Procesos técnicos normatizados I

PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS NORMATIZADOS I

AÑO 2010
UNIDAD Nº 1: HEMOSTASIA

FISIOLOGÍA DE LA HEMOSTASIA
El sistema hemostático es un complejo sistema diseñado y balanceado para mantener el flujo sanguíneo, exponer los vasos sanguíneos, y sellar las superficies dañadas para minimizar pérdidas de sangre y promover la restauración de la angioarquitectura normal. Otro sinónimo :Es el conjunto de mecanismos la fluidez de la sangre y la integridad vascular fisiológicos que mantienen

OTRA: • Cascada de activación enzimática: Reacción en cadena. • Permite amplificar el efecto de factores de la coagulación, presentes a bajísimas concentraciones en la sangre. • Los factores de la coagulación se encuentran en forma de precursores inactivos: proenzimas o zimógenos El sistema hemostático consiste de: • Factores de la coagulación: proteínas producidas principalmente por el hígado que, a través de la cascada de la coagulación, forman fibrina; • Plaquetas: elementos celulares que se adhieren a un área lesionada y forman el tapón hemostático inicial; • Factores fibrinolíticos: enzimas que disuelven el coágulo después que el área lesionada ha sido sellada y reparada; • Inhibidores: factores de la coagulación que ayudan a localizar el coágulo en el área lesionada e impiden una propagación anormal; y • Células endoteliales: células que tapizan los vasos sanguíneos. En un estado imperturbado, contribuyen a mantener el flujo sanguíneo y en un estado alterado, liberan sustancias para promover la coagulación, activar inhibidores, y la fibrinólisis. La sangre circula a través de los vasos sanguíneos sin que se produzca activación plaquetaria o de la coagulación y sin que se produzca tampoco hemorragia apreciable. La lesión de un vaso sanguíneo desencadena el proceso hemostático, comenzando con la adhesión de las plaquetas al endotelio dañado o a las estructuras subendoteliales expuestas. Simultáneamente, proteínas de la fase fluida del plasma reaccionan con el subendotelio e inician la activación por contacto de la coagulación. Los tejidos expuestos, o los macrófagos que se hallan en la matriz extracelular del vaso, exponen factor tisular (FT) o tromboplastina a la sangre, disparándose de esta forma la fase extrínseca de la coagulación. HEMOSTASIA PRIMARIA Adhesión plaquetaria: El proceso de adhesión comprende el transporte por difusión de las plaquetas hacia la superficie reactiva y la interacción de los receptores de la membrana plaquetaria con sus ligandos en las estructuras de la pared lesionada. Entre las proteínas adhesivas de la matriz se incluyen el colágeno, la fibronectina, el factor de von Willebrand y la vitronectina. Las plaquetas no se adhieren a las células vasculares endoteliales normales, pero en áreas de disrupción endotelial sí lo hacen a varios componentes del tejido conectivo subendotelial. En los segundos siguientes a la lesión, las
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plaquetas se adhieren a las fibrillas de colágeno del subendotelio vascular a través de un receptor, la glicoproteína Ib/IIa. Esta interacción está estabilizada por el factor von Willebrand (vW), una glicoproteína adhesiva que permite a las plaquetas permanecer unidas a la pared del vaso. El factor de von Willebrand realiza esta función formando un enlace entre un receptor plaquetario situado en la glicoproteína I y las fibrillas de colágeno subendoteliales. Una vez adheridas al subendotelio, las plaquetas se extienden sobre la superficie y plaquetas adicionales aportadas por el flujo sanguíneo se unen, primero a la placa de plaquetas adheridas y, eventualmente, una a otra formando las masas de agregados plaquetarios. o Adhesión:las plaquetas se adhieren la superficie dañada o Activación:liberación de sustancias que activan más plaquetas (realimentación positiva: amplificación) o Agregación Secreción de los gránulos y agregación plaquetaria: Al igual que ocurre en otras células, la activación y secreción plaquetaria están reguladas por cambios en el nivel de nucleótidos cíclicos, por el flujo de entrada de calcio, por la hidrólisis de los fosfolípidos y por la fosforilación de proteínas intracelulares críticas. Entre los agonistas para las plaquetas que se han estudiado in vitro, los que tienen mayor relevancia fisiológica parecen ser la trombina, el ADP, la adrenalina, el colágeno, y el ácido araquidónico. Existen receptores específicos en la superficie de la plaqueta para cada uno de estos agonistas y dichos receptores están enlazados a estructuras intracelulares, conduciendo a cambios intracelulares que caracterizan a la plaqueta activada. Un mecanismo común a varios de los agonistas es una elevación en la concentración plasmática de calcio ionizado. La unión de agonistas a receptores de la superficie de las plaquetas, activa dos enzimas de la membrana: fosfolipasa C y fosfolipasa A2. La activación de la fosfolipasa A2 conlleva a la liberación de ácido araquidónico libre que se convierte por último en el potente agregante plaquetario tromboxano A2 (TxA2) facilitando el transporte de calcio a través de las membranas intercelulares, con redistribución del calcio hacia el citoplasma. La activación de la fosfolipasa C produce la hidrólisis del fosfolípido de membrana fosfatidilinositol 4.5 bifosfato (PIP2), liberando diacilglicerol (DAG) e inositoltrifosfato (IP3). El IP3 interviene en el movimiento de calcio dentro del citosol plaquetario y estimula la fosforilación de las cadenas ligeras de miosina. Esta última interactúa con la actina para facilitar el movimiento de los gránulos y el cambio de forma de las plaquetas. El resultado de todos estos mecanismos de activación tiene tres efectos principales: 1) la secreción del contenido de los gránulos intracelulares de la plaqueta; 2) la exposición de receptores de superficie para las proteínas plasmáticas (particularmente fibrinógeno y factor de vW); y 3) la alteración de la estructura lipídica de la membrana plaquetaria, que induce la aceleración de la coagulación plasmática.
Tras la activación, las plaquetas secretan al plasma su contenido en gránulos. Las plaquetas activadas se unen entre sí mediante fibrinógeno, a través de los receptores de glicoproteína IIb/IIIa, fijando plaquetas adyacentes y formando un trombo hemostático. Estos compuestos actúan como potentes inductores de la agregación plaquetaria al promover lugares de unión plaquetarios (glicoproteína IIb/IIIa) para el fibrinógeno y factor de vW, paso esencial en el proceso de la agregación. La segunda vía dependiente de la liberación de TxA2 es a través de la ciclooxigenasa y de la tromboxano-sintetasa, al actuar respectivamente en el ácido araquidónico y en los endoperóxidos cíclicos. El TxA2 promueve la movilización de calcio intracelular y también cambios en la estructura de la glicoproteína IIb/IIIa, que llevan a la exposición de lugares de unión al fibrinógeno previamente ocultos. El TxA2 no sólo es un potente agregante plaquetario, sino que también induce vasoconstricción. La tercera vía de la activación plaquetaria está mediada por la colágena y la trombina, las cuales pueden directamente estimular la liberación de factor de activación plaquetaria, favoreciendo la interacción de fibrinógeno y factor von Willebrand con el receptor glicoproteína IIb/IIIa.

Resumiendo la hemostasia primaria comprende • Fase de vasoconstricción parietal: • Liberación de factores tisulares de coagulación • Fase endotelial-trombocitaria: • Activación de plaquetas • Resultado: • Formación de un tapón inestable de plaquetas (3-5 min)

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y la extrínseca. son transformadas en enzimas. Adhesión de plaquetas a la matriz subendotelial expuesta 4. Vasoconstricción mediada por serotonina 3. lipoproteínas e iones como son el factor V activado (FVa). activan a otros factores. factor Fizgerald) • • • Los factores de coagulación se encuentran en el plasma en forma de proenzimas que una vez activadas. generalmente mediante proteólisis parcial. Agregación irreversible de plaquetas dependiente de trombina HEMOSTASIA SECUNDARIA Mientras se está formando el tapón hemostásico primario.CE. confluyen en la activación del factor X. requiere la combinación de una serie de proteínas. juntas. el calcio y los fosfolípidos.Procesos técnicos normatizados I • • • • • • • • SECUENCIA: 1. iniciada por el factor tisular o factor III. Punción o lesión vascular 2. a su vez. factor tisular) Fibroblastos. Activación plaquetaria 5.CE • Factor IX ( factor Christmas. verdadera llave que regula la intensidad del proceso de coagulación. en un proceso en cascada que culmina. en la activación de la fibrinólisis y disolución del mismo.Megac. Inicio de la síntesis de factores de coagulación: TROMBINA 8. La transformación del factor X en factor X activado (FXa). Agregación reversible de plaquetas 6.. Monocitos • Factor IV (calcio) • Factor V (factor lábil) Megac. mediada "in vivo" por el colágeno y demás proteínas con fuerte carga negativa. serín proteasas en su mayor parte que. Ambas vías se encuentran íntimamente relacionadas entre sí a la altura de la activación del factor IX y. Por motivos pedagógicos se ha clasificado la hemostasia en dos grandes vías: la vía intrínseca. cuya activación se realiza en la llamada fase de contacto. El Proc Tecn Norm I Coagulación -3- . por un lado en la formación del coágulo y.. factor antihemofílico B) HEPATOCITOS • Factor X (factor Stuart ) HEPATOCITOS • Factor XI (factor antihemofílico C) HEPATOCITOS • Factor XII (factor Hageman) HEPATOCITOS • Factor XIII (factor estabilizante de la fibrina) HEPATOCITOS Otros factores: • Prekalikreina (factor Fletcher) • Kininógeno de alto peso molecular (HMWK. Vía Intrínseca Vía extrínseca Factor I (fibrinógeno) HEPATOCITOS Factor II (protrombina) HEPATOCITOS Factor III (tromboplastina.Hepatocitos • Factor VII (factor estable) HEPATOCITOS • Factor VIII (factor antihemofílico A) Hepat. por otro. las proteínas plasmáticas de la coagulación se activan para iniciar la hemostasia secundaria. Liberación de factores plaquetarios 7.

precisando también la presencia de calcio. 2) toda la plasmina que penetra en la circulación es rápidamente unida y neutralizada por el inhibidor alfa2-antiplasmina y 3) las células endoteliales liberan un inhibidor del activador de plasminógeno (PAI 1). esta reacción permanece localizada porque 1) el tPA activa el plasminógeno con más eficacia cuando está absorbido en los coágulos de fibrina. en plasmina. Activación del sistema de coagulación y formación del trombo La lesión en la pared del vaso conduce no sólo a la adhesión plaquetaria a la superficie expuesta y a la consiguiente agregación plaquetaria. VIII y XIII y estimula la agregación y secreción plaquetarias. el crecimiento de la masa trombótica compuesta de plaquetas. Aunque la conversión de la protrombina puede tener lugar en diversas superficies ricas en fosfolípidos. se acelera varios miles de veces en la superficie de las plaquetas activadas. que bloquea la acción del tPA. el calcio y el factor tisular. Existen tres activadores principales del sistema fibrinolítico: fragmentos del factor Hageman. La plasmina degrada entonces el polímero de fibrina en fragmentos pequeños (pdf) que son eliminados por el sistema de limpieza de los monocitos-macrófagos. además de ser un potente activador plaquetario. se forma un complejo entre el factor VII. La finalidad de ambas vías es la activación del factor X. La vía intrínseca o de contacto. Aunque la plasmina puede degradar también el fibrinógeno. forman un complejo sobre el colágeno del subendotelio vascular. una lipoproteína que está en casi todas las membranas celulares y que queda expuesta después de una lesión celular. cataliza la formación de fibrinógeno a fibrina y promueve su polimerización.Procesos técnicos normatizados I complejo así resultante es capaz de activar. Tras la liberación de fibrinopéptidos A y B de las cadenas alfa y beta del fibrinógeno. necesaria para la transformación de protrombina en trombina. sino también a una marcada activación de la coagulación tanto por la vía intrínseca como extrínseca. un cininógeno de alto peso molecular y la precalicreina). En la vía extrínseca o del factor tisular. difunde desde las células endoteliales y convierte al plasminógeno. factor V y fosfolípidos. La trombina tiene múltiples funciones en la hemostasia. Aunque su papel principal es la conversión de fibrinógeno en fibrina. El polímero de fibrina es estabilizado entonces por el enlace cruzado de cadenas individuales mediante el factor XIII. tanto naturales como artificiales. el factor II o protrombina a trombina enzima eje del sistema de coagulación y fibrinólisis. la cual. absorbido en el coágulo de fibrina. De esta forma. principal activador fisiológico. también activa los factores V. la molécula modificada. se polimeriza en un gel insoluble. El tPA. por proteolisis limitada. urocinasa (UK) y activador tisular del plasminógeno (tPA). Proc Tecn Norm I Coagulación -4- . como consecuencia del paso de fibrinógeno a fibrina: FIBRINOGENO (soluble) ---. ahora denominada monómero de fibrina. formándose trombina. fibrina y eritrocitos puede oponerse a la fuerza del flujo sanguíneo.FIBRINA (insoluble) Coágulo blando Coágulo estable FIBRINOLISIS FISIOLÓGICA Fibrinolisis: • Cicatrización del tejido vascular lesionado • Destrucción enzimática de la red de fibrina Resultado: • Situación hemostática normal (48-72 horas) La lisis del coágulo y la reparación del vaso comienzan inmediatamente después de la formación del tapón hemostático definitivo. RESUMIENDO Fase de formación de trombina: • Cascada de activación de enzimas y factores Fase de formación de fibrina: • Producción de una red insoluble de proteína Resultado: Estabilización y fijación del coágulo (5-10 min) La sangre cambia desde un estado fluido a un estado de gel. en la que tres proteínas plasmáticas (el factor Hageman.

lo que favorecería la formación local de plasmina y la degradación de la fibrina “in situ”. los cuales poseen mayor afinidad por la fibrina y se activan más fácilmente por los activadores fibrinolíticos. Actualmente se ha demostrado que la calicreina puede activar una forma proenzimática de la UK. aprox. Además tiene una gran importancia en el área terapéutica por la aplicación creciente de fármacos fibrinolíticos en el tratamiento de la trombosis. denominadas Lisplasminógeno. Su concentración plasmática es aproximadamente de 1-6ng/ml.2 días. que induciría un cambio de conformación de la enzima y el sustrato. valina o metionina en dicha posición. su concentración plasmática es de 20 mg/dl y su vida media de 2. especialmente en el infarto agudo de miocardio (IAM). Es un activador directo del plasminógeno Proc Tecn Norm I Coagulación -5- . la actividad fibrinolítica plasmática puede aumentar o disminuir dependiendo de una serie de factores. En la región amino-terminal existen cinco estructuras (kringles = anillos) que son los lugares por los que el plasminógeno va a unirse específicamente a la fibrina. ACTIVADORES TIPO UROQUINASA (UK) Y PROUROQUINASA (u-PA y scu-PA): La UK es una proteasa serínica similar a la tripsina. El t-PA es sintetizado por las células endoteliales y liberado a la circulación por diversos estímulos. El centro activo está localizado en la cadena ligera. En su forma nativa el plasminógeno contiene ácido glutámico en posición aminoterminal (Glu-plasminógeno). PLASMINÓGENO Es una glicoproteína monocatenaria sintetizada en el hígado. ACTIVADORES DEL PLASMINÓGENO La activación del plasminógeno a plasmina tiene lugar por escisión del enlace Arg561-Val562 en la molécula del Glu-plasminógeno por acción de los diferentes activadores. van a jugar un papel fundamental en la regulación de la fibrinólisis. Por lo referente a su mecanismo de acción. una propiedad importante del t-PA es su gran afinidad por la fibrina. pudiendo ser convertido por pequeñas cantidades de plasmina a formas con lisina. la formación de complejos inactivos entre el t-PA y su inhibidor específico es debida a una interacción con el centro activo y la eliminación del t-PA de la circulación a través del hígado. denominadas precursores. 1.000 veces. La cadena pesada A contiene una región denominada dominio “finger”. siendo la plasmina el enzima responsable de dicha degradación. siendo su vida media de 5 minutos. La principal vía de eliminación del t-PA es a través del hígado. actualmente se sabe que existen otras sustancias en la sangre. por tanto. como la precalicreína o el quininógeno de alto peso molecular (HMWK) que pueden inducir la activación del plasminógeno. la activación del plasminógeno y la formación de plasmina. habiéndose sugerido que éste sería el principal mecanismo de activación de la fibrinólisis intrínseca. ACTIVACIÓN INTRÍNSECA DEL PLASMINÓGENO: Fue denominada inicialmente activación por contacto o XII-dependiente. compuesta por dos cadenas polipeptídicas unidas por un puente disulfuro. La activación del sistema fibrinolítico es esencial para eliminar depósitos intravasculares de fibrina resultantes de la activación fisiológica o patológica del sistema de coagulación. Por tanto. Cada una de las estructuras anteriores tiene su función: la fijación del t-PA a la fibrina se hace a través de los dominios “finger” y “kringle”. una estructura similar al factor de crecimiento epidérmico (dominio-EGF) y dos “kringles” similares a los del plasminógeno. La fibrinolisis es un proceso específico de disolución de fibrina por proteasas sanguíneas. lo que se ha explicado por la formación de un complejo ternario entre el t-PA y el plasminógeno a nivel de la superficie de la fibrina. También van a mediar la interacción del plasminógeno con la alfa2-antiplasmina y.Procesos técnicos normatizados I La producción de plasmina libre en la superficie del trombo conduce a la lisis de la fibrina y esto es muy importante para el mantenimiento de la permeabilidad vascular. ACTIVADOR TISULAR DEL PLASMINÓGENO (t-PA): El t-PA en su forma nativa es una proteasa serínica monocatenaria la cual puede ser convertida en una molécula de doble cadena por acción de la plasmina. mientras que ésta estimula significativamente. El t-PA es una enzima débil en ausencia de fibrina. La activación del factor XII conduce a la generación de calicreina que va a ser un potente activador de la fibrinólisis intrínseca. Además el plasminógeno se une a través de los LBS a la célula endotelial lo que favorece su activación a nivel local. supone el reconocimiento por parte del receptor hepático del dominio EGF. La plasmina así formada es una serín-proteasa bicatenaria compuesta por una cadena pesada derivada de la porción amino-terminal y 5 “kringles” y una cadena ligera que contiene el centro activo.

y c) unión covalente con la fibrina. haciendo que ésta sea más resistente a la acción de la plasmina. pero no con scu-PA ni SK. INHIBIDOR DEL PLASMINÓGENO: Es una glicoproteína rica en histidina. En cuanto a su mecanismo de acción. PAI-3: Se trata de un inhibidor de los activadores tipo u-PA. ALFA-2-MACROGLOBULINA: Es una glicoproteína de síntesis hepática. Se aisló en la orina humana y más tarde fue detectado en plasma. El plasmático se encuentra fundamentalmente en su forma activa. Reacciona con t-PA y uroquinasa. El PAI-1 plaquetar esta en forma latente. Aparte de inhibir a u-PA. Consiste en dos moléculas unidas por enlaces no covalentes y forma complejos con diversas proteasas serínicas como trombina. factor XI activado y kalicreina. inhibidores de los activadores del plasminógeno e inhibidores de la plasmina. en donde se encuentra a una concentración de 2 µg/ml. tripsina y plasmina. ya que activa indiscriminadamente tanto al plasminógeno circulante como al unido a la fibrina. Es el principal inhibidor fisiológico de la plasmina y representa el 75% de la actividad antiplasmínica del plasma. con liberación de un péptido intermedio. pero a diferencia del t-PA no posee un dominio “finger”. carece de afinidad específica por la fibrina. Este inhibidor reacciona débilmente con el Glu-plasminógeno y se une de forma covalente a la cadena alfa de la fibrina durante el proceso de la coagulación. Este inhibidor es sintetizado por células endoteliales y hepatocitos. Es el principal inhibidor fisiológico de los activadores tipo t-PA y u-PA y juega un importante papel en la regulación de la fibrinólisis. La interacción tiene lugar entre los LBS y el centro activo serina de la plasmina con los lugares correspondientes de la alfa2-AP. Aproximadamente el 50% del plasminógeno se une a esta proteína. Su papel en la fibrinólisis se basa en inhibir el exceso de plasmina una vez saturada la capacidad inhibitoria de la alfa2-antiplasmina. de esta manera la vida media de la plasmina ligada a la fibrina es dos a tres veces superior a la de la plasmina libre. siendo su vida media de 10 minutos. ANTICOAGULANTES Naturales (fisiológicos)  Factores físicos (flujo alto y baja viscosidad) Proc Tecn Norm I Coagulación -6- . a diferencia del t-PA. El compartimento sanguíneo más importante de PAI-1 lo constituyen las plaquetas donde se almacena a nivel de los gránulos alfa y se libera por acción del colágeno y ADP. Esta reacción se produce mucho más lentamente cuando los LBS y el centro activo están ocupados. aunque reacciona más lentamente que la alfa2-antiplasmina. está presente en los gránulos alfa de las plaquetas (90%) y en el plasma (10%) donde circula en forma activa ligado a una proteína estabilizadora (vitronectina). Por consiguiente. La prouroquinasa (scu-PA) es una glicoproteína monocatenaria. factor X activado. INHIBIBORES DE LA PLASMINA: ALFA2-ANTIPLASMINA: Es una glicoproteína que se sintetiza en el hígado. INHIBIDORES DE LOS ACTIVADORES DEL PLASMINÓGENO: TIPO ENDOTELIAL (PAI-1): es una glicoproteína. como sucede a nivel de la superficie de la fibrina. INHIBIDORES DEL SISTEMA FIBRINOLÍTICO Se clasifican en inhibidores competitivos del plasminógeno. El hígado y el endotelio vascular también van a contribuir a la presencia en la sangre de este inhibidor.6 días y su concentración plasmática de 1 µ M. mientras que varios miembros de familias con déficit de PAI-1 presentaron una moderada o severa sintomatología hemorrágica. La interacción del PAI-1 con los activadores tiene lugar a través de la formación de un complejo a nivel del centro reactivo. lo que quizás pudiera explicar su falta de afinidad por la fibrina. se podría concluir que la alfa2-AP ejerce su efecto inhibitorio sobre la fibrinólisis a tres niveles: a) inactivación rápida de la plasmina.Procesos técnicos normatizados I con formación de Glu-plasmina pero. b) interferencia con la unión del plasminógeno a la fibrina. inhibe de forma competitiva al plasminógeno por el que tiene afinidad a nivel de los LBS. la molécula forma un complejo 1:1 con la plasmina en dos fases: una muy rápida y reversible y otra más lenta e irreversible. La porción aminoterminal contiene una región homóloga al factor de crecimiento epidérmico y otra similar a los “kringles” del plasminógeno. también neutraliza a la trombina. pudiendo ser reactivado in vivo. Su vida media es de 2. lo que reduce la cantidad de plasminógeno que puede unirse a la fibrina durante el proceso de coagulación. En cuanto a su papel fisiopatológico se han observado cifras elevadas de PAI-1 en situaciones clínicas relacionadas con fenómenos trombóticos. reacciones que se ven aceleradas en presencia de heparina. Durante la agregación plaquetar se produce un marcado aumento de los niveles de inhibidor.

interfiriendo con la gammacarboxilación. de cuyo equilibrio depende la hemostasia y la permeabilidad vascular. Los principales factores e inhibidores de la coagulación de síntesis hepática. El resultado es la síntesis de factores disfuncionales que son Proc Tecn Norm I Coagulación -7- . V. (Protein Induced by Vitamin K Absence) y poseen actividad anticoagulante por un mecanismo competitivo sobre los factores carboxilados. La vitamina K (quinona) es transformada después de su absorción en vitamina KH2 (hidroquinona). Otra fuente muy importante de vitamina K es la proporcionada por la actividad de la flora intestinal normal. Para ser usada debe ser reconvertida en vitamina K de nuevo.Procesos técnicos normatizados I   Mecanismos fisiológicos (endotelio vascular) Fibrinolisis (disolución del coágulo) Artificiales (farmacológicos)  Quitar el calcio (sólo en el laboratorio)  Inactivar factores de la coagulación (Heparina)  Alterar la síntesis de factores de coagulación: Antagonistas de la vitamina K (Sintron®) ANTICOAGULACIÓN ORAL Todo este complejo sistema está sometido a un complejo proceso de regulaciones.K. VII. principalmente. Los factores no carboxilados se conocen como P. proteína C y S que son. VII. La actividad de la vitamina K sobre dichos factores no está en relación directa con la síntesis de las moléculas. especialmente en los vegetales de hoja verde. La vitamina K se encuentra ampliamente distribuida en los alimentos. Esta gammacarboxilación está producida por una carboxilasa que precisa como cofactor a la vitamina K. dependientes de la vitamina K. que es el cofactor de la cocarboxilasa dependiente de la vitamina K. son los factores IX. Es una vitamina liposoluble. sino con modificaciones de última hora que multiplican por varios logaritmos su actividad. X. De todos ellos fijaremos nuestra atención en los factores IX. IX y X. siendo almacenada en esta forma. II.V.I. La síntesis de los factores de coagulación se realiza. Como se ha indicado antes. II. merced a una vitamina K reductasa. mediante la actividad de una vitamina K epóxido reductasa. La vitamina KH2 es transformada en vitamina K epóxido. Los anticoagulante orales del tipo de las cumadinas actúan inhibiendo la actividad de ambas reductasas: La vitamina K reductasa y la vitamina K epóxido reductasa. Los factores vitamina K dependientes poseen un residuo de ácido glutámico en el extremo amino-terminal de la molécula y debe ser carboxilado en posición gamma para optimizar su capacidad para formar complejos activos. ambos grupos actúan inhibiendo la síntesis de los factores II. obviaremos la fibrinolisis por quedar fuera del propósito de este trabajo. contraregulaciones y retroalimentaciones. en el hígado y endotelio vascular. antitrombina III y factor VII. proteína C y S. X. FÁRMACOS ANTICOAGULANTES Los anticoagulantes orales pertenecen a dos grandes familias de drogas: las cumarinas y las inandionas.A. fibrinógeno. lo que implica que es necesario para su absorción cierto consumo de grasas. además de tener un origen común.

y. revisión de plaquetas y morfología de glóbulos rojos y blancos.000 a 450. con actividad inhibidora de la coagulación. deberá ser considerado como un paso integral en la evaluación de todos los pacientes. El análisis de laboratorio será dependiente del grado de tecnología disponible. También disponemos de warfarina (Aldocumar ®) en presentación de 10 mg por comprimido. Al mismo tiempo. lo que evita oscilaciones en el nivel de anticoagulación. pueden conducir a una alteración en estos pasos iniciales dando como resultado una tendencia hemorrágica. los efectos anticoagulantes sólo aparecerán cuando se alcance un descenso suficiente de los niveles de dichos factores que dependerán de su tasa individual de degradación. Las plaquetas pueden estar agrandadas en los síndromes de BernardSoulier y May-Heggelin. son visible grandes gránulos de inclusión. tales como defectos de liberación y pool de almacenamiento e incluyendo la trombastenia de Glanzsmann. Lo contrario que el acenocumarol. presentada en comprimidos de 20 mg. Las plaquetas comprenden el componente principal del tapón hemostático primario y son elementos críticos para el mantenimiento de una hemostasia normal. los anticoagulantes orales no tienen actividad anticoagulante per se. a cambio de presentar problemas de persistencia del efecto en caso de sobredosificación.K. en presentaciones de 4 y 1 mg. En los frotis Chediak-Higashi. pero que no muestran actividad coagulante adecuada (P. Las plaquetas pueden parecer grises o descoloridas en el síndrome de plaquetas grises. la cantidad de Proc Tecn Norm I Coagulación -8- . Estas pruebas básicas brindarán información importante al investigador. ya sea en la cantidad de plaquetas o en su funcionamiento. en la mayoría de los defectos de la función plaquetaria. Como mínimo. y por el mismo motivo. el descenso de los niveles de proteína C. A diferencia de la heparina. Tabla 1 Proteína Factor II Factor VII Factor IX Factor X Proteína C Proteína S Vida media 60 horas o superior 4 a 6 horas 20 a 24 horas 48 a 72 horas 6 horas 42 horas Presentaciones farmacéuticas En nuestro país es ampliamente utilizado el acenocumarol (Sintrom ®). se debe realizar un recuento completo de sangre con frotis de sangre periférico.000 células/mm3. lo que tiene importantes implicaciones que luego comentaremos. pero pueden resumirse en una mayor semivida para la warfarina. en comprimidos de 1. Por el contrario. Las plaquetas son pequeñas en tamaño y se encuentran en menores cantidades en el síndrome de Wiskott-Aldrich (eccema en PE). Las anormalidades. Las diferencias entre los distintos anticoagulantes han sido señaladas antes. Debido a que estos fármacos no alteran el catabolismo de los factores de coagulación. EVALUACIÓN DE LA FUNCIÓN PLAQUETARIA Las plaquetas son células sanguíneas de forma discoide que circulan en una concentración de 150.A. La presencia de plaquetas grandes pero en cantidades disminuidas con morfología normal de glóbulos rojos y blancos podrían orientarnos a considerar procesos inmuno mediados. una anisindiona: fenindiona. En los países anglosajones predomina el uso de la warfarina (Marcumar ®). No obstante. dada su vida media más corta.V. determinará un riesgo tromboembólico aumentado hasta que se alcancen los niveles de anticoagulación necesarios. interfieren en la síntesis de las proteínas C y S.I. como el recuento plaquetario. por lo tanto.Procesos técnicos normatizados I detectables con métodos inmunológicos. en Francia es de uso habitual el anticoagulante Previscan ®. de semivida más corta y menor persistencia del efecto anticoagulante.). Al mismo tiempo. 3 y 5 mg. El estudio del frotis de sangre periférico puede ayudar al diagnóstico de muchos trastornos plaquetarios adquiridos. dosis que resulta inconveniente en pacientes que necesitan dosis pequeñas del anticoagulante.

 . pruebas de función plaquetaria (que pueden ser realizadas ya sea en sangre completa o en plasma rico en plaquetas).  .  El método no detecta deficiencias de factores de la vía intrínseca (VIII. Se pueden realizar pruebas específicas de función plaquetaria utilizando evaluación de agregación a un panel de agonistas con plasma rico en plaquetas o a través de agregómetros de sangre completa. Por lo tanto. El costado de la herida. Soluplastin: viales conteniendo tromboplastina de cerebro de conejo. a) Recolección: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporción 9 + 1 exacta (ejemplo: 4. epinefrina. Se coloca una manga para presión sanguínea en la parte superior del brazo y se infla a 40 mm Hg. cloruro de calcio para una concentración final de 0. ristocetina. Otras pruebas de laboratorio que pueden ser usadas para evaluar la función plaquetaria incluyen el tiempo de sangría. no la parte superior. PRÁCTICAS: Estudio básico de hemostasia para enfermedades hemorrágicas • Recuento de plaquetas • Tiempo de sangría • Tiempo de protrombina (TP) • Tiempo de tromboplastina parcial activado (KPTT) Tiempo de protrombina (TP) Tromboplastina cálcica para la determinación del Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick en una etapa – TP  Es una prueba global para evaluar la coagulación extrínseca. se seca cada 15 segundos hasta que se note un cese de sangrado. Proc Tecn Norm I Coagulación -9- . Generalmente se logra utilizando un aparato con una plantilla que produce un corte de una longitud y profundidad específica en el antebrazo del paciente (generalmente 5 mm de longitud y 1 mm de profundidad).detección de alteraciones en los niveles de uno o más factores involucrados en la vía extrínseca. y retención plaquetaria en burbujas de vidrio.estudios de rutina en los análisis prequirúrgicos. cuando se realizan con precisión. Aunque técnicamente sensibles. XI y XII). apunta a un defecto en la función plaquetaria. Los agonistas comunes empleados en los análisis de la función plaquetaria incluyen ADP. IX. éstas proporcionan valiosa información para la categorización de estos trastornos.Procesos técnicos normatizados I plaquetas y su morfología son normales. pero generalmente se reportan como menos de 9 minutos.5 ml de anticoagulante).1 mol/l.  Por lo tanto la determinación se aplica a:  .0125 mol/l y cloruro de sodio para una concentración final de 0. Los tiempos de sangría dependen del operador y deben ser realizados por un individuo con experiencia en este procedimiento. colocado a 37oC y en presencia de un exceso de tromboplastina tisular y calcio. el tiempo de sangría ofrece la única prueba in-vivo para evaluar la función plaquetaria. factor V o proacelerina.5 ml de sangre + 0. FUNDAMENTOS DEL METODO  Este ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado. Un tiempo de sangría prolongado de cara a un recuento plaquetario normal o casi normal. ácido araquidónico. siendo sensible a: factor II o protrombina. Las pruebas de función plaquetaria realizadas en un laboratorio requieren equipo y personal especializado. factor VII o proconvertina y factor X o Stuart-Prower. es necesaria una evaluación adicional de la función plaquetaria. Comúnmente. Los tiempos de sangría normales varían en base al método y a la edad del paciente. y trombina. colágeno.control de la terapéutica con anticoagulantes orales. la dirección del corte es longitudinal para minimizar la cicatriz. Si se encuentran disponibles.

En un tubo de hemólisis.2.  Centrifugar y separar el plasma antes de los 30 minutos.130 mol/l c) Sustancias interferentes conocidas: . de esta manera un paciente que se controla en diferentes sitios del mundo con reactivos diferentes logramos las mismas intensidades de anticoagulación. con la intención de uniformar el problema de la variabilidad de la expresión de resultados de laboratorio. Dado que el efecto de los anticoagulantes orales consiste en la reducción de los niveles de los factores vitamina K dependientes.las contaminaciones. Previo al tiempo estimado de coagulación.  . son causa de tiempos falsamente prolongados. se aconseja repetir el procedimiento desechando los valores anteriores.: 2.Tiempo de Protrombina o Tiempo de Quick: 10 . deben seguirse las instrucciones del fabricante del mismo. colocar 0.Procesos técnicos normatizados I  Si se emplea Anticoagulante TP de Wiener lab. sin embargo la variabilidad de la preparación de los reactivos de laboratorio no hace recomendable el simple valor del tiempo de Quick para ese fin.. . El importante concepto del RIN es la uniformidad que logra en el control del efecto de los anticoagulantes orales.hemólisis visibles dificultan la medición foto-óptica de los resultados PROCEDIMIENTO 1.Mantener el tubo dentro del baño y cerca de una fuente de luz. Los reactivos más efectivos para este fin son aquellos cuyos ISI son más cercanos al valor de 1 de la tromboplastina patrón. por lo que los diferentes ISI de los diferentes reactivos serán mayores a 1.N.5 ml de sangre). Si la diferencia entre los replicados de una misma muestra es mayor del 5%.la presencia de heparina o EDTA invalida los resultados.I. 2. Proc Tecn Norm I Coagulación . sacar el tubo del baño. el tiempo de protrombina o tiempo de Quick es el ideal para ese fin.Media 12 segundos.14 seg .4 . Mezclar suavemente.Colocar el plasma (desconocido o control) en baño de agua a 37oC durante 2-3 minutos (no más de 10 minutos). 3.10 - .  En caso de emplear un instrumento de medición.5 Razón Internacional Normatizada RIN – Razón Internacional Normatizada. 4. VALORES DE REFERENCIA  El rango de valores obtenidos en pacientes normales oscila  Entre:. El médico debe exigir la expresión de los resultados del laboratorio con el indispensable valor del RIN. visibles o no.2 ml de Soluplastin reconstituido y preincubar a 37oC durante 2-3 minutos (no más de 10 minutos). inclinar suavemente una o dos veces por segundo y detener el cronómetro en el momento de la aparición del coágulo 5.100%  R. La fórmula para el cálculo de RIN es la siguiente : ISI Tiempo Quick Paciente ( Seg ) RIN =---------------------------------Tiempo Quick Normal ( Seg ) El ISI o índice de Sensibilidad es la sensibilidad de cada reactivo de tromboplastina calibrado en relación a una tromboplastina patrón cuyo ISI es de 1. b) Aditivos: para obtener el plasma se debe emplear Anticoagulante TP de Wiener lab.2 ml de Soluplastin. . En la década del 80. se requerirán7 gotas para 4.Calcular el tiempo promedio de coagulación de la determinación por duplicado para cada plasma (desconocido o control).Porcentaje de Actividad Protrombínica: 70 . surgió el concepto del RIN o Razón Internacional Normatizada.Pipetear 100 ul del plasma preincubado y agregar rápidamente al tubo conteniendo 0. o citrato de sodio 0. disparando simultáneamente el cronómetro.

inclinar suavemente una vez por segundo y detener el cronómetro en el momento de la formación del coágulo.  También detecta deficiencias severas de los factores II. Agitar brevemente para homogeneizar el contenido. VALORES DE REFERENCIA El intervalo de valores observados en individuos normales oscila entre 33-48 segundos.11 - .  Sirve para detectar anormalidades en la vía intrínseca de la coagulación.5 ml de anticoagulante). a fin de poder someterlos a tratamientos preventivos prequirúrgicos y evitar problemas hemorrágicos. Se considera fuera de lo normal valores que difieran en más de 6 segundos de un plasma control. La rapidez. o en casos muy específicos de pacientes que presenten recurrencias trombóticas bajo un nivel adecuado de anticoagulación. no siendo así con los trastornos plaquetarios. Es recomendable que cada laboratorio procese un plasma control con cada lote de reactivos empleado y que correlacionelos valores obtenidos para los pacientes con el de dicho plasma. Tomar nota del tiempo de coagulación. las deficiencias de los factores VII y XIII ni los problemas vasculares. PREPARACION DE LAS MUESTRAS PARA OTROS ESTUDIOS DE HEMOSTASIA Recolección: obtener sangre cuidadosamente (evitando estasis o trauma) y colocar en un tubo con anticoagulante en proporción 9 + 1 exacta (ejemplo: 4. como son los factores necesarios para la formación del activador intrínseco de la protrombina. Luego sacar el tubo del baño.025 mol/l. es una prueba sensible a la deficiencia de factores procoagulantes del plasma así como a la presencia de ciertos inhibidores de la coagulación. sencillezy reproducibilidad de la prueba la hacen muy adecuada para el control de la terapéutica anticoagulante por heparina. Proc Tecn Norm I Coagulación . IX. V.5 ml de sangre + 0. activador y calcio. MUESTRA idem TP PROCEDIMIENTO Precalentar el Cloruro de Calcio antes de realizar la prueba en baño de agua a 37oC. También permite la identificación rápida de hemofílicos en potencia. mantener en el baño unos 25 segundos. Cloruro de Calcio: solución de cloruro de calcio 0. haciendo constar estos resultados en el informe. Niveles superiores a 3 se reservan exclusivamente para las prótesis valvulares de diseño antiguo como StarrEdwards o Bjork-Sorin. luego agregar: Cloruro de Calcio (a 37oC) 100 ul Disparar simultáneamente un cronómetro. REACTIVOS PROVISTOS Reactivo APTT: viales conteniendo cefalina con tierra de diatomeas como activador particulado. FUNDAMENTOS DEL METODO El ensayo se basa en la medida del tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado. X y fibrinógeno.Procesos técnicos normatizados I Un concepto importante a destacar es que el nivel de RIN ideal para tratamiento de la gran mayoría de las patologías trombóticas es de 2 a 3. XI y XII. Tiempo de Tromboplastina KPTT o APTTest Parcial Activada  El tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT). o sea los factores VIII. En un tubo de hemólisis colocar: Muestra (plasma desconocido o control) 100 ul Reactivo APTT (homogeneizado) 100 ul Mezclar e incubar 3 minutos a 37oC. colocado en un baño a 37oC y en presencia de un exceso de cefalina.

12 - . Otra temperatura nos dará resultados erróneos. Incubar 2 min a 37°C. XI. Es apropiado el uso de pipetas automáticas de diferente graduación. X A una dilución del plasma problema se le agrega un plasma deficiente en el factor que se va a dosar. Técnica. Proc Tecn Norm I Coagulación . XII. GENERALIDADES ANTES DE COMENZAR LOS ENSAYOS Todos los días. asegurándose de su correcto funcionamiento. una segunda centrifugación con el fin de asegurar que no quedan restos de plaquetas. por lo menos.ej. se necesitan por lo menos seis plasmas normales con los que se efectúan un control de calidad de los reactivos utilizados.22 µ m. QUININOGENOS DE ALTO PESO MOLECULAR PRECALICREINA Y Las técnicas de dosaje de estos factores se basan en la prueba de TTPK. Se debe contar con varios cronómetros de 60 segundos. a –20°C (cuanto más baja la temperatura mejor es la conservación) teniendo en cuenta que es preferible contar con un freezer que proporcione temperaturas más bajas (p. 100 µ l de plasma deficiente diluido al ½ (reconstituido con el mismo buffer por lo menos 15 minutos antes) 100 µ l de la mezcla cefalina/kaolín (partes iguales de ambas. VII. –70°C). Disparar cronómetro. mantenerlas en un baño de hielo fundente. se trasvasan los plasmas a otros tubos de plástico separándolos con pipetas tipo Pasteur plásticas. Mover los tubos cada 30 segundos para evitar que se deposite el caolín. 100 µ l de cloruro de calcio 0. Una vez centrifugados. El tiempo de coagulación de la mezcla es inversamente proporcional a la concentración porcentual del factor investigado. de volumen fijo o variable. obteniéndose así plasma pobre en plaquetas (PPP). 100 µ l de plasma problema diluido al ½. Cuando se crea necesario (valores menores de 25%) se realizaran diluciones mayores hasta alcanzar el valor porcentual adecuado.35 Dilución 1/2 1/4 1/8 Concentración 100 % 50 % 25 % El plasma problema se diluye al medio con el mismo buffer. Los valores hallados en segundos se interpolan en la curva. estable 2 horas). DOSAJE DE FACTORES II. eso se toma como un 100%. pues disminuyen los errores en el desarrollo de las técnicas.025M precalentado a 37°C. Técnica general: Curva standard: Si el standard tiene 1 U/dl.Procesos técnicos normatizados I La sangre recogida se centrifuga a 3000 rpm durante 15 minutos cuidando que la temperatura no sobrepase los 20°C ya que se perderán los factores termolábiles (VIII y V). V. eso se toma como un 100%. Si es posible. IX. los plasmas se fraccionan en alícuotas y se congelan. Se debe controlar la temperatura de los baños termostatizados a fin de que se mantengan en 37°C +/-0. Si se desean almacenar. utilizando como reactivo un plasma deficiente en el factor a dosar. cuidando que al sumergirlas no se llegue a la interfase glóbulos/plasma que es la zona rica en plaquetas. Estos plasmas normales se obtienen y procesan de la misma forma que las muestras de pacientes a estudiar. antes de comenzar los ensayos. Diluciones con buffer pH 7. Colocar los tubos de vidrio en el baño a 37 °C para precalentarlos. CONSERVACION DE LAS MUESTRAS Las muestras así tratadas se mantienen en ambiente fresco hasta el momento de efectuar los ensayos. DOSAJE DE FACTORES VIII. Técnica general: Curva standard: Si el standard tiene 1 U/dl. cuando ocurre se detiene el cronómetro. El tiempo de coagulación de la mezcla es inversamente proporcional a la concentración porcentual del factor investigado. Métodos alternativos para eliminar las plaquetas son los que utilizan la filtración con membranas de 0. Observar la formación de coágulo.5°C. se efectúa entonces.

25 ml de cloruro de calcio al 2% Incubar 1 hora a 37°C El coágulo formado se vuelca sobre un cuadrado de gasa. se hace una muñeca y se exprime. TIEMPO DE TROMBINA Preparación de la trombina: Reactivos: Plasma citratado humano o bovino. Se abre la tela para retirar la fibrina Lavar con agua destilada 2 veces y luego con alcohol durante 5 minutos. Agua destilada.85% (solución fisiológica) Carbonato de sodio al 2%. Disparar cronómetro. Cuando se crea necesario (valores menores de 25%) se realizaran diluciones mayores hasta alcanzar el valor porcentual adecuado. Este se redisuelve con 5 ml de solución fisiológico. Acido acético al 2%. El precipitado que quedó se vuelve a disolver con otros 5 ml de solución fisiológica y el proceso se repite varias veces. DOSAJE DE FIBRINOGENO Método gravimétrico: En una probeta de plástico colocar 20 ml de solución fisiológica 1 ml de plasma problema 1. cuando ocurre se detiene el cronómetro.25 M Acetona. Observar la formación de coágulo. con varilla de vidrio. Agitar vigorosamente durante un tiempo prolongado. Colocar los tubos de vidrio en el baño a 37° C para precalentarlos. 2 seg). Disponer un tubo de plástico con embudo. Disparar el cronómetro. Se centrifuga y se recupera el precipitado. Ajustar el pH a 5. dé como resultado tiempos entre 18 y 20 segundos. 100 µ l de plasma deficiente (reconstituido con el mismo buffer por lo menos 15 minutos antes) Incubar de 3 a 5 minutos a 37° C. Determinación del tiempo de trombina: Se utiliza una trombina diluída en solución fisiológica tal que dosando un plasma pobre de plaquetas normal del día. Disolver el precipitado en 25 ml de solución fisiológica. 100 µ l de plasma problema Incubar 30 segundos 100 µ l de trombina diluída. Purificación: (se puede realizar al día siguiente) Colocar en tubo de plástico partes iguales de trombina cruda y acetona.0 con carbonato de sodio. Técnica.3 con ácido acético. Cloruro de calcio 0. Ajustar el pH a 7.1 seg. Exprimirlo y recuperar el líquido que es la trombina cruda. Observar la formación del coágulo.Procesos técnicos normatizados I Diluciones con buffer Michaelis Dilución Concentración 1/2 100 % 1/4 50 % 1/8 25 % El plasma problema se diluye 1/10 con el mismo buffer. Proc Tecn Norm I Coagulación . Dejar de 2 a 24 horas en heladera (4°C). Centrifugar y descartar el sobrenadante. Los valores hallados en segundos se interpolan en la curva. Cloruro de sodio 0. Se agregan 3 ml de cloruro de calcio y se deja 2 horas a temperatura ambiente hasta coagulación completa. Para poder utilizarla. 200 µ l de tromboplastina cálcica precalentada a 37° C. colocar dentro de éste una gasa y volcar el coágulo formado. esa trombina debe diluirse con solución fisiológica hasta obtener un tiempo de 19 +/. 100 µ l de plasma problema diluido 1/10.13 - . Centrifugar y recuperar el sobrenadante que es trombina purificada de alta concentración 8tiempo de trombina aprox. Procedimiento: Extracción: 100 ml de plasma se llevan a 1000 ml con agua destilada.

La fibrina formada es mantenida en solución por el inhibidor de coagulación. Un tiempo acortado indica presencia de plasmina o aumento de activadores (u otras enzimas proteolíticas) En casos de observarse un test prolongado. El mismo debe llevarse a cabo dentro de los 20 minutos siguientes. colocar un tubo en baño a 37° C para precalentarlo Diluir el plasma problema 1/10 con buffer Owren Colocar 100 µ l de dilución en el tubo. Esto puede ocasionar la falta de formación del coágulo que se puede confundir con una lisis anormal. El factor XIII activado se une a un péptido específico de la glicina etilester y libera amonio (NH3). 1/10. rango de medida 0 . Componentes: 1-Reactivo activador: Trombina bovina 2. plasminógeno y los activadores del plasminógeno (tPA. La velocidad de reacción es proporcional a la concentración del Factor XIII. en pacientes con antecedentes Proc Tecn Norm I Coagulación . En caso de valores que escapan de la curva. 1/40 y dosar el fibrinógeno a cada una de ellas. Método comercial (Berichrom Factor XIII) Características principales: Método cuantitativo automatizado.p.14 - . en medio alcalino y luego es coagulado.Procesos técnicos normatizados I Se coloca la fibrina sobre un vidrio de reloj y se lleva a estufa a 110°C. Para transformar los segundos en mg/dl de fibrinógeno se debe realizar una curva preparando las siguiendo diluciones de las siguientes diluciones del standard de fibrinógeno: 1/5. Resultados en 6 minutos.Reactivo de detección: Sustrato de F XIII Principio del test: La trombina activa el factor XIII de la muestra y convierte el fibrinógeno en fibrina. Significado clínico: El tiempo de lisis del coágulo formado en el ensayo es inversamente proporcional a la actividad fibrinolítica plasmática.½) o trabajar con el plasma puro.140%. son la contaminación de los reactivos y la dificultad en la disolución del precipitado de las euglobulinas. En esta técnica las principales fuentes de error. El consumo de NADH es medido utilizando la absorbancia a 340 nm. scuPA) quedando en solución la mayor parte de los inhibidores.150%. LISIS DE EUGLOBULINAS Sinonimia: tiempo de fibrinólisis. donde se encuentran el fibrinógeno. Luego de esta incubación observar la presencia o disolución del coágulo. Muestra: Plasma citratado. El precipitado de euglobulinas es disuelto. se pueden hacer diluciones menores (1/5. Metodología: Se precipitan en medio ácido las euglobulinas del plasma. El NADH es oxidado a NAD. La evaluación en % del normal. sin predilución de la muestra. 3. Incubar 1 minuto Agregar 100 µ l de trombina de concentración conocida. Determinación fotométrica de Factor XIII. 1/20. La sangre se centrifuga 10 minutos a 3000 r.m. debe mantenerse en baño de hielo hasta su procesamiento. DETERMINACION DEL FACTOR XIII factor estabilizante de la fibrina (Método con Urea 5M) En tubo de vidrio colocar 200 µ l de plasma 200 µ l de cloruro de calcio 0. es desarrollada usando una curva de referencia construida a partir de diluciones del Plasma Humano Standard con solución salina fisiológica. Por lo tanto se debe observar que el coágulo se haya formado y luego vigilar su desaparición.NADH. Una vez obtenida la muestra. Disparar un cronómetro Visualizar la formación del coágulo.025M Incubar 30 minutos en baño a 37 °C Despegar el coágulo formado Agregar 3 ml de Urea 5M (se puede reemplazar por ácido monocloroacético) Dejar 24 hs en baño a 37° C. Valor de referencia: El coágulo debe permanecer formado entre 2 y 4 horas. Es aconsejable hacer el dosaje en paralelo Con un plasma normal. RANGO DE REFERENCIA: 70 . hasta peso constante Cálculo: peso de la fibrina x 100 = mg de fibrina/ml - Método de Clauss: El tiempo de coagulación del plasma por acción de un exceso de trombina es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno.

en personas sanas luego del ejercicio. En consecuencia. pH aproximado de 5. COAMATIC ® LR Antithrombin se basa en la inhibición de FXa.Procesos técnicos normatizados I trombóticos se deben estudiar los componentes del sistema fibrinolítico pre y post estasis venoso.2) Solución de borato de sodio 0. Es aconsejable hacer el dosaje en paralelo de un plasma normal. Variables preanalíticas: Aumentado: Se prolonga el tiempo de lisis si la concentración de fibrinógeno está aumentada.025M Procedimientos 500 µ l de plasma problema 8 ml de solución agua – ácido acético Incubar 30 minutos en heladera (4° C) Centrifugar 5 minutos a 1500 rpm Descartar sobrenadante invirtiendo el tubo sobre papel de filtro para drenaje completo (aproximadamente 1 minuto) Agregar 500 µ l de solución de borato de sodio para disolver el precipitado (puede ayudarse con una varilla delgada) Agregar 500 µ l de cloruro de calcio 0. presencia de plasmina.normal.025M y llevar a 37 °C. causa un tiempo de lisis acortado. fibrinólisis a Disminuido: Una concentración de fibrinógeno disminuida (menor de 80 mg/dl). ANTITROMBINA III Síntesis hepática y endotelio. TAT Proc Tecn Norm I Coagulación . Monitoreo de la terapia con uroquinasa. Utilidad clínica: Screening para la evaluación de la fibrinólisis. Reactivos Plasma citratado Solución agua destilada – ácido acético al 1% (100 ml de agua destilada + 1. Cloruro de calcio 0. déficit de alfa 2 antiplasmina.TOS-GLY-PRO-ARG-OH + PARANITROANILINA TROMBINA (405 nm) Sin embargo. glicoproteína Vida ½: 2 – 8 días . el cofactor II de la heparina presente en el plasma puede inhibir también la trombina añadida y dar lugar a un valor demasiado elevado.87 ml de ácido acético al 1%.15 - .1% en solución fisiológica. A los pocos minutos se forma un coágulo que debe observarse cada 15 minutos hasta que se produce la lisis. Un ensayo basado en FXa también permite determinar con precisión la AT en pacientes que reciben terapia con heparina. venipunción traumática. estreptoquinasa y tPA. Aumento de activadores del plasminógeno. heparina potencia su acción INHIBE: IIa IXa Xa XIa DETERMINACION: PLASMA CITRATADO Y SUSTRATO CROMOGENICO La mayoría de ensayos de AT funcionales se basan en la capacidad de AT del plasma de inactivar trombina añadida de forma exógena en presencia de heparina AT III + HEPARINA ---------------(AT III + HEPARINA) (AT III + HEPARINA) + TROMBINA EN EXCESO ------{AT III-HEP-TROMB} + TROMBINA RESTO TOS-GLY-PRO-ARG-pNA + H2O ------------------. se ha demostrado que un ensayo de AT basado en el factor FXa discrimina mejor entre individuos deficientes en AT e individuos no deficientes en AT que un ensayo basado en la trombina. AT + Heparin ———> [AT•Heparin] [AT•Heparin] + FXa (excess) —> [AT•Heparin•FXa] + FXa (residual) FXa (residual) + S-2772 ————————> Peptide + pNA COMPLEJO TROMBINA ANTITROMBINA Sinonimia: TATIII.

leucemia promielocítica e infusión de endotoxina (sepsis). Enzimas Hepáticas Aumentadas. Es decir.Procesos técnicos normatizados I Método: RIA. Constituye un índice de la generación de trombina. ovario y tracto gastrointestinal. en cambio el TATIII se encuentra en niveles elevados. no se observan indicios clínicos. Calibrado contra WHO standards. denominada CID preclínica o de bajo grado. lo cual puede inducir una formación de trombina o agregación plaquetaria excesiva. Diagnóstico precoz de CID (coagulación intravascular diseminada) en la fase I (activación compensada del sistema hemostático). especialmente elevada se observa en la leucemia mieloide aguda. 2. el KPTT y el recuento de plaquetas están dentro de los valores normales. Proc Tecn Norm I Coagulación . Este complejo es estable y tiene una vida media de 15 minutos por lo tanto es factible su dosaje en plasma por métodos inmunológicos. el TP. Bajo recuento plaquetario). La concentración de TATIII está directamente relacionada con la cantidad de trombina que se ha generado. Utilidad clínica: Evaluación de activación de la coagulación. Una activación de la coagulación. existe un riesgo incrementado de complicaciones tromboembólicas aunque un evento puede no necesariamente ser gatillado. Elevadas concentraciones de TATIII y de fragmentos 1+2 sugieren la presencia de hipercoagulabilidad.Trombina (bovina) conteniendo Heparina (2. Se encuentra elevado en tumores sólidos malignos y leucemias agudas. BERICHROM ANTITROMBINA III Características principales: Solamente utilizado en analizadores de química clínica Sin interferencia por cofactor II de Heparina.2 nmol/l si se utiliza el ELISA Significado clínico: El complejo trombina-antitrombina es producido durante la inactivación de la trombina cuando forma un complejo con la antitrombina. Valor de referencia: menor de 2 nmol/l si se utiliza RIA menor de 0. · Trombosis venosa profunda (deep) y embolismo pulmonar · Tumores malignos o leucemia mieloide aguda · Predisposición a trombosis · Infarto agudo de miocardio y terapia trombolítica seguido a un evento trombótico Monitoreo del tratamiento en estados de hipercoagulabilidad. Luego de la terapia con heparina el TAT disminuye volviendo a los valores normales. Variable por enfermedad: Aumentado: En numerosas afecciones asociadas con la activación de la coagulación como tromboembolia venosa. Rápida determinación. En esta fase. Se encuentra aumentado en neoplasias. Medida de la actividad usando un sustrato cromogénico. Variables por drogas Disminuido:: Administración de antitrombina.16 - . La cuantificación del complejo TATIII se utiliza para determinar la generación y la neutralización de la trombina. Síndrome HELLP (Hemólisis. Pronóstico de pacientes con cáncer pulmonar: Se ha demostrado que la activación de la coagulación correlaciona con la extensión de la metástasis y tiene un valor pronóstico de la enfermedad. La trombina. usualmente no se encuentra en sangre en forma libre. Screening de estados de hipercoagulabilidad los cuales pueden estar asociados con varias enfermedades primarias y condiciones: · Coagulación intravascular diseminada aguda y crónica. preeclampsia.5 IU/ml) y aprotinina. Esto implica que una alteración en el equilibrio hemostático está presente.Reactivo sustrato. usando Trombina bovina. se encuentra como complejo inactivo en forma de trombina-antitrombina (TAT III). ELISA Muestra: plasma citratado pobre en plaquetas. en el cáncer de pulmón. Componentes: 1.

La Proteína C activada. PROTEINA C Sinonimia: PC Método: cromogénico (proteína C funcional).140% del normal. en la práctica clínica para aumentar la detección de estas anomalías deberían utilizar ensayos funcionales en lugar de inmunológicos. Evaluación: La actividad de Proteína C como porcentaje del normal.125%. Componentes: 1. embolismo pulmonar en el 40% de los casos. y el color es medido a 405 nm. en presencia de calcio y proteína S. presente en exceso.Protein C activador: (Agkistrodon contortrix) (3 x 10 ml). por ejemplo en presencia de sepsis.140% del normal. de síntesis hepática. El desarrollo de color es inversamente proporcional a la concentración de AT III. La proteína C es activada a PCa a través del complejo trombina-trombomodulina. La trombina remanente libera un colorante del sustrato cromogénico.Procesos técnicos normatizados I 3. tromboflebitis superficial en el 48% de los casos. Por ello. se presentan TVP (trombosis venosa profunda) en el 63% de los casos. Tipo II: se presenta con un trastorno en la actividad funcional de la proteína C. 3. La deficiencia heterocigota tiene una prevalencia de 1/200-1/300 y la deficiencia homocigota alrededor de 1/16000. que se une a la membrana fosfolipídica e inhibe al FVIII a y FVa por proteólisis limitada. cliva el sustrato y libera el colorante. coagulométrico. La deficiencia de esta proteína se subdivide en dos tipos: • Tipo I: es el subtipo más frecuente. en una reacción que depende de calcio.Buffer HEPES: (1 x 30 mL). 2. dicho riesgo aumenta considerablemente si se asocian a otras alteraciones Proc Tecn Norm I Coagulación . La deficiencia de PC aumenta el riesgo de CID (coagulación intravascular diseminada). 0 . El incremento en absorción es directamente proporcional a la actividad de Proteína C. caracterizado por una disminución paralela de la actividad funcional y la concentración plasmática de la proteína. Esta proteína tiene una vida media de 5-7 horas.Tris Buffer. Rango de referencia: 70 . La PCa forma un complejo con la proteína S y el factor V.Reactivo sustrato: (3 x 3 mL). No requiere dilución de la muestra con plasma deficiente. Rango de referencia: 75 . hallándose una actividad funcional reducida y concentraciones antigénicas normales. Elisa: inmunológico Muestra: plasma citratado Valor de referencia: PC actividad: 70-140 % PC antigénico: 80-120% Significado clínico: La proteína C (PC) es una glicoproteína vitamina K dependiente. PROTEÍNA C: Berichrom Protein C Características principales: Sin interferencia por Heparina o Factor VIII. Principio del test: La heparina del reactivo trombina. La deficiencia heterocigota de PC es un factor que potencia débilmente el riesgo de trombosis. Las formas heterocigotas de la enfermedad muestran unos niveles de PC de un 50% aproximadamente. Principio del test: La Proteína C en la muestra del paciente es activada por el veneno de víbora. es determinada de una curva de referencia preparada usando el Plasma Humano Standard. Se encuentra en el 2-5% de los pacientes con tromboembolismo. • En pacientes con deficiencia de PC que presentan trombosis. Rango de medida: 0 . es inactivada en proporción a la concentración de AT III. activa la AT III en la muestra de plasma. Amplio rango de linealidad.140%. La trombina.17 - .

embolismo pulmonar agudo. cirrosis hepática. La manifestación clínica más frecuente es la trombosis venosa profunda recurrente. post cirugía. hepatopatías . en ocasiones fatales. DIMERO D Sinonimia: producto de degradación de la fibrina Método: aglutinación en placa (látex). angina inestable. El dímero D es un fragmento de la fibrina que contiene una unión intermolecular entre las cadenas gamma de dos monómeros de fibrina pero no el fibrinógeno. enzimoinmunoensayo (ELISA). FV de Leyden) o factores predisponentes (cirugía. Variable por droga: Disminuido: Por disminucion en la disponibilidad de vitamina K (acenocumarol (sintrom). Utilidad clínica: Diagnóstico de deficiencia de proteína C y para diferenciar el déficit tipo I del tipo II. turbidimetría. puerperio y tratamiento con anticonceptivos orales). sepsis. infancia. (Métodos cuantitativos). Significado clínico: Cuando la fibrina es clivada por la plasmina. warfarina (coumadin). Variable por enfermedad: Aumentado: Diabetes mellitus tipo I. CID. carcinoma hepatocelular. antibióticos). Variables preanalíticas: Disminuido: Presencia de inhibidor lúpico. Proc Tecn Norm I Coagulación . adolescencia. se libera un número pequeño de productos de degradación que se encuentran en el plasma en distintas enfermedades en las que ocurre trombosis como infarto agudo de miocardio. El dímero D tiene un valor predictivo negativo superior al 90%. Muestra: plasma citratado Valor de referencia: inferior a 100 ng/ml. Los casos raros de homocigosidad (en los cuales la actividad de la PC es menor del 1%) se asocian con trombosis graves. insuficiencia renal crónica. coagulación intravascular diseminada y trombosis venosa profunda.18 - . síndrome distress respiratorio. malabsorción. Disminuido: Infecciones por Clostridium difficile. anticoagulación oral. en el período neonatal. Valores superiores a 500 ng/ml sugieren fuertemente coagulación intravascular diseminada. Esto significa que un resultado negativo es excluyente de la activación de la coagulación y consecuentemente de fibrinólisis. Su presencia confirma que ha ocurrido la formación de trombina y plasmina. CID y trombosis arterial. Los niveles de los productos de degradación del fibrinógeno (PDF) no dímero D pueden estar falsamente elevados con inhibidores de la trombina (como la heparina) y están también elevados en la fibrinólisis primaria o disfrinogenemia. El dímero D es uno de estos productos. Proviene de la acción de la plasmina sobre la fibrina estabilizada (insoluble). La enfermedad se conoce como púrpura fulminante y se caracteriza por necrosis dérmica. embarazo. presencia de inhibidor lúpico. deficiencia de vitamina K.Procesos técnicos normatizados I genéticas (por ej. embolismo pulmonar.

Procesos técnicos normatizados I Utilidad clínica: • Screening antes de una cirugía. estreptoquinasa. heparina de bajo peso molecular. estrógenos conjugados. activador tisular del plasminogeno. Monitoreo junto con otros tests durante una terapia trombolítica. Diagnóstico de degradación de la fibrina. Variable por droga: Disminuido:: Aspirina. pacientes que han sufrido infarto de miocardio. coagulación intravascular diseminada. infarto de miocardio agudo. Diagnóstico de coagulación intravascular diseminada. ácido tranexámico. Evaluar casos de coagulación intravascular diseminada (CID). Es una determinación de urgencia que permite confirmar los resultados hallados por la medición de los productos de degradación del fibrinógeno (altamente sensible). betabloqueante. Proc Tecn Norm I Coagulación . Exclusión de trombosis venosa profunda. artritis reumatoidea. embolia pulmonar.factorVIIa. sinvastatina. pravastatina. Evaluar de una activación fibrinólitica en los pacientes sometidos a cirugía cardíaca con circulación extracorpórea. trombosis venosa profunda. cirrosis hepática. prostaciclina. simvastatina. para evaluar el riesgo de producir trombosis venosa profunda o tromboembolismo pulmonar. lidocaína. trombosis arterial. tumores ginecológicos malignos. tromboembolismo pulmonar y coagulación intravascular diseminada. Diagnóstico de eventos tromboembólicos. síndrome nefrótico. angina inestable o coagulación intravascular diseminada.19 - . heparina no fraccionada. mujeres con pre-eclampsia. factor VIIa. • • • • • • • • Variable por enfermedad: Aumentado: Cáncer colorrectal. Usando un límite de corte de 200 ng/ml tiene una sensibilidad=94% y un VPP=92% para trombosis venosa profunda distal. enfermedad de Crohn. urokinasa. 17 beta estradiol. Aumentado: Terapia antiplaquetaria. anticonceptivos orales. bezafibrato. warfarina. No sirve como diagnóstico debido a su baja especificidad= 40%.

B.15 30 .000 – 400.40 175 . AB VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: VALORES DE REFERENCIA: 40 – 126 % 49 – 163 % 42 – 141 % 66 – 176 % 200 – 400 mg/dl 0 – 120 segundos 0 – 160 segundos 89 – 118 73 – 127 70 – 150 54 – 146 >2.Procesos técnicos normatizados I HEMOSTASIA MUESTRA: plasma (CITRATADO).300 < 10 RN de término 150.000 – 400.16 30 .16 % % % % > 75 % 15 – 25 segundos 27 – 37 seg 15 – 25 seg Exámenes de coagulación en el RN: valores normales Prematuro Rcto de plaquetas x mm3 Tiempo de protrombina (seg) Tiempo parcial de TP Fibrinógeno (mg/dl) PDF (mg/ml) 150.80 15 . AB VALORES DE REFERENCIA: Grupo sanguíneo 0 Grupo sanguíneo A.20 - . B. VALORES DE REFERENCIA: 85 – 140 % VALORES DE REFERENCIA: 19 – 31 mg/dl VALORES DE REFERENCIA: <250 mg/L VALORES DE REFERENCIA: 50 – 150 % VALORES DE REFERENCIA: 62 – 139 % VALORES DE REFERENCIA: 50 – 150 % VALORES DE REFERENCIA: 50 – 150 % VALORES DE REFERENCIA: 65 – 150 % VALORES DE REFERENCIA: 77 – 131 % VALORES DE REFERENCIA: 65 – 150 % VALORES DE REFERENCIA: 50 – 150 % VALORES DE REFERENCIA: 60 – 150 % VALORES DE REFERENCIA: Antitrombina III (actividad) Antitrombina III (proteína) Dímero D Factor II Factor V Factor VII Factor VIII Factor IX Factor X Factor XI Factor XII Factor XIII Factor Von Willebrand (actividad) Factor Von Willebrand (antigénico) Fibrinógeno Función plaquetar colágeno/ADP Función plaquetar colágeno/epinefrina Inhibidor de la plasmita Plasminógeno Proteína C funcional Proteína S libre Resistencia a la proteína C activada Tiempo de protrombina Tiempo de reptilase Tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT) Tiempo de trombina Grupo sanguíneo 0 Grupo sanguíneo A.000 11 .000 12 .400 < 10 Proc Tecn Norm I Coagulación .

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