EXTENDIDO DE SANGRE PERIFÉRICA

La preparación de un frotis sanguíneo puede llevarse a cabo junto a la cama del paciente o
en el laboratorio si se emplea sangre anticoagulada con EDTA. Dos de los procedimientos
más básicos realizados en el laboratorio de hematología son la preparación y tinción de los
frotis sanguíneos.

MÉTODO DE EMPUJE EN CUÑA

Puede usarse sangre entera anticoagulada con EDTA o sangre capilar de flujo libre. Si se
emplea EDTA, los frotis deben prepararse durante la primera hora siguiente a la recolección.

Antes de preparar los frotis, se almacena la sangre entre 18 y 25°C. Es necesario mezclar
bien la muestra antes de prepararlos.

Para realizar el extendido se requieren portaobjetos limpios de vidrio (simples o con un

extremo esmerilado), un lápiz marcador y una lámina o laminilla para el empuje. El
procedimiento es el siguiente:

1. Colocar una pequeña gota (0.05 mL) de sangre bien mezclada, ya sea de la punción
directa del dedo bien limpiado o del tubo con anticoagulante, a 1cm de un extremo del
portaobjetos. Si se emplean portaobjetos de extremo esmerilado, la sangre se coloca
cerca de este.
2. Deje el portaobjetos sobre una superficie plana con la gota de sangre al lado derecho.
Invierta esta orientación si es zurdo.
3. Coloque un segundo portaobjetos para empujar un poco frente a la gota de sangre. El
ángulo de esta laminilla debe ser de unos 45°.
4. Deslice el portaobjetos de empuje hacia atrás, hacia la gota de sangre. Permita que la
gota se extienda hasta tres cuartas partes del bisel del portaobjetos de empuje. No
permita que la sangre se extienda hasta los bordes. Empuje rápidamente el portaobjetos
hacia delante (lejos de la gota). Este movimiento hacia delante debe ser suave y continuo
hasta el extremo del portaobjetos.
5. Permita que el frotis se seque al aire antes de teñirlo. Se pueden abanicar en el aire para
que se sequen en menos tiempo.
6. Marque el portaobjetos con un lápiz marcador. La identificación debe ser en el extremo
grueso (o el esmerilado) del portaobjetos.

Existe un dispositivo especial para empujar o laminilla de extensión en el comercio para

dispersar los frotis sanguíneos sin marcas en los bordes.
Evaluación visual de un buen frotis de sangre

Un frotis ideal tiene las siguientes características:

1. Progresa de grueso en el punto de origen, a delgado con un borde uniforme en el punto

de terminación.
2. No toca los bordes externos del portaobjetos, ni se desborda por los lados o extremos del
mismo.
3. Se ve liso sin ondas ni huecos.
4. No tiene estrías, crestas ni depresiones, lo cual indicaría que se llevaron más leucocitos a
esta área.
5. Se prepara con una cantidad adecuada de sangre y se extiende para ocupar dos tercios
de la longitud del portaobjetos de vidrio.

Causas de un frotis de sangre deficiente

1. Almacenamiento prolongado de muestras de sangre entera anticoagulada. Esto puede

ocasionar distorsión celular.
2. Retraso en la preparación del frotis. Es importante realizar el frotis inmediatamente
después de colocar la gota de sangre en el portaobjetos. Si este proceso se retrasa, las
células más grandes, como los neutrófilos y monocitos, se localizan de manera
desproporcionada en el extremo desgastado cuando se examina al microscopio.
3. Portaobjetos sucios o de mala calidad. Las laminillas deben estar libres de polvo y
manchas de grasa.
4. Tamaño inapropiado de la gota de sangre. Una gota demasiado grande produce un frotis
grueso y largo. Una gota demasiado pequeña produce uno delgado y corto.
5. Ángulo incorrecto del portaobjetos de empuje. Mientras menor sea el ángulo del
portaobjetos de empuje, es más largo el frotis. Mientras más grande sea el ángulo, el
frotis es más grueso.
6. Velocidad inapropiada del movimiento de empuje. La lentitud en el empuje de la gota de
sangre produce irregularidades y afecta la distribución de las células en el frotis.
7. Presión inadecuada, mientras más sea la presión, más delgado será el frotis.
8. Humedad en el ambiente del laboratorio. La humedad elevada puede hacer que las
laminillas se sequen con mayor lentitud. El secado prolongado produce distorsión de los
eritrocitos al examen microscópico.

MÉTODO CON CUBREOBJETOS PARA PREPARAR UNA PELÍCULA DE SANGRE

1. Sostenga dos cubreobjetos limpios por sus bordes con los dedos pulgar e índice de cada
mano. Toque el centro de un cubreobjetos con una pequeña gota de sangre.
2. Coloque de inmediato el segundo cubreobjetos sobre la gota de sangre en sentido
diagonal.
3. Permita que la sangre se extienda por acción capilar. Justo antes de que se detenga la
diseminación, separe con suavidad y de manera uniforme los cubreobjetos en el plano
horizontal.
4. Coloque los frotis en posición vertical y permita que sequen al aire antes de teñirlo.

El método del cubreobjetos produce una buena distribución de los leucocitos en todas las
partes de la preparación. A causa del menor tamaño de la muestra, se cuentan 50 leucocitos
por cada cubreobjetos. Debido a la pequeñez del cubreobjetos, casi siempre se coloca
(adhiere) sobre un portaobjetos convencional para teñirlo.

TINCIÓN RUTINARIA DE UN FROTIS DE SANGRE PERIFÉRICA

Para examinar con detalle las células de un frotis de sangre, es necesario teñirlas. La tinción
más usual en el laboratorio de hematología es la del tipo Romanowsky.

Principio de la tinción

En 1981, Romanowsky y Malachowsky describieron por primera vez el uso de una tinción
que combinaba una solución policroma de azul de metileno (oxidado) con eosina para teñir la
sangre. Diez años más tarde, Leishmann refinó esta técnica; combinó la eosina con el azul
de metileno policromo, recuperó el precipitado y lo disolvió en alcohol metílico. Hoy en día,
las tinciones tipo Romanowsky se preparan con esta técnica modificada.

Una tinción de Romanowsky se define como cualquier tinción que contenga azul de metileno
y/o sus productos de oxidación, además de un pigmento de fluoresceína halogenada, casi
siempre eosina B o Y.

Las tinciones de base de Romanowsky, como la técnica de Wright, Giemsa o May-Grünwald,

son soluciones alcohólicas con componentes ácidos y básicos. Las tinciones de este tipo se
conocen como policromas porque pueden impartir muchos colores y producir el efecto de
Romanowsky. Este efecto imparte un color típico a ciertos componentes celulares y refleja la
acción combinada de los pigmentos contenidos en la tinción a un pH de 6.4 a 7.0. Los
colores característicos son púrpura en el núcleo celular, azul y rosa en el citoplasma y varios
colores en gránulos específicos.

Preparación de la tinción

La oxidación del azul de metileno origina una solución que contiene sobre todo azul de
metileno; azur A, B y C, violeta de metileno, y la tionina sindimetiltionina. Cuando se agrega
el pigmento eosina a esta solución, el precipitado que se forma consiste en eosinatos de
estos productos. El eosinato de azur B parece ser el compuesto que produce el efecto
Romanowsky característico. Las tinciones con mayor cantidad de eosina azur B reaccionan
con rapidez y proporcionan un mejor efecto Romanowsky que los productos que contienen
menor cantidad de esta sal.
El contenido de azur B y eosina Y debe ser consistente y guardar las proporciones correctas,
pueden prepararse soluciones con una composición y peso conocido de azur (por ejemplo
tinción de Giemsa). Una solución base de la tinción se disuelve en una mezcla de glicerol y
alcohol metílico absoluto. Luego, la tinción base se diluye con amortiguador de fosfato de pH
6.8 para permitir la ionización de las tinciones.

Reacciones de tinción

A continuación se describen las tinciones específicas en una tinción tipo Romanowsky y sus
reacciones asociadas:

El azul de metileno es un pigmento alcalino que tiñe el núcleo y algunas estructuras

citoplasmáticas de color azul o púrpura. Por tanto, estas estructuras son basófilas (por
ejemplo DNA o RNA).

La eosina es un pigmento ácido que tiñe algunas estructuras citoplasmáticas de color rojo -
naranja. Las estructuras que adquieren este color son acidófilas (por ejemplo proteínas con
grupos amino).

Cuando una estructura citoplasmática capta los componentes alcalino y ácido de la mezcla
de tinción, adquiere un color rosa o lila. A esto se le conoce como una reacción neutrófila.

Procedimiento de la tinción

La sangre y otros tipos de muestras pueden teñirse con pigmentos de tipo Romanowsky.

Estas tinciones pueden prepararse en el laboratorio o adquirirse en su forma lista para usar.
Puede usarse en técnica manual o automática.

En algunos laboratorios, los frotis por separado se fijan con alcohol antes de iniciar el
procedimiento de tinción. Este paso intensifica la retención de gránulos en las células
sanguíneas. El fijador usual es el alcohol metílico. Los portaobjetos pueden colocarse en
metanol anhidro y libre de acetona durante 1 minuto o más. Las tinciones de Wright y otras
del tipo Romanowsky se disuelven en alcohol metílico, por tanto la fijación suele realizarse
cuando se aplica el colorante al frotis sanguíneo.

Las tinciones pueden adquirirse en su forma lista para usarse o pueden prepararse mediante
la dilución de ampolletas con peso ya determinado en alcohol metílico de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Se necesita un soporte para tinción o frascos para tinción de
Coplin.

1. Coloque la laminilla bien seca y con la identificación adecuada en un soporte para tinción
nivelado con el lado del frotis hacia arriba.
2. Coloque tinte recién filtrado lentamente sobre el portaobjetos hasta que el frotis quede
todo cubierto. No agregue tinte en exceso. Los tiempos de tinción varían. A menudo se
necesitan de 3 a 10 minutos para obtener un frotis sanguíneo con un a tinción aceptable.
3. Al final del tiempo de tinción, agregue el amortiguador (pH 6.4 con suavidad al
portaobjetos sin retirar el tinte. El amortiguador debe formar una burbuja grande de forma
convexa sobre la laminilla. No agregue una cantidad excesiva de amortiguador. Algunos
laboratorios prefieren usar agua corriente ordinaria en lugar del amortiguador.
4. Mezcle el tinte y el amortiguador mezclando con suavidad e el portaobjetos. Una laminilla
bien mezclada debe exhibir un brillo verde metálico en la superficie. El tiempo para esta
etapa debe varía entre 2 y 5 minutos.
5. Lave el tinte y el amortiguador del portaobjetos con un flujo suave de agua corriente.
Levante el portaobjetos por los bordes y limpie el dorso del mismo para eliminar cualquier
pigmento.
6. Permita que el extendido coloreado se seque al aire libre.

Fuentes de error en la tinción

La tinción de mala calidad puede tener varias causas:

1. La falta de filtrado diario del tinte o antes de usarlo puede producir sedimentos en los
frotis sanguíneos. Si el sedimento precipitado es abundante, será imposible visualizar las
células sanguíneas al microscopio. Pequeñas cantidades de sedimento pueden
confundirse con plaquetas en el examen microscópico.
2. El pH inapropiado del amortiguador puede producir una reacción tintorial demasiado
brillante o demasiado oscura. La solución amortiguadora debe controlar el equilibrio ácido
- base de la tinción para producir los colores adecuados en los diversos componentes de
las células sanguíneas. Un amortiguador demasiado ácido determina que un frotis
sanguíneo se vea demasiado rojo en el examen microscópico. Si el amortiguador es
demasiado alcalino, el frotis se verá demasiado azul en el examen microscópico.
3. Los tiempos incorrectos de tinción o amortiguación pueden hacer que la tinción sea débil
o que los colores de los frotis de sangre estén alterados. Un tiempo de tinción demasiado
breve determina que el frotis de sangre se vea demasiado rojo al microscopio. Si el
tiempo de tinción se prolonga mucho, este frotis se verá muy oscuro.
4. Los reactivos deteriorados o las proporciones inapropiadas de tinte y amortiguador
durante el proceso, producen colores deslavados en las células.
 VALORACIÓN DEL EXTENDIDO DE SANGRE PERIFÉRICA

ANOMALÍAS MORFOLÓGICAS EN LOS ERITROCITOS

Normalidad

1. Alteraciones morfológicas en los eritrocitos.

• Anisocitosis Desigualdad en el tamaño de los hematíes. Para evaluarla se tiene en

cuenta el número de estas en 10 campos observados.
• Microcitosis: Predominio de hematíes de diámetro < 6 µm y VCM < 80 fL.
• Macrocitosis: Predominio de hematíes de diámetro>= 12 µm y VCM >100 fL.
• Megalocitosis: Predominio de hematíes de diámetro >= 12 µm y VCM >100fL.
2. Alteraciones de la forma (poiquilocitosis).

• Esquistocitos: Hematíes fragmentados.

• Dacriocitos: Hematíes con una proyección alongada en un polo(forma de pera o
lágrima)
• Esferocitos: Hematíes de forma esférica sin aclaración central.
• Ovalocitos: Hematíes en forma de óvalo.
• Eliptocitos: Hematíes en forma elíptica.
• Drepanocitos: Hematíes falciformes.
• Codocitos o hematíes en forma de diana: Hematíes con un área con mayor
contenido de hemoglobina que se sitúa en la zona central clara.
• Estomatocitos: Hematíes que en su región central clara posen una hendidura en forma
de boca.
• Equinocito o hematíes crenados: Hematíes con espículas cortas distribuidas
regularmente por toda la superficie.
• Keratocitos o hematíes en casco: Presentan dos proyecciones en forma de espiculas.
• Excentrocitos: Hematíes con distribución anormal de la hemoglobina. Se dispone
como despegada de la parte interna de la membrana y concentrada en uno de sus
extremos.
3. Alteraciones de la coloración de la hemoglobina.

• Hipocromía: Se consideran los glóbulos rojos hipocrómicos, cuando su contenido de

hemoglobina es inferior al normal. La carencia de hemoglobina severa o marcada, por
lo general trae como consecuencia que los glóbulos rojos se deformen produciéndose
formas anormales y carentes de hemoglobina, como los cadocitos, anulocitos y
leptocitos entre otros. Para evaluar la Hipocromía se deben contar 10 campos
microscópicos, sacar el promedio de glóbulos rojos hipocròmicos
• Policromacia: Hematíes jóvenes que conservan parte del material basófilo del
eritroblasto y se tiñen de color gris. Un aumento en la policromatofilia observada en
ESP es reflejo de una médula ósea en estrés que está respondiendo a la hipoxia
generada por la no-disposición de oxígeno en los tejidos. La policromatofilia se
relaciona directamente con reticulocitos revelados con la coloración supravital. Para
informar la policromatofilia se debe contar diez campos, sacar un promedio.

4. Inclusiones eritrocitarias.

• Corpúsculos de Howell-Jolly: Corpúsculos redondos únicos o múltiples de 1 µm

de diámetro de color rojo violáceo. No es común encontrar más de una inclusión
en cada glóbulo, y su hallazgo es típico de procesos diseritropoyeticos. Son
basófilos y se tiñen intensamente con las coloraciones de Romanowsky. Están
compuestos de por cromatina nuclear picnótica. Las anemias hemolíticas graves,
anemias diseritropoyéticos. Un pequeño número de estas inclusiones aparece tras
la esplenectomía, la asplenia congénita, así como en la mielofibrosis avanzada.

• Anillos de Cabot: Constituyen unas finas fibras basófilas que se tiñen con el azul
de metileno de las coloraciones de Romanowsky, algunas veces se disponen
concentricamente a la membrana eritrocitaria, otras aparecen en forma de ocho.
El anillo por lo general se encuentra asociado a otras inclusiones como el
 punteado basòfilo. Dado su tamaño no se registran en el histograma glóbulos
blancos ni dispersograma. Línea muy fina en forma de anillo o de 8 de color
rosado o gris.

• Punteado basófilo: Corresponde a una acumulación de gránulos basófilos que

se tiñen con el azul de metileno de los colorantes de Romanosky, están agregados
ribosómicos. El punteado basófilo fino se observa generalmente en trastornos
caracterizados por la alteración en la biosíntesis de hemoglobina, como en los
síndromes diseritropoyéticos, hemoglobinopatías. El punteado basófilo grueso se
observa en procesos tóxicos como en intoxicaciones por plomo; no obstante,
cualquiera de los dos, fino o grueso, se puede encontrar indiscriminadamente en
cualquiera de los casos mencionados. Agrupados de color azul grisáceo.

• Cuerpos de Pappenheimer: Son inclusiones intraeritrocitarias que contienen

gránulos de hierro en asociación con mitocondrias y restos ribosomales. Son
indicativos de las alteraciones de la eritropoyesis, especialmente la observada en
las anemias sideroblásticas, talasemias, alcoholismo grave y otros procesos
diseritropoyèticos. Se pueden observar también en síndromes postesplenectomía.
Gránulos azul negruzcos.

• Reticulocitos

• Cuerpos de Heinz: Esferulas azules.

• Siderocitos: Gránulos verdes (tinción de Perls).

• Parásitos: Plasmodium, filaria, babesia, bartonella bacilliformis.

ANOMALÍAS MORFOLÓGICAS DE LEUCOCITOS POLINUCLEARES NEUTROFILOS

1. Alteraciones nucleares

• Anomalía constitucional de Pelger Huet: Es una anormalidad de los Leucocitos

PMN con relativa ausencia de segmentación. Queda configurado en forma de
banda o en 2 segmentos; cuando son dos se consideran que uno es imagen
especular del otro, y se fundamentan como una expresión heterocigótica del
fenómeno. La no lobulación obedece a una expresión homocigótica. Hablamos de
Pelger cuando todos los PMN son hiposegmentados y de pseudopelger cuando
algunos presentan segmentación normal. Pueden encontrarse normalmente en
forma hereditaria o patológicamente adquirida y se considera como precursor de
un proceso mieloide agudo. Es muy importante tener en cuenta esta anormalidad,
ya que la morfología de los neutrófilos se puede prestar a confusión con algunas
células inmaduras. En el histograma de leucocitos se registran en la zona del valle
 entre monocitos y granulocitos. En el dispersograma queda con el grupo de
neutrófilos, ubicándose hacia el límite inferior de su área de informe.
• Núcleos en anillo: Hiposegmentación nuclear con un gran agujero central.
• Hipersegmentación nuclear: Polinucleares con 4 o más segmentos.
• Pleocariocito: Hipersegmentación nuclear y gigantismo celular simultáneamente.

2. Alteraciones del citoplasma

• Granulación tóxica: Las granulaciones tóxicas de los PMN son gránulos hipertrofiados
que le dan un aspecto hipergranular a los citoplasmas, especialmente de los
neutrófilos. Las células con este tipo de inclusiones no presentan un registro especial
ni en los histogramas ni en dispersogramas. Granulación que se tiñe de forma
pronunciada.

• Degranulación: Neutrófilo sin granulación, aparece azulado y agranular.

• Anomalía de Alder-Reilly: Es una característica autosómica recesiva que se manifiesta

en los leucocitos con la presencia de gránulos azurofilos agrupados en racimos.
Comúnmente se observa en granulocitos, monocitos, y linfocitos, en neutrófilos se
podrían confundir con granulaciones tóxicas, sin embargo, las existencias en otras
células diferentes de PMN y la ausencia de vacuolas tóxicas y de cuerpos de Doler
ayudan a hacer la diferenciación. Esta anomalía se ha asociado al síndrome de
Hunter, el síndrome de Hurler (gargolismo) y el enanismo polidistrófico; todos estos
asociados con un desorden de los mucopolisacàridos caracterizado por opacidad de
la córnea, defectos en el crecimiento, deformidad de la columna vertebral y muerte en
la primera década de la vida. Granulaciones burdas de color violeta.

• Anomalía de steinbrinck Chediak- Higashi: Es un desorden autosomico raro que se

caracteriza por la presencia de PMN carentes de gránulos azurofilos primarios, en su
lugar se forman gránulos pleomorficos anormales y afuncionales, se encuentran
principalmente en los PMN y monocitos. La ausencia de gránulos normales
predispone a la infecciones recurrentes que, en general, es lo que acciona la muerte
del pacientes anomalía se observa en niños con infecciones crónicas graves.
Frecuentemente se asocia con albinismo. Gránulos en forma de inclusiones azules
oscuras de 3 a 9 micras.

• Cuerpos de Dohle: No son exclusivos de PMN, también se pueden encontrar en los

citoplasmas de los monocitos y se observan como inclusiones redondeadas basófilas
que se depositan en la periferia de las células, por lo tanto, es más factible
encontrarlos en el citoplasma de los neutrófilos, ya que al ser acidófilo, las inclusiones
basófilas resaltan en los citoplasmas basófilos de los eosinófilos y los monocitos
pueden pasar desapercibidos. Inclusiones basófilas, avaladas o rectangulares.

• Bastones de Auer: Son inclusiones intracitoplasmáticas en forma de varilla o bastón

que observamos en los mieloblastos, promielocitos y monoblastos. Se cree que son
gránulos azurofilos que se fusionan. Tienen afinidad por la eosina. Se encuentra en
 leucemia mieloide aguda y durante la crisis blastica de la leucemia mieloide crónica.
Estructuras azurofilas en forma de bastoncillo, de puntas afiladas (desde blasto hasta
Neutrófilo).

OBSERVACIONES DE LA LINEA PLAQUETARIA

• Número de plaquetas
• Distribución de plaquetas
• Cúmulos de plaquetarios
• Satelitismo plaquetario
• Anisocitosis plaquetaria
• Granularidad plaquetaria

REPORTE ERITROCITARIO EN EL EXTENDIDO DE SANGRE PERIFÈRICA

Las anormalidades eritrocitarias (anisocitosis, poiquilocitosis, hipocromia y policromatofilia)

se reportan en forma semicuantitativa como aparecen en el siguiente cuadro, una vez
analizados varios campos microscópicos:

ANISOCITOSIS

Normal Ligera Moderada Marcada

0-5 células 6-15 células 16-30 células Más de 30 células
ADE hasta 15,5 16.1 - 18 18.1-20 Mayor de 20
 Ìndice Normal Ligera(+) Moderada(++) Marcada(+++)
0-5 6-15 16-30 MAYOR 30
Micro:
VCM (FL) 80-95 76-80 66-75 Menor de 65
Macro:
VCM(FL) 80-95 96-108 109-120 Mayor de 120

POIQUILOCITOSIS

Normal Ligera(+) Moderada(++) Marcada(+++)

0-1 célula 2-5células 6-15 células Más de 15 células

POLICROMATOFILIA

Indice Normal Ligera(+) Moderada(++) Marcada(+++)

0-1 1-2 3-5 Más de 6 células
Reticulocitos%
0,1 2-4 5-6 Mayor de 6

HIPOCROMIA

Indice Normal Ligera(+) Moderada(++) Marcada(+++)

0-5células 6-15 células 16-30 células Más de 30 células
HCM%
29-33 28-30 25-27 Menor de 24

INCLUSIONES

Indice Normal Ligera(+) Moderada(++) Marcada(+++9

0 1-2 células 3-5 células Más de 6 células