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Proteínas

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Aminoácidos y Proteínas

Temario: - Curva de titulación de aa. - Espectrofotometría. - Cuantificación de proteínas. - Electroforesis. - Técnicas de purificación. - Técnicas de secuenciación de proteínas.

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Cuantificación de proteínas
- Espectrofotometría directa (capacidad intrínseca de las proteínas de absorber luz a 280 nm) - Método de Lowry (reacción química) - Método de Bradford (fijación de un colorante)

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Espectrofotometria
Ley de Lambert-Beer A= ε lC A = absorbancia del cromóforo a una longitud de onda de determinada. ε = absortividad molar (coeficiente de extinción molar), absorbancia de una solución 1M del compuesto (sv, T, λ ). Unidades: litro/mol x cm l = longitud del camino óptico en la cubeta (en cm). C= concentración del cromóforo en la solución, en moles/litro.

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En el caso de las proteínas los cromóforos son los residuos de aminoácidos aromáticos (Trp, Tyr, Phe) y las uniones peptídicas. DO 280  máximo de absorción aa aromáticos y no absorbe el sv (agua)
Cromóforo Long. de onda para la absorción máxima (nm) Triptofano Tirosina Fenilalanina Unión peptídica Puente disulfuro 280 275 257 205 250 Absortividad molar (l/mol.cm) 5.600 1.400 200 4-8.000 300

Grupos aromáticos (280 nm) VENTAJAS DESVENTAJAS Gran espectro de sensibilidad

Unión peptídica (205 nm) Proteínas sin grupos aromáticos

Interferencia de ácidos nucleicos Detección de otros compuestos u otros compuestos aromáticos químicos (solventes, etc.)

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Método de Lowry
Método colorimetrico para cuantificar proteínas. Paso 1: formación de un complejo entre la proteína y el Cu+2 del reactivo en medio alcalino.
Los iones Cu2+ , en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+ -proteína tienen un color azul claro. La formación de estos complejos provoca el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndo los residuos de Tyr que van a participar en la 2º etapa de la reacción.

Paso 2: reducción del Rvo de Folin dando productos coloreados que pueden leerse a 750 nm.
El principal constituyente del reactivo de Folin es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos de las Tyr da lugar a un complejo de color azul intenso. Solución I (1ml c/ 0.2 ml de muestra): Na2CO3 2% en NaOH 0.1M + tartrato de Na+ y K+ 2% + CuSO4 1%. Solución II (0.1 ml c/ 0.2 ml muestra): Rvo de Folin (ácido fosfotungstico-fosfomolibdico), color amarillo.

Procedimiento • 0.2 ml dilución muestra + 1 ml sc I  10 min • 0.1 ml Rvo Folin  30 min  formación de complejos azules • Leer DO 750 nm

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Ejemplo de cuantificación de proteínas por el método de Lowry
1) Curva de calibración: proteína patrón Albúmina 0.4 mg/ml
• Preparar distintas diluciones de la solución de albúmina patrón
Blanco Albumina (µ l) Agua (µ l) Albumina (µ g) Absorbancia 0 200 T1 10 190 T1* 10 190 T2 20 180 T2* 20 180 T3 30 170 T3* 30 170 T4 40 160 T4* 40 160 T5 50 150 T5* 50 150 T6 60 140 T6* 60 140

• Calcular el contenido de albúmina en cada uno de los tubos
Blanco Albumina (µ l) Agua (µ l) Albumina (µ g) Absorbancia 0 200 0 T1 10 190 4 T1* 10 190 4 T2 20 180 8 T2* 20 180 8 T3 30 170 12 T3* 30 170 12 T4 40 160 16 T4* 40 160 16 T5 50 150 20 T5* 50 150 20 T6 60 140 24 T6* 60 140 24

• Agregar los reactivos y medir la DO a 750 nm de cada uno de los tubos
Blanco Albumina (µ l) Agua (µ l) Albumina (µ g) Absorbancia 0 200 0 0 T1 10 190 4 0,065 T1* 10 190 4 0,06 T2 20 180 8 0,102 T2* 20 180 8 0,098 T3 30 170 12 0,172 T3* 30 170 12 0,174 T4 40 160 16 0,219 T4* 40 160 16 0,22 T5 50 150 20 0,255 T5* 50 150 20 0,263 T6 60 140 24 0,309 T6* 60 140 24 0,296

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Ejemplo de cuantificación de proteínas por el método de Lowry
• Graficar
Blanco Albumina (µ l) Agua (µ l) Albumina (µ g) Absorbancia 0 200 0 0 T1 10 190 4 0,065 T1* 10 190 4 0,06 T2 20 180 8 0,102 T2* 20 180 8 0,098 T3 30 170 12 0,172 T3* 30 170 12 0,174 T4 40 160 16 0,219 0,22 T4* 40 160 T5 50 150 20 0,255 T5* 50 150 20 0,263 T6 60 140 24 0,309 T6* 60 140 24 0,296

Pr (µ g)= 76.43xDO – 0.361

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Ejemplo de cuantificación de proteínas por el método de Lowry
1) Muestra problema:
• Preparar distintas diluciones de la muestra / tomar distintos volúmenes
muestra 1: homogenato de hígado Dilución 1/50 1 muestra (µ l) Agua (µ l) Absorbancia Proteína (mg/ml) 10 190 2 10 190 3 20 180 4 20 180 5 50 150 6 50 150 1 10 190 2 10 190 muestra 2: mitocondrias de hígado Dilución 1/20 3 20 180 4 20 180 5 50 150 6 50 150 1 10 190 2 10 190 muestra 3: mitocondrias de testículo Dilución 1/20 3 20 180 4 20 180 5 50 150 6 50 150

• Agregar los reactivos y medir la DO a 750 nm de cada uno de los tubos
muestra 1: homogenato de hígado Dilución 1/50 1 muestra (µ l) Agua (µ l) Absorbancia Proteína (mg/ml) 10 190 0,07 2 10 190 0,06 3 20 180 0,13 4 20 180 0,131 5 50 150 0,316 6 50 150 0,314 1 10 190 0,103 2 10 190 0,082 muestra 2: mitocondrias de hígado Dilución 1/20 3 20 180 0,286 4 20 180 0,199 5 50 150 0,458 6 50 150 0,491 1 10 190 0,08 2 10 190 0,072 muestra 3: mitocondrias de testículo Dilución 1/20 3 20 180 0,119 4 20 180 0,132 5 50 150 0,291 6 50 150 0,297

• Calcular usando la curva de calibración el contenido de proteína de cada muestra
muestra 1: homogenato de hígado Dilución 1/50 1 muestra (µ l) Agua (µ l) Absorbancia Proteína (mg/ml) 10 190 0,07 24,2 2 10 190 0,06 21,1 3 20 180 0,13 23,7 4 20 180 0,131 24,1 23,4 5 50 150 0,316 23,8 6 50 150 0,314 23,6 1 10 190 0,103 15,0 2 10 190 0,082 11,8 muestra 2: mitocondrias de hígado Dilución 1/20 3 20 180 0,286 21,5 14.1 4 20 180 0,199 14,8 5 50 150 0,458 13,9 6 50 150 0,491 14,9 1 10 190 0,08 11,5 2 10 190 0,072 10,3 muestra 3: mitocondrias de testículo Dilución 1/20 3 20 180 0,119 8,7 9,7 4 20 180 0,132 9,7 5 50 150 0,291 8,8 6 50 150 0,297 8,9

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Método de Bradford
Método colorimétrico para dosar proteínas. Utiliza el colorante Azul brillante de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G-250), el cual se une a las proteínas en medio ácido formando complejos azules que presentan un máximo de absorción a 595nm.
Rvo de Bradford : Azul de coomasie G-250,etanol , Ac. fosfórico , agua.

Procedimiento • 0.2 ml dilución muestra + 1 ml Rvo Bradford  10 min  formación de complejos azules • Leer DO 595 nm

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Electroforesis

Criterio de pureza (Qué pasa si corriendo con SDS aparecen dos bandas?) Determinación de PM (SDS-PAGE) Determinación de PI (isoelectroenfoque) Criterio de identificación (western blot)
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Diagnóstico de Anemia falsiforme o Drepanocitica (Hemoglobinopatía S)
Electroforesis sobre acetato de celulosa a pH: 8.6

Revelado con Coomasie-Blue vs Revelado con Ag

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Técnicas de purificación de proteínas
Por solubilidad: • precipitación isoeléctrica • precipitación por salado Por tamaño: • diálisis • centrifugación en gradiente de densidad • cromatografía de exclusión molecular Por carga: • cromatografía de intercambio iónico • electroforesis bidimensional Por afinidad: • cromatografía de afinidad

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Muestras: Órganos o tejidos Cultivos celulares Proteínas recombinantes

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Diálisis

Cromatografia de exclusión

molecular

Centrifugación en gradiente de densidad

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Cromatografia de intercambio iónico

Intercambiador catiónico

Intercambiador aniónico

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Cromatografia de afinidad

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1. ¿ Cómo determinamos que la proteína está pura? 2. ¿ Cómo determinamos que la proteína que purificamos es la que nos interesa?

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1. ¿ Cómo determinamos que la proteína está pura?

La actividad específica es una medida de pureza: aumenta durante la purificación de la proteína y llega a ser máxima y constante cuando la proteína está pura.

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1. ¿ Cómo determinamos que la proteína está pura?

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2. ¿ Cómo determinamos que la proteína que purificamos es la que nos interesa?
Medida de la actividad enzimática Western blot Ensayos biológicos

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Western Blot como criterio de identificación
SDS-PAGE las calles corresponden a: 1-marcador de PM 2-cultivo sin inducir 3-cultivo inducido con 0.4 mM de IPTG 4-sobrenadante ingreso a columna G50 5-pellet (descartado) 6-ACBP eluída 10 µ l 7-ACBP eluída 18 µ l 8-Homogenato de hígado

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1- s/i 2- c/i IPTG 0,05 mM 3- pellet del lisado 4- sobrenadante del lisado DO= 1,426 5- sobrenadante mtra+resina agito O/N 6- descarte del primer lavado 7, 8- lavado para elusion de prot inespecíficas hasta DO< 0,05 (> [imidazol]) 9, 10, 11, 12- elusion T7 RNA polimerasa DO= 1,770; 1,223; 0,439; 0,211 12341234marcador PM 500 pb transcripción con T7 comercial transcripción con nuestra T7 0,5 ul idem con 0,9 ul marcador PM 250 pb pcr como control de PM transcripción del molde de pcr idem pero con mas [NTP’s]

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Métodos para determinar el PM
SDS-PAGE

Cromatografía de exclusión molecular (proteína nativa): graficar log PM vs tiempo o volumen de elusión Equilibrio de sedimentación (proteína nativa): S = m(1- dmedio/dpartícula) f S = dx/dt w2x
S: coeficiente de sedimentación (seg) m: masa de la partícula f: coeficiente de fricción x: distancia desde el centro de rotación w: velocidad angular de rotación
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