientes que presenten recurrencias trombóticas bajo un nivel adecuado de anticoagulación. Tiempo de Tromboplastina KPTT o APTTest Parcial Activada  El tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT). Tomar nota del tiempo de coagulación.Procesos técnicos normatizados I Un concepto importante a destacar es que el nivel de RIN ideal para tratamiento de la gran mayoría de las patologías trombóticas es de 2 a 3. Se considera fuera de lo normal valores que difieran en más de 6 segundos de un plasma control. X y fibrinógeno. XI y XII. sencillezy reproducibilidad de la prueba la hacen muy adecuada para el control de la terapéutica anticoagulante por heparina. MUESTRA idem TP PROCEDIMIENTO Precalentar el Cloruro de Calcio antes de realizar la prueba en baño de agua a 37oC. REACTIVOS PROVISTOS Reactivo APTT: viales conteniendo cefalina con tierra de diatomeas como activador particulado. las deficiencias de los factores VII y XIII ni los problemas vasculares. IX. Es recomendable que cada laboratorio procese un plasma control con cada lote de reactivos empleado y que correlacionelos valores obtenidos para los pacientes con el de dicho plasma.11 - .

Si es posible. pues disminuyen los errores en el desarrollo de las técnicas.22 µ m. Si se desean almacenar. DOSAJE DE FACTORES VIII. CONSERVACION DE LAS MUESTRAS Las muestras así tratadas se mantienen en ambiente fresco hasta el momento de efectuar los ensayos. Disparar cronómetro.35 Dilución 1/2 1/4 1/8 Concentración 100 % 50 % 25 % El plasma problema se diluye al medio con el mismo buffer. 100 µ l de plasma deficiente diluido al ½ (reconstituido con el mismo buffer por lo menos 15 minutos antes) 100 µ l de la mezcla cefalina/kaolín (partes iguales de ambas.025M precalentado a 37°C. Mover los tubos cada 30 segundos para evitar que se deposite el caolín. Técnica. QUININOGENOS DE ALTO PESO MOLECULAR PRECALICREINA Y Las técnicas de dosaje de estos factores se basan en la prueba de TTPK. El tiempo de coagulación de la mezcla es inversamente proporcional a la concentración porcentual del factor investigado. VII. Estos plasmas normales se obtienen y procesan de la misma forma que las muestras de pacientes a estudiar. se efectúa entonces. obteniéndose así plasma pobre en plaquetas (PPP). una segunda centrifugación con el fin de asegurar que no quedan restos de plaquetas. X A una dilución del plasma problema se le agrega un plasma deficiente en el factor que se va a dosar. utilizando como reactivo un plasma deficiente en el factor a dosar. Otra temperatura nos dará resultados erróneos. Proc Tecn Norm I Coagulación . –70°C). mantenerlas en un baño de hielo fundente.Procesos técnicos normatizados I La sangre recogida se centrifuga a 3000 rpm durante 15 minutos cuidando que la temperatura no sobrepase los 20°C ya que se perderán los factores termolábiles (VIII y V). Una vez centrifugados. Incubar 2 min a 37°C. los plasmas se fraccionan en alícuotas y se congelan. V. 100 µ l de cloruro de calcio 0. estable 2 horas). DOSAJE DE FACTORES II. Cuando se crea necesario (valores menores de 25%) se realizaran diluciones mayores hasta alcanzar el valor porcentual adecuado. se necesitan por lo menos seis plasmas normales con los que se efectúan un control de calidad de los reactivos utilizados. cuidando que al sumergirlas no se llegue a la interfase glóbulos/plasma que es la zona rica en plaquetas. IX. asegurándose de su correcto funcionamiento. XII. cuando ocurre se detiene el cronómetro. de volumen fijo o variable. GENERALIDADES ANTES DE COMENZAR LOS ENSAYOS Todos los días. Técnica general: Curva standard: Si el standard tiene 1 U/dl. Los valores hallados en segundos se interpolan en la curva.12 - . por lo menos. antes de comenzar los ensayos. El tiempo de coagulación de la mezcla es inversamente proporcional a la concentración porcentual del factor investigado. eso se toma como un 100%. a –20°C (cuanto más baja la temperatura mejor es la conservación) teniendo en cuenta que es preferible contar con un freezer que proporcione temperaturas más bajas (p. Observar la formación de coágulo. eso se toma como un 100%.5°C. Se debe controlar la temperatura de los baños termostatizados a fin de que se mantengan en 37°C +/-0. se trasvasan los plasmas a otros tubos de plástico separándolos con pipetas tipo Pasteur plásticas. Métodos alternativos para eliminar las plaquetas son los que utilizan la filtración con membranas de 0. 100 µ l de plasma problema diluido al ½. XI. Se debe contar con varios cronómetros de 60 segundos. Diluciones con buffer pH 7. Es apropiado el uso de pipetas automáticas de diferente graduación. Colocar los tubos de vidrio en el baño a 37 °C para precalentarlos.ej. Técnica general: Curva standard: Si el standard tiene 1 U/dl.

Cuando se crea necesario (valores menores de 25%) se realizaran diluciones mayores hasta alcanzar el valor porcentual adecuado. Acido acético al 2%.85% (solución fisiológica) Carbonato de sodio al 2%. Agua destilada. Disparar cronómetro. colocar dentro de éste una gasa y volcar el coágulo formado. Ajustar el pH a 7. se hace una muñeca y se exprime. Procedimiento: Extracción: 100 ml de plasma se llevan a 1000 ml con agua destilada. Cloruro de calcio 0. Disparar el cronómetro.25 ml de cloruro de calcio al 2% Incubar 1 hora a 37°C El coágulo formado se vuelca sobre un cuadrado de gasa. TIEMPO DE TROMBINA Preparación de la trombina: Reactivos: Plasma citratado humano o bovino.0 con carbonato de sodio. Purificación: (se puede realizar al día siguiente) Colocar en tubo de plástico partes iguales de trombina cruda y acetona. cuando ocurre se detiene el cronómetro. 200 µ l de tromboplastina cálcica precalentada a 37° C.3 con ácido acético. El precipitado que quedó se vuelve a disolver con otros 5 ml de solución fisiológica y el proceso se repite varias veces.13 - . Observar la formación de coágulo. 100 µ l de plasma problema diluido 1/10. Determinación del tiempo de trombina: Se utiliza una trombina diluída en solución fisiológica tal que dosando un plasma pobre de plaquetas normal del día. 100 µ l de plasma deficiente (reconstituido con el mismo buffer por lo menos 15 minutos antes) Incubar de 3 a 5 minutos a 37° C. Se abre la tela para retirar la fibrina Lavar con agua destilada 2 veces y luego con alcohol durante 5 minutos. Disolver el precipitado en 25 ml de solución fisiológica.Procesos técnicos normatizados I Diluciones con buffer Michaelis Dilución Concentración 1/2 100 % 1/4 50 % 1/8 25 % El plasma problema se diluye 1/10 con el mismo buffer. esa trombina debe diluirse con solución fisiológica hasta obtener un tiempo de 19 +/. Agitar vigorosamente durante un tiempo prolongado. Cloruro de sodio 0. Este se redisuelve con 5 ml de solución fisiológico.25 M Acetona.1 seg. 2 seg). Centrifugar y recuperar el sobrenadante que es trombina purificada de alta concentración 8tiempo de trombina aprox. Se agregan 3 ml de cloruro de calcio y se deja 2 horas a temperatura ambiente hasta coagulación completa. Disponer un tubo de plástico con embudo. Exprimirlo y recuperar el líquido que es la trombina cruda. Colocar los tubos de vidrio en el baño a 37° C para precalentarlos. Observar la formación del coágulo. Proc Tecn Norm I Coagulación . Técnica. Centrifugar y descartar el sobrenadante. 100 µ l de plasma problema Incubar 30 segundos 100 µ l de trombina diluída. con varilla de vidrio. Dejar de 2 a 24 horas en heladera (4°C). Ajustar el pH a 5. DOSAJE DE FIBRINOGENO Método gravimétrico: En una probeta de plástico colocar 20 ml de solución fisiológica 1 ml de plasma problema 1. Para poder utilizarla. Los valores hallados en segundos se interpolan en la curva. Se centrifuga y se recupera el precipitado. dé como resultado tiempos entre 18 y 20 segundos.

14 - .NADH. El precipitado de euglobulinas es disuelto. Significado clínico: El tiempo de lisis del coágulo formado en el ensayo es inversamente proporcional a la actividad fibrinolítica plasmática. Es aconsejable hacer el dosaje en paralelo Con un plasma normal. DETERMINACION DEL FACTOR XIII factor estabilizante de la fibrina (Método con Urea 5M) En tubo de vidrio colocar 200 µ l de plasma 200 µ l de cloruro de calcio 0. El consumo de NADH es medido utilizando la absorbancia a 340 nm. Luego de esta incubación observar la presencia o disolución del coágulo. es desarrollada usando una curva de referencia construida a partir de diluciones del Plasma Humano Standard con solución salina fisiológica. colocar un tubo en baño a 37° C para precalentarlo Diluir el plasma problema 1/10 con buffer Owren Colocar 100 µ l de dilución en el tubo. Disparar un cronómetro Visualizar la formación del coágulo. El factor XIII activado se une a un péptido específico de la glicina etilester y libera amonio (NH3). Un tiempo acortado indica presencia de plasmina o aumento de activadores (u otras enzimas proteolíticas) En casos de observarse un test prolongado.025M Incubar 30 minutos en baño a 37 °C Despegar el coágulo formado Agregar 3 ml de Urea 5M (se puede reemplazar por ácido monocloroacético) Dejar 24 hs en baño a 37° C. Por lo tanto se debe observar que el coágulo se haya formado y luego vigilar su desaparición. scuPA) quedando en solución la mayor parte de los inhibidores. Metodología: Se precipitan en medio ácido las euglobulinas del plasma.140%.Reactivo de detección: Sustrato de F XIII Principio del test: La trombina activa el factor XIII de la muestra y convierte el fibrinógeno en fibrina. Resultados en 6 minutos.p. en pacientes con antecedentes Proc Tecn Norm I Coagulación . debe mantenerse en baño de hielo hasta su procesamiento. 3. Esto puede ocasionar la falta de formación del coágulo que se puede confundir con una lisis anormal. Determinación fotométrica de Factor XIII. Método comercial (Berichrom Factor XIII) Características principales: Método cuantitativo automatizado. se pueden hacer diluciones menores (1/5. La velocidad de reacción es proporcional a la concentración del Factor XIII. 1/20. La fibrina formada es mantenida en solución por el inhibidor de coagulación. rango de medida 0 . En esta técnica las principales fuentes de error. Una vez obtenida la muestra. La evaluación en % del normal. Muestra: Plasma citratado. donde se encuentran el fibrinógeno. son la contaminación de los reactivos y la dificultad en la disolución del precipitado de las euglobulinas.m. RANGO DE REFERENCIA: 70 . La sangre se centrifuga 10 minutos a 3000 r.½) o trabajar con el plasma puro. Componentes: 1-Reactivo activador: Trombina bovina 2. hasta peso constante Cálculo: peso de la fibrina x 100 = mg de fibrina/ml - Método de Clauss: El tiempo de coagulación del plasma por acción de un exceso de trombina es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno. En caso de valores que escapan de la curva. plasminógeno y los activadores del plasminógeno (tPA. en medio alcalino y luego es coagulado. Para transformar los segundos en mg/dl de fibrinógeno se debe realizar una curva preparando las siguiendo diluciones de las siguientes diluciones del standard de fibrinógeno: 1/5. 1/40 y dosar el fibrinógeno a cada una de ellas. Incubar 1 minuto Agregar 100 µ l de trombina de concentración conocida. El NADH es oxidado a NAD. Valor de referencia: El coágulo debe permanecer formado entre 2 y 4 horas. sin predilución de la muestra.150%. LISIS DE EUGLOBULINAS Sinonimia: tiempo de fibrinólisis.Procesos técnicos normatizados I Se coloca la fibrina sobre un vidrio de reloj y se lleva a estufa a 110°C. 1/10. El mismo debe llevarse a cabo dentro de los 20 minutos siguientes.

en personas sanas luego del ejercicio.TOS-GLY-PRO-ARG-OH + PARANITROANILINA TROMBINA (405 nm) Sin embargo. En consecuencia.normal. Un ensayo basado en FXa también permite determinar con precisión la AT en pacientes que reciben terapia con heparina. se ha demostrado que un ensayo de AT basado en el factor FXa discrimina mejor entre individuos deficientes en AT e individuos no deficientes en AT que un ensayo basado en la trombina.1% en solución fisiológica. el cofactor II de la heparina presente en el plasma puede inhibir también la trombina añadida y dar lugar a un valor demasiado elevado. AT + Heparin ———> [AT•Heparin] [AT•Heparin] + FXa (excess) —> [AT•Heparin•FXa] + FXa (residual) FXa (residual) + S-2772 ————————> Peptide + pNA COMPLEJO TROMBINA ANTITROMBINA Sinonimia: TATIII.2) Solución de borato de sodio 0. pH aproximado de 5.Procesos técnicos normatizados I trombóticos se deben estudiar los componentes del sistema fibrinolítico pre y post estasis venoso.87 ml de ácido acético al 1%. Aumento de activadores del plasminógeno. déficit de alfa 2 antiplasmina. glicoproteína Vida ½: 2 – 8 días . Utilidad clínica: Screening para la evaluación de la fibrinólisis. causa un tiempo de lisis acortado. venipunción traumática. ANTITROMBINA III Síntesis hepática y endotelio.025M Procedimientos 500 µ l de plasma problema 8 ml de solución agua – ácido acético Incubar 30 minutos en heladera (4° C) Centrifugar 5 minutos a 1500 rpm Descartar sobrenadante invirtiendo el tubo sobre papel de filtro para drenaje completo (aproximadamente 1 minuto) Agregar 500 µ l de solución de borato de sodio para disolver el precipitado (puede ayudarse con una varilla delgada) Agregar 500 µ l de cloruro de calcio 0. presencia de plasmina. heparina potencia su acción INHIBE: IIa IXa Xa XIa DETERMINACION: PLASMA CITRATADO Y SUSTRATO CROMOGENICO La mayoría de ensayos de AT funcionales se basan en la capacidad de AT del plasma de inactivar trombina añadida de forma exógena en presencia de heparina AT III + HEPARINA ---------------(AT III + HEPARINA) (AT III + HEPARINA) + TROMBINA EN EXCESO ------{AT III-HEP-TROMB} + TROMBINA RESTO TOS-GLY-PRO-ARG-pNA + H2O ------------------. Monitoreo de la terapia con uroquinasa. A los pocos minutos se forma un coágulo que debe observarse cada 15 minutos hasta que se produce la lisis. fibrinólisis a Disminuido: Una concentración de fibrinógeno disminuida (menor de 80 mg/dl). TAT Proc Tecn Norm I Coagulación .15 - . Cloruro de calcio 0. Variables preanalíticas: Aumentado: Se prolonga el tiempo de lisis si la concentración de fibrinógeno está aumentada. Es aconsejable hacer el dosaje en paralelo de un plasma normal. COAMATIC ® LR Antithrombin se basa en la inhibición de FXa. estreptoquinasa y tPA.025M y llevar a 37 °C. Reactivos Plasma citratado Solución agua destilada – ácido acético al 1% (100 ml de agua destilada + 1.

· Trombosis venosa profunda (deep) y embolismo pulmonar · Tumores malignos o leucemia mieloide aguda · Predisposición a trombosis · Infarto agudo de miocardio y terapia trombolítica seguido a un evento trombótico Monitoreo del tratamiento en estados de hipercoagulabilidad. no se observan indicios clínicos. Elevadas concentraciones de TATIII y de fragmentos 1+2 sugieren la presencia de hipercoagulabilidad.2 nmol/l si se utiliza el ELISA Significado clínico: El complejo trombina-antitrombina es producido durante la inactivación de la trombina cuando forma un complejo con la antitrombina. BERICHROM ANTITROMBINA III Características principales: Solamente utilizado en analizadores de química clínica Sin interferencia por cofactor II de Heparina. 2. en cambio el TATIII se encuentra en niveles elevados. lo cual puede inducir una formación de trombina o agregación plaquetaria excesiva. La trombina. Enzimas Hepáticas Aumentadas.Reactivo sustrato. ELISA Muestra: plasma citratado pobre en plaquetas. denominada CID preclínica o de bajo grado. ovario y tracto gastrointestinal. Constituye un índice de la generación de trombina. Rápida determinación. Medida de la actividad usando un sustrato cromogénico. La concentración de TATIII está directamente relacionada con la cantidad de trombina que se ha generado. Luego de la terapia con heparina el TAT disminuye volviendo a los valores normales. preeclampsia.16 - . Bajo recuento plaquetario). Variables por drogas Disminuido:: Administración de antitrombina. Síndrome HELLP (Hemólisis. especialmente elevada se observa en la leucemia mieloide aguda.Procesos técnicos normatizados I Método: RIA. leucemia promielocítica e infusión de endotoxina (sepsis). Calibrado contra WHO standards. Proc Tecn Norm I Coagulación . se encuentra como complejo inactivo en forma de trombina-antitrombina (TAT III). Se encuentra aumentado en neoplasias. Esto implica que una alteración en el equilibrio hemostático está presente. Pronóstico de pacientes con cáncer pulmonar: Se ha demostrado que la activación de la coagulación correlaciona con la extensión de la metástasis y tiene un valor pronóstico de la enfermedad. En esta fase. Diagnóstico precoz de CID (coagulación intravascular diseminada) en la fase I (activación compensada del sistema hemostático). en el cáncer de pulmón. usualmente no se encuentra en sangre en forma libre. Valor de referencia: menor de 2 nmol/l si se utiliza RIA menor de 0. Utilidad clínica: Evaluación de activación de la coagulación. Una activación de la coagulación. Screening de estados de hipercoagulabilidad los cuales pueden estar asociados con varias enfermedades primarias y condiciones: · Coagulación intravascular diseminada aguda y crónica. usando Trombina bovina. Componentes: 1. el KPTT y el recuento de plaquetas están dentro de los valores normales. La cuantificación del complejo TATIII se utiliza para determinar la generación y la neutralización de la trombina. Es decir. el TP. Se encuentra elevado en tumores sólidos malignos y leucemias agudas. Variable por enfermedad: Aumentado: En numerosas afecciones asociadas con la activación de la coagulación como tromboembolia venosa.5 IU/ml) y aprotinina.Trombina (bovina) conteniendo Heparina (2. Este complejo es estable y tiene una vida media de 15 minutos por lo tanto es factible su dosaje en plasma por métodos inmunológicos. existe un riesgo incrementado de complicaciones tromboembólicas aunque un evento puede no necesariamente ser gatillado.

La deficiencia heterocigota de PC es un factor que potencia débilmente el riesgo de trombosis. caracterizado por una disminución paralela de la actividad funcional y la concentración plasmática de la proteína. Se encuentra en el 2-5% de los pacientes con tromboembolismo. Principio del test: La heparina del reactivo trombina. que se une a la membrana fosfolipídica e inhibe al FVIII a y FVa por proteólisis limitada. 0 . La trombina. 3.Buffer HEPES: (1 x 30 mL). La proteína C es activada a PCa a través del complejo trombina-trombomodulina. La deficiencia heterocigota tiene una prevalencia de 1/200-1/300 y la deficiencia homocigota alrededor de 1/16000. PROTEÍNA C: Berichrom Protein C Características principales: Sin interferencia por Heparina o Factor VIII. coagulométrico.Procesos técnicos normatizados I 3.17 - . La deficiencia de esta proteína se subdivide en dos tipos: • Tipo I: es el subtipo más frecuente. Por ello. Componentes: 1. Evaluación: La actividad de Proteína C como porcentaje del normal. presente en exceso.Tris Buffer.140% del normal. es determinada de una curva de referencia preparada usando el Plasma Humano Standard. Principio del test: La Proteína C en la muestra del paciente es activada por el veneno de víbora. 2. Rango de referencia: 75 . La trombina remanente libera un colorante del sustrato cromogénico. embolismo pulmonar en el 40% de los casos. dicho riesgo aumenta considerablemente si se asocian a otras alteraciones Proc Tecn Norm I Coagulación . • En pacientes con deficiencia de PC que presentan trombosis. Rango de referencia: 70 . Elisa: inmunológico Muestra: plasma citratado Valor de referencia: PC actividad: 70-140 % PC antigénico: 80-120% Significado clínico: La proteína C (PC) es una glicoproteína vitamina K dependiente.125%.140% del normal. No requiere dilución de la muestra con plasma deficiente. El incremento en absorción es directamente proporcional a la actividad de Proteína C. cliva el sustrato y libera el colorante. El desarrollo de color es inversamente proporcional a la concentración de AT III. Tipo II: se presenta con un trastorno en la actividad funcional de la proteína C. PROTEINA C Sinonimia: PC Método: cromogénico (proteína C funcional). La deficiencia de PC aumenta el riesgo de CID (coagulación intravascular diseminada). tromboflebitis superficial en el 48% de los casos.140%. La PCa forma un complejo con la proteína S y el factor V. en una reacción que depende de calcio. hallándose una actividad funcional reducida y concentraciones antigénicas normales. Rango de medida: 0 . Las formas heterocigotas de la enfermedad muestran unos niveles de PC de un 50% aproximadamente. por ejemplo en presencia de sepsis. de síntesis hepática. La Proteína C activada. es inactivada en proporción a la concentración de AT III. y el color es medido a 405 nm. Esta proteína tiene una vida media de 5-7 horas.Protein C activador: (Agkistrodon contortrix) (3 x 10 ml). activa la AT III en la muestra de plasma. Amplio rango de linealidad. en presencia de calcio y proteína S.Reactivo sustrato: (3 x 3 mL). en la práctica clínica para aumentar la detección de estas anomalías deberían utilizar ensayos funcionales en lugar de inmunológicos. se presentan TVP (trombosis venosa profunda) en el 63% de los casos.

Proviene de la acción de la plasmina sobre la fibrina estabilizada (insoluble). Significado clínico: Cuando la fibrina es clivada por la plasmina. Muestra: plasma citratado Valor de referencia: inferior a 100 ng/ml. puerperio y tratamiento con anticonceptivos orales). Valores superiores a 500 ng/ml sugieren fuertemente coagulación intravascular diseminada. La manifestación clínica más frecuente es la trombosis venosa profunda recurrente. Su presencia confirma que ha ocurrido la formación de trombina y plasmina. turbidimetría. malabsorción. embolismo pulmonar agudo. anticoagulación oral. síndrome distress respiratorio. en ocasiones fatales. warfarina (coumadin). infancia. carcinoma hepatocelular. DIMERO D Sinonimia: producto de degradación de la fibrina Método: aglutinación en placa (látex). insuficiencia renal crónica. Utilidad clínica: Diagnóstico de deficiencia de proteína C y para diferenciar el déficit tipo I del tipo II. coagulación intravascular diseminada y trombosis venosa profunda. Los casos raros de homocigosidad (en los cuales la actividad de la PC es menor del 1%) se asocian con trombosis graves. antibióticos). Los niveles de los productos de degradación del fibrinógeno (PDF) no dímero D pueden estar falsamente elevados con inhibidores de la trombina (como la heparina) y están también elevados en la fibrinólisis primaria o disfrinogenemia. en el período neonatal. Disminuido: Infecciones por Clostridium difficile. adolescencia. Variable por droga: Disminuido: Por disminucion en la disponibilidad de vitamina K (acenocumarol (sintrom). post cirugía. Variable por enfermedad: Aumentado: Diabetes mellitus tipo I. (Métodos cuantitativos). embarazo. CID y trombosis arterial. enzimoinmunoensayo (ELISA).18 - . sepsis. Esto significa que un resultado negativo es excluyente de la activación de la coagulación y consecuentemente de fibrinólisis. FV de Leyden) o factores predisponentes (cirugía. Proc Tecn Norm I Coagulación . El dímero D es uno de estos productos.Procesos técnicos normatizados I genéticas (por ej. se libera un número pequeño de productos de degradación que se encuentran en el plasma en distintas enfermedades en las que ocurre trombosis como infarto agudo de miocardio. El dímero D tiene un valor predictivo negativo superior al 90%. Variables preanalíticas: Disminuido: Presencia de inhibidor lúpico. hepatopatías . El dímero D es un fragmento de la fibrina que contiene una unión intermolecular entre las cadenas gamma de dos monómeros de fibrina pero no el fibrinógeno. cirrosis hepática. angina inestable. deficiencia de vitamina K. presencia de inhibidor lúpico. embolismo pulmonar. CID. La enfermedad se conoce como púrpura fulminante y se caracteriza por necrosis dérmica.

heparina de bajo peso molecular. estreptoquinasa. anticonceptivos orales. factor VIIa.Procesos técnicos normatizados I Utilidad clínica: • Screening antes de una cirugía. bezafibrato. Diagnóstico de coagulación intravascular diseminada. tromboembolismo pulmonar y coagulación intravascular diseminada. trombosis arterial. sinvastatina. Exclusión de trombosis venosa profunda. estrógenos conjugados. para evaluar el riesgo de producir trombosis venosa profunda o tromboembolismo pulmonar. infarto de miocardio agudo. No sirve como diagnóstico debido a su baja especificidad= 40%. ácido tranexámico. Evaluar de una activación fibrinólitica en los pacientes sometidos a cirugía cardíaca con circulación extracorpórea. Usando un límite de corte de 200 ng/ml tiene una sensibilidad=94% y un VPP=92% para trombosis venosa profunda distal. pravastatina.19 - . lidocaína. Monitoreo junto con otros tests durante una terapia trombolítica. urokinasa.factorVIIa. • • • • • • • • Variable por enfermedad: Aumentado: Cáncer colorrectal. Variable por droga: Disminuido:: Aspirina. Proc Tecn Norm I Coagulación . Evaluar casos de coagulación intravascular diseminada (CID). Diagnóstico de degradación de la fibrina. tumores ginecológicos malignos. betabloqueante. 17 beta estradiol. heparina no fraccionada. Es una determinación de urgencia que permite confirmar los resultados hallados por la medición de los productos de degradación del fibrinógeno (altamente sensible). warfarina. trombosis venosa profunda. embolia pulmonar. enfermedad de Crohn. artritis reumatoidea. mujeres con pre-eclampsia. pacientes que han sufrido infarto de miocardio. Diagnóstico de eventos tromboembólicos. simvastatina. activador tisular del plasminogeno. coagulación intravascular diseminada. síndrome nefrótico. Aumentado: Terapia antiplaquetaria. prostaciclina. cirrosis hepática. angina inestable o coagulación intravascular diseminada.

VALORES DE REFERENCIA: 85 – 140 % VALORES DE REFERENCIA: 19 – 31 mg/dl VALORES DE REFERENCIA: <250 mg/L VALORES DE REFERENCIA: 50 – 150 % VALORES DE REFERENCIA: 62 – 139 % VALORES DE REFERENCIA: 50 – 150 % VALORES DE REFERENCIA: 50 – 150 % VALORES DE REFERENCIA: 65 – 150 % VALORES DE REFERENCIA: 77 – 131 % VALORES DE REFERENCIA: 65 – 150 % VALORES DE REFERENCIA: 50 – 150 % VALORES DE REFERENCIA: 60 – 150 % VALORES DE REFERENCIA: Antitrombina III (actividad) Antitrombina III (proteína) Dímero D Factor II Factor V Factor VII Factor VIII Factor IX Factor X Factor XI Factor XII Factor XIII Factor Von Willebrand (actividad) Factor Von Willebrand (antigénico) Fibrinógeno Función plaquetar colágeno/ADP Función plaquetar colágeno/epinefrina Inhibidor de la plasmita Plasminógeno Proteína C funcional Proteína S libre Resistencia a la proteína C activada Tiempo de protrombina Tiempo de reptilase Tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) Tiempo de trombina Grupo sanguíneo 0 Grupo sanguíneo A.000 12 . B. B.Procesos técnicos normatizados I HEMOSTASIA MUESTRA: plasma (CITRATADO).000 11 .40 175 .80 15 .300 < 10 RN de término 150.15 30 .20 - . AB VALORES DE REFERENCIA: Grupo sanguíneo 0 Grupo sanguíneo A.000 – 400.000 – 400.400 < 10 Proc Tecn Norm I Coagulación .16 30 .16 % % % % > 75 % 15 – 25 segundos 27 – 37 seg 15 – 25 seg Exámenes de coagulación en el RN: valores normales Prematuro Rcto de plaquetas x mm3 Tiempo de protrombina (seg) Tiempo parcial de TP Fibrinógeno (mg/dl) PDF (mg/ml) 150. AB VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: 40 – 126 % 49 – 163 % 42 – 141 % 66 – 176 % 200 – 400 mg/dl 0 – 120 segundos 0 – 160 segundos 89 – 118 73 – 127 70 – 150 54 – 146 >2.