ALUMNO (a

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PRESENTACION
Los profesores de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la U niversidad Nacional de Trujillo, han actualizado la Guía de Práctica, donde el estudiante encontrará una breve introducción de la importancia bioquímica y correlato medico de cada práctica, así como el procedimiento a desarrollar, finalizando con un breve cuestionario a fin de ampliar o concretar la aplicación de lo tratado. La Bioquímica es sin duda la ciencia que más ha aportado al desarrollo de la Medicina, basada en una rigurosa apl icación del método científico de la investigación

experimental. En la práctica, los alumnos a partir de los conocimientos adquiridos en los diálogos, seminarios y casos clínicos, tienen la oportunidad de plantear

interrogantes, contrastarlas con un experimento en forma ordenada, obten iendo resultados que al final se discutirán en grupo con el docente. También podrán conocer algunos métodos aplicados al diagnóstico clínico o al estudio nutricional. La práctica en Bioquímica, constituye un estímulo importante en el desarrollo de la investi gación experimental, permitiendo a nuestros estudiantes desarrollar habilidades y destrezas en trabajos de investigación y así obtener logros a nivel nacional para nuestra Facultad. Un recuerdo especial para los profesores que sentaron las bases para la actual guía de práctica como el Dr. Hugo Alpaca Muñoz, el Dr. Jorge García Ventura y un

agradecimiento a todos los docentes que de una u otra manera aportaron con sus conocimientos para disponer de esta herramienta que beneficiará a los alumnos de nuestra Facultad. Dr. CARLOS ARANCIBIA ARROYO Dra. MARIA DAYSI REYES BELTRAN Dr. JUAN VALLADOLID ALZAMORA Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA Dr. WALTER OBESO TERRONES Dr. ALFREDO LARIOS CANTO Dr. JORGE PLASENCIA ALVAREZ Dr. HECTOR RODRIGUEZ BARBOZA

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I UNIDAD SUBESTRUCTURA CELULAR: ENZIMAS Y BIOENERGETICA

REUNION DE LABORATORIO N° 01
PRACTICA N° 01
DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS
I. INTRODUCCION: La vida depende de una serie ordenada de reacciones químicas que son catalizadas por enzimas formadas para este fin. Las enzimas son proteínas relativamente frágiles con tendencia a sufrir desnaturalización e inactivación, es decir alteraciones en su conformación, por efecto de diversos agentes físicos y químicos como: temperatura, ácidos, álcalis fuertes, sales pesadas, pH, etc. Las enzimas se encuentran en pequeñas concentraciones en los materiales biológicos resultando , complicada su individualización o purificación. Para poder verificar directamente las propiedades comunes o similares de la naturaleza proteica que las caracterizan, experimentalmente se pueden utilizar las propiedades de catalizadores específicos que tienen las enzimas, como indicador de las alteraciones que pueden sufrir éstas cuando son sometidas a la acción de diferentes agentes físicos y químicos. De esta manera, sin necesidad de individualizar o purificar una determinada enzima se pueden verificar cómo los agentes físicos y químicos afectan la naturaleza proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad. La finalidad de la presente práctica, es evidenciar las características proteicas de las enzimas y que expuestas a la acción de diversos agentes físicos y químicos hacen variar su comportamiento y actividad catalítica. II. REACTIVOS A UTILIZAR: NaOH 1N SO4 Cu 20% NaCl 0.15M Amilasa salival 1.0% Solución iodada HCl 3N y 0.05N Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 Ácido tricloro acético (A.T.C.A.) al 20%

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Preparar: SISTEMA A TUBOS COMPONENTES (en ml) Amilasa al 1% NaOH 1N HCl 3N Ácido Tricloro acético 20% Sulfato de Cobre al 20% Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 I 1.0 2.4 II 1.0 2.4 III 1.0 2.4 IV 1.0 2.4 V 1.0 2.4 VI 1.0 2.4

0 5.0 1.4 2.6 NaCl 0. 4. A continuación armar el siguiente sistema: TUBOS COMPONENTES (en ml) HCl 0.0 VI 1. .0 5.05N De los tubos de reacción del sistema (B).1 M / pH 6.5 0.0 1.0 III 1. d.4 2. Esquematice el procedimiento de la práctica.0 IV 1.0 5. de la enzima tratada. d.5 II 5 0.5 IV 5 0.0 1.4 a. c. Colocar el tubo VI en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.15 M Agua Destilada 5.4 2.0 V 1.5 0.0 5.0 1. Pre incubar por dos minutos a 37 ºC.0 II 1.0 I 1.5 e. b. Dejar en incubación a 37 °C por 20 minutos. Observar el color producido e interpretar los resultados.0 1.4 2.5 I 5 0. CUESTIONARIO: 1.0 1.0 a.5 0. IV. 3.4 2. de cada uno de los tubos del sistema (A) a su correspondiente tubo del último sistema (B).5 0. agregar: Solución yodada 0.5 0.0 5.5 VI 5 0. Explique los tipos de enlaces fuertes y débiles que existen entre los aminoácidos para conformar una determinada proteína. Durante este lapso construir el siguiente SISTEMA B: SISTEMA B: TUBOS COMPONENTES (en ml) Almidón al 1. c.0% en solución acuosa Buffer fosfato 0. Observar el aspecto y color producido e interpretar. Explique la teoría de la acción molecular de las enzimas sobre sus respectivos sustratos. Interprete y explique bioquímicamente cada uno de los pasos realizados durante el desarrollo de la práctica 2. b.5 III 5 0. Agregar 0.5 V 5 0. Dejar los 5 primeros tubos del sistema en reposo por 10 minutos a la temperatura ambiente.6 ml.4 2.

1 ml.Ácido Clorhídrico 0. 3 ml. 2. entonces en un organismo vivo habría tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes. . verificando tanto el sustrato residual y los productos formados en dicha reacción. solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. la vida tal como es no podría existir. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL ) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura.Solución yodada. la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras: 1. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) y Armar el siguiente sistema: ETAPA A: TUBOS COMPONENTES Solución de almidón pH 6. .Solución de almidón pH 6. INTRODUCCION: Las enzimas pueden ser descritas como catalizadores complejos de origen biológico que tienen un alto grado de especificidad y eficiencia. y Volverlos a colocar al baño de agua a 37 °C durante 10 minutos. La finalidad del presente trabajo experimental es determinar la actividad enzimática. II. permitiendo que las reacciones químicas dentro de la célula ocurran rápidamente a través de vías bien definidas. Solución fosfomolíbdica.5 PRACTICA N° 02 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. Sin estas proteínas especializadas. Solución Cúprica alcalina. utilizando la enzima amilasa salival que tiene la capacidad de degradar el almidón en maltosa (disacárido reductor) y algo de glucosa.0 al 1% Solución de cloruro de sodio 0.1M Agua destilada I 5 ml. II 5 ml. y Agregar 1 ml.Reactivo Folin Wu: a. de enzima al tubo II.05N . Verificando los productos liberados después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura. REACTIVOS A UTILIZAR: . Para poder mostrar la actividad enzimática se debe tener presente fundamentalmente que cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima. 1 ml. y Colocar los tubos al baño de agua a 37 °C por 5 minutos.Cloruro de sodio solución 0. En general.0 al 1%. b. .Enzima al 1% (amilasa salival). III. . Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada.1M . 4 ml.

CUESTIONARIO: 1. 0. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante III. 2. II 1ml.5 ml. Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimático y defínalos.5 ml. Elabore un gráfica para demostrar la acción de una enzima sobre su sustrato. 2ml. 1ml. transferir 0. .05 N De los tubos I y II: Etapa A Solución yodada I 5 ml. 1ml. 3.5 ml. 1ml. y Inmediatamente cumplidos los 10 minutos. 2ml. 0. 4. Mezclar. 1ml. donde se observe la energía de activación y el estado de transición. TUBOS COMPONENTES Ácido clorhídrico 0. CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin WU) TUBOS COMPONENTES De los tubos I y II: etapa A Solución Cúprica alcalina Hervir 8 minutos Enfriar Solución fosfomolíbdica Agua destilada y I 1ml. De cada uno de los tubos del sistema anterior. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante. ¿Qué métodos conoce para determinar la actividad enzimática? Explique la acción bioquímica de cada uno de los componentes en los pasos seguidos para determinar la actividad enzimática. 0. a este nuevo sistema.5 ml. y Mezclar. II 5 ml.5 ml. 0.6 CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL.

0 1. que precipitan porque la solubilidad en estas condiciones disminuye al mínimo.0 1. Por tanto. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Marcar una serie de tubos de ensayo de 1 al 9 TUBOS REACTIVOS (en ml. de solución del tubo N° 1 y agregarlo al tubo N° 2.Indicador de pH: Papel Indicador ó pHmetro.0 IV 5. REACTIVOS A UTILIZAR: . la proteína sufre variaciones en la constitución de sus grupos químicos.0 1. Aprovechando este comportamiento.0 1. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que el punto o pH isoeléctrico de las enzimas es una característica físico química común de estas moléculas. .8 II 5 III 5 IV 5 V 5 VI 5 VII 5 VIII 5 IX 5 Mezclar el tubo N° 1 Extraer 5ml. se extrae 5 ml.NaOH al 10%. En el tubo N° 9 una vez efectuada la mezcla.0 V 5. iguales o mayores al PI. Cuando una proteína se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pH menores.1N en cada tubo. TUBOS CONTENIDO ( en ml. porque el número total de cargas positivas es igual al número total de cargas negativas contenidas en la proteína.Ácido acético 1N . . del tubo N° 2 y transferir al tubo N° 3.) Ácido Acético 1N Agua Destilada      I 3. Completando del mismo modo hasta completar la serie.Solución de caseína en Acetato de Sodio 0. . cuando se encuentran en una solución que tienen pH igual al PI.0 1. II.0 IX 5.1N III. cada proteína posee un determinado punto isoeléctrico (PI).2 6. Al contenido anterior del sistema agregar rápidamente 1 ml.0 1. de solución y se elimina.0 1.0 VII 5.0 Mezclar al instante por inversión. se puede determinar el PI de una proteína observando los cambios de solubilidad que se producen cuando la proteína se encuentra en varias soluciones que tienen pH conocidos.) Contenido Anterior Caseína 0.7 PRACTICA N° 03 DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LAS PROTEINAS I.0 1. de caseína en acetato de sodio 0. algunas proteínas son muy díficilmente solubles y precipitan.0 VI 5.1N (sal)  I 5.0 II 5. INTRODUCCION: El punto isoeléctrico es la concentración de iones hidrógeno en el cual la proteína es eléctricamente neutra. Mezclar Extraer 5ml.0 III 5. produciéndose en consecuencia variaciones en la estructura terciaria o cuaternaria y por lo tanto en su función biológica Aparte de otras propiedades que presentan las proteínas.0 1.0 VIII 5.

al 0. TUBOS N°.1 TUBO N° 3 = pH 4. Así en el tubo N° 1 es de 1. 4. 3. 2. la concentración de ácido acético varía. Anotar en el cuadro que se da a continuación Observar después de 30 minutos de reposo y anotar también en el cuadro respectivo.1N).6 = 4. 1 = 4. CUESTIONARIO: 1.1 4 NOTA: De la manera indicada en el ejemplo. x = precipitado EFECTO INMEDIATO EFECTO DESPUÉS DE 30 MINUTOS CÁLCULO DEL pH  Determinar el tubo que presenta el máximo de precipitación.  Calcular el pH de cada uno de los tubos aplicando la Ecuación de Henderson ± Hasselbach. . 0.7 Ejemplo : Si la concentración de la sal es de 1 ml. Indique el punto isoeléctrico aproximado a la proteína. I II III IV V VI VII VIII IX Emplear los símbolos siguientes : O = no cambia + = opalescencia. Anotar los resultados en la columna respectiva del cuadro anterior.1 N. En el tubo N°2 la concentración de ácido acético es de 8 ml.1 N. ¿Cómo interpreta el resultado obtenido del punto isoeléctrico? ¿Qué es el pK? El pH neutro del medio ¿es igual al pH isoeléctrico? De sus razones.6 ml. Ecuación de Henderson ± Hasselbach [ sal ] pH = pK + log. Etc. debe calcularse el pH de cada uno de los tubos IV. [ Ácido ] pK del Ácido Acético = 4. verificar el pH de cada uno de los tubos con el indicador de pH.0 ml. Cálculo de pH para el tubo N° 3: pH = pK + log. que encontró en su experimento.  Luego de transcurridos los 30 minutos de reposo.8    Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la proteína en los diferentes tubos. lo cual se producirá en el tubo que tiene pH próximo a la solubilidad mínima de la proteína. de acetato de sodio 0. 0.1 N en todos los casos. Ver ejemplo. En el tubo N° 3 la concentración de ácido acético es de 4. de ácido 1 N (16 ml.7 ± 0.

9 5.1 N ¿Cuál es el pH de la solución en 1 ml? . Si la concentración de ácido acético en el tubo II es 8 ml a 0.

. se toma como medida de la reacción el número de uniones peptídicas o glicosídicas atacadas respectivamente. La definición recomendada por la Unión Internacional de Bioquímica a través de su comisión de enzimas es la siguiente: ³Una Unidad Internacional (UI) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol (Q mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de medida´.La concentración del sustrato o los sustratos y cofactores. De esta manera se puede expresar la cantidad de una enzima en términos de unidades enzimaticas. Esto es posible debido a que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima. constituye una medida del grado de pureza de la enzima durante el proceso de purificación.10 REUNION DE LABORATORIO N° 02 PRACTICA N° 04 CUANTIFICACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE LAS ENZIMAS I. definible como el número de moléculas de sustrato transformado por minuto y por molécula de enzima (ó por un solo centro activo) en condicionales experimentales tales que se esté midiendo la velocidad máxima (concentración saturante del sustrato). y en general de todos aquellos factores que de una u otra manera pueden modificar la actividad de la enzima. o cualquier otra molécula en la cual son atacados más de una unión.La temperatura a la cual se define la Unidad. INTRODUCCION: Al no ser posible medir la cantidad de enzima directamente en las estructuras biológicas.Cuando el sustrato es una proteína. se recurre a la medida de la velocidad de la reacción que cataliza. deben establecerse: .En casos de reacciones bimoleculares del tipo: 2 A ----. una Unidad será la cantidad de enzima que cataliza la transformación de dos Q Moles de sustrato por minuto.B + C en que dos moléculas reaccionan entre si. Esta aumenta durante el proceso de purificación de la enzima en los homogenizados biológicos y llega a ser máxima y constante cuando la enzima se halla en estado puro. . entendiéndose por unidad de una enzima a la cantidad de ella que produce cierta velocidad de reacción bajo determinadas condiciones. Entonces la actividad específica además de cuantificar la enzima. . o un polisacárido.El pH. Esa velocidad de reacción se expresa como la cantidad de sustrato transformado en cierto tiempo. Dos casos merecen aclaración especial: . En cuanto a las mencionadas condiciones de medida. se debe reemplazar la definición de un Qmol de sustrato por un microequivalente (Q eq) del grupo involucrado. A fin de evitar ambigüedades surgidas de la utilización de distintas unidades para expresar la cantidad de sustrato y el tiempo se ha definido por convención una unidad que puede ser aplicada a casi todas las enzimas y que permite comparar las actividades de enzimas diferentes. y se expresa como el número de unidades de la enzima por miligramo de proteína. Se denomina Actividad Específica a la cantidad de una enzima expresada en términos del contenido de proteína de la preparación. Es decir en los ejemplos mencionados más que el numero de moléculas completamente hidrolizados. En éste último caso y siempre que se conozca un peso molecular se puede definir otra unidad ³LA ACTIVIDAD MOLECULAR O MOLAR O NÚMERO DE RECAMBIO´ (ÍNDICE CATALÍTICO). . ACTIVIDAD ESPECÍFICA.

recomienda el uso de una nueva unidad EL KATAL (Kat) que se define como la cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato en producto por segundo.67 nanokatales La Actividad Específica se expresa en esta nueva unidad como Katales por kilogramo de proteína (ó Microkatales por miligramo de proteína) y la actividad molar en Katales por mol de enzima. La finalidad del presente trabajo experimental es cuantificar la Actividad Enzimática determinando la actividad específica.2 ml. 0. 0.5 ml. 0. 20 minutos 0. 8. (Pre ± incubación) Preparado enzimático Mezclar e incubar a 37°C.3 N Sulfato de Zinc 5 % Sacarosa 0.11 Actualmente la Unión Internacional de Bioquímica.5 ml. 8.0 y Sacarosa 0. 2 minutos 0.0 Incubar a 37°C. 0.17 M Buffer acetato 0. Su relación con la Unidad Internacional es la siguiente: Un Katal es igual a 6 x 10 7 Unidades Internacionales.17 M Agua destilada y y TUBOS DE ENSAYO I II 0. 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: y Armar el siguiente sistema: SISTEMA DE INCUBACIÓN COMPONENTES Sacarosa 0.0 ml.01667 microkatales = 16.5 ml. Una Unidad Internacional es igual a 0. II. REACTIVOS A UTILIZAR: y Preparado enzimático (homogenizado celular de Fusarium moniliforme) y Buffer de acetato 0.3 ml.02M pH 5.5 ml. DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS DE LA REACCIÓN (azúcar reductor) Se empleará los filtrados libres de proteínas del paso anterior y se determinará azúcar reductor mediante el siguiente procedimiento: .0 ml.5 ml.2 ml.02 M pH 5. Detener la reacción empleando: Hidróxido de bario 0.5 ml.3 N y Sulfato de Zinc al 5 % y Solución fosfomolíbdica y solución cúprico alcalina y Reactivo de Biuret III. 0. 0.17M y Hidróxido de bario 0. Mezclar: Separar el precipitado de proteínas filtrando o centrifugando por 10 minutos.3 ml.

. I II 0.. 0. 0. de agua destilada.. el factor es.. 1.5 ml. Cálculos de la concentración de los productos (hexosas) [(Lect... = Micromoles de Hexosas / 2 Minutos Tiempo de incubación en minutos (20 min). II ± Lect. 0. de Proteínas ..0 ml.0 ml..0 ml. Mezclar y dejar en reposo durante 20 minutos.0 ml. Leer a 420 nm.5 ml.2 ml..045 uM/ml..0 ml.. 0. III 1. Cálculo de las Unidades (U) (U) = uM de sustrato transformado x ml. 1. I ± Lect. agregar 7.5 ml. de proteínas por ml.. 4.8 ml. y y y CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Determinación de la concentración de proteínas en el preparado enzimático: (Reacción de Biuret) COMPONENTES Preparado enzimático Agua destilada Reactivo de Biuret 1. Mezclar.0 ml..12 TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES Filtrado I Filtrado II Agua destilada Solución cúprica alcalina I 0.. y CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA U A. Colocar en un baño de agua hirviendo durante 8 minutos Enfriara al chorro de agua Solución fosfomolíbdica y 1.. del blanco) ± (Lect.5 ml. CÁLCULO: (Lect. 0. Mezclar y dejar en reposo por 30 minutos.0 ml...E.0 ml. Leer a 540 nm Para el espectrofotómetro. I) x Factor = mg.5 ml.5 ml..5 ml. 0. II 0. = mg. II ± Lect. del blanco)] x Factor = uMoles de Hexosas por ml. 4.. Factor = 0..

Cuándo determina el azúcar reductor de una reacción.5 x 10-4 ¿En cual de los dos preparados hay mayor cantidad de enzima? 6. 2. 5.13 IV. CUESTIONARIO: 1. 3. proteína) a. para calcular la Actividad Específica? ¿Por qué se utiliza el reactivo de Biuret? ¿Por qué una enzima se cuantifica en función de su actividad enzimática y no por el peso de la proteína (enzima)? Si en dos preparados biológicos A y B la actividad específica de una determinada enzima es: (en uM/mg. A = 1 x 10-3 y B = 1. 4. ¿Cómo explica la aparición de la coloración al final del sistema? ¿Por qué es necesario conocer previamente la concentración de proteínas del preparado enzimático y determinar la unidad de enzima (U). .

0 .25 % .4 2.4 2.Buffer fosfato 0. tomando como ejemplo la hidrólisis enzimática del almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reacción enzimática.4 2.0 1. sobre la serie infinita de enzimas que se conoce.0 5. de tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectada por la variación que pudieran sufrir los otros.Solución de cloruro de sodio al 2 % .0 VI 1.4 2. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.0 IV 1. La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores.0 1. concentración de enzima.Buffer acetato 0. etc).4 1. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reacción enzimática sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones.6 Buffer borato 0.Ácido clorhídrico 0.Amilasa salival dializada al 0.0 5.05N .6 II 1. III. como se comprenderá. PH. presentan características comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo. Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara de la influencia de los factores (Tiempo.0 1.1M pH 6.0 1. iones.0 5. pH.1M pH 9.0 Solución de ClNa al 2 % Agua destilada I 1.6 .0 5.1M pH 4. concentración de sustrato.0 1.1M pH 4.Solución fosfomolíbdica. TIEMPO TEMPERATURA.4 III 2. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes.0 5.4 2. varia en forma característica para cada enzima en particular.6 Buffer fosfato 0.4 VIII 1. concentración de sustrato.4 2. Este patrón general.0 1. retardando o i pidiendo m su actividad.Solución cúprico alcalina.0 VII 1.6 .0 5. pH.Solución de almidón al 1 % .1M pH 9. IONES INORGÁNICOS I.Buffer borato 0. . II. todas las enzimas.Solución yodada (yoduro de potasio + yodato de potasio) .0 1. REACTIVOS A UTILIZAR . INTRODUCCION: En general.1M pH 6.0 5.0 . tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática.) Solución de almidón al 1 % Buffer acetato 0. concentración de enzima.14 PRACTICA N° 05 FACTORES FÍSICOS-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS PARTE I: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMAS. temperatura. independientemente del tipo de reacción que catalizan.0 5.0 3.0 V 1.

5 5.0 0. Cumplido los 8 minutos sacar los tubos y enfriar con agua corriente y AGREGAR: . según se indica y tomar el tiempo. .0 ml.5 5.0 Solución iodada 0. azul claro.0 ml.5 ml. . 0. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES III Incubado correspondientemente a los tubos III y V Solución cúprico alcalina 1.0 II 0.2 VIII 0. por cinco minutos.6 III 0.El Control de los productos formados se hará en base a la capacidad reductora de estos (glucosa.05N 5. agregando a cada tubo marcado.El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0 °C y 4 °C durante cinco minutos. 1.0 0.5 5. TUBOS V 1.0 ml.5 0.0 0. maltosa) de la siguiente manera: Esta determinación sólo se hará en los tubos III y V del incubado a los 20 minutos.) Preparado enzimático (en ml.) I II III IV V VI VII VIII Incubado correspondiente de 0. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.0 0. I 0.5 0.6 VI 0.6 IV 0.6 VII 0.Realizar controles de la actividad enzimática.5 0.5 5.El control del sustrato no transformado se realiza por la reacción del yodo.6 V 0.5 0. del incubado de su correspondiente tubo. de acuerdo a los sistemas que a continuación se presentan: y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL . sin color) en el cuadro final.0 0. de la siguiente manera: Cumplidos los 20 minutos de incubación sacar los tubos del baño maría y luego armar una serie paralela de tubos marcados del I al VIII. valorando los cambios de coloración (azul oscuro.15 .5 Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos.6 (Computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimático fue agregado a cada tubo) y Mezclar y continuar la incubación por 20 minutos. .5 5.0 0. Mezclar y poner en baño maría hirviendo por 8 minutos. y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS .5 0. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.Agregar el preparado enzimático a los tubos: II al VIII.5 0.5 0.5 5.Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al baño de agua a 37 °C.5 cada uno de los tubos HCl 0. 1.0 ml.5 5.0 0. para el equilibrio de la temperatura.

0 ml. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 4. Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de tubos valorando los cambios de coloración (azul oscuro. ¿Cómo puede demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 6. 1. ¿Cómo se determina el sustrato residual y los productos finales cuando se usa almidón como sustrato? 3. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática? 5. CUESTIONARIO: 1. 5. sin color) en el cuadro final. CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA POR E L SUSTRATO RESIDUAL: (cambio de color) A los 20 minutos: I II III IV V VI VII VIII CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (cambio de color) A los 20 minutos III V IV. 5. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la presencia de un ión activador sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? . azul claro.0 ml.16 COMPONENTES III Solución fosfomolíbdica Agua destilada TUBOS IV 1. ¿Cuáles son los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas? 2.0 ml.0 ml.

II. PARTE II: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO. En este rango de concentración de sustrato la reacción es esencialmente de orden cero con respecto al sustrato.1 M pH 6. de modo que no es tan directamente proporcional a la concentración del sustrato. se define mejor en términos de la concentración de sustrato necesario para obtener una velocidad inicial de reacción igual a la mitad de la velocidad máxima. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: . I.6 Tungstato de sodio al 10 % Ácido sulfúrico 2/3 N III. la velocidad de la reacción llega a ser esencialmente independiente de la concentración del sustrato y asintóticamente alcanza una velocidad constante. y se dice que la enzima está siendo saturada con su sustrato.17 REUNION DE LABORATORIO N° 03 PRACTICA N° 06 FACTORES FÍSICO-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. Las reacciones catalizadas por enzimas son algo diferentes. A baja concentración de sustrato la velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato y la reacción es de primer orden con respecto al sustrato.075 M Solución de ureasa cristalina en Buffer fosfato 0. debido a que la velocidad de colisión entre los reactantes es proporcional a la concentración de cada uno de ellos. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato 0. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD MÁXIMA Y KM.1 M pH EDTA 0.005 M Urea 0. Sin embargo. Con un incremento ulterior en la concentración de sustrato. en esta zona la reacción es de orden mixto. la velocidad inicial se incrementa con menor intensidad. La finalidad de la presente práctica es demostrar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática y hallar la velocidad máxima y el Km de la reacción. cuando la concentración del sustrato es incrementada. la velocidad de reacción siempre es proporcional a la concentración de cada uno de los reactantes. Desde el punto de vista operacional la constante de Michaelis (Km). INTRODUCCION: En las reacciones no catalizadas.

M¶ Ejemplo: Concentración de úrea en el tubo I.0 8.0 1.5 V 1.0 0.5 VI 0.0 1.5 0.5 0.5 ml.5 VII 0. .0 I 0.5 VI 0.5 III 2.5 V 0. de cada uno de los siguientes incubados a tubos de ensayo de una segunda serie siguiendo el siguiente esquema: COMPONENTES Del incubado anterior Agua destilada Reactivo de Nessler I 1.0 1. empleando la concentración de amoníaco producido por ml. Para ello se medirá el tiempo de incubación inmediatamente después de agregar la enzima.5 3.5 0.0 8.0 0.05 % I 3.5 IV 0.0 1.5 0.0 0.5 0.MEZCLAR Transferir 1ml.0 8.5 0.  Calcular la velocidad de reacción para cada uno de los sistemas enzimáticos preparados.0 1.0 1.M.5 VII 0.0 2.5 IV 1.0 8.18 COMPONENTES Buffer fosfato pH 6.5 0.  Calcular la concentración de sustrato (concentración molar) en cada tubo de incubación empleando la siguiente fórmula: V.0 8.5 II 0. = V¶.0 1.  Hallar la diferencia de cada uno de los tubos.0 0. con respecto al tubo blanco (tubo VII).5 II 2.5 0.0 IV 1.0 - Pre incubar a 37 °C durante cinco minutos Incubar cada uno de los tubos exactamente 15 minutos 37°C ES FUNDAMENTAL: Medir exactamente el tiempo de incubación para cada tubo.5 2.0 8. Para ello multiplicar la diferencia anterior por el factor de calibración empleado (1660) = µmoles de NH3 /ml.0 II 1. Transcurridos los 15 minutos agregar rápidamente: COMPONENTES H2SO4 2/3 N Tungstato de sodio 10% Ureasa . V¶ = 4 ml.0 8.5 0.5 0.0 1.5 0. Luego:  Realizar las lecturas en el espectrofotómtero a 540 nm en cada uno de los tubos. ésta debe agregarse con intervalos de 1 a 2 minutos a cada tubo de tal manera que permita un fácil manejo de los mismos al final de cada tiempo. Datos: V = 0.5 MEZCLAR y dejar en reposo por cinco minutos.075 M Ureasa 0.0 VII 1.0 V 1.  Encontrar la concentración de amoníaco producido por ml.0 III 1. dividido entre el tiempo de incubación (15 minutos).6 Urea 0.0 VI 1.5 1.5 3.5 III 0.

Construir una gráfica en un sistema de coordenadas teniendo como parámetros la inversa de la concentración del sustrato (1/S) (abscisas) en función de la inversa de la velocidad inicial de la reacción (ordenada). ¿Para que sirve la ecuación de Lineweaver? 6. En la curva trazada calcular la Km e indicar la Vmax.19 M = 0.  Utilizando papel milimetrado.  Anotar los resultados de cada uno de los tubos (concentración del sustrato y velocidad de la reacción).0093 M 4ml.075 M M¶ = ? M¶ = 0. ¿Qué es el Km? 4.075 M = 0.5 ml x 0. ¿Cómo afecta la concentración del sustrato la velocidad de la reacción? 2. Calcular en la gráfica obtenida la velocidad máxima y la Km. CUESTIONARIO: 1. aplicar la ecuación de Lineweaver Burk a los resultados obtenidos. ¿Qué importancia tien el Km? 5. ¿Qué establece la ecuación de Micahelis Menten? 3.  Construir una gráfica en el sistema de coordenadas teniendo como parámetros : La concentración del sustrato (abscisa) en función de la velocidad de la reacción (ordenada). ¿Qué métodos conoce para determinar el Km? . IV.

si la enzima continúa inhibida después de la reacción del inhibidor. si el sistema deshidrogenasa succínica+succinato. Estas sustancias se conocen como los inhibidores enzimáticos. En la inhibición competitiva se dice que un inhibidor obra por competencia si su acción inhibidora se revierte al aumentar la concentración de sustrato. común en sistemas más complejos en el que el inhibidor se une exclusivamente al complejo enzima -sustrato para dar un complejo enzimasustrato-inhibidor incapaz de transformarse en otro producto. Por esta razón la unión de este último con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor. A la inversa. se dice que el inhibidor es reversible. de este tipo de inhibición es el que presenta la succinato deshidrogenasa que tiene como sustrato el succinato y puede ser inhibido por sustancias estructuralmente parecidas a dicho ácido como son el malato. El inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual se debería unir el sustrato impidiendo por lo tanto la formación del complejo activoenzima-sustrato. Si el efecto inhibidor se revierte al incrementar la concentración del sustrato (succinato) entonces se podrá afirmar que el inhibidor es de tipo competitivo. Si la inhibición no se revierte al agregar sustrato (succinato). Un ejemplo clásico. Por ejemplo. . entonces la inhibición será de tipo no competitiva. se agrega malonato como inhibidor. inhiben metaloenzimas por enlazarse al ión metálico. el exceso de inhibidor. Aquí el inhibidor se une a la enzima en otro sitio que no es aquel por el cual se une al sustrato. cloruro de mercurio. Los dos tipos más comunes son: las inhibiciones reversibles competitivas y las inhibiciones reversibles no competitivas. a las que se pueden agregar las inhibiciones reversibles acompetitivas. La inhibición acompetitiva. y la enzima recupera su actividad original. NO y CO. Respecto de los inhibidores reversibles es importante destacar que la interacción entre inhibidor y enzima se traduce en varios tipos de inhibición perfectamente diferenciados experimentalmente. que se pueden distinguir en base a un criterio experimental. INTRODUCCION: Existen sustancias cuya acción sobre una enzima es la disminución de su actividad. Ejemplos de este tipo de inhibición son los causados por el N-etilamida. De allí el nombre de competitivo. Los inhibidores enzimáticos se clasifican en reversibles e irreversibles. pudiéndose formar entonces un complejo ternario enzima-sustrato-inhibidor. Excluyéndose de ésta categoría aquellos agentes como los ácidos fuertes. EDTA. La inhibición no competitiva se caracteriza por que no puede ser revertida por un aumento de la concentración del sustrato ya que este último no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. alcoholes y calor que producen alteraciones en la estructura espacial de la molécula proteica que conduce a la desnaturalización. se dice que el inhibidor es irreversible. es otro tipo de inhibición reversible. Experimentalmente se puede identificar si un inhibidor cualquiera es o no competitivo.20 REUNION DE LABORATORIO N° 04 PRACTICA N° 07 ACCION DE LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS Y NO COMPETITIVOS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. por que efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazarse mutuamente de la enzima. los cuale enlazan iones metálicos necesarios para la actividad enzimática. ácido oxálico y glutarato. Quedando por demostrar si este tipo de inhibición es reversible o no. Si después de hacer actuar el inhidor sobre la enzima. que es cataliticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reacción y complejo-enzima-inhibidor. eliminamos por algún método.

5 IV 0. ¿Por qué el malonato es inhibidor competitivo? 2. II. ¿Cómo podría usted demostrar que la inhibición producida por el cloruro mercúrico es o no reversible? . que el malonato es un inhibidor competitivo y que el cloruro mercúrico es un inhibidor no competitivo.3 0.2 Succinato de sodio 0.5 1.Cloruro de mercurio .5 1.1 M 2 ± 6 diclorofenolindofenol Homogenizado 10 % I 2.5 III 0.5 M Cloruro de mercurio 0. IV.0 V 1.0 III 1.0 1. III.2 1.0 1.0 II 1.2 0.5 M Buffer fosfato 0.2 .0 1.5 - IV.0 1.2 ± 6 Diclorofenolindofenol .5 1.Malonato de sodio 0.1 M . ¿Por qué el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo? 3.2 0.3 0.Succinato de sodio 0.1M pH 7.Succinato de sodio 0. Dejar en reposo 15 minutos a la temperatura ambiente y luego observar los resultados y anotar.1 M Succinato de sodio 0. CUESTIONARIO: 1. REACTIVOS A UTILIZAR .1 M .1M pH 7.0 1.0 IV 1. II 0.8 0.Homogenizado hepático 10 % III.5 0.0 Dejar en reposo por 30 minutos a la temperatura ambiente. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.0 1.2 Anotar y luego agregar a los tubos II.5 M . pH 7.1 M Malonato de sodio 0.Buffer fosfato 0. COMPONENTES Succinato de sodio 0.21 La siguiente práctica tiene por finalidad demostrar en el sistema enzimático Deshidrogenasa succínica+succinato: que el malonato y el cloruro mercúrico producen inhibición de este sistema. Observar los resultados en cada uno de los tubos (cambio de color).0 0.1 M.

¿Qué diferencias puede usted establecer entre la inhibición competitiva y la inhibición alostérica? 7. 5. De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibición competitiva en el sistema Deshidrogenasa succínica ± succinato. sin considerar el cloruro de mercurio. De por los menos dos semejanzas entre la inhibición no competitiva reversible e inhibición alostérica. además del malonato utilizado en el presente experimento.22 4. 6. . Señale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibición no competitiva reversible.

Los más representativos de este grupo son la rotenona y la piericidina. entonces podemos deducir que el inhibidor actúa en algún sitio anterior al citocromo o de la cadena. pero si el indicador se decolora. quiere decir que dicho inhibidor estará actuando en alguna región anterior a la FMN. Este mismo sistema multienzimático es también conocido como cadena de transporte de electrones. INTRODUCCION: Los equivalentes de reducción. Si el inhibidor no impide la oxidación del indicador. es o no permeable al flujo de electrones que provienen del indicador. etc. el monóxido de carbono. etc. Los inhibidores más comúnmente usados pueden reunirse en tres grupos principales según el sitio de la cadena respiratoria donde actúan. Si se administra un inhibidor que impide el flujo de electrones en algún punto de esta porción de la cadena. se les denomina inhibidores del sitio II. Por su acción cercana en el primer sitio de la desfosforilación se les suele denominar inhibidores del sitio I. mediante el uso de indicadores conocidos como 2 ± 6 diclorofenolindofenol y p ± fenilendiamina. el BAL y barbiturato de sódio. La p-fenilendiamina. denominación que pone énfasis en que las oxidaciones reducciones son fenómenos caracterizados por la pérdida o ganancia de electrones. los detergentes. bloqueando el transporte de electrones entre la flavina y la ubiquinona. Si al administrar un inhibidor de la cadena. la p-fenilendiamina no se oxidará (no cambia de color). barbital sódico y azida de sodio. es decir que es capaz de ceder electrones. Existen diversas sustancias que actúan como inhibidores de la cadena respiratoria. entonces podemos deducir que el mencionado inhibidor actuará en algún sitio comprendido entre la CoQ y el citocromo B inclusive (cercano al sitio II de la cadena). Cuando se oxida (cede electrones) cambia de color (a marrón oscuro). átomos de hidrógeno o electrones. A estos se les denomina inhibidores del sitio III. los esteroides. es otro indicador que actúa como sustrato. el citocromo C actuará como primer aceptor de electrones que provienen de la p-fenilendiamina. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que los inhibidores: rotenona. De esta manera se puede verificar si la cadena comprendida entre el citocromo C y el oxígeno. Un grupo de inhibidores actúa sobre el Hemo a3 de la citocromo oxidasa impidiendo su interacción con el oxígeno. Si se administra un inhibidor que no impide la oxidación de la p-fenilendiamina y que tampoco impide la reducción del 2-6 diclorofenolindofenol. . Un primer grupo de inhibidores actúa sobre la NADH-deshidrogenasa. se utilizan sustancias indicadoras artificiales que cambian de color cuando se oxidan o se reducen. El ejemplo clásico de este grupo es la antimicina. Para poder determinar la permeabilidad de la cadena de oxidoreducción al paso o no de electrones.23 PRACTICA N° 08 EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE ÓXIDO-REDUCCIÓN I. inclusive de la cadena (región que incluye el sitio I). Un segundo grupo de sustancias actúan bloqueando la transf rencia de electrones e entre los citocromos b y c. algunos anestésicos volátiles como el halotano. sitio II y sitio III. éste impide que el 2-6 diclorofenolindofenol se reduzca (se decolore). inhibidores similares son la hidroxiquinolina N-óxido. provenientes de la deshidrogenación de los sustratos del ciclo de Krebbs y otros metabolitos son transferidos al oxígeno por un sistema multienzimático denominado cadena respiratoria. entonces podemos deducir que el sitio de inhibición estará en alguín sitio posterior a la CoQ inclusive. ésta cede sus electrones a los indicadores entre la FMN y la CoQ. Como hay flujo de electrones en la cadena. la azida. que al reducirse (recibir electrones) se decoloran. comprenden el cianuro. actúan en las regiones cercanas al sitio I. Inhibidores de localización son: el amital. En la cadena REDOX. Este sistema está localizado en la membrana mitocondrial interna y se caracteriza por la cohesión física con la cual sus componentes se encuentran unidos entre si e integrados en la membrana. así por ejemplo el 26 diclorofenolindofenol y el azul de metileno son sustancias indicadoras de color azul en estado oxidado. respectivamente.

5 0.02 % Malato 0.1M pH 7.1M Azida de sodio Fracción mitocondrial 10% (hígado de rata) III. TUBOS COMPONENTES (en ml.0 V 1.1M Barbiturato de sodio Azida de sodio Homogenizado mitocondrial 10% I 1.1M Rotenona 0. dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.2 0. verificar el efecto de los inhibidores: rotenona. dejar en 10% ambiente por 20 0.5 0. barbital sódico y azida de sodio.5 reposo a temperatura minutos.0 0.5 0.5 Mezclar.0 0.0 0.5 0.1M.0 1.5 0.4 2.5 0. I 2.5 V 0. pH: 7.5 III 1. 6-diclorofenol indofenol 0.1M P±fenilendiamina 1% Homogenizado de mitocondrias Mezclar. ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (en ml.5 0.24 II.5 0.5 1. En el sistema p±fenilendiamina + cadena rédox mitocondrial.1M pH 7.5 0.0 .2 0.) Buffer fosfato 0.5 0.0 II 1.4 Azida de sodio Barbiturato de sodio 0. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) En el sistema Deshidrogenasa málica + malato + cadena rédox mitocondrial.5 0.0 0.2 0.1M Rotenona 0.0 0.6-diclorofenolindofenol 0.2 0.5 0.1M Barbiturato de sodio 0.5 VI 0.5 IV 0.0 IV 1.5 1.02 % p-fenilendiamina 1% Malato de sodio 0.2 III 1.) Buffer fosfato de sodio 0.5 1.5 II 1.4 2.2 1. Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos).5 0. verificar el efecto de los inhibidores rotenona. barbital sódico y azida de sodio.5 1.1M Rotenona 0.0 0.5 0.

que cambios observaría con la rotenona. ¿Si utiliza el indicador p±fenilendiamina en un sistema con cadena respiratoria.25 Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos). la acción de los inhibidores e indicadores utilizados en el experimento. 5. . ¿Qué inhibidores de la cadena de óxido reducción conoce y a qué nivel actúan? 2. Indique usted los sustratos y enzimas que intervienen en los sistemas realizados en la práctica.6-diclorofenolindofenol en un sistema con cadena respiratoria. ¿Si utiliza el indicador rédox 2. que cambios observaría con la rotenona. IV. barbiturato de sodio y azida de sodio? 4. Grafique usted en una cadena de óxido reducción biológica. barbiturato de sodio y azida de sodio? 3. CUESTIONARIO: 1.

reducción usando los indicadores redox 2 . hallándolas de modo fundamental en una subestructura celular en donde la energía derivada de las oxidaciones es "capturada" en la forma del intermediario macroérgico ATP. El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15 minutos en la centrífuga refrigerada. fosfolípidos.154 M. Las enzimas de óxido . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Fraccionamiento Celular Cada grupo recibirá una rata albina (Rattus rattus var. Se hace presión manualmente con el embolo girando hacia el fondo. se emplea una centrífuga refrigerada. El sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca en un beaker de 100ml.reducción tienen una distribución característica intracelularmente. II. KCl 0. El sobrenadante es separado en un beaker de 500ml. Se coloca el hígado en un petri se elimina la cápsula del hígado y otros tejidos periféricos.02 % Succinato 0. Fracción mitocondrial del homogenizado. De acuerdo a su estructura y función. Fracción microsomal soluble del homogenizado.fenilendiamina y los componentes celulares de un homogeneizado de hígado de rata obtenidos por centrifugación dif rencial mediante el método de e Schreider y col.6-diclorofenolindofenol 0. La finalidad del presente trabajo es objetivizar la distribución intracelular de las enzimas de óxido . Estos sistemas están constituidos por proteínas.25 M Fracción nuclear del homogenizado. INTRODUCCION: Los carbohidratos. Homogenizado al 10%: se pesa 10gr de hígado y se corta en fragmentos pequeños y se coloca en el homogenizador potter y se le agrega solución de KCl 0. Todo debe trabajarse entre 0 y 4ºC. albicans). - - .4 2. grupos prostéticos y átomos metálicos. constituyendo la fracción microsomal con el citosol.26 PRACTICA N° 09 DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE ÓXIDOREDUCCIÓN I. aminoácidos y algunas otras sustancias sufren oxidaciones en el organismo mediante sistemas enzimáticos simples o complejos. inmediatamente se hara un corte longitudinal en el abdomen procediendo a extraer el hígado. Se separa el sobrenadante en un beaker. El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fracción mitocondrial. El animal será sacrificado. El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocándolo en tubos de polietileno.6 diclorofenilindofenol y p . REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0.1M p±fenilendiamina 1% Homogenizado total de hígado de rata en sucrosa 0.1M pH: 7. previa calibración en la balanza. ácidos grasos.154 M III. las enzimas que intervienen en estos pr cesos se encuentran o clasificadas en diversos grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimológica.

6-diclorofenolindofenol y cómo actúa en la cadena respiratoria? 2. Grafique usted en una cadena de óxido ± reducción biológica la acción de los indicadores rédox 2.5 III 0.5 1 1.27 Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Buffer fosfato 0.5 0.1M Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal -soluble Homogenizado total I 1.2 0.5 0. ¿Qué es un homogenizado de hígado y cómo se obtienen las fracciones celulares por centrifugación diferencial? 5. para interpretar los resultados. empleando: COMPONENTES Buffer fosfato 0.5 1. 4. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador.5 V 0. IV. ¿Qué es el 2. Haga un esquema de la centrifugación diferencial .5 IV 0. pH 7.5 2 1.4 2 ± 6 diclorofenolindofenol Succinato de sodio 0. CUESTIONARIO: 1.5 0.2 II 0. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador.0 1.6 diclorofenolindofenol y p±fenilendiamina.5 Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente.0 0.1M. para interpretar los resultados.4 P ± fenilendiamina 1% (sustrato + indicador) Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal ±soluble Homogenizado total 0.0 0.5 - Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente.0 0.0 0. ¿En que fracciones celulares se encuentran las enzimas de óxido ± reducción? 6.5 4 1.0 0.5 5 1.0 0.5 0.2 0.0 0.5 3 1.5 1.5 1. pH 7.2 0.0 0.5 1. Armar otro sistema. ¿Qué es el p-fenilendiamina y cómo actúa en la cadena respiratoria? 3.1M.2 0.0 0.

pero al año de edad la actividad es igual a la del adulto. Entre 2 ± 12 horas después de producida la pancreatitis aguda. Para la mayor parte. edema y pancreatitis están presentes indudablemente. Muy raramente permanece elevada 4-6 días. después de colangiografía. peritonitis. El presente experimento tiene por finalidad determinar la amilasa sérica en personas normales y/o con alteraciones patológicas especialmente del pancreas. las elevaciones son (con excepción de los niveles obtenidos después de la administración de opiáceos) menos de 500 unidades. . La amilasa comprende a sólo el 20% del almidón y es soluble en agua. Si liberan alfa o beta maltosa. con frecuencia 2-3 días después. difiere de la amilasa porque contiene además enlaces alfa 1-6 glucosídicos frecuentemente ramificados. INTRODUCCION: La amilasa es una enzima que hidroliza el almidón. encefalitis viral. el resto es una fracción inosoluble llamada amilopectina. Ambas. las cuales explicarían probablemente menos del 25% de la actividad sérica normal. cirrosis. La amilasa salival y pancreática humana esta dentro del grupo de las primeras. Es posible encontrar valores más altos. Para la determinación de amilasa usamos el método de Caraway. después de la administración secretina. La diferencia entre la cantidad de color azul formado en la muestra incubada y el blanco incubado por la adición de suero después de la incubación. así como en la orina existe actividad amilásica. trombosis mesentérica. El origen de la amilasa sérica humana incluye al páncreas y glándulas salivales. En la bilis no hay actividad. uremia después de la administración de codeína. en el que la cantidad de almidón y tiempo de incubación son ajustados de manera que sólo una porción de almidón es hidrolizado cuando la reacci n ó es parada por la adición de yodo. morfina. La elevación puede ocurrir en otras condiciones que incluyen enfermedad de las glándulas salivales (pancreatitis). mide la cantidad de almidón hidrolizado y por ende la actividad de amilasa de la muestra. la amilasa se encuentra grandemente incrementada y retorna a los valores normales lentamente. enfermedad séptica aguda del coledoco. carcinoma bronconígeno y en neumonía. En pancreatitis se llega hasta 2000 a 3000 unidades. después de ruptura esplénica. En algunas de estas condiciones. Si dentro de 24 horas no se eleva. Bajos niveles pueden encontrarse en pancreatitia crónica y en carcinoma pancreático cuando el daño es extenso y hay insuficiencia de las acinos glandulares. En los casos señalados se ha propuesto la prueba funcional de la amilasa sérica después de la administración de secretina y morfina. músculo estriado. Después de la administración de morfina en normales se incrementa la amilasa sérica. Se ha reportado incremento después de la ingestión de alcohol.28 PRACTICA N° 10 DETERMINACION DE AMILASA SERICA I. En normales. diuréticos tiazídicos. En otros. la explicación no es clara. En el suero humano. no es probable el diagnóstico de pancreatitis aguda. La amilasa es un poliglucósido de configuración lineal de unidades de glucosa unidos por enlace alfa 1-4 glucosídicos. También ha sido informado en leche y en el semen humano. se les clasifica en alfa y beta amilasa. La amilasa puede ser detectada en niños desde 1 a 2 meses de edad y los valores son más bajos que en el adulto normal. en pacientes con insuficiencias pancreática. Otras fuentes incluyen el hígado. La alfa amilasa actúa rompiendo los enlaces alfa 1-4 glucosídicos en la parte central de la amilasa formando una mixtura de pequeñas dextrinas + maltosa. la amilisa sérica se altera. trompa de Falopio y tejido adiposo. Los valores normales de amilasa por el método de Caraway calibrado en unidades Somogy es de 60 a 180. obstrucción intestinal. úlcera duodenal o gástrica penetrante o perforada. amilasa y amilopectina producen sólo B-glucosa por hidrólisis. En obstrucción de los conductos puede elevarse.

II BLANCO 5. Leer 660 nm.29 II.0 ml. 3. 5. 35 ml. REACTIVOS A UTILIZAR: y Sustrato de almidón Bufferado.) I PROBLEMA Sustrato de almidón Bufferado Retirar los frascos y agregar suero Retirar los frascos y agregar suero Agua destilada Solución iodada de trabajo.0 ml. espectrofotómetro a Incubar a 37°C durante cinco minutos ambos frascos Mezclar e incubar a 37°C durante 7. pH 7. debido a que las proteínas séricas disminuyen la cantidad de color producido por el complejo yodo ± almidón y este podría ser diferente).0 ml.1 ml. 35 ml. en función de la actividad enzimática? ¿Cómo explica usted el diferente comportamiento de la amilasa hepática y pancreática sometidas a electroforesis? ¿Por qué la concentración de amilasa sérica es menor durante los primeros meses de vida lactante? .5 minutos exactamente 800 = Unidades de amilada por 100 ml (Se requiere un blanco por cada muestra de suero. 5. Mezclar bien.1 ml.0 ml. 2.0 : y Solución Stock de iodo : y Solución iodada de trabajo: III. 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): Armar el siguiente sistema: (Utilizar dos frascos volumétricos ± Erlenmeyer de 50 ml. 4. De qué manera el ión cloruro activa a la amilasa ¿Qué semejanza o diferencia puede establecer usted entre amilasa dializada y no dializada. en CÁLCULO Absorbancia del _ Absorbancia del blanco problema _______________________________________ X Absorbancia del blanco 5. IV. 0. CUESTIONARIO: 1.

30 .

producción endógena de glucosa así como la utilización y excreción de la misma. se llama cotransporte. Este es un caso interesante en que un sistema de transporte a través de la membrana favorecería a otro. .31 II UNIDAD METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS REUNION DE LABORATORIO N° 05 PRACTICA N° 11 DEMOSTRACION DE LA DIGESTION Y ABSORCION DE LOS CARBOHIDRATOS: GLICEMIA PRE Y POST-PRANDIAL. Este proceso. Varía entre los 80 ± 120 mg%. La entrada de la glucosa en estas células está supeditada a que. la constante disponibilidad de este sustrato a los tejidos. En el caso del hígado. Por todo esto. el sodio. y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentración de sodio en fluído extracelular. y de origen endógeno. que proviene del hígado por glucogenólisis. con ella. sino que lo hace por un mecanismo de difusión controlada. al salir del Na+ mantenga alta concentración en el líquido extracelular. Este mecanismo requiere ATP como fuente de energía. volvería a salir de la célula. sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento. En el cerebro y los glóbulos rojos es la única fuente de energía. con el método de la glucosa oxidasa la concentración varía entre 70 ± 110 mg/dl. El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a través de las células de la mucosa intestinal no es muy conocido. el corazón y el músculo esquelético. A su vez. I. Por otra parte. La glucosa en sangre. contribuyen a mantener constante la concentración de glucosa en sangre. por ello. Diversos factores que inciden sobre la absorción. Se cree que está íntimamente ligado al transporte de sodio. por lo tanto la concentración de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo. Los valores normales de glucosa en sangre son variables de acuerdo al método utiizado. el organismo dispone de una compleja maquinaria metabólica que permite asegurar la constancia de la concentración de glucosa en la sangre y. siendo el hepatocito permeable para este metabolito. hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina. en particular en el tejido adiposo. el transporte de glucosa al interior de las células es por difusión pasiva. El conocimiento de la glicemia es importante no sólo porque permite tener una idea integral del mecanismo de homeostasis metabólica existente. Según el método l de Folin Wu. por la bomba de sodio y potasio. En este caso la glucosa entra en la célula. proviene de dos orígenes: de origen exógeno de los alimentos. posiblemente porque se une a la misma proteína transportadora que lleva el sodio. En casi todos los demás tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las células por simple difusión. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea es una de las fuentes de energía más importantes en el organismo y en algunos tejidos altamente especializados.

Preparación del Reactivo de trabajo: 500 partes de agua destilada. Colocar las muestras en tubos de ensayo. REACTIVOS A UTILIZAR .00 g/l f = ----------- S y D = Dpre. --------20 ul 2 ml Incubar todos los tubos 10 minutos en baño de agua a 37 ºC Leer en Espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco. III.AF: Solución de 4 ± aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0. IV. CUESTIONARIO: 1.000 U/ml) y Peróxidasa (120 U/ml). tanto en personas normales como en casos patológicos.32 La finalidad de la siguiente práctica es demostrar la digestión y absorción de la glucosa. Agregar 3 partes de enzimas GOD/POD previamente homogenizadas. II.92 mol/l. La segunda: Esta muestra se tomará después de una hora. y con aguja N° 20. . colocar: COMPONENTES Standard Muestra (suero preprandial) Muestra (suero postprandial) Reactivo de trabajo B ------------2 ml S 20 ul --------2 ml Dpre.Reactivo 4. Restar a D el Blanco (B) y el resultado se multiplica por f. ----20 ul ----2 ml Dpost. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES : Se tomarán dos muestras de sangre : La primera: La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra.AF. y Dpost. por el método de Glucosa oxidasa. como máximo. Dpre. Cálculo de los resultados : Glucosa (g/l) = D x f donde 1.Estándar: Solución de glucosa 1 g/l . (Desconocido preprandial) y Dpost. . 50 partes de Reactivo Fenol y llevar a 1. Mezclar por inversión sin agitar. S (Standard). Antes de multiplicar D x f. Rotular y fechar. En esos momentos.GOD/POD: Solución de glucosa oxidasa (1. . Utilizar 4 tubos de ensayo: B (Blanco). luego se centrifuga a 3000 RPM por 10 minutos. después de la ingesta alimenticia. se deja reposar 10 minutos. (Desconocido post prandial). La determinación de la glicemia se realizará por el método Enzimático de la glucosa oxidasa. 50 partes de Reactivo 4.Reactivo Fenol: Solución de Fenol 55 mmol/l. Separar el suero. cuál es el rango considerado normal para la glicemia basal? Explique las variaciones en los valores. cuantificando la glicemia pre y postprandial. se extraerán 5 ml. que usted puede encontrar por ejemplo en una intolerancia a la glucosa.000 partes con agua destilada. . ¿Actualmente. con jeringa hipodérmica de 10 ml. de sangre de la flexura del codo.

EXTRACCION DE GLUCOGENO HEPATICO (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Homogenizado de hígado en ayunas Homogenizado de hígado post prandial I 0. relacionados con la glicemia. .33 2. para el diagnóstico de diabetes mellitus? 5.Alcohol absoluto.Homogenizado de hígado de rata al 10 % (pesar 10 g.H2S04 concentrado. . ¿Cómo esperaría encontrar los valores de la glicemia dosada en la sangre venosa y en la sangre arterial? Fundamente las variaciones que se pueden encontrar. La acción de la beta amilasa también rinde una dextrina límite.6 los cuales se presentan con frecuencia aproximada de uno por cada 10 residuos. ¿Cuál son los criterios bioquímicos. de hígado y homogenizar con agua destilada. INTRODUCCION: El glucógeno está presente en el citosol en forma de gránulos los que contienen las enzimas glucógeno fosforilasa. 3. En el hígado el glucógeno se incrementa después de la ingesta de alimentos (período post prandial) llegando a los límites máximos cuando la dieta es abundante y/o en base a carbohidratos. El glucógeno es también fácilmente hidrolizable por alfa y beta amilasa para rendir glucosa y maltosa respectivamente. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.5 . glucógeno sintetasa y algunas otras que regulan la síntesis y degradación. REACTIVOS A UTILIZAR . ¿Conoce otros métodos para determinar la glicemia? Explique su fundamento 4. En cambio el glucógeno post prandial es debido a que la glucogénesis se incrementa cuando las concentraciones en sangre alcanzan valores de 150 mg/100 ml ó más. ¿Qué variaciones fisiológicas de glicemia puede usted señalar? PRACTICA N° 12 INFLUENCIA DE LA DIETA EN LA FORMACIÓN Y ALMACENAMIENTO DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO I. El glucógeno puede ser aislado de los tejidos por digestión con soluciones de hidróxido de potasio caliente en los cuales los enlaces no reductores alfa 1.Na2S04 solución saturada.Fenol al 80 % . Se encuentra glucógeno o se puede sintetizar en cualquier célula del organismo.) III.6 son estables. La finalidad de la siguiente práctica es cuantificar el glucógeno en ayunas y después de la uingesta de alimentos y evaluar los valores encontrados relacionados con los factores que determinan sus síntesis y degradación II. .4 y alfa 1.4 y las ramificaciones se forman por enlaces glucosidicos alfa 1. lugares principales de almacenamiento.5 --II --0. La mayoría de los residuos de glucosa en el glucógeno están ligados por enlaces glucosídicos alfa 1.KOH al 60 % . El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa de fácil disponibilidad. pero las concentraciones varían en los diferentes tejidos correspondiendo las concentraciones más altas del hígado y al músculo esquelético.

1 Mezclar.0 --Muestra del tubo II. Reposo por una hora.1 0.0 5. Centrifugar a 3500 RPM por 10 min. Colocar los tubos en agua helada durante 5 min.0 Disolver el precipitado por agitación.5 0.0 5. Leer en el fotocolorímetro con filtro verde.0 Na 2SO4 solución saturada.0 -Agua destilada 1. Alcohol al 98 % 5. CUANTIFICACION POR METODO COLORIMETRO DEL GLUCOGENO EXTRAIDO Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml)) I II BLANCO Muestra del tubo I del Sistema anterior««««««« 1. ¿Porqué mecanismo metabólico el glucógeno incrementa cuando la concentración de glucosa en sangre es mayor de 150 mg/dl? 5. del Sistema anterior« -1. 2. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones de ayuno? Dé usted las razones metabólicas que expliquen su resultado.5 Calentar los tubos en baño maría a 100 C por 10 min.0 2. ¿Qué relaciones metabólicas puede usted establecer entre los valores de glucógeno obtenidos en ambas muestras de hígado de rata.0 5. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones post prandial? 3. Blanco) x Factor IV. gota a gotaen el centro de c/tubo 5.1 Mezclar. 0. Agregar agua destilada 5. CALCULOS: Factor Espectrofotómetro = 7 g % de glucógeno = (Lec.0 1. Explique los mecanismos que regulan la homeostasis de la glucosa y el rol del glucógeno durante el ayuno prolongado.1 0. .0 Fenol al 80 % 0.0 5.1 0.0 Mezclar y dejar en el baño de agua helada durante 5 minutos más.34 KOH al 60 % 0.I ± Lect. y sin retirar los tubos del baño helado: Agregar H2S04 cc. motivo del experimento? 4. 540 n m. CUESTIONARIO: 1. Eliminar el sobrenadante y colocar boca a bajo los tubos sobre papel de filtro por 5 minutos.

La administración de insulina va seguida de la glicemia (hipoglicemia) cuya magnitud depende de la dosis administrada. . una excesiva excreción de glucosa por la orina (glucosuria) y un reducido nivel de glucógeno en el hígado. de manera que cada vez se eleva la glicemia. REACTIVOS A UTILIZAR . II. aminoácidos. La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos. . Se explica así que la falta de insulina determina una hiperglicemia que es el signo fundamental del cuadro denominado Diabetes.Glucómetro. Los mecanismos reguladores de la concentración de glucosa son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los primeros actúan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las glándulas de secreción interna. se produce más insulina que tiende a aminorarla. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas. La insulina también favorece la conversión de los hidratos de carbono en ácidos grasos y por otro lado inhibe la gluconeogénesis a partir de los aminoácidos. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea proviene de: glucógeno hepático. La glicemia se eleva después de la ingestión de un alimento rico en hidratos de carbono para luego descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas después de la ingestión vuelve al nivel de ayunas. La secreción de insulina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia. En condiciones normales. el efecto se debe fundamentalmente a que la hormona favorece la formación de glucógeno en el hígado y en el músculo. El efecto más importante de una deficiencia insulínica es el de un nivel sanguíneo de glucosa elevado (hiperglicemia). en ayunas. La insulina ejerce efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otros nutrientes.Conejos adultos de más de 2 kg. a la vez que acelera la oxidación de glucosa en diferentes tejidos. Siendo en la sangre arterial mayor que en la venosa.Solución de insulina cristalizada (Lilly): I Unidad por ml. otros carbohidratos y de glucosa absorbida por el intestino. pues es utilizada por todas las células para producir energía y por algunas células para funciones más especializadas por ejemplo glucogénesis. . la glicemia es muy constante. Esta hormona es producida por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas y es secretado en respuesta directa al incremento de glucosa en la sangre.35 REUNION DE LABORATORIO N° 06 PRACTICA N° 13 REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA ACCION DE LA HORMONA INSULINA I. de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la producción y la utilización de la glucosa sanguínea. cuya sensibilidad está regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipófisis por el otro. . La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de administración de insulina.Jeringas hipodérmicas de 1 cc. lipogénesis y otras semejantes.

Explique brevemente la regulación de la glicemia.  Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de insulina. Hacer una gráfica de glicemia vs tiempo       IV. La que servirá para establecer los valores basales de glicemia. . Anotar los resultados en relación al tiempo. Explique cómo y porqué se producen los signos y síntomas del cuadro clínico de hipoglicemia. que facilita la medida de la dosis.  Extraer una primera muestra de sangre del pabellón auricular del conejo. 3. EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE INSULINA. ¿Cuáles son las hormonas contrarreguladoras y su mecanismo de acción? 5. CUESTIONARIO: 1. 2. de la tasa de llegada e índice de salida de la glucosa de la sangre. como resultado. 4. Explique la naturaleza química y las acciones biológicas de la insulina. lo que hace un total de tres muestras en una hora. Utilizar una jeringa hipodérmica de 1 ml. y y Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de insulina a inyectar.  Luego extraer muestras de sangre a los 15 . en términos generales. Explique el mecanismo de acción de la insulina en la homeostasis de la glucosa.36 III. 30 y 60 minutos después de inyectada la insulina. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. Dosis de la solución de insulina cristalina (I Unidad por ml) inyectar I Unidad por Kilogramo de peso corporal.

4. ACTIVIDADES INTRUCCIONALES: Procedimiento  Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de adrenalina a inyectar. III. tomando las variaciones en relación al tiempo. . ello se debe a que favorece la conversión del glucógeno en glucosa (glucogenólisis) en el hígado. Con cada una de las citadas muestras realizar los dosajes de glucosa según el método de Glucocinta 5. Anotar los resultados en relación al tiempo. Extraer una primera muestra de sangre.fosfatasa. hormona secretada por la médula suprarrenal. construir una gráfica. CUESTIONARIO: 1. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de la administración de adrenalina. REACTIVOS A UTILIZAR .Conejos adultos de más de 2 kg de peso corporal. tiene acción hiperglicemiante. sometidos a ayuno de 8 a 12 horas. la glucogenólisis se realiza con la formación de lactato el que va ha contribuir directamente a la formación de glucosa y glucógeno en la célula hepática por los mecanismos gluconeogenéticos. 30 y 60 minutos después de inyectada la adrenalina. si l aparece hipoglicemia se segrega más adrenalina y glucagón que aceleran la regulación que espontáneamente debe realizar el hígado. 2. además de actuar en el músculo.  Dosis de la solución de adrenalina (0. Explique la naturaleza química y las acciones fisiológicas de la adrenalina. 3. LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE 1. EXTRACCION DE ADRENALINA. El efecto glucogenolítico de la adrenalina es debido a que activa a la fosforilasa. Servirá para establecer los valores basales de glicemia. 3.1 mg por ml. ¿Cuál es el mecanismo de acción hormonal de la adrenalina a nivel de sus órganos blanco? Explique de manera suscinta el efecto de la adrenalina sobre la glicemia. con especial referencia al metabolismo de los carbohidratos. ¡ ¡ ¡ IV. 2.37 ACCION DE LA HORMONA ADRENALINA I. por la ausencia en este de la glucosa 6.025 mg por cada kilogramo de peso corporal que corresponde a 0. lo que hace un total de tres muestras en una hora. Con los resultados así obtenidos. Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de adrenalina según el peso del animal. Luego extraer muestras de sangre a los 15 .25 ml de la solución a utilizar por kg de peso. INTRODUCCION: La adrenalina. II.Solución de adrenalina 0.Jeringas hipodérmicas de 1 cc. La secreción de adrenalina parece estar condicionada en forma importante por el nive de glicemia. .Glucómetro. . ¿Cuál es el efecto metabólico de la adrenalina sobre el hígado y sobre el tejido muscular y que efecto produce sobre la glicemia? . 4. Utilizar una jeringa hipodérmica de tuberculina que facilita la medida de la dosis.1 mg/ml) inyectar 0. del pabellón auricular del conejo.

pero como anotamos éste identifica a las sustancias con capacidad reductora y por tanto es de carácter inespecífico. en presencia de glucosa (sustrato) de la orina remueve de éste 2 iones hidrógeno (2H+) formando gluconolactona). fructuosa. utilizando un método específico a base de glucosa oxidasa y otro inespecífico en base al reactivo de Benedict. c) Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato cloral. Los iones hidrógeno removidos se combinan con el oxígeno atmosférico y forman peróxido de hidrógeno (H2O2). Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza para determinar glucosa en orina. La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras. El peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa oxida a la 0-tolidina y toma color azul. La glucosa puede ser determinada de manera específica utilizando como reactivo básico la glucosa oxidasa (método enzimático). II. ¿Qué efectos tiene la adrenalina.5 y 1. por acción de la glucosa oxidasa produce ácido glucorón más peróxido de ico hidrógeno. formaldehído. de uso generalizado en clínica. INTRODUCCION: En la orina de sujetos normales no existen cantidades detectables de azúcares en orina. puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que podemos señalar: a) Otros azúcares reductores: lactosa. ácido glucorónico. Por el contrario.5 g/l. además de glucosa. La glucosa oxidasa. b) Otros compuestos orgánicos: ácido homogentísico. en presencia de peroxidasa produce 0-tolidina oxidasa (de color azul) más agua. el cual es hidratado a ácido glucónico. pero cuando la glicemia supera los 180 mg % se puede producir glucosuria (presencia de glucosa en orina) porque en estas condiciones se supera la capacidad del riñón para reabsorverla (dintel renal). La glucosa del filtrado glomerular renal se reabsorbe en su totalidad en los tubos contorneados proximales. etc. creatinina. ácido úrico. y por tanto es explicable que no aparezca glucosa en orina. La prueba está basada en que la glucosa urinaria en presencia de oxígeno. Los azúcares forman más o menos la décima parte de dicha cantidad y de ella no puede decirse que su totalidad esté constituída por glucosa. es posible encontrar cierta cantidad de elementos reductores que se eliminen diariamente entre 0. cuando existe insuficiencia renal (menor filtración) no aparece glucosa en la orina aunque la concentración de glucosa se encuentra elevada por encima de 180 mg %. REACTIVOS A UTILIZAR .38 5. Este. sin tomar en cuenta su acción en el metabolismo hidrocarbonado? REUNION DE LABORATORIO N° 07 PRACTICA N° 14 DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA EN ORINAY SU DIFERENCIACIÓN DE OTROS AZUCARES REDUCTORES I. Cuando la capacidad de reabsorción renal disminuye. ácido ascórbico. En la orina. Sin embargo. galactosa y pentosas. la orina en glucosa aparece aunque ésta se encuentre en concentraciones normales en la sangre (diabetes insípida).

4. después de humedecida la cinta. 2. 2. Determinación de sustancias reductoras en orina mediante el reactivo de Benedict. incluida la glucosa Que resultados podrían obtenerse al tratar una muestra problema de orina. Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml. 3. III. Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas (Glucocinta Lilly). Determinación enzimática de la glucosa en orina (Método de la glucosa oxidasa). Explique que es el umbral renal de la glucosa. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. en relación a la glicemia del paciente podría plantear? Explique el fundamento del método de a glucosa oxidasa para la detección de glucosuria. Agregar orina problema: 5 gotas. . Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras. 3. IV. Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del líquido contenido en el tubo. 3. da negativo Ante una prueba positiva de glucosa en orina: ¿Qué presunciones diagnósticas. Procedimiento: 1. 1. realizamos la siguiente determinación con la misma muestra de orina. CUESTIONARIO: 1. Fundamente la utilización del reactivo de Benedict para la detección de sustancias con capacidad reductora. 2. adquiere o no color azul. Observar si a los 60 segundos. Llevar al baño de agua hirviendo por 5 min o exponer el tubo al fuego directo hasta que hierva por 1 min. Compare la intensidad de la coloración azulada con una escala adjunta que representa aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa. Si aparece un precipitado de color rojo ladrillo. 5. Agitar para evitar que el líquido se proyecte hacia fuera del tubo.10 ml. primero con el reactivo de Benedict y luego por el método de la glucosa oxidasa Que presunciones plantearía si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de Benedict da resultado positivo y sin embargo. Colocar en baño de agua hirviendo por 5 min o exponer al fuego directo hasta ebullición por 1 min. 4. 6. Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recién emitida contenida en un depósito de 5. la reacción demuestra la presencia de sustancias reductoras.39 - Reactivo de Benedict. Observar si hay cambio de color y precipitado. al ser tratada con el método de la glucosa oxidasa.

40 .

II. 20 ml. cartílago. III. válvulas del corazón y son responsables de las características físicas de estas estructuras.Poner una gota de orina al centro de un papel de prueba con Azure-A. cerca de 100 mg/día. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.Papel Whatman I impregnado con Azure-A . Dejar por 20 min. Los mucopolisacáridos son sustancias de gran peso molecular que se encuentran en varios tejidos: Conectivo. Dejar 3 min. INTRODUCCION: Determinar desórdenes genéticos puede involucrar los sistemas enzimáticos esenciales del metabolismo de los mucopolisacáridos. aorta. 0. Síndrome de Hunter. Los individuos con MPS secretan grandes cantidades de mucopolisacáridos. Estas son subdividas en varios grupos tales como : Síndrome de Morquiolo. 300 ml . Si un resultado cualitativo para investigar mucopolisacáridos en orina ha sido positivo ¿Porqué debe ser confirmado y cuantificado por cromatografía o precipitación? ¿Cuál es la constitución química básica de los glicosaminoglicanos (mucopolisacáridos)? ¿Cuál es la constitución química básica de los proteoglicanos? Cite 5 ejemplos de éstos. II. La finalidad del experimento es determinar cualitativamente en orina la excesiva excreción de mucopolisacáridos.La orina turbia debe ser filtrada o centrifugada previamente. Un resultado positivo por este procedimiento debe ser confirmado y cuantificado por columna cromatográfica ó utilizando la reacción de precipitación con cloruro de cetil piridium.Solución de Lavado :  Metanol  Acido acético glacial  Agua destilada. REACTIVOS A UTILIZAR . los cuales son excretados anormalmente en grandes cantidades en las mucopolisacaridosis (MPS). cantidad que es bastante elevada si se compara con los 15 mg/día que excretan las personas normales. De acuerdo a su composición química los mucopolisacáridos están agrupados en dermatán sulfato. Síndrome de Sanfilippo. . llamados también MPS I.Usar orina fresca o de 24 hrs conservadas en refrigeración (no usar preservantes). . cordón umbilical. CUESTIONARIO: 1. heparán sulfato y queratán sulfato. 3. resultado obtenido cuando la excreción está sobre el límite superior normal de 15 mg/día. Sacar y secar la tira de papel en estufa a 80º C o con aire caliente. 2. IV. La presencia de mucopolisacáridos en orina puede detectarse por un simple procedimiento o Test de Identificación de Mucopolisacáridos que se basa en que el papel Whatman I impregnado con el colorante AZURE-A. Síndrome de Hurler.1 ml. RESULTADOS Positivo: aparición de un color púrpura. Transferir a una caja Petri llena de solución de lavado. .41 PRACTICA N° 15 IDENTIFICACION DE MUCOPOLISACARIDURIA I. III y IV. Negativo: aparición solamente de un color azul pálido. en contacto con mucopolisacpáridos forma un complejo de color púrpura metacromático.

42

4.

¿Cuál es la importancia biológica del ácido hialurónico, condroitina y heparina?

III UNIDAD METABOLISMO DE LIPIDOS

REUNION DE LABORATORIO N° 08
PRACTICA N° 16
DEMOSTRACIÓN DE LA DIGESTION DE LAS GRASAS IN VITRO. ACCION EMULSIFICANTE DE LAS SALES BILIARES SOBRE LAS GRASAS. ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA SOBRE LOS TRIGLICÉRIDOS Y EFECTO DE LAS SALES BILIARES
I. INTRODUCCION: Los triglicéridos son los principales lípidos de la dieta. En el estómago ocurre la acción de la lipasa gástrica y la licuefacción de la masa de lípidos de los alimentos por contraccion peristálticas. La es principal digestión ocurre en el duodeno, tiene lugar en la interfase agua-lípido y su velocidad depende del área de superficie de la interfase, la cual es grandemente incrementada por el movimiento peristáltico del intestino combinado con la acción emulsificante de los ácidos biliares. Los ácidos biliares son moléculas anfipáticas sintetizados por el hígado a partir del colesterol y secretados como conjugados de glicina y taurina. La lipasa pancreática (Triacilglicerol lipasa) cataliza la hidrólisis de los triglicéridos en sus posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto con ácidos grasos. La actividad enzimática de la lipasa pancreática incrementa grandemente cuando contacta la interfase agua-líquido, un fenómeno conocido como activación interfacial. La unión a la interfase agua-líquido requiera la colipasa, una proteína de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con la lipasa pancreática (449 residuos), con cambios conformacionales que f rma una o superficie hidrofóbica y deja libre el centro activo. La alteración en la digestión o absorción de las grasas produce esteatorrea La finalidad de la práctica es demostrar la acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando su efecto con el agua y el cloroformo. Asimismo la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y el efecto de las sales biliares. II. REACTIVOS A UTILIZAR III. Cloroformo Aceite vegetal, de olivo Solución de sales biliares Buffer fosfato 0.1M pH 8,0 Emulsificación de aceite vegetal Solución de fenolftaleina (Solución alcohólica) Hidróxido de sodio (NaOH) 0.1N

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

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y

Acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas utilizando tubos de 15 x 125 mm. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Aceite de olivo(gotas) Agua destilada (ml) Cloroformo (ml) Sales Biliares (ml) Agitar enérgicamente los tubos Dejar en reposo y anotar los resultados para interpretarlos Acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y efecto de las sales biliares sobre la reacción enzimática utilizando tubos de 20 ± 25 x 150 mm. COMPONENTES (ml) TUBOS Emulsificación de aceite vegetal Buffer fosfato 0.1M pH 8.0 Solución de sales biliares 1 % Solución de extracto pancreático 1 % Agua destilada I 2 2 2 3 II 3 2 2 2 III 3 2 2 2 IV 3 2 2 2 Tubo 1 3 5 Tubo 2 3 3 2 Tubo 3 3 2 -

Mezclar los 4 tubos y llevar al baño maría a 37 °C , por 30 minutos, agitando de vez en cuando. Al finalizar el tiempo de incubación retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftaleína. Mezclar bien y luego realizar la titulación. TITULACION: Utilizando una pipeta graduada de 1 ml, dejar caer gota a gota NaOH 0,1N en el fondo de cada tubo del sistema, mezclar bien hasta la aparición de un color rosado tenue persistente. Anotar la cantidad de NaOH 0,1N gastados. Anotar los resultados para su interpretación. IV. CUESTIONARIO: 1. Explique lo que son sustancias anfipáticas. 2. Diferenciar emulsión de solución, acción de las sales biliares vs cloroformo. 3. ¿Cuántas clases de lipasa pancreática actuán en el intestino? 4. Cuál de los métodos para medir la actividad enzimática se ha empleado en esta práctica. Explique el papel de la fenolftaleína en la titulación. 5. Diferencie la absorción de los ácidos grasos según su tamaño.

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PRACTICA N° 17
DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS PRE Y POST PRANDIAL EN SUERO HUMANO
I. INTRODUCCION: Los lípidos de la dieta son principalmente triglicéridos. Son transportados junto a colesterol y fosfolípidos por los quilomicrones, formados en el enterocito. Los quilomicrones son las lipoproteínas más grandes, menos densas, ricas en triglicéridos, con la apoproteína apo B48. Por el conducto toráxico llegan a la circulación general. El pico máximo de lipemia postprandial se observa entre las 4 y 6 horas de la ingesta, y al cabo de 9 a 10 horas retorna a los valores basales de lípidos, especialmente de los triglicéridos. Los niveles de lípidos postprandiales, especialmente de los triglicéridos dependen de la cantidad de lípido de la dieta, de la digestión y absorción, de los niveles basales sanguíneos, de la acción de la lipasa lipoproteic en los tejidos extrahepáticos. La lipasa a lipoproteica actúa sobre los triglicéridos de los quilomicrones, liberando ácidos grasos que son captados por los tejidos extrahepáticos. Los quilomicrones son convertidos en remanentes de quilomicrones y captados por el hígado. Se ha considerado al incremento de la lipemia postprandial como un factor riesgo de aterogénesis. La finalidad de la práctica es demostra las variaciones de la concentración de trigliceridos en suero después de la ingesta de alimentos de alto contenido de grasas II. REACTIVOS A UTILIZAR - Reactivo enzimático para determinación de Triglicéridos ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Un alumno por cada mesa vendrá en ayunas de al menos 10 horas, a las 7 a.m. se les extraerá una muestra basal. Ingerirán una dieta rica en grasas conteniendo un vaso de leche, un huevo, 2 panes y 10 aceitunas. A las 4 y 7 horas de la ingesta, se obtendrá una segunda muestra. Se obtendrá el suero y se hará la determinación de triglicéridos. Armar el siguiente sistema. COMPONENTES BLANCO STANDARD DESCONOCIDO Muestra --------10 ul Standard ----10 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar e incubar 10 minutos de 20« 25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. Medir la absorbancia del Standard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A). Cálculos:

III.

C ! 200 v

(ADesconocid o ?mg / dl A (AStandar
1.71 mmol/l 2.28 mmol/l

C ! 2.28 v

(ADesconocido ?mmol / l A (AStandar

Valores Referenciales Sospechoso: sobre 150 mg/dl ó Elevado: sobre 200 mg/dl ó

. el ejercicio y el género sobre la lipemia postprandial. CUESTIONARIO: 1.45 IV. Destino de los productos de acción de la lipasa lipoproteica sobre los triglicéridos. Grafique los cambios de triglicéridos postprandiales en función del tiempo. Explique porqué el incremento de la lipemia postprandial es considerado un factor de riesgo coronario. 3. 5. 2. 4. Alteración de la lipemia postprandial en diabetes y familiares de diabéticos. Cuál es el efecto de la edad.

Los dos primeros pasan a la sangre y son fuente de energía en los tejidos extrahepáticos como el corazón y el músculo esquelético.5 g Mezclar hasta disolver los cristales de Sulfato de Amonio. a l denominada cetoacidosis diabética. REACTIVOS A UTILIZAR: . . el hiperinsulinismo. Estos son el ácido acetoacético. produce acetil CoA que ingresa al Ciclo de Krebs y en parte se utiliza en la síntesis de cuerpos cetónicos (cetogénesis). en toda hipercatabolia como la fiebre. el ácido beta hidroxibutírico y la acetona. INTRODUCCION: La beta oxidación de los ácidos grasos en el hígado. rinde un color azul violeta. sin mezclar) 1ml _________________________________________________________________________ Anotar sus resultados. Prueba de Legal El nitroprusiato de sodio diluido en presencia de cuerpos cetónicos. en el síndrome de Fanconi. Procedimiento: Armar el siguiente sistema: COMPONENTES TUBO Orina 3 ml Cristales de sulfato de amonio 0. Su concentración normal en orina es de 125 mg/ 24 horas. de la beta oxidación y de la cetogénesis. Dado que éstos son ácidos se produce acidosis metabólica. Nitroprusiato de sodio 10% 3 gotas Amoníaco (agregar lentamente por las paredes del tubo.Sulfato de amonio. en la enfermedad de Von Gierke y otras glucogenosis. hipertiroidismo. Prueba de Rothera y Trabajar del tubo identificado como orina patológica y Utilizar nitroprusiato en polvo.Nitroprusiato de sodio.Disponer de dos tubos que contengan orina normal y orina patológica. Aumentan en sangre (cetonemia) y en orina (cetonuria) por condiciones fisiológicas como el ayuno prolongado. de la siguiente manera: II. Los cuerpos cetónicos son eliminados por la orina y la a etona también por la c respiración. III. solución al 5% en H2O. en la dieta pobre en carbohidratos. a nivel mitocondrial. DETERMINACION SEMICUANTITATIVA DE CUERPOS CETONICOS EN ORINA I. incluyendo el cerebro en el ayuno prolongado. El diagnóstico y monitoreo de su tratamiento se hace con su determinación en sangre o/i orina. solución al 10% en H2O . el aumento de la lipólisis. En la Diabetes mellitus. .46 PRACTICA N° 18 IDENTIFICACIÓN DE LOS CUERPOS CETONICOS EN LA ORINA. y en sangre hasta 1mg/dl. especialmente de acetona. en los vómitos. En condiciones patológicas como la Diabetes mellitus. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento INVESTIGACION DE ACETONA . cristales. al superar la capacidad de oxidación de los tejidos extrahepáticos lleva a niveles aumentados de cuerpos cetónicos.Cloruro Férrico.

Procedimiento (Se utiliza orina filtrada): COMPONENTES Orina filtrada Cloruro Férrico. Uso de tira reactiva.Armar dos sistemas que contengan orina normal y patológica. Este método con sus dos variantes es posible aplicarlo al suero sanguíneo. se debe multiplicar por 10 el número de veces que se ha diluido ésta.1 cc 0. 15. Esperar 20 segundos. para investigar acetona y tener una cifra aproximada en su cuantía.9 cc 1.9 cc 3. 3. Prueba de Cloruro Férrico o de Gerhart. de la siguiente manera: AGUA 0. Esto es debido a que el nitroprusiato de sodio en polvo da reacción positiva solo cuando en la orina sin diluir alcanza la concentración mínima de 10 mg% de acetona y por eso. en cada una de las excavaciones que contiene el reactivo.9 cc 2. Cuál es la importancia de la cuantificación de los cuerpos cetónicos en el monitoreo de la cetoacidosis. 1/30. para calcular la concentración en orina diluida. 2. INVESTIGACIÓN DE ACIDO ACETOACETICO .2 g de reactivo sólido de nitroprusiato de sodio en cada una de éstas. Diluir la orina al 1/10. 5. etc.9 cc 4. Se basa en que en presencia de cloruro férrico.1 cc DILUCION 1/10 1/20 1/30 1/40 1/50   Agregar una gota de cada una de las diluciones. Observar la máxima dilución de la orina en el que aparece color azul violeta y multiplicar por el denominador de la dilución alcanzada por 10 y se tendrá la cantidad aproximada de acetona en mg por 100ml. 4. CUESTIONARIO: 1.1 cc 0. 150 mg/dl.9 cc + + + + + ORINA 0. Compare los métodos para determinar los cuerpos cetónicos. leer en escala colorimétrico. estimando la concentración como negativo 5. cetonuria.1 cc 0.1 cc 0. Sumergir la tira en el frasco conteniendo la orina. solución 5% en agua TUBO 5 ml gota a gota hasta la aparición del Color rojo burdeos si existe ácido Acetoacético IV. cetoacidosis y de ejemplos de cada uno de ellos.47   En una lámina de porcelana con excavaciones colocar 0. Cuál es el mecanismo fisiopatológico de la cetoacidosis en un paciente que llega al hospital por alcoholismo agudo . 50. 1/20. Realice una comparación entre la síntesis de cuerpos cetónicos con la etapa inicial de la síntesis de colesterol Defina: cetonemia. el ácido acetoacético rinde una coloración rojo burdeos.

La hipertrigliceridemia se asocia a disminución de HDL. . Entre las hipercolesterolemias primarias se señalan: La hipercolesterolemia familiar. . o secundarias a otras enfermedades. clorhidrato de magnesio. por el método enzimático y la determinación de HDL. Hipertrigliceridemia moderada de 200 a 499.. A partir de él se forman los ácidos biliares y las hormonas esteroideas. 5 niveles: Óptimo < 100 mg/dl.Precipitante para macro ensayos (PRECa) . previa precipitación de las otras lipoproteínas. la hiperlipidemia familiar combinada la hiperkilomicronemia. REACTIVOS A UTILIZAR: . ictericia obstructiva. la hipertrigliceridemia familiar. la disbetalipoproteinemia. el lipoteroidismo. su incremento también es considerado factor de riesgo coronario. INTRODUCCION: El colesterol es un componente importante de las biomembranas. En la presente práctica. La HDL realiza el transporte reverso del colesterol. obesidad central. Medir la absorbancia del Starndard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A) III. y el resto en la VLDL y HDL. regulando su fluidez. Son hipertrigliceridemias primarias.Precipitante para semimicro ensayos (PRECb) ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN DE COLESTEROL SANGUÍNEO Armar el siguiente sistema: COMPONENTE BLANCO PROBLEMA ESTÁNDAR Suero ----10 ul ----Estándar 200 mg/dl --------10 ul Reactivo enzimático 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar. y el LDL. II.Reactivo precipitante de HDL: ácido fosfotungstico. la gota. en el denominado síndrome metabólico.Reactivo Standard para colesterol 50 mg/dl. Es transportado principalmente por la LDL que es considerada aterogénica. la hiperlipidemia familiar combinada. hiperglicemia e hipertensión. limítrofe alto 200-239 y alto definitivo > 240 (Hipercolesterolemia > 200 mg/dl). El HDL colesterol. resistencia a la insulina. etc. el HDL.El III Panel de Expertos ha establecido los valores de referencia para el colesterol. normal a 40 a 59. alto o protector mayor o igual a 60. la hipercolesterolemia poligénica. el síndrome nefrótico. se realizará la determinación de colesterol sanguíneo. el hipotiroidismo. cirrosis biliar. En el colesterol se considera 3 niveles: Deseable < 200 mg/dl. el uso de anticonceptivos orales. severa 500 o más La hipercolesterolemia puede deberse a causas primarias o secundarias. el alcoholismo. Los triglicéridos an ayunas circulan unidas a las VLDL y son fuente de energía para los tejidos. La hipertrigliceridemia puede deberse a causa primarias o familiares.48 REUNION DE LABORATORIO N° 09 PRACTICA N° 19 DETERMINACION DE PERFIL LIPIDICO I. 3 niveles: Bajo o de riesgo < 40. Entre las secundarias: La diabetes. El LDL colesterol. . Son causas secundarias: la diabetes. En los triglicéridos se considera: normal menos de 150mg/dl. incubar 10 minutos de 20«25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. limítrofe de 150 a 199. de los tejidos hacia el hígado y es considerada antiaterogénica .

incubar por 5 minutos a 37 ºC o 10 minutos a 20«25 ºC. CALCULOS: Concentración HDL-Colesterol: Macro método : ¤ C ! 150 v A Desconocid o A Standard mg/dl Semi  micro método : ¤ C ! 175 v A Desconocid o A Standard mg/dl TG 5 Concentración de LDL-Colesterol: VALORES DE REFERENCIA: HDL-Colesterol: Hombres LDL  C ! TC  HDL  C  ?mg/dlA Mujeres (mg/dl) ¢ standard £ ¢ ! 200 v muestra ?mg/dl A ó ! 5. respectivamente. Leer las absorbancias del desconocido y del Standard. comparando con el blanco.17 v ¢ ¢ muestra standard ?mmol/l A ¤ ¤ £ . incubar por 10 minutos a temperatura ambiente.7 mmol/l ó 6. dentro de 60 minutos ( A).7 mmol/l Componente Macro Semi-micro Suero 500 ul 200 ul PRECa 1000 ul ----PRECb ----500 ul Mezclar bien. Centrifugar for 2 minutos a 10000 RPM.49 CALCULOS VALORES REFERENCIALES: Sospechoso: sobre 220 mg/dl Elevado: sobre 260 mg/dl DETERMINACIÓN DE HDL -COLESTEROL: Armar el siguiente sistema: ó 5. alternativamente por 10 minutos a 4000 RPM Después de centrifugar separar el sobrenadante del precipitado y determinar la concentración de colesterol: Componente Blanco Standard Desconocido Agua Destilada 100 ul --------Standard ----100 ul ----HDL sobrenadante --------100 ul Reactivo de trabajo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar.

Realice una breve explicación del rol de la LDL en la aterogénesis. Señale la importancia fisiológica del colesterol. 3. Realice una breve descripción de hipercolesterolemia familiar y su relación con la cardiopatía isquémica. Alteraciones del perfil lipídico en la diabetes y en el hipotiroidismo. CUESTIONARIO: > 65 45-65 < 45 150 mg/dl 190 mg/dl 1. 4. 6. 2. Señale las principales causas de HDL disminuido. Cuál es la importancia de la hipertrigliceridemia en la aterogenesis.50 Normal > 55 Bajo riesgo 35-55 Riesgo elevado < 35 LDL-Colesterol: Sospechoso: Elevado: IV. 7. 5. 8. Señale la importancia clínica del colesterol. . Cualés son las causas primarias de hipertrigliceridemia.

especialmente coronario. Se extraera el suero y a cada una se determinara el perfil lipídico siguiendo el método enzimático empleado en la práctica anterior. Las hiperlipidemias pueden ser primarias o familiares como la hipercolesterolemia familiar.  Dieta standard para ratas a base de maíz. La dieta es importante en el control de la hiperlipidemia. o Las diez restantes conformaran el grupo experimental. aumento de las grasas monoinsaturadas y polinsaturadas. Las cuales se dividirán en dos grupos en forma aleatoria. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procemiento  Tratamiento experimental.51 PRACTICA N° 20 HIPERLIPEMIA EXPERIMENTAL I. Se compararán los valores de colesterol. cada mesa obtendrá de cada rata control y experimental una muestra sanguínea de la cola antes del tratamiento y otra al final.  Reactivo precipitante para HDL.  Set de determinación de colesterol enzimático.  Sebo de pollo. Se dispondran de 20 ratas albinas adultas. La ATP III. las que recibiran adicionalmente 2 cc de aceite preparado de sebo de pollo. o Diez de ellas constituirán el grupo control y seguiran su dieta habitual agua y alimentos (maíz) ad libitum. INTRODUCCION: El aumento de los lípidos sanguíneos o hiperlipidemia constituye una situación metabólica de riesgo. HDL. El tratamiento será por 21 días. se busca mostrar como la ingesta de una dieta rica en grasa saturada con sebo de pollo por 3 semanas. Se considera aterogénicos el aumento del colesterol y de los tigliceridos.  Set de determinación de triglicéridos enzimático. III. sidrome nefrotico. hipotiroidismo. Y secundarias a otras patologías como la diabetes. la hipertrigliceridemia familiar etc. como parte del cambio de estilo de vida junto al ejercicio y control de peso. disminución de las grasas saturadas. Una dieta rica en grasas saturadas aumenta el riesgo de hiperlipidemia y consiguiente mayor riesgo coronario. bajo la supervisión del personal de la sección. LDL y triglicéridos entre ambas ratas. Con la ayuda del personal de la sección. ha establecido los criterios para una dieta adecuada que incluye disminución de la ingesta de colesterol. la hiperlipidemia familiar combinada. 1-2 representantes de cada mesa se encargarán del control de la dieta. REACTIVOS A UTILIZAR:  Ratas de peso aproximado de 200gr.    . Extracción de las muestras. puede producir el incremento de los lípidos sanguíneos. En el presente experimento. etc. II. Se determinará el perfil lipídico antes y después del tratamiento y se compararan los resultados.

5. Señale en detalle la dieta recomendada por la ATP III. 4. 3. CUESTIONARIO: 1. Qué alimentos son fuentes de fibra. Qué alimentos son ricos en grasas saturadas. 2. Qué alimentos son ricos en colesterol. Qué alimentos son fuentes de omega 3. 6. Qué alimentos son ricos en grasas monoinsaturadas. . para el tratamiento de la hiperlipidemia. Qué alimentos son ricos en grasas polinsaturadas. 7.52 IV.

con retardo marcado del crecimiento. . quimotripsina.Buffer fosfato 0. ataca a los residuos pequeños. REACTIVOS A UTILIZAR: . La elastasa tiene una especificidad amplia. . como la glicina. En el lactante con ausencia congénita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de activación de quimotripsinógeno y procarboxipeptidasa. alanina y serina. c) de origen intestinal: aminopeptidasas. quimotripsina.25% saturada con butanol. Son exopeptidasas: carboxipeptidasa y aminopeptidasa. triptofano y fenilalanina. elastasas.Acido tricloroacético al 10%. tripsina. elastasa y carboxipeptidasa. y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados en las heces). o degradación hasta aminoácidos en el tubo digestivo. b) de origen pancreático: tripsina. La quimotripsina es específica para los enlaces peptidicos de los aminoácidos sin carga como los aromáticos: tirosina.53 IV UNIDAD PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS: INTEGRACION DEL METABOLISMO REUNION DE LABORATORIO N° 10 PRACTICA N° 21 DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA I. Son endopeptidasas: pepsina. que provienen de la carne de los alimentos).Solución acuosa de ninhidrina al 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) I II III III.1 M pH 8. y es específica de los enlaces peptidicos sobre el lado carboxílico de residuos de aminoácidos básicos: lisina y arginina solamente. La tripsina. es activada por la enterocinasa en el intestino. . determinado los productos (aminoácidos) con ninhidrina II. . .1 M pH 8. La carboxipeptidasa hidroliza el enlace peptídico carboxiterminal en las cadenas polipeptidicas. La presente práctica tiene como finalidad demostrar la acción hidrolítica de las enzimas digestivas contenidas en el páncreas sobre la caseína o proteína de la leche. existe hipoproteinemia. La falta de enzimas proteolíticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las heces.Solución de extracto pancreático.Caseína al 1% en buffer fosfato 0. dipeptidasas. INTRODUCCION: La digestión de las proteínas. es un proceso complicado que se realiza con el concurso de diversas enzimas proteolíticas Entre estas enzimas proteoliticas tenemos: a) de origen gástrico: pepsina y renina.

Luego a los tubos de incubación del primer sistema.1 M pH 8. 4. Observe las variaciones que se produce en cada tubo. agregue gota a gota 1 ml de ácido tricloroacético al 10% agitando continuamente.54 Caseína al 1% Buffer fosfato 0. Después del tiempo de incubado tomar 0. Elabore un esquema con la digestión y absorción de proteínas y aminoácidos. IV. Escriba dos esquemas mostrando dos ejemplos de transaminación y dos de desaminación con los nombres de aminoácidos y alfa cetoácidos que participan. 3. II. durante 3 a 5 minutos. 2.5 ml. CUESTIONARIO: 1. Observa los cambios de color de cada tubo. . de cada uno de los tubos y trasladarlo a otro sistema numerado (I. III). Mezclar y llevar a un baño de agua hirviendo (franca ebullición). Explique el sitio de producción y la acción de las hormonas que intervienen en el proceso de digestión y absorción de los aminoácidos.0 Solución de extracto pancreático Agua destilada Pasos: * * * * * * * 1 1 1 --- 1 1 --1 --1 1 1 Mezclar y colocar al baño de agua a 37 ºC por 30 minutos. agregar 1 ml de solución de ninhidrina. Interprete todos los resultados encontrados en la práctica y explíquelos usando algunos dibujos. En este nuevo sistema.

con actividad antioxidante y antitripsina que disminuye el apetito y dificulta la digestión de las proteínas.Solución de ninhidrina 0.5 0. II. b. c.2 II 2.5 III 2. la alfa-1 antitripsina fecal (1-AT-Fecal) que es una glicoproteína.5 0. Es interesante también que el aceite de semilla de algodón posea un pigmento.5 0.2 IV 2. Mezclar y centrifugar a 2500 rpm por 10 min. Después del tiempo de incubación: agregar a cada uno de los tubos 2 ml de etanol absoluto. secretada a la luz intestinal. efecto que desaparece cuando la soya es hervida. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0. Algunos alimentos en estado natural poseen componentes perjudiciales para la nutrición.Buffer fosfato 0.Etanol absoluto III.1 M pH 8. Digiere las proteínas desnaturalizadas y parcialemente digeridas. Por ejemplo el frijol de soja contiene un principio cuya actividad antitripsina dificulta la digestión de las proteínas. Incubar en baño maría a 37°C durante 1 hora.5 0.55 PRACTICA N° 22 INHIBICION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS: ACCION DE LA SOYA HERVIDA Y CRUDA SOBRE EL EFECTO PROTEOLITICO DE LA TRIPSINA I. INTRODUCCION: La tripsina actúa como una endopeptidasa e hidroliza prácticamente toda clase de proteínas.Proteína de soya cruda 30%. REACTIVOS A UTILIZAR.25% saturada con butanol. el gisipol.Solución de tripsina 20 mg%. Esta sustancia de naturaleza peptídica es inactivada por el calor.Proteína de soya hervida 30%.5 - . . La finalidad del siguiente experimento es demostrar el efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre el efecto proteolítico de la tripsina.0 Proteína de soja cruda 30% Proteína de soja hervida 30% Solución de tripsina 20 mg% Pasos: a. . .5 0. El ovomucoide de la clara de huevo inhibe también de manera enérgica la tripsina. .0. ello explica en parte que el valor nutritivo del frijol de Soja aumenta considerablemente si se coce a ebullición por varios minutos.Los extractos de páncreas poseen también un péptido inhibidor de la tripsina. I 2.5 0.1 M pH 8. con mayor rapidez que las originales desdoblándose en polipéptidos de peso variable y algunos aminoácidos. . .

f. Por qué razón el ovomucoide de la clara del huevo inhibe la acción de la tripsina. e. Anotar los resultados. IV. II. 3. ¿Qué es el gisipol y cómo actúa en su acción antioxidante? Con dibujos represente la práctica realizada. III. Explique con sus propias palabras cuál cree que es el objetivo de la práctica que realizó. IV colocar 1 ml de sobrenadante de los tubos respectivos del paso anterior y agregar 1 ml de ninhidrina 0. En otra serie de tubos numerados I .56 d. Someter los tubos a temperatura de ebullición del agua utilizando baño maría durante 5 minutos. .25%. CUESTIONARIO: 1. 2. 4.

insuficiente ingestión de proteína. regulación del metabolismo. Agammaglobulinemia y la analbuminemia son cuadros demasiado raros. FUNDAMENTOS DEL METODO Determinación de Proteínas Totales: Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico. regulación del equilibrio hídrico. Las cifras de proteínas plasmáticas totales pueden aumentar (hiperproteinemia) con cociente A/G normal en la hemoconcentración.6 a 3. En el suero solo albúmina y globulina . respecto del Blanco del reactivo. en la gastroenteropatía exudativa con pérdidas fecales de proteínas. INTRODUCCION: Las proteínas plasmáticas son importantes para el organismo porque realizan diversas funciones: coagulación. ceruloplasmina. haptoglobina. excreción. es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra. en la macroglobulinemia de Waldenström.. con inversión de A/G por aumento de las globulinas: en el mieloma múltiple. II. inmunodifusión o inmunoelectroforesis.Las fracciones globulínicas contienen varias proteínas específicas: inmunoglobulinas.8 g/dl y globulinas: 2. Los bajos niveles de albúmina pueden ser debidos a: incrementadas pérdidas de albúmina en la orina. por el método colorimétrico. El origen de las proteínas plasmáticas es hepático con excepción de las globulinas gamma que se forman en las células plasmáticas. para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540nm. en el kala-azar. Reactivo EDTA/Cu Reactivo BCF . defensa contra las infecciones. La presente práctica tiene por finalidad determinar las concentraciones séricas de proteínas totales y fraccionadas en personas normales y/o con procesos patológicos.5 a 4. en medio tamponado a pH3.9 g/dl de las cuales albúmina: 3. etc. El aumento de absorbancia a 625 nm. etc. Las proteínas plasmáticas por métodos químicos se clasifican en albúmina. Determinación de Albúmina: La albúmina reacciona específicamente sin separación previa con la forma aniónica de la bromo Cresolsulfon Ftaleina (BCF).1 a 7.57 REUNION DE LABORATORIO N° 11 PRACTICA N° 23 CUANTIFICACION DE PROTEINAS SERICAS TOTALES Y FRACCIONADAS I. disminución de la formación en el hígado como en la cirrosis. en presencia de un exceso de colorante. REACTIVOS A UTILIZAR. La disminución de proteínas totales (hipoproteinemia) son generalmente asociadas con HIPOALBUMINEMIA que a su vez están acompañadas con pequeños cambios en las globulinas. en medio alcalino. conservación del equilibrio ácido básico.8. globulina y fibrinógeno. en las colagenopatías. La concentración sérica de las proteínas totales es de 6.1 g/dl. la transferrina. cuya intensidad es provisional a la concentración de proteínas totales en la muestra. que se pueden determinar por electroforesis. etc. transporte.

(g/dl). Leer en espectrofotómetro a 625 nm o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo CALCULOS DE LOS RESULTADOS : Alb.58 III. S (Standard) y D (Desconocido). 1 ml.Alb. llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo.0 Mezclar e incubar 10 minutos a 37rC.0 Desconocido 0. Mantener los tubos entre 15 y 28 ºC durante 10 minutos. Leer las absorbancias a 540 nm.(g/dl) Relación A/ ! ¥ VALORES DE REFERENCIA: Albúmina = 3.01 ----1.(g/dl) Albúmina (g/dl) ! D v f f! S Albúmina(g/dl) PT. PROCEDIMIENTO: En tres tubos de fotocolorímetro marcados B(Blanco). 1 ml.2 .0 a 8. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Determinación de Proteínas Totales PROCEDIMIENTO: En tres tubos marcados B (Blanco). El color resultante es estable por lo menos 30 minutos. Mezclar con varilla.01 1. Reactivo BCF 1ml. ó 20 minutos a temperatura ambiente. S (Standard) y D (Desconocido).0 g/dl Determinación de Albúmina.8 g/dl Relación A/G = 1.2 ± 2. colocar: B S D Suero Patrón 10 ul Muestra 10 ul.5 ± 4. CALCULOS: FACTOR ! Concentrac ión Standard Absorbancia Standard  Proteina Total (g/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: 6. colocar: Componentes Muestra (ml) Standard (ml) Reactivo (ml) Blanco --------1.0 Standard ----0.

CUESTIONARIO: 1. 4. 5. . Cuáles son las principales características de las proteínas plasmáticas. ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de las proteínas séricas totales y las fracciones albúmina y globulinas? ¿Qué importancia tiene determinar la relación albúmina/ globulina. 2. en clínica? ¿En qué se basa la determinación de las proteínas totales y fraccionadas en nuestro experimento? Elabore un esquema sobre el proceso fisiopatológico de un edema.59 IV. 3.

algunas enzimas. glomerulonefritis focales proliferativas.85% a una concentración final de 25 mg/ml. febril. la cantidad es pequeña alcanzando máximo de 150 mg en orina de 24 horas.5% (en agua destilada) Cloruro de sodio 0. sin que exista evidencia de lesión renal. INTRODUCCION: La orina normal contiene una pequeña cantidad de proteínas solubles (albúminas. nefropatía tóxica. Se diluye con cloruro de sodio 0. Standard de proteína: Pueden usarse suero claro normal de concentración conocido o un suero control adquirido comercialmente. Las proteínas son casi completamente absorbidas en los túbulos. Son causas de proteinuria Renal: glomerulonefritis difusa. Si aparece un precipitado o enturbamiento se puede deber a la presencia de proteínas o fosfatos. La proteinuria fisiológica (proteinuria ortóstatica) se presenta después de ejercicios y de permanecer largo tiempo en posición de pie. moléculas proteicas de variado tamaño incluyendo las más largas. Añadir: Solución de ácido acético al 2% IV gotas Si desaparece la turbidez. Extrarrenal: proteinuria ortostática. etc. La proteína de Bence Jones está constituída por las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas que constituye la proteína monoclonal. III. nefropatía diabética.85%. Esta dilución debe ser preparada el mismo día. II. En el mieloma múltiple y macroglubinemia de Waldestrom.60 PRACTICA Nº 24 DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE PROTEINAS EN ORINA I. Las proteínas de peso molecular relativamente bajo y de pequeño tamaño pasan primero a través de los glomérulos injuriados. La proteinuria puede ser renal o extrarrenal. tuberculosis renal. mieloma múltiple. riñón poliquístico etc. gravídica. 12. Acido acético al 2%. menos de 10 mg/dl. hemoglobina. El fibrinógeno es una molécula muy larga y escapa solo en enfermedad renal severa.0 Someter a ebullición por 1 minuto. La presente práctica tiene por finalidad determinar la presencia de proteínas en la orina y de cuantificarlas en caso que estén presentes en casos normales y en estados patológicos. Acido tricloroacético. COMPONENTE (ml) TUBO Muestra de Orina 5. albúmina. escapan en el filtrado de forma que los túbulos son incapaces de captar la gran cantidad de proteínas y resulta una masiva proteinuria. se trata de proteínas. . se ha hace más intensa o se forma un precipitado. síndrome nefrótico. se trata de fosfatos que se han disuelto en medio ácido. Si la turbidez persiste. aparece la proteína de Bence Jones. nefropatía lúpica. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LAS PROTEÍNAS EN ORI NA: Coagulación por el calor. por ejemplo la proteína de Bence Jones. Cuando el glomérulo es dañado por alguna enfermedad.). luego las globulinas. en la eclampsia. REACTIVOS A UTILIZAR.

CALCULO: Desde que 4 ml de orina se trata igual que un standard de 4 ml conteniendo 25 mg/100 ml entonces: Calcular de la siguiente manera: Absorbancia problema ± Absorbancia blanco x 25 = mg/100 ml. Leer el standard (I) calibrando con agua destilada y luego a la lectura del problema (II) restar el blanco de la orina (III).5% I 4. 3.0 1. . 2.0 III 4.= proteína total de orina de 24 H en mg. mg/100 ml orina x 100 IV. y leer en fotocolorímetro con filtro (420 um). En qué consiste el método de Heavy para la determinación de proteínas ¿Cuál es el mecanismo por el cual un paciente con glomeruloesclerosis elimina mucha proteína por la orina? Señale algunas causas de proteinuria fisiológica y patológica. 5. NOTA: Antes de leer los tubos deben ser mezclados totalmente evitando que burbujas de aire puedan interferir con la lectura. ¿Cómo diferencia usted un precipitado en un tubo de ensayo que no c orresponde a proteínas en orina? Señale algunos tipos de proteínas anormales que pueden ser encontradas en la orina. CUESTIONARIO: 1.0 1.0 4.0 II 1.61 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS EN LA ORINA : Método turbidimétrico de Heavy. orina Absorbancia del standard Volumen total en ml orina -----------------------------------. 4. En tres tubos marcados previamente agregar: COMPONENTES (ml) /TUBOS Solución standard de proteína Orina previamente filtrada Agua destilada Acido tricloroacético 12.0 Dejar reposar 5 a 10 min.

en la hepatitis o en el infarto de miocardio.. llamada también alanina aminotransferasa cataliza la reacción L-alanina + alfa-cetoglutarato . Las transaminasas están normalmente presentes en la sangre. En la presente práctica la glutámico pirúvico transaminasa (GPT) es determinada agregando suero a una solución bufferada conteniendo ácido alfa cetoglutarato y L-alanina y el ácido pirúvico formado. estas enzimas son liberadas dentro de la corriente sanguínea y pueden elevar sus niveles. VALORES DE REFERENCIA: Hasta 29 U/l a 30 ºC Hasta 45 U/l a 37 ºC .Piruvato + L . II. particularmente en el hígado y corazón. INTRODUCCION: La transaminasa glutámica pirúvica.0 Volumen de muestra (ml) 0. REACTIVOS A UTILIZAR. Reactivo para SGTP:  Buffer TRIS pH 7. producto resultante después de la incubación. Cuando se produce destrucción tisular de estos órganos como sucede por ejemplo. se mide colorimétricamente por reacción con dinitrofenil hidrazina en medio alcalino. hasta por tres minutos. CALCULOS: Actividad ALAT (UI/l) = A/min x 1768 Nota: de las absorbancias. Con la aspartato transaminasa.glutamato. estas enzimas proveen un medio de interconversión de proteínas e intermediarios metabólicos de los carbohidratos y hacen disponibles las reservas proteicas almacenadas en el hígado al ciclo del ácido cítrico. Leer la absorbancia inicial (A1) a 340 nm.5  a-cetoglutarato  L-alanina  LDH  NADH III. sacar diferencias y determinar una media que luego se multiplica por el factor determinado..62 PRACTICA N° 25 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ALANINA AMINOTRANSFERASA SERICA (ALT) o TRANSAMINASA GLUTAMICO PIRUVICA (SGTP) I.1 Mezclar y transferir a la cubeta del espectrofotómetro. Incubar 60 segundos a la temperatura de reacción. Repetir las lecturas a intervalos de 60 segundos. relativamente en bajas concentraciones pero en los tejidos están presentes en grandes cantidades. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Reactivo reconstituido (ml) 1.

6. Cuál es la utilidad práctica de la utilización del dosaje de transaminasas. ¿Cuál es la importancia metabólica de la transaminasa glutámico pirúvico? 3. Diga usted en que consiste el mecanismo de transaminación. ¿Cuál es la ubicación intercelular de las TGP y TGO? 5. . 2. TGO-S algunas veces separadas y otras veces juntas. CUESTIONARIO: 1. Haga un esquema de una transaminación.63 IV. ¿Cuáles serían las razones para solicitar. en el diagnóstico diferencial clínico? 4. colocando los nombres de las moléculas que participan.

. salen de las células y funcionan fuera de ellas.25 Standard 0. Leer a 505 nm.1 0.1 0.15 0. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente.4N (NaOH 0. las enzimas se sintetizan en las células y en la mayoría de los casos ejercen su función en su interior.1 0. Armar el siguiente sistema: Tubo 1 2 3 4 5 6 Agua Destilada (ml) 0.40 0. Otras enzimas.35 0. INTRODUCCION: En condiciones normales.4N diluido con agua destilada 1:10) Mezclar y reposar por 15 minutos a temperatura ambiente antes de leer. la glutámico pirúvica (TGP) y la glutámico oxalacética (TGO) o aspartato aminotransferasa (AST). El color es estable sólo por 30 minutos. como es el caso de: Las enzimas del tubo digestivo.05 0.25 AST 0 22 55 96 150 212 Agregar 0. las dos suben nuevamente. sobre todo en la cogestión hepática. cuando sobreviene la mejoría clínica. sube al máximo entre las 12 y 48 horas y suele volver a lo normal a los 4 ó 7 días. presentes en cantidades muy bajas en el suero aun cuando en ciertas enfermedades suben considerablemente. En la clínica son importantes dos transaminasas.0 0. El tejido miocárdico es muy rico en TGO y el ascenso de esta enzima acompaña a los procesos destructivos del corazón. El ascenso es.4 Reactivo de color: 2-4 dinitrofenilhidrazina Standard: Buffer piruvato pH 7.4N III. preparar una curva de calibración para AST. pero tiene el inconveniente de elevarse en diversos cuadros. II. si aparece una recaída. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) : 1) CURVA DE CALIBRACIÓN: Antes de usar los reactivos por primera vez. aunque se hallan en todos los tejidos se relacionan preferentemente con los procesos de ³escape´ de enzimas del mi cardio o el hígado. en general. descienden en forma paralela y. a veces proporciona datos positivos en casos con datos electrocardiográficos de difícil interpretación.1 Sustrato AST (ml) 0.45 0. Agregar 5 ml de NaOH 0. una vez sintetizadas.1 0. es la determinación por método colorimétrico de una de estas transaminasas de importancia clínica como es la aspartato aminotransferasa. Las enzimas con actividad en el suero sanguíneo (las que intervienen en la coagulación. En las lesiones o hepáticas aumentan ambas transaminasas en el suero.1 0. éstas. La finalidad del presente trabajo experimental.64 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST) I.4 NaOH 0. REACTIVOS A UTILIZAR Sustrato AST: Buffer de DL-aspartato y -cetoglutarato pH 7. por ejemplo) y las enzimas de escape.20 0.10 0.50 0.5 ml de reactivo de color.30 0. proporcional a la extensión del infarto.

Agregar 5 ml de Na OH 0. Inmediatamente empezar el control de tiempo. 3. Haga un resumen de seis líneas sobre AST.Colocar 0. . . .Incubar a 37 ºC durante 5 minutos. CUESTIONARIO: 1. según instrucciones previas. .Al cumplirse los 60 minutos. exactamente.5 ml de reactivo de color. agregar 0.5 ml de sustrato AST en cada tubo. 2.1 ml de suero.Incubar a 37 ºC durante 60 minutos. .4 N Mezclar y dejar reposar por 15 minutos antes de la lectura. . . IV.65 Construir en papel semilogarítmico los valores de transmitancia en el eje vertical y en el eje horizontal las U/ml de AST 2) PROCEDIMIENTO DE LA MUESTRA (disponer de un tubo de ensayo): . ¿Cuál es la utilidad y el comportamiento en sus concentraciones de la AST en casos de infarto agudo de miocardio? Interprete y explique todo lo actuado en la práctica.Agregar 0.Obtener el valor de U/ml de AST a partir de la curva de AST de calibración. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente.

La concentración normal es de 12 a 14 g/dl en mujeres y de 14 a 16 g/dl en varones en nuestro medio y a nivel del mar. Hemoglowiener reactivo Tubos de vidrio Lancetas Pipetas ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: COMPONENTES STANDARD hemogloWiener Reactivo 5 ml Con pipeta limpia y seca. Standard de Hemoglobina. II. Buffer/Ferricianuro: comprimidos estabilizados de ferricianuro de potasio y buffer de fosfatos. de modo que en mujeres se considera si esta es menor de 12 g/dl y en varones. que también puede deberse a problemas en la maduración de los glóbulos rojos como la deficiencia de ácido fólico. El defecto enzimático en algunas de las etapas de síntesis del grupo Hemo. En este último grupo. que es sin duda uno de los exámenes más solicitados. produce disminución de su concentración dando lugar a la anemia por menor producción como en la anemia ferropénica. agregar: hemogloWiener Standard 20 ul DESCONOCIDO 5 ml ----Armar el siguient e sistema: III. una causa pueden ser las hemoglobinopatías por defecto en la síntesis de una de las cadenas (talasemias) o de cambios en la estructura de una de las subunidades por mutaciones que cambian un aminoácido por otro como en la hemoglobina S. da lugar a las diferentes tipos de porfirias. utilizando el método enzimático de determinación de hemoglobina. cuya función es el transporte de oxígeno. . INTRODUCCION: La hemoglobina es una hemoproteína. que puede tener también otras causas como la Policitemia Vera La OMS basa su definición de anemia en la concentración de hemoglobina. que termina con la adición del hierro por la ferroquelatasa. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración de hemoglobina en sangre de personas normales. Pero la hemoglobina puede también disminuír por pérdida de sangre como en las hemorragias o por hemólisis (anemias hemolíticas).66 REUNION DE LABORATORIO N° 12 PRACTICA N° 26 CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA I. menor de 13 g/dl. en niños existe variación con la edad. por diferentes causas. En la práctica médica es por ello importante determinar la concentración de la hemoglobina. Se sintetiza en la médula ósea por una vía común a la síntesis de porfirinas. tetramérica. En la hipoxia por altura por otro lado se produce aumento de su síntesis llevando a la policitemia. con dos subunidades alfa y dos beta. REACTIVO MATERIAL Y EQUIPOS Tensioactivo/CNX: ampollas autorrompibles conteniendo solución estabilizada de tensioactivo/CNX. La disminución de la síntesis de hemoglobina.

llevando el aparato a cero con Reactivo CALCULO DE RESULTADOS: Hemoglobin a (g/dl) ! D v factor factor ! Standard (g/l) S VALORES DE REFERENCIA: .0 g/dl IV. Mezclar y luego de 3 minutos leer en espectrofotómetro a 540 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520 -550). Haga un esquema con la estructura de la hemoglobina. . 2.67 Muestra (sangre total) ----20 ul Medir primero el Standard y luego usar la misma micropipeta.0 ± 16. Una anemia importante es la anemia de células falciformes: Haga un resumen de las causas de su etiología y su patogenía. enjuagando tres veces en el propio reactivo antes de agregar cada muestra. 4. el número de ellos y las interacciones del ión Fe++ dentro del grupo hemo.0 ± 18.Mujeres: 11. indicando sus aminoácidos importantes en cada polipéptido. Cuál es la más frecuente y cuántos tipos de anemia conoce.0 g/dl . CUESTIONARIO: 1. Qué es la anemia.Hombres: 13. Interprete y explique el procedimiento de la práctica. 3.

Si se lee después. denominada bilirrubina directa o conjugada. Este pigmento insoluble en agua es transportado unido a la albúmina. da color a las heces y ultrafiltra el glomérulo. La concentración sanguínea de bilirrubina total es de 1 mg / dl. Cada gramo de hemoglobina degradada origina 35 mg de bilirrubina. siendo en su mayoría bilirrubina indirecta.5 ml 2. por el método de Malloy Evelyn. donde el defecto limitante es la excreción. después de un proceso de captación y conjugación con dos moléculas de ácido glucurónico por la enzima bilirrubina glucuronil transferasa.Bilirrubina Standard.Diazorreactivo: Mezclar: 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo sulfanílico. que varían con la edad de presentación y también en cuanto a su gravedad La bilirrubina directa da una reacción inmediata con el diazorreactivo. que utiliza el diazorreactivo de Erlich.5 ml ----Desarrollador --------2. Directa Bil. habrá III. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total de las fracciones de bilirrubina en el suero o plasma de personas normales y con ictericia. habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta. y el origen de esta alteración obedece a causas de origen pre hepático. La hiperbilirrubinemia puede ser a predominio de la bilirrubina no conjugada como en las anemias hemolíticas o en los defectos congénitos de conjugación. . se convierte en una forma soluble.Desarrollador o solvente .68 CUANTIFICACION DE BILIRRUBINAS SERICAS I. . excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. II. Total Muestra (suero) 200 ul 200 ul 200 ul Agua destilada 2. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total y de las fracciones (bilirrubina directa e indirecta) en el suero de personas normales. REACTIVOS . sólo reacciona después de agregar alcohol a la mezcla. llevando el aparato a cero con agua destilada. o en las enfermedades extrahepáticas obstructivas. Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos. que es finalmente excretada con la bilis al intestino por un proceso de transporte activo. hepático y post hepático. La manifestación clínica más importante de las hiperbilirrubinemias es la ictericia. éste es convertido en biliverdina y luego en bilirrubina. leer en espectrofotómetro a 530 nm o fotocolorímtero con filtro verde (520-550 nm). La bilirrubina indirecta o no conjugada llega al hepatocito y se separa de la albúmina. La hemoglobina es liberada y se separa la globina del hem. INTRODUCCION: Los hematíes tienen una vida media de 120 días.5 ml Reactivo Sulfanílico 200 ul --------Diazorreactivo ----200 ul 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión. Luego de 5 minutos.Nitrito de Sodio . la indirecta. o de la bilirrubina conjugada en las hepatopatías. al cabo de la cual son destruidos en el sistema retículo endotelial. que no se excreta por orina. por el método enzimático de determinación de bilirrubina. Si lee antes.Reactivo sulfanílico . ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Bil.

2. ¿Cuál es la acción bioquímica que realiza cada uno de los reactivos utilizados en la práctica? 5. B. ¿Cuál es el comportamiento de las bilirrubinas en caso de una insuficiencia hepática. total . ¿Cuáles son las principales causas de hiperbilirrubinemia no conjugada? 3.Abs. CUESTIONARIO: 1. Directa . ¿Cuáles son las causas de hiperbilirrubinemia conjugada? 4.69 sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre CALCULOS: Bilirrubina total (mg/l) = (Abs. Blanco) x F Bilirrubina Directa (mg/l) = Abs.Abs Blanco. Por qué? .Bilirrubina Directa VALORES DE REFERENCIA: . Bil.) x F Bilirrubina Libre (indirecta) = Bilirrubina total . Elabore un esquema con los tipos de ictericia que se pueden producir durante el metabolismo de la bilirrubina.Adultos: o Directa: hasta 2 mg/l o Total: hasta 10 mg/l IV. ¿Cuál es el riesgo de aumento de bilirrubina no conjuda en el recién nacido? 6.

La presente práctica tiene por finalidad cuantificar las concentraciones séricas de ácido úrico en personas adultas normales y / o con alteraciones patológicas mediante el procedimiento químico de Folin-Dennis que se basa en la acción reductora del ácido úrico en medio alcalino sobre el ácido fosfotúngstico. policitemias. en alcalinidad. el resto se degrada y es eliminado como CO2 y NH3. II. Aproximadamente 80 % de esa cantidad es excretada por orina. Standar: solución de ácido úrico 100 mg/dl Uricasa: solución de uricasa mayor o igual a 3U/I Reactivo 4-AF/POD: frasco conteniendo más de 100 U de peroxidasa (POD). En el hombre. por otro. También existe hiperuricemia proveniente de la destrucción excesiva de células (material nuclear) en leucemias y linfomas. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento . En orina. más frecuente en hombres.Muestra: suero o plasma heparinizado . Como sucede con otros constituyentes séricos. enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm). colocar: B S D Standard 50 ul Muestra 50 ul Reactivo de trabajo 2. diferencia que desaparece después de los 45-50 años de edad.5 ml 2. o urea. Los varones tienen niveles 1 mg/dl más altos que las mujeres.5 ml Mezclar suavemente e incubar 15 minutos en baño de agua a 37 °C o 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). podemos encontrar concentra ciones incrementadas de ácido úrico sérico en la gota. del grado de eliminación de ácido úrico. INTRODUCCION: El ácido úrico es un producto de la degradación hepática de las bases nitrogenadas purínicas adenina y guanina. el pH ácido favorece la formación de ácido úrico no disociado y puede precipitar. En el plasma.70 PRACTICA N° 27 CUANTIFICACION DEL ACIDO URICO SERICO I. . los que se degradan y en un primer momento liberan los ácidos nucleicos de las proteínas. En las alteraciones renales severas son comunes los niveles altos de ácido úrico como resultado de una excreción disminuida. ocurre lo contrario. que circulan en la sangre (en el plasma y en los glóbulos rojos humanos) y es la orina su vía de excreción. etc. la uricemia se incrementa después de la ingestión de nucleoproteínas con los alimentos. que es el más común de los desórdenes del metabolismo de las purinas. el ácido úrico alcanza una concentración de 4 a 6 mg/dl. Al pH sanguíneo predomina la forma desprotonada o urato. la concentración de ácido úrico en suero o plasma depende de un neto balance entre el grado de síntesis de purinas y fraccionamiento de nucleoproteínas por un lado y.5 ml 2. III. Reactivo de fenol. En condiciones patológicas. Un adulto normal produce unos 500 mg de ácido úrico por día.En tres tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas marcadas B (Blanco). cantidad que puede incrementarse con una dieta rica en purinas. llevando el aparato a cero con el blanco. Retirar. S (Standard) y D (Desconocido). a pH menores predomina la forma protonada no disociada o ácido úrico. La cantidad de uratos excretados varía normalmente de 250 a 750 mg / 24 hrs. REACTIVOS A UTILIZAR.

4. ¿Cómo explica el uso del alopurinol en el tratamiento de la gota? ¿Cuál es el proceso de la artritis y de la formación de los tofos en la gota? Explique por qué existe hiperuricemia en las enfermedades de leucemia. 5. se observan los siguientes rangos de valores: Hombres: 26-60 mg/l Mujeres: 20-50 mg/l Los valores de ácido úrico varían de acuerdo a la edad. IV. 3. el sexo y las diferentes dietas. incluso se ha observado una variación estacional. Cómo se sintetiza el ácido úrico. con ingesta normal de proteínas. 6. . Cuál es la fisiopatología de las hiperuricemias.71 - CALCULO DE RESULTADOS: Acido Urico (mg/dl) ! D v f donde " f " ! 100 mg/dl S - VALORES DE REFERENCIA: En adultos normales. CUESTIONARIO: 1. 2. Y dónde se realiza esta síntesis. Señale la deficiencia parcial enzimática que ha sido encontrada en algunos pacientes con gota.

y es excretada en una cantidad casi constante.0 mol/l . aumenta en el cuerpo humano fundamentalmente por síntesis. El clearence de creatinina normal es mayor de 100 ml / min. sexo o ejercicios. La concentración de creatinina en suero no es afectada por la dieta. Aproximadamente 2% de la creatina fosfato muscular es convertida en creatinina diariamente. La creatinina es fácilmente difusible y es igualmente distribuida en el agua corporal. ya que los niveles de creatinina sérica dependen del grado de excreción. La concentración normal en suero varía de 0. aunque una pequeña cantidad pre formada es ingerida con los alimentos. Usando métodos enzimáticos para determinar específicamente creatinina y comparando con los valores obtenidos por la reacción de Jaffe en personas normales y nefriticos se encuentra que la creatinina verdadera del suero comprende aproximadamente un 90% del total.16 mmol/l . INTRODUCCION: La creatina. Es excretada fundamentalmente por el riñón el cual clarifica el plasma de creatinina. La creatinina es un constituyente habitual de la orina. las variaciones fluctúan entre 0.Standard: Solución de creatinina 2 mg/l. precursora de la creatinina. Elevadas concentraciones se producen solamente cuando la función renal está muy alterada y aunque el mismo tipo de información acerca del diagnóstico y pronóstico se obtiene por la determinación de nitrógeno ureico o creatinina.Reactivo 1: Hidróxido de sodio 0. siendo la producción endógena constante. La cantidad eliminada por las personas del sexo masculino generalmente es más grande que en las de sexo femenino. mientras que en eritrocitos sólo corresponde a un 40%.1. las que pueden ser de origen pre renal como el shock o la insuficiencia cardíaca. como las glomerulonefritis o la nefropatía diabética o post renal. renal. . El suero es depurado de creatinina en el riñón por filtración glomerular proporcionando una buena base para el test de clearance. como las uropatías obstructivas La creatinina en medio alcalino reacciona con el ácido pícrico para dar un tautómero de picrato de creatinina de color anaranjado (reacción de Jaffe).Reactivo 2: Acido pícrico 4. Esto. edad. REACTIVOS A UTILIZAR.4 mg /100 ml. La creatininuria es determinada mediante el método enzimático. La determinación de hace de ordinario en un filtrado libre de proteínas obtenido a partir del suero. la cual puede alterarse por diversas causas. hace remarcable la necesidad de usar suero y no sangre total para la determinación de creatinina por el método colorimétrico.5 a 1. II. La creatinina urinaria disminuye en la insuficiencia renal y es útil para medir el grado de filtración glomerular y lo poco que es transferido a través de las células tubulares. la cantidad total depende de la masa muscular. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento III.72 REUNION DE LABORATORIO N° 13 PRACTICA N° 28 DETERMINACION DE CREATININA SERICA EN PERSONAS SANAS Y NEFROPATAS I. 9 . La determinación de creatinina tiene utilidad en la práctica médica para la evaluación de la función renal.5 g/24hs. La creatina fosfato se forma en los miocitos y es un compuesto importante como fuente de energía en la contracción muscular. esta última determinación se prefiere porque proporciona mayor información relacionada con el estado de la función renal. . catabolismo de proteínas.

Incubar exactamente por 2 minutos y leer A2.1 mg/dl 0. ¿Qué información o presunción obtiene al dosar la creatinina sérica? ¿Por qué se prefiere la determinación de creatinina urinaria a la de nitrógeno ureico? Interprete y explique el procedimiento de la práctica. Explique por qué se incrementa la creatinina en tres estados patológicos que conozca. 4.73 PROCEDIMIENTO En caso de que la muestra a utilizar sea en suero. S (Standard). Incubar 5 minutos a 20-25 °C/30 °C/37 °C. A que se denomina clearence de creatinina y que importancia tiene.6 ± 1.73m2A ! mgcreatinina mlOrinav mlorina/24h mgcreatinina ml suerov 1440 /100 VALORES REFERENCIA: DE SUERO/PLASMA: Mujeres Varones ORINA: Mujeres Varones Clearance de Creatinina: Mujeres Varones IV. CUESTIONARIO: 1.73 m2 . ¦ ¦ Standard(mg/dl)Av 50 v? A Standard 0. Incubar 1 minuto a 20-25 °C y leer A1. su determinación. Haga dibujos del procedimiento. M (Muestra) Componentes Blanco Standard Muestra Reactivo 1 1000 ul 1000 ul 1000 ul Muestra --------50 ul Standard ----50 ul ----Mezclar. 5.3 mg/dl 11 ± 20 mg/kg/d 14 ± 26 mg/kg/d 95 ± 160 ml/min/1. En tubos de ensayo marcados B (Blanco). luego agregar: Reactivo 2 250 ul 250 ul 250 ul Llevar el espectrofotómetro a cero con el blanco.9 ± 1.73 m2 98 ± 156 ml/min/1. 3. Mezclar. CALCULOS: ¨A Muestra (A2-A1) y ¨A Standard (A2-A1) CALCULOS: SUERO/PLASMA : ¦ ¦ Creatinina(mg/dl)! ORINA : Creatinina(mg/dl)! Standard(mg/dl)A v? A Standard A Muestra A Muestra CLEARANCE DE CREATININA : /100 ?mg/min/1. 2.

Reactivo hipoclorito. . Las concentraciones de urea en sangre total. La urea en el plasma es filtrada por los glomérulos renales. se informa el BUN según la siguiente fórmula: Urea x 0. La concentración de la urea en la corriente sanguínea es el resultado del balance entre el grado de degradación de las proteínas y el grado de eliminación por los riñones. pero en condiciones normales aproximadamente el 40% de este filtrado regresa p difusión a la sangre. o 3 minutos a 37 °C. Normalmente no tiene función útil en el organismo. Agregar a cada tubo: Reactivo hipoclorito (ml) 1. La finalidad de la presente práctica es cuantificar la uremia por el método de la ureasa. conociendo los valores de urea. es excretado casi enteramente por los riñones. son muy similares.00 Incubar 5 minutos a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C). Los valores normales de urea en suero (como nitrógeno ureico sanguíneo o BUN) es de 9 ± 19 mg/100 ml.00 1. Este método es altamente específico y aunque está basado en reacciones de urea. en personas normales y / o con procesos patológicos.14 = UREA En sentido inverso.Reactivo de salicilato.00 1.00 Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente (20 a 25 °C) o 5 .01 Standard (ml) ----0. II. es convencionalmente reportado co nitrógeno ureico.Solución standard III.00 1. éste reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimétricamente. La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoniaco. Cuando el nitrógeno ureico es determinado por el método de la ureasa. El grado de azoemia depende de la extensión y tipo de lesión renal. es el principal producto final del catabolismo de las proteínas y se distribuye en todos los tejidos. . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento PROCEDIMIENTO Componentes Blanco Standard Desconocido Muestra (ml) --------0.Suspensión de ureasa. . La or importancia clínica de la urea viene del hecho de una elevada concentración sanguínea puede estar asociada con una mala función renal. suero o plasma. REACTIVOS A UTILIZAR. .01 ----Reactivo de trabajo (ml) 1. INTRODUCCION: La urea es sintetizada en el hígado. La uremia es determinada colorimétricamente por el uso de ureasa.00 1.74 PRACTICA N° 29 CUANTIFICACION DE UREA EN SANGRE I.4665 = Nitrógeno ureico sanguíneo Los riñones eliminan diariamente entre 20 a 40 gramos de urea. ésta transforma a la urea en carbonato de amonio y con la adición del reactivo de Nessler el amoníaco liberado forma un compuesto de color amarillo bruno cuya intensidad se mide en fotocolorímetro. Los valores de urea se mo reportan siguiendo la siguiente fórmula: Nitrógeno ureico sanguíneo x 2.

6. Señale las características comunes que se encuentran en los efectos enzimáticos hereditarios del ciclo de la úrea. 2.75 minutos a 37 °C.5 a 22. 3. 4. CUESTIONARIO: 1. 5. ¿Qué importancia clínica tiene para usted.7 mg/dl 7 a 14 g/24 hrs. : 4. Leer las absorbancias dentro del plazo de una hora CALCULOS: FACTOR ! 66 Absorbancia Standard Urea (mg/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: SUERO/PLASMA: Urea : Nitrógeno Ureico ORINA: Urea : Nitrógeno Ureico IV. . conocer las concentraciones séricas de úrea? ¿Qué influencia tiene la ingesta proteica sobre la concentración sérica de úrea? En relación a las concentraciones séricas de úrea y NH4+. ¿Qué alteraciones en las concentraciones séricas de úrea y NH4+ podrían encontrarse en el coma hepático? ¿Cuál es la importancia metabólica de la existencia del ciclo de la ornitina en el hígado de los seres humanos? ¿Cuál es la importancia metabólica que en el hígado humano exista una relación entre el ciclo de los ácidos tricarboxilicos y el ciclo de la ornitina? 10 a 50 mg/dl : 15 a 30 g/24 hrs.

5 III 4. La presencia de estos cetoácidos se debe fundamentalmente a los procesos de transdesaminación y desaminación del ácido glutámico (transdesaminación) que se estimula fundamentalmente y en mucha menor proporción por desaminación de la L-Alanina por la acción de la L-aminoácido.Homogeneizado de hígado o riñón de rata 10% y conservado en baño helado.4 .NaOH: solución 2N . II.Buffer fosfato 0.1M pH 7. REACTIVOS A UTILIZAR. Añadir ácido tricloroacético al 10% Mezclar y añadir agua destilada I 4.5 TUBOS DE ENSAYO II 4. INTRODUCCION: La remoción del grupo amino de las L-aminoácidos es el primer paso en la degradación metabólica general de estos compuestos (catabolismo). Esto es importante porque el L-glutamato es el único aminoácido en el hígado que experimentan desaminación oxidativa a una tasa apreciable y esta reacción se cataliza por la L glutamato deshidrogenasa. todo el nitrógeno amino proveniente de los aminoácidos que puede experimentar transaminación se puede concentrar en el glutamato.0 1.5 1. La finalidad de la práctica es demostrar los procesos de desaminación (oxidativa o no) que sufren los L aminoácidos en el hígado utilizando a la L-Alanina como un ejemplo de éstos y al 2-4 Dinitrofenilhidrazina como indicador de los cetoácidos formados provenientes de la desaminación.0 1. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente esquema de incubación: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.Acido tricloroacético al 10% . Puesto que la alanina es también sustrato para la reacción de glutamato transaminasa.0 3.0 1.1 M pH 7. .76 PRACTICA N° 30 DEMOSTRACION DE LOS PROCESOS DE DESAMINACION OXIDATIVA DE LOS L-E-AMINOACIDOS I. . Filtrar y medir a otros tubos previamente marcados: .5 1.5 1.2-4-Dinitrofenilhidrazina: solución 0.0 0.1% en HCl 2 N.L-alanina: solución 0.2M Agua destilada Homogeneizado de hígado Colocar en baño maría a 37°C durante treinta minutos.0 3.0 0. Si se agrega una determinada cantidad de L-alanina a un homogeneizado de hígado después de un período de incubación (30 minutos) podemos demostrar que se ha producido desaminación si encontramos determinada cantidad de cetoácidos (ácido pirúvico y ácido alfa-cetoglutarato) los que pueden ser identificados frente a una solución de 2-4 Fenihidrazina en medio alcalino. Dos sistemas enzimáticos de transaminación: la alanina piruvato transaminasa(ALT) y la glutamato alfa-cetoglutarato transaminasa (AST) catalizan la transferencia de grupos amino de la mayor parte de los aminoácidos para formar alanina a partir del piruvato o glutamato a partir de alfa-cetoglutarato.2M .0 3.5 III.0 0.4 Solución L-alanina 0.

0 4. de los resultados de su práctica de laboratorio? . ¿Cuál es la razón por la que se utiliza 2. NaOH 2N Dejar en reposo durante 10 minutos.0 1.77 COMPONENTES (ml) Filtrado 2.0 1.0 Señale los sistemas enzimáticos flavinodependientes que producen desaminación oxidativa de los aminoácidos.0 III 4.0 4. CUESTIONARIO: 1 2 3 4 5 6 I 4. Realizar las lecturas con el espectrofotómetro.4-Dinitrofenilhidrazina solución al 1% Mezclar y dejar en reposo durante veinte minutos.0 TUBOS DE ENSAYO II 4.0 4. IV.4-Dinitrofenilhidrazina en el sistema? ¿Cómo explica usted los resultados fotocolorimétricos obtenidos en los tres diferentes tubos de experimentación del sistema? ¿Cuál es la importancia biológica de la desaminación oxidativa de los aminoácidos? ¿Qué conclusiones puede establecer usted.0 1. De un ejemplo de desaminación oxidativa de un aminoácido.

Ciertas células sin vitamina C no son capaces de producir o mantener sustancias de importancia intracelular.2 mg/100ml. VITAMINAS Y MINERALES REUNION DE LABORATORIO N° 14 PRACTICA N° 31 DOSAJE DE VITAMINA ³A´ El instructivo de la presente práctica se les proporcionará durante la práctica respectiva. La única acción en el cuerpo es debido principalmente a que es una clase especial de agente reductor que influye en los procesos de óxido reducción. Los nivelas ² plasmáticos en una población bien alimentada varían entre 5. Se estima que una ingestión diaria de 2.5 mg de ácido ascórbico para niños y 7. En los leucocitos la concentración es mucho mayor que en el plasma (15 mg/100 g) de capa blanca leucocitaria. PROTEICOS. Las necesidades mínimas diarias de vitamina C son 10 mg y son preferibles 30 mg por día. Para ello es necesario que los. En el escorbuto no tratado. El principal resultado de tal deficiencia es el escorbuto. Se necesita también para la producción normal de fibrinas del tejido conectivo y de la sustancia del baso intercelular (por ello el aumento de fragilidad capilar en el escorbuto). dolor de las extremidades. Las intervenciones quirúrgicas dan lugar a disminuciones de 17 a 20% de contenido en el plasma y en glóbulos blancos.2 mg/100ml o en glóbulos blancos a 8 mg/100 g indican una deficiencia importante que puede significar cicatrización tardía o dehiscencia de las suturas. una enfermedad caracterizada por debilidad. lesiones en las encías y ligera anemia. Los síntomas son vagos y generalmente limitadas alteraciones del crecimiento de los dientes.ácido dehidroascórbico).5 mg para adultos es suficiente para prevenir síntomas de deficiencia. hemorragias subcutáneas y sangrado de encías. La corteza suprarrenal. Se presenta en alimentos frescos y en vegetales. el nivel plasmático de ácido ascórbico es inferior de 0. INTRODUCCION: La vitamina C o ácido ascórbico es hidrosoluble y antiescorbútica.78 V UNIDAD NUTRICION: REQUERIMIENTOS ENERGETICOS. Aunque no se conoce con seguridad sus funciones metabólicas precisas hay pruebas que señalan su requerimiento para el metabolismo de la tirosina . el escorbuto clínico tarda 6 meses en manifestarse. PRACTICA N° 32 DOSAJE DE VITAMINA ³C´ I. Antes de la intervención quirúrgica las cifras plasmáticas inferiores de 0. Casos subclínicos de deficiencia de vitamina C son muy comunes entre la población pobre de las grandes ciudades. En caso de alimentación deficiente. alimentos antes del cocimiento contengan 70 mg de vitamina C. Esto puede ser hecho con un simple aparato para medir la presión sanguínea con la cual la presión dentro de los capilares se incrementa por la constricción de . la hipófisis y el ojo son espacialmente ricos en vitamina C. Un excelente test clínico para la deficiencia de vitamina C es la determinación del promedio de resistencia capilar. La vitamina C es destruida rápidamente por el calor de cocimiento o la pasteurización.5 y 1.1 gm/100ml y en glóbulos blancos menos de 2 mg/100 g. Muchas de estas propiedades podrían depender de las propiedades reversibles de óxido reducción (redox) de esta vitamina (ácido ascórbico .

Agua destilada Reactivo de color combinado I II 1 0. Por 6'ste procedimiento el ácido ascórbico del plasma o sangre es oxidado a ácido dehidroascórbico. y Dejar los tubos en reposo por 30 min. y Leer en fotocolorimetro (540 nm).79 la vena del brazo. y Agregar 1. Esta sufre rearreglo molecular en ácido fuerte dando un compuesto rojo. Absorbancia se compara con patrones adecuados de ácido ascórbico. II. Mezclar: COMPONENTES (ml) TUBOS Liquido sobrenadante de paso anterior Acido tricloroacético al 10% Standard de ácido ascórbico.Blanco NOTA: y El ácido ascórbico es muy inestable.1 de la solución tioúrea.5 0. y Acido sulfúrico al 85%. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento y Extraer más o menos 5 mi de sangre de la flexura del codo e introducirlos en frascos previamente oxalatados.5%. El ácido ascórbico es estable durante varias horas en el filtro. Transcurrido el tiempo se enfrian los tubos en baño de hielo durante 5 minutos. y Reactivos 2. y Standard de ácido ascórbico 2 ml/100ml. y Reactivo de color.5 = mg/dl Abs. 2 mi de ácido sulfúrico al Q5°o. se tapan en tubos con papel parafinado y se colocan en baño de agua a 56°C durante una hora. REACTIVOS A UTILIZAR: y Acido tricloroacético al 10& (P/V). mezclando: 5 ml del reactivo 2.Blanco x 2. Para la determinación del ácido ascórbico en sangre. . enfriando el hielo. por el método colorimétrico de Roe y Ructher modificado. y Mezclar nuevamente. CÁLCULOS: Abs. y Agregar a cada tubo lentamente y mezclando. El propósito de la siguiente práctica es determinar la concentración de ácido ascórbico en el plasma de personas adultas normales o carenciales. Hemorragias que en la piel aparecen con excesiva frecuencia podrían indicar fragilidad capilar. el acide dehisroascórbico se transforma rápidamente en ácido dicetoglucónico que se une a 2 dinitrofenilhidracina -4 para formar una hidrazona de color pardo.4 III 0. Del Standard . y El ácido ascórbico utilizado para preparar la solución patrón debe ser de grado analítico.). y Los valores inferiores a 0.2 mg/dl pueden preceder en 2-3 meses a la aparición de un escorbuto clínico.5% III. Se utilizará el método de Roe y Kutcher modificado para la cuantificación del ácido del ácido ascórbico en sangre. total o plasma.5 0. En un pH ácido.4 0. Se prepara en el mismo dia de uso. Del problema . Por ello es indispensable separa el plasma de ids glóbulos rojos y realizar el análisis sin tardar.6 ml de agua destilada.4 dinitrofenilhidracina. 0.4 - y Se mezclan los reactivos. esta debe ser fresca (no después de 30 min. y Oxalato de litio al 6. y Solución de sulfato cúprico al 1. La excreción normal diaria de vitamina C en orina de adultos varia entre 10 y 30 mg.1 mil de la solución de sulfato cúprico.4 dinitrifenilhidracina al 2% en ácido sulfúrico 9 N.5 0. y Solución de tioúrea al 10% en etanol al 50%. y 0.5 0.

CUESTIONARIO 1. ¿Por qué las necesidades de vitamina C deben ser satisfechas en la dieta normal? 2. Mencione algunas funciones metabólicas importantes del ácido ascórbico. hipertiroidismo. Desde el punto de vista metabólico ¿Cómo explica que los requerimientos de vitamina C sean mayores en el curso de las enfermedades infecciosas. embarazo. ¿Qué relaciones metabólicas podría mencionar entre el ácido fólico y Fe+++ en la producción de anemia en el escorbuto? 3.80 IV. lactancia e intervenciones quirúrgicas? 4. . ¿Cómo explicaría que las dosis superiores a 1 g/dia pueden ocasionar hemolisis en portadores de deficiencia eritrocitica de G-6-P-deshidrogenasa? 5. neoplasias.

5 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) --------Muestra (ml) 0. De la misma manera. etc. etc. etc.05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos. fiebre reumática. La deficiencia de hierro pasa por tres estadios:  Deficiencia de los depósitos de hierro. INTRODUCCION: El hierro sérico es importante en el organismo porque es componente esencial de la hemoglobina encargada del transporte de oxígeno.y la mioglobina. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm .0 Reactivo color: ferrozina. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACION DE HIERRO Armar el siguiente sistema Componentes Blanco (suero) Muestra Buffer Acido (ml) 2. que se encuentra dentro de las células. dado que no sólo es relativamente insoluble. sino que además es tóxico.50 0. hidroxilamina clorhidrato. el hierro en uso. así como de otras hemoproteínas como los citocromos ± componentes de la cadena respiratoria. dado que un aumento en sus niveles se encuentra asociado a diversas patologías tales como destrucción aumentada de los glóbulos rojos.50 Reactivo color (ml) ----0.0. REACTIVOS A UTILIZAR: Buffer ácido: buffer acetato pH 4.81 REUNION DE LABORATORIO N° 15 PRACTICA N° 33 DETERMINACION DE HIERRO SERICO TOTAL Y TIBC I. que se encuentra en la hemoglobina. Buffer alcalino: buffer TRIS pH 8. lo que lleva a la disminución de la ferritina sérica  Disminución de hierro sérico. El hierro es absorbido en el intestino delgado como Fe2+ y su regulación ocurre a ese nivel y es transferido a la transferrina para su transporte sérico. hidroxilamina clorhidrato. II.5 2. aumento de Capacidad Total de Fijación de Hierro y disminución de la Saturación de Hierro  Anemia por deficiencia de hierro: microcítica hipocrómica. y el circulante. El contenido de hierro en el cuerpo humano se encuentra distribuido en tres formas: el almacenado. tumores. La evaluación de la concentración de hierro sérico es de gran utilidad. Solución Standard: Fe (II) en hidroxilamina clorhidrato 500 ug/dl III. Prácticamente todo el hierro corporal se encuentra unido a proteína. El hierro forma parte de los centros Fe-S de la cadena respiratoria. La capacidad de fijación de hierro (TIBC) aumenta en casos de anemias ferroprivas y disminuye en las hemocromatosis. su disminución se asocia entre otras patologías a problemas de absorción y almacenaje. defectos en el mecanismo de almacenaje. El 90 % de anemias en las mujeres es por deficiencia de Fe. enzimas y varios tipos de proteínas.

CUESTIONARIO: 1. 4.50 Muestra (ml) 0.50 0.00 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) 0.Muestra Abs. 2.50 0.Bl. 3. : : : 100 ± 400 ug/dl 250 ± 400 ug/dl 20 ± 55 % Señale al menos 5 funciones del hierro Causas de deficiencia de hierro Informe sobre estructura de la ferritina ¿Qué exámenes solicitaría para evaluar la deficiencia de hierro? ¿Qué importancia tiene medir la saturación de hierro? ©¨ § (ug/dl) ! Ferremia(ud/dl) I (ug/dl) ©¨ v 100 .Muestra Abs.reactivo Abs.muestra Abs. 5.50 Reactivo color (ml) ----0.standard Abs.Standard Abs.Bl. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm Calculos: UIBC (ug/dl) ! 500  TI v 500 Abs.Reactivo v 500 Abs.muestra % Saturación! Ferremia (ug/dl) TIBC (ug/dl) Valores de Referencia: TIBC: Hasta 6 años Sobre 6 años % Saturación IV.82 Cálculos: Ferremia (ug/dl) ! Valores de referencia:  Varones: 50 .Bl.Bl.160 ug/dl  Mujeres : 40-150 ug/dl DETERMINACION PARA TIBC (capacidad de fijación de hierro) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Muestra Muestra Buffer Alcalino (ml) 2.00 2.05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos.

Este tipo de alcalosis que es de tipo respiratorio resulta por hiperventilación que puede ser causada a su vez por: a) drogas. 6) dieta alta en grasas o en ayuno prolongado el cloro es desplazado por los cuerpos cetónico por sobre producción de estos.Reactivo de Color 2. después de incubar 5 minutos a oscuras.83 PRACTICA N° 34 DETEMINACION DE CLORO. No exponer a la luz CALCULOS Lectura tandard   ! 355 v Lectura uestra ?mg/dlA  . 5) en la diabetes mellitus no controlada.Estándar de cloruro: 355 mg/dl III. c) algunos tipos de enfermedad tubular renal con acidosis pueden producir incremento del cloruro sérico.4. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES ESTANDAR PROBLEMA Estándar diluido 20 ul --Suero diluido --20 ul Reactivo de color 1 ml 1 ml Mezcla. SODIO Y POTASIO EN EL SUERO DE PERSONAS SANAS Y EN ESTADO PATOLOGICO DETEMINACION DE CLORO I. Medir en el transcurso de 60 minutos la absorbancia de problema y estándar. todas estas alteraciones tienen exceso de C02 (que produce hipocloremia). INTRODUCCION: El ión cloro comprende aproximadamente el 65% del total de aniones del liquido extracelular. d) excesiva ingestión de ClNH4 (cloruro de amonio) produce acidosis que puede ser seguida de altos niveles de cloruro sérico. En el suero normal el cloruro se encuentra en concentraciones que varían entre 100 y 106 mEqL. 7) en hiper o en s hipofunción de las glándulas adrenales (corteza). 2) parálisis de los músculos respiratorios. fiebre. II. tensión de oxígeno disminuida (altura). Se puede presentar concentración de cloruro disminuido (hipocloremia) en hipoventilación causada por: 1) depresión del sistema nervioso central. La concentración de cloruro se puede incrementar (hipercloremia) en muchos casos como resultado del déficit primario de C02.6 TPZ existente parcialmente como complejo Hg(II)+Sulfato de Hierro . igualmente sucede en el ClK. ansiedad. 3) enfermedad pulmonar. De todos los aniones es uno de los de más baja concentración en el líquido intracelular. b) enfermedades que producen estímulo del centro respiratorio como: histeria. REACTIVOS A UTILIZAR: . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Antes de la determinación el estándar y las muestras de suero deben ser diluidas en relación 1/50 con agua destilada (20 µL de muestra/1 ml de agua). 4) enfermedad renal crónica.

¿Puede señalar cinco causas de hipercloremia? 4. la deficiencia acentuada del cloro en la enfermedad de Addison? 3. CUESTIONARIO: 1. ¿Puede señalar cinco causas de hipocloremia? 5 ¿Cual es la relación de las alteraciones de la cloremia con el equilibrio ácido básico? . (Convertir en mEq/l dividiendo entre 3.84 VALORES NORMALES : 335 . ¿Qué influencia tiene la Aldosterona en el metabolismo del cloro? 2. ¿Cómo explicaría usted.55) IV.383 mg/dl.

enfermedad renal con disfunción tubular. El estado clínico de hidratación es importante para evaluar el significado de los niveles séricos de sodio. Se puede encontrar incremento de sodio con hiperosmolaridad en individuos con deficiencia predominante de agua corporal. El ión sodio es importante en el mantenimiento del equilibrio ácido básico ya que constituye aproximadamente el 90% del total de cationes extra celulares. el sodio esta en equilibrio con el del líquido intersticial. como en el coma diabético. fístula intestinal. si el líquido ingerido es insuficiente por razones anormales.diariamente. por ejemplo en pacientes con diabetes insípida no controlada. sudor y saliva. cuando el líquido ingerido no es suficiente para eliminar la sobrecarga de solutos por el riñón. en diabetes mellitus no controlada. INTRODUCCIÓN Debido a la predominante concentración del ión sodio en el líquido extracelular éste influye sobre la presión osmótica que juega un rol preponderante en la distribución del agua entre el espacio extra o intra celular. Un adulto de 70 kg de peso contiene aproximadamente 80 g de sodio de los cuales 44 se encuentra en el % líquido extra celular y el 35% en los huesos. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante: Acetato de uranilo más acetato de magnesio  Reactivo de color: tioglicolatop de amonio  Standard de sodio: 50 mmol/l . alimentación nasogástrica con alto contenido de proteínas. En el hombre adulto hay cerca de 43 mEq de sodio intercambiable por kg. en pacientes con diarrea. La determinación del sodio de los fluidos biológicos se realiza sea por electrodo ión selectivo o menos frecuentemente por método colorimétrico II. El exceso de sodio se elimina por el riñón. Puede ocurrir deshidratación con sodio sérico elevado. El ion sodio es ingerido en los alimentos en combinación con el cloro fosfato. sulfato y otros aniones (sales). En el suero. es aparentemente inerte (no ionizable). La concentración sérica normal es de 135 a 145 mEq por L (310 A 340 mg%). El sodio se excreta casi exclusivamente en la orina. es el principal factor de regulación de este ion corporal y de sus concentraciones. pacientes con diarrea.85 DETERMINACION DE SODIO I. Como sucede con el agua corporal los valores varían inversamente con la grasa corporal. Del total de sodio corporal hay un 18% que fundamentalmente se encuentra en los huesos. Son ingeridos cerca de 3 gr. con pequeñas diferencias debido al equilibrio de Donnan. Se observan concentraciones bajas si las concentraciones de sodio exceden a las del agua. El riñon puede regular la excreción de sodio y agua por lo tanto. En condiciones anormales pueden ser muy considerables las pérdidas de agua por el sudor u otr s o fluidos. tratado sólo con insulina y solución salina. hay por lo tanto un 82% del total que es capaz de recambio y participa en las reacciones fisiológicas. El suero o plasma contiene más del 90% del sodio total de la sangre. en mujeres hay sólo 39 mEq por kg. Pequeñas cantidades aparecen también en las heces. La cantidad presente dentro de la célula no puede ser medida sin biopsio del tejido. Tales valores no dan información acerca del volumen y distribución de la cantidad total presente ni de la cantidad intracelular existente. La concentración sérica es representativa de toda la concentración celular. por peso corporal. Diariamente y tiene acceso al suero por difusión a través de la mucosa intestinal o sea que cerca del 4% del sodio corporal total se recambia. Algunos pacientes con enfermedad cerebral. y en niños es mayor.

CUESTIONARIO: 1. incluye básicamente las concentraciones de esté ion? . ¿Qué semejanza existe en la absorción intestinal de este ion y la glucosa? 4. Señale las concentraciones séricas normales. Después de 5 a 30 minutos medir las absorbancias contra agua destilada a 405 nm CALCULOS: Factor: 150 /Lectura Bco Reactivo-Lectura Standard Na (mmol/l)= (Lectura Bco Reactivo-Lectura Muestra) x factor IV. Dejar reaccionar durante 30 minutos Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (PROCEDIMIENTO) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco de Standard Problema Reactivo Standard 20 ul Problema 20 ul Precipitante 1 ml 1ml Tapar los tubos y mezclar cuidadosamente. Dejar reaccionar durante 5 minutos Agitar fuertemente por 50 segundos. ¿Por qué la clasificación de deshidratación por alteración de la osmolaridad. ¿Cuál es el principal factor de regulación del ion sodio corporal? 3.86 III. ¿Cuál es la importancia biológica del ion sodio? 2. 5. Emplear el sobrenadante Precipitante 20 ul Sobrenadante 20 ul Standard Sobrenadante 20 ul Problema Reactivo de color 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar bien.

en íleo paralitico y anastomosis intestinal no funcionante. Bajo estas condiciones el potasio se eleva si el riñon no puede excretar esta sobrecarga. Aproximadamente 293 gr.9 mEq/L. Entonces el 2<26 del total del potasio corporal son recambiados diariamente. en intoxicación temprana con salicilatos. del cual el 98% es intracelular mientras que el 2% está presente en el liquido extracelular. así mismo en algunos casos de . Hiperpotasemia se puede encontrar en: Shock o falla circulatoria de cualquier causa. Se debe evitar la hemolisis en la toma de muestras de sangre porque el potasio puede ser liberado de los eritrocitos lisados. En los niños donde la ingestión de potasio es relativamente más grande. De potasio en forma de sal son ingeridos diariamente y recambiados con el potasio corporal. la excesiva destrucción de células del cuerpo y la utilización de proteínas para propósitos calóricos se acompañaría de pérdida de potasio celular. El potasio es rápidamente removido del líquido extracelular después que es ingerido.87 DETERMINACION DE POTASIO I. asi mismo en algunos casos de insuficiencia renal se encuentra elevada la concentración de potasio. pues la falta de esferoides adrenales provocan retención de potasio sérico. El déficit de potasio celular es reflejado en los hallazgos séricos y bajo estas condiciones la regla es hipopotasemia debido a la elevada excreción urinaria de cloruro de potasio. El potasio se pierde en el cuerpo principalmente en la orina aunque pequeñas cantidades son perdidas en la respiración insensible. Además de este rol pasivo. diarrea o fístula gastrointestinal segundo por excreción urinaria incrementada en individuos con anormalidades tubulares renales. en administración continua de glucosa endovenosa y terapia salina. en fístulas gastrointestinales y vómitos. el recambio diario es de 14%. en alcalosis con hiperventilación. Del sue el ro potasio es transferido el líquido intersticial antes de penetrar a las células o al filtrado glomerular a través de la membrana de los capilares glomerulares del riñón. Existe también una pérdida lenta de potasio de los glóbulos rojos hacia el suero cuando la sangre permanece guardada. en adultos masculinos hay aproximadamente 46 mEq de recambio de potasio. (3300 mEq) de potasio en un adulto de 70 kg. La concentración de potasio intracelular varia con los cambios del agua que gene ralmente acompaña a las alteraciones de los niveles de sodio extracelular. en mujeres solamente 40 mEq por kilogramo de peso. en la diabetes no controlada. INTRODUCCIÓN El potasio es el principal catión intracelular y por lo tanto es un factor importante de la presión osmótica que determina la distribución de agua entre las células y el líquido extracelular. Los niños tienen relativamente menos contenido de potasio por kilogramo de peso debido a que la relación de agua intracelular/extracelular es menor que en adultos. varían entre 4-5. El potasio del hueso. cerebro y de los glóbulos rojos se recambia más lentamente que en otros órganos. Déficit de potasio corporal puede resultar en: Pobre ingestión de alimentos. esto es debido a que la excreción de potasio por orina se mantiene constante. El 95% del total del potasio corporal es intercambiable aunque el grado de recambio de cada tejido varía en los diferentes órganos. en hiperfunción adrenocortical o sobredosis de cortisona o ACTH. en recién nacidos los niveles son algo más altos. influye activamente en el metabolismo celular ya que es cofactor de muchas reacciones enzimáticas intercelulares. en hipoventilación tanto central como periférica cuyo incremento de potasio es frecuente. se produce intercambio entre el sodio intersticial y el potasio intracelular.5 -5-3 mEq/L. el potasio es liberado de las células y excretado dando como resultado hipopotasemia. en insuficiencia de la corteza adrenal. en deshidratación. Con ingestión calórica inadecuada y la utilización de proteínas celular para propósitos calóricos. Se produce hiperpotasemia con pérdida intracelular de potasio cuando la permeabilidad de la membrana celular está alterada por lesión tisular. La concentración de potasio en el suero de personas normales es de 3. son perdidos a través del vómito. Bajo condiciones de incremento de pH (alcalosis) asociado con la disminución de cloruros. Excesiva cantidad de potasio puede liberarse del cuerpo bajo dos condiciones: primero cuando las secreciones intestinales con su contenido relativamente alto de potasio. Existe aproximadamente 130 gr.

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insuficiencia renal crónica. II. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante :ácido tricloroacético  Reactivo TPB-Na: tetrafenilborato de sodio  NaOH  Estándar de Potasio III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): 1. Precipitación: en un tubo de ensayo pequeño añadir 50 ul de suero y 500 ul de reactivo precipitante. Mezclar cuidadosamente. Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). 2. Armar el siguiente sistema: Componentes Reactivo de trabajo Standard Sobrenadante Standard 1 ml 100 ul 100 ul Problema 1 ml

Para producir una turbidez homogénea el Standard y el sobrenadante transparente deben de ser agregados en el centro de la superficie del reactivo de trabajo Mezclar cuidadosamente Dejar reposar por lo menos 5 minutos Medir las absorbancias dentro de los 5 y 30 minutos CÁLCULOS: Factor: 5/Lectura del Standard Problema: lectura del problema x factor VALORES NORMALES: Suero de 3.5 a 5.5 mmol/l IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es el principio o fundamento del método de Hoffman para determinación del potasio sérico? 2. ¿Cómo explica metabólicamente la influencia sobre la concentración sérica de potasio producida por la administración de glucosa e insulina? 3. Explique usted los efectos metabólicos de la aldosterona en la excreción renal de potasio. 4. De ejemplos de hiperpotasemia y de hipopotasemia

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PRACTICA N° 35
DETERMINACION DE CALCIO SERICO
I. INTRODUCCION: El calcio sérico se encuentra en dos formas: Una combinada con proteínas séricas, inactivo e incapaz de difundir a través de las membranas de los capilares. Y la forma no unida a las proteínas, es principalmente iónico, difusible y activo. Varios factores influyen en la concentración de calcio sérico total. La hiperproteinemia está asociada con una elevación en los niveles de calcio, mientras que la hipoproteinemia se acompaña con disminución de la concentración de calcio; sin embargo la concentración de calcio ionizado no se altera. El calcio ionizado se altera en las siguientes situaciones: 1) Por variaciones del pH sérico; la alcalosis tiende a disminuir el calcio y la acidosis tiende a incrementarlo. 2) La ingestión de vitamina D aumenta el calcio ionizado a través de la absorción de calcio y por la excreción del fósforo. 3) La hormona paratiroidea es el factor más importante que controla los niveles de calcio sérico y su efecto es casi exclusivamente limitado a la forma iónica del calcio. La concentración del calcio sérico en individuos normales es de 9 a 11,5 mg por 100 ml Aproximadamente 4,5 a 5,5 mg% es ionizado y cerca de 0,5 mg% está presente como citrato de calcio y el resto se encuentra unido a las proteínas. El propósito de la presente práctica es determinar la concentración sérica de calcio total en personas adultas normales y/o en estado patológico por el método colorimétrico directo

II.

REACTIVOS A UTILIZAR: - Buffer alcalino: buffer lisina pH 11,1 - Reactivo de Color: 8-hidroxiquinolina, o-cresolftaleina-complexona, ácido clorhídrico - Solución estándar de calcio: 8 mg/dl

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Standard Muestra Muestra --------20 ul Standard ----20 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar y medir la absorbancia de la muestra (¨A muestra) y del Standard (¨A Standard) contra el blanco en un lapso de 5 a 30 minutos CALCULOS: A muestra C ! 8v ?mg/dlA A standard VALORES DE REFERENCIA: Suero o Plasma: 8,1 ± 10,4 mg/dl 


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IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es la importancia biológica del calcio en el ser humano? 2. ¿Cuáles son las formas de calcio sérico? 3. ¿Cuáles son los factores que controlan los niveles de calcio sérico? 4. ¿Cuál es la concentración normal de calcio sérico total? 5. Señale algunas alteraciones fisiológicas y/o patológicas que producen alteraciones de los niveles séricos de calcio.

Utilizar heparina como anticoagulante de elección. la resistencia de los eritrocitos a las soluciones hipotónicas disminuye. .91 PRACTICA N° 36 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. Aunque en la prueba de la osmosis la ruptura de las células resulta de la alteración de su forma y disminución de su resistencia a las fuerzas osmóticas más que a un cambio en la composición de la célula o su osmolaridad. El uso de anticoagulantes del tipo de los oxalatos que comprende la adición de sales osmóticamente activas son indeseables.5% . no deben hacer contacto con las paredes de los tubos secos porque estos pueden causar .31 g). La muestra de sangre debe ser obtenida con un mínimo de estancamiento y de trauma.Cloruro de sodio (180 g). Cuando éstos son colocados en una solución hipertónica pierden líquido arrugándose y destruyéndose hasta que se establece el equilibrio osmótico con el líquido circulante.Solución salina amortiguada concentrada 10%.Na2P04 (27. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS ERITROCITOS : PRECAUCIONES: 1. cuando estos son puestos en soluciones hipertónica e hipotónica respectivamente. II. de allí que se emplee el término de fragilidad.5% EXPERIMENTO N°2 .NaCl al 15%. Sin embargo en ciertas anemias hemolíticas adquiridas.86 g). INTRODUCCION: La membrana de los eritrocitos es semipermeable. REACTIVOS A UTILIZAR: EXPERIMENTO N°1 . 2.5 .Heparina III.NaH2 PO4. . Si utilizamos una serie de soluciones de CINa de concentraciones gradualmente progresivas es posible comprobar que la hemolisis de los eritrocitos se producen dentro de ciertos limites de hipotonicidad. La muestra debe ser procesada tan pronto como sea posible después de tomada. Se afora con 2 litros de agua destilada y se conserva a 0° C (dura varios meses). anemia falciforme y en la anemia hipocrónica ordinaria (ferropénica). 3.NaCl al 4. .2H2O (4. lo que se conoce con el nombre de fragilidad osmótica de los eritrocitos (0. La presente práctica tiene la finalidad de: Verificar el desplazamiento de agua desde el medio extracelular hacia el medio intracelular y viceversa en los eritrocitos.3%).0. . . Las células esferociticas se rompen más rápidamente que las demás y de hecho la prueba de la fragilidad osmótica puede ser considerada como un índice más sensible que la de la magnitud de eritrocitos a la lisis en solución hipotónica. Demostrar la fragilidad osmótica de los eritrocitos cuando éstos son colocados en diversas soluciones de CINa de diversas concentraciones. es observada en la talasemia. Sin embargo cuando los eritrocitos son colocados en solución hipotónica aceptan líquido (hinchándose) hasta que se alcanza el equilibrio osmótico o hasta que se rompen.NaCl al 8. 4. Cuidar que las gotas de sangre caigan directamente en las soluciones salinas.

20 3 1.50 8 2.35 5 2.25 0. con un algodón empapado en alcohol yodado. EFECTO DE LAS SOLUCIONES HIPERTÓNICAS E HIPOTONICAS SOBRE LA INTEGRIDAD DE LOS ERITROCITOS: (Verificar por inferencia el desplazamiento del agua entre los medios intra y extracelular.50 0. en tubos heparinizados.50 2. por acción de soluciones salinas de diferente concentración).00 3. Observar que la fragilidad globular media de los eritrocitos se produce entre los tubos 5 y 6 (0.02 ml de sangre del paciente a cada uno de los doce tubos de una primera hilera. Conviene preparar una solución al 1% a partir de la solución concentrada al 10% y armar la siguiente serie de tubos: N° de NaCl al 1% Agua destilada % de NaCl tubo (ml) (ml) 1 0.70 12 4. La sangre del paciente y del sujeto normal son tomadas. Utilizando lancetas descartables o lanceta de Link estéril pinchar el dedo. Anotar los resultados.75 3.00 1. Procedimiento: Realizar asepsia del pulpejo del dedo escogido de la mano.80 2.50 4.50 3.10 2 1.25 1. Volver a mezclar y luego centrifugar a 2000 rpm.25 2. PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES Las diluciones se pueden preparar inmediatamente antes de la prueba: 1.45 7 2. Mezclar correctamente cada tubo y dejar a temperatura ambiente por 30 minutos. Depositar una gota de sangre en cada una de las tres láminas porta-objeto.60 10 3. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 2 y 4 de cada mesa de trabajo).40 6 2.75 2.00 4.00 0. Se debe rotar cada muestra suavemente en el tubo hasta que el color sea rojo brillante (plenamente oxidado). 4.75 0. 6.00 2. con las precauciones señaladas. Utilizando con precisión una pipeta para hemoglobina o una pipeta Pasteur calibrada. Marcar el tubo donde la hemólisis es completa (color rojo intenso).45% de NaCl).00 0.50 0. Colocar cantidades similares de sangre control del sujeto normal en cada uno de los tubos de una segunda hilera. 5.25 0.55 9 3. Proceder de la siguiente manera: Láminas (gotas) I II III .65 11 3. 3.40 y 0. 7.50 0.92 hemólisis. Mezclar el contenido de cada tubo antes de agregar la sangre. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 1 y 3 de cada mesa de trabajo).00 0.00 0. LECTURA: Observar cuidadosamente y marcar los tubos donde se inicia la hemólisis.75 0.30 4 1.50 1. añadir 0. objetivado por el color rojizo pálido que toma el líquido sobrenadante en los tubos centrifugados.50 0.

Anotar los resultados. Señale causas de alteraciones en la fragilidad osmótica. .5% Solución hipertónica de CINa 15% Solución hipotónica de CINa 4. diga: A. ¿Cuál es la relación normal existente que permite la forma de disco bicóncavo del eritrocito? B. IV. 2. De acuerdo a los valores normales del test de fragilidad osmótica de los eritrocitos. ¿Cuáles son las relaciones normales existentes para la formación de los esferocitos y de las células tipo tiro al blanco? (target cell). señale la concentración o porcentaje de NaCl del tubo en el cual empezó la hemólisis.5% Mezclar bien. así mismo el tubo en donde la hemólisis fue completa. 3. Si el test de fragilidad osmótica de los eritrocitos de un modo general evalúa la relación entre el área superficial y el volumen de la célula. 4. señale los porcentajes de inicio y finalización (total) de la hemólisis. 1 2 - 1 2 - 1 2 Utilizando el microscopio observar los eritrocitos de cada una de las láminas. CUESTIONARIO: 1. Según observación cuidadosa. Establecer las comparaciones morfológicas y/o lisis de los glóbulos rojos en rel ción a cada tipo de a soluciones empleadas en cada caso.93 Sangre del pulpejo de dedo Solución isotónica de CINa 8.

Algunas personas . Por lo general la aglutinación puede observarse a simple vista. El mecanismo de una reacción de aglutinación es semejante al de las reacciones de precipitación. En general las pruebas de aglutinación son fáciles de prac ticar. en el diagnóstico de las anemias hemolíticas por autoinmunidad (en la que los pacientes producen anticuerpos para las membranas de sus propios eritrocitos). Las pruebas de aglutinación tienen muchos usos en el laboratorio clínico. Pasteurella). Brucella.). eritrocitos. Algunas personas son poseedoras de un antígeno de superficie designado en forma arbitraria como antígeno A (eritrocitos tipo A). En la membrana de los glóbulos rojos de cualquier persona normal se pueden encontrar determinados antígenos (antígeno de superficie o determinantes antígenos). en la Prueba de Weil Felix (en pacientes con enfermedades provocadas por Ricketsias. con cinco sitios eficaces de fijación de antígeno por cada moléculas de 19S tengan una actividad aglutinante superior a la de los anticuerpos IgG con dos sitios de fijación de antígeno por cada molécula. en la superficie de los eritrocitos del donador (Prueba indirecta de Coombs). En efecto dichas pruebas permiten habitualmente descubrir hasta 0. partículas de látex. en pruebas inmunitarias del embarazo. Estas partículas (bacterias. bastante reproducibles y sumamente sensibles. ambos tipos de reacciones se producen por medio de anticuerpos multivalientes que se combinan con partículas de antígeno formando complejos de antígeno anticuerpos. La concentración del anticuerpo aglutinante se define como la mayor dilución de antisuero que aglutina el antígeno examinado. INTRODUCCION: Frecuentemente los antígenos se asocian con partículas que son demasiado grandes para formar soluciones o suspensiones coloidales en los medios acuosos. etc. En otras palabras. en la Prueba de Paul-Bunnell (Prueba de aglutinación en pacientes con mononucleosis infecciosa). pero en algunos casos se necesita el examen microscópico de la preparación estudiada. Los anticuerpos de las distintas clases de inmunoglobulinas difieren en su capacidad de producir reacciones de aglutinación. La única diferencia entre una reacción de precipitación y otro de aglutinación es que los antígenos son moléculas pequeñas en tanto que los antígenos aglutinantes están asociados con partículas de mayor tamaño. Por lo tanto no es sorprendente que los anticuerpos IgM. en la prueba del factor reumatoideo (en pacientes con artritis reumatoides).1 Ugr de anticuerpos/ml de suero Las pruebas de aglutinación se utilizan rutinariamente en las pruebas cruzadas con sangre antes de administrar transfusiones endovenosas en pacientes. para descubrir la presencia de anticuerpos del receptor. dirigidos contra el mismo antígeno. etc. como el tifus endémico). en las condiciones empleadas en la prueba. otras personas tienen otro tipo de antígeno de superficie que se llama antígeno B (eritrocitos tipo B). Al igual que las reacciones de precipitación las pruebas de aglutinación requieren de un pH apropiado y de la moralidad de amortiguadores salinos y debe existir una proporción adecuada de antígeno respecto del anticuerpo. tanto para medir antígenos como para determinar las concentraciones de los anticuerpos. Se denomina reacción de aglutinación al fenómeno en que la mezcla de las partículas de antígeno con los antisueros específicos provoca una agrupación de dichas partículas antigénicas.94 PRACTICA N° 37 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. pueden quedar suspendidas en una solución salina y mezclarse con antisueros específicos. en la Prueba de Widal (en pacientes infectados con bacterias gram negativas como Salmonella. Estas diferencias dependen principalmente de la valencia del sitio de fijación del antígeno en las diversas clases de los anticuerpos. una baja concentración de anticuerpos IgM produce una reacción de aglutinación cuya intensidad es igual a la que se produce con una elevada concentración de anticuerpos IgG.

tomar una muestra de sangre sin anticoagulante y obtener el suero por centrifugación. III. le ha conferido una tolerancia inmunológica específica hacia él. y Obtener muestras de sangre tipo A y tipo B. previamente identificadas. Es un hecho bien conocido que muchas bacterias instestinales (salmonellas y shigellas) tienen antígenos que reaccionan en forma cruzada con los antígenos humanos AB0 (H). Como existe un desarrollo gradual de estas isoglutininas. REACTIVOS A UTILIZAR: y Kit para identificar grupos sanguíneos (Diagnóstica). Por otra parte. y Llevar los glóbulos rojos sedimentados con suero fisiológico por tres veces. ya que su propio antígeno A. Utilizando los símbolos (+ )= positivo y (-)= negativo complete el cuadro de aglutinación de los grupos sanguíneos ABO: . Estos anticuerpos (isoaglutininas) son del tipo IgH y son poco detectables en los sueros de los recién nacidos.  Identificación de isoaglutininas en suero: y De uno de los estudiantes de cada grupo (o masa) de trabajo. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo B sobre la gota de suero con marca 2 y mezclar. Los antígenos aparecen a comienzos de la edad fetal en cuanto se forman los eritrocitos . Pero una persona del grupo A forma sólo anti B y no anti A. CUESTIONARIO: 1. llamados isoaglutininas. Observar si hay o no aglutinación de los glóbulos rojos en 1 y/o en 2 de isoaglutininas en el suero problema del estudiante y deducir el grupo sanguíneo que posee. y Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos y descartar el plasma. II. en el suero existe también normalmente anticuerpos contra los antígenos A y B. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.95 pueden tener ambos antígenos A y B (eritrocitos AB) y una cuarta posibilidad es que no tengan ninguno de los antígenos mencionados (eritrocitos tipo 0 o H). y y y y IV. se ha sugerido que las inmunizaciones inaparentes durante la infancia y el comienzo de la niñez pueden ser responsables de la producción de anti A o anti B. Los antígenos de superficie A y B son llamados también aglutinógenos y se ha estimado que pueden haber hasta un millón de sitios antigénicos A o B en un solo hematíe. y Preparar una suspensión al 5% de glóbulos rojos lavados. La misma lógica explicaría que una persona del grupo B forma sólo anti A y no anti B. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo A sobre la gota de suero con marca 1 y mezclar. porque producen aglutinación de los glóbulos rojos que poseen el correspondiente antígeno y porque los antígenos son de origen humano (iso=de una misma especie). para eliminar los anticuerpos inespecíficos adicionados a la superficie de los glóbulos rojos.000. De acuerdo con esta hipótesis todos los recié nacidos n están expuestos a los antígenos A y B. del tipo A y B en solución salina fisiológica. pero aumentan con rapidez su titulación en los primeros meses de vida. aunque quizá sea más realista una cifra de 5000. En cada extremo de una lámina porta objetos poner una gota del suero recientemente obtenido y marcar 1 y 2 respectivamente. con hepsrina como anticoagulante.

EN EL SUERO Anti Anti Anti Anti POSIBILIDADES DE TRANSFUSIÓN Puede recibir Puede donar De A AyO ByO O Todos (receptor Universal) A y AB B y AB Todos (donador Universal) AB 4. ¿Cuál es el fundamento de las reacciones antígeno-anticuerpo? . ¿Qué aplicaciones de las reacciones antígeno anticuerpo puede señalar? 5. En el siguiente cuadro anote los anticuerpos en el suero: GRUPOS SANGUÍNEOS ABO ANTIGENOS EN LOS POS ERITROCI.96 SUERO DEL GRUPO O B A AB ( ( ( ( AB ) ) ) ) ERITROCITOS DEL GRUPO A B ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( C ) ) ) ) 2. (G. SANG) A B O AB ANTICUER. Diga usted ¿Por qué ya no es costumbre corriente utilizar sujetos de tipo O como ³donadores universales´ y personas de tipo AB como ³receptores universales´? 3.