ALUMNO (a

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PRESENTACION
Los profesores de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la U niversidad Nacional de Trujillo, han actualizado la Guía de Práctica, donde el estudiante encontrará una breve introducción de la importancia bioquímica y correlato medico de cada práctica, así como el procedimiento a desarrollar, finalizando con un breve cuestionario a fin de ampliar o concretar la aplicación de lo tratado. La Bioquímica es sin duda la ciencia que más ha aportado al desarrollo de la Medicina, basada en una rigurosa apl icación del método científico de la investigación

experimental. En la práctica, los alumnos a partir de los conocimientos adquiridos en los diálogos, seminarios y casos clínicos, tienen la oportunidad de plantear

interrogantes, contrastarlas con un experimento en forma ordenada, obten iendo resultados que al final se discutirán en grupo con el docente. También podrán conocer algunos métodos aplicados al diagnóstico clínico o al estudio nutricional. La práctica en Bioquímica, constituye un estímulo importante en el desarrollo de la investi gación experimental, permitiendo a nuestros estudiantes desarrollar habilidades y destrezas en trabajos de investigación y así obtener logros a nivel nacional para nuestra Facultad. Un recuerdo especial para los profesores que sentaron las bases para la actual guía de práctica como el Dr. Hugo Alpaca Muñoz, el Dr. Jorge García Ventura y un

agradecimiento a todos los docentes que de una u otra manera aportaron con sus conocimientos para disponer de esta herramienta que beneficiará a los alumnos de nuestra Facultad. Dr. CARLOS ARANCIBIA ARROYO Dra. MARIA DAYSI REYES BELTRAN Dr. JUAN VALLADOLID ALZAMORA Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA Dr. WALTER OBESO TERRONES Dr. ALFREDO LARIOS CANTO Dr. JORGE PLASENCIA ALVAREZ Dr. HECTOR RODRIGUEZ BARBOZA

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I UNIDAD SUBESTRUCTURA CELULAR: ENZIMAS Y BIOENERGETICA

REUNION DE LABORATORIO N° 01
PRACTICA N° 01
DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS
I. INTRODUCCION: La vida depende de una serie ordenada de reacciones químicas que son catalizadas por enzimas formadas para este fin. Las enzimas son proteínas relativamente frágiles con tendencia a sufrir desnaturalización e inactivación, es decir alteraciones en su conformación, por efecto de diversos agentes físicos y químicos como: temperatura, ácidos, álcalis fuertes, sales pesadas, pH, etc. Las enzimas se encuentran en pequeñas concentraciones en los materiales biológicos resultando , complicada su individualización o purificación. Para poder verificar directamente las propiedades comunes o similares de la naturaleza proteica que las caracterizan, experimentalmente se pueden utilizar las propiedades de catalizadores específicos que tienen las enzimas, como indicador de las alteraciones que pueden sufrir éstas cuando son sometidas a la acción de diferentes agentes físicos y químicos. De esta manera, sin necesidad de individualizar o purificar una determinada enzima se pueden verificar cómo los agentes físicos y químicos afectan la naturaleza proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad. La finalidad de la presente práctica, es evidenciar las características proteicas de las enzimas y que expuestas a la acción de diversos agentes físicos y químicos hacen variar su comportamiento y actividad catalítica. II. REACTIVOS A UTILIZAR: NaOH 1N SO4 Cu 20% NaCl 0.15M Amilasa salival 1.0% Solución iodada HCl 3N y 0.05N Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 Ácido tricloro acético (A.T.C.A.) al 20%

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Preparar: SISTEMA A TUBOS COMPONENTES (en ml) Amilasa al 1% NaOH 1N HCl 3N Ácido Tricloro acético 20% Sulfato de Cobre al 20% Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 I 1.0 2.4 II 1.0 2.4 III 1.0 2.4 IV 1.0 2.4 V 1.0 2.4 VI 1.0 2.4

1 M / pH 6. A continuación armar el siguiente sistema: TUBOS COMPONENTES (en ml) HCl 0.0 a. b.0% en solución acuosa Buffer fosfato 0.4 a. 4.0 5. Durante este lapso construir el siguiente SISTEMA B: SISTEMA B: TUBOS COMPONENTES (en ml) Almidón al 1.6 ml.4 2.6 NaCl 0. agregar: Solución yodada 0.5 0.5 0.05N De los tubos de reacción del sistema (B). Interprete y explique bioquímicamente cada uno de los pasos realizados durante el desarrollo de la práctica 2. d. .4 2. Agregar 0.5 II 5 0.0 5.0 1.0 5.5 V 5 0. Pre incubar por dos minutos a 37 ºC.5 III 5 0. Explique la teoría de la acción molecular de las enzimas sobre sus respectivos sustratos. CUESTIONARIO: 1. IV. Esquematice el procedimiento de la práctica. d. 3. Dejar los 5 primeros tubos del sistema en reposo por 10 minutos a la temperatura ambiente.4 2.4 2.0 III 1.15 M Agua Destilada 5.4 2.0 5.5 0. b. Explique los tipos de enlaces fuertes y débiles que existen entre los aminoácidos para conformar una determinada proteína. Observar el aspecto y color producido e interpretar.0 1. c.0 1.5 0. Colocar el tubo VI en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.0 5. Observar el color producido e interpretar los resultados. de la enzima tratada. de cada uno de los tubos del sistema (A) a su correspondiente tubo del último sistema (B).4 2.0 1. Dejar en incubación a 37 °C por 20 minutos.5 VI 5 0.5 e.0 VI 1.0 1. c.5 IV 5 0.5 0.0 1.0 V 1.0 IV 1.5 I 5 0.0 I 1.0 II 1.

verificando tanto el sustrato residual y los productos formados en dicha reacción. Sin estas proteínas especializadas. En general.Enzima al 1% (amilasa salival). de enzima al tubo II. II 5 ml.0 al 1%.05N .Solución de almidón pH 6. utilizando la enzima amilasa salival que tiene la capacidad de degradar el almidón en maltosa (disacárido reductor) y algo de glucosa. 2.Reactivo Folin Wu: a. INTRODUCCION: Las enzimas pueden ser descritas como catalizadores complejos de origen biológico que tienen un alto grado de especificidad y eficiencia.Solución yodada. 4 ml. La finalidad del presente trabajo experimental es determinar la actividad enzimática.Cloruro de sodio solución 0. y Volverlos a colocar al baño de agua a 37 °C durante 10 minutos. REACTIVOS A UTILIZAR: . . permitiendo que las reacciones químicas dentro de la célula ocurran rápidamente a través de vías bien definidas. y Agregar 1 ml. III.1M Agua destilada I 5 ml.Ácido Clorhídrico 0. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato. la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras: 1. Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada. II. la vida tal como es no podría existir. 1 ml. .1M . Para poder mostrar la actividad enzimática se debe tener presente fundamentalmente que cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima. 3 ml. . Verificando los productos liberados después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) y Armar el siguiente sistema: ETAPA A: TUBOS COMPONENTES Solución de almidón pH 6.5 PRACTICA N° 02 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. y Colocar los tubos al baño de agua a 37 °C por 5 minutos. Solución Cúprica alcalina. entonces en un organismo vivo habría tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes. . Solución fosfomolíbdica. b.0 al 1% Solución de cloruro de sodio 0. 1 ml. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL ) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura.

transferir 0. De cada uno de los tubos del sistema anterior. Elabore un gráfica para demostrar la acción de una enzima sobre su sustrato. 0. a este nuevo sistema. y Mezclar. donde se observe la energía de activación y el estado de transición.5 ml. 2. 1ml. 4. ¿Qué métodos conoce para determinar la actividad enzimática? Explique la acción bioquímica de cada uno de los componentes en los pasos seguidos para determinar la actividad enzimática. 0. II 5 ml. 1ml. CUESTIONARIO: 1.6 CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL.5 ml. . 3. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante. II 1ml. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante III.05 N De los tubos I y II: Etapa A Solución yodada I 5 ml. 0.5 ml. 2ml. TUBOS COMPONENTES Ácido clorhídrico 0. 1ml. Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimático y defínalos. 2ml. Mezclar. 0. CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin WU) TUBOS COMPONENTES De los tubos I y II: etapa A Solución Cúprica alcalina Hervir 8 minutos Enfriar Solución fosfomolíbdica Agua destilada y I 1ml.5 ml.5 ml. y Inmediatamente cumplidos los 10 minutos. 1ml.

8 II 5 III 5 IV 5 V 5 VI 5 VII 5 VIII 5 IX 5 Mezclar el tubo N° 1 Extraer 5ml.0 VI 5.) Contenido Anterior Caseína 0. se extrae 5 ml.0 III 5.0 1. de solución y se elimina. II. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Marcar una serie de tubos de ensayo de 1 al 9 TUBOS REACTIVOS (en ml.0 1. Al contenido anterior del sistema agregar rápidamente 1 ml. algunas proteínas son muy díficilmente solubles y precipitan.0 1. de solución del tubo N° 1 y agregarlo al tubo N° 2. de caseína en acetato de sodio 0.1N (sal)  I 5. .0 1. iguales o mayores al PI. Completando del mismo modo hasta completar la serie. Mezclar Extraer 5ml. .0 V 5.) Ácido Acético 1N Agua Destilada      I 3.Indicador de pH: Papel Indicador ó pHmetro. .1N en cada tubo. En el tubo N° 9 una vez efectuada la mezcla.0 1. que precipitan porque la solubilidad en estas condiciones disminuye al mínimo. TUBOS CONTENIDO ( en ml.0 VIII 5. INTRODUCCION: El punto isoeléctrico es la concentración de iones hidrógeno en el cual la proteína es eléctricamente neutra. se puede determinar el PI de una proteína observando los cambios de solubilidad que se producen cuando la proteína se encuentra en varias soluciones que tienen pH conocidos. Cuando una proteína se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pH menores.0 1.0 1. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que el punto o pH isoeléctrico de las enzimas es una característica físico química común de estas moléculas. cada proteína posee un determinado punto isoeléctrico (PI). Por tanto. porque el número total de cargas positivas es igual al número total de cargas negativas contenidas en la proteína. del tubo N° 2 y transferir al tubo N° 3.1N III.NaOH al 10%. Aprovechando este comportamiento. produciéndose en consecuencia variaciones en la estructura terciaria o cuaternaria y por lo tanto en su función biológica Aparte de otras propiedades que presentan las proteínas.Solución de caseína en Acetato de Sodio 0.0 II 5.0 1. la proteína sufre variaciones en la constitución de sus grupos químicos. cuando se encuentran en una solución que tienen pH igual al PI.0 VII 5.Ácido acético 1N .0 IX 5.0 1.7 PRACTICA N° 03 DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LAS PROTEINAS I. REACTIVOS A UTILIZAR: .0 IV 5.0 Mezclar al instante por inversión.2 6.

6 = 4. de acetato de sodio 0.1 4 NOTA: De la manera indicada en el ejemplo. TUBOS N°.0 ml.8    Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la proteína en los diferentes tubos. verificar el pH de cada uno de los tubos con el indicador de pH. Anotar los resultados en la columna respectiva del cuadro anterior.1 N en todos los casos. x = precipitado EFECTO INMEDIATO EFECTO DESPUÉS DE 30 MINUTOS CÁLCULO DEL pH  Determinar el tubo que presenta el máximo de precipitación.6 ml. [ Ácido ] pK del Ácido Acético = 4.1 N.1 N. ¿Cómo interpreta el resultado obtenido del punto isoeléctrico? ¿Qué es el pK? El pH neutro del medio ¿es igual al pH isoeléctrico? De sus razones.7 Ejemplo : Si la concentración de la sal es de 1 ml. CUESTIONARIO: 1. En el tubo N° 3 la concentración de ácido acético es de 4. lo cual se producirá en el tubo que tiene pH próximo a la solubilidad mínima de la proteína. I II III IV V VI VII VIII IX Emplear los símbolos siguientes : O = no cambia + = opalescencia. debe calcularse el pH de cada uno de los tubos IV.1N). En el tubo N°2 la concentración de ácido acético es de 8 ml. Así en el tubo N° 1 es de 1. que encontró en su experimento.7 ± 0. al 0.1 TUBO N° 3 = pH 4. 0. 3. 4. Etc. Anotar en el cuadro que se da a continuación Observar después de 30 minutos de reposo y anotar también en el cuadro respectivo.  Luego de transcurridos los 30 minutos de reposo. 2. de ácido 1 N (16 ml. 1 = 4. la concentración de ácido acético varía. Ver ejemplo. Ecuación de Henderson ± Hasselbach [ sal ] pH = pK + log. . Cálculo de pH para el tubo N° 3: pH = pK + log. Indique el punto isoeléctrico aproximado a la proteína.  Calcular el pH de cada uno de los tubos aplicando la Ecuación de Henderson ± Hasselbach. 0.

9 5.1 N ¿Cuál es el pH de la solución en 1 ml? . Si la concentración de ácido acético en el tubo II es 8 ml a 0.

Es decir en los ejemplos mencionados más que el numero de moléculas completamente hidrolizados. A fin de evitar ambigüedades surgidas de la utilización de distintas unidades para expresar la cantidad de sustrato y el tiempo se ha definido por convención una unidad que puede ser aplicada a casi todas las enzimas y que permite comparar las actividades de enzimas diferentes. constituye una medida del grado de pureza de la enzima durante el proceso de purificación. Entonces la actividad específica además de cuantificar la enzima. La definición recomendada por la Unión Internacional de Bioquímica a través de su comisión de enzimas es la siguiente: ³Una Unidad Internacional (UI) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol (Q mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de medida´. y en general de todos aquellos factores que de una u otra manera pueden modificar la actividad de la enzima. ACTIVIDAD ESPECÍFICA.B + C en que dos moléculas reaccionan entre si.La concentración del sustrato o los sustratos y cofactores. se debe reemplazar la definición de un Qmol de sustrato por un microequivalente (Q eq) del grupo involucrado. definible como el número de moléculas de sustrato transformado por minuto y por molécula de enzima (ó por un solo centro activo) en condicionales experimentales tales que se esté midiendo la velocidad máxima (concentración saturante del sustrato). deben establecerse: . De esta manera se puede expresar la cantidad de una enzima en términos de unidades enzimaticas. Esta aumenta durante el proceso de purificación de la enzima en los homogenizados biológicos y llega a ser máxima y constante cuando la enzima se halla en estado puro. entendiéndose por unidad de una enzima a la cantidad de ella que produce cierta velocidad de reacción bajo determinadas condiciones.En casos de reacciones bimoleculares del tipo: 2 A ----.La temperatura a la cual se define la Unidad.10 REUNION DE LABORATORIO N° 02 PRACTICA N° 04 CUANTIFICACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE LAS ENZIMAS I. . se toma como medida de la reacción el número de uniones peptídicas o glicosídicas atacadas respectivamente. o un polisacárido. . . Esto es posible debido a que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima. Esa velocidad de reacción se expresa como la cantidad de sustrato transformado en cierto tiempo. .El pH. y se expresa como el número de unidades de la enzima por miligramo de proteína. En cuanto a las mencionadas condiciones de medida. INTRODUCCION: Al no ser posible medir la cantidad de enzima directamente en las estructuras biológicas.Cuando el sustrato es una proteína. En éste último caso y siempre que se conozca un peso molecular se puede definir otra unidad ³LA ACTIVIDAD MOLECULAR O MOLAR O NÚMERO DE RECAMBIO´ (ÍNDICE CATALÍTICO). se recurre a la medida de la velocidad de la reacción que cataliza. Dos casos merecen aclaración especial: . Se denomina Actividad Específica a la cantidad de una enzima expresada en términos del contenido de proteína de la preparación. o cualquier otra molécula en la cual son atacados más de una unión. una Unidad será la cantidad de enzima que cataliza la transformación de dos Q Moles de sustrato por minuto.

11 Actualmente la Unión Internacional de Bioquímica. Su relación con la Unidad Internacional es la siguiente: Un Katal es igual a 6 x 10 7 Unidades Internacionales. 20 minutos 0.3 N y Sulfato de Zinc al 5 % y Solución fosfomolíbdica y solución cúprico alcalina y Reactivo de Biuret III. 0. 0. Detener la reacción empleando: Hidróxido de bario 0.5 ml.5 ml.5 ml.3 N Sulfato de Zinc 5 % Sacarosa 0.5 ml. Mezclar: Separar el precipitado de proteínas filtrando o centrifugando por 10 minutos.0 Incubar a 37°C. 8. 0. DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS DE LA REACCIÓN (azúcar reductor) Se empleará los filtrados libres de proteínas del paso anterior y se determinará azúcar reductor mediante el siguiente procedimiento: . 0. recomienda el uso de una nueva unidad EL KATAL (Kat) que se define como la cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato en producto por segundo.17 M Agua destilada y y TUBOS DE ENSAYO I II 0.17M y Hidróxido de bario 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: y Armar el siguiente sistema: SISTEMA DE INCUBACIÓN COMPONENTES Sacarosa 0.2 ml.5 ml. 2 minutos 0.3 ml.02 M pH 5.0 ml. 0.3 ml. 0. (Pre ± incubación) Preparado enzimático Mezclar e incubar a 37°C.01667 microkatales = 16.02M pH 5. 0.17 M Buffer acetato 0.2 ml.5 ml. La finalidad del presente trabajo experimental es cuantificar la Actividad Enzimática determinando la actividad específica.0 y Sacarosa 0.67 nanokatales La Actividad Específica se expresa en esta nueva unidad como Katales por kilogramo de proteína (ó Microkatales por miligramo de proteína) y la actividad molar en Katales por mol de enzima. II. Una Unidad Internacional es igual a 0. REACTIVOS A UTILIZAR: y Preparado enzimático (homogenizado celular de Fusarium moniliforme) y Buffer de acetato 0.0 ml. 8.

. 0. III 1..0 ml. y CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA U A..0 ml.5 ml.. Mezclar y dejar en reposo por 30 minutos.5 ml.8 ml...5 ml. Mezclar y dejar en reposo durante 20 minutos.5 ml. Cálculos de la concentración de los productos (hexosas) [(Lect. 1. de Proteínas . el factor es. agregar 7. = mg..2 ml. = Micromoles de Hexosas / 2 Minutos Tiempo de incubación en minutos (20 min). I) x Factor = mg.. del blanco)] x Factor = uMoles de Hexosas por ml. Leer a 420 nm..0 ml.5 ml.. 0.....0 ml. y y y CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Determinación de la concentración de proteínas en el preparado enzimático: (Reacción de Biuret) COMPONENTES Preparado enzimático Agua destilada Reactivo de Biuret 1.0 ml. II ± Lect. II 0. 4. 1. I II 0..5 ml.0 ml.. 0.. 0. I ± Lect. 0. Colocar en un baño de agua hirviendo durante 8 minutos Enfriara al chorro de agua Solución fosfomolíbdica y 1. 4..E.0 ml.12 TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES Filtrado I Filtrado II Agua destilada Solución cúprica alcalina I 0. de proteínas por ml..5 ml. del blanco) ± (Lect. de agua destilada.. Leer a 540 nm Para el espectrofotómetro. II ± Lect.045 uM/ml.0 ml. Factor = 0. CÁLCULO: (Lect. 0. Mezclar. Cálculo de las Unidades (U) (U) = uM de sustrato transformado x ml.

3. 2. . A = 1 x 10-3 y B = 1. proteína) a. Cuándo determina el azúcar reductor de una reacción. para calcular la Actividad Específica? ¿Por qué se utiliza el reactivo de Biuret? ¿Por qué una enzima se cuantifica en función de su actividad enzimática y no por el peso de la proteína (enzima)? Si en dos preparados biológicos A y B la actividad específica de una determinada enzima es: (en uM/mg. 5. CUESTIONARIO: 1. ¿Cómo explica la aparición de la coloración al final del sistema? ¿Por qué es necesario conocer previamente la concentración de proteínas del preparado enzimático y determinar la unidad de enzima (U). 4.5 x 10-4 ¿En cual de los dos preparados hay mayor cantidad de enzima? 6.13 IV.

La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores.4 VIII 1.0 5.Solución yodada (yoduro de potasio + yodato de potasio) . pH. pH.0 1.4 III 2.0 5. INTRODUCCION: En general.4 2.Buffer fosfato 0.Solución de cloruro de sodio al 2 % .0 1. de tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectada por la variación que pudieran sufrir los otros. II.0 5.0 3.25 % .4 2. concentración de sustrato.1M pH 9. tomando como ejemplo la hidrólisis enzimática del almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reacción enzimática.4 2.0 Solución de ClNa al 2 % Agua destilada I 1.6 II 1.6 Buffer fosfato 0.0 5. todas las enzimas. .Solución cúprico alcalina.0 VI 1.0 5.1M pH 4.Solución de almidón al 1 % . IONES INORGÁNICOS I. III.0 V 1. sobre la serie infinita de enzimas que se conoce.0 IV 1.0 1. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reacción enzimática sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones. tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática. temperatura.6 .0 VII 1.1M pH 6.0 5. Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara de la influencia de los factores (Tiempo. como se comprenderá. TIEMPO TEMPERATURA.1M pH 4.4 2.0 .6 .Buffer borato 0.Solución fosfomolíbdica.4 1.Ácido clorhídrico 0.0 . iones. Este patrón general.4 2. concentración de enzima. etc). concentración de enzima.6 Buffer borato 0.Buffer acetato 0.1M pH 6. varia en forma característica para cada enzima en particular. independientemente del tipo de reacción que catalizan. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.0 1. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes.0 5.4 2.Amilasa salival dializada al 0. PH.05N . presentan características comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo.0 1.14 PRACTICA N° 05 FACTORES FÍSICOS-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS PARTE I: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMAS.1M pH 9.) Solución de almidón al 1 % Buffer acetato 0. retardando o i pidiendo m su actividad.0 1. concentración de sustrato. REACTIVOS A UTILIZAR .0 1.0 5.

sin color) en el cuadro final. 0.0 0.0 0.5 5.6 V 0. de acuerdo a los sistemas que a continuación se presentan: y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL . . 1. 1.5 0.2 VIII 0.Agregar el preparado enzimático a los tubos: II al VIII. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.5 5.0 ml.0 ml.5 cada uno de los tubos HCl 0. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES III Incubado correspondientemente a los tubos III y V Solución cúprico alcalina 1.15 .5 0.5 0. para el equilibrio de la temperatura.0 0. de la siguiente manera: Cumplidos los 20 minutos de incubación sacar los tubos del baño maría y luego armar una serie paralela de tubos marcados del I al VIII.5 0.0 0.0 Solución iodada 0.5 5. por cinco minutos. y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS . .6 VII 0. .0 0. azul claro.0 0. del incubado de su correspondiente tubo.0 ml. maltosa) de la siguiente manera: Esta determinación sólo se hará en los tubos III y V del incubado a los 20 minutos.6 III 0.5 5.0 0. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.5 5.0 II 0. Cumplido los 8 minutos sacar los tubos y enfriar con agua corriente y AGREGAR: .) Preparado enzimático (en ml.5 ml.Realizar controles de la actividad enzimática.Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al baño de agua a 37 °C.0 ml.5 0.El Control de los productos formados se hará en base a la capacidad reductora de estos (glucosa. Mezclar y poner en baño maría hirviendo por 8 minutos.05N 5.El control del sustrato no transformado se realiza por la reacción del yodo. valorando los cambios de coloración (azul oscuro. agregando a cada tubo marcado.) I II III IV V VI VII VIII Incubado correspondiente de 0.El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0 °C y 4 °C durante cinco minutos.6 (Computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimático fue agregado a cada tubo) y Mezclar y continuar la incubación por 20 minutos.5 5.6 IV 0.5 0.5 5. I 0. según se indica y tomar el tiempo.6 VI 0.5 0. TUBOS V 1.5 Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos.

CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA POR E L SUSTRATO RESIDUAL: (cambio de color) A los 20 minutos: I II III IV V VI VII VIII CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (cambio de color) A los 20 minutos III V IV. sin color) en el cuadro final. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 4. 1. CUESTIONARIO: 1.16 COMPONENTES III Solución fosfomolíbdica Agua destilada TUBOS IV 1. 5.0 ml. azul claro. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la presencia de un ión activador sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? . ¿Cómo se determina el sustrato residual y los productos finales cuando se usa almidón como sustrato? 3. ¿Cuáles son los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas? 2. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática? 5. 5. ¿Cómo puede demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 6.0 ml.0 ml. Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de tubos valorando los cambios de coloración (azul oscuro.0 ml.

la velocidad de reacción siempre es proporcional a la concentración de cada uno de los reactantes.075 M Solución de ureasa cristalina en Buffer fosfato 0.1 M pH EDTA 0. INTRODUCCION: En las reacciones no catalizadas. A baja concentración de sustrato la velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato y la reacción es de primer orden con respecto al sustrato.1 M pH 6. II. la velocidad de la reacción llega a ser esencialmente independiente de la concentración del sustrato y asintóticamente alcanza una velocidad constante. se define mejor en términos de la concentración de sustrato necesario para obtener una velocidad inicial de reacción igual a la mitad de la velocidad máxima. cuando la concentración del sustrato es incrementada. PARTE II: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO.17 REUNION DE LABORATORIO N° 03 PRACTICA N° 06 FACTORES FÍSICO-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. y se dice que la enzima está siendo saturada con su sustrato. Las reacciones catalizadas por enzimas son algo diferentes. Sin embargo. la velocidad inicial se incrementa con menor intensidad. Desde el punto de vista operacional la constante de Michaelis (Km). I. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: . En este rango de concentración de sustrato la reacción es esencialmente de orden cero con respecto al sustrato.6 Tungstato de sodio al 10 % Ácido sulfúrico 2/3 N III. debido a que la velocidad de colisión entre los reactantes es proporcional a la concentración de cada uno de ellos. de modo que no es tan directamente proporcional a la concentración del sustrato. en esta zona la reacción es de orden mixto. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD MÁXIMA Y KM. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato 0. Con un incremento ulterior en la concentración de sustrato. La finalidad de la presente práctica es demostrar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática y hallar la velocidad máxima y el Km de la reacción.005 M Urea 0.

0 1.  Encontrar la concentración de amoníaco producido por ml.5 VI 0.5 II 0.0 II 1.5 VI 0.5 V 0.0 1.5 MEZCLAR y dejar en reposo por cinco minutos. ésta debe agregarse con intervalos de 1 a 2 minutos a cada tubo de tal manera que permita un fácil manejo de los mismos al final de cada tiempo.0 8.  Calcular la velocidad de reacción para cada uno de los sistemas enzimáticos preparados.0 1.5 0. de cada uno de los siguientes incubados a tubos de ensayo de una segunda serie siguiendo el siguiente esquema: COMPONENTES Del incubado anterior Agua destilada Reactivo de Nessler I 1. dividido entre el tiempo de incubación (15 minutos).5 0.075 M Ureasa 0.0 8.0 0.0 8.5 III 0.0 VI 1.  Calcular la concentración de sustrato (concentración molar) en cada tubo de incubación empleando la siguiente fórmula: V.5 III 2.5 3.0 - Pre incubar a 37 °C durante cinco minutos Incubar cada uno de los tubos exactamente 15 minutos 37°C ES FUNDAMENTAL: Medir exactamente el tiempo de incubación para cada tubo.0 1.0 1. .6 Urea 0. Transcurridos los 15 minutos agregar rápidamente: COMPONENTES H2SO4 2/3 N Tungstato de sodio 10% Ureasa .M.5 0. empleando la concentración de amoníaco producido por ml.5 0. Datos: V = 0.5 0.0 I 0.5 0.5 0.0 1.18 COMPONENTES Buffer fosfato pH 6.0 VII 1. Para ello se medirá el tiempo de incubación inmediatamente después de agregar la enzima.0 1.0 8.0 III 1.5 VII 0.5 IV 1.0 0.0 V 1.0 2.0 8.5 3.5 0.5 0. Para ello multiplicar la diferencia anterior por el factor de calibración empleado (1660) = µmoles de NH3 /ml.05 % I 3.  Hallar la diferencia de cada uno de los tubos.5 1.0 IV 1. V¶ = 4 ml.5 V 1. con respecto al tubo blanco (tubo VII).0 0.0 8.0 8.5 0.5 0.0 1. = V¶.5 IV 0.5 VII 0.M¶ Ejemplo: Concentración de úrea en el tubo I.0 0.5 ml. Luego:  Realizar las lecturas en el espectrofotómtero a 540 nm en cada uno de los tubos.MEZCLAR Transferir 1ml.5 2.5 II 2.

Construir una gráfica en un sistema de coordenadas teniendo como parámetros la inversa de la concentración del sustrato (1/S) (abscisas) en función de la inversa de la velocidad inicial de la reacción (ordenada). Calcular en la gráfica obtenida la velocidad máxima y la Km.075 M M¶ = ? M¶ = 0.  Utilizando papel milimetrado.  Anotar los resultados de cada uno de los tubos (concentración del sustrato y velocidad de la reacción). IV. aplicar la ecuación de Lineweaver Burk a los resultados obtenidos. ¿Qué establece la ecuación de Micahelis Menten? 3. En la curva trazada calcular la Km e indicar la Vmax. ¿Qué métodos conoce para determinar el Km? . ¿Cómo afecta la concentración del sustrato la velocidad de la reacción? 2. ¿Qué importancia tien el Km? 5. ¿Para que sirve la ecuación de Lineweaver? 6.  Construir una gráfica en el sistema de coordenadas teniendo como parámetros : La concentración del sustrato (abscisa) en función de la velocidad de la reacción (ordenada).075 M = 0.0093 M 4ml. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué es el Km? 4.5 ml x 0.19 M = 0.

si la enzima continúa inhibida después de la reacción del inhibidor. Un ejemplo clásico. Aquí el inhibidor se une a la enzima en otro sitio que no es aquel por el cual se une al sustrato. común en sistemas más complejos en el que el inhibidor se une exclusivamente al complejo enzima -sustrato para dar un complejo enzimasustrato-inhibidor incapaz de transformarse en otro producto. inhiben metaloenzimas por enlazarse al ión metálico. es otro tipo de inhibición reversible. La inhibición acompetitiva. Experimentalmente se puede identificar si un inhibidor cualquiera es o no competitivo. . Los dos tipos más comunes son: las inhibiciones reversibles competitivas y las inhibiciones reversibles no competitivas. Quedando por demostrar si este tipo de inhibición es reversible o no. ácido oxálico y glutarato. se dice que el inhibidor es reversible. NO y CO. alcoholes y calor que producen alteraciones en la estructura espacial de la molécula proteica que conduce a la desnaturalización. Respecto de los inhibidores reversibles es importante destacar que la interacción entre inhibidor y enzima se traduce en varios tipos de inhibición perfectamente diferenciados experimentalmente. entonces la inhibición será de tipo no competitiva. Los inhibidores enzimáticos se clasifican en reversibles e irreversibles. Por esta razón la unión de este último con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor. Si después de hacer actuar el inhidor sobre la enzima. Excluyéndose de ésta categoría aquellos agentes como los ácidos fuertes. Ejemplos de este tipo de inhibición son los causados por el N-etilamida. el exceso de inhibidor. cloruro de mercurio. A la inversa. los cuale enlazan iones metálicos necesarios para la actividad enzimática. Por ejemplo. que es cataliticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reacción y complejo-enzima-inhibidor. y la enzima recupera su actividad original. EDTA. pudiéndose formar entonces un complejo ternario enzima-sustrato-inhibidor. Si la inhibición no se revierte al agregar sustrato (succinato). INTRODUCCION: Existen sustancias cuya acción sobre una enzima es la disminución de su actividad. Estas sustancias se conocen como los inhibidores enzimáticos. Si el efecto inhibidor se revierte al incrementar la concentración del sustrato (succinato) entonces se podrá afirmar que el inhibidor es de tipo competitivo. En la inhibición competitiva se dice que un inhibidor obra por competencia si su acción inhibidora se revierte al aumentar la concentración de sustrato. por que efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazarse mutuamente de la enzima.20 REUNION DE LABORATORIO N° 04 PRACTICA N° 07 ACCION DE LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS Y NO COMPETITIVOS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. El inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual se debería unir el sustrato impidiendo por lo tanto la formación del complejo activoenzima-sustrato. eliminamos por algún método. se dice que el inhibidor es irreversible. de este tipo de inhibición es el que presenta la succinato deshidrogenasa que tiene como sustrato el succinato y puede ser inhibido por sustancias estructuralmente parecidas a dicho ácido como son el malato. si el sistema deshidrogenasa succínica+succinato. a las que se pueden agregar las inhibiciones reversibles acompetitivas. se agrega malonato como inhibidor. que se pueden distinguir en base a un criterio experimental. La inhibición no competitiva se caracteriza por que no puede ser revertida por un aumento de la concentración del sustrato ya que este último no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. De allí el nombre de competitivo.

Observar los resultados en cada uno de los tubos (cambio de color).Succinato de sodio 0.1 M 2 ± 6 diclorofenolindofenol Homogenizado 10 % I 2.2 0.0 1.1 M Malonato de sodio 0.2 Anotar y luego agregar a los tubos II.5 1. Dejar en reposo 15 minutos a la temperatura ambiente y luego observar los resultados y anotar.Homogenizado hepático 10 % III.0 1. REACTIVOS A UTILIZAR .1 M Succinato de sodio 0.3 0.Succinato de sodio 0.0 0.0 II 1. que el malonato es un inhibidor competitivo y que el cloruro mercúrico es un inhibidor no competitivo.1 M.0 1.2 ± 6 Diclorofenolindofenol . CUESTIONARIO: 1.Buffer fosfato 0.Cloruro de mercurio .5 M .Malonato de sodio 0.5 1.0 1.1 M . II.0 1.5 M Buffer fosfato 0.0 IV 1.5 - IV.5 IV 0.21 La siguiente práctica tiene por finalidad demostrar en el sistema enzimático Deshidrogenasa succínica+succinato: que el malonato y el cloruro mercúrico producen inhibición de este sistema.3 0. ¿Por qué el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo? 3.1M pH 7. IV.5 M Cloruro de mercurio 0.1 M .8 0.0 Dejar en reposo por 30 minutos a la temperatura ambiente.2 Succinato de sodio 0.5 0.1M pH 7.0 III 1.2 .5 III 0. ¿Cómo podría usted demostrar que la inhibición producida por el cloruro mercúrico es o no reversible? . II 0. III.5 1. ¿Por qué el malonato es inhibidor competitivo? 2. COMPONENTES Succinato de sodio 0.2 0.0 V 1.0 1. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.2 1. pH 7.

De por los menos dos semejanzas entre la inhibición no competitiva reversible e inhibición alostérica. Señale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibición no competitiva reversible. 5. ¿Qué diferencias puede usted establecer entre la inhibición competitiva y la inhibición alostérica? 7. sin considerar el cloruro de mercurio. 6.22 4. . además del malonato utilizado en el presente experimento. De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibición competitiva en el sistema Deshidrogenasa succínica ± succinato.

entonces podemos deducir que el inhibidor actúa en algún sitio anterior al citocromo o de la cadena. mediante el uso de indicadores conocidos como 2 ± 6 diclorofenolindofenol y p ± fenilendiamina. el monóxido de carbono. comprenden el cianuro. El ejemplo clásico de este grupo es la antimicina. Inhibidores de localización son: el amital. En la cadena REDOX. La p-fenilendiamina. Un primer grupo de inhibidores actúa sobre la NADH-deshidrogenasa. Si al administrar un inhibidor de la cadena. se les denomina inhibidores del sitio II. bloqueando el transporte de electrones entre la flavina y la ubiquinona. quiere decir que dicho inhibidor estará actuando en alguna región anterior a la FMN. Si el inhibidor no impide la oxidación del indicador. Por su acción cercana en el primer sitio de la desfosforilación se les suele denominar inhibidores del sitio I. Un segundo grupo de sustancias actúan bloqueando la transf rencia de electrones e entre los citocromos b y c.23 PRACTICA N° 08 EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE ÓXIDO-REDUCCIÓN I. inclusive de la cadena (región que incluye el sitio I). Si se administra un inhibidor que no impide la oxidación de la p-fenilendiamina y que tampoco impide la reducción del 2-6 diclorofenolindofenol. se utilizan sustancias indicadoras artificiales que cambian de color cuando se oxidan o se reducen. Este mismo sistema multienzimático es también conocido como cadena de transporte de electrones. algunos anestésicos volátiles como el halotano. así por ejemplo el 26 diclorofenolindofenol y el azul de metileno son sustancias indicadoras de color azul en estado oxidado. sitio II y sitio III. actúan en las regiones cercanas al sitio I. Un grupo de inhibidores actúa sobre el Hemo a3 de la citocromo oxidasa impidiendo su interacción con el oxígeno. Como hay flujo de electrones en la cadena. Este sistema está localizado en la membrana mitocondrial interna y se caracteriza por la cohesión física con la cual sus componentes se encuentran unidos entre si e integrados en la membrana. entonces podemos deducir que el sitio de inhibición estará en alguín sitio posterior a la CoQ inclusive. pero si el indicador se decolora. De esta manera se puede verificar si la cadena comprendida entre el citocromo C y el oxígeno. A estos se les denomina inhibidores del sitio III. INTRODUCCION: Los equivalentes de reducción. entonces podemos deducir que el mencionado inhibidor actuará en algún sitio comprendido entre la CoQ y el citocromo B inclusive (cercano al sitio II de la cadena). Los más representativos de este grupo son la rotenona y la piericidina. es decir que es capaz de ceder electrones. es o no permeable al flujo de electrones que provienen del indicador. Para poder determinar la permeabilidad de la cadena de oxidoreducción al paso o no de electrones. es otro indicador que actúa como sustrato. provenientes de la deshidrogenación de los sustratos del ciclo de Krebbs y otros metabolitos son transferidos al oxígeno por un sistema multienzimático denominado cadena respiratoria. Si se administra un inhibidor que impide el flujo de electrones en algún punto de esta porción de la cadena. que al reducirse (recibir electrones) se decoloran. átomos de hidrógeno o electrones. los esteroides. la p-fenilendiamina no se oxidará (no cambia de color). Existen diversas sustancias que actúan como inhibidores de la cadena respiratoria. el BAL y barbiturato de sódio. los detergentes. el citocromo C actuará como primer aceptor de electrones que provienen de la p-fenilendiamina. barbital sódico y azida de sodio. ésta cede sus electrones a los indicadores entre la FMN y la CoQ. Cuando se oxida (cede electrones) cambia de color (a marrón oscuro). Los inhibidores más comúnmente usados pueden reunirse en tres grupos principales según el sitio de la cadena respiratoria donde actúan. . éste impide que el 2-6 diclorofenolindofenol se reduzca (se decolore). la azida. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que los inhibidores: rotenona. respectivamente. etc. denominación que pone énfasis en que las oxidaciones reducciones son fenómenos caracterizados por la pérdida o ganancia de electrones. inhibidores similares son la hidroxiquinolina N-óxido. etc.

1M pH 7.5 0.0 II 1.1M Rotenona 0.5 1.1M Barbiturato de sodio 0. barbital sódico y azida de sodio.5 0. Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos).1M Barbiturato de sodio Azida de sodio Homogenizado mitocondrial 10% I 1.5 0.02 % Malato 0. dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.5 0.2 III 1.2 0.2 0.0 0.5 Mezclar.5 0.5 reposo a temperatura minutos. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0. barbital sódico y azida de sodio. I 2.5 IV 0.24 II. verificar el efecto de los inhibidores: rotenona.1M Rotenona 0.0 1.5 V 0.0 0.0 .2 0.5 0.02 % p-fenilendiamina 1% Malato de sodio 0.5 1.6-diclorofenolindofenol 0.5 0. dejar en 10% ambiente por 20 0. ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (en ml.5 1.1M.0 0.5 0.1M pH 7.0 0.0 0.) Buffer fosfato 0.5 0. verificar el efecto de los inhibidores rotenona.1M Rotenona 0.2 1.4 Azida de sodio Barbiturato de sodio 0.5 VI 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) En el sistema Deshidrogenasa málica + malato + cadena rédox mitocondrial.4 2.1M P±fenilendiamina 1% Homogenizado de mitocondrias Mezclar.0 IV 1.5 III 1.5 0.4 2.2 0.5 0.5 0.5 0. TUBOS COMPONENTES (en ml.0 0.5 II 1.5 0.1M Azida de sodio Fracción mitocondrial 10% (hígado de rata) III.0 V 1. 6-diclorofenol indofenol 0.5 1. pH: 7. En el sistema p±fenilendiamina + cadena rédox mitocondrial.) Buffer fosfato de sodio 0.

IV. ¿Qué inhibidores de la cadena de óxido reducción conoce y a qué nivel actúan? 2. Grafique usted en una cadena de óxido reducción biológica. que cambios observaría con la rotenona.6-diclorofenolindofenol en un sistema con cadena respiratoria. que cambios observaría con la rotenona. ¿Si utiliza el indicador p±fenilendiamina en un sistema con cadena respiratoria. barbiturato de sodio y azida de sodio? 3. . ¿Si utiliza el indicador rédox 2. Indique usted los sustratos y enzimas que intervienen en los sistemas realizados en la práctica. CUESTIONARIO: 1. 5. barbiturato de sodio y azida de sodio? 4. la acción de los inhibidores e indicadores utilizados en el experimento.25 Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos).

constituyendo la fracción microsomal con el citosol. se emplea una centrífuga refrigerada. KCl 0.02 % Succinato 0. grupos prostéticos y átomos metálicos. El animal será sacrificado. Fracción microsomal soluble del homogenizado. fosfolípidos.154 M. Homogenizado al 10%: se pesa 10gr de hígado y se corta en fragmentos pequeños y se coloca en el homogenizador potter y se le agrega solución de KCl 0. El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15 minutos en la centrífuga refrigerada. Todo debe trabajarse entre 0 y 4ºC. albicans). REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0.4 2. Estos sistemas están constituidos por proteínas.25 M Fracción nuclear del homogenizado. Fracción mitocondrial del homogenizado.reducción usando los indicadores redox 2 .6-diclorofenolindofenol 0. El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocándolo en tubos de polietileno. INTRODUCCION: Los carbohidratos. previa calibración en la balanza. La finalidad del presente trabajo es objetivizar la distribución intracelular de las enzimas de óxido . hallándolas de modo fundamental en una subestructura celular en donde la energía derivada de las oxidaciones es "capturada" en la forma del intermediario macroérgico ATP.1M pH: 7.6 diclorofenilindofenol y p . Se hace presión manualmente con el embolo girando hacia el fondo.reducción tienen una distribución característica intracelularmente. las enzimas que intervienen en estos pr cesos se encuentran o clasificadas en diversos grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimológica. El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fracción mitocondrial. Se coloca el hígado en un petri se elimina la cápsula del hígado y otros tejidos periféricos. inmediatamente se hara un corte longitudinal en el abdomen procediendo a extraer el hígado.26 PRACTICA N° 09 DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE ÓXIDOREDUCCIÓN I. - - .154 M III. II.fenilendiamina y los componentes celulares de un homogeneizado de hígado de rata obtenidos por centrifugación dif rencial mediante el método de e Schreider y col. El sobrenadante es separado en un beaker de 500ml. Las enzimas de óxido . ácidos grasos.1M p±fenilendiamina 1% Homogenizado total de hígado de rata en sucrosa 0. El sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca en un beaker de 100ml. aminoácidos y algunas otras sustancias sufren oxidaciones en el organismo mediante sistemas enzimáticos simples o complejos. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Fraccionamiento Celular Cada grupo recibirá una rata albina (Rattus rattus var. Se separa el sobrenadante en un beaker. De acuerdo a su estructura y función.

2 II 0.2 0.0 1.5 - Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador.5 2 1.5 0. Grafique usted en una cadena de óxido ± reducción biológica la acción de los indicadores rédox 2.2 0. IV.5 Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente. para interpretar los resultados.5 IV 0.5 0.5 0.0 0.5 1 1. 4. para interpretar los resultados.0 0. CUESTIONARIO: 1.5 1.5 1.1M.0 0.2 0.4 P ± fenilendiamina 1% (sustrato + indicador) Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal ±soluble Homogenizado total 0. Armar otro sistema. empleando: COMPONENTES Buffer fosfato 0.5 4 1.4 2 ± 6 diclorofenolindofenol Succinato de sodio 0. ¿Qué es el p-fenilendiamina y cómo actúa en la cadena respiratoria? 3.5 5 1.0 0. pH 7.6 diclorofenolindofenol y p±fenilendiamina.2 0.5 III 0.27 Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Buffer fosfato 0. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador.0 0.0 0.5 1.0 0.0 0. ¿En que fracciones celulares se encuentran las enzimas de óxido ± reducción? 6.5 3 1.5 V 0.5 0.1M Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal -soluble Homogenizado total I 1.6-diclorofenolindofenol y cómo actúa en la cadena respiratoria? 2.0 0. ¿Qué es el 2.5 1. Haga un esquema de la centrifugación diferencial . ¿Qué es un homogenizado de hígado y cómo se obtienen las fracciones celulares por centrifugación diferencial? 5.1M. pH 7.

Bajos niveles pueden encontrarse en pancreatitia crónica y en carcinoma pancreático cuando el daño es extenso y hay insuficiencia de las acinos glandulares. . En los casos señalados se ha propuesto la prueba funcional de la amilasa sérica después de la administración de secretina y morfina. Se ha reportado incremento después de la ingestión de alcohol. La alfa amilasa actúa rompiendo los enlaces alfa 1-4 glucosídicos en la parte central de la amilasa formando una mixtura de pequeñas dextrinas + maltosa. en pacientes con insuficiencias pancreática. En normales. la amilisa sérica se altera. obstrucción intestinal. En obstrucción de los conductos puede elevarse. Si liberan alfa o beta maltosa. La elevación puede ocurrir en otras condiciones que incluyen enfermedad de las glándulas salivales (pancreatitis). Los valores normales de amilasa por el método de Caraway calibrado en unidades Somogy es de 60 a 180. se les clasifica en alfa y beta amilasa. no es probable el diagnóstico de pancreatitis aguda. la amilasa se encuentra grandemente incrementada y retorna a los valores normales lentamente. En el suero humano. peritonitis. Es posible encontrar valores más altos. Para la mayor parte. Para la determinación de amilasa usamos el método de Caraway. después de colangiografía. así como en la orina existe actividad amilásica. Entre 2 ± 12 horas después de producida la pancreatitis aguda. las cuales explicarían probablemente menos del 25% de la actividad sérica normal.28 PRACTICA N° 10 DETERMINACION DE AMILASA SERICA I. músculo estriado. en el que la cantidad de almidón y tiempo de incubación son ajustados de manera que sólo una porción de almidón es hidrolizado cuando la reacci n ó es parada por la adición de yodo. trompa de Falopio y tejido adiposo. encefalitis viral. amilasa y amilopectina producen sólo B-glucosa por hidrólisis. La amilasa es un poliglucósido de configuración lineal de unidades de glucosa unidos por enlace alfa 1-4 glucosídicos. después de la administración secretina. la explicación no es clara. trombosis mesentérica. El presente experimento tiene por finalidad determinar la amilasa sérica en personas normales y/o con alteraciones patológicas especialmente del pancreas. edema y pancreatitis están presentes indudablemente. INTRODUCCION: La amilasa es una enzima que hidroliza el almidón. carcinoma bronconígeno y en neumonía. La diferencia entre la cantidad de color azul formado en la muestra incubada y el blanco incubado por la adición de suero después de la incubación. mide la cantidad de almidón hidrolizado y por ende la actividad de amilasa de la muestra. las elevaciones son (con excepción de los niveles obtenidos después de la administración de opiáceos) menos de 500 unidades. En otros. El origen de la amilasa sérica humana incluye al páncreas y glándulas salivales. diuréticos tiazídicos. Muy raramente permanece elevada 4-6 días. Si dentro de 24 horas no se eleva. La amilasa puede ser detectada en niños desde 1 a 2 meses de edad y los valores son más bajos que en el adulto normal. En algunas de estas condiciones. La amilasa salival y pancreática humana esta dentro del grupo de las primeras. después de ruptura esplénica. Después de la administración de morfina en normales se incrementa la amilasa sérica. úlcera duodenal o gástrica penetrante o perforada. difiere de la amilasa porque contiene además enlaces alfa 1-6 glucosídicos frecuentemente ramificados. pero al año de edad la actividad es igual a la del adulto. También ha sido informado en leche y en el semen humano. enfermedad séptica aguda del coledoco. morfina. cirrosis. con frecuencia 2-3 días después. La amilasa comprende a sólo el 20% del almidón y es soluble en agua. el resto es una fracción inosoluble llamada amilopectina. uremia después de la administración de codeína. En la bilis no hay actividad. Otras fuentes incluyen el hígado. En pancreatitis se llega hasta 2000 a 3000 unidades. Ambas.

IV.0 ml. 0. pH 7.0 ml. 35 ml. 5.1 ml. 2. 4. De qué manera el ión cloruro activa a la amilasa ¿Qué semejanza o diferencia puede establecer usted entre amilasa dializada y no dializada. debido a que las proteínas séricas disminuyen la cantidad de color producido por el complejo yodo ± almidón y este podría ser diferente). ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): Armar el siguiente sistema: (Utilizar dos frascos volumétricos ± Erlenmeyer de 50 ml.) I PROBLEMA Sustrato de almidón Bufferado Retirar los frascos y agregar suero Retirar los frascos y agregar suero Agua destilada Solución iodada de trabajo.29 II. 3.1 ml. 0. en CÁLCULO Absorbancia del _ Absorbancia del blanco problema _______________________________________ X Absorbancia del blanco 5. 5. II BLANCO 5. Leer 660 nm.0 ml. REACTIVOS A UTILIZAR: y Sustrato de almidón Bufferado. Mezclar bien. CUESTIONARIO: 1. 35 ml.0 : y Solución Stock de iodo : y Solución iodada de trabajo: III.0 ml. en función de la actividad enzimática? ¿Cómo explica usted el diferente comportamiento de la amilasa hepática y pancreática sometidas a electroforesis? ¿Por qué la concentración de amilasa sérica es menor durante los primeros meses de vida lactante? .5 minutos exactamente 800 = Unidades de amilada por 100 ml (Se requiere un blanco por cada muestra de suero. espectrofotómetro a Incubar a 37°C durante cinco minutos ambos frascos Mezclar e incubar a 37°C durante 7.

30 .

sino que lo hace por un mecanismo de difusión controlada. el corazón y el músculo esquelético. proviene de dos orígenes: de origen exógeno de los alimentos. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea es una de las fuentes de energía más importantes en el organismo y en algunos tejidos altamente especializados. Los valores normales de glucosa en sangre son variables de acuerdo al método utiizado. . siendo el hepatocito permeable para este metabolito. Este mecanismo requiere ATP como fuente de energía. el transporte de glucosa al interior de las células es por difusión pasiva. I. el organismo dispone de una compleja maquinaria metabólica que permite asegurar la constancia de la concentración de glucosa en la sangre y. con el método de la glucosa oxidasa la concentración varía entre 70 ± 110 mg/dl. hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina. La glucosa en sangre. contribuyen a mantener constante la concentración de glucosa en sangre. la constante disponibilidad de este sustrato a los tejidos. Varía entre los 80 ± 120 mg%. sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento. Diversos factores que inciden sobre la absorción. Por todo esto. Este proceso. El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a través de las células de la mucosa intestinal no es muy conocido. El conocimiento de la glicemia es importante no sólo porque permite tener una idea integral del mecanismo de homeostasis metabólica existente. En este caso la glucosa entra en la célula. La entrada de la glucosa en estas células está supeditada a que. en particular en el tejido adiposo. posiblemente porque se une a la misma proteína transportadora que lleva el sodio. A su vez. volvería a salir de la célula. y de origen endógeno. En el cerebro y los glóbulos rojos es la única fuente de energía. Este es un caso interesante en que un sistema de transporte a través de la membrana favorecería a otro. Según el método l de Folin Wu. con ella. el sodio. por ello. por lo tanto la concentración de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo. que proviene del hígado por glucogenólisis. por la bomba de sodio y potasio. En casi todos los demás tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las células por simple difusión.31 II UNIDAD METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS REUNION DE LABORATORIO N° 05 PRACTICA N° 11 DEMOSTRACION DE LA DIGESTION Y ABSORCION DE LOS CARBOHIDRATOS: GLICEMIA PRE Y POST-PRANDIAL. Por otra parte. producción endógena de glucosa así como la utilización y excreción de la misma. En el caso del hígado. Se cree que está íntimamente ligado al transporte de sodio. al salir del Na+ mantenga alta concentración en el líquido extracelular. se llama cotransporte. y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentración de sodio en fluído extracelular.

La segunda: Esta muestra se tomará después de una hora. cuantificando la glicemia pre y postprandial. como máximo. por el método de Glucosa oxidasa. En esos momentos. CUESTIONARIO: 1. La determinación de la glicemia se realizará por el método Enzimático de la glucosa oxidasa. ----20 ul ----2 ml Dpost. con jeringa hipodérmica de 10 ml. Rotular y fechar. . III. . IV. que usted puede encontrar por ejemplo en una intolerancia a la glucosa. (Desconocido post prandial). REACTIVOS A UTILIZAR . cuál es el rango considerado normal para la glicemia basal? Explique las variaciones en los valores. (Desconocido preprandial) y Dpost.00 g/l f = ----------- S y D = Dpre. y con aguja N° 20. luego se centrifuga a 3000 RPM por 10 minutos.AF: Solución de 4 ± aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0. Colocar las muestras en tubos de ensayo.AF. Mezclar por inversión sin agitar. Dpre. colocar: COMPONENTES Standard Muestra (suero preprandial) Muestra (suero postprandial) Reactivo de trabajo B ------------2 ml S 20 ul --------2 ml Dpre. después de la ingesta alimenticia. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES : Se tomarán dos muestras de sangre : La primera: La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra. se deja reposar 10 minutos. 50 partes de Reactivo Fenol y llevar a 1. Separar el suero.Estándar: Solución de glucosa 1 g/l . Utilizar 4 tubos de ensayo: B (Blanco). II. Restar a D el Blanco (B) y el resultado se multiplica por f.Reactivo 4. . Cálculo de los resultados : Glucosa (g/l) = D x f donde 1. --------20 ul 2 ml Incubar todos los tubos 10 minutos en baño de agua a 37 ºC Leer en Espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco. se extraerán 5 ml. y Dpost. Agregar 3 partes de enzimas GOD/POD previamente homogenizadas. Antes de multiplicar D x f. 50 partes de Reactivo 4.92 mol/l.32 La finalidad de la siguiente práctica es demostrar la digestión y absorción de la glucosa. .Reactivo Fenol: Solución de Fenol 55 mmol/l.000 partes con agua destilada. tanto en personas normales como en casos patológicos.000 U/ml) y Peróxidasa (120 U/ml).Preparación del Reactivo de trabajo: 500 partes de agua destilada. S (Standard). de sangre de la flexura del codo.GOD/POD: Solución de glucosa oxidasa (1. ¿Actualmente.

6 son estables. En cambio el glucógeno post prandial es debido a que la glucogénesis se incrementa cuando las concentraciones en sangre alcanzan valores de 150 mg/100 ml ó más. . La mayoría de los residuos de glucosa en el glucógeno están ligados por enlaces glucosídicos alfa 1. 3. Se encuentra glucógeno o se puede sintetizar en cualquier célula del organismo. pero las concentraciones varían en los diferentes tejidos correspondiendo las concentraciones más altas del hígado y al músculo esquelético.) III. . ¿Qué variaciones fisiológicas de glicemia puede usted señalar? PRACTICA N° 12 INFLUENCIA DE LA DIETA EN LA FORMACIÓN Y ALMACENAMIENTO DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO I. relacionados con la glicemia. El glucógeno puede ser aislado de los tejidos por digestión con soluciones de hidróxido de potasio caliente en los cuales los enlaces no reductores alfa 1. La acción de la beta amilasa también rinde una dextrina límite. ¿Cuál son los criterios bioquímicos. lugares principales de almacenamiento.Fenol al 80 % .Homogenizado de hígado de rata al 10 % (pesar 10 g. ¿Cómo esperaría encontrar los valores de la glicemia dosada en la sangre venosa y en la sangre arterial? Fundamente las variaciones que se pueden encontrar.KOH al 60 % .Alcohol absoluto. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. El glucógeno es también fácilmente hidrolizable por alfa y beta amilasa para rendir glucosa y maltosa respectivamente.5 . EXTRACCION DE GLUCOGENO HEPATICO (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Homogenizado de hígado en ayunas Homogenizado de hígado post prandial I 0. El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa de fácil disponibilidad.Na2S04 solución saturada. ¿Conoce otros métodos para determinar la glicemia? Explique su fundamento 4.33 2. INTRODUCCION: El glucógeno está presente en el citosol en forma de gránulos los que contienen las enzimas glucógeno fosforilasa. La finalidad de la siguiente práctica es cuantificar el glucógeno en ayunas y después de la uingesta de alimentos y evaluar los valores encontrados relacionados con los factores que determinan sus síntesis y degradación II. para el diagnóstico de diabetes mellitus? 5.5 --II --0.6 los cuales se presentan con frecuencia aproximada de uno por cada 10 residuos. de hígado y homogenizar con agua destilada.H2S04 concentrado.4 y alfa 1. En el hígado el glucógeno se incrementa después de la ingesta de alimentos (período post prandial) llegando a los límites máximos cuando la dieta es abundante y/o en base a carbohidratos. REACTIVOS A UTILIZAR .4 y las ramificaciones se forman por enlaces glucosidicos alfa 1. glucógeno sintetasa y algunas otras que regulan la síntesis y degradación. .

0 5.0 Mezclar y dejar en el baño de agua helada durante 5 minutos más. Reposo por una hora. motivo del experimento? 4. del Sistema anterior« -1.1 0. CALCULOS: Factor Espectrofotómetro = 7 g % de glucógeno = (Lec. ¿Porqué mecanismo metabólico el glucógeno incrementa cuando la concentración de glucosa en sangre es mayor de 150 mg/dl? 5.0 1. Blanco) x Factor IV.1 Mezclar. Colocar los tubos en agua helada durante 5 min. gota a gotaen el centro de c/tubo 5. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones post prandial? 3. Alcohol al 98 % 5.0 5.0 Disolver el precipitado por agitación.34 KOH al 60 % 0.5 Calentar los tubos en baño maría a 100 C por 10 min. . 540 n m. y sin retirar los tubos del baño helado: Agregar H2S04 cc. 0.1 Mezclar.1 0. Agregar agua destilada 5. Explique los mecanismos que regulan la homeostasis de la glucosa y el rol del glucógeno durante el ayuno prolongado. 2.I ± Lect.0 Fenol al 80 % 0.0 Na 2SO4 solución saturada.5 0. Eliminar el sobrenadante y colocar boca a bajo los tubos sobre papel de filtro por 5 minutos. Centrifugar a 3500 RPM por 10 min. ¿Qué relaciones metabólicas puede usted establecer entre los valores de glucógeno obtenidos en ambas muestras de hígado de rata.0 --Muestra del tubo II. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones de ayuno? Dé usted las razones metabólicas que expliquen su resultado. CUESTIONARIO: 1.0 -Agua destilada 1.0 2. CUANTIFICACION POR METODO COLORIMETRO DEL GLUCOGENO EXTRAIDO Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml)) I II BLANCO Muestra del tubo I del Sistema anterior««««««« 1.0 5. Leer en el fotocolorímetro con filtro verde.0 5.1 0.

una excesiva excreción de glucosa por la orina (glucosuria) y un reducido nivel de glucógeno en el hígado. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas. de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la producción y la utilización de la glucosa sanguínea. Los mecanismos reguladores de la concentración de glucosa son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los primeros actúan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las glándulas de secreción interna. . La administración de insulina va seguida de la glicemia (hipoglicemia) cuya magnitud depende de la dosis administrada. aminoácidos. cuya sensibilidad está regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipófisis por el otro. el efecto se debe fundamentalmente a que la hormona favorece la formación de glucógeno en el hígado y en el músculo. . La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos. Esta hormona es producida por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas y es secretado en respuesta directa al incremento de glucosa en la sangre. la glicemia es muy constante. en ayunas. II.Jeringas hipodérmicas de 1 cc. Siendo en la sangre arterial mayor que en la venosa. REACTIVOS A UTILIZAR . pues es utilizada por todas las células para producir energía y por algunas células para funciones más especializadas por ejemplo glucogénesis. El efecto más importante de una deficiencia insulínica es el de un nivel sanguíneo de glucosa elevado (hiperglicemia). La insulina también favorece la conversión de los hidratos de carbono en ácidos grasos y por otro lado inhibe la gluconeogénesis a partir de los aminoácidos. lipogénesis y otras semejantes. En condiciones normales. . . La insulina ejerce efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otros nutrientes. Se explica así que la falta de insulina determina una hiperglicemia que es el signo fundamental del cuadro denominado Diabetes.Conejos adultos de más de 2 kg.35 REUNION DE LABORATORIO N° 06 PRACTICA N° 13 REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA ACCION DE LA HORMONA INSULINA I.Glucómetro. se produce más insulina que tiende a aminorarla. de manera que cada vez se eleva la glicemia. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea proviene de: glucógeno hepático. La glicemia se eleva después de la ingestión de un alimento rico en hidratos de carbono para luego descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas después de la ingestión vuelve al nivel de ayunas. otros carbohidratos y de glucosa absorbida por el intestino. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de administración de insulina. a la vez que acelera la oxidación de glucosa en diferentes tejidos.Solución de insulina cristalizada (Lilly): I Unidad por ml. La secreción de insulina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia.

lo que hace un total de tres muestras en una hora. CUESTIONARIO: 1. y y Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de insulina a inyectar. Dosis de la solución de insulina cristalina (I Unidad por ml) inyectar I Unidad por Kilogramo de peso corporal. 30 y 60 minutos después de inyectada la insulina. 4. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. La que servirá para establecer los valores basales de glicemia. como resultado. ¿Cuáles son las hormonas contrarreguladoras y su mecanismo de acción? 5. Explique cómo y porqué se producen los signos y síntomas del cuadro clínico de hipoglicemia. que facilita la medida de la dosis. 2. 3. Hacer una gráfica de glicemia vs tiempo       IV. .  Luego extraer muestras de sangre a los 15 . EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE INSULINA. Anotar los resultados en relación al tiempo.  Extraer una primera muestra de sangre del pabellón auricular del conejo. Utilizar una jeringa hipodérmica de 1 ml.36 III. Explique la naturaleza química y las acciones biológicas de la insulina. Explique brevemente la regulación de la glicemia. en términos generales. de la tasa de llegada e índice de salida de la glucosa de la sangre.  Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de insulina. Explique el mecanismo de acción de la insulina en la homeostasis de la glucosa.

REACTIVOS A UTILIZAR . EXTRACCION DE ADRENALINA. tomando las variaciones en relación al tiempo. Utilizar una jeringa hipodérmica de tuberculina que facilita la medida de la dosis. del pabellón auricular del conejo.Jeringas hipodérmicas de 1 cc. la glucogenólisis se realiza con la formación de lactato el que va ha contribuir directamente a la formación de glucosa y glucógeno en la célula hepática por los mecanismos gluconeogenéticos. II. 3.Conejos adultos de más de 2 kg de peso corporal. hormona secretada por la médula suprarrenal. con especial referencia al metabolismo de los carbohidratos.37 ACCION DE LA HORMONA ADRENALINA I. además de actuar en el músculo. Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de adrenalina según el peso del animal. El efecto glucogenolítico de la adrenalina es debido a que activa a la fosforilasa. Servirá para establecer los valores basales de glicemia. si l aparece hipoglicemia se segrega más adrenalina y glucagón que aceleran la regulación que espontáneamente debe realizar el hígado.Solución de adrenalina 0.  Dosis de la solución de adrenalina (0. por la ausencia en este de la glucosa 6. ¿Cuál es el mecanismo de acción hormonal de la adrenalina a nivel de sus órganos blanco? Explique de manera suscinta el efecto de la adrenalina sobre la glicemia. lo que hace un total de tres muestras en una hora.25 ml de la solución a utilizar por kg de peso.1 mg por ml.Glucómetro. 3. . 4. III. 2. ello se debe a que favorece la conversión del glucógeno en glucosa (glucogenólisis) en el hígado. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de la administración de adrenalina.fosfatasa. ¿Cuál es el efecto metabólico de la adrenalina sobre el hígado y sobre el tejido muscular y que efecto produce sobre la glicemia? . Explique la naturaleza química y las acciones fisiológicas de la adrenalina. . CUESTIONARIO: 1. Luego extraer muestras de sangre a los 15 . 30 y 60 minutos después de inyectada la adrenalina. La secreción de adrenalina parece estar condicionada en forma importante por el nive de glicemia. Anotar los resultados en relación al tiempo. construir una gráfica. LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE 1. ACTIVIDADES INTRUCCIONALES: Procedimiento  Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de adrenalina a inyectar. Extraer una primera muestra de sangre. Con los resultados así obtenidos.025 mg por cada kilogramo de peso corporal que corresponde a 0. INTRODUCCION: La adrenalina. .1 mg/ml) inyectar 0. tiene acción hiperglicemiante. Con cada una de las citadas muestras realizar los dosajes de glucosa según el método de Glucocinta 5. ¡ ¡ ¡ IV. 2. sometidos a ayuno de 8 a 12 horas. 4.

creatinina. INTRODUCCION: En la orina de sujetos normales no existen cantidades detectables de azúcares en orina. pero cuando la glicemia supera los 180 mg % se puede producir glucosuria (presencia de glucosa en orina) porque en estas condiciones se supera la capacidad del riñón para reabsorverla (dintel renal). ácido glucorónico. ácido úrico. es posible encontrar cierta cantidad de elementos reductores que se eliminen diariamente entre 0. utilizando un método específico a base de glucosa oxidasa y otro inespecífico en base al reactivo de Benedict.38 5.5 y 1. Sin embargo. además de glucosa. en presencia de glucosa (sustrato) de la orina remueve de éste 2 iones hidrógeno (2H+) formando gluconolactona). cuando existe insuficiencia renal (menor filtración) no aparece glucosa en la orina aunque la concentración de glucosa se encuentra elevada por encima de 180 mg %. formaldehído. Cuando la capacidad de reabsorción renal disminuye. Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza para determinar glucosa en orina. La glucosa puede ser determinada de manera específica utilizando como reactivo básico la glucosa oxidasa (método enzimático). La glucosa oxidasa.5 g/l. sin tomar en cuenta su acción en el metabolismo hidrocarbonado? REUNION DE LABORATORIO N° 07 PRACTICA N° 14 DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA EN ORINAY SU DIFERENCIACIÓN DE OTROS AZUCARES REDUCTORES I. galactosa y pentosas. ¿Qué efectos tiene la adrenalina. La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras. ácido ascórbico. en presencia de peroxidasa produce 0-tolidina oxidasa (de color azul) más agua. fructuosa. Este. II. etc. b) Otros compuestos orgánicos: ácido homogentísico. c) Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato cloral. La prueba está basada en que la glucosa urinaria en presencia de oxígeno. El peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa oxida a la 0-tolidina y toma color azul. por acción de la glucosa oxidasa produce ácido glucorón más peróxido de ico hidrógeno. REACTIVOS A UTILIZAR . y por tanto es explicable que no aparezca glucosa en orina. puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que podemos señalar: a) Otros azúcares reductores: lactosa. Los azúcares forman más o menos la décima parte de dicha cantidad y de ella no puede decirse que su totalidad esté constituída por glucosa. La glucosa del filtrado glomerular renal se reabsorbe en su totalidad en los tubos contorneados proximales. la orina en glucosa aparece aunque ésta se encuentre en concentraciones normales en la sangre (diabetes insípida). En la orina. el cual es hidratado a ácido glucónico. de uso generalizado en clínica. Los iones hidrógeno removidos se combinan con el oxígeno atmosférico y forman peróxido de hidrógeno (H2O2). Por el contrario. pero como anotamos éste identifica a las sustancias con capacidad reductora y por tanto es de carácter inespecífico.

5. Observar si hay cambio de color y precipitado. Agitar para evitar que el líquido se proyecte hacia fuera del tubo. realizamos la siguiente determinación con la misma muestra de orina. Determinación de sustancias reductoras en orina mediante el reactivo de Benedict. 3. CUESTIONARIO: 1. 6. 3. incluida la glucosa Que resultados podrían obtenerse al tratar una muestra problema de orina. Determinación enzimática de la glucosa en orina (Método de la glucosa oxidasa). Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml. al ser tratada con el método de la glucosa oxidasa. Colocar en baño de agua hirviendo por 5 min o exponer al fuego directo hasta ebullición por 1 min. 2. primero con el reactivo de Benedict y luego por el método de la glucosa oxidasa Que presunciones plantearía si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de Benedict da resultado positivo y sin embargo. . Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas (Glucocinta Lilly). 2. Observar si a los 60 segundos. Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recién emitida contenida en un depósito de 5. III. Agregar orina problema: 5 gotas. Fundamente la utilización del reactivo de Benedict para la detección de sustancias con capacidad reductora. después de humedecida la cinta. 4. 3. la reacción demuestra la presencia de sustancias reductoras. Si aparece un precipitado de color rojo ladrillo. Explique que es el umbral renal de la glucosa. Llevar al baño de agua hirviendo por 5 min o exponer el tubo al fuego directo hasta que hierva por 1 min. Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del líquido contenido en el tubo. 2. en relación a la glicemia del paciente podría plantear? Explique el fundamento del método de a glucosa oxidasa para la detección de glucosuria. IV. 1. Compare la intensidad de la coloración azulada con una escala adjunta que representa aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa.39 - Reactivo de Benedict. da negativo Ante una prueba positiva de glucosa en orina: ¿Qué presunciones diagnósticas. adquiere o no color azul. 4. Procedimiento: 1.10 ml. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras.

40 .

300 ml . Transferir a una caja Petri llena de solución de lavado. cerca de 100 mg/día.1 ml. válvulas del corazón y son responsables de las características físicas de estas estructuras.Usar orina fresca o de 24 hrs conservadas en refrigeración (no usar preservantes). De acuerdo a su composición química los mucopolisacáridos están agrupados en dermatán sulfato. RESULTADOS Positivo: aparición de un color púrpura. III. Síndrome de Hunter. cartílago. REACTIVOS A UTILIZAR . INTRODUCCION: Determinar desórdenes genéticos puede involucrar los sistemas enzimáticos esenciales del metabolismo de los mucopolisacáridos.Poner una gota de orina al centro de un papel de prueba con Azure-A. 0. Sacar y secar la tira de papel en estufa a 80º C o con aire caliente. Síndrome de Sanfilippo. cordón umbilical. . cantidad que es bastante elevada si se compara con los 15 mg/día que excretan las personas normales. Estas son subdividas en varios grupos tales como : Síndrome de Morquiolo. resultado obtenido cuando la excreción está sobre el límite superior normal de 15 mg/día. Un resultado positivo por este procedimiento debe ser confirmado y cuantificado por columna cromatográfica ó utilizando la reacción de precipitación con cloruro de cetil piridium. La presencia de mucopolisacáridos en orina puede detectarse por un simple procedimiento o Test de Identificación de Mucopolisacáridos que se basa en que el papel Whatman I impregnado con el colorante AZURE-A. heparán sulfato y queratán sulfato. . CUESTIONARIO: 1.Papel Whatman I impregnado con Azure-A . II.La orina turbia debe ser filtrada o centrifugada previamente. 3. Síndrome de Hurler.Solución de Lavado :  Metanol  Acido acético glacial  Agua destilada.41 PRACTICA N° 15 IDENTIFICACION DE MUCOPOLISACARIDURIA I. II. los cuales son excretados anormalmente en grandes cantidades en las mucopolisacaridosis (MPS). aorta. . en contacto con mucopolisacpáridos forma un complejo de color púrpura metacromático. III y IV. Negativo: aparición solamente de un color azul pálido. Los individuos con MPS secretan grandes cantidades de mucopolisacáridos. Dejar 3 min. IV. Si un resultado cualitativo para investigar mucopolisacáridos en orina ha sido positivo ¿Porqué debe ser confirmado y cuantificado por cromatografía o precipitación? ¿Cuál es la constitución química básica de los glicosaminoglicanos (mucopolisacáridos)? ¿Cuál es la constitución química básica de los proteoglicanos? Cite 5 ejemplos de éstos. Dejar por 20 min. Los mucopolisacáridos son sustancias de gran peso molecular que se encuentran en varios tejidos: Conectivo. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. llamados también MPS I. La finalidad del experimento es determinar cualitativamente en orina la excesiva excreción de mucopolisacáridos. 2. 20 ml.

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4.

¿Cuál es la importancia biológica del ácido hialurónico, condroitina y heparina?

III UNIDAD METABOLISMO DE LIPIDOS

REUNION DE LABORATORIO N° 08
PRACTICA N° 16
DEMOSTRACIÓN DE LA DIGESTION DE LAS GRASAS IN VITRO. ACCION EMULSIFICANTE DE LAS SALES BILIARES SOBRE LAS GRASAS. ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA SOBRE LOS TRIGLICÉRIDOS Y EFECTO DE LAS SALES BILIARES
I. INTRODUCCION: Los triglicéridos son los principales lípidos de la dieta. En el estómago ocurre la acción de la lipasa gástrica y la licuefacción de la masa de lípidos de los alimentos por contraccion peristálticas. La es principal digestión ocurre en el duodeno, tiene lugar en la interfase agua-lípido y su velocidad depende del área de superficie de la interfase, la cual es grandemente incrementada por el movimiento peristáltico del intestino combinado con la acción emulsificante de los ácidos biliares. Los ácidos biliares son moléculas anfipáticas sintetizados por el hígado a partir del colesterol y secretados como conjugados de glicina y taurina. La lipasa pancreática (Triacilglicerol lipasa) cataliza la hidrólisis de los triglicéridos en sus posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto con ácidos grasos. La actividad enzimática de la lipasa pancreática incrementa grandemente cuando contacta la interfase agua-líquido, un fenómeno conocido como activación interfacial. La unión a la interfase agua-líquido requiera la colipasa, una proteína de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con la lipasa pancreática (449 residuos), con cambios conformacionales que f rma una o superficie hidrofóbica y deja libre el centro activo. La alteración en la digestión o absorción de las grasas produce esteatorrea La finalidad de la práctica es demostrar la acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando su efecto con el agua y el cloroformo. Asimismo la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y el efecto de las sales biliares. II. REACTIVOS A UTILIZAR III. Cloroformo Aceite vegetal, de olivo Solución de sales biliares Buffer fosfato 0.1M pH 8,0 Emulsificación de aceite vegetal Solución de fenolftaleina (Solución alcohólica) Hidróxido de sodio (NaOH) 0.1N

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

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y

Acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas utilizando tubos de 15 x 125 mm. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Aceite de olivo(gotas) Agua destilada (ml) Cloroformo (ml) Sales Biliares (ml) Agitar enérgicamente los tubos Dejar en reposo y anotar los resultados para interpretarlos Acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y efecto de las sales biliares sobre la reacción enzimática utilizando tubos de 20 ± 25 x 150 mm. COMPONENTES (ml) TUBOS Emulsificación de aceite vegetal Buffer fosfato 0.1M pH 8.0 Solución de sales biliares 1 % Solución de extracto pancreático 1 % Agua destilada I 2 2 2 3 II 3 2 2 2 III 3 2 2 2 IV 3 2 2 2 Tubo 1 3 5 Tubo 2 3 3 2 Tubo 3 3 2 -

Mezclar los 4 tubos y llevar al baño maría a 37 °C , por 30 minutos, agitando de vez en cuando. Al finalizar el tiempo de incubación retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftaleína. Mezclar bien y luego realizar la titulación. TITULACION: Utilizando una pipeta graduada de 1 ml, dejar caer gota a gota NaOH 0,1N en el fondo de cada tubo del sistema, mezclar bien hasta la aparición de un color rosado tenue persistente. Anotar la cantidad de NaOH 0,1N gastados. Anotar los resultados para su interpretación. IV. CUESTIONARIO: 1. Explique lo que son sustancias anfipáticas. 2. Diferenciar emulsión de solución, acción de las sales biliares vs cloroformo. 3. ¿Cuántas clases de lipasa pancreática actuán en el intestino? 4. Cuál de los métodos para medir la actividad enzimática se ha empleado en esta práctica. Explique el papel de la fenolftaleína en la titulación. 5. Diferencie la absorción de los ácidos grasos según su tamaño.

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PRACTICA N° 17
DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS PRE Y POST PRANDIAL EN SUERO HUMANO
I. INTRODUCCION: Los lípidos de la dieta son principalmente triglicéridos. Son transportados junto a colesterol y fosfolípidos por los quilomicrones, formados en el enterocito. Los quilomicrones son las lipoproteínas más grandes, menos densas, ricas en triglicéridos, con la apoproteína apo B48. Por el conducto toráxico llegan a la circulación general. El pico máximo de lipemia postprandial se observa entre las 4 y 6 horas de la ingesta, y al cabo de 9 a 10 horas retorna a los valores basales de lípidos, especialmente de los triglicéridos. Los niveles de lípidos postprandiales, especialmente de los triglicéridos dependen de la cantidad de lípido de la dieta, de la digestión y absorción, de los niveles basales sanguíneos, de la acción de la lipasa lipoproteic en los tejidos extrahepáticos. La lipasa a lipoproteica actúa sobre los triglicéridos de los quilomicrones, liberando ácidos grasos que son captados por los tejidos extrahepáticos. Los quilomicrones son convertidos en remanentes de quilomicrones y captados por el hígado. Se ha considerado al incremento de la lipemia postprandial como un factor riesgo de aterogénesis. La finalidad de la práctica es demostra las variaciones de la concentración de trigliceridos en suero después de la ingesta de alimentos de alto contenido de grasas II. REACTIVOS A UTILIZAR - Reactivo enzimático para determinación de Triglicéridos ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Un alumno por cada mesa vendrá en ayunas de al menos 10 horas, a las 7 a.m. se les extraerá una muestra basal. Ingerirán una dieta rica en grasas conteniendo un vaso de leche, un huevo, 2 panes y 10 aceitunas. A las 4 y 7 horas de la ingesta, se obtendrá una segunda muestra. Se obtendrá el suero y se hará la determinación de triglicéridos. Armar el siguiente sistema. COMPONENTES BLANCO STANDARD DESCONOCIDO Muestra --------10 ul Standard ----10 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar e incubar 10 minutos de 20« 25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. Medir la absorbancia del Standard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A). Cálculos:

III.

C ! 200 v

(ADesconocid o ?mg / dl A (AStandar
1.71 mmol/l 2.28 mmol/l

C ! 2.28 v

(ADesconocido ?mmol / l A (AStandar

Valores Referenciales Sospechoso: sobre 150 mg/dl ó Elevado: sobre 200 mg/dl ó

3. Cuál es el efecto de la edad. 5.45 IV. CUESTIONARIO: 1. Destino de los productos de acción de la lipasa lipoproteica sobre los triglicéridos. el ejercicio y el género sobre la lipemia postprandial. Explique porqué el incremento de la lipemia postprandial es considerado un factor de riesgo coronario. Grafique los cambios de triglicéridos postprandiales en función del tiempo. . Alteración de la lipemia postprandial en diabetes y familiares de diabéticos. 2. 4.

Sulfato de amonio. de la beta oxidación y de la cetogénesis. Los cuerpos cetónicos son eliminados por la orina y la a etona también por la c respiración. Aumentan en sangre (cetonemia) y en orina (cetonuria) por condiciones fisiológicas como el ayuno prolongado. incluyendo el cerebro en el ayuno prolongado. .Disponer de dos tubos que contengan orina normal y orina patológica. Prueba de Legal El nitroprusiato de sodio diluido en presencia de cuerpos cetónicos.Cloruro Férrico. El diagnóstico y monitoreo de su tratamiento se hace con su determinación en sangre o/i orina. Dado que éstos son ácidos se produce acidosis metabólica. INTRODUCCION: La beta oxidación de los ácidos grasos en el hígado. DETERMINACION SEMICUANTITATIVA DE CUERPOS CETONICOS EN ORINA I. . III. solución al 5% en H2O. En condiciones patológicas como la Diabetes mellitus. a l denominada cetoacidosis diabética. REACTIVOS A UTILIZAR: . en toda hipercatabolia como la fiebre. Los dos primeros pasan a la sangre y son fuente de energía en los tejidos extrahepáticos como el corazón y el músculo esquelético. sin mezclar) 1ml _________________________________________________________________________ Anotar sus resultados.46 PRACTICA N° 18 IDENTIFICACIÓN DE LOS CUERPOS CETONICOS EN LA ORINA. de la siguiente manera: II. Prueba de Rothera y Trabajar del tubo identificado como orina patológica y Utilizar nitroprusiato en polvo. Procedimiento: Armar el siguiente sistema: COMPONENTES TUBO Orina 3 ml Cristales de sulfato de amonio 0. en la dieta pobre en carbohidratos. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento INVESTIGACION DE ACETONA . al superar la capacidad de oxidación de los tejidos extrahepáticos lleva a niveles aumentados de cuerpos cetónicos. Nitroprusiato de sodio 10% 3 gotas Amoníaco (agregar lentamente por las paredes del tubo. Su concentración normal en orina es de 125 mg/ 24 horas. en la enfermedad de Von Gierke y otras glucogenosis. En la Diabetes mellitus. especialmente de acetona. el hiperinsulinismo. hipertiroidismo. solución al 10% en H2O . produce acetil CoA que ingresa al Ciclo de Krebs y en parte se utiliza en la síntesis de cuerpos cetónicos (cetogénesis). en el síndrome de Fanconi. rinde un color azul violeta. el ácido beta hidroxibutírico y la acetona. el aumento de la lipólisis. Estos son el ácido acetoacético. cristales.5 g Mezclar hasta disolver los cristales de Sulfato de Amonio. a nivel mitocondrial. y en sangre hasta 1mg/dl. en los vómitos.Nitroprusiato de sodio.

Diluir la orina al 1/10. Realice una comparación entre la síntesis de cuerpos cetónicos con la etapa inicial de la síntesis de colesterol Defina: cetonemia. INVESTIGACIÓN DE ACIDO ACETOACETICO . 15. Compare los métodos para determinar los cuerpos cetónicos. Esperar 20 segundos. 150 mg/dl.1 cc 0. 4. cetonuria. solución 5% en agua TUBO 5 ml gota a gota hasta la aparición del Color rojo burdeos si existe ácido Acetoacético IV.9 cc + + + + + ORINA 0. 2.2 g de reactivo sólido de nitroprusiato de sodio en cada una de éstas. Cuál es la importancia de la cuantificación de los cuerpos cetónicos en el monitoreo de la cetoacidosis. de la siguiente manera: AGUA 0. para calcular la concentración en orina diluida. Sumergir la tira en el frasco conteniendo la orina.1 cc 0. 1/20. Cuál es el mecanismo fisiopatológico de la cetoacidosis en un paciente que llega al hospital por alcoholismo agudo . Este método con sus dos variantes es posible aplicarlo al suero sanguíneo. para investigar acetona y tener una cifra aproximada en su cuantía. 50. Prueba de Cloruro Férrico o de Gerhart. Observar la máxima dilución de la orina en el que aparece color azul violeta y multiplicar por el denominador de la dilución alcanzada por 10 y se tendrá la cantidad aproximada de acetona en mg por 100ml. en cada una de las excavaciones que contiene el reactivo.1 cc 0. leer en escala colorimétrico.9 cc 3. el ácido acetoacético rinde una coloración rojo burdeos.9 cc 2. 1/30. 3.Armar dos sistemas que contengan orina normal y patológica. Procedimiento (Se utiliza orina filtrada): COMPONENTES Orina filtrada Cloruro Férrico.1 cc DILUCION 1/10 1/20 1/30 1/40 1/50   Agregar una gota de cada una de las diluciones.1 cc 0.47   En una lámina de porcelana con excavaciones colocar 0. etc.9 cc 4. 5. estimando la concentración como negativo 5.9 cc 1. CUESTIONARIO: 1. Uso de tira reactiva. se debe multiplicar por 10 el número de veces que se ha diluido ésta. cetoacidosis y de ejemplos de cada uno de ellos. Esto es debido a que el nitroprusiato de sodio en polvo da reacción positiva solo cuando en la orina sin diluir alcanza la concentración mínima de 10 mg% de acetona y por eso. Se basa en que en presencia de cloruro férrico.

En el colesterol se considera 3 niveles: Deseable < 200 mg/dl. Son hipertrigliceridemias primarias. Es transportado principalmente por la LDL que es considerada aterogénica.Reactivo precipitante de HDL: ácido fosfotungstico. En la presente práctica. cirrosis biliar. su incremento también es considerado factor de riesgo coronario. II. 3 niveles: Bajo o de riesgo < 40. La hipertrigliceridemia puede deberse a causa primarias o familiares. A partir de él se forman los ácidos biliares y las hormonas esteroideas. Entre las hipercolesterolemias primarias se señalan: La hipercolesterolemia familiar. INTRODUCCION: El colesterol es un componente importante de las biomembranas.Reactivo Standard para colesterol 50 mg/dl. la disbetalipoproteinemia. REACTIVOS A UTILIZAR: . La HDL realiza el transporte reverso del colesterol.Precipitante para macro ensayos (PRECa) . incubar 10 minutos de 20«25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. alto o protector mayor o igual a 60. el alcoholismo. la hipertrigliceridemia familiar.48 REUNION DE LABORATORIO N° 09 PRACTICA N° 19 DETERMINACION DE PERFIL LIPIDICO I. . resistencia a la insulina. la hiperlipidemia familiar combinada la hiperkilomicronemia. Los triglicéridos an ayunas circulan unidas a las VLDL y son fuente de energía para los tejidos.Precipitante para semimicro ensayos (PRECb) ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN DE COLESTEROL SANGUÍNEO Armar el siguiente sistema: COMPONENTE BLANCO PROBLEMA ESTÁNDAR Suero ----10 ul ----Estándar 200 mg/dl --------10 ul Reactivo enzimático 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar. previa precipitación de las otras lipoproteínas. . hiperglicemia e hipertensión. el síndrome nefrótico. La hipertrigliceridemia se asocia a disminución de HDL.El III Panel de Expertos ha establecido los valores de referencia para el colesterol. normal a 40 a 59. limítrofe alto 200-239 y alto definitivo > 240 (Hipercolesterolemia > 200 mg/dl). y el resto en la VLDL y HDL. el hipotiroidismo. el uso de anticonceptivos orales. la hiperlipidemia familiar combinada. El LDL colesterol. clorhidrato de magnesio. ictericia obstructiva. El HDL colesterol. en el denominado síndrome metabólico. 5 niveles: Óptimo < 100 mg/dl. limítrofe de 150 a 199. y el LDL. Hipertrigliceridemia moderada de 200 a 499. obesidad central. En los triglicéridos se considera: normal menos de 150mg/dl. la gota. Medir la absorbancia del Starndard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A) III. el lipoteroidismo. por el método enzimático y la determinación de HDL.. regulando su fluidez. el HDL. la hipercolesterolemia poligénica. severa 500 o más La hipercolesterolemia puede deberse a causas primarias o secundarias. de los tejidos hacia el hígado y es considerada antiaterogénica . Son causas secundarias: la diabetes. se realizará la determinación de colesterol sanguíneo. etc. Entre las secundarias: La diabetes. o secundarias a otras enfermedades. .

17 v ¢ ¢ muestra standard ?mmol/l A ¤ ¤ £ . alternativamente por 10 minutos a 4000 RPM Después de centrifugar separar el sobrenadante del precipitado y determinar la concentración de colesterol: Componente Blanco Standard Desconocido Agua Destilada 100 ul --------Standard ----100 ul ----HDL sobrenadante --------100 ul Reactivo de trabajo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar. comparando con el blanco. Leer las absorbancias del desconocido y del Standard. CALCULOS: Concentración HDL-Colesterol: Macro método : ¤ C ! 150 v A Desconocid o A Standard mg/dl Semi  micro método : ¤ C ! 175 v A Desconocid o A Standard mg/dl TG 5 Concentración de LDL-Colesterol: VALORES DE REFERENCIA: HDL-Colesterol: Hombres LDL  C ! TC  HDL  C  ?mg/dlA Mujeres (mg/dl) ¢ standard £ ¢ ! 200 v muestra ?mg/dl A ó ! 5.7 mmol/l Componente Macro Semi-micro Suero 500 ul 200 ul PRECa 1000 ul ----PRECb ----500 ul Mezclar bien. Centrifugar for 2 minutos a 10000 RPM. incubar por 10 minutos a temperatura ambiente. respectivamente.49 CALCULOS VALORES REFERENCIALES: Sospechoso: sobre 220 mg/dl Elevado: sobre 260 mg/dl DETERMINACIÓN DE HDL -COLESTEROL: Armar el siguiente sistema: ó 5. incubar por 5 minutos a 37 ºC o 10 minutos a 20«25 ºC.7 mmol/l ó 6. dentro de 60 minutos ( A).

Realice una breve explicación del rol de la LDL en la aterogénesis. 8. . 3. Señale la importancia fisiológica del colesterol. 6. 4.50 Normal > 55 Bajo riesgo 35-55 Riesgo elevado < 35 LDL-Colesterol: Sospechoso: Elevado: IV. Cuál es la importancia de la hipertrigliceridemia en la aterogenesis. Cualés son las causas primarias de hipertrigliceridemia. CUESTIONARIO: > 65 45-65 < 45 150 mg/dl 190 mg/dl 1. Alteraciones del perfil lipídico en la diabetes y en el hipotiroidismo. 2. Señale las principales causas de HDL disminuido. 7. Señale la importancia clínica del colesterol. Realice una breve descripción de hipercolesterolemia familiar y su relación con la cardiopatía isquémica. 5.

Y secundarias a otras patologías como la diabetes. la hiperlipidemia familiar combinada. HDL. o Las diez restantes conformaran el grupo experimental. Las hiperlipidemias pueden ser primarias o familiares como la hipercolesterolemia familiar. aumento de las grasas monoinsaturadas y polinsaturadas. Se determinará el perfil lipídico antes y después del tratamiento y se compararan los resultados. las que recibiran adicionalmente 2 cc de aceite preparado de sebo de pollo.  Set de determinación de colesterol enzimático. hipotiroidismo. Con la ayuda del personal de la sección. Una dieta rica en grasas saturadas aumenta el riesgo de hiperlipidemia y consiguiente mayor riesgo coronario. LDL y triglicéridos entre ambas ratas. o Diez de ellas constituirán el grupo control y seguiran su dieta habitual agua y alimentos (maíz) ad libitum. cada mesa obtendrá de cada rata control y experimental una muestra sanguínea de la cola antes del tratamiento y otra al final. Se extraera el suero y a cada una se determinara el perfil lipídico siguiendo el método enzimático empleado en la práctica anterior. Extracción de las muestras.  Sebo de pollo.  Dieta standard para ratas a base de maíz. como parte del cambio de estilo de vida junto al ejercicio y control de peso. Las cuales se dividirán en dos grupos en forma aleatoria. INTRODUCCION: El aumento de los lípidos sanguíneos o hiperlipidemia constituye una situación metabólica de riesgo. En el presente experimento. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procemiento  Tratamiento experimental.  Set de determinación de triglicéridos enzimático. 1-2 representantes de cada mesa se encargarán del control de la dieta. se busca mostrar como la ingesta de una dieta rica en grasa saturada con sebo de pollo por 3 semanas. puede producir el incremento de los lípidos sanguíneos. sidrome nefrotico. ha establecido los criterios para una dieta adecuada que incluye disminución de la ingesta de colesterol. La ATP III. La dieta es importante en el control de la hiperlipidemia. disminución de las grasas saturadas. II. Se dispondran de 20 ratas albinas adultas. etc.51 PRACTICA N° 20 HIPERLIPEMIA EXPERIMENTAL I. Se considera aterogénicos el aumento del colesterol y de los tigliceridos. El tratamiento será por 21 días.  Reactivo precipitante para HDL. Se compararán los valores de colesterol. bajo la supervisión del personal de la sección. III. REACTIVOS A UTILIZAR:  Ratas de peso aproximado de 200gr.    . la hipertrigliceridemia familiar etc. especialmente coronario.

Qué alimentos son ricos en colesterol. Qué alimentos son fuentes de omega 3.52 IV. 5. Señale en detalle la dieta recomendada por la ATP III. para el tratamiento de la hiperlipidemia. 3. Qué alimentos son ricos en grasas monoinsaturadas. 2. 7. 6. Qué alimentos son fuentes de fibra. 4. CUESTIONARIO: 1. Qué alimentos son ricos en grasas saturadas. . Qué alimentos son ricos en grasas polinsaturadas.

Buffer fosfato 0. c) de origen intestinal: aminopeptidasas.1 M pH 8.53 IV UNIDAD PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS: INTEGRACION DEL METABOLISMO REUNION DE LABORATORIO N° 10 PRACTICA N° 21 DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA I. alanina y serina. b) de origen pancreático: tripsina. La falta de enzimas proteolíticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las heces. o degradación hasta aminoácidos en el tubo digestivo. La quimotripsina es específica para los enlaces peptidicos de los aminoácidos sin carga como los aromáticos: tirosina. . como la glicina.Caseína al 1% en buffer fosfato 0. . En el lactante con ausencia congénita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de activación de quimotripsinógeno y procarboxipeptidasa. . ataca a los residuos pequeños. La presente práctica tiene como finalidad demostrar la acción hidrolítica de las enzimas digestivas contenidas en el páncreas sobre la caseína o proteína de la leche.Solución acuosa de ninhidrina al 0. es un proceso complicado que se realiza con el concurso de diversas enzimas proteolíticas Entre estas enzimas proteoliticas tenemos: a) de origen gástrico: pepsina y renina. existe hipoproteinemia. dipeptidasas. REACTIVOS A UTILIZAR: . y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados en las heces).Acido tricloroacético al 10%. Son exopeptidasas: carboxipeptidasa y aminopeptidasa. elastasa y carboxipeptidasa. La tripsina. La elastasa tiene una especificidad amplia. quimotripsina.25% saturada con butanol. INTRODUCCION: La digestión de las proteínas. quimotripsina. triptofano y fenilalanina. Son endopeptidasas: pepsina. elastasas. tripsina. y es específica de los enlaces peptidicos sobre el lado carboxílico de residuos de aminoácidos básicos: lisina y arginina solamente. con retardo marcado del crecimiento. determinado los productos (aminoácidos) con ninhidrina II. La carboxipeptidasa hidroliza el enlace peptídico carboxiterminal en las cadenas polipeptidicas. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) I II III III. que provienen de la carne de los alimentos). es activada por la enterocinasa en el intestino. . .1 M pH 8.Solución de extracto pancreático.

de cada uno de los tubos y trasladarlo a otro sistema numerado (I. 3. agregar 1 ml de solución de ninhidrina.1 M pH 8. durante 3 a 5 minutos. Luego a los tubos de incubación del primer sistema. II. . Después del tiempo de incubado tomar 0. III). En este nuevo sistema. 4. Observe las variaciones que se produce en cada tubo. agregue gota a gota 1 ml de ácido tricloroacético al 10% agitando continuamente. Interprete todos los resultados encontrados en la práctica y explíquelos usando algunos dibujos. Observa los cambios de color de cada tubo. Elabore un esquema con la digestión y absorción de proteínas y aminoácidos. Mezclar y llevar a un baño de agua hirviendo (franca ebullición). IV.5 ml. Explique el sitio de producción y la acción de las hormonas que intervienen en el proceso de digestión y absorción de los aminoácidos.54 Caseína al 1% Buffer fosfato 0. Escriba dos esquemas mostrando dos ejemplos de transaminación y dos de desaminación con los nombres de aminoácidos y alfa cetoácidos que participan.0 Solución de extracto pancreático Agua destilada Pasos: * * * * * * * 1 1 1 --- 1 1 --1 --1 1 1 Mezclar y colocar al baño de agua a 37 ºC por 30 minutos. CUESTIONARIO: 1. 2.

efecto que desaparece cuando la soya es hervida. con mayor rapidez que las originales desdoblándose en polipéptidos de peso variable y algunos aminoácidos.5 0. Algunos alimentos en estado natural poseen componentes perjudiciales para la nutrición. la alfa-1 antitripsina fecal (1-AT-Fecal) que es una glicoproteína. .2 IV 2. Mezclar y centrifugar a 2500 rpm por 10 min. c.Proteína de soya hervida 30%. Es interesante también que el aceite de semilla de algodón posea un pigmento.Proteína de soya cruda 30%.5 0. el gisipol. .5 - . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.5 III 2.Los extractos de páncreas poseen también un péptido inhibidor de la tripsina.Solución de ninhidrina 0.5 0. . I 2. . ello explica en parte que el valor nutritivo del frijol de Soja aumenta considerablemente si se coce a ebullición por varios minutos. REACTIVOS A UTILIZAR. Después del tiempo de incubación: agregar a cada uno de los tubos 2 ml de etanol absoluto. La finalidad del siguiente experimento es demostrar el efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre el efecto proteolítico de la tripsina. Por ejemplo el frijol de soja contiene un principio cuya actividad antitripsina dificulta la digestión de las proteínas.25% saturada con butanol.5 0.Etanol absoluto III. II.55 PRACTICA N° 22 INHIBICION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS: ACCION DE LA SOYA HERVIDA Y CRUDA SOBRE EL EFECTO PROTEOLITICO DE LA TRIPSINA I.5 0. secretada a la luz intestinal. .1 M pH 8.2 II 2.0 Proteína de soja cruda 30% Proteína de soja hervida 30% Solución de tripsina 20 mg% Pasos: a.0.Buffer fosfato 0. Incubar en baño maría a 37°C durante 1 hora. con actividad antioxidante y antitripsina que disminuye el apetito y dificulta la digestión de las proteínas. .1 M pH 8. Digiere las proteínas desnaturalizadas y parcialemente digeridas. INTRODUCCION: La tripsina actúa como una endopeptidasa e hidroliza prácticamente toda clase de proteínas.5 0.Solución de tripsina 20 mg%. Esta sustancia de naturaleza peptídica es inactivada por el calor. b. El ovomucoide de la clara de huevo inhibe también de manera enérgica la tripsina.

En otra serie de tubos numerados I . IV colocar 1 ml de sobrenadante de los tubos respectivos del paso anterior y agregar 1 ml de ninhidrina 0.25%. Anotar los resultados. CUESTIONARIO: 1. f. 3. ¿Qué es el gisipol y cómo actúa en su acción antioxidante? Con dibujos represente la práctica realizada.56 d. IV. 4. e. Explique con sus propias palabras cuál cree que es el objetivo de la práctica que realizó. Por qué razón el ovomucoide de la clara del huevo inhibe la acción de la tripsina. III. II. Someter los tubos a temperatura de ebullición del agua utilizando baño maría durante 5 minutos. . 2.

Las cifras de proteínas plasmáticas totales pueden aumentar (hiperproteinemia) con cociente A/G normal en la hemoconcentración. inmunodifusión o inmunoelectroforesis. etc.8 g/dl y globulinas: 2. transporte. globulina y fibrinógeno. excreción. con inversión de A/G por aumento de las globulinas: en el mieloma múltiple. cuya intensidad es provisional a la concentración de proteínas totales en la muestra.5 a 4. en la gastroenteropatía exudativa con pérdidas fecales de proteínas. haptoglobina.6 a 3. en presencia de un exceso de colorante. la transferrina. regulación del equilibrio hídrico.9 g/dl de las cuales albúmina: 3. La presente práctica tiene por finalidad determinar las concentraciones séricas de proteínas totales y fraccionadas en personas normales y/o con procesos patológicos. ceruloplasmina.Las fracciones globulínicas contienen varias proteínas específicas: inmunoglobulinas. conservación del equilibrio ácido básico. El aumento de absorbancia a 625 nm. respecto del Blanco del reactivo. disminución de la formación en el hígado como en la cirrosis. regulación del metabolismo. en el kala-azar. INTRODUCCION: Las proteínas plasmáticas son importantes para el organismo porque realizan diversas funciones: coagulación. insuficiente ingestión de proteína. por el método colorimétrico. etc.1 a 7. para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540nm.57 REUNION DE LABORATORIO N° 11 PRACTICA N° 23 CUANTIFICACION DE PROTEINAS SERICAS TOTALES Y FRACCIONADAS I. que se pueden determinar por electroforesis. REACTIVOS A UTILIZAR. FUNDAMENTOS DEL METODO Determinación de Proteínas Totales: Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico. defensa contra las infecciones.8. II. Determinación de Albúmina: La albúmina reacciona específicamente sin separación previa con la forma aniónica de la bromo Cresolsulfon Ftaleina (BCF). etc. El origen de las proteínas plasmáticas es hepático con excepción de las globulinas gamma que se forman en las células plasmáticas. es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra. en la macroglobulinemia de Waldenström. La disminución de proteínas totales (hipoproteinemia) son generalmente asociadas con HIPOALBUMINEMIA que a su vez están acompañadas con pequeños cambios en las globulinas. en medio tamponado a pH3. Las proteínas plasmáticas por métodos químicos se clasifican en albúmina. La concentración sérica de las proteínas totales es de 6.. Reactivo EDTA/Cu Reactivo BCF . Los bajos niveles de albúmina pueden ser debidos a: incrementadas pérdidas de albúmina en la orina. en medio alcalino. Agammaglobulinemia y la analbuminemia son cuadros demasiado raros. En el suero solo albúmina y globulina . en las colagenopatías.1 g/dl.

01 ----1. 1 ml.(g/dl) Relación A/ ! ¥ VALORES DE REFERENCIA: Albúmina = 3. Leer las absorbancias a 540 nm. Mantener los tubos entre 15 y 28 ºC durante 10 minutos.0 Mezclar e incubar 10 minutos a 37rC. CALCULOS: FACTOR ! Concentrac ión Standard Absorbancia Standard  Proteina Total (g/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: 6.0 a 8. PROCEDIMIENTO: En tres tubos de fotocolorímetro marcados B(Blanco).0 Desconocido 0.(g/dl) Albúmina (g/dl) ! D v f f! S Albúmina(g/dl) PT. Mezclar con varilla. Leer en espectrofotómetro a 625 nm o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo CALCULOS DE LOS RESULTADOS : Alb. colocar: Componentes Muestra (ml) Standard (ml) Reactivo (ml) Blanco --------1. S (Standard) y D (Desconocido). llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo.5 ± 4. colocar: B S D Suero Patrón 10 ul Muestra 10 ul.58 III.2 ± 2. 1 ml.0 Standard ----0. S (Standard) y D (Desconocido). ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Determinación de Proteínas Totales PROCEDIMIENTO: En tres tubos marcados B (Blanco).0 g/dl Determinación de Albúmina. (g/dl).Alb. ó 20 minutos a temperatura ambiente. El color resultante es estable por lo menos 30 minutos.2 . Reactivo BCF 1ml.01 1.8 g/dl Relación A/G = 1.

2. . 3. ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de las proteínas séricas totales y las fracciones albúmina y globulinas? ¿Qué importancia tiene determinar la relación albúmina/ globulina. 4. CUESTIONARIO: 1. 5. en clínica? ¿En qué se basa la determinación de las proteínas totales y fraccionadas en nuestro experimento? Elabore un esquema sobre el proceso fisiopatológico de un edema.59 IV. Cuáles son las principales características de las proteínas plasmáticas.

escapan en el filtrado de forma que los túbulos son incapaces de captar la gran cantidad de proteínas y resulta una masiva proteinuria. INTRODUCCION: La orina normal contiene una pequeña cantidad de proteínas solubles (albúminas. glomerulonefritis focales proliferativas.60 PRACTICA Nº 24 DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE PROTEINAS EN ORINA I. El fibrinógeno es una molécula muy larga y escapa solo en enfermedad renal severa. luego las globulinas. Extrarrenal: proteinuria ortostática. se ha hace más intensa o se forma un precipitado. febril. Si la turbidez persiste. 12. la cantidad es pequeña alcanzando máximo de 150 mg en orina de 24 horas. aparece la proteína de Bence Jones. La proteína de Bence Jones está constituída por las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas que constituye la proteína monoclonal. Acido acético al 2%. moléculas proteicas de variado tamaño incluyendo las más largas. mieloma múltiple.).0 Someter a ebullición por 1 minuto. se trata de fosfatos que se han disuelto en medio ácido. nefropatía tóxica. Standard de proteína: Pueden usarse suero claro normal de concentración conocido o un suero control adquirido comercialmente. síndrome nefrótico. por ejemplo la proteína de Bence Jones. Las proteínas son casi completamente absorbidas en los túbulos. II. Si aparece un precipitado o enturbamiento se puede deber a la presencia de proteínas o fosfatos.85%.85% a una concentración final de 25 mg/ml. tuberculosis renal. La presente práctica tiene por finalidad determinar la presencia de proteínas en la orina y de cuantificarlas en caso que estén presentes en casos normales y en estados patológicos. menos de 10 mg/dl. La proteinuria fisiológica (proteinuria ortóstatica) se presenta después de ejercicios y de permanecer largo tiempo en posición de pie. Son causas de proteinuria Renal: glomerulonefritis difusa. En el mieloma múltiple y macroglubinemia de Waldestrom. algunas enzimas. gravídica. REACTIVOS A UTILIZAR. III. sin que exista evidencia de lesión renal. COMPONENTE (ml) TUBO Muestra de Orina 5.5% (en agua destilada) Cloruro de sodio 0. en la eclampsia. Se diluye con cloruro de sodio 0. riñón poliquístico etc. hemoglobina. La proteinuria puede ser renal o extrarrenal. etc. Acido tricloroacético. nefropatía lúpica. nefropatía diabética. se trata de proteínas. albúmina. Las proteínas de peso molecular relativamente bajo y de pequeño tamaño pasan primero a través de los glomérulos injuriados. Añadir: Solución de ácido acético al 2% IV gotas Si desaparece la turbidez. Cuando el glomérulo es dañado por alguna enfermedad. Esta dilución debe ser preparada el mismo día. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LAS PROTEÍNAS EN ORI NA: Coagulación por el calor. .

y leer en fotocolorímetro con filtro (420 um). ¿Cómo diferencia usted un precipitado en un tubo de ensayo que no c orresponde a proteínas en orina? Señale algunos tipos de proteínas anormales que pueden ser encontradas en la orina.61 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS EN LA ORINA : Método turbidimétrico de Heavy.0 III 4. 4. 3. CALCULO: Desde que 4 ml de orina se trata igual que un standard de 4 ml conteniendo 25 mg/100 ml entonces: Calcular de la siguiente manera: Absorbancia problema ± Absorbancia blanco x 25 = mg/100 ml.= proteína total de orina de 24 H en mg. mg/100 ml orina x 100 IV. NOTA: Antes de leer los tubos deben ser mezclados totalmente evitando que burbujas de aire puedan interferir con la lectura. En qué consiste el método de Heavy para la determinación de proteínas ¿Cuál es el mecanismo por el cual un paciente con glomeruloesclerosis elimina mucha proteína por la orina? Señale algunas causas de proteinuria fisiológica y patológica. 2.0 4. 5. orina Absorbancia del standard Volumen total en ml orina -----------------------------------. . En tres tubos marcados previamente agregar: COMPONENTES (ml) /TUBOS Solución standard de proteína Orina previamente filtrada Agua destilada Acido tricloroacético 12.0 Dejar reposar 5 a 10 min.0 1.0 II 1.5% I 4. CUESTIONARIO: 1. Leer el standard (I) calibrando con agua destilada y luego a la lectura del problema (II) restar el blanco de la orina (III).0 1.

relativamente en bajas concentraciones pero en los tejidos están presentes en grandes cantidades. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Reactivo reconstituido (ml) 1. particularmente en el hígado y corazón. Con la aspartato transaminasa. CALCULOS: Actividad ALAT (UI/l) = A/min x 1768 Nota: de las absorbancias.5  a-cetoglutarato  L-alanina  LDH  NADH III. VALORES DE REFERENCIA: Hasta 29 U/l a 30 ºC Hasta 45 U/l a 37 ºC . Las transaminasas están normalmente presentes en la sangre. se mide colorimétricamente por reacción con dinitrofenil hidrazina en medio alcalino. En la presente práctica la glutámico pirúvico transaminasa (GPT) es determinada agregando suero a una solución bufferada conteniendo ácido alfa cetoglutarato y L-alanina y el ácido pirúvico formado. producto resultante después de la incubación.1 Mezclar y transferir a la cubeta del espectrofotómetro. Incubar 60 segundos a la temperatura de reacción. estas enzimas son liberadas dentro de la corriente sanguínea y pueden elevar sus niveles..Piruvato + L .0 Volumen de muestra (ml) 0. REACTIVOS A UTILIZAR. en la hepatitis o en el infarto de miocardio. II. hasta por tres minutos.62 PRACTICA N° 25 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ALANINA AMINOTRANSFERASA SERICA (ALT) o TRANSAMINASA GLUTAMICO PIRUVICA (SGTP) I. Repetir las lecturas a intervalos de 60 segundos. sacar diferencias y determinar una media que luego se multiplica por el factor determinado. estas enzimas proveen un medio de interconversión de proteínas e intermediarios metabólicos de los carbohidratos y hacen disponibles las reservas proteicas almacenadas en el hígado al ciclo del ácido cítrico. INTRODUCCION: La transaminasa glutámica pirúvica. Cuando se produce destrucción tisular de estos órganos como sucede por ejemplo. llamada también alanina aminotransferasa cataliza la reacción L-alanina + alfa-cetoglutarato . Leer la absorbancia inicial (A1) a 340 nm.glutamato. Reactivo para SGTP:  Buffer TRIS pH 7..

TGO-S algunas veces separadas y otras veces juntas. ¿Cuáles serían las razones para solicitar. ¿Cuál es la importancia metabólica de la transaminasa glutámico pirúvico? 3. Haga un esquema de una transaminación. 6. colocando los nombres de las moléculas que participan. ¿Cuál es la ubicación intercelular de las TGP y TGO? 5. Cuál es la utilidad práctica de la utilización del dosaje de transaminasas. . en el diagnóstico diferencial clínico? 4. CUESTIONARIO: 1. Diga usted en que consiste el mecanismo de transaminación. 2.63 IV.

0 0. Las enzimas con actividad en el suero sanguíneo (las que intervienen en la coagulación. En la clínica son importantes dos transaminasas. Leer a 505 nm.45 0. las dos suben nuevamente. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) : 1) CURVA DE CALIBRACIÓN: Antes de usar los reactivos por primera vez. El ascenso es. Agregar 5 ml de NaOH 0.05 0. a veces proporciona datos positivos en casos con datos electrocardiográficos de difícil interpretación. cuando sobreviene la mejoría clínica.1 0. si aparece una recaída. preparar una curva de calibración para AST.4 Reactivo de color: 2-4 dinitrofenilhidrazina Standard: Buffer piruvato pH 7. como es el caso de: Las enzimas del tubo digestivo. salen de las células y funcionan fuera de ellas.25 AST 0 22 55 96 150 212 Agregar 0. El tejido miocárdico es muy rico en TGO y el ascenso de esta enzima acompaña a los procesos destructivos del corazón. REACTIVOS A UTILIZAR Sustrato AST: Buffer de DL-aspartato y -cetoglutarato pH 7.4N III.1 Sustrato AST (ml) 0. La finalidad del presente trabajo experimental. descienden en forma paralela y. éstas.1 0. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. por ejemplo) y las enzimas de escape. El color es estable sólo por 30 minutos. INTRODUCCION: En condiciones normales. una vez sintetizadas.35 0. En las lesiones o hepáticas aumentan ambas transaminasas en el suero.30 0.1 0.40 0.1 0.50 0. Armar el siguiente sistema: Tubo 1 2 3 4 5 6 Agua Destilada (ml) 0. la glutámico pirúvica (TGP) y la glutámico oxalacética (TGO) o aspartato aminotransferasa (AST).15 0.4N (NaOH 0. sobre todo en la cogestión hepática. .4N diluido con agua destilada 1:10) Mezclar y reposar por 15 minutos a temperatura ambiente antes de leer. proporcional a la extensión del infarto.5 ml de reactivo de color. Otras enzimas. sube al máximo entre las 12 y 48 horas y suele volver a lo normal a los 4 ó 7 días. las enzimas se sintetizan en las células y en la mayoría de los casos ejercen su función en su interior. II.64 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST) I.10 0. pero tiene el inconveniente de elevarse en diversos cuadros. es la determinación por método colorimétrico de una de estas transaminasas de importancia clínica como es la aspartato aminotransferasa.25 Standard 0. presentes en cantidades muy bajas en el suero aun cuando en ciertas enfermedades suben considerablemente.20 0.1 0. aunque se hallan en todos los tejidos se relacionan preferentemente con los procesos de ³escape´ de enzimas del mi cardio o el hígado. en general.4 NaOH 0.

¿Cuál es la utilidad y el comportamiento en sus concentraciones de la AST en casos de infarto agudo de miocardio? Interprete y explique todo lo actuado en la práctica. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente.Incubar a 37 ºC durante 5 minutos. agregar 0. .Agregar 5 ml de Na OH 0.Colocar 0. . IV.Al cumplirse los 60 minutos.5 ml de sustrato AST en cada tubo. . 3. según instrucciones previas. Haga un resumen de seis líneas sobre AST. 2. .4 N Mezclar y dejar reposar por 15 minutos antes de la lectura. .Incubar a 37 ºC durante 60 minutos.Agregar 0. CUESTIONARIO: 1.5 ml de reactivo de color. exactamente.65 Construir en papel semilogarítmico los valores de transmitancia en el eje vertical y en el eje horizontal las U/ml de AST 2) PROCEDIMIENTO DE LA MUESTRA (disponer de un tubo de ensayo): .Obtener el valor de U/ml de AST a partir de la curva de AST de calibración.1 ml de suero. . . Inmediatamente empezar el control de tiempo.

por diferentes causas. una causa pueden ser las hemoglobinopatías por defecto en la síntesis de una de las cadenas (talasemias) o de cambios en la estructura de una de las subunidades por mutaciones que cambian un aminoácido por otro como en la hemoglobina S. El defecto enzimático en algunas de las etapas de síntesis del grupo Hemo. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración de hemoglobina en sangre de personas normales. tetramérica. produce disminución de su concentración dando lugar a la anemia por menor producción como en la anemia ferropénica. Standard de Hemoglobina. que termina con la adición del hierro por la ferroquelatasa. agregar: hemogloWiener Standard 20 ul DESCONOCIDO 5 ml ----Armar el siguient e sistema: III.66 REUNION DE LABORATORIO N° 12 PRACTICA N° 26 CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA I. Buffer/Ferricianuro: comprimidos estabilizados de ferricianuro de potasio y buffer de fosfatos. La disminución de la síntesis de hemoglobina. da lugar a las diferentes tipos de porfirias. cuya función es el transporte de oxígeno. Pero la hemoglobina puede también disminuír por pérdida de sangre como en las hemorragias o por hemólisis (anemias hemolíticas). . REACTIVO MATERIAL Y EQUIPOS Tensioactivo/CNX: ampollas autorrompibles conteniendo solución estabilizada de tensioactivo/CNX. de modo que en mujeres se considera si esta es menor de 12 g/dl y en varones. que es sin duda uno de los exámenes más solicitados. en niños existe variación con la edad. utilizando el método enzimático de determinación de hemoglobina. que también puede deberse a problemas en la maduración de los glóbulos rojos como la deficiencia de ácido fólico. En la práctica médica es por ello importante determinar la concentración de la hemoglobina. menor de 13 g/dl. La concentración normal es de 12 a 14 g/dl en mujeres y de 14 a 16 g/dl en varones en nuestro medio y a nivel del mar. INTRODUCCION: La hemoglobina es una hemoproteína. Hemoglowiener reactivo Tubos de vidrio Lancetas Pipetas ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: COMPONENTES STANDARD hemogloWiener Reactivo 5 ml Con pipeta limpia y seca. con dos subunidades alfa y dos beta. En este último grupo. que puede tener también otras causas como la Policitemia Vera La OMS basa su definición de anemia en la concentración de hemoglobina. II. Se sintetiza en la médula ósea por una vía común a la síntesis de porfirinas. En la hipoxia por altura por otro lado se produce aumento de su síntesis llevando a la policitemia.

67 Muestra (sangre total) ----20 ul Medir primero el Standard y luego usar la misma micropipeta. Haga un esquema con la estructura de la hemoglobina.0 ± 18. enjuagando tres veces en el propio reactivo antes de agregar cada muestra. Cuál es la más frecuente y cuántos tipos de anemia conoce. 3. llevando el aparato a cero con Reactivo CALCULO DE RESULTADOS: Hemoglobin a (g/dl) ! D v factor factor ! Standard (g/l) S VALORES DE REFERENCIA: .Hombres: 13.Mujeres: 11. Interprete y explique el procedimiento de la práctica. CUESTIONARIO: 1. indicando sus aminoácidos importantes en cada polipéptido. el número de ellos y las interacciones del ión Fe++ dentro del grupo hemo. Qué es la anemia. . Mezclar y luego de 3 minutos leer en espectrofotómetro a 540 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520 -550). 4. Una anemia importante es la anemia de células falciformes: Haga un resumen de las causas de su etiología y su patogenía.0 g/dl .0 g/dl IV. 2.0 ± 16.

llevando el aparato a cero con agua destilada. leer en espectrofotómetro a 530 nm o fotocolorímtero con filtro verde (520-550 nm). Luego de 5 minutos. Total Muestra (suero) 200 ul 200 ul 200 ul Agua destilada 2. y el origen de esta alteración obedece a causas de origen pre hepático.Desarrollador o solvente . La hiperbilirrubinemia puede ser a predominio de la bilirrubina no conjugada como en las anemias hemolíticas o en los defectos congénitos de conjugación. La manifestación clínica más importante de las hiperbilirrubinemias es la ictericia. hepático y post hepático. al cabo de la cual son destruidos en el sistema retículo endotelial. Cada gramo de hemoglobina degradada origina 35 mg de bilirrubina. denominada bilirrubina directa o conjugada. después de un proceso de captación y conjugación con dos moléculas de ácido glucurónico por la enzima bilirrubina glucuronil transferasa. INTRODUCCION: Los hematíes tienen una vida media de 120 días. se convierte en una forma soluble. que utiliza el diazorreactivo de Erlich. por el método enzimático de determinación de bilirrubina. que no se excreta por orina. la indirecta.Nitrito de Sodio .Diazorreactivo: Mezclar: 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo sulfanílico. siendo en su mayoría bilirrubina indirecta. ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Bil. Este pigmento insoluble en agua es transportado unido a la albúmina. Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos. habrá III. Si lee antes. o en las enfermedades extrahepáticas obstructivas. Directa Bil.5 ml 2. que es finalmente excretada con la bilis al intestino por un proceso de transporte activo. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total de las fracciones de bilirrubina en el suero o plasma de personas normales y con ictericia. II. o de la bilirrubina conjugada en las hepatopatías. donde el defecto limitante es la excreción. da color a las heces y ultrafiltra el glomérulo. La concentración sanguínea de bilirrubina total es de 1 mg / dl. habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta.68 CUANTIFICACION DE BILIRRUBINAS SERICAS I. que varían con la edad de presentación y también en cuanto a su gravedad La bilirrubina directa da una reacción inmediata con el diazorreactivo. La hemoglobina es liberada y se separa la globina del hem. éste es convertido en biliverdina y luego en bilirrubina. . .5 ml ----Desarrollador --------2.Bilirrubina Standard.5 ml Reactivo Sulfanílico 200 ul --------Diazorreactivo ----200 ul 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión.Reactivo sulfanílico . Si se lee después. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total y de las fracciones (bilirrubina directa e indirecta) en el suero de personas normales. La bilirrubina indirecta o no conjugada llega al hepatocito y se separa de la albúmina. REACTIVOS . excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. sólo reacciona después de agregar alcohol a la mezcla. por el método de Malloy Evelyn.

CUESTIONARIO: 1. Por qué? . ¿Cuál es la acción bioquímica que realiza cada uno de los reactivos utilizados en la práctica? 5. ¿Cuáles son las principales causas de hiperbilirrubinemia no conjugada? 3.Bilirrubina Directa VALORES DE REFERENCIA: . Bil. ¿Cuál es el riesgo de aumento de bilirrubina no conjuda en el recién nacido? 6. B.69 sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre CALCULOS: Bilirrubina total (mg/l) = (Abs. Directa .Abs Blanco. Elabore un esquema con los tipos de ictericia que se pueden producir durante el metabolismo de la bilirrubina. ¿Cuál es el comportamiento de las bilirrubinas en caso de una insuficiencia hepática.Abs. Blanco) x F Bilirrubina Directa (mg/l) = Abs.Adultos: o Directa: hasta 2 mg/l o Total: hasta 10 mg/l IV.) x F Bilirrubina Libre (indirecta) = Bilirrubina total . 2. total . ¿Cuáles son las causas de hiperbilirrubinemia conjugada? 4.

que circulan en la sangre (en el plasma y en los glóbulos rojos humanos) y es la orina su vía de excreción. el resto se degrada y es eliminado como CO2 y NH3. la concentración de ácido úrico en suero o plasma depende de un neto balance entre el grado de síntesis de purinas y fraccionamiento de nucleoproteínas por un lado y. la uricemia se incrementa después de la ingestión de nucleoproteínas con los alimentos. REACTIVOS A UTILIZAR. En condiciones patológicas. En el plasma. INTRODUCCION: El ácido úrico es un producto de la degradación hepática de las bases nitrogenadas purínicas adenina y guanina. Aproximadamente 80 % de esa cantidad es excretada por orina. diferencia que desaparece después de los 45-50 años de edad. llevando el aparato a cero con el blanco. Como sucede con otros constituyentes séricos.En tres tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas marcadas B (Blanco). Reactivo de fenol. III. policitemias. Standar: solución de ácido úrico 100 mg/dl Uricasa: solución de uricasa mayor o igual a 3U/I Reactivo 4-AF/POD: frasco conteniendo más de 100 U de peroxidasa (POD). colocar: B S D Standard 50 ul Muestra 50 ul Reactivo de trabajo 2. Al pH sanguíneo predomina la forma desprotonada o urato. Un adulto normal produce unos 500 mg de ácido úrico por día. .5 ml Mezclar suavemente e incubar 15 minutos en baño de agua a 37 °C o 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm). En el hombre. La presente práctica tiene por finalidad cuantificar las concentraciones séricas de ácido úrico en personas adultas normales y / o con alteraciones patológicas mediante el procedimiento químico de Folin-Dennis que se basa en la acción reductora del ácido úrico en medio alcalino sobre el ácido fosfotúngstico. podemos encontrar concentra ciones incrementadas de ácido úrico sérico en la gota. También existe hiperuricemia proveniente de la destrucción excesiva de células (material nuclear) en leucemias y linfomas. En orina. del grado de eliminación de ácido úrico. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento . S (Standard) y D (Desconocido). el ácido úrico alcanza una concentración de 4 a 6 mg/dl. que es el más común de los desórdenes del metabolismo de las purinas. el pH ácido favorece la formación de ácido úrico no disociado y puede precipitar. Los varones tienen niveles 1 mg/dl más altos que las mujeres. La cantidad de uratos excretados varía normalmente de 250 a 750 mg / 24 hrs. II. cantidad que puede incrementarse con una dieta rica en purinas. Retirar. a pH menores predomina la forma protonada no disociada o ácido úrico. los que se degradan y en un primer momento liberan los ácidos nucleicos de las proteínas. En las alteraciones renales severas son comunes los niveles altos de ácido úrico como resultado de una excreción disminuida.70 PRACTICA N° 27 CUANTIFICACION DEL ACIDO URICO SERICO I.Muestra: suero o plasma heparinizado . por otro. o urea.5 ml 2. ocurre lo contrario. más frecuente en hombres. etc. en alcalinidad.5 ml 2.

CUESTIONARIO: 1. 2. el sexo y las diferentes dietas. 6. incluso se ha observado una variación estacional. Señale la deficiencia parcial enzimática que ha sido encontrada en algunos pacientes con gota. . 5. Y dónde se realiza esta síntesis. IV. Cuál es la fisiopatología de las hiperuricemias. 3.71 - CALCULO DE RESULTADOS: Acido Urico (mg/dl) ! D v f donde " f " ! 100 mg/dl S - VALORES DE REFERENCIA: En adultos normales. se observan los siguientes rangos de valores: Hombres: 26-60 mg/l Mujeres: 20-50 mg/l Los valores de ácido úrico varían de acuerdo a la edad. Cómo se sintetiza el ácido úrico. ¿Cómo explica el uso del alopurinol en el tratamiento de la gota? ¿Cuál es el proceso de la artritis y de la formación de los tofos en la gota? Explique por qué existe hiperuricemia en las enfermedades de leucemia. 4. con ingesta normal de proteínas.

REACTIVOS A UTILIZAR. la cantidad total depende de la masa muscular.5 g/24hs.4 mg /100 ml. esta última determinación se prefiere porque proporciona mayor información relacionada con el estado de la función renal. como las glomerulonefritis o la nefropatía diabética o post renal. . La creatinina es fácilmente difusible y es igualmente distribuida en el agua corporal. ya que los niveles de creatinina sérica dependen del grado de excreción. El clearence de creatinina normal es mayor de 100 ml / min. Es excretada fundamentalmente por el riñón el cual clarifica el plasma de creatinina. Esto.72 REUNION DE LABORATORIO N° 13 PRACTICA N° 28 DETERMINACION DE CREATININA SERICA EN PERSONAS SANAS Y NEFROPATAS I. aumenta en el cuerpo humano fundamentalmente por síntesis. renal. La concentración normal en suero varía de 0. El suero es depurado de creatinina en el riñón por filtración glomerular proporcionando una buena base para el test de clearance.5 a 1. mientras que en eritrocitos sólo corresponde a un 40%. La creatina fosfato se forma en los miocitos y es un compuesto importante como fuente de energía en la contracción muscular. catabolismo de proteínas. La creatinina urinaria disminuye en la insuficiencia renal y es útil para medir el grado de filtración glomerular y lo poco que es transferido a través de las células tubulares. Aproximadamente 2% de la creatina fosfato muscular es convertida en creatinina diariamente. INTRODUCCION: La creatina. sexo o ejercicios. 9 . siendo la producción endógena constante. y es excretada en una cantidad casi constante. Usando métodos enzimáticos para determinar específicamente creatinina y comparando con los valores obtenidos por la reacción de Jaffe en personas normales y nefriticos se encuentra que la creatinina verdadera del suero comprende aproximadamente un 90% del total.0 mol/l . Elevadas concentraciones se producen solamente cuando la función renal está muy alterada y aunque el mismo tipo de información acerca del diagnóstico y pronóstico se obtiene por la determinación de nitrógeno ureico o creatinina. la cual puede alterarse por diversas causas. . II.Reactivo 1: Hidróxido de sodio 0. La determinación de hace de ordinario en un filtrado libre de proteínas obtenido a partir del suero. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento III. La determinación de creatinina tiene utilidad en la práctica médica para la evaluación de la función renal. La concentración de creatinina en suero no es afectada por la dieta. las que pueden ser de origen pre renal como el shock o la insuficiencia cardíaca.Reactivo 2: Acido pícrico 4. las variaciones fluctúan entre 0.1.Standard: Solución de creatinina 2 mg/l. hace remarcable la necesidad de usar suero y no sangre total para la determinación de creatinina por el método colorimétrico. La creatinina es un constituyente habitual de la orina. La cantidad eliminada por las personas del sexo masculino generalmente es más grande que en las de sexo femenino.16 mmol/l . La creatininuria es determinada mediante el método enzimático. aunque una pequeña cantidad pre formada es ingerida con los alimentos. precursora de la creatinina. como las uropatías obstructivas La creatinina en medio alcalino reacciona con el ácido pícrico para dar un tautómero de picrato de creatinina de color anaranjado (reacción de Jaffe). edad.

En tubos de ensayo marcados B (Blanco). Mezclar. ¦ ¦ Standard(mg/dl)Av 50 v? A Standard 0.73 PROCEDIMIENTO En caso de que la muestra a utilizar sea en suero. Incubar exactamente por 2 minutos y leer A2. Haga dibujos del procedimiento. Explique por qué se incrementa la creatinina en tres estados patológicos que conozca. A que se denomina clearence de creatinina y que importancia tiene.9 ± 1. 2.3 mg/dl 11 ± 20 mg/kg/d 14 ± 26 mg/kg/d 95 ± 160 ml/min/1.6 ± 1. 5.73m2A ! mgcreatinina mlOrinav mlorina/24h mgcreatinina ml suerov 1440 /100 VALORES REFERENCIA: DE SUERO/PLASMA: Mujeres Varones ORINA: Mujeres Varones Clearance de Creatinina: Mujeres Varones IV. luego agregar: Reactivo 2 250 ul 250 ul 250 ul Llevar el espectrofotómetro a cero con el blanco. ¿Qué información o presunción obtiene al dosar la creatinina sérica? ¿Por qué se prefiere la determinación de creatinina urinaria a la de nitrógeno ureico? Interprete y explique el procedimiento de la práctica.73 m2 . M (Muestra) Componentes Blanco Standard Muestra Reactivo 1 1000 ul 1000 ul 1000 ul Muestra --------50 ul Standard ----50 ul ----Mezclar. 3.1 mg/dl 0. CALCULOS: ¨A Muestra (A2-A1) y ¨A Standard (A2-A1) CALCULOS: SUERO/PLASMA : ¦ ¦ Creatinina(mg/dl)! ORINA : Creatinina(mg/dl)! Standard(mg/dl)A v? A Standard A Muestra A Muestra CLEARANCE DE CREATININA : /100 ?mg/min/1. su determinación. S (Standard). Incubar 1 minuto a 20-25 °C y leer A1. Incubar 5 minutos a 20-25 °C/30 °C/37 °C. CUESTIONARIO: 1.73 m2 98 ± 156 ml/min/1. 4.

00 Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente (20 a 25 °C) o 5 . . es el principal producto final del catabolismo de las proteínas y se distribuye en todos los tejidos.Suspensión de ureasa.00 1. REACTIVOS A UTILIZAR. Cuando el nitrógeno ureico es determinado por el método de la ureasa. II. La uremia es determinada colorimétricamente por el uso de ureasa.01 ----Reactivo de trabajo (ml) 1. conociendo los valores de urea. .01 Standard (ml) ----0. éste reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimétricamente. Los valores de urea se mo reportan siguiendo la siguiente fórmula: Nitrógeno ureico sanguíneo x 2. pero en condiciones normales aproximadamente el 40% de este filtrado regresa p difusión a la sangre.00 1. Las concentraciones de urea en sangre total. se informa el BUN según la siguiente fórmula: Urea x 0. La finalidad de la presente práctica es cuantificar la uremia por el método de la ureasa. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento PROCEDIMIENTO Componentes Blanco Standard Desconocido Muestra (ml) --------0. es excretado casi enteramente por los riñones. La or importancia clínica de la urea viene del hecho de una elevada concentración sanguínea puede estar asociada con una mala función renal. La urea en el plasma es filtrada por los glomérulos renales.Reactivo hipoclorito.Reactivo de salicilato. Este método es altamente específico y aunque está basado en reacciones de urea. ésta transforma a la urea en carbonato de amonio y con la adición del reactivo de Nessler el amoníaco liberado forma un compuesto de color amarillo bruno cuya intensidad se mide en fotocolorímetro. Agregar a cada tubo: Reactivo hipoclorito (ml) 1. . suero o plasma. en personas normales y / o con procesos patológicos. La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoniaco. .74 PRACTICA N° 29 CUANTIFICACION DE UREA EN SANGRE I.4665 = Nitrógeno ureico sanguíneo Los riñones eliminan diariamente entre 20 a 40 gramos de urea. o 3 minutos a 37 °C. INTRODUCCION: La urea es sintetizada en el hígado.00 1. La concentración de la urea en la corriente sanguínea es el resultado del balance entre el grado de degradación de las proteínas y el grado de eliminación por los riñones.00 1.00 Incubar 5 minutos a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C). son muy similares. Normalmente no tiene función útil en el organismo.Solución standard III. es convencionalmente reportado co nitrógeno ureico.14 = UREA En sentido inverso. El grado de azoemia depende de la extensión y tipo de lesión renal. Los valores normales de urea en suero (como nitrógeno ureico sanguíneo o BUN) es de 9 ± 19 mg/100 ml.

7 mg/dl 7 a 14 g/24 hrs. Señale las características comunes que se encuentran en los efectos enzimáticos hereditarios del ciclo de la úrea. : 4. Leer las absorbancias dentro del plazo de una hora CALCULOS: FACTOR ! 66 Absorbancia Standard Urea (mg/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: SUERO/PLASMA: Urea : Nitrógeno Ureico ORINA: Urea : Nitrógeno Ureico IV. ¿Qué alteraciones en las concentraciones séricas de úrea y NH4+ podrían encontrarse en el coma hepático? ¿Cuál es la importancia metabólica de la existencia del ciclo de la ornitina en el hígado de los seres humanos? ¿Cuál es la importancia metabólica que en el hígado humano exista una relación entre el ciclo de los ácidos tricarboxilicos y el ciclo de la ornitina? 10 a 50 mg/dl : 15 a 30 g/24 hrs. conocer las concentraciones séricas de úrea? ¿Qué influencia tiene la ingesta proteica sobre la concentración sérica de úrea? En relación a las concentraciones séricas de úrea y NH4+.75 minutos a 37 °C.5 a 22. . ¿Qué importancia clínica tiene para usted. 2. 5. 3. 6. CUESTIONARIO: 1. 4.

0 0. REACTIVOS A UTILIZAR. Si se agrega una determinada cantidad de L-alanina a un homogeneizado de hígado después de un período de incubación (30 minutos) podemos demostrar que se ha producido desaminación si encontramos determinada cantidad de cetoácidos (ácido pirúvico y ácido alfa-cetoglutarato) los que pueden ser identificados frente a una solución de 2-4 Fenihidrazina en medio alcalino. Filtrar y medir a otros tubos previamente marcados: .Acido tricloroacético al 10% . Esto es importante porque el L-glutamato es el único aminoácido en el hígado que experimentan desaminación oxidativa a una tasa apreciable y esta reacción se cataliza por la L glutamato deshidrogenasa. .1M pH 7.0 1. todo el nitrógeno amino proveniente de los aminoácidos que puede experimentar transaminación se puede concentrar en el glutamato.0 3.5 TUBOS DE ENSAYO II 4.5 1.5 III 4.0 0.Buffer fosfato 0. II.0 3.5 1. La finalidad de la práctica es demostrar los procesos de desaminación (oxidativa o no) que sufren los L aminoácidos en el hígado utilizando a la L-Alanina como un ejemplo de éstos y al 2-4 Dinitrofenilhidrazina como indicador de los cetoácidos formados provenientes de la desaminación.2-4-Dinitrofenilhidrazina: solución 0. Puesto que la alanina es también sustrato para la reacción de glutamato transaminasa.4 . INTRODUCCION: La remoción del grupo amino de las L-aminoácidos es el primer paso en la degradación metabólica general de estos compuestos (catabolismo).1% en HCl 2 N.0 3.2M Agua destilada Homogeneizado de hígado Colocar en baño maría a 37°C durante treinta minutos. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente esquema de incubación: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.76 PRACTICA N° 30 DEMOSTRACION DE LOS PROCESOS DE DESAMINACION OXIDATIVA DE LOS L-E-AMINOACIDOS I. .2M .5 III. La presencia de estos cetoácidos se debe fundamentalmente a los procesos de transdesaminación y desaminación del ácido glutámico (transdesaminación) que se estimula fundamentalmente y en mucha menor proporción por desaminación de la L-Alanina por la acción de la L-aminoácido.0 1.Homogeneizado de hígado o riñón de rata 10% y conservado en baño helado.L-alanina: solución 0. Añadir ácido tricloroacético al 10% Mezclar y añadir agua destilada I 4.1 M pH 7. Dos sistemas enzimáticos de transaminación: la alanina piruvato transaminasa(ALT) y la glutamato alfa-cetoglutarato transaminasa (AST) catalizan la transferencia de grupos amino de la mayor parte de los aminoácidos para formar alanina a partir del piruvato o glutamato a partir de alfa-cetoglutarato.4 Solución L-alanina 0.NaOH: solución 2N .0 1.5 1.0 0.

4-Dinitrofenilhidrazina solución al 1% Mezclar y dejar en reposo durante veinte minutos.77 COMPONENTES (ml) Filtrado 2. De un ejemplo de desaminación oxidativa de un aminoácido.0 Señale los sistemas enzimáticos flavinodependientes que producen desaminación oxidativa de los aminoácidos. CUESTIONARIO: 1 2 3 4 5 6 I 4.0 4.4-Dinitrofenilhidrazina en el sistema? ¿Cómo explica usted los resultados fotocolorimétricos obtenidos en los tres diferentes tubos de experimentación del sistema? ¿Cuál es la importancia biológica de la desaminación oxidativa de los aminoácidos? ¿Qué conclusiones puede establecer usted.0 1.0 1. de los resultados de su práctica de laboratorio? .0 4. IV.0 1.0 4. NaOH 2N Dejar en reposo durante 10 minutos.0 III 4.0 TUBOS DE ENSAYO II 4. ¿Cuál es la razón por la que se utiliza 2. Realizar las lecturas con el espectrofotómetro.

Se presenta en alimentos frescos y en vegetales.78 V UNIDAD NUTRICION: REQUERIMIENTOS ENERGETICOS. Las intervenciones quirúrgicas dan lugar a disminuciones de 17 a 20% de contenido en el plasma y en glóbulos blancos.5 mg de ácido ascórbico para niños y 7. En el escorbuto no tratado. lesiones en las encías y ligera anemia. dolor de las extremidades. La vitamina C es destruida rápidamente por el calor de cocimiento o la pasteurización. Los nivelas ² plasmáticos en una población bien alimentada varían entre 5.1 gm/100ml y en glóbulos blancos menos de 2 mg/100 g. El principal resultado de tal deficiencia es el escorbuto. Las necesidades mínimas diarias de vitamina C son 10 mg y son preferibles 30 mg por día. VITAMINAS Y MINERALES REUNION DE LABORATORIO N° 14 PRACTICA N° 31 DOSAJE DE VITAMINA ³A´ El instructivo de la presente práctica se les proporcionará durante la práctica respectiva. Los síntomas son vagos y generalmente limitadas alteraciones del crecimiento de los dientes. Muchas de estas propiedades podrían depender de las propiedades reversibles de óxido reducción (redox) de esta vitamina (ácido ascórbico .5 y 1. Esto puede ser hecho con un simple aparato para medir la presión sanguínea con la cual la presión dentro de los capilares se incrementa por la constricción de . la hipófisis y el ojo son espacialmente ricos en vitamina C. hemorragias subcutáneas y sangrado de encías. INTRODUCCION: La vitamina C o ácido ascórbico es hidrosoluble y antiescorbútica. La única acción en el cuerpo es debido principalmente a que es una clase especial de agente reductor que influye en los procesos de óxido reducción.5 mg para adultos es suficiente para prevenir síntomas de deficiencia. Aunque no se conoce con seguridad sus funciones metabólicas precisas hay pruebas que señalan su requerimiento para el metabolismo de la tirosina .ácido dehidroascórbico). Antes de la intervención quirúrgica las cifras plasmáticas inferiores de 0. PROTEICOS. Para ello es necesario que los. alimentos antes del cocimiento contengan 70 mg de vitamina C. el nivel plasmático de ácido ascórbico es inferior de 0. PRACTICA N° 32 DOSAJE DE VITAMINA ³C´ I.2 mg/100ml o en glóbulos blancos a 8 mg/100 g indican una deficiencia importante que puede significar cicatrización tardía o dehiscencia de las suturas.2 mg/100ml. Un excelente test clínico para la deficiencia de vitamina C es la determinación del promedio de resistencia capilar. el escorbuto clínico tarda 6 meses en manifestarse. Casos subclínicos de deficiencia de vitamina C son muy comunes entre la población pobre de las grandes ciudades. Se estima que una ingestión diaria de 2. En los leucocitos la concentración es mucho mayor que en el plasma (15 mg/100 g) de capa blanca leucocitaria. En caso de alimentación deficiente. Ciertas células sin vitamina C no son capaces de producir o mantener sustancias de importancia intracelular. una enfermedad caracterizada por debilidad. Se necesita también para la producción normal de fibrinas del tejido conectivo y de la sustancia del baso intercelular (por ello el aumento de fragilidad capilar en el escorbuto). La corteza suprarrenal.

total o plasma. esta debe ser fresca (no después de 30 min.4 dinitrifenilhidracina al 2% en ácido sulfúrico 9 N. 2 mi de ácido sulfúrico al Q5°o. Del problema .5%. . y El ácido ascórbico utilizado para preparar la solución patrón debe ser de grado analítico. CÁLCULOS: Abs. y 0. La excreción normal diaria de vitamina C en orina de adultos varia entre 10 y 30 mg. Absorbancia se compara con patrones adecuados de ácido ascórbico. Esta sufre rearreglo molecular en ácido fuerte dando un compuesto rojo. y Agregar a cada tubo lentamente y mezclando. y Los valores inferiores a 0.4 0. El ácido ascórbico es estable durante varias horas en el filtro.5% III. Del Standard . REACTIVOS A UTILIZAR: y Acido tricloroacético al 10& (P/V).2 mg/dl pueden preceder en 2-3 meses a la aparición de un escorbuto clínico. El propósito de la siguiente práctica es determinar la concentración de ácido ascórbico en el plasma de personas adultas normales o carenciales. Mezclar: COMPONENTES (ml) TUBOS Liquido sobrenadante de paso anterior Acido tricloroacético al 10% Standard de ácido ascórbico.5 = mg/dl Abs. y Reactivo de color. mezclando: 5 ml del reactivo 2.4 III 0.Blanco NOTA: y El ácido ascórbico es muy inestable. y Oxalato de litio al 6. Hemorragias que en la piel aparecen con excesiva frecuencia podrían indicar fragilidad capilar. y Leer en fotocolorimetro (540 nm). Por ello es indispensable separa el plasma de ids glóbulos rojos y realizar el análisis sin tardar. Por 6'ste procedimiento el ácido ascórbico del plasma o sangre es oxidado a ácido dehidroascórbico. Para la determinación del ácido ascórbico en sangre. y Reactivos 2. 0. y Acido sulfúrico al 85%. Transcurrido el tiempo se enfrian los tubos en baño de hielo durante 5 minutos.5 0.6 ml de agua destilada. II. por el método colorimétrico de Roe y Ructher modificado. y Solución de sulfato cúprico al 1. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento y Extraer más o menos 5 mi de sangre de la flexura del codo e introducirlos en frascos previamente oxalatados.Blanco x 2. Agua destilada Reactivo de color combinado I II 1 0. Se prepara en el mismo dia de uso. enfriando el hielo.4 dinitrofenilhidracina.1 de la solución tioúrea. y Agregar 1.79 la vena del brazo. En un pH ácido.5 0. el acide dehisroascórbico se transforma rápidamente en ácido dicetoglucónico que se une a 2 dinitrofenilhidracina -4 para formar una hidrazona de color pardo. se tapan en tubos con papel parafinado y se colocan en baño de agua a 56°C durante una hora.5 0. y Solución de tioúrea al 10% en etanol al 50%.4 - y Se mezclan los reactivos.).1 mil de la solución de sulfato cúprico. y Standard de ácido ascórbico 2 ml/100ml.5 0. y Dejar los tubos en reposo por 30 min. y Mezclar nuevamente. Se utilizará el método de Roe y Kutcher modificado para la cuantificación del ácido del ácido ascórbico en sangre.

¿Qué relaciones metabólicas podría mencionar entre el ácido fólico y Fe+++ en la producción de anemia en el escorbuto? 3. CUESTIONARIO 1. lactancia e intervenciones quirúrgicas? 4. embarazo. neoplasias. hipertiroidismo. ¿Por qué las necesidades de vitamina C deben ser satisfechas en la dieta normal? 2.80 IV. ¿Cómo explicaría que las dosis superiores a 1 g/dia pueden ocasionar hemolisis en portadores de deficiencia eritrocitica de G-6-P-deshidrogenasa? 5. . Desde el punto de vista metabólico ¿Cómo explica que los requerimientos de vitamina C sean mayores en el curso de las enfermedades infecciosas. Mencione algunas funciones metabólicas importantes del ácido ascórbico.

hidroxilamina clorhidrato. el hierro en uso. lo que lleva a la disminución de la ferritina sérica  Disminución de hierro sérico. El hierro forma parte de los centros Fe-S de la cadena respiratoria. Solución Standard: Fe (II) en hidroxilamina clorhidrato 500 ug/dl III. El contenido de hierro en el cuerpo humano se encuentra distribuido en tres formas: el almacenado. La capacidad de fijación de hierro (TIBC) aumenta en casos de anemias ferroprivas y disminuye en las hemocromatosis. etc.0. sino que además es tóxico. y el circulante.5 2. etc. dado que un aumento en sus niveles se encuentra asociado a diversas patologías tales como destrucción aumentada de los glóbulos rojos.5 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) --------Muestra (ml) 0. tumores. que se encuentra en la hemoglobina. enzimas y varios tipos de proteínas. Buffer alcalino: buffer TRIS pH 8. II. dado que no sólo es relativamente insoluble. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACION DE HIERRO Armar el siguiente sistema Componentes Blanco (suero) Muestra Buffer Acido (ml) 2.50 Reactivo color (ml) ----0. De la misma manera. que se encuentra dentro de las células. aumento de Capacidad Total de Fijación de Hierro y disminución de la Saturación de Hierro  Anemia por deficiencia de hierro: microcítica hipocrómica. La evaluación de la concentración de hierro sérico es de gran utilidad. El hierro es absorbido en el intestino delgado como Fe2+ y su regulación ocurre a ese nivel y es transferido a la transferrina para su transporte sérico.50 0. REACTIVOS A UTILIZAR: Buffer ácido: buffer acetato pH 4. defectos en el mecanismo de almacenaje. su disminución se asocia entre otras patologías a problemas de absorción y almacenaje. así como de otras hemoproteínas como los citocromos ± componentes de la cadena respiratoria. La deficiencia de hierro pasa por tres estadios:  Deficiencia de los depósitos de hierro. fiebre reumática.05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos. INTRODUCCION: El hierro sérico es importante en el organismo porque es componente esencial de la hemoglobina encargada del transporte de oxígeno. etc.81 REUNION DE LABORATORIO N° 15 PRACTICA N° 33 DETERMINACION DE HIERRO SERICO TOTAL Y TIBC I. Prácticamente todo el hierro corporal se encuentra unido a proteína. hidroxilamina clorhidrato.y la mioglobina.0 Reactivo color: ferrozina. El 90 % de anemias en las mujeres es por deficiencia de Fe.

Muestra Abs.standard Abs.Reactivo v 500 Abs.50 Reactivo color (ml) ----0. 5. CUESTIONARIO: 1.50 Muestra (ml) 0.50 0. 3.50 0. 2.Bl. 4.Bl.82 Cálculos: Ferremia (ug/dl) ! Valores de referencia:  Varones: 50 .00 2.Bl.Bl.Standard Abs.00 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) 0. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm Calculos: UIBC (ug/dl) ! 500  TI v 500 Abs.160 ug/dl  Mujeres : 40-150 ug/dl DETERMINACION PARA TIBC (capacidad de fijación de hierro) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Muestra Muestra Buffer Alcalino (ml) 2.Muestra Abs.muestra % Saturación! Ferremia (ug/dl) TIBC (ug/dl) Valores de Referencia: TIBC: Hasta 6 años Sobre 6 años % Saturación IV.reactivo Abs.muestra Abs.05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos. : : : 100 ± 400 ug/dl 250 ± 400 ug/dl 20 ± 55 % Señale al menos 5 funciones del hierro Causas de deficiencia de hierro Informe sobre estructura de la ferritina ¿Qué exámenes solicitaría para evaluar la deficiencia de hierro? ¿Qué importancia tiene medir la saturación de hierro? ©¨ § (ug/dl) ! Ferremia(ud/dl) I (ug/dl) ©¨ v 100 .

Estándar de cloruro: 355 mg/dl III.6 TPZ existente parcialmente como complejo Hg(II)+Sulfato de Hierro . REACTIVOS A UTILIZAR: .Reactivo de Color 2. INTRODUCCION: El ión cloro comprende aproximadamente el 65% del total de aniones del liquido extracelular. c) algunos tipos de enfermedad tubular renal con acidosis pueden producir incremento del cloruro sérico. todas estas alteraciones tienen exceso de C02 (que produce hipocloremia). En el suero normal el cloruro se encuentra en concentraciones que varían entre 100 y 106 mEqL. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES ESTANDAR PROBLEMA Estándar diluido 20 ul --Suero diluido --20 ul Reactivo de color 1 ml 1 ml Mezcla. d) excesiva ingestión de ClNH4 (cloruro de amonio) produce acidosis que puede ser seguida de altos niveles de cloruro sérico. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Antes de la determinación el estándar y las muestras de suero deben ser diluidas en relación 1/50 con agua destilada (20 µL de muestra/1 ml de agua). fiebre.83 PRACTICA N° 34 DETEMINACION DE CLORO. 3) enfermedad pulmonar.4. Se puede presentar concentración de cloruro disminuido (hipocloremia) en hipoventilación causada por: 1) depresión del sistema nervioso central. 7) en hiper o en s hipofunción de las glándulas adrenales (corteza). La concentración de cloruro se puede incrementar (hipercloremia) en muchos casos como resultado del déficit primario de C02. No exponer a la luz CALCULOS Lectura tandard   ! 355 v Lectura uestra ?mg/dlA  . Este tipo de alcalosis que es de tipo respiratorio resulta por hiperventilación que puede ser causada a su vez por: a) drogas. II. después de incubar 5 minutos a oscuras. Medir en el transcurso de 60 minutos la absorbancia de problema y estándar. b) enfermedades que producen estímulo del centro respiratorio como: histeria. 5) en la diabetes mellitus no controlada. 4) enfermedad renal crónica. 2) parálisis de los músculos respiratorios. igualmente sucede en el ClK. SODIO Y POTASIO EN EL SUERO DE PERSONAS SANAS Y EN ESTADO PATOLOGICO DETEMINACION DE CLORO I. tensión de oxígeno disminuida (altura). 6) dieta alta en grasas o en ayuno prolongado el cloro es desplazado por los cuerpos cetónico por sobre producción de estos. De todos los aniones es uno de los de más baja concentración en el líquido intracelular. ansiedad.

¿Qué influencia tiene la Aldosterona en el metabolismo del cloro? 2. CUESTIONARIO: 1. ¿Cómo explicaría usted. (Convertir en mEq/l dividiendo entre 3.84 VALORES NORMALES : 335 . ¿Puede señalar cinco causas de hipercloremia? 4. ¿Puede señalar cinco causas de hipocloremia? 5 ¿Cual es la relación de las alteraciones de la cloremia con el equilibrio ácido básico? .383 mg/dl. la deficiencia acentuada del cloro en la enfermedad de Addison? 3.55) IV.

alimentación nasogástrica con alto contenido de proteínas. por peso corporal. La concentración sérica es representativa de toda la concentración celular. Son ingeridos cerca de 3 gr. Del total de sodio corporal hay un 18% que fundamentalmente se encuentra en los huesos. Algunos pacientes con enfermedad cerebral. En el suero. en mujeres hay sólo 39 mEq por kg. Pequeñas cantidades aparecen también en las heces. La determinación del sodio de los fluidos biológicos se realiza sea por electrodo ión selectivo o menos frecuentemente por método colorimétrico II. y en niños es mayor. La concentración sérica normal es de 135 a 145 mEq por L (310 A 340 mg%). Diariamente y tiene acceso al suero por difusión a través de la mucosa intestinal o sea que cerca del 4% del sodio corporal total se recambia. El ion sodio es ingerido en los alimentos en combinación con el cloro fosfato. hay por lo tanto un 82% del total que es capaz de recambio y participa en las reacciones fisiológicas. En el hombre adulto hay cerca de 43 mEq de sodio intercambiable por kg. sulfato y otros aniones (sales).diariamente. Puede ocurrir deshidratación con sodio sérico elevado. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante: Acetato de uranilo más acetato de magnesio  Reactivo de color: tioglicolatop de amonio  Standard de sodio: 50 mmol/l . tratado sólo con insulina y solución salina. El suero o plasma contiene más del 90% del sodio total de la sangre. Tales valores no dan información acerca del volumen y distribución de la cantidad total presente ni de la cantidad intracelular existente. en pacientes con diarrea. Se observan concentraciones bajas si las concentraciones de sodio exceden a las del agua. si el líquido ingerido es insuficiente por razones anormales. Un adulto de 70 kg de peso contiene aproximadamente 80 g de sodio de los cuales 44 se encuentra en el % líquido extra celular y el 35% en los huesos. El estado clínico de hidratación es importante para evaluar el significado de los niveles séricos de sodio. Se puede encontrar incremento de sodio con hiperosmolaridad en individuos con deficiencia predominante de agua corporal. INTRODUCCIÓN Debido a la predominante concentración del ión sodio en el líquido extracelular éste influye sobre la presión osmótica que juega un rol preponderante en la distribución del agua entre el espacio extra o intra celular. El sodio se excreta casi exclusivamente en la orina. Como sucede con el agua corporal los valores varían inversamente con la grasa corporal. sudor y saliva. en diabetes mellitus no controlada. con pequeñas diferencias debido al equilibrio de Donnan. por ejemplo en pacientes con diabetes insípida no controlada. enfermedad renal con disfunción tubular. fístula intestinal. es aparentemente inerte (no ionizable). el sodio esta en equilibrio con el del líquido intersticial. como en el coma diabético.85 DETERMINACION DE SODIO I. pacientes con diarrea. El exceso de sodio se elimina por el riñón. cuando el líquido ingerido no es suficiente para eliminar la sobrecarga de solutos por el riñón. es el principal factor de regulación de este ion corporal y de sus concentraciones. El ión sodio es importante en el mantenimiento del equilibrio ácido básico ya que constituye aproximadamente el 90% del total de cationes extra celulares. La cantidad presente dentro de la célula no puede ser medida sin biopsio del tejido. El riñon puede regular la excreción de sodio y agua por lo tanto. En condiciones anormales pueden ser muy considerables las pérdidas de agua por el sudor u otr s o fluidos.

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (PROCEDIMIENTO) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco de Standard Problema Reactivo Standard 20 ul Problema 20 ul Precipitante 1 ml 1ml Tapar los tubos y mezclar cuidadosamente. incluye básicamente las concentraciones de esté ion? . Señale las concentraciones séricas normales. ¿Por qué la clasificación de deshidratación por alteración de la osmolaridad. 5. Dejar reaccionar durante 30 minutos Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). Dejar reaccionar durante 5 minutos Agitar fuertemente por 50 segundos. ¿Qué semejanza existe en la absorción intestinal de este ion y la glucosa? 4. CUESTIONARIO: 1.86 III. Emplear el sobrenadante Precipitante 20 ul Sobrenadante 20 ul Standard Sobrenadante 20 ul Problema Reactivo de color 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar bien. ¿Cuál es la importancia biológica del ion sodio? 2. ¿Cuál es el principal factor de regulación del ion sodio corporal? 3. Después de 5 a 30 minutos medir las absorbancias contra agua destilada a 405 nm CALCULOS: Factor: 150 /Lectura Bco Reactivo-Lectura Standard Na (mmol/l)= (Lectura Bco Reactivo-Lectura Muestra) x factor IV.

en adultos masculinos hay aproximadamente 46 mEq de recambio de potasio. Además de este rol pasivo. La concentración de potasio intracelular varia con los cambios del agua que gene ralmente acompaña a las alteraciones de los niveles de sodio extracelular. (3300 mEq) de potasio en un adulto de 70 kg. el recambio diario es de 14%. en intoxicación temprana con salicilatos. Con ingestión calórica inadecuada y la utilización de proteínas celular para propósitos calóricos. Excesiva cantidad de potasio puede liberarse del cuerpo bajo dos condiciones: primero cuando las secreciones intestinales con su contenido relativamente alto de potasio. Existe aproximadamente 130 gr. Los niños tienen relativamente menos contenido de potasio por kilogramo de peso debido a que la relación de agua intracelular/extracelular es menor que en adultos. en deshidratación. en alcalosis con hiperventilación. Existe también una pérdida lenta de potasio de los glóbulos rojos hacia el suero cuando la sangre permanece guardada. Entonces el 2<26 del total del potasio corporal son recambiados diariamente. en insuficiencia de la corteza adrenal. cerebro y de los glóbulos rojos se recambia más lentamente que en otros órganos. El potasio del hueso. en recién nacidos los niveles son algo más altos. del cual el 98% es intracelular mientras que el 2% está presente en el liquido extracelular. De potasio en forma de sal son ingeridos diariamente y recambiados con el potasio corporal. Déficit de potasio corporal puede resultar en: Pobre ingestión de alimentos. El déficit de potasio celular es reflejado en los hallazgos séricos y bajo estas condiciones la regla es hipopotasemia debido a la elevada excreción urinaria de cloruro de potasio. en hiperfunción adrenocortical o sobredosis de cortisona o ACTH.5 -5-3 mEq/L. varían entre 4-5. En los niños donde la ingestión de potasio es relativamente más grande. El potasio es rápidamente removido del líquido extracelular después que es ingerido. asi mismo en algunos casos de insuficiencia renal se encuentra elevada la concentración de potasio. en íleo paralitico y anastomosis intestinal no funcionante. esto es debido a que la excreción de potasio por orina se mantiene constante. INTRODUCCIÓN El potasio es el principal catión intracelular y por lo tanto es un factor importante de la presión osmótica que determina la distribución de agua entre las células y el líquido extracelular. así mismo en algunos casos de . Del sue el ro potasio es transferido el líquido intersticial antes de penetrar a las células o al filtrado glomerular a través de la membrana de los capilares glomerulares del riñón. Aproximadamente 293 gr. Bajo estas condiciones el potasio se eleva si el riñon no puede excretar esta sobrecarga. Se produce hiperpotasemia con pérdida intracelular de potasio cuando la permeabilidad de la membrana celular está alterada por lesión tisular. La concentración de potasio en el suero de personas normales es de 3.9 mEq/L. la excesiva destrucción de células del cuerpo y la utilización de proteínas para propósitos calóricos se acompañaría de pérdida de potasio celular. Hiperpotasemia se puede encontrar en: Shock o falla circulatoria de cualquier causa. influye activamente en el metabolismo celular ya que es cofactor de muchas reacciones enzimáticas intercelulares. El potasio se pierde en el cuerpo principalmente en la orina aunque pequeñas cantidades son perdidas en la respiración insensible. Bajo condiciones de incremento de pH (alcalosis) asociado con la disminución de cloruros. son perdidos a través del vómito. en administración continua de glucosa endovenosa y terapia salina. en la diabetes no controlada. diarrea o fístula gastrointestinal segundo por excreción urinaria incrementada en individuos con anormalidades tubulares renales. en mujeres solamente 40 mEq por kilogramo de peso. en hipoventilación tanto central como periférica cuyo incremento de potasio es frecuente. el potasio es liberado de las células y excretado dando como resultado hipopotasemia. El 95% del total del potasio corporal es intercambiable aunque el grado de recambio de cada tejido varía en los diferentes órganos. se produce intercambio entre el sodio intersticial y el potasio intracelular.87 DETERMINACION DE POTASIO I. pues la falta de esferoides adrenales provocan retención de potasio sérico. Se debe evitar la hemolisis en la toma de muestras de sangre porque el potasio puede ser liberado de los eritrocitos lisados. en fístulas gastrointestinales y vómitos.

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insuficiencia renal crónica. II. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante :ácido tricloroacético  Reactivo TPB-Na: tetrafenilborato de sodio  NaOH  Estándar de Potasio III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): 1. Precipitación: en un tubo de ensayo pequeño añadir 50 ul de suero y 500 ul de reactivo precipitante. Mezclar cuidadosamente. Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). 2. Armar el siguiente sistema: Componentes Reactivo de trabajo Standard Sobrenadante Standard 1 ml 100 ul 100 ul Problema 1 ml

Para producir una turbidez homogénea el Standard y el sobrenadante transparente deben de ser agregados en el centro de la superficie del reactivo de trabajo Mezclar cuidadosamente Dejar reposar por lo menos 5 minutos Medir las absorbancias dentro de los 5 y 30 minutos CÁLCULOS: Factor: 5/Lectura del Standard Problema: lectura del problema x factor VALORES NORMALES: Suero de 3.5 a 5.5 mmol/l IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es el principio o fundamento del método de Hoffman para determinación del potasio sérico? 2. ¿Cómo explica metabólicamente la influencia sobre la concentración sérica de potasio producida por la administración de glucosa e insulina? 3. Explique usted los efectos metabólicos de la aldosterona en la excreción renal de potasio. 4. De ejemplos de hiperpotasemia y de hipopotasemia

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PRACTICA N° 35
DETERMINACION DE CALCIO SERICO
I. INTRODUCCION: El calcio sérico se encuentra en dos formas: Una combinada con proteínas séricas, inactivo e incapaz de difundir a través de las membranas de los capilares. Y la forma no unida a las proteínas, es principalmente iónico, difusible y activo. Varios factores influyen en la concentración de calcio sérico total. La hiperproteinemia está asociada con una elevación en los niveles de calcio, mientras que la hipoproteinemia se acompaña con disminución de la concentración de calcio; sin embargo la concentración de calcio ionizado no se altera. El calcio ionizado se altera en las siguientes situaciones: 1) Por variaciones del pH sérico; la alcalosis tiende a disminuir el calcio y la acidosis tiende a incrementarlo. 2) La ingestión de vitamina D aumenta el calcio ionizado a través de la absorción de calcio y por la excreción del fósforo. 3) La hormona paratiroidea es el factor más importante que controla los niveles de calcio sérico y su efecto es casi exclusivamente limitado a la forma iónica del calcio. La concentración del calcio sérico en individuos normales es de 9 a 11,5 mg por 100 ml Aproximadamente 4,5 a 5,5 mg% es ionizado y cerca de 0,5 mg% está presente como citrato de calcio y el resto se encuentra unido a las proteínas. El propósito de la presente práctica es determinar la concentración sérica de calcio total en personas adultas normales y/o en estado patológico por el método colorimétrico directo

II.

REACTIVOS A UTILIZAR: - Buffer alcalino: buffer lisina pH 11,1 - Reactivo de Color: 8-hidroxiquinolina, o-cresolftaleina-complexona, ácido clorhídrico - Solución estándar de calcio: 8 mg/dl

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Standard Muestra Muestra --------20 ul Standard ----20 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar y medir la absorbancia de la muestra (¨A muestra) y del Standard (¨A Standard) contra el blanco en un lapso de 5 a 30 minutos CALCULOS: A muestra C ! 8v ?mg/dlA A standard VALORES DE REFERENCIA: Suero o Plasma: 8,1 ± 10,4 mg/dl 


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IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es la importancia biológica del calcio en el ser humano? 2. ¿Cuáles son las formas de calcio sérico? 3. ¿Cuáles son los factores que controlan los niveles de calcio sérico? 4. ¿Cuál es la concentración normal de calcio sérico total? 5. Señale algunas alteraciones fisiológicas y/o patológicas que producen alteraciones de los niveles séricos de calcio.

Se afora con 2 litros de agua destilada y se conserva a 0° C (dura varios meses). Sin embargo en ciertas anemias hemolíticas adquiridas.Cloruro de sodio (180 g). La muestra debe ser procesada tan pronto como sea posible después de tomada.31 g). Aunque en la prueba de la osmosis la ruptura de las células resulta de la alteración de su forma y disminución de su resistencia a las fuerzas osmóticas más que a un cambio en la composición de la célula o su osmolaridad. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS ERITROCITOS : PRECAUCIONES: 1. Utilizar heparina como anticoagulante de elección. .Na2P04 (27.5% . 3.Solución salina amortiguada concentrada 10%. . no deben hacer contacto con las paredes de los tubos secos porque estos pueden causar . 4. La muestra de sangre debe ser obtenida con un mínimo de estancamiento y de trauma. anemia falciforme y en la anemia hipocrónica ordinaria (ferropénica).0.2H2O (4. El uso de anticoagulantes del tipo de los oxalatos que comprende la adición de sales osmóticamente activas son indeseables.91 PRACTICA N° 36 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. la resistencia de los eritrocitos a las soluciones hipotónicas disminuye. Las células esferociticas se rompen más rápidamente que las demás y de hecho la prueba de la fragilidad osmótica puede ser considerada como un índice más sensible que la de la magnitud de eritrocitos a la lisis en solución hipotónica.NaCl al 15%.NaH2 PO4. cuando estos son puestos en soluciones hipertónica e hipotónica respectivamente. lo que se conoce con el nombre de fragilidad osmótica de los eritrocitos (0. 2.3%). de allí que se emplee el término de fragilidad. . Si utilizamos una serie de soluciones de CINa de concentraciones gradualmente progresivas es posible comprobar que la hemolisis de los eritrocitos se producen dentro de ciertos limites de hipotonicidad. Sin embargo cuando los eritrocitos son colocados en solución hipotónica aceptan líquido (hinchándose) hasta que se alcanza el equilibrio osmótico o hasta que se rompen. INTRODUCCION: La membrana de los eritrocitos es semipermeable. II. Cuando éstos son colocados en una solución hipertónica pierden líquido arrugándose y destruyéndose hasta que se establece el equilibrio osmótico con el líquido circulante.Heparina III. . Demostrar la fragilidad osmótica de los eritrocitos cuando éstos son colocados en diversas soluciones de CINa de diversas concentraciones. .5% EXPERIMENTO N°2 .NaCl al 4. Cuidar que las gotas de sangre caigan directamente en las soluciones salinas. La presente práctica tiene la finalidad de: Verificar el desplazamiento de agua desde el medio extracelular hacia el medio intracelular y viceversa en los eritrocitos.86 g).NaCl al 8. REACTIVOS A UTILIZAR: EXPERIMENTO N°1 . es observada en la talasemia.5 .

02 ml de sangre del paciente a cada uno de los doce tubos de una primera hilera.70 12 4.75 2. LECTURA: Observar cuidadosamente y marcar los tubos donde se inicia la hemólisis.50 0.50 4.75 3.50 1.00 0. Mezclar el contenido de cada tubo antes de agregar la sangre.50 0.80 2. objetivado por el color rojizo pálido que toma el líquido sobrenadante en los tubos centrifugados. Anotar los resultados.00 4.25 1. 6. Utilizando lancetas descartables o lanceta de Link estéril pinchar el dedo. Mezclar correctamente cada tubo y dejar a temperatura ambiente por 30 minutos.60 10 3. PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES Las diluciones se pueden preparar inmediatamente antes de la prueba: 1. Volver a mezclar y luego centrifugar a 2000 rpm.75 0. Conviene preparar una solución al 1% a partir de la solución concentrada al 10% y armar la siguiente serie de tubos: N° de NaCl al 1% Agua destilada % de NaCl tubo (ml) (ml) 1 0.00 0. La sangre del paciente y del sujeto normal son tomadas.25 0. 4. por acción de soluciones salinas de diferente concentración).55 9 3.00 1.92 hemólisis. Se debe rotar cada muestra suavemente en el tubo hasta que el color sea rojo brillante (plenamente oxidado). con las precauciones señaladas. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 1 y 3 de cada mesa de trabajo).10 2 1.20 3 1. 7.75 0.35 5 2.00 0. añadir 0. Proceder de la siguiente manera: Láminas (gotas) I II III .40 y 0.30 4 1.00 3. Procedimiento: Realizar asepsia del pulpejo del dedo escogido de la mano.40 6 2.00 2.50 0. 3.45% de NaCl).50 3. Observar que la fragilidad globular media de los eritrocitos se produce entre los tubos 5 y 6 (0.50 8 2.50 0. Depositar una gota de sangre en cada una de las tres láminas porta-objeto.45 7 2.00 0. en tubos heparinizados. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 2 y 4 de cada mesa de trabajo).25 2. Marcar el tubo donde la hemólisis es completa (color rojo intenso).50 2. con un algodón empapado en alcohol yodado. EFECTO DE LAS SOLUCIONES HIPERTÓNICAS E HIPOTONICAS SOBRE LA INTEGRIDAD DE LOS ERITROCITOS: (Verificar por inferencia el desplazamiento del agua entre los medios intra y extracelular.25 0.65 11 3. 5. Colocar cantidades similares de sangre control del sujeto normal en cada uno de los tubos de una segunda hilera. Utilizando con precisión una pipeta para hemoglobina o una pipeta Pasteur calibrada.

diga: A. IV. CUESTIONARIO: 1.93 Sangre del pulpejo de dedo Solución isotónica de CINa 8. Anotar los resultados. 3. Establecer las comparaciones morfológicas y/o lisis de los glóbulos rojos en rel ción a cada tipo de a soluciones empleadas en cada caso. ¿Cuáles son las relaciones normales existentes para la formación de los esferocitos y de las células tipo tiro al blanco? (target cell). Señale causas de alteraciones en la fragilidad osmótica. 1 2 - 1 2 - 1 2 Utilizando el microscopio observar los eritrocitos de cada una de las láminas. señale los porcentajes de inicio y finalización (total) de la hemólisis. 4. señale la concentración o porcentaje de NaCl del tubo en el cual empezó la hemólisis. Si el test de fragilidad osmótica de los eritrocitos de un modo general evalúa la relación entre el área superficial y el volumen de la célula. De acuerdo a los valores normales del test de fragilidad osmótica de los eritrocitos. 2.5% Mezclar bien. ¿Cuál es la relación normal existente que permite la forma de disco bicóncavo del eritrocito? B.5% Solución hipertónica de CINa 15% Solución hipotónica de CINa 4. así mismo el tubo en donde la hemólisis fue completa. . Según observación cuidadosa.

en la Prueba de Widal (en pacientes infectados con bacterias gram negativas como Salmonella. INTRODUCCION: Frecuentemente los antígenos se asocian con partículas que son demasiado grandes para formar soluciones o suspensiones coloidales en los medios acuosos. Algunas personas . con cinco sitios eficaces de fijación de antígeno por cada moléculas de 19S tengan una actividad aglutinante superior a la de los anticuerpos IgG con dos sitios de fijación de antígeno por cada molécula. La única diferencia entre una reacción de precipitación y otro de aglutinación es que los antígenos son moléculas pequeñas en tanto que los antígenos aglutinantes están asociados con partículas de mayor tamaño.94 PRACTICA N° 37 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. ambos tipos de reacciones se producen por medio de anticuerpos multivalientes que se combinan con partículas de antígeno formando complejos de antígeno anticuerpos. bastante reproducibles y sumamente sensibles. como el tifus endémico).). En efecto dichas pruebas permiten habitualmente descubrir hasta 0. dirigidos contra el mismo antígeno. en las condiciones empleadas en la prueba. etc. Pasteurella). en la Prueba de Weil Felix (en pacientes con enfermedades provocadas por Ricketsias. Por lo tanto no es sorprendente que los anticuerpos IgM. tanto para medir antígenos como para determinar las concentraciones de los anticuerpos. Estas diferencias dependen principalmente de la valencia del sitio de fijación del antígeno en las diversas clases de los anticuerpos. Algunas personas son poseedoras de un antígeno de superficie designado en forma arbitraria como antígeno A (eritrocitos tipo A). Las pruebas de aglutinación tienen muchos usos en el laboratorio clínico. pero en algunos casos se necesita el examen microscópico de la preparación estudiada. Los anticuerpos de las distintas clases de inmunoglobulinas difieren en su capacidad de producir reacciones de aglutinación. para descubrir la presencia de anticuerpos del receptor. en pruebas inmunitarias del embarazo. una baja concentración de anticuerpos IgM produce una reacción de aglutinación cuya intensidad es igual a la que se produce con una elevada concentración de anticuerpos IgG. Por lo general la aglutinación puede observarse a simple vista. etc. En general las pruebas de aglutinación son fáciles de prac ticar. La concentración del anticuerpo aglutinante se define como la mayor dilución de antisuero que aglutina el antígeno examinado. Brucella. eritrocitos. pueden quedar suspendidas en una solución salina y mezclarse con antisueros específicos. En otras palabras. partículas de látex. otras personas tienen otro tipo de antígeno de superficie que se llama antígeno B (eritrocitos tipo B). en la prueba del factor reumatoideo (en pacientes con artritis reumatoides). Estas partículas (bacterias. en la Prueba de Paul-Bunnell (Prueba de aglutinación en pacientes con mononucleosis infecciosa). El mecanismo de una reacción de aglutinación es semejante al de las reacciones de precipitación. en el diagnóstico de las anemias hemolíticas por autoinmunidad (en la que los pacientes producen anticuerpos para las membranas de sus propios eritrocitos).1 Ugr de anticuerpos/ml de suero Las pruebas de aglutinación se utilizan rutinariamente en las pruebas cruzadas con sangre antes de administrar transfusiones endovenosas en pacientes. Se denomina reacción de aglutinación al fenómeno en que la mezcla de las partículas de antígeno con los antisueros específicos provoca una agrupación de dichas partículas antigénicas. en la superficie de los eritrocitos del donador (Prueba indirecta de Coombs). Al igual que las reacciones de precipitación las pruebas de aglutinación requieren de un pH apropiado y de la moralidad de amortiguadores salinos y debe existir una proporción adecuada de antígeno respecto del anticuerpo. En la membrana de los glóbulos rojos de cualquier persona normal se pueden encontrar determinados antígenos (antígeno de superficie o determinantes antígenos).

y Llevar los glóbulos rojos sedimentados con suero fisiológico por tres veces. porque producen aglutinación de los glóbulos rojos que poseen el correspondiente antígeno y porque los antígenos son de origen humano (iso=de una misma especie). Observar si hay o no aglutinación de los glóbulos rojos en 1 y/o en 2 de isoaglutininas en el suero problema del estudiante y deducir el grupo sanguíneo que posee. y Preparar una suspensión al 5% de glóbulos rojos lavados. ya que su propio antígeno A. pero aumentan con rapidez su titulación en los primeros meses de vida. Estos anticuerpos (isoaglutininas) son del tipo IgH y son poco detectables en los sueros de los recién nacidos. y Obtener muestras de sangre tipo A y tipo B. Los antígenos de superficie A y B son llamados también aglutinógenos y se ha estimado que pueden haber hasta un millón de sitios antigénicos A o B en un solo hematíe. De acuerdo con esta hipótesis todos los recié nacidos n están expuestos a los antígenos A y B. le ha conferido una tolerancia inmunológica específica hacia él. Los antígenos aparecen a comienzos de la edad fetal en cuanto se forman los eritrocitos . y y y y IV.95 pueden tener ambos antígenos A y B (eritrocitos AB) y una cuarta posibilidad es que no tengan ninguno de los antígenos mencionados (eritrocitos tipo 0 o H). ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. se ha sugerido que las inmunizaciones inaparentes durante la infancia y el comienzo de la niñez pueden ser responsables de la producción de anti A o anti B. Es un hecho bien conocido que muchas bacterias instestinales (salmonellas y shigellas) tienen antígenos que reaccionan en forma cruzada con los antígenos humanos AB0 (H). llamados isoaglutininas. previamente identificadas. del tipo A y B en solución salina fisiológica. tomar una muestra de sangre sin anticoagulante y obtener el suero por centrifugación. CUESTIONARIO: 1. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo A sobre la gota de suero con marca 1 y mezclar. III. con hepsrina como anticoagulante. La misma lógica explicaría que una persona del grupo B forma sólo anti A y no anti B. II.  Identificación de isoaglutininas en suero: y De uno de los estudiantes de cada grupo (o masa) de trabajo. REACTIVOS A UTILIZAR: y Kit para identificar grupos sanguíneos (Diagnóstica). para eliminar los anticuerpos inespecíficos adicionados a la superficie de los glóbulos rojos. Por otra parte. En cada extremo de una lámina porta objetos poner una gota del suero recientemente obtenido y marcar 1 y 2 respectivamente. aunque quizá sea más realista una cifra de 5000. Utilizando los símbolos (+ )= positivo y (-)= negativo complete el cuadro de aglutinación de los grupos sanguíneos ABO: . Pero una persona del grupo A forma sólo anti B y no anti A. Como existe un desarrollo gradual de estas isoglutininas. en el suero existe también normalmente anticuerpos contra los antígenos A y B.000. y Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos y descartar el plasma. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo B sobre la gota de suero con marca 2 y mezclar.

(G. EN EL SUERO Anti Anti Anti Anti POSIBILIDADES DE TRANSFUSIÓN Puede recibir Puede donar De A AyO ByO O Todos (receptor Universal) A y AB B y AB Todos (donador Universal) AB 4. Diga usted ¿Por qué ya no es costumbre corriente utilizar sujetos de tipo O como ³donadores universales´ y personas de tipo AB como ³receptores universales´? 3. ¿Cuál es el fundamento de las reacciones antígeno-anticuerpo? . SANG) A B O AB ANTICUER. ¿Qué aplicaciones de las reacciones antígeno anticuerpo puede señalar? 5.96 SUERO DEL GRUPO O B A AB ( ( ( ( AB ) ) ) ) ERITROCITOS DEL GRUPO A B ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( C ) ) ) ) 2. En el siguiente cuadro anote los anticuerpos en el suero: GRUPOS SANGUÍNEOS ABO ANTIGENOS EN LOS POS ERITROCI.

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