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propiedades del vino

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AGRADECIMIENTOS

En primer lugar quiero dar las gracias al Dr. Ramón Oliver y Dr. Santiago Hernández por darme la oportunidad de participar en este proyecto realizado en el Departamento de Quimiometría de la Universidad de Barcelona.

En segundo lugar, dar las gracias a la dirección de la parte experimental de este proyecto, al Dr. Xavier Saurina, sus consejos han hecho posible el desarrollo de este.

También agradecer a los compañeros del laboratorio de quimiometría, en especial a Anna y Toni, que me han ayudado a resolver los problemas y dudas que han ido surgiendo durante estos 4 meses.

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CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN

1.1. El vino y sus propiedades
El vino es una bebida alcohólica que se obtiene a partir de la fermentación alcohólica del zumo de uvas y por extensión la obtenida a partir de otros frutos o materiales vegetales. Su elaboración consta de 3 fases principales: obtención del mosto, su fermentación y por último su conservación y envejecimiento. El vino forma parte de nuestra cultura des de hace aproximadamente 6.000 años. A lo largo de estos años la consideración social del vino ha ido cambiando. Hace poco tiempo que el estudio del vino estaba enfocado en los efectos adversos que producen sus componentes, ya que contiene especies químicas causantes de las alteraciones relacionadas con la seguridad alimentaria. En cambio, desde hace una década, el interés científico se ha centrado en los efectos beneficiosos que comporta el consumo moderado del vino para la salud. Los polifenoles no tienen una función conocida en la nutrición (o sea no son nutrientes) y en los estudios se ha demostrado las propiedades biológicas como antioxidantes, antisépticos, antimutagénicas, anticarcinogénicas y antinflamatorias entre otros, que son beneficiosas en la prevención de enfermedades y en la protección del genoma, particularmente para las células epiteliales intestinales, unos de los tejidos más proliferativos del cuerpo humano. Los componentes más importantes del vino son el agua (componente mayoritario), el alcohol etílico (entre 7 y 17 grados alcohólicos), pequeñas cantidades de otros alcoholes, ácido málico, tartárico, cítrico, acético y carbónico, polifenoles (tañimos, antocianos), sustancias nitrogenadas (aminoácidos, aminas), hidratos de carbono, especies inorgánicas (potasio y fosfatos) y sustancias volátiles (aldehídos, cetonas, ésteres). La composición cualitativa y la cuantitativa depende de la clase del vino. La calidad de los vinos se encuentra condicionada por la materia prima, los microorganismos que intervienen en la vinificación y por las condiciones tecnológicas de la elaboración.
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Arantza León Sanz

Una Denominación de Origen es una indicación geográfica que garantiza el origen y la calidad de un vino. Indica que el vino se ha obtenido en zonas delimitadas y que ha estado elaborado según el reglamento preciso (variedades de cepas, rendimiento límite por hectárea, grado alcohólico, prácticas vinícolas y envejecimiento, calidades organolépticas, etc.)

1.1.1.

Vinificación
nombrado vinificación

Las diversas etapas del proceso de elaboración del vino son las siguientes:

Vendimia: es la cosecha de la uva cuando ha alcanzado el grado de maduración deseado, la composición de la cual depende de la variedad, el clima, el suelo y del agua. La mezcla de variedades de uva: se determina por el vino que se quiere obtener. La separación de la rapa: se ha de separa la parte leñosa del racimo de la uva mediante una máquina llamada despalilladora. Obtención del mosto: puede ser por dilaceración (rotura de los granos del racimo mediante rodillos o cilindros), por centrifugación (separando las partes sólidas del líquido) o por prensado (directamente o mediante separación previa de la rapa). En otros tiempos se conseguía pisando la uva con los pies. Correcciones y manipulaciones del mosto: es la enyesada (con sulfato de calcio), la sulfatación (con dióxido de azufre o derivados) y la fosfatación (con fosfatos) para obtener vino de características correctas y constantes. Fermentación alcohólica: se vuelcan en grandes depósitos de madera o acero inoxidable donde el mosto va fermentando debido a las levaduras, transformando los azúcares en alcohol etílico y CO2. Actualmente se acostumbra a inactivar la levadura del mosto por sulfatación y se añade la levadura seleccionada. Durante el proceso, en el cual se ha de controlar la temperatura y el aire, los restos de sólidos suben a la superficie impidiendo la correcta ventilación. La fermentación que primeramente es lenta, después es tumultuosa y finalmente vuelve a ser lenta, tiene una durada que oscila entre unos cuantos días y algunas semanas. Es importante controlar el pH de este proceso ya que de él depende su rendimiento. Si se trata de un vino negro o rosado hace falta que la piel esté en contacto con el mosto fermentado ya que los antocianos (donadores del color) sólo se disuelven bien en alcohol. En este caso, se lleva a cabo la maceración carbónica, proceso en el cual el racimo se fermenta sin romper la uva. El método convencional de fermentación alcohólica comporta la rotura o aplastamiento de los granos de uva para liberar el zumo y la pulpa de la piel. En la maceración carbónica el zumo fermenta mientras se encuentra aun dentro de la piel del grano. Fermentación málico láctica: es debido a bacterias que producen la descarboxilación del ácido málico dando lugar al ácido láctico, alcoholes
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bentonita o enzimas. Después. perdida de color y aumento del acidez volátil. la cual cosa da lugar a una perdida de acidez del vino y una ganancia en suavidad y aroma. se puede someter el vino a diversas correcciones: alcoholización o adobamiento. y tiene una duración que varía desde tres meses hasta más de cinco años. y el intercambio de aromas entre el vino y la madera le confiere a estos unos rasgos más complejos. Puede dar lugar espontáneamente después de la fermentación alcohólica o se puede inducir. Esta fermentación aporta una disminución del pH a la vez que aumenta el contenido en polifenoles y glicerol. Prensa de la parte sólida: da un nuevo líquido. La mayoría de vinos de mediana y baja calidad son sometidos. Polifenoles en el vino Los polifenoles son un grupo de sustancias químicas formadas por anillos aromáticos y caracterizados por la presencia de al menos un grupo fenol en su estructura. corrección de la cata del vino dulce con azúcar o con mosto (vino vertido) y clarificación con gelatina. pero también puede conducir a su deterioramiento debido a la formación de aminas biogénicas. corrección del color. son potentes antioxidantes.Determinación de Polifenoles en el Vino y CO2. Pasa en las bodegas y puede incluir una fermentación málico láctica espontánea. • • • 1. después del cual el vino adquiere unas características similares a las que se conseguirían haciéndolos envejecer en la bodega durante tres meses. neutralización. que se añade al trasegado. o se obtiene un vino de menos calidad (vino prensado). -9- . Estos vinos serán los nombrados de Crianza. Son productos esenciales para la fisiología vegetal y en general. el vino se vuelve a trasegar.2. adición de ácido tartárico o ácido cítrico. Tiene lugar en botas de madera. Estructuralmente van des de moléculas simples como los ácidos fenólicos a polímeros de alto peso molecular como los taninos. • • Trasegar: facilita el aireo y la separación del poso. habitualmente roble. Embotellamiento: para obtener la calidad deseada. Segunda fermentación lenta: reposo y enfriamiento del vino que facilita su transparencia. al envejecimiento acelerado. en esta etapa se producen un conjunto de oxidaciones. que consiste en mantenerlos a una temperatura próxima a la de su punto de congelación durante un periodo de ocho días. pero. Envejecimiento: químicamente. Reserva y Gran Reserva. reducciones y esterificaciones que completan la maduración del vino. Se estima que hay más de 8.000 polifenoles diferentes.

Clasificación Polifenoles Átomos de Carbono Esqueleto Tipo Ejemplos presentes en vino 6 C6 Fenoles Simples Benzoquinonas -------------------------. Estos efectos son debidos al hecho que algunos polifenoles. hasta hace poco tiempo.10 - .--------------. Los compuestos polifenólicos de la uva se encuentra en la piel.C2 Derivados de Tirosina Ácidos Fenilacéticos Tirosol . Tabla 1.------------------------------8 C6 .C1 Ácidos Fenólicos Ácido Gálico -------------------------.--------------. y después del proceso de vinificación los encontraremos en el vino.------------------------.------------------------. pero se piensa que es muy alta.Arantza León Sanz Los polifenoles se subdividen de la siguiente manera: Figura 1. precipiten proteínas presentes en los alimentos y también forman complejos insolubles con algunos oligoelementos y por lo tanto disminuyen el valor nutricional de los alimentos.------------------------------7 C6 . el interés nutricional de estos compuestos requiere en los efectos adversos que se producen. y puede superar el gramo por día en algunas poblaciones.Clasificación de los polifenoles.1. como ahora los taninos. No obstante esto. en semillas y en la pulpa. La ingesta total de polifenoles en el ser humano es difícil de calcular. La siguiente tabla muestra el tipo de polifenol según el número de átomos de carbono y ejemplos de esos polifenoles en el vino.

C3 Ácidos cinámicos Fenilpropenos Cumarinas -------------------------.------------------------.------------------------------9 C6 .--------------.--------------.------------------------. el proceso de envejecimiento o el cáncer).------------------------------n15 (C6-C3-C6)n Taninos Condensados Procianidina 1.--------------.--------------.------------------------------30 (C6-C3-C6)2 Bioflavonoides Resveratrol -------------------------.------------------------. por lo tanto.------------------------.------------------------------14 C6.Determinación de Polifenoles en el Vino -------------------------.--------------.------------------------------18 (C6-C3)2 Lignanos Neolignanos -------------------------.------------------------.------------------------------13 C6 -C1-C6 Xantonas -------------------------. ya que la mayoría de estos compuestos actúan como antioxidantes y.2.C2-C6 Estilbenos Antraquinones -------------------------. Muchos se investigan con profundidad para determinar si resultan útiles como anticancerígenos y en el tratamiento de otras enfermedades de gran trascendencia social. .------------------------------n6 (C6)n Melaninas Catecolicas -------------------------. podrían tener efectos beneficiosos sobre enfermedades en que la oxidación representa un papel importante (enfermedades cardiovasculares.------------------------.------------------------.--------------.--------------.------------------------.------------------------.1.--------------.------------------------------10 C6-C4 Naftoquinones Ácido Cafeico -------------------------.------------------------.11 - .--------------. En la última década los compuestos polifenólicos han despertado un gran interés en la comunidad científica.------------------------------15 C6-C3-C6 Flavonoides Isoflavonoides Quercetina Cianidina Catequina Miricetina Malvidina -------------------------. Papel de los polifenoles en el vino Los polifenoles se les atribuye diferentes efectos beneficiosos para la salud humana. neurodegenerativas como el Alzheimer o el Parkinson.--------------.------------------------------n9 (C6-C3)n Ligninas -------------------------.

A .5 7. contenido total de polifenoles en diversas bebidas.3. pero en cantidades diferentes. Urquiaga en su estudio [1] de polifenoles dan valores equivalentes a los de la tabla 1.1 8. se han realizado diversos estudios que demuestran que el vino tinto presta mayor protección cardiovascular a diferencia del vino blanco.8 0. Concentracion en mg/L de algunos constituyentes polifenolicos del vino. Leighton y I.5 9. Contenido total de polifenoles (mg/L) Vino tinto Vino blanco Cerveza Te 1000-4000 200-300 60-100 750-1050 En un estudio de un vino tinto Cabernet Sauvignon se hizo un fraccionamiento y análisis por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) obteniéndose como resultado tres fracciones: • • • Polifenoles neutros Polifenoles ácidos En la fracción acuosa residual las antocianinas.03 Tabla 1. [3] La fracción de polifenoles hidrosolubles representa el 71% de sus componentes fenólicos por lo tanto lo más importante en cuanto a capacidad antioxidante.1 2.12 - . El vino tinto contiene muchos más polifenoles que el blanco. Tabla 1.8 23.0 1. mientras que los vinos rosados se encuentran en una posición intermedia.Arantza León Sanz Los polifenoles se encuentran en todos los tipos de vinos.0 0. F.0 0.0 0.5 7 35 21 2.2.7 1.3 donde se comparan diversas bebidas [2]. Además. Polifenoles Ácido gálico Catequina Epicatequina Ácido cafeico Cianidina Malvidina 3-glucosa Rutina Miricetina Quercitina Resveratrol Vino tinto Vino blanco 95 191 82 7.0 0.

Polifenoles Utilizados A continuación se muestra una lista con la clasificación y la estructura de cada uno de los polifenoles estudiados en este proyecto: 1. que es un producto natural que se encuentra principalmente en la piel y piñones de la uva. y se unen a las lipoproteínas humanas de baja densidad (LDL) después de un consumo moderado de vino.[4] Como ejemplo de los polifenoles.2.Determinación de Polifenoles en el Vino pesar de estola fracción de polifenoles neutros es la que tuvo mayor actividad antioxidante por unidad de concentración de polifenoles. Ácidos Fenólicos • Ácido Siríngico • Ácido Gálico . y recientemente se asocia a la protección de enfermedades neurodegenerativas.13 - . [5-7] 1.2. hablamos del resveratrol. ayuda a reducir el riesgo de enfermedades coronarias. Es un potente antioxidante al que se le atribuyen diferentes efectos beneficiosos como actividad antiinflamatoria y antitumoral. Su contenido en el vino depende de la variedad de uva y de la tecnología aplicada en la producción vinícola.

4-dihidroxibenzoico • 4-hidroxibenzoico .14 - .Arantza León Sanz • Ácido Vanílico • • 3.

15 - .Ácidos Cinámicos • Ácido Cafeico • Ácido Cumárico • Ácido Felúrico .Determinación de Polifenoles en el Vino 2. .

Flavonoides • Epicatequina • Catequina • Quercetina .16 - .Arantza León Sanz 3. .

. Métodos analíticos para la determinación y caracterización de los polifenoles en el vino Los polifenoles son los compuestos más relacionados con las propiedades organolépticas del vino. La caracterización de los vinos respecto a los polifenoles esta enfocada más en este sentido que no con el proceso vinícola.1. los orígenes o otros factores. el tipo de uva.1. Estos métodos realizan la detección mediante técnicas espectrofotométricas. La composición elemental e isotópica [18]. Cromatografía de líquidos (HPLC) liquid La cromatografía líquida de alta eficacia o High performance chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna. las redes neuronales artificiales (ANN) y la refresión por mínimos cuadrados parciales (PLS) se utilizan para obtener clasificaciones mas especificas. De todos ellos se da una descripción en [22]. También hay estudios que tratan de extraer información de otras propiedades. Otros métodos como el análisis de agrupaciones (CA). En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente.20] y las imprentas digitales de compuestos volátiles [21] han estado utilizadas en diversos estudios para clasificar y correlacionar los vinos según la vinificación. La determinación polifenoles se suele llevar a cabo mediante técnicas de separación como HPLC [8. el envejecimiento. El contenido de los polifenoles en los vinos mantiene una fuerte dependencia con el clima. el análisis discriminante linear (LDA). fluorimétricas o acoplamiento a MS.3. Los estudios realizados con polifenoles se decantan para caracterizar los vinos según sus propiedades organolépticas.17] de gran interés debido a la rapidez del análisis. el contenido de polifenoles [19. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica. Este perfil composicional puede dar información relevante. Técnicas utilizadas 1. El análisis por componentes principales (PCA) es el método quimiométrico más utilizado para un estudio preliminar de las propiedades de los vinos a partir de los datos de los perfiles composicionales anteriormente nombrados. También se han descrito métodos inmunológicos y enzimáticos [16. La caracterización de los vinos según la familia de compuestos estudiada la caracterización se enfoca en una dirección o en otra.17 - .4. 1. un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna.4. la agricultura y las prácticas vinícolas.9] CE [10-12] o GC [13-15]. etc. a pesar de que la composición de compuestos polifenólicos también se puede caracterizar los vinos según la región.

El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria.4. el agua fuertemente en la región del infrarrojo. Para facilitar la detección se ha desarrollado diversas estrategias de derivatización. Electroforesis Capilar (CE) Se basa en una técnica de separación de analitos mediante la aplicación de un campo eléctrico. es disipada como calor (vibraciones moleculares). aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe radiaciones de longitudes de onda que no pertenecen al espectro visible. Sus límites de detección están condicionados por el pequeño volumen de muestra introducida en el capilar. visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto. La absorción de las radiaciones ultravioletas. 1. son transformadas en luz visible. El gran poder de separación. La diferencia de energía entre la absorción y la emisión. una molécula absorbe un fotón de alta energía. Todas las sustancias pueden absorber energía radiante. de una longitud de onda mayor al incidente. En el proceso. La Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la solución. Las radiaciones absorbidas (invisibles al ojo humano). Cuando la luz atraviesa una sustancia. [23] 1. y es característica para cada sustancia química.3.4.18 - .4. se excita y después emite como un fotón de baja energía (mayor longitud de onda).Arantza León Sanz La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna.4. Espectrofotometría La espectrofotometría es un método de análisis óptico que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto. y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Fluorescencia La fluorescencia es la propiedad de una sustancia para emitir luz cuando es expuesta a radiaciones del tipo ultravioleta. o sea. la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida. esta técnica resulta adecuada para separar muchos analitos en una gran diversidad de áreas. parte de la energía es absorbida.2. de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas. 1. En la fluorescencia todo el proceso es muy corto . rayos catódicos o rayos X. eleva eficacia y bajo consumo de muestra. generalmente del orden de pocos nL.

El PCA descompone la matriz de datos experimentales en sus componentes principales de la siguiente forma: R = TP T + E (1) Siendo R la matriz experimental. Puede utilizarse para una caracterización preliminar de los datos y para establecer pautas y dosificaciones. De esta forma. la fosforescencia (<10-5 s). las representaciones de los loadings proporcionan un información muy útil acerca de la relevancia de las variables y de sus posibles correlaciones. El segundo componente principal. Métodos quimiométricos tratamiento de datos para el El análisis por componentes principales (PCA) se basa en concentrar la información de un sistema. Normalmente. El superíndice T se utiliza para indicar la matriz transpuesta. El análisis por componentes principales actúa a modo de filtro de datos. P la matriz de vectores propios. de modo que el primer componente principal describe la máxima cantidad de información posible referente al sistema. es ortogonal o perpendicular al primero y describe la máxima cantidad de la información residual. T la matriz de coordenadas principales o scores que contiene las coordenadas de cada muestra en el nuevo espacio de componentes principales. En ciertos casos particulares son interesantes las representaciones de los componentes principales superiores. se consigue una distribución bidimensional de los objetos en la que pueden apreciarse las diferentes agrupaciones y los objetos que se separan de ellas. eliminando la información repetitiva y las variaciones aleatorias asociadas al proceso experimental. por su parte. También.19 - . suelen representarse los scores del primer componente principal con respecto a los scores del segundo.Determinación de Polifenoles en el Vino (>10-5 s) y este intervalo de tiempo es la principal diferencia con otro conocido fenómeno luminoso. todos ellos ortogonales entre sí. y E la matriz de error de la reproducción de los datos en sus componentes principales. autovectores o loadings. . De esta forma se van calculando los componentes principales superiores hasta que toda la información relevante del sistema queda descrita. que representan la dirección de los componentes principales en el espacio de las variables originales. 1.5. que originalmente puede estar contenida en un gran número de variables. Los componentes principales se obtienen por combinación lineal de las variables originales a través de una serie de transformaciones.

4-dihidroxibenzoico (3.4-h) Catequina (Cat) 4-hidroxibenzoico (4-h) Epicatequina (Epi) Ácido Siringico (Syr) Ácido Cafeico (Caf) Ácido Vanílico (Van) Ácido Cumárico (Cum) Ácido Felúrico (Fel) .20 - . reactivo analítico) Hidróxido de sodio (Merck.CAPÍTULO 2: PARTE EXPERIMENTAL 2. Reactivos Reactivos y disolventes: • • • • • • Tetraborato de sodio decahidratado (Merck. reactivo analítico) Polifenoles: • • • • • • • • • • Ácido Gálico (Gal) 3.1. reactivo analítico) Metanol (Merck. reactivo para HPLC) Agua Milli-Q (Millipore) Ácido Fosfórico (Merck. reactivo para HPLC) 2-Propanol (Merck.

Joven (M8) de Barberà. 2007. sin filtrar y sin desgasificar. Reserva (M11) Raimat viña 32. d. Joven (M1) Castillo de Liria.o. Tempranillo 2006.o. d. Crianza (M5) Torres Coronas.21 - .o.o. Tempranillo 2001. d. Crianza (M12) Señorío de los Llanos. d. Crianza (M7) Josep Foraster.3. d. Ribera del Duero. d.Determinación de Polifenoles en el Vino • Resveratrol (Resv) 2. Cabernet Sauvignon. d. • • • • • • • • • • Clos Gebrat.o. Crianza (M10) René Barbier. Ull de llebre (100%) 2004. Valdepeñas. Tinta del País 2007. Catalunya. d. d. Todas las soluciones se mantienen en el frigorífico. 2006.2. Penedès. Cabernet Sauvignon 20% y Merlot 10% 2004.o. Joven (M3) Don Luciano. 2007. d. tempranillo 1999. Tierra de Extremadura. Joven (M9) Abadia Raimat.o. Tempranillo y Garnacha 2007.o.o. Catalunya. Conca Tempranillo 2008. Gran Reseva (M15) Finca Vieja. La Mancha. d. La Mancha.o.o.o. d. d. Priorat.o. Gran Reserva (M16) Protos. d. d. Crianza (M4) Finca Resalso. d. d. Costers del Segre. Ull de llebre 70%.o. Costers del Segre 2006. • 5 viñas. Cabernet Sauvignon 2005.o Liria. Valdepeñas. Soluciones Las soluciones madre de cada uno de los polifenoles se han preparado en concentraciones de 100 mM en metanol. Valdepeñas. Crianza (M6) Señorío de los Llanos. Muestras de vino De cada vino se almacena en la nevera 30 mL en un recipiente de plástico. Joven (M13) Estola. Tempranillo 2005. Joven (M17) • • • • • • . 2. 2007. Joven (M2) Viña Fadrí. A partir de las soluciones madre se han preparado todas las soluciones de trabajo utilizando agua Milli-Q como disolvente. La Mancha.o. Ribera del Duero. Crianza (M14) Pata Negra. Tinto Fino (100%) 2006. Tempranillo 2007.o.

o. Rioja. Somontano. Joven (M25) Duque de Azara. Tempranillo. Electroforesis Capilar (HP 3D CE. (CMS.22 - . d. Joven (M28) Gran Feudo. Ribera del Duero. Crianza (M26) Señorío de Lazán.o. Agilent Technologies.e. Moristel y Tempranillo 2004. x 375 m d. Cabernet Sauvignon y Garnacha 2007. Cabernet Sauvignon. 2007. controlado por ordenador Espectrofluorímetro Aminco serie 2 modelo AB2.4. Rioja. d. Reserva (M24) Duque de Azara. d. Somontano.. Navarra. d. Reserva. Crianza (M23) Viña Vial. d. equipada con un detector en serie de diodos y refrigeración del capilar por aire.) y 4 µm de diámetro de partícula de Phenomenex con una precolumna C18 (4mm x 3mm d.o. 2007.o. Garnacha Tinta y Mazuelo 2004.Arantza León Sanz • • • • • • • Tilenus.o. Sauvignon 2004.o. d. d. d. Tempranillo.o. Rioja.o. (M29) Garnacha y Cabernet • • • • • 2. desgasificador de vacío G1379A. Columna cromatográfica Synergi Hydro-RP C-18 (150 mm x 4. d. Tempranillo 2006. d. Tempranillo. Instrumentación y Aparatos Los instrumentos y aparatos utilizados han sido los siguientes: • Cromatógrafo de líquidos Agilent 1100 series equipado con bomba cuaternaria G1311A.i.o.o. 2006. d.i. • • • • • . Mencía 2007. 670 mm de longitud total y 587 mm de longitud efectiva. Reino Unido) Espectrofotometro Perkin-Elmer λ-19. la inyección de las muestras se lleva a cabo mediante una válvula de inyección de seis puertos Rheodyne 7725(i) con un helicoide de 20 µL de volumen. Navarra. d. Sauvignon Tempranillo y Merlot 2005. Joven (M22) Viña Zaco.o. 2008. Crianza (M20) Señorío de Arriezu. Joven (M18) Bajoz. Bierzo. Reserva (M27) Irache. Joven (M21) Tierras Reina. detector de diodos en serie G1315B equipado con una celda de flujo de 13 µL y detector de fluorescencia G1321A. Rioja.6 mm d. Tinta de Toro.i. Joven (M19) Valpinicia. Capilares de sílice fundida de 75 m d.) de la misma casa. Sauvignon Tempranillo y Merlot 2007. Germany). Somontano.o.

360 nm y 520 nm con el detector UV-Visible. Acondicionamiento del capilar Antes de la primera inyección del día.5.e.5. Cromatografía de líquidos (HPLC) Para la separación de los polifenoles se ha utilizado una columna cromatográfica Synergi Hydro-RP C-18 (150 mm x 4.i.i. La detección se ha realizado a 230 nm con un detector en serie de diodos y para la obtención de datos se ha utilizado el software suministrado por el fabricante (HP ChemStation). 2. Para la obtención de datos se ha utilizado el software suministrado por el fabricante (HP ChemStation). y el eluyente B. Electroforesis Capilar (CE) Para la separación de los polifenoles se ha utilizado un capilar de sílice fundida de 75 m d. 320 nm.) de la misma casa.Determinación de Polifenoles en el Vino • Micropipetas automáticas de 10. . Procedimiento experimental 2. El electrolito de separación es bórax 20 mM (pH acuoso 9. El potencial de separación es + 25 KV y las intensidades obtenidas del orden de 30 A.) y 4 µm de diámetro de partícula de Phenomenex con una precolumna C18 (4mm x 3mm d. Nichiryo Co. es ácido fosfórico a una concentración de 9 mM.5.1. 1000 y 5000 µL (Nichipet EX. 670 mm de longitud total y 587 mm de longitud efectiva.. Antes de cada inyección se proceden a un pre-condicionamiento de capilar con NaOH 0.i.23 - . el capilar se ha de activar con NaOH 0. El eluyente A. La detección se ha realizado a 280 nm. es metanol 100%.1. solución acuosa. Tabla del gradiente.6 mm d. Tabla 2. 100. Japan) 2.2. El caudal es de 1 mL / min.1 M durante 2 minutos seguido de 1 min de agua y 2 min de electrolito todos ellos a una presión de ~ 1 bar. todos ellos a una presión de ~ 1 bar finalmente se ha de equilibrar el capilar con el electrolito de separación aplicando el potencial de trabajo durante 30min. 5 min de agua y 3 min de electrolito. solución orgánica.1 M durante 20 min..2) con un 20% de 2-isopropanol. x 375 m d. En el detector de fluorescencia la detección esta comprendido en un intervalo de 260 – 375 nm. Tiempo (min) 0 20 22 27 28 % Eluyente B 5 60 95 95 5 Se inyecta un volumen de 20 µL de cada vino filtrado previamente con un filtro de 45 m con ayuda de una jeringa. La temperatura de termostatización del capilar de 25ºC.

Las muestras de vino se diluyen en agua Milli-Q. El objetivo. 2. Se utiliza como blanco el agua Milli-Q. es determinar el punto máximo de excitación y el de emisión.3.5. .4. Fluorescencia Se han registrado los espectros de excitación – emisión de 29 muestras de vino en un intervalo de longitud de onda de excitación entre 250 nm y 275 nm y de emisión entre 260 nm y 460 nm. Se trabaja con 100 µL de vino que se lleva a un matraz de 10 mL y se enrasa con agua Milli-Q.Arantza León Sanz 2. Las muestras de vino se diluyen en agua Milli-Q. Se trabaja con una solución de 200 µL de vino en un matraz de 10 mL enrasado con agua Milli-Q. Espectrofotometría Se han registrado los espectros UV-Visible de cada muestra de vino en un intervalo de longitud de onda comprendido entre 200 nm y 900 nm.5.24 - .

Y de la solución anterior se prepara otra de 200 µL en 1mL de agua Milli-Q teniendo así una concentración de 0. catequina.i. ácido siríngico. se describirán todos los estudios realizados para separar el mayor número de compuestos polifenólicos.) y 4 µm de diámetro de partícula de Phenomenex Precolumna C18 (4mm x 3mm d.CAPÍTULO 3: RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.0025 mM. las condiciones experimentales de separación han de permitir separar el máximo nombre de analitos en el menor tiempo de análisis. epicatequina.1. ácido vanílico. 520 nm Columna cromatográfica: Synergi Hydro-RP C-18 (150 mm x 4.1. ácido cumárico.5) Eluyente B: Metanol 100 % Caudal de 1mL/min λ = 280. 320.i.1. ácido felúrico. Se ha preparado una solución madre de polifenoles de 25 µL de cada polifenol en 2 mL de metanol. 360. Como criterio de optimización. resveratrol) de los cuales se ha estudiado el tiempo de retención y los espectros de cada uno.6 mm d. 3. 4-hidroxibenzoico. ácido cafeico. Cromatografía de líquidos (HPLC) En este apartado. Optimización del gradiente de elución a) Estudio de muestras sintéticas de polifenoles Se ha analizado el comportamiento cromatográfico de 11 polifenoles (ácido gálico. .4-dihidroxibenzoico. a partir de las soluciones madre 100 mM preparadas en metanol.) de Phenomenex • 3.25 - . Se han fijado algunas de las condiciones cromatográficas: • • • • • Eluyente A: 9 mM H3PO4 (pH = 2.

5.27 168. 10 60 95 95 0. 5.16 Familia Flavoniode Ácido Fenólico Ácido Cinámico En la tabla 3. Método A) Tiempo (min) 0 15 17 19 20 % Eluyente B 0. 5. llamado post-time. 10 B) Tiempo (min) 0 20 22 24 25 % Eluyente B 0. . 10 60 95 95 0. 5.15 180. 5. 10 60 95 95 0. 5. Optimización de la programación del gradiente de elusión para las muestras sintéticas de polifenoles.Arantza León Sanz Con esta última solución. 10 D) Tiempo (min) 0 30 32 34 35 % Eluyente B 0. 5. 10 60 95 95 0. Tabla 3. Polifenoles Polifenol Epicatequina Ácido vanílico Ácido Cafeico Peso molecular 290.3 se refleja los tres polifenoles sintéticos que no se han podido definir correctamente en función del porcentaje inicial de eluyente B frente al tiempo que transcurre la pendiente del gradiente de metanol generado (60%). 10 Comprobamos que los picos salen bien definidos. En la tabla 3.26 - . 10 C) Tiempo (min) 0 25 27 29 30 % Eluyente B 0. se estudia el comportamiento de los polifenoles en función del porcentaje inicial del eluyente B (Metanol) de la pendiente del gradiente de metanol generado. Para asegurar que entre cada análisis la columna esté estabilizada se añade un periodo de 5 minutos más al final. Estos polifenoles son: Tabla 3.1 se muestra el diseño experimental utilizado.2. 5. sin cola y que se pueden identificar todos ellos excepto 3 polifenoles que son difíciles de separar adecuadamente. es decir.1.

En este caso se amplia el tiempo de post-time a 10 minutos para asegurar que la columna está estabilizada y preparada para el siguiente análisis. 512 18.5 17 17. 50 (ARANTZA\14ABR006.2 10. 5 18 18.8 11 11. .003 25 40 40 40 mAU 80 mAU 70 mAU 70 18.4 Ref =600.5 15 min DAD1 A. % Eluyente B 0 DAD1 A.5 13 13.022 16. D) 5 DAD1 A.50 (ARANTZA\14ABR005.4 10. Sig=280. Sig=280.27 - 13. Sig=280. 653 30 30 13. 50 (ARANTZA\14ABR009. D) 11. 377 16.5 12 12. D) 16.020 14. Sig=280.457 DAD1 A. 5 19 19.5 14 14.8 11 11. 50 (ARANTZA\ 14ABR010. Sig=280.728 70 19.468 10 DAD1 A. 084 mAU 80 mAU 80 mAU 70 70 70 60 60 60 50 50 50 14. 298 12.5 min 0 12. 5 14 14.592 30 30 30 14.282 11.50 (ARANTZA\14ABR004.531 20 20 10 10 10 0 16.784 12.4 Ref =600.513 13.4 Ref =600.5 16 16. Sig=280.922 17. 402 14.4 12.8 10 10.4 11. 928 13.603 60 60 60 50 50 50 30 40 40 40 30 17.4 Ref =600. D) m AU mAU 70 mAU 14.5 18 18.8 12 12. D) DAD1 A.480 40 10.4 11. D) 14.065 10.744 14.D) 13. En la tabla 3. Optimización de la programación del gradiente de elución de separación de polifenoles.096 DAD1 A.6 min DAD1 A.164 15.563 13.606 16.6 11.449 Tiempo (min) 30 11. 318 10.4 Ref =600.5 min 0 0 12 12.6 10. 271 15.741 20 20 20 10 10 10 0 14.4 Ref =600.521 30 16.D) mAU 90 mAU 100 mAU 100 12.4 Ref =600.718 10.50 (ARANTZA\16ABR002. 4 11. Sig=280. 240 20 20 20 10 10 10 0 13.50 (ARANTZA\ 16ABR001.5 16 16.982 40 60 50 40 11.50 (ARANTZA\14ABR001. 264 DAD1 A.3.2 12.5 17 17.8 12 12.D) 17.5 17 17.900 30 20 20 20 10 0 0 11. 2 11.6 11.113 .954 30 18. 5 min DAD1 A.5 15 15. D) 13.5 min 11 11. 5 12.4 min 9. Se estudia el comportamiento de los polifenoles en función del porcentaje inicial del eluyente B (Metanol) de la pendiente del gradiente de metanol generado.4 Ref =600.5 15 15. 446 20 40 40 40 12.50 (ARANTZA\14ABR012.5 18 min 0 13.8 13 min 0 10.6 12. 2 11. Sig=280.4 Ref =600.594 12. Sig=280.272 13. D) DAD1 A.167 60 60 60 50 50 50 15.5 15 15.4 se muestra el diseño experimental utilizado. 079 80 80 80 70 60 60 15 11. 5 min b) Estudio con una muestra de vino En este apartado. se estudia una muestra de vino filtrada previamente con un filtro de 45 µm para asegurar que no entra ninguna partícula que pueda obstruir la precolumna y la columna. 647 13 13.4 Ref =600.928 15.2 12.50 (ARANTZA\14ABR003. 50 (ARANTZA\14ABR007.5 16 16.5 14 14.665 11. Sig=280. 012 20 15. 2 11.953 12.5 16 16. Sig=280.5 min 0 12 12. 50 (ARANTZA\14ABR008.978 12.4 Ref =600. D) 15.5 14 14.Determinación de Polifenoles en el Vino Tabla 3.5 13 13.5 13 13.5 20 min 0 15 15.4 Ref =600. 295 DAD1 A.5 14 14.846 14. Sig=280.851 14.5 15 15.

456 17.042 14.733 13.620 16.604 5.5 11.D) DAD1 A.054 2.940 3.198 14. 5.763 2.562 12.323 15.674 21.876 17.543 1. 5.439 38 33 28 23 20.420 5 8. 5.939 10 % Eluyente B 0.667 12.423 3.133 4.686 5. 5.578 2. Figura 3. Cromatograma de una mezcla de vino.732 2.443 1.523 15.327 3.4 Ref =600.415 18.405 12.4 Ref =600. 10 % Eluyente B 0.583 23.319 13.506 10.017 12. 5.965 6.181 15.813 15 30 32 37 25 27 32 20 22 27 15 17 22 25 25.4.993 22.695 3.696 7.492 13.473 14.856 20 20.688 6.322 23.095 18.488 15.038 17.689 15 14.263 10.568 1.159 6.905 7.570 5.244 20. 5.490 2.695 1.662 4.468 18. 10 % Eluyente B 0.336 6.285 9.199 8.490 0 0 0 0 19.765 19.840 26.829 17.960 12.915 5. Cromatograma de una mezcla de vino.548 10.824 9.D) 5 5.50 (ARANTZA\16ABR005.409 10.953 1.530 12.713 12.062 9.160 17. 10% de eluyente B inicial a 30 min. 9.819 2.233 35.335 30 30.256 14.129 2.28 - 16.498 21.130 23.313 2.869 5.531 24.968 7. Optimización de la programación del gradiente de elusión aplicada en muestras comerciales de vino.232 2.823 8.871 3.198 22.883 6.608 2.092 21. Sig=280.330 24.008 3.702 17. 0% de eluyente B inicial a 15 min.909 4. 10 % Eluyente B 0.377 6.966 10.443 8.286 5.5 Tabla 3. 10 60 95 95 0.810 35 35.937 33.465 9.092 11.Arantza León Sanz mAU 100 200 300 400 500 0 100 150 200 250 300 350 400 50 mAU 450 0 0 Método 0 E) F) G) H) 2. .201 13.189 6.882 2.5 1.808 14.141 13. Sig=280.637 7.246 4.842 Tiempo (min) Tiempo (min) Tiempo (min) Tiempo (min) 10 10.732 9.708 15.811 4.451 7.439 14.1.362 12.372 18.316 17.599 8.324 3. 5.586 11.059 27.479 6.576 7.361 17.126 5.944 29.245 17. 10 60 95 95 0.426 1.947 24.50 (ARANTZA\16ABR006.354 4.2.764 15.685 20 32.032 7.266 19.420 11.748 16. 5.378 7.992 18.060 12.464 23.960 18.513 17.871 13.837 11. 10 60 95 95 0.818 min min .5 28.312 DAD1 A. 10 Figura 3.583 16.514 9.077 6. 10 60 95 95 0.068 3.441 4.

3.Determinación de Polifenoles en el Vino En este caso.174 33. Eliminar todos los picos con una altura inferior a 3 mAU (n picos filtrados).428 28. Es decir. se hace un tratamiento de datos.083 32.286 28. 4.685 18. Tabla 3. En este caso interesan los valores más próximos a 1 (óptimo) que los próximos a 0.646 18. Seleccionar todos los picos del cromatograma (n picos). (min) 18.548 23. Seleccionamos dos criterios para tratar los datos obtenidos: a) Factor de tiempo (dtiempo) Se da el valor 1 cuando el tiempo es inferior a 15 min y se da el valor 0 al tiempo que supere 30 min.5. 2.604 23. . Método % Eluyente B Tiempo (min)* 0 15 0 20 0 25 0 30 5 15 5 20 5 25 5 30 10 15 10 20 10 25 10 30 Pico ref. 3. Figura 3. por lo tanto.517 23.937 n Picos 75 73 70 83 80 85 93 86 82 85 87 79 n Picos Filtrados 71 70 67 79 77 83 91 86 77 83 86 77 * Tiempo que dura el gradiente de elusión aplicado.394 28. desde el %B inicial hasta el 60% de B.29 - . Estos límites se fijan por criterio propio. Este tratamiento consiste en: 1.197 33. a diferencia del estudio de los polifenoles no se puede apreciar con facilidad cuál de los estudios es el más adecuado como se puede ver en los ejemplos de las representaciones cromatográficas. Representación gráfica del criterio factor tiempo. Escoger el último pico del cromatograma como referencia para establecer el tiempo de análisis. Tratamiento de datos para optimizar el método.

Arantza León Sanz Se aplica la siguiente ecuación: d = tiempo Límite Superior − Pico de Referencia Límite Superior − Límite Inferior (2) Donde. Límite Inferior = 15 min Límite Superior = 30 min b) Número de picos (dpicos) Se da el valor 0 cuando el número de picos es inferior a 50 picos y se da el valor 1 al número de picos que supere 100 picos. Estos límites se fijan por criterio propio. Figura 3. Representación gráfica del criterio número de picos.4.30 - . Límite Inferior = 50 picos Límite Superior = 100 picos Estos criterios se relacionan mediante la función conjunta: Dconjunta =  d picos — dtiempo      1/2 (4) . En este caso interesan los valores más próximos a 1 (óptimo) que los próximos a 0. Se aplica la siguiente ecuación: n Picos Filtrados − Límite Inferior Límite Superior − Límite Inferior d picos = (3) Donde.

44 0.34 0. Gradiente optimizado.52 0.54 Dconjunta 0.60 0. Representación gráfica del gradiente optimizado.72 0.5.65 y 0.82 0.6.5.10 dpicos 0. .50 0.82 0.10 0.66 0. desde el %B inicial hasta el 60% de B.59 0.36 * Tiempo que dura el gradiente de elusión aplicado. Es decir.72 0.66 0.58 0. Como se puede observar en la función (Dconjunta) hay dos posibles métodos que podrían ser óptimos.Determinación de Polifenoles en el Vino Tabla 3.42 0. Método % Eluyente B 0 0 0 0 5 5 5 5 10 10 10 10 Tiempo* (min) 15 20 25 30 15 20 25 30 15 20 25 30 dtiempo 0.31 - .57 0. Tiempo (min) 0 20 22 27 28 % Eluyente B 5 60 95 95 5 100 80 % Eluyente B 60 40 20 0 0 3 6 9 12 15 t (m in) 18 21 24 27 30 Figura 3.58 0. porque los valor de dtiempo y dpicos son. en comparación al otro método. más iguales entre ellos.82 0.34 0.09 0.50 0.40 0.41 0.66 0.56 0.65 0.54 0. Relación de los criterios según la función conjunta.82 0. De esta manera se ha optimizado el método que queda de la siguiente manera: Tabla 3.66. 0. Se elige el método con 5% eluyente de B inicial y duración de 20 minutos.33 0.34 0.44 0.54 0.57 0.

701 24.628 13.288 10.236 25 0 0 5 10 15 20 25. 2.32 - .300 7.616 20. Identificación de polifenoles en muestras vino En este apartado se intenta identificar los polifenoles que anteriormente se han estudiado en una muestra concreta de vino.656 11. Con las condiciones mencionadas anteriormente y con el gradiente de elución que se ha establecido en el apartado 3.577 12.009 4.366 18.9653.178 9.540 18.Arantza León Sanz mAU 500 400 300 6.780 4.680 23.285 18.507 4.063 7.546 6.743 6.034 3.1.435 8.739 25.841 min Figura 3.661 11. Se coge 200 µL de agua Milli-Q y 800 µL de vino.210 18.125 16.794 5.645 4. Muestra de vino diluida.009 10.231 200 12.140 21.624 5.569 1.932 100 1.070 8. Solución de polifenoles.229 4.447 1.810 4.316 5.994 15.042 10.1.595 15.359 14.278 9. Cromatograma de una muestra de vino utilizando el gradiente optimizado.823 8.783 17.355 20.240 8.668 6.938 5.926 14. Se coge 200 µL de la solución madre de polifenoles y 800 µL de vino.603 2.707 22.054 22.1.6.516 10. Se coge 200 µL de la solución madre de polifenoles y 800 µL de agua Milli-Q.577 7.278 15.888 2.517 23.233 11.2.846 12.807 13.213 5.998 20.789 9.216 17.759 2.937 19.704 1.146 2.834 13.340 2.695 3. se analiza: 1. Se ha obtenido los siguientes cromatogramas de los cuales se han podido identificar los polifenoles indicados: . 3.887 7.550 13.047 20. 3. Muestra adicionada.148 22.068 16.434 16.

188 2.787 20 20.733 24.268 7.10.474 15 15.266 25.759 6.558 18.919 14.476 Resv Determinación de Polifenoles en el Vino 20 20.8462.8.730 11.061 22.754 7.908 3.021 Resv 19.130 20.858 Van Van 13.908 4-h 12. Espectros de los polifenoles) .201 2.606 20.780 16.7.50 (ARANTZA\14MAY 002.036 25.208 14.534 1. (ver Tabla 3.118 15.491 2.946 1.718 15.644 4.560 1.240 18.662 15 4-h Figura 3.4-h 3.710 4.120 10.50 (ARANTZA\14MAY 004.237 min .693 2.175 5. 12.446 2.914 21.624 15.575 Para verificar los polifenoles identificados en los cromatogramas.341 18.477 10 10 10.025 20.464 6.168 15.191 5.165 24.974 2.377 Ga Ga 6.852 4.4 Ref =600.742 23.030 10.797 8.252 9.037 5.680 18.157 24.636 9.173 9.774 22.975 13.709 1.703 22. Cromatograma de la adición de polifenoles en el vino con identificación de picos.33 13.548 15.353 7.661 13.D) 5 3.180 4.100 150 200 250 300 350 400 50 mAU 0 100 200 300 400 mAU 0 0 DAD1 A.4 Ref =600.018 3.775 13.553 8.515 22.405 24.397 25 25 min 23.823 16.048 4.184 17.348 8.702 5.169 22.062 10.980 2.766 Fel 17.186 11.697 20.021 21.463 5.449 18.112 6.346 Fell 17.697 11.275 16. teniendo de referencia el tiempo de retención y el espectro de cada solución sintética de polifenol individualmente.947 9.384 5 DAD1 A.D) 0 1.272 10.411 8.047 7.481 12.256 17.818 25.271 Caf Syr 14.810 7.400 16.558 10.328 2.567 8.288 2.808 10.108 11.547 23.456 Cat Cat 11. Sig=280.804 2.217 16.448 1.606 11.626 19.452 1.947 5.703 1.103 7.944 19.650 2.690 Cum Cum 16.436 4.415 6.461 22.597 13.606 7.839 11.752 18.011 8.996 21.055 Caf Syr 14. Sig=280. Figura 3.365 18.054 25.4-h 9.406 14.124 22.530 24. se identifica los espectros de cada pico en la muestra de vino y en la adicionada. Cromatograma de la solución de vino con identificación preeliminar de picos.183 6.

48 Epi 12.4-H 9.04 4-H 12.Arantza León Sanz Tabla 3. Espectros de los polifenoles. Polifenol Tiempo retención Espectro polifenol Espectro vino Espectro vino+adición Gal 6.59 .7.17 Cat 11.98 Van 13.34 - .12 3.

el 4-hidroxibenzoico su espectro en el vino sólo es muy similar en cambio con la adición no se podría asegurar.35 - . así que es muy probable que ese pico esté formado por varios componentes.68 Fell 17. En concreto. con el resveratrol pasa al revés.76 Syr 13. se identifica mejor en la adición de polifenoles en el vino que en la muestra de vino sola. En cambio.35 Se puede ver que la mayoría se corresponden con el espectro del polifenol sólo.91 Coum 16.19 Resv 19.Determinación de Polifenoles en el Vino Polifenol Tiempo retención Espectro polifenol Espectro vino Espectro vino+adición Caff 13. .

50 Ref =600.96 0.10 10.51 1191. la finalidad es obtener el mismo perfil cromatográfico respecto al tiempo de retención y el área del pico de los analitos de una misma muestra de vino analizada repetidamente con el mismo método para verificar que el método seleccionado es válido.23 . Es uno de los tres componentes que en el estudio de polifenoles no se podía separar adecuadamente.9.4 Sig=280.27 9.55 0.4 Ref =600.24 0. A. Otra manera representativa queda reflejada en una tabla: Tabla 3.42 0.15 178.61 1055.10 11.30 0.47 0.D) (ARANTZA\12MAY 006.35 148.50 (ARANTZA\12MAY 001.50 Ref =600.D) (ARANTZA\12MAY 002.4 Sig=280. forme parte de éste. A.D) (ARANTZA\12MAY 003.Arantza León Sanz Otra observación es que en el vino sólo y en el vino con la adición de polifenoles no se ha podido identificar el polifenol epicatequina.55 11.87 1.4 Sig=280.50 Ref =600.4 Sig=280.1.37 0. Cromatograma de repetibilidad a 280 nm.50 Ref =600.17 9.50 Ref =600.D) (ARANTZA\12MAY 005. Sig=280. se necesitaría hacer un estudio más amplio para verificar que la adición de los polifenoles tiene un comportamiento proporcional. A. Repetibilidad En este apartado.4 Sig=280. podemos decir que la identificación es correcta. En general.38 89.9.D) (ARANTZA\12MAY 004. la información es insuficiente. A. Se ha decidido analizar la muestra seis veces a 280 nm y queda representado de la siguiente manera: DAD1 DAD1 DAD1 DAD1 DAD1 DAD1 mAU 400 A.32 0.25 0.68 Área RSD (%) RSD (%) (Tiempo) promedia (Area) 0. 3.4-H Cat 4-H Epi Van Caff Tr* promedio 6. por lo tanto es posible que por el tiempo de retención y el espectro que se obtiene al identificar el ácido vinílico. A.36 - 3106.56 10.55 1.3.D) 350 300 250 200 150 100 50 0 0 5 10 15 20 25 min Figura 3.64 4. Pero.17 . Repetibilidad Polifenol Ga 3.36 1093.54 2.

533 Syr 60 14.723 21.. se ha identificado los polifenoles de la solución madre que presentan mayor intensidad de fluorescencia y se han identificado en una muestra de vino: FLD1 A.67 3109.13 2.41 2. teniendo en cuenta que la muestra sólo se filtra. Em=375 (ARANTZA\18MAY 001. Se ha utilizado el mismo método cromatográfico optimizado para el detector de absorción molecular UV-Visible.1. se conecta el detector de fluorescencia simultáneamente al detector de UV-Visible.4. La finalidad es ver si algunos polifenoles pueden ser estudiados fluorimétricamente.48 3.90 12.66 0.031 4-h 20 Resv 19.370 3. Se ha fijado como criterio que el RSD no puede ser superior al 5%.37 - .185 0 0 5 10 15 20 25 min Figura 3.348 9.24 0. Como en el apartado 3.150 Cat 40 11.45 3422. Ex=260.2.22 0.66 * Promedio del tiempo de retención En esta tabla se muestra el valor de RSD del área del pico y el tiempo de retención de los polifenoles identificados en el vino.05 1. λemisión= 375 nm . Por lo tanto.1.309 22. Cromatograma de los polifenoles estudiados en detector de fluorescencia con λ excitación=260 . se da válida la repetibilidad.56 13.4-h 12.53 3214.D) LU Van 140 120 100 80 13.22 0.04 13.490 17.19 1668.025 19. Detector de Fluorescencia En este apartado.10.Determinación de Polifenoles en el Vino Syr Coum Fell Resv 11. 3.

Tempranillo y Garnacha 2007.Arantza León Sanz FLD1 A. Cromatograma de una muestra de vino en detector de fluorescencia con λ excitación=260 .2.218 6.378 8.o.237 23.839 12. 2006.5.o.192 3.591 11.660 3.957 15.862 23. 3. El estudio realizado ha consistido electroforéticos de 6 vinos diferentes: • en la comparación 22. Joven (M3) Don Luciano. d.370 11. Catalunya.274 Ga 12.317 de los perfiles 5 viñas.385 7. d.055 5. se diferencian en la denominación de origen.996 16.585 40 17.658 Resv 0 0 5 10 15 20 25 min Figura 3. Crianza (M5) Torres Coronas. En los perfiles electroforéticos aparecen diferencias y similitudes: . d.537 18.425 LU 100 80 13.437 6.185 7.414 23. Electroforesis Capilar En este apartado se estudiará el comportamiento electroforético de diversos vinos utilizando unas condiciones experimentales optimizadas anteriormente. d. Em=375 (ARANTZA\24ABR006.396 9.148 8.989 21.782 7. Ull de llebre (100%) 2004. 2007.107 11. Crianza (M4) Finca Resalso. Tierra de Extremadura.014 22.o. 2007.841 14. Ribera del Duero.099 17.D) 14.370 19.174 14. los seis vinos escogidos son de dos tipos diferentes: joven y crianza.165 9.369 Cat 11.564 20. d.814 13. Joven (M2) Viña Fadrí. La Mancha. Ex=260. λemisión= 375 nm.791 160 140 12.o Liria. d.909 20.783 6.691 15.603 19.o. la añada y el tipo de uva.575 8.38 - .015 10.580 60 9.288 120 13. Electroforesis Capilar.732 8.139 20 21.714 20.603 17.408 14.039 19. El procedimiento experimental está explicado en el apartado 2.621 15. Crianza (M6) • • • • • Además.987 9.308 16. Catalunya.194 Caf 13. Tinto Fino (100%) 2006.715 22.2. Joven (M1) Castillo de Liria.613 5.11.o.

Espectrofotometría En este estudio se han registrado los espectros de 29 muestras de vino previamente diluidos con agua (100 µL de vino en 10 mL de agua Milli-Q). DAD1 A.13. Sig=230.12.D) m AU 16 14 12 10 8 6 4 2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 m in Figura 3.D) mAU 6 5 4 3 2 1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 min Figura 3.3.30 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\LIDIA\090309_CE 2009-03-09 11-54-30\019-0302. (Ver Anexo 1 Apartado 1.39 - . La finalidad es obtener los espectros de absorción molecular de cada vino para ver si hay diferencias entre ellos. Electroferograma de la M1 a 230 nm.Determinación de Polifenoles en el Vino DAD1 A.3 Espectrofotometría) . electrolito de bórax 20 mM con un 20% de 2-isopropanol a +25KV y 30µA. Sig=230. 3.30 Ref=off (C:\CHEM32\1\DATA\LIDIA\120309_CE 2009-03-12 11-31-33\029-0302. electrolito de bórax 20 mM con un 20% de 2-isopropanol a +25KV y 30µA. Se ha podido observar que todos los vinos analizados presentan espectros bastante semejantes. Electroferograma de la M5 a 230 nm.

4. Observamos que la longitud de máxima emisión es 376 nm.4. Se ha podido observar que todos los vinos analizados presentan espectros bastante semejantes. Representación de los espectros de emisión de las muestras de vino.Arantza León Sanz 3. Fluorescencia En este estudio se han registrado los espectros de 29 muestras de vino previamente diluidos con agua (200 µL de vino en 10 mL de agua Milli-Q). Excitación Se ha registrado los espectros de emisión en un intervalo de 260 a 320 nm.14.4.2. 35 30 25 20 15 10 5 0 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 Figura 3. . La finalidad es obtener los espectros fluorescentes o espectros de emisión molecular de cada vino para ver si hay diferencias entre ellos.40 - .1. 3. Observamos que la longitud de máxima emisión es 260 nm. 3. Espectros de emisión Se ha registrado los espectros de emisión en un intervalo de 280 a 450 nm.

la crianza. Representación de los espectros de excitación de las muestras de vino. se analiza los resultados de las 4 técnicas independientemente mediante el análisis por componentes principales (PCA). representación de scores de los datos obtenidos mediante la cromatografía de líquidos con detección fluorescente. (Ver anexo 1 Apartado 1.5. En cambio en la 3. ya que se encuentran relativamente cerca. 3. También pasa con algunos vinos de Cataluña. Se puede establecer relaciones y pautas según la denominación de origen.15. se representa el mismo score de cromatografía de líquidos por el detector de fluorescencia pero en función el tipo de crianza.16. La Figura 3. la añada y el tipo de uva. Estudio PCA) .Determinación de Polifenoles en el Vino 35 30 25 20 15 10 5 0 254 256 258 260 262 264 266 268 270 272 274 Figura 3. que según la zona también quedan próximos entre ellos. Estudio de los perfiles composicionales de vinos En este apartado. y no se aprecia conjuntos definidos.4. se puede ver que las muestras de vinos están dispersas. se puede ver que los vinos con denominación de origen la Rioja (color lila) tienen un comportamiento similar. teniendo en cuenta que la muestra es muy variable. El estudio también se ha realizado con el resto de técnicas. Según la denominación de origen. sino dispersos.15.41 - .

Representación Scores de HPLC con FLD en función la denominación de origen. .17.16.42 - . Figura 3. Representación Loadings de HPLC con FLD en función el tipo de crianza.Arantza León Sanz Figura 3.

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