ALUMNO (a): 2 PRESENTACION Los profesores de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la U niversidad Nacional de Trujillo, han actualizado la Guía de Práctica, donde el estudiante encontrará una breve introducción de la importancia bioquímica y correlato medico de cada práctica, así como el procedimiento a desarrollar, finalizando con un breve cuestionario a fin de ampliar o concretar la aplicación de lo tratado. La Bioquímica es sin duda la ciencia que más ha aportado al desarrollo de la Medicina, basada en una rigurosa apl icación del método científico de la investigación experimental. En la práctica, los alumnos a partir de los conocimientos adquiridos en los diálogos, seminarios y casos clínicos, tienen la oportunidad de plantear interrogantes, contrastarlas con un experimento en forma ordenada, obten iendo resultados que al final se discutirán en grupo con el docente. También podrán conocer algunos métodos aplicados al diagnóstico clínico o al estudio nutricional. La práctica en Bioquímica, constituye un estímulo importante en el desarrollo de la investi gación experimental, permitiendo a nuestros estudiantes desarrollar habilidades y destrezas en trabajos de investigación y así obtener logros a nivel nacional para nuestra Facultad. Un recuerdo especial para los profesores que sentaron las bases para la actual guía de práctica como el Dr. Hugo Alpaca Muñoz, el Dr. Jorge García Ventura y un agradecimiento a todos los docentes que de una u otra manera aportaron con sus conocimientos para disponer de esta herramienta que beneficiará a los alumnos de nuestra Facultad. Dr. CARLOS ARANCIBIA ARROYO Dra. MARIA DAYSI REYES BELTRAN Dr. JUAN VALLADOLID ALZAMORA Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA Dr. WALTER OBESO TERRONES Dr. ALFREDO LARIOS CANTO Dr. JORGE PLASENCIA ALVAREZ Dr. HECTOR RODRIGUEZ BARBOZA 3 I UNIDAD SUBESTRUCTURA CELULAR: ENZIMAS Y BIOENERGETICA REUNION DE LABORATORIO N° 01 PRACTICA N° 01 DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS I. INTRODUCCION: La vida depende de una serie ordenada de reacciones químicas que son catalizadas por enzimas formadas para este fin. Las enzimas son proteínas relativamente frágiles con tendencia a sufrir desnaturalización e inactivación, es decir alteraciones en su conformación, por efecto de diversos agentes físicos y químicos como: temperatura, ácidos, álcalis fuertes, sales pesadas, pH, etc. Las enzimas se encuentran en pequeñas concentraciones en los materiales biológicos resultando , complicada su individualización o purificación. Para poder verificar directamente las propiedades comunes o similares de la naturaleza proteica que las caracterizan, experimentalmente se pueden utilizar las propiedades de catalizadores específicos que tienen las enzimas, como indicador de las alteraciones que pueden sufrir éstas cuando son sometidas a la acción de diferentes agentes físicos y químicos. De esta manera, sin necesidad de individualizar o purificar una determinada enzima se pueden verificar cómo los agentes físicos y químicos afectan la naturaleza proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad. La finalidad de la presente práctica, es evidenciar las características proteicas de las enzimas y que expuestas a la acción de diversos agentes físicos y químicos hacen variar su comportamiento y actividad catalítica. II. REACTIVOS A UTILIZAR: NaOH 1N SO4 Cu 20% NaCl 0.15M Amilasa salival 1.0% Solución iodada HCl 3N y 0.05N Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 Ácido tricloro acético (A.T.C.A.) al 20% III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Preparar: SISTEMA A TUBOS COMPONENTES (en ml) Amilasa al 1% NaOH 1N HCl 3N Ácido Tricloro acético 20% Sulfato de Cobre al 20% Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 I 1.0 2.4 II 1.0 2.4 III 1.0 2.4 IV 1.0 2.4 V 1.0 2.4 VI 1.0 2.4 4 a. b. c. d. Observar el aspecto y color producido e interpretar. Dejar los 5 primeros tubos del sistema en reposo por 10 minutos a la temperatura ambiente. Colocar el tubo VI en un baño de agua hirviendo por 10 minutos. Durante este lapso construir el siguiente SISTEMA B: SISTEMA B: TUBOS COMPONENTES (en ml) Almidón al 1.0% en solución acuosa Buffer fosfato 0.1 M / pH 6.6 NaCl 0.15 M Agua Destilada 5.0 1.4 2.0 5.0 1.4 2.0 5.0 1.4 2.0 5.0 1.4 2.0 5.0 1.4 2.0 5.0 1.4 2.0 I 1.0 II 1.0 III 1.0 IV 1.0 V 1.0 VI 1.0 a. Pre incubar por dos minutos a 37 ºC. b. Agregar 0.6 ml. de la enzima tratada, de cada uno de los tubos del sistema (A) a su correspondiente tubo del último sistema (B). c. Dejar en incubación a 37 °C por 20 minutos. d. A continuación armar el siguiente sistema: TUBOS COMPONENTES (en ml) HCl 0.05N De los tubos de reacción del sistema (B), agregar: Solución yodada 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 I 5 0.5 II 5 0.5 III 5 0.5 IV 5 0.5 V 5 0.5 VI 5 0.5 e. Observar el color producido e interpretar los resultados. IV. CUESTIONARIO: 1. Interprete y explique bioquímicamente cada uno de los pasos realizados durante el desarrollo de la práctica 2. Esquematice el procedimiento de la práctica. 3. Explique los tipos de enlaces fuertes y débiles que existen entre los aminoácidos para conformar una determinada proteína. 4. Explique la teoría de la acción molecular de las enzimas sobre sus respectivos sustratos. 5 PRACTICA N° 02 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. INTRODUCCION: Las enzimas pueden ser descritas como catalizadores complejos de origen biológico que tienen un alto grado de especificidad y eficiencia; permitiendo que las reacciones químicas dentro de la célula ocurran rápidamente a través de vías bien definidas. Sin estas proteínas especializadas, la vida tal como es no podría existir. Para poder mostrar la actividad enzimática se debe tener presente fundamentalmente que cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato, entonces en un organismo vivo habría tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes. Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada, solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. En general, la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras: 1. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL ) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura. 2. Verificando los productos liberados después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura. La finalidad del presente trabajo experimental es determinar la actividad enzimática, utilizando la enzima amilasa salival que tiene la capacidad de degradar el almidón en maltosa (disacárido reductor) y algo de glucosa; verificando tanto el sustrato residual y los productos formados en dicha reacción. II. REACTIVOS A UTILIZAR: - Solución de almidón pH 6.0 al 1%. - Cloruro de sodio solución 0.1M - Enzima al 1% (amilasa salival). - Ácido Clorhídrico 0.05N - Solución yodada. - Reactivo Folin Wu: a. Solución Cúprica alcalina. b. Solución fosfomolíbdica. III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) y Armar el siguiente sistema: ETAPA A: TUBOS COMPONENTES Solución de almidón pH 6.0 al 1% Solución de cloruro de sodio 0.1M Agua destilada I 5 ml. 1 ml. 4 ml. II 5 ml. 1 ml. 3 ml. y Colocar los tubos al baño de agua a 37 °C por 5 minutos. y Agregar 1 ml. de enzima al tubo II. y Volverlos a colocar al baño de agua a 37 °C durante 10 minutos. 6 CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL. y Inmediatamente cumplidos los 10 minutos. De cada uno de los tubos del sistema anterior, transferir 0.5 ml. a este nuevo sistema. TUBOS COMPONENTES Ácido clorhídrico 0.05 N De los tubos I y II: Etapa A Solución yodada I 5 ml. 0.5 ml. 0.5 ml. II 5 ml. 0.5 ml. 0.5 ml. y Mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante. CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin WU) TUBOS COMPONENTES De los tubos I y II: etapa A Solución Cúprica alcalina Hervir 8 minutos Enfriar Solución fosfomolíbdica Agua destilada y I 1ml. 1ml. II 1ml. 1ml. 1ml. 2ml. 1ml. 2ml. Mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante III. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. ¿Qué métodos conoce para determinar la actividad enzimática? Explique la acción bioquímica de cada uno de los componentes en los pasos seguidos para determinar la actividad enzimática. Elabore un gráfica para demostrar la acción de una enzima sobre su sustrato, donde se observe la energía de activación y el estado de transición. Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimático y defínalos. 7 PRACTICA N° 03 DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LAS PROTEINAS I. INTRODUCCION: El punto isoeléctrico es la concentración de iones hidrógeno en el cual la proteína es eléctricamente neutra, porque el número total de cargas positivas es igual al número total de cargas negativas contenidas en la proteína. Por tanto, cada proteína posee un determinado punto isoeléctrico (PI). Cuando una proteína se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pH menores, iguales o mayores al PI, la proteína sufre variaciones en la constitución de sus grupos químicos, produciéndose en consecuencia variaciones en la estructura terciaria o cuaternaria y por lo tanto en su función biológica Aparte de otras propiedades que presentan las proteínas, cuando se encuentran en una solución que tienen pH igual al PI, algunas proteínas son muy díficilmente solubles y precipitan. Aprovechando este comportamiento, se puede determinar el PI de una proteína observando los cambios de solubilidad que se producen cuando la proteína se encuentra en varias soluciones que tienen pH conocidos. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que el punto o pH isoeléctrico de las enzimas es una característica físico química común de estas moléculas, que precipitan porque la solubilidad en estas condiciones disminuye al mínimo. II. REACTIVOS A UTILIZAR: - NaOH al 10%. - Ácido acético 1N - Indicador de pH: Papel Indicador ó pHmetro. - Solución de caseína en Acetato de Sodio 0.1N III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Marcar una serie de tubos de ensayo de 1 al 9 TUBOS REACTIVOS (en ml.) Ácido Acético 1N Agua Destilada      I 3.2 6.8 II 5 III 5 IV 5 V 5 VI 5 VII 5 VIII 5 IX 5 Mezclar el tubo N° 1 Extraer 5ml. de solución del tubo N° 1 y agregarlo al tubo N° 2. Mezclar Extraer 5ml. del tubo N° 2 y transferir al tubo N° 3. Completando del mismo modo hasta completar la serie. En el tubo N° 9 una vez efectuada la mezcla, se extrae 5 ml. de solución y se elimina. Al contenido anterior del sistema agregar rápidamente 1 ml. de caseína en acetato de sodio 0.1N en cada tubo. TUBOS CONTENIDO ( en ml.) Contenido Anterior Caseína 0.1N (sal)  I 5.0 1.0 II 5.0 1.0 III 5.0 1.0 IV 5.0 1.0 V 5.0 1.0 VI 5.0 1.0 VII 5.0 1.0 VIII 5.0 1.0 IX 5.0 1.0 Mezclar al instante por inversión. 8    Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la proteína en los diferentes tubos. Anotar en el cuadro que se da a continuación Observar después de 30 minutos de reposo y anotar también en el cuadro respectivo. TUBOS N°. I II III IV V VI VII VIII IX Emplear los símbolos siguientes : O = no cambia + = opalescencia, x = precipitado EFECTO INMEDIATO EFECTO DESPUÉS DE 30 MINUTOS CÁLCULO DEL pH  Determinar el tubo que presenta el máximo de precipitación, lo cual se producirá en el tubo que tiene pH próximo a la solubilidad mínima de la proteína.  Luego de transcurridos los 30 minutos de reposo, verificar el pH de cada uno de los tubos con el indicador de pH. Anotar los resultados en la columna respectiva del cuadro anterior.  Calcular el pH de cada uno de los tubos aplicando la Ecuación de Henderson ± Hasselbach. Ver ejemplo. Ecuación de Henderson ± Hasselbach [ sal ] pH = pK + log. [ Ácido ] pK del Ácido Acético = 4.7 Ejemplo : Si la concentración de la sal es de 1 ml. de acetato de sodio 0.1 N en todos los casos, la concentración de ácido acético varía. Así en el tubo N° 1 es de 1.6 ml. de ácido 1 N (16 ml. 0.1N). En el tubo N°2 la concentración de ácido acético es de 8 ml. al 0.1 N. En el tubo N° 3 la concentración de ácido acético es de 4.0 ml. 0.1 N. Etc. Cálculo de pH para el tubo N° 3: pH = pK + log. 1 = 4.7 ± 0.6 = 4.1 TUBO N° 3 = pH 4.1 4 NOTA: De la manera indicada en el ejemplo, debe calcularse el pH de cada uno de los tubos IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. Indique el punto isoeléctrico aproximado a la proteína, que encontró en su experimento. ¿Cómo interpreta el resultado obtenido del punto isoeléctrico? ¿Qué es el pK? El pH neutro del medio ¿es igual al pH isoeléctrico? De sus razones. 9 5. Si la concentración de ácido acético en el tubo II es 8 ml a 0.1 N ¿Cuál es el pH de la solución en 1 ml? 10 REUNION DE LABORATORIO N° 02 PRACTICA N° 04 CUANTIFICACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE LAS ENZIMAS I. INTRODUCCION: Al no ser posible medir la cantidad de enzima directamente en las estructuras biológicas, se recurre a la medida de la velocidad de la reacción que cataliza. Esto es posible debido a que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima. De esta manera se puede expresar la cantidad de una enzima en términos de unidades enzimaticas, entendiéndose por unidad de una enzima a la cantidad de ella que produce cierta velocidad de reacción bajo determinadas condiciones. Esa velocidad de reacción se expresa como la cantidad de sustrato transformado en cierto tiempo. A fin de evitar ambigüedades surgidas de la utilización de distintas unidades para expresar la cantidad de sustrato y el tiempo se ha definido por convención una unidad que puede ser aplicada a casi todas las enzimas y que permite comparar las actividades de enzimas diferentes. La definición recomendada por la Unión Internacional de Bioquímica a través de su comisión de enzimas es la siguiente: ³Una Unidad Internacional (UI) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol (Q mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de medida´. Dos casos merecen aclaración especial: - Cuando el sustrato es una proteína, o un polisacárido, o cualquier otra molécula en la cual son atacados más de una unión, se debe reemplazar la definición de un Qmol de sustrato por un microequivalente (Q eq) del grupo involucrado. Es decir en los ejemplos mencionados más que el numero de moléculas completamente hidrolizados, se toma como medida de la reacción el número de uniones peptídicas o glicosídicas atacadas respectivamente. - En casos de reacciones bimoleculares del tipo: 2 A ----- B + C en que dos moléculas reaccionan entre si, una Unidad será la cantidad de enzima que cataliza la transformación de dos Q Moles de sustrato por minuto. En cuanto a las mencionadas condiciones de medida, deben establecerse: - La temperatura a la cual se define la Unidad. - El pH. - La concentración del sustrato o los sustratos y cofactores, y en general de todos aquellos factores que de una u otra manera pueden modificar la actividad de la enzima. ACTIVIDAD ESPECÍFICA. Se denomina Actividad Específica a la cantidad de una enzima expresada en términos del contenido de proteína de la preparación, y se expresa como el número de unidades de la enzima por miligramo de proteína. Esta aumenta durante el proceso de purificación de la enzima en los homogenizados biológicos y llega a ser máxima y constante cuando la enzima se halla en estado puro. Entonces la actividad específica además de cuantificar la enzima, constituye una medida del grado de pureza de la enzima durante el proceso de purificación. En éste último caso y siempre que se conozca un peso molecular se puede definir otra unidad ³LA ACTIVIDAD MOLECULAR O MOLAR O NÚMERO DE RECAMBIO´ (ÍNDICE CATALÍTICO), definible como el número de moléculas de sustrato transformado por minuto y por molécula de enzima (ó por un solo centro activo) en condicionales experimentales tales que se esté midiendo la velocidad máxima (concentración saturante del sustrato). 11 Actualmente la Unión Internacional de Bioquímica, recomienda el uso de una nueva unidad EL KATAL (Kat) que se define como la cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato en producto por segundo. Su relación con la Unidad Internacional es la siguiente: Un Katal es igual a 6 x 10 7 Unidades Internacionales. Una Unidad Internacional es igual a 0.01667 microkatales = 16.67 nanokatales La Actividad Específica se expresa en esta nueva unidad como Katales por kilogramo de proteína (ó Microkatales por miligramo de proteína) y la actividad molar en Katales por mol de enzima. La finalidad del presente trabajo experimental es cuantificar la Actividad Enzimática determinando la actividad específica. II. REACTIVOS A UTILIZAR: y Preparado enzimático (homogenizado celular de Fusarium moniliforme) y Buffer de acetato 0.02M pH 5.0 y Sacarosa 0.17M y Hidróxido de bario 0.3 N y Sulfato de Zinc al 5 % y Solución fosfomolíbdica y solución cúprico alcalina y Reactivo de Biuret III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: y Armar el siguiente sistema: SISTEMA DE INCUBACIÓN COMPONENTES Sacarosa 0.17 M Buffer acetato 0.02 M pH 5.0 Incubar a 37°C. (Pre ± incubación) Preparado enzimático Mezclar e incubar a 37°C. Detener la reacción empleando: Hidróxido de bario 0.3 N Sulfato de Zinc 5 % Sacarosa 0.17 M Agua destilada y y TUBOS DE ENSAYO I II 0.3 ml. 0.5 ml. 0.5 ml. 2 minutos 0.2 ml. 0.2 ml. 20 minutos 0.5 ml. 0.5 ml. 0.3 ml. 8.0 ml. 0.5 ml. 0.5 ml. 8.0 ml. Mezclar: Separar el precipitado de proteínas filtrando o centrifugando por 10 minutos. DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS DE LA REACCIÓN (azúcar reductor) Se empleará los filtrados libres de proteínas del paso anterior y se determinará azúcar reductor mediante el siguiente procedimiento: 12 TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES Filtrado I Filtrado II Agua destilada Solución cúprica alcalina I 0.5 ml. 0.5 ml. 0.5 ml. II 0.5 ml. 0.5 ml. 0.5 ml. III 1.0 ml. 0.5 ml. Colocar en un baño de agua hirviendo durante 8 minutos Enfriara al chorro de agua Solución fosfomolíbdica y 1.0 ml. 1.0 ml. 1.0 ml. Mezclar, agregar 7.0 ml. de agua destilada. Mezclar y dejar en reposo durante 20 minutos. Leer a 420 nm. Factor = 0.045 uM/ml. Cálculos de la concentración de los productos (hexosas) [(Lect. II ± Lect. del blanco) ± (Lect. I ± Lect. del blanco)] x Factor = uMoles de Hexosas por ml. Cálculo de las Unidades (U) (U) = uM de sustrato transformado x ml. = Micromoles de Hexosas / 2 Minutos Tiempo de incubación en minutos (20 min). y y y CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Determinación de la concentración de proteínas en el preparado enzimático: (Reacción de Biuret) COMPONENTES Preparado enzimático Agua destilada Reactivo de Biuret 1.0 ml. 4.0 ml. 0.8 ml. 4.0 ml. I II 0.2 ml. Mezclar y dejar en reposo por 30 minutos. Leer a 540 nm Para el espectrofotómetro, el factor es..................... CÁLCULO: (Lect. II ± Lect. I) x Factor = mg. de proteínas por ml. y CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA U A.E. = mg. de Proteínas 13 IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. 5. Cuándo determina el azúcar reductor de una reacción. ¿Cómo explica la aparición de la coloración al final del sistema? ¿Por qué es necesario conocer previamente la concentración de proteínas del preparado enzimático y determinar la unidad de enzima (U), para calcular la Actividad Específica? ¿Por qué se utiliza el reactivo de Biuret? ¿Por qué una enzima se cuantifica en función de su actividad enzimática y no por el peso de la proteína (enzima)? Si en dos preparados biológicos A y B la actividad específica de una determinada enzima es: (en uM/mg. proteína) a. A = 1 x 10-3 y B = 1.5 x 10-4 ¿En cual de los dos preparados hay mayor cantidad de enzima? 6. 14 PRACTICA N° 05 FACTORES FÍSICOS-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS PARTE I: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMAS, PH, TIEMPO TEMPERATURA, IONES INORGÁNICOS I. INTRODUCCION: En general, todas las enzimas, independientemente del tipo de reacción que catalizan, presentan características comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo, retardando o i pidiendo m su actividad. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reacción enzimática sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones. Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara de la influencia de los factores (Tiempo, temperatura, concentración de enzima, concentración de sustrato, pH, iones, etc), sobre la serie infinita de enzimas que se conoce. Este patrón general, como se comprenderá, varia en forma característica para cada enzima en particular. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes, de tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectada por la variación que pudieran sufrir los otros. La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores, pH, concentración de enzima, concentración de sustrato, tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática, tomando como ejemplo la hidrólisis enzimática del almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reacción enzimática. II. REACTIVOS A UTILIZAR - Solución de almidón al 1 % - Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 - Buffer acetato 0.1M pH 4.6 - Buffer borato 0.1M pH 9.0 - Solución de cloruro de sodio al 2 % - Amilasa salival dializada al 0.25 % - Ácido clorhídrico 0.05N - Solución yodada (yoduro de potasio + yodato de potasio) - Solución cúprico alcalina. - Solución fosfomolíbdica. III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.) Solución de almidón al 1 % Buffer acetato 0.1M pH 4.6 Buffer fosfato 0.1M pH 6.6 Buffer borato 0.1M pH 9.0 Solución de ClNa al 2 % Agua destilada I 1.0 5.0 1.4 2.6 II 1.0 5.0 3.4 III 2.0 5.0 1.4 1.0 IV 1.0 5.0 1.4 2.0 V 1.0 5.0 1.4 2.0 VI 1.0 5.0 1.4 2.0 VII 1.0 5.0 1.4 2.4 VIII 1.0 5.0 1.4 2.0 15 - Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al baño de agua a 37 °C, por cinco minutos, para el equilibrio de la temperatura. - El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0 °C y 4 °C durante cinco minutos. - Agregar el preparado enzimático a los tubos: II al VIII, según se indica y tomar el tiempo. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.) Preparado enzimático (en ml. I 0.0 II 0.6 III 0.6 IV 0.6 V 0.6 VI 0.6 VII 0.2 VIII 0.6 (Computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimático fue agregado a cada tubo) y Mezclar y continuar la incubación por 20 minutos. - Realizar controles de la actividad enzimática, de acuerdo a los sistemas que a continuación se presentan: y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL - El control del sustrato no transformado se realiza por la reacción del yodo, de la siguiente manera: Cumplidos los 20 minutos de incubación sacar los tubos del baño maría y luego armar una serie paralela de tubos marcados del I al VIII, agregando a cada tubo marcado, 0.5 ml. del incubado de su correspondiente tubo. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.) I II III IV V VI VII VIII Incubado correspondiente de 0.5 cada uno de los tubos HCl 0.05N 5.0 Solución iodada 0.5 0.5 5.0 0.5 0.5 5.0 0.5 0.5 5.0 0.5 0.5 5.0 0.5 0.5 5.0 0.5 0.5 5.0 0.5 0.5 5.0 0.5 Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos; valorando los cambios de coloración (azul oscuro, azul claro, sin color) en el cuadro final. y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS - El Control de los productos formados se hará en base a la capacidad reductora de estos (glucosa, maltosa) de la siguiente manera: Esta determinación sólo se hará en los tubos III y V del incubado a los 20 minutos. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES III Incubado correspondientemente a los tubos III y V Solución cúprico alcalina 1.0 ml. 1.0 ml. TUBOS V 1.0 ml. 1.0 ml. Mezclar y poner en baño maría hirviendo por 8 minutos. Cumplido los 8 minutos sacar los tubos y enfriar con agua corriente y AGREGAR: 16 COMPONENTES III Solución fosfomolíbdica Agua destilada TUBOS IV 1.0 ml. 5.0 ml. 1.0 ml. 5.0 ml. Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de tubos valorando los cambios de coloración (azul oscuro, azul claro, sin color) en el cuadro final. CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA POR E L SUSTRATO RESIDUAL: (cambio de color) A los 20 minutos: I II III IV V VI VII VIII CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (cambio de color) A los 20 minutos III V IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuáles son los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas? 2. ¿Cómo se determina el sustrato residual y los productos finales cuando se usa almidón como sustrato? 3. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 4. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática? 5. ¿Cómo puede demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 6. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la presencia de un ión activador sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 17 REUNION DE LABORATORIO N° 03 PRACTICA N° 06 FACTORES FÍSICO-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. PARTE II: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD MÁXIMA Y KM. I. INTRODUCCION: En las reacciones no catalizadas, la velocidad de reacción siempre es proporcional a la concentración de cada uno de los reactantes, debido a que la velocidad de colisión entre los reactantes es proporcional a la concentración de cada uno de ellos. Las reacciones catalizadas por enzimas son algo diferentes. A baja concentración de sustrato la velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato y la reacción es de primer orden con respecto al sustrato. Sin embargo, cuando la concentración del sustrato es incrementada, la velocidad inicial se incrementa con menor intensidad, de modo que no es tan directamente proporcional a la concentración del sustrato; en esta zona la reacción es de orden mixto. Con un incremento ulterior en la concentración de sustrato, la velocidad de la reacción llega a ser esencialmente independiente de la concentración del sustrato y asintóticamente alcanza una velocidad constante. En este rango de concentración de sustrato la reacción es esencialmente de orden cero con respecto al sustrato, y se dice que la enzima está siendo saturada con su sustrato. Desde el punto de vista operacional la constante de Michaelis (Km), se define mejor en términos de la concentración de sustrato necesario para obtener una velocidad inicial de reacción igual a la mitad de la velocidad máxima. La finalidad de la presente práctica es demostrar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática y hallar la velocidad máxima y el Km de la reacción. II. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato 0.1 M pH EDTA 0.005 M Urea 0.075 M Solución de ureasa cristalina en Buffer fosfato 0.1 M pH 6.6 Tungstato de sodio al 10 % Ácido sulfúrico 2/3 N III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: 18 COMPONENTES Buffer fosfato pH 6.6 Urea 0.075 M Ureasa 0.05 % I 3.0 0.5 0.5 II 2.5 1.0 0.5 III 2.0 1.5 0.5 IV 1.5 2.0 0.5 V 1.0 2.5 0.5 VI 0.5 3.0 0.5 VII 0.5 3.0 - Pre incubar a 37 °C durante cinco minutos Incubar cada uno de los tubos exactamente 15 minutos 37°C ES FUNDAMENTAL: Medir exactamente el tiempo de incubación para cada tubo. Para ello se medirá el tiempo de incubación inmediatamente después de agregar la enzima, ésta debe agregarse con intervalos de 1 a 2 minutos a cada tubo de tal manera que permita un fácil manejo de los mismos al final de cada tiempo. Transcurridos los 15 minutos agregar rápidamente: COMPONENTES H2SO4 2/3 N Tungstato de sodio 10% Ureasa - MEZCLAR Transferir 1ml. de cada uno de los siguientes incubados a tubos de ensayo de una segunda serie siguiendo el siguiente esquema: COMPONENTES Del incubado anterior Agua destilada Reactivo de Nessler I 1.0 8.0 1.0 II 1.0 8.0 1.0 III 1.0 8.0 1.0 IV 1.0 8.0 1.0 V 1.0 8.0 1.0 VI 1.0 8.0 1.0 VII 1.0 8.0 1.0 I 0.5 0.5 II 0.5 0.5 III 0.5 0.5 IV 0.5 0.5 V 0.5 0.5 VI 0.5 0.5 VII 0.5 0.5 0.5 MEZCLAR y dejar en reposo por cinco minutos. Luego:  Realizar las lecturas en el espectrofotómtero a 540 nm en cada uno de los tubos.  Hallar la diferencia de cada uno de los tubos, con respecto al tubo blanco (tubo VII).  Encontrar la concentración de amoníaco producido por ml. Para ello multiplicar la diferencia anterior por el factor de calibración empleado (1660) = µmoles de NH3 /ml.  Calcular la velocidad de reacción para cada uno de los sistemas enzimáticos preparados; empleando la concentración de amoníaco producido por ml, dividido entre el tiempo de incubación (15 minutos).  Calcular la concentración de sustrato (concentración molar) en cada tubo de incubación empleando la siguiente fórmula: V.M. = V¶.M¶ Ejemplo: Concentración de úrea en el tubo I. Datos: V = 0.5 ml. V¶ = 4 ml. 19 M = 0.075 M M¶ = ? M¶ = 0.5 ml x 0.075 M = 0.0093 M 4ml.  Anotar los resultados de cada uno de los tubos (concentración del sustrato y velocidad de la reacción).  Construir una gráfica en el sistema de coordenadas teniendo como parámetros : La concentración del sustrato (abscisa) en función de la velocidad de la reacción (ordenada). En la curva trazada calcular la Km e indicar la Vmax.  Utilizando papel milimetrado, aplicar la ecuación de Lineweaver Burk a los resultados obtenidos. Construir una gráfica en un sistema de coordenadas teniendo como parámetros la inversa de la concentración del sustrato (1/S) (abscisas) en función de la inversa de la velocidad inicial de la reacción (ordenada). Calcular en la gráfica obtenida la velocidad máxima y la Km. IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cómo afecta la concentración del sustrato la velocidad de la reacción? 2. ¿Qué establece la ecuación de Micahelis Menten? 3. ¿Qué es el Km? 4. ¿Qué importancia tien el Km? 5. ¿Para que sirve la ecuación de Lineweaver? 6. ¿Qué métodos conoce para determinar el Km? 20 REUNION DE LABORATORIO N° 04 PRACTICA N° 07 ACCION DE LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS Y NO COMPETITIVOS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. INTRODUCCION: Existen sustancias cuya acción sobre una enzima es la disminución de su actividad. Estas sustancias se conocen como los inhibidores enzimáticos. Excluyéndose de ésta categoría aquellos agentes como los ácidos fuertes, alcoholes y calor que producen alteraciones en la estructura espacial de la molécula proteica que conduce a la desnaturalización. Los inhibidores enzimáticos se clasifican en reversibles e irreversibles, que se pueden distinguir en base a un criterio experimental. Si después de hacer actuar el inhidor sobre la enzima, eliminamos por algún método, el exceso de inhibidor, y la enzima recupera su actividad original, se dice que el inhibidor es reversible. A la inversa, si la enzima continúa inhibida después de la reacción del inhibidor, se dice que el inhibidor es irreversible. Respecto de los inhibidores reversibles es importante destacar que la interacción entre inhibidor y enzima se traduce en varios tipos de inhibición perfectamente diferenciados experimentalmente. Los dos tipos más comunes son: las inhibiciones reversibles competitivas y las inhibiciones reversibles no competitivas, a las que se pueden agregar las inhibiciones reversibles acompetitivas. En la inhibición competitiva se dice que un inhibidor obra por competencia si su acción inhibidora se revierte al aumentar la concentración de sustrato. El inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual se debería unir el sustrato impidiendo por lo tanto la formación del complejo activoenzima-sustrato. De allí el nombre de competitivo, por que efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazarse mutuamente de la enzima. Un ejemplo clásico, de este tipo de inhibición es el que presenta la succinato deshidrogenasa que tiene como sustrato el succinato y puede ser inhibido por sustancias estructuralmente parecidas a dicho ácido como son el malato, ácido oxálico y glutarato. La inhibición no competitiva se caracteriza por que no puede ser revertida por un aumento de la concentración del sustrato ya que este último no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. Aquí el inhibidor se une a la enzima en otro sitio que no es aquel por el cual se une al sustrato. Por esta razón la unión de este último con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor, pudiéndose formar entonces un complejo ternario enzima-sustrato-inhibidor, que es cataliticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reacción y complejo-enzima-inhibidor. Ejemplos de este tipo de inhibición son los causados por el N-etilamida, cloruro de mercurio, EDTA; los cuale enlazan iones metálicos necesarios para la actividad enzimática, NO y CO; inhiben metaloenzimas por enlazarse al ión metálico. La inhibición acompetitiva, es otro tipo de inhibición reversible, común en sistemas más complejos en el que el inhibidor se une exclusivamente al complejo enzima -sustrato para dar un complejo enzimasustrato-inhibidor incapaz de transformarse en otro producto. Experimentalmente se puede identificar si un inhibidor cualquiera es o no competitivo. Por ejemplo, si el sistema deshidrogenasa succínica+succinato, se agrega malonato como inhibidor. Si el efecto inhibidor se revierte al incrementar la concentración del sustrato (succinato) entonces se podrá afirmar que el inhibidor es de tipo competitivo. Si la inhibición no se revierte al agregar sustrato (succinato), entonces la inhibición será de tipo no competitiva. Quedando por demostrar si este tipo de inhibición es reversible o no. 21 La siguiente práctica tiene por finalidad demostrar en el sistema enzimático Deshidrogenasa succínica+succinato: que el malonato y el cloruro mercúrico producen inhibición de este sistema; que el malonato es un inhibidor competitivo y que el cloruro mercúrico es un inhibidor no competitivo. II. REACTIVOS A UTILIZAR - Buffer fosfato 0.1 M, pH 7.2 - Succinato de sodio 0.1 M - Succinato de sodio 0.5 M - 2 ± 6 Diclorofenolindofenol - Malonato de sodio 0.1 M - Cloruro de mercurio - Homogenizado hepático 10 % III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.1M pH 7.2 Succinato de sodio 0.1 M Succinato de sodio 0.5 M Cloruro de mercurio 0.1 M Malonato de sodio 0.1 M 2 ± 6 diclorofenolindofenol Homogenizado 10 % I 2.0 1.0 1.0 II 1.8 0.2 1.0 1.0 III 1.3 0.2 0.5 1.0 1.0 IV 1.3 0.2 0.5 1.0 1.0 V 1.0 0.5 0.5 1.0 1.0 Dejar en reposo por 30 minutos a la temperatura ambiente. Observar los resultados en cada uno de los tubos (cambio de color). COMPONENTES Succinato de sodio 0.5 M Buffer fosfato 0.1M pH 7.2 Anotar y luego agregar a los tubos II, III, IV. Dejar en reposo 15 minutos a la temperatura ambiente y luego observar los resultados y anotar. II 0.5 III 0.5 IV 0.5 - IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Por qué el malonato es inhibidor competitivo? 2. ¿Por qué el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo? 3. ¿Cómo podría usted demostrar que la inhibición producida por el cloruro mercúrico es o no reversible? 22 4. De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibición competitiva en el sistema Deshidrogenasa succínica ± succinato, además del malonato utilizado en el presente experimento. 5. Señale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibición no competitiva reversible, sin considerar el cloruro de mercurio. 6. ¿Qué diferencias puede usted establecer entre la inhibición competitiva y la inhibición alostérica? 7. De por los menos dos semejanzas entre la inhibición no competitiva reversible e inhibición alostérica. 23 PRACTICA N° 08 EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE ÓXIDO-REDUCCIÓN I. INTRODUCCION: Los equivalentes de reducción, átomos de hidrógeno o electrones, provenientes de la deshidrogenación de los sustratos del ciclo de Krebbs y otros metabolitos son transferidos al oxígeno por un sistema multienzimático denominado cadena respiratoria. Este sistema está localizado en la membrana mitocondrial interna y se caracteriza por la cohesión física con la cual sus componentes se encuentran unidos entre si e integrados en la membrana. Este mismo sistema multienzimático es también conocido como cadena de transporte de electrones, denominación que pone énfasis en que las oxidaciones reducciones son fenómenos caracterizados por la pérdida o ganancia de electrones. Existen diversas sustancias que actúan como inhibidores de la cadena respiratoria. Los inhibidores más comúnmente usados pueden reunirse en tres grupos principales según el sitio de la cadena respiratoria donde actúan. Un primer grupo de inhibidores actúa sobre la NADH-deshidrogenasa, bloqueando el transporte de electrones entre la flavina y la ubiquinona. Los más representativos de este grupo son la rotenona y la piericidina. Inhibidores de localización son: el amital, los esteroides, los detergentes, algunos anestésicos volátiles como el halotano, etc. Por su acción cercana en el primer sitio de la desfosforilación se les suele denominar inhibidores del sitio I. Un segundo grupo de sustancias actúan bloqueando la transf rencia de electrones e entre los citocromos b y c. El ejemplo clásico de este grupo es la antimicina, inhibidores similares son la hidroxiquinolina N-óxido, el BAL y barbiturato de sódio, se les denomina inhibidores del sitio II. Un grupo de inhibidores actúa sobre el Hemo a3 de la citocromo oxidasa impidiendo su interacción con el oxígeno, comprenden el cianuro, el monóxido de carbono, la azida, etc. A estos se les denomina inhibidores del sitio III. Para poder determinar la permeabilidad de la cadena de oxidoreducción al paso o no de electrones, se utilizan sustancias indicadoras artificiales que cambian de color cuando se oxidan o se reducen; así por ejemplo el 26 diclorofenolindofenol y el azul de metileno son sustancias indicadoras de color azul en estado oxidado, que al reducirse (recibir electrones) se decoloran. Como hay flujo de electrones en la cadena, ésta cede sus electrones a los indicadores entre la FMN y la CoQ. Si al administrar un inhibidor de la cadena, éste impide que el 2-6 diclorofenolindofenol se reduzca (se decolore), quiere decir que dicho inhibidor estará actuando en alguna región anterior a la FMN, inclusive de la cadena (región que incluye el sitio I), pero si el indicador se decolora, entonces podemos deducir que el sitio de inhibición estará en alguín sitio posterior a la CoQ inclusive. La p-fenilendiamina, es otro indicador que actúa como sustrato; es decir que es capaz de ceder electrones. Cuando se oxida (cede electrones) cambia de color (a marrón oscuro). En la cadena REDOX, el citocromo C actuará como primer aceptor de electrones que provienen de la p-fenilendiamina. De esta manera se puede verificar si la cadena comprendida entre el citocromo C y el oxígeno, es o no permeable al flujo de electrones que provienen del indicador. Si se administra un inhibidor que impide el flujo de electrones en algún punto de esta porción de la cadena, la p-fenilendiamina no se oxidará (no cambia de color). Si el inhibidor no impide la oxidación del indicador, entonces podemos deducir que el inhibidor actúa en algún sitio anterior al citocromo o de la cadena. Si se administra un inhibidor que no impide la oxidación de la p-fenilendiamina y que tampoco impide la reducción del 2-6 diclorofenolindofenol, entonces podemos deducir que el mencionado inhibidor actuará en algún sitio comprendido entre la CoQ y el citocromo B inclusive (cercano al sitio II de la cadena). La presente práctica tiene por finalidad demostrar que los inhibidores: rotenona, barbital sódico y azida de sodio, actúan en las regiones cercanas al sitio I, sitio II y sitio III, respectivamente, mediante el uso de indicadores conocidos como 2 ± 6 diclorofenolindofenol y p ± fenilendiamina. 24 II. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0.1M, pH: 7.4 2,6-diclorofenolindofenol 0.02 % p-fenilendiamina 1% Malato de sodio 0.1M Rotenona 0.1M Barbiturato de sodio 0.1M Azida de sodio Fracción mitocondrial 10% (hígado de rata) III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) En el sistema Deshidrogenasa málica + malato + cadena rédox mitocondrial, verificar el efecto de los inhibidores: rotenona, barbital sódico y azida de sodio. ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (en ml.) Buffer fosfato 0.1M pH 7.4 2, 6-diclorofenol indofenol 0.02 % Malato 0.1M Rotenona 0.1M Barbiturato de sodio Azida de sodio Homogenizado mitocondrial 10% I 1.2 1.0 0.5 II 1.5 1.0 0.2 III 1.0 1.0 0.2 0.5 IV 0.5 1.0 0.2 0.5 0.5 V 0.5 1.0 0.2 0.5 0.5 VI 0.5 1.0 0.2 0.5 0.5 Mezclar, dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos. Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos). En el sistema p±fenilendiamina + cadena rédox mitocondrial, verificar el efecto de los inhibidores rotenona, barbital sódico y azida de sodio. TUBOS COMPONENTES (en ml.) Buffer fosfato de sodio 0.1M pH 7.4 Azida de sodio Barbiturato de sodio 0.1M Rotenona 0.1M P±fenilendiamina 1% Homogenizado de mitocondrias Mezclar, dejar en 10% ambiente por 20 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 reposo a temperatura minutos. I 2.0 II 1.5 III 1.0 IV 1.0 V 1.0 25 Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos). IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué inhibidores de la cadena de óxido reducción conoce y a qué nivel actúan? 2. ¿Si utiliza el indicador rédox 2,6-diclorofenolindofenol en un sistema con cadena respiratoria, que cambios observaría con la rotenona, barbiturato de sodio y azida de sodio? 3. ¿Si utiliza el indicador p±fenilendiamina en un sistema con cadena respiratoria, que cambios observaría con la rotenona, barbiturato de sodio y azida de sodio? 4. Indique usted los sustratos y enzimas que intervienen en los sistemas realizados en la práctica. 5. Grafique usted en una cadena de óxido reducción biológica, la acción de los inhibidores e indicadores utilizados en el experimento. 26 PRACTICA N° 09 DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE ÓXIDOREDUCCIÓN I. INTRODUCCION: Los carbohidratos, ácidos grasos, aminoácidos y algunas otras sustancias sufren oxidaciones en el organismo mediante sistemas enzimáticos simples o complejos. Estos sistemas están constituidos por proteínas, fosfolípidos, grupos prostéticos y átomos metálicos. De acuerdo a su estructura y función, las enzimas que intervienen en estos pr cesos se encuentran o clasificadas en diversos grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimológica. Las enzimas de óxido - reducción tienen una distribución característica intracelularmente, hallándolas de modo fundamental en una subestructura celular en donde la energía derivada de las oxidaciones es "capturada" en la forma del intermediario macroérgico ATP. La finalidad del presente trabajo es objetivizar la distribución intracelular de las enzimas de óxido - reducción usando los indicadores redox 2 - 6 diclorofenilindofenol y p - fenilendiamina y los componentes celulares de un homogeneizado de hígado de rata obtenidos por centrifugación dif rencial mediante el método de e Schreider y col. II. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0.1M pH: 7.4 2,6-diclorofenolindofenol 0.02 % Succinato 0.1M p±fenilendiamina 1% Homogenizado total de hígado de rata en sucrosa 0.25 M Fracción nuclear del homogenizado. Fracción mitocondrial del homogenizado. Fracción microsomal soluble del homogenizado. KCl 0.154 M III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Fraccionamiento Celular Cada grupo recibirá una rata albina (Rattus rattus var. albicans). El animal será sacrificado, inmediatamente se hara un corte longitudinal en el abdomen procediendo a extraer el hígado. Se coloca el hígado en un petri se elimina la cápsula del hígado y otros tejidos periféricos. Homogenizado al 10%: se pesa 10gr de hígado y se corta en fragmentos pequeños y se coloca en el homogenizador potter y se le agrega solución de KCl 0.154 M. Se hace presión manualmente con el embolo girando hacia el fondo. Todo debe trabajarse entre 0 y 4ºC. El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocándolo en tubos de polietileno, previa calibración en la balanza, se emplea una centrífuga refrigerada. El sobrenadante es separado en un beaker de 500ml. El sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca en un beaker de 100ml. El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15 minutos en la centrífuga refrigerada. Se separa el sobrenadante en un beaker, constituyendo la fracción microsomal con el citosol. El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fracción mitocondrial. - - 27 Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4 2 ± 6 diclorofenolindofenol Succinato de sodio 0.1M Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal -soluble Homogenizado total I 1.0 1.0 0.2 II 0.5 1.0 0.2 0.5 III 0.5 1.0 0.2 0.5 IV 0.5 1.0 0.2 0.5 V 0.5 1.0 0.2 0.5 Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador, para interpretar los resultados. Armar otro sistema, empleando: COMPONENTES Buffer fosfato 0.1M, pH 7.4 P ± fenilendiamina 1% (sustrato + indicador) Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal ±soluble Homogenizado total 0.5 0.5 1 1.5 0.5 2 1.0 0.5 0.5 3 1.0 0.5 0.5 4 1.0 0.5 5 1.0 0.5 - Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador, para interpretar los resultados. IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué es el 2,6-diclorofenolindofenol y cómo actúa en la cadena respiratoria? 2. ¿Qué es el p-fenilendiamina y cómo actúa en la cadena respiratoria? 3. Grafique usted en una cadena de óxido ± reducción biológica la acción de los indicadores rédox 2,6 diclorofenolindofenol y p±fenilendiamina. 4. ¿Qué es un homogenizado de hígado y cómo se obtienen las fracciones celulares por centrifugación diferencial? 5. ¿En que fracciones celulares se encuentran las enzimas de óxido ± reducción? 6. Haga un esquema de la centrifugación diferencial 28 PRACTICA N° 10 DETERMINACION DE AMILASA SERICA I. INTRODUCCION: La amilasa es una enzima que hidroliza el almidón. Si liberan alfa o beta maltosa, se les clasifica en alfa y beta amilasa. La amilasa salival y pancreática humana esta dentro del grupo de las primeras. La alfa amilasa actúa rompiendo los enlaces alfa 1-4 glucosídicos en la parte central de la amilasa formando una mixtura de pequeñas dextrinas + maltosa. La amilasa es un poliglucósido de configuración lineal de unidades de glucosa unidos por enlace alfa 1-4 glucosídicos. La amilasa comprende a sólo el 20% del almidón y es soluble en agua; el resto es una fracción inosoluble llamada amilopectina, difiere de la amilasa porque contiene además enlaces alfa 1-6 glucosídicos frecuentemente ramificados. Ambas, amilasa y amilopectina producen sólo B-glucosa por hidrólisis. En el suero humano, así como en la orina existe actividad amilásica. También ha sido informado en leche y en el semen humano. En la bilis no hay actividad. El origen de la amilasa sérica humana incluye al páncreas y glándulas salivales, las cuales explicarían probablemente menos del 25% de la actividad sérica normal. Otras fuentes incluyen el hígado, músculo estriado, trompa de Falopio y tejido adiposo. Los valores normales de amilasa por el método de Caraway calibrado en unidades Somogy es de 60 a 180. La amilasa puede ser detectada en niños desde 1 a 2 meses de edad y los valores son más bajos que en el adulto normal, pero al año de edad la actividad es igual a la del adulto. Entre 2 ± 12 horas después de producida la pancreatitis aguda, la amilasa se encuentra grandemente incrementada y retorna a los valores normales lentamente, con frecuencia 2-3 días después. Muy raramente permanece elevada 4-6 días. Si dentro de 24 horas no se eleva, no es probable el diagnóstico de pancreatitis aguda. La elevación puede ocurrir en otras condiciones que incluyen enfermedad de las glándulas salivales (pancreatitis), úlcera duodenal o gástrica penetrante o perforada, después de colangiografía, enfermedad séptica aguda del coledoco, trombosis mesentérica, obstrucción intestinal, peritonitis, uremia después de la administración de codeína, morfina, diuréticos tiazídicos, encefalitis viral, cirrosis, después de ruptura esplénica, carcinoma bronconígeno y en neumonía. Se ha reportado incremento después de la ingestión de alcohol. En algunas de estas condiciones, edema y pancreatitis están presentes indudablemente. En otros, la explicación no es clara. Para la mayor parte, las elevaciones son (con excepción de los niveles obtenidos después de la administración de opiáceos) menos de 500 unidades. Es posible encontrar valores más altos. En pancreatitis se llega hasta 2000 a 3000 unidades. Bajos niveles pueden encontrarse en pancreatitia crónica y en carcinoma pancreático cuando el daño es extenso y hay insuficiencia de las acinos glandulares. En los casos señalados se ha propuesto la prueba funcional de la amilasa sérica después de la administración de secretina y morfina. En normales, después de la administración secretina, la amilisa sérica se altera. En obstrucción de los conductos puede elevarse. Después de la administración de morfina en normales se incrementa la amilasa sérica; en pacientes con insuficiencias pancreática. Para la determinación de amilasa usamos el método de Caraway, en el que la cantidad de almidón y tiempo de incubación son ajustados de manera que sólo una porción de almidón es hidrolizado cuando la reacci n ó es parada por la adición de yodo. La diferencia entre la cantidad de color azul formado en la muestra incubada y el blanco incubado por la adición de suero después de la incubación, mide la cantidad de almidón hidrolizado y por ende la actividad de amilasa de la muestra. El presente experimento tiene por finalidad determinar la amilasa sérica en personas normales y/o con alteraciones patológicas especialmente del pancreas. 29 II. REACTIVOS A UTILIZAR: y Sustrato de almidón Bufferado, pH 7.0 : y Solución Stock de iodo : y Solución iodada de trabajo: III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): Armar el siguiente sistema: (Utilizar dos frascos volumétricos ± Erlenmeyer de 50 ml.) I PROBLEMA Sustrato de almidón Bufferado Retirar los frascos y agregar suero Retirar los frascos y agregar suero Agua destilada Solución iodada de trabajo. Mezclar bien. Leer 660 nm. en CÁLCULO Absorbancia del _ Absorbancia del blanco problema _______________________________________ X Absorbancia del blanco 5.0 ml. 0.1 ml. 35 ml. 5.0 ml. II BLANCO 5.0 ml. 0.1 ml. 35 ml. 5.0 ml. espectrofotómetro a Incubar a 37°C durante cinco minutos ambos frascos Mezclar e incubar a 37°C durante 7.5 minutos exactamente 800 = Unidades de amilada por 100 ml (Se requiere un blanco por cada muestra de suero, debido a que las proteínas séricas disminuyen la cantidad de color producido por el complejo yodo ± almidón y este podría ser diferente). IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. De qué manera el ión cloruro activa a la amilasa ¿Qué semejanza o diferencia puede establecer usted entre amilasa dializada y no dializada, en función de la actividad enzimática? ¿Cómo explica usted el diferente comportamiento de la amilasa hepática y pancreática sometidas a electroforesis? ¿Por qué la concentración de amilasa sérica es menor durante los primeros meses de vida lactante? 30 31 II UNIDAD METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS REUNION DE LABORATORIO N° 05 PRACTICA N° 11 DEMOSTRACION DE LA DIGESTION Y ABSORCION DE LOS CARBOHIDRATOS: GLICEMIA PRE Y POST-PRANDIAL. I. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea es una de las fuentes de energía más importantes en el organismo y en algunos tejidos altamente especializados. En el cerebro y los glóbulos rojos es la única fuente de energía. Por todo esto, el organismo dispone de una compleja maquinaria metabólica que permite asegurar la constancia de la concentración de glucosa en la sangre y, con ella, la constante disponibilidad de este sustrato a los tejidos. La glucosa en sangre, proviene de dos orígenes: de origen exógeno de los alimentos, y de origen endógeno, que proviene del hígado por glucogenólisis. Por otra parte, hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina, por lo tanto la concentración de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo. Diversos factores que inciden sobre la absorción, producción endógena de glucosa así como la utilización y excreción de la misma, contribuyen a mantener constante la concentración de glucosa en sangre. En el caso del hígado, el transporte de glucosa al interior de las células es por difusión pasiva, siendo el hepatocito permeable para este metabolito. En casi todos los demás tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las células por simple difusión, sino que lo hace por un mecanismo de difusión controlada, en particular en el tejido adiposo, el corazón y el músculo esquelético. El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a través de las células de la mucosa intestinal no es muy conocido. Se cree que está íntimamente ligado al transporte de sodio. Este proceso, por ello, se llama cotransporte, y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentración de sodio en fluído extracelular. En este caso la glucosa entra en la célula, posiblemente porque se une a la misma proteína transportadora que lleva el sodio. A su vez, el sodio, por la bomba de sodio y potasio, volvería a salir de la célula. Este mecanismo requiere ATP como fuente de energía. La entrada de la glucosa en estas células está supeditada a que, al salir del Na+ mantenga alta concentración en el líquido extracelular. Este es un caso interesante en que un sistema de transporte a través de la membrana favorecería a otro. Los valores normales de glucosa en sangre son variables de acuerdo al método utiizado. Según el método l de Folin Wu. Varía entre los 80 ± 120 mg%; con el método de la glucosa oxidasa la concentración varía entre 70 ± 110 mg/dl. El conocimiento de la glicemia es importante no sólo porque permite tener una idea integral del mecanismo de homeostasis metabólica existente, sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento. 32 La finalidad de la siguiente práctica es demostrar la digestión y absorción de la glucosa, cuantificando la glicemia pre y postprandial, por el método de Glucosa oxidasa; tanto en personas normales como en casos patológicos. II. REACTIVOS A UTILIZAR - Estándar: Solución de glucosa 1 g/l - GOD/POD: Solución de glucosa oxidasa (1,000 U/ml) y Peróxidasa (120 U/ml). - Reactivo 4- AF: Solución de 4 ± aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0.92 mol/l. - Reactivo Fenol: Solución de Fenol 55 mmol/l. - Preparación del Reactivo de trabajo: 500 partes de agua destilada, 50 partes de Reactivo 4- AF, 50 partes de Reactivo Fenol y llevar a 1,000 partes con agua destilada. Agregar 3 partes de enzimas GOD/POD previamente homogenizadas. Mezclar por inversión sin agitar. Rotular y fechar. III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES : Se tomarán dos muestras de sangre : La primera: La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra. La segunda: Esta muestra se tomará después de una hora, como máximo, después de la ingesta alimenticia. En esos momentos, se extraerán 5 ml. de sangre de la flexura del codo, con jeringa hipodérmica de 10 ml. y con aguja N° 20. Colocar las muestras en tubos de ensayo, se deja reposar 10 minutos, luego se centrifuga a 3000 RPM por 10 minutos. Separar el suero. La determinación de la glicemia se realizará por el método Enzimático de la glucosa oxidasa. Utilizar 4 tubos de ensayo: B (Blanco), S (Standard), Dpre. (Desconocido preprandial) y Dpost. (Desconocido post prandial), colocar: COMPONENTES Standard Muestra (suero preprandial) Muestra (suero postprandial) Reactivo de trabajo B ------------2 ml S 20 ul --------2 ml Dpre. ----20 ul ----2 ml Dpost. --------20 ul 2 ml Incubar todos los tubos 10 minutos en baño de agua a 37 ºC Leer en Espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco. Cálculo de los resultados : Glucosa (g/l) = D x f donde 1.00 g/l f = ----------- S y D = Dpre. y Dpost. Antes de multiplicar D x f, Restar a D el Blanco (B) y el resultado se multiplica por f. IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Actualmente, cuál es el rango considerado normal para la glicemia basal? Explique las variaciones en los valores, que usted puede encontrar por ejemplo en una intolerancia a la glucosa. 33 2. ¿Cómo esperaría encontrar los valores de la glicemia dosada en la sangre venosa y en la sangre arterial? Fundamente las variaciones que se pueden encontrar. 3. ¿Conoce otros métodos para determinar la glicemia? Explique su fundamento 4. ¿Cuál son los criterios bioquímicos, relacionados con la glicemia, para el diagnóstico de diabetes mellitus? 5. ¿Qué variaciones fisiológicas de glicemia puede usted señalar? PRACTICA N° 12 INFLUENCIA DE LA DIETA EN LA FORMACIÓN Y ALMACENAMIENTO DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO I. INTRODUCCION: El glucógeno está presente en el citosol en forma de gránulos los que contienen las enzimas glucógeno fosforilasa, glucógeno sintetasa y algunas otras que regulan la síntesis y degradación. La mayoría de los residuos de glucosa en el glucógeno están ligados por enlaces glucosídicos alfa 1,4 y las ramificaciones se forman por enlaces glucosidicos alfa 1,6 los cuales se presentan con frecuencia aproximada de uno por cada 10 residuos. El glucógeno puede ser aislado de los tejidos por digestión con soluciones de hidróxido de potasio caliente en los cuales los enlaces no reductores alfa 1,4 y alfa 1,6 son estables. El glucógeno es también fácilmente hidrolizable por alfa y beta amilasa para rendir glucosa y maltosa respectivamente. La acción de la beta amilasa también rinde una dextrina límite. El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa de fácil disponibilidad. Se encuentra glucógeno o se puede sintetizar en cualquier célula del organismo, pero las concentraciones varían en los diferentes tejidos correspondiendo las concentraciones más altas del hígado y al músculo esquelético, lugares principales de almacenamiento. En el hígado el glucógeno se incrementa después de la ingesta de alimentos (período post prandial) llegando a los límites máximos cuando la dieta es abundante y/o en base a carbohidratos. En cambio el glucógeno post prandial es debido a que la glucogénesis se incrementa cuando las concentraciones en sangre alcanzan valores de 150 mg/100 ml ó más. La finalidad de la siguiente práctica es cuantificar el glucógeno en ayunas y después de la uingesta de alimentos y evaluar los valores encontrados relacionados con los factores que determinan sus síntesis y degradación II. REACTIVOS A UTILIZAR - KOH al 60 % - Na2S04 solución saturada. - Alcohol absoluto. - Fenol al 80 % - H2S04 concentrado. - Homogenizado de hígado de rata al 10 % (pesar 10 g. de hígado y homogenizar con agua destilada.) III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. EXTRACCION DE GLUCOGENO HEPATICO (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Homogenizado de hígado en ayunas Homogenizado de hígado post prandial I 0,5 --II --0,5 34 KOH al 60 % 0,5 0,5 Calentar los tubos en baño maría a 100 C por 10 min. Alcohol al 98 % 5,0 5,0 Na 2SO4 solución saturada. 0,1 0,1 Mezclar. Reposo por una hora. Centrifugar a 3500 RPM por 10 min. Eliminar el sobrenadante y colocar boca a bajo los tubos sobre papel de filtro por 5 minutos. Agregar agua destilada 5,0 5,0 Disolver el precipitado por agitación. CUANTIFICACION POR METODO COLORIMETRO DEL GLUCOGENO EXTRAIDO Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml)) I II BLANCO Muestra del tubo I del Sistema anterior««««««« 1,0 --Muestra del tubo II, del Sistema anterior« -1,0 -Agua destilada 1,0 1,0 2,0 Fenol al 80 % 0,1 0,1 0,1 Mezclar. Colocar los tubos en agua helada durante 5 min. y sin retirar los tubos del baño helado: Agregar H2S04 cc. gota a gotaen el centro de c/tubo 5,0 5,0 5,0 Mezclar y dejar en el baño de agua helada durante 5 minutos más. Leer en el fotocolorímetro con filtro verde, 540 n m. CALCULOS: Factor Espectrofotómetro = 7 g % de glucógeno = (Lec.I ± Lect. Blanco) x Factor IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones de ayuno? Dé usted las razones metabólicas que expliquen su resultado. 2. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones post prandial? 3. ¿Qué relaciones metabólicas puede usted establecer entre los valores de glucógeno obtenidos en ambas muestras de hígado de rata, motivo del experimento? 4. ¿Porqué mecanismo metabólico el glucógeno incrementa cuando la concentración de glucosa en sangre es mayor de 150 mg/dl? 5. Explique los mecanismos que regulan la homeostasis de la glucosa y el rol del glucógeno durante el ayuno prolongado. 35 REUNION DE LABORATORIO N° 06 PRACTICA N° 13 REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA ACCION DE LA HORMONA INSULINA I. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea proviene de: glucógeno hepático, aminoácidos, otros carbohidratos y de glucosa absorbida por el intestino. En condiciones normales, en ayunas, la glicemia es muy constante. Siendo en la sangre arterial mayor que en la venosa. La glicemia se eleva después de la ingestión de un alimento rico en hidratos de carbono para luego descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas después de la ingestión vuelve al nivel de ayunas. La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos, pues es utilizada por todas las células para producir energía y por algunas células para funciones más especializadas por ejemplo glucogénesis, lipogénesis y otras semejantes. Los mecanismos reguladores de la concentración de glucosa son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los primeros actúan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las glándulas de secreción interna, de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la producción y la utilización de la glucosa sanguínea; cuya sensibilidad está regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipófisis por el otro. La insulina ejerce efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otros nutrientes. Esta hormona es producida por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas y es secretado en respuesta directa al incremento de glucosa en la sangre. El efecto más importante de una deficiencia insulínica es el de un nivel sanguíneo de glucosa elevado (hiperglicemia), una excesiva excreción de glucosa por la orina (glucosuria) y un reducido nivel de glucógeno en el hígado. La administración de insulina va seguida de la glicemia (hipoglicemia) cuya magnitud depende de la dosis administrada; el efecto se debe fundamentalmente a que la hormona favorece la formación de glucógeno en el hígado y en el músculo, a la vez que acelera la oxidación de glucosa en diferentes tejidos. La insulina también favorece la conversión de los hidratos de carbono en ácidos grasos y por otro lado inhibe la gluconeogénesis a partir de los aminoácidos. Se explica así que la falta de insulina determina una hiperglicemia que es el signo fundamental del cuadro denominado Diabetes. La secreción de insulina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia, de manera que cada vez se eleva la glicemia, se produce más insulina que tiende a aminorarla. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de administración de insulina. II. REACTIVOS A UTILIZAR - Conejos adultos de más de 2 kg. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas. - Solución de insulina cristalizada (Lilly): I Unidad por ml. - Jeringas hipodérmicas de 1 cc. - Glucómetro. 36 III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. y y Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de insulina a inyectar. Dosis de la solución de insulina cristalina (I Unidad por ml) inyectar I Unidad por Kilogramo de peso corporal. Utilizar una jeringa hipodérmica de 1 ml, que facilita la medida de la dosis. EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE INSULINA.  Extraer una primera muestra de sangre del pabellón auricular del conejo. La que servirá para establecer los valores basales de glicemia.  Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de insulina.  Luego extraer muestras de sangre a los 15 , 30 y 60 minutos después de inyectada la insulina, lo que hace un total de tres muestras en una hora. Anotar los resultados en relación al tiempo. Hacer una gráfica de glicemia vs tiempo       IV. CUESTIONARIO: 1. Explique la naturaleza química y las acciones biológicas de la insulina. 2. Explique brevemente la regulación de la glicemia, como resultado, en términos generales, de la tasa de llegada e índice de salida de la glucosa de la sangre. 3. Explique el mecanismo de acción de la insulina en la homeostasis de la glucosa. 4. ¿Cuáles son las hormonas contrarreguladoras y su mecanismo de acción? 5. Explique cómo y porqué se producen los signos y síntomas del cuadro clínico de hipoglicemia. 37 ACCION DE LA HORMONA ADRENALINA I. INTRODUCCION: La adrenalina, hormona secretada por la médula suprarrenal, tiene acción hiperglicemiante; ello se debe a que favorece la conversión del glucógeno en glucosa (glucogenólisis) en el hígado, además de actuar en el músculo, por la ausencia en este de la glucosa 6- fosfatasa, la glucogenólisis se realiza con la formación de lactato el que va ha contribuir directamente a la formación de glucosa y glucógeno en la célula hepática por los mecanismos gluconeogenéticos. El efecto glucogenolítico de la adrenalina es debido a que activa a la fosforilasa. La secreción de adrenalina parece estar condicionada en forma importante por el nive de glicemia, si l aparece hipoglicemia se segrega más adrenalina y glucagón que aceleran la regulación que espontáneamente debe realizar el hígado. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de la administración de adrenalina. II. REACTIVOS A UTILIZAR - Conejos adultos de más de 2 kg de peso corporal, sometidos a ayuno de 8 a 12 horas. - Solución de adrenalina 0,1 mg por ml. - Jeringas hipodérmicas de 1 cc. - Glucómetro. III. ACTIVIDADES INTRUCCIONALES: Procedimiento  Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de adrenalina a inyectar.  Dosis de la solución de adrenalina (0,1 mg/ml) inyectar 0,025 mg por cada kilogramo de peso corporal que corresponde a 0,25 ml de la solución a utilizar por kg de peso. Utilizar una jeringa hipodérmica de tuberculina que facilita la medida de la dosis. EXTRACCION DE ADRENALINA. LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE 1. Extraer una primera muestra de sangre, del pabellón auricular del conejo. Servirá para establecer los valores basales de glicemia. 2. Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de adrenalina según el peso del animal. 3. Luego extraer muestras de sangre a los 15 , 30 y 60 minutos después de inyectada la adrenalina, lo que hace un total de tres muestras en una hora. 4. Con cada una de las citadas muestras realizar los dosajes de glucosa según el método de Glucocinta 5. Con los resultados así obtenidos, construir una gráfica, tomando las variaciones en relación al tiempo. Anotar los resultados en relación al tiempo. ¡ ¡ ¡ IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. Explique la naturaleza química y las acciones fisiológicas de la adrenalina. ¿Cuál es el mecanismo de acción hormonal de la adrenalina a nivel de sus órganos blanco? Explique de manera suscinta el efecto de la adrenalina sobre la glicemia; con especial referencia al metabolismo de los carbohidratos. ¿Cuál es el efecto metabólico de la adrenalina sobre el hígado y sobre el tejido muscular y que efecto produce sobre la glicemia? 38 5. ¿Qué efectos tiene la adrenalina, sin tomar en cuenta su acción en el metabolismo hidrocarbonado? REUNION DE LABORATORIO N° 07 PRACTICA N° 14 DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA EN ORINAY SU DIFERENCIACIÓN DE OTROS AZUCARES REDUCTORES I. INTRODUCCION: En la orina de sujetos normales no existen cantidades detectables de azúcares en orina. Sin embargo, es posible encontrar cierta cantidad de elementos reductores que se eliminen diariamente entre 0,5 y 1,5 g/l. Los azúcares forman más o menos la décima parte de dicha cantidad y de ella no puede decirse que su totalidad esté constituída por glucosa. La glucosa del filtrado glomerular renal se reabsorbe en su totalidad en los tubos contorneados proximales, y por tanto es explicable que no aparezca glucosa en orina, pero cuando la glicemia supera los 180 mg % se puede producir glucosuria (presencia de glucosa en orina) porque en estas condiciones se supera la capacidad del riñón para reabsorverla (dintel renal). Cuando la capacidad de reabsorción renal disminuye, la orina en glucosa aparece aunque ésta se encuentre en concentraciones normales en la sangre (diabetes insípida). Por el contrario, cuando existe insuficiencia renal (menor filtración) no aparece glucosa en la orina aunque la concentración de glucosa se encuentra elevada por encima de 180 mg %. En la orina, además de glucosa, puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que podemos señalar: a) Otros azúcares reductores: lactosa, fructuosa, galactosa y pentosas. b) Otros compuestos orgánicos: ácido homogentísico, creatinina, ácido úrico, ácido glucorónico, ácido ascórbico. c) Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato cloral, formaldehído, etc. Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza para determinar glucosa en orina, pero como anotamos éste identifica a las sustancias con capacidad reductora y por tanto es de carácter inespecífico. La glucosa puede ser determinada de manera específica utilizando como reactivo básico la glucosa oxidasa (método enzimático), de uso generalizado en clínica. La prueba está basada en que la glucosa urinaria en presencia de oxígeno, por acción de la glucosa oxidasa produce ácido glucorón más peróxido de ico hidrógeno. Este, en presencia de peroxidasa produce 0-tolidina oxidasa (de color azul) más agua. La glucosa oxidasa, en presencia de glucosa (sustrato) de la orina remueve de éste 2 iones hidrógeno (2H+) formando gluconolactona), el cual es hidratado a ácido glucónico. Los iones hidrógeno removidos se combinan con el oxígeno atmosférico y forman peróxido de hidrógeno (H2O2). El peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa oxida a la 0-tolidina y toma color azul. La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras, utilizando un método específico a base de glucosa oxidasa y otro inespecífico en base al reactivo de Benedict. II. REACTIVOS A UTILIZAR 39 - Reactivo de Benedict. Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas (Glucocinta Lilly). III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. Determinación de sustancias reductoras en orina mediante el reactivo de Benedict. 1. Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml. Llevar al baño de agua hirviendo por 5 min o exponer el tubo al fuego directo hasta que hierva por 1 min. Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del líquido contenido en el tubo. Agitar para evitar que el líquido se proyecte hacia fuera del tubo. Agregar orina problema: 5 gotas. Colocar en baño de agua hirviendo por 5 min o exponer al fuego directo hasta ebullición por 1 min. Observar si hay cambio de color y precipitado. Si aparece un precipitado de color rojo ladrillo, la reacción demuestra la presencia de sustancias reductoras. 2. 3. 4. Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras, realizamos la siguiente determinación con la misma muestra de orina. Determinación enzimática de la glucosa en orina (Método de la glucosa oxidasa). Procedimiento: 1. 2. 3. Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recién emitida contenida en un depósito de 5- 10 ml. Observar si a los 60 segundos, después de humedecida la cinta, adquiere o no color azul. Compare la intensidad de la coloración azulada con una escala adjunta que representa aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa. IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. Fundamente la utilización del reactivo de Benedict para la detección de sustancias con capacidad reductora, incluida la glucosa Que resultados podrían obtenerse al tratar una muestra problema de orina, primero con el reactivo de Benedict y luego por el método de la glucosa oxidasa Que presunciones plantearía si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de Benedict da resultado positivo y sin embargo, al ser tratada con el método de la glucosa oxidasa, da negativo Ante una prueba positiva de glucosa en orina: ¿Qué presunciones diagnósticas, en relación a la glicemia del paciente podría plantear? Explique el fundamento del método de a glucosa oxidasa para la detección de glucosuria. Explique que es el umbral renal de la glucosa. 4. 5. 6. 40 41 PRACTICA N° 15 IDENTIFICACION DE MUCOPOLISACARIDURIA I. INTRODUCCION: Determinar desórdenes genéticos puede involucrar los sistemas enzimáticos esenciales del metabolismo de los mucopolisacáridos. Los mucopolisacáridos son sustancias de gran peso molecular que se encuentran en varios tejidos: Conectivo, cartílago, cordón umbilical, aorta, válvulas del corazón y son responsables de las características físicas de estas estructuras. De acuerdo a su composición química los mucopolisacáridos están agrupados en dermatán sulfato, heparán sulfato y queratán sulfato, los cuales son excretados anormalmente en grandes cantidades en las mucopolisacaridosis (MPS). Estas son subdividas en varios grupos tales como : Síndrome de Morquiolo, Síndrome de Hurler, Síndrome de Hunter, Síndrome de Sanfilippo, llamados también MPS I, II, III y IV. Los individuos con MPS secretan grandes cantidades de mucopolisacáridos, cerca de 100 mg/día, cantidad que es bastante elevada si se compara con los 15 mg/día que excretan las personas normales. La presencia de mucopolisacáridos en orina puede detectarse por un simple procedimiento o Test de Identificación de Mucopolisacáridos que se basa en que el papel Whatman I impregnado con el colorante AZURE-A, en contacto con mucopolisacpáridos forma un complejo de color púrpura metacromático, resultado obtenido cuando la excreción está sobre el límite superior normal de 15 mg/día. La finalidad del experimento es determinar cualitativamente en orina la excesiva excreción de mucopolisacáridos. II. REACTIVOS A UTILIZAR - Papel Whatman I impregnado con Azure-A - Solución de Lavado :  Metanol  Acido acético glacial  Agua destilada. III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. - Usar orina fresca o de 24 hrs conservadas en refrigeración (no usar preservantes). - La orina turbia debe ser filtrada o centrifugada previamente. - Poner una gota de orina al centro de un papel de prueba con Azure-A. Dejar 3 min. Transferir a una caja Petri llena de solución de lavado. Dejar por 20 min. Sacar y secar la tira de papel en estufa a 80º C o con aire caliente. RESULTADOS Positivo: aparición de un color púrpura. Negativo: aparición solamente de un color azul pálido. Un resultado positivo por este procedimiento debe ser confirmado y cuantificado por columna cromatográfica ó utilizando la reacción de precipitación con cloruro de cetil piridium. IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. Si un resultado cualitativo para investigar mucopolisacáridos en orina ha sido positivo ¿Porqué debe ser confirmado y cuantificado por cromatografía o precipitación? ¿Cuál es la constitución química básica de los glicosaminoglicanos (mucopolisacáridos)? ¿Cuál es la constitución química básica de los proteoglicanos? Cite 5 ejemplos de éstos. 20 ml. 0,1 ml. 300 ml 42 4. ¿Cuál es la importancia biológica del ácido hialurónico, condroitina y heparina? III UNIDAD METABOLISMO DE LIPIDOS REUNION DE LABORATORIO N° 08 PRACTICA N° 16 DEMOSTRACIÓN DE LA DIGESTION DE LAS GRASAS IN VITRO. ACCION EMULSIFICANTE DE LAS SALES BILIARES SOBRE LAS GRASAS. ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA SOBRE LOS TRIGLICÉRIDOS Y EFECTO DE LAS SALES BILIARES I. INTRODUCCION: Los triglicéridos son los principales lípidos de la dieta. En el estómago ocurre la acción de la lipasa gástrica y la licuefacción de la masa de lípidos de los alimentos por contraccion peristálticas. La es principal digestión ocurre en el duodeno, tiene lugar en la interfase agua-lípido y su velocidad depende del área de superficie de la interfase, la cual es grandemente incrementada por el movimiento peristáltico del intestino combinado con la acción emulsificante de los ácidos biliares. Los ácidos biliares son moléculas anfipáticas sintetizados por el hígado a partir del colesterol y secretados como conjugados de glicina y taurina. La lipasa pancreática (Triacilglicerol lipasa) cataliza la hidrólisis de los triglicéridos en sus posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto con ácidos grasos. La actividad enzimática de la lipasa pancreática incrementa grandemente cuando contacta la interfase agua-líquido, un fenómeno conocido como activación interfacial. La unión a la interfase agua-líquido requiera la colipasa, una proteína de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con la lipasa pancreática (449 residuos), con cambios conformacionales que f rma una o superficie hidrofóbica y deja libre el centro activo. La alteración en la digestión o absorción de las grasas produce esteatorrea La finalidad de la práctica es demostrar la acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando su efecto con el agua y el cloroformo. Asimismo la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y el efecto de las sales biliares. II. REACTIVOS A UTILIZAR III. Cloroformo Aceite vegetal, de olivo Solución de sales biliares Buffer fosfato 0.1M pH 8,0 Emulsificación de aceite vegetal Solución de fenolftaleina (Solución alcohólica) Hidróxido de sodio (NaOH) 0.1N ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento 43 y Acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas utilizando tubos de 15 x 125 mm. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Aceite de olivo(gotas) Agua destilada (ml) Cloroformo (ml) Sales Biliares (ml) Agitar enérgicamente los tubos Dejar en reposo y anotar los resultados para interpretarlos Acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y efecto de las sales biliares sobre la reacción enzimática utilizando tubos de 20 ± 25 x 150 mm. COMPONENTES (ml) TUBOS Emulsificación de aceite vegetal Buffer fosfato 0.1M pH 8.0 Solución de sales biliares 1 % Solución de extracto pancreático 1 % Agua destilada I 2 2 2 3 II 3 2 2 2 III 3 2 2 2 IV 3 2 2 2 Tubo 1 3 5 Tubo 2 3 3 2 Tubo 3 3 2 - Mezclar los 4 tubos y llevar al baño maría a 37 °C , por 30 minutos, agitando de vez en cuando. Al finalizar el tiempo de incubación retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftaleína. Mezclar bien y luego realizar la titulación. TITULACION: Utilizando una pipeta graduada de 1 ml, dejar caer gota a gota NaOH 0,1N en el fondo de cada tubo del sistema, mezclar bien hasta la aparición de un color rosado tenue persistente. Anotar la cantidad de NaOH 0,1N gastados. Anotar los resultados para su interpretación. IV. CUESTIONARIO: 1. Explique lo que son sustancias anfipáticas. 2. Diferenciar emulsión de solución, acción de las sales biliares vs cloroformo. 3. ¿Cuántas clases de lipasa pancreática actuán en el intestino? 4. Cuál de los métodos para medir la actividad enzimática se ha empleado en esta práctica. Explique el papel de la fenolftaleína en la titulación. 5. Diferencie la absorción de los ácidos grasos según su tamaño. 44 PRACTICA N° 17 DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS PRE Y POST PRANDIAL EN SUERO HUMANO I. INTRODUCCION: Los lípidos de la dieta son principalmente triglicéridos. Son transportados junto a colesterol y fosfolípidos por los quilomicrones, formados en el enterocito. Los quilomicrones son las lipoproteínas más grandes, menos densas, ricas en triglicéridos, con la apoproteína apo B48. Por el conducto toráxico llegan a la circulación general. El pico máximo de lipemia postprandial se observa entre las 4 y 6 horas de la ingesta, y al cabo de 9 a 10 horas retorna a los valores basales de lípidos, especialmente de los triglicéridos. Los niveles de lípidos postprandiales, especialmente de los triglicéridos dependen de la cantidad de lípido de la dieta, de la digestión y absorción, de los niveles basales sanguíneos, de la acción de la lipasa lipoproteic en los tejidos extrahepáticos. La lipasa a lipoproteica actúa sobre los triglicéridos de los quilomicrones, liberando ácidos grasos que son captados por los tejidos extrahepáticos. Los quilomicrones son convertidos en remanentes de quilomicrones y captados por el hígado. Se ha considerado al incremento de la lipemia postprandial como un factor riesgo de aterogénesis. La finalidad de la práctica es demostra las variaciones de la concentración de trigliceridos en suero después de la ingesta de alimentos de alto contenido de grasas II. REACTIVOS A UTILIZAR - Reactivo enzimático para determinación de Triglicéridos ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Un alumno por cada mesa vendrá en ayunas de al menos 10 horas, a las 7 a.m. se les extraerá una muestra basal. Ingerirán una dieta rica en grasas conteniendo un vaso de leche, un huevo, 2 panes y 10 aceitunas. A las 4 y 7 horas de la ingesta, se obtendrá una segunda muestra. Se obtendrá el suero y se hará la determinación de triglicéridos. Armar el siguiente sistema. COMPONENTES BLANCO STANDARD DESCONOCIDO Muestra --------10 ul Standard ----10 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar e incubar 10 minutos de 20« 25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. Medir la absorbancia del Standard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A). Cálculos: III. C ! 200 v (ADesconocid o ?mg / dl A (AStandar 1.71 mmol/l 2.28 mmol/l C ! 2.28 v (ADesconocido ?mmol / l A (AStandar Valores Referenciales Sospechoso: sobre 150 mg/dl ó Elevado: sobre 200 mg/dl ó 45 IV. CUESTIONARIO: 1. Cuál es el efecto de la edad, el ejercicio y el género sobre la lipemia postprandial. 2. Alteración de la lipemia postprandial en diabetes y familiares de diabéticos. 3. Destino de los productos de acción de la lipasa lipoproteica sobre los triglicéridos. 4. Explique porqué el incremento de la lipemia postprandial es considerado un factor de riesgo coronario. 5. Grafique los cambios de triglicéridos postprandiales en función del tiempo. 46 PRACTICA N° 18 IDENTIFICACIÓN DE LOS CUERPOS CETONICOS EN LA ORINA. DETERMINACION SEMICUANTITATIVA DE CUERPOS CETONICOS EN ORINA I. INTRODUCCION: La beta oxidación de los ácidos grasos en el hígado, a nivel mitocondrial, produce acetil CoA que ingresa al Ciclo de Krebs y en parte se utiliza en la síntesis de cuerpos cetónicos (cetogénesis). Estos son el ácido acetoacético, el ácido beta hidroxibutírico y la acetona. Los dos primeros pasan a la sangre y son fuente de energía en los tejidos extrahepáticos como el corazón y el músculo esquelético, incluyendo el cerebro en el ayuno prolongado. Los cuerpos cetónicos son eliminados por la orina y la a etona también por la c respiración. Su concentración normal en orina es de 125 mg/ 24 horas, y en sangre hasta 1mg/dl. Aumentan en sangre (cetonemia) y en orina (cetonuria) por condiciones fisiológicas como el ayuno prolongado, en la dieta pobre en carbohidratos. En condiciones patológicas como la Diabetes mellitus, el hiperinsulinismo, en la enfermedad de Von Gierke y otras glucogenosis, en los vómitos, en el síndrome de Fanconi, en toda hipercatabolia como la fiebre, hipertiroidismo. En la Diabetes mellitus, el aumento de la lipólisis, de la beta oxidación y de la cetogénesis, al superar la capacidad de oxidación de los tejidos extrahepáticos lleva a niveles aumentados de cuerpos cetónicos. Dado que éstos son ácidos se produce acidosis metabólica, a l denominada cetoacidosis diabética. El diagnóstico y monitoreo de su tratamiento se hace con su determinación en sangre o/i orina. REACTIVOS A UTILIZAR: - Sulfato de amonio, cristales. - Nitroprusiato de sodio, solución al 10% en H2O - Cloruro Férrico, solución al 5% en H2O. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento INVESTIGACION DE ACETONA - Disponer de dos tubos que contengan orina normal y orina patológica. Prueba de Legal El nitroprusiato de sodio diluido en presencia de cuerpos cetónicos, especialmente de acetona, rinde un color azul violeta. Procedimiento: Armar el siguiente sistema: COMPONENTES TUBO Orina 3 ml Cristales de sulfato de amonio 0.5 g Mezclar hasta disolver los cristales de Sulfato de Amonio. Nitroprusiato de sodio 10% 3 gotas Amoníaco (agregar lentamente por las paredes del tubo, sin mezclar) 1ml _________________________________________________________________________ Anotar sus resultados. Prueba de Rothera y Trabajar del tubo identificado como orina patológica y Utilizar nitroprusiato en polvo, de la siguiente manera: II. III. 47   En una lámina de porcelana con excavaciones colocar 0.2 g de reactivo sólido de nitroprusiato de sodio en cada una de éstas. Diluir la orina al 1/10, 1/20, 1/30, etc; de la siguiente manera: AGUA 0.9 cc 1.9 cc 2.9 cc 3.9 cc 4.9 cc + + + + + ORINA 0.1 cc 0.1 cc 0.1 cc 0.1 cc 0.1 cc DILUCION 1/10 1/20 1/30 1/40 1/50   Agregar una gota de cada una de las diluciones, en cada una de las excavaciones que contiene el reactivo. Observar la máxima dilución de la orina en el que aparece color azul violeta y multiplicar por el denominador de la dilución alcanzada por 10 y se tendrá la cantidad aproximada de acetona en mg por 100ml. Esto es debido a que el nitroprusiato de sodio en polvo da reacción positiva solo cuando en la orina sin diluir alcanza la concentración mínima de 10 mg% de acetona y por eso, para calcular la concentración en orina diluida, se debe multiplicar por 10 el número de veces que se ha diluido ésta. Este método con sus dos variantes es posible aplicarlo al suero sanguíneo, para investigar acetona y tener una cifra aproximada en su cuantía. Uso de tira reactiva. Sumergir la tira en el frasco conteniendo la orina. Esperar 20 segundos, leer en escala colorimétrico, estimando la concentración como negativo 5, 15, 50, 150 mg/dl. INVESTIGACIÓN DE ACIDO ACETOACETICO - Armar dos sistemas que contengan orina normal y patológica. Prueba de Cloruro Férrico o de Gerhart. Se basa en que en presencia de cloruro férrico, el ácido acetoacético rinde una coloración rojo burdeos. Procedimiento (Se utiliza orina filtrada): COMPONENTES Orina filtrada Cloruro Férrico, solución 5% en agua TUBO 5 ml gota a gota hasta la aparición del Color rojo burdeos si existe ácido Acetoacético IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. 5. Realice una comparación entre la síntesis de cuerpos cetónicos con la etapa inicial de la síntesis de colesterol Defina: cetonemia, cetonuria, cetoacidosis y de ejemplos de cada uno de ellos. Compare los métodos para determinar los cuerpos cetónicos. Cuál es la importancia de la cuantificación de los cuerpos cetónicos en el monitoreo de la cetoacidosis. Cuál es el mecanismo fisiopatológico de la cetoacidosis en un paciente que llega al hospital por alcoholismo agudo 48 REUNION DE LABORATORIO N° 09 PRACTICA N° 19 DETERMINACION DE PERFIL LIPIDICO I. INTRODUCCION: El colesterol es un componente importante de las biomembranas, regulando su fluidez. A partir de él se forman los ácidos biliares y las hormonas esteroideas. Es transportado principalmente por la LDL que es considerada aterogénica, y el resto en la VLDL y HDL. Los triglicéridos an ayunas circulan unidas a las VLDL y son fuente de energía para los tejidos; su incremento también es considerado factor de riesgo coronario. La HDL realiza el transporte reverso del colesterol, de los tejidos hacia el hígado y es considerada antiaterogénica .El III Panel de Expertos ha establecido los valores de referencia para el colesterol, el HDL, y el LDL. En el colesterol se considera 3 niveles: Deseable < 200 mg/dl, limítrofe alto 200-239 y alto definitivo > 240 (Hipercolesterolemia > 200 mg/dl). El HDL colesterol, 3 niveles: Bajo o de riesgo < 40, normal a 40 a 59, alto o protector mayor o igual a 60. El LDL colesterol, 5 niveles: Óptimo < 100 mg/dl. En los triglicéridos se considera: normal menos de 150mg/dl, limítrofe de 150 a 199, Hipertrigliceridemia moderada de 200 a 499, severa 500 o más La hipercolesterolemia puede deberse a causas primarias o secundarias. Entre las hipercolesterolemias primarias se señalan: La hipercolesterolemia familiar, la hipercolesterolemia poligénica, la hiperlipidemia familiar combinada, la disbetalipoproteinemia. Entre las secundarias: La diabetes, el lipoteroidismo, el síndrome nefrótico, ictericia obstructiva, cirrosis biliar.. La hipertrigliceridemia puede deberse a causa primarias o familiares, o secundarias a otras enfermedades. Son hipertrigliceridemias primarias, la hiperlipidemia familiar combinada la hiperkilomicronemia, la hipertrigliceridemia familiar. Son causas secundarias: la diabetes, el hipotiroidismo, la gota, el alcoholismo, el uso de anticonceptivos orales, etc. La hipertrigliceridemia se asocia a disminución de HDL, obesidad central, resistencia a la insulina, hiperglicemia e hipertensión, en el denominado síndrome metabólico. En la presente práctica, se realizará la determinación de colesterol sanguíneo, por el método enzimático y la determinación de HDL, previa precipitación de las otras lipoproteínas. II. REACTIVOS A UTILIZAR: - Reactivo Standard para colesterol 50 mg/dl. - Reactivo precipitante de HDL: ácido fosfotungstico, clorhidrato de magnesio. - Precipitante para macro ensayos (PRECa) - Precipitante para semimicro ensayos (PRECb) ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN DE COLESTEROL SANGUÍNEO Armar el siguiente sistema: COMPONENTE BLANCO PROBLEMA ESTÁNDAR Suero ----10 ul ----Estándar 200 mg/dl --------10 ul Reactivo enzimático 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar, incubar 10 minutos de 20«25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. Medir la absorbancia del Starndard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A) III. 49 CALCULOS VALORES REFERENCIALES: Sospechoso: sobre 220 mg/dl Elevado: sobre 260 mg/dl DETERMINACIÓN DE HDL -COLESTEROL: Armar el siguiente sistema: ó 5.7 mmol/l ó 6.7 mmol/l Componente Macro Semi-micro Suero 500 ul 200 ul PRECa 1000 ul ----PRECb ----500 ul Mezclar bien, incubar por 10 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar for 2 minutos a 10000 RPM, alternativamente por 10 minutos a 4000 RPM Después de centrifugar separar el sobrenadante del precipitado y determinar la concentración de colesterol: Componente Blanco Standard Desconocido Agua Destilada 100 ul --------Standard ----100 ul ----HDL sobrenadante --------100 ul Reactivo de trabajo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar, incubar por 5 minutos a 37 ºC o 10 minutos a 20«25 ºC. Leer las absorbancias del desconocido y del Standard, respectivamente, comparando con el blanco; dentro de 60 minutos ( A). CALCULOS: Concentración HDL-Colesterol: Macro método : ¤ C ! 150 v A Desconocid o A Standard mg/dl Semi  micro método : ¤ C ! 175 v A Desconocid o A Standard mg/dl TG 5 Concentración de LDL-Colesterol: VALORES DE REFERENCIA: HDL-Colesterol: Hombres LDL  C ! TC  HDL  C  ?mg/dlA Mujeres (mg/dl) ¢ standard £ ¢ ! 200 v muestra ?mg/dl A ó ! 5.17 v ¢ ¢ muestra standard ?mmol/l A ¤ ¤ £ 50 Normal > 55 Bajo riesgo 35-55 Riesgo elevado < 35 LDL-Colesterol: Sospechoso: Elevado: IV. CUESTIONARIO: > 65 45-65 < 45 150 mg/dl 190 mg/dl 1. Señale la importancia fisiológica del colesterol. 2. Señale la importancia clínica del colesterol. 3. Realice una breve descripción de hipercolesterolemia familiar y su relación con la cardiopatía isquémica. 4. Alteraciones del perfil lipídico en la diabetes y en el hipotiroidismo. 5. Señale las principales causas de HDL disminuido. 6. Realice una breve explicación del rol de la LDL en la aterogénesis. 7. Cuál es la importancia de la hipertrigliceridemia en la aterogenesis. 8. Cualés son las causas primarias de hipertrigliceridemia. 51 PRACTICA N° 20 HIPERLIPEMIA EXPERIMENTAL I. INTRODUCCION: El aumento de los lípidos sanguíneos o hiperlipidemia constituye una situación metabólica de riesgo, especialmente coronario. Se considera aterogénicos el aumento del colesterol y de los tigliceridos. Las hiperlipidemias pueden ser primarias o familiares como la hipercolesterolemia familiar, la hiperlipidemia familiar combinada, la hipertrigliceridemia familiar etc. Y secundarias a otras patologías como la diabetes, hipotiroidismo, sidrome nefrotico, etc. La dieta es importante en el control de la hiperlipidemia, como parte del cambio de estilo de vida junto al ejercicio y control de peso. La ATP III, ha establecido los criterios para una dieta adecuada que incluye disminución de la ingesta de colesterol, disminución de las grasas saturadas, aumento de las grasas monoinsaturadas y polinsaturadas. Una dieta rica en grasas saturadas aumenta el riesgo de hiperlipidemia y consiguiente mayor riesgo coronario. En el presente experimento, se busca mostrar como la ingesta de una dieta rica en grasa saturada con sebo de pollo por 3 semanas; puede producir el incremento de los lípidos sanguíneos. Se determinará el perfil lipídico antes y después del tratamiento y se compararan los resultados. II. REACTIVOS A UTILIZAR:  Ratas de peso aproximado de 200gr.  Sebo de pollo.  Dieta standard para ratas a base de maíz.  Set de determinación de colesterol enzimático.  Set de determinación de triglicéridos enzimático.  Reactivo precipitante para HDL. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procemiento  Tratamiento experimental. Se dispondran de 20 ratas albinas adultas. Las cuales se dividirán en dos grupos en forma aleatoria. o Diez de ellas constituirán el grupo control y seguiran su dieta habitual agua y alimentos (maíz) ad libitum. o Las diez restantes conformaran el grupo experimental, las que recibiran adicionalmente 2 cc de aceite preparado de sebo de pollo. El tratamiento será por 21 días, 1-2 representantes de cada mesa se encargarán del control de la dieta, bajo la supervisión del personal de la sección. Extracción de las muestras. Con la ayuda del personal de la sección, cada mesa obtendrá de cada rata control y experimental una muestra sanguínea de la cola antes del tratamiento y otra al final. Se extraera el suero y a cada una se determinara el perfil lipídico siguiendo el método enzimático empleado en la práctica anterior. Se compararán los valores de colesterol, HDL, LDL y triglicéridos entre ambas ratas. III.    52 IV. CUESTIONARIO: 1. Señale en detalle la dieta recomendada por la ATP III, para el tratamiento de la hiperlipidemia. 2. Qué alimentos son ricos en grasas saturadas. 3. Qué alimentos son ricos en colesterol. 4. Qué alimentos son ricos en grasas monoinsaturadas. 5. Qué alimentos son ricos en grasas polinsaturadas. 6. Qué alimentos son fuentes de omega 3. 7. Qué alimentos son fuentes de fibra. 53 IV UNIDAD PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS: INTEGRACION DEL METABOLISMO REUNION DE LABORATORIO N° 10 PRACTICA N° 21 DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA I. INTRODUCCION: La digestión de las proteínas, o degradación hasta aminoácidos en el tubo digestivo, es un proceso complicado que se realiza con el concurso de diversas enzimas proteolíticas Entre estas enzimas proteoliticas tenemos: a) de origen gástrico: pepsina y renina; b) de origen pancreático: tripsina, quimotripsina, elastasa y carboxipeptidasa; c) de origen intestinal: aminopeptidasas, dipeptidasas. Son endopeptidasas: pepsina, tripsina, quimotripsina, elastasas. Son exopeptidasas: carboxipeptidasa y aminopeptidasa. La tripsina, es activada por la enterocinasa en el intestino, y es específica de los enlaces peptidicos sobre el lado carboxílico de residuos de aminoácidos básicos: lisina y arginina solamente. La quimotripsina es específica para los enlaces peptidicos de los aminoácidos sin carga como los aromáticos: tirosina, triptofano y fenilalanina. La elastasa tiene una especificidad amplia, ataca a los residuos pequeños, como la glicina, alanina y serina. La carboxipeptidasa hidroliza el enlace peptídico carboxiterminal en las cadenas polipeptidicas. La falta de enzimas proteolíticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las heces, que provienen de la carne de los alimentos), y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados en las heces). En el lactante con ausencia congénita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de activación de quimotripsinógeno y procarboxipeptidasa, existe hipoproteinemia, con retardo marcado del crecimiento. La presente práctica tiene como finalidad demostrar la acción hidrolítica de las enzimas digestivas contenidas en el páncreas sobre la caseína o proteína de la leche, determinado los productos (aminoácidos) con ninhidrina II. REACTIVOS A UTILIZAR: - Caseína al 1% en buffer fosfato 0,1 M pH 8. - Buffer fosfato 0,1 M pH 8. - Solución de extracto pancreático. - Solución acuosa de ninhidrina al 0,25% saturada con butanol. - Acido tricloroacético al 10%. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) I II III III. 54 Caseína al 1% Buffer fosfato 0.1 M pH 8.0 Solución de extracto pancreático Agua destilada Pasos: * * * * * * * 1 1 1 --- 1 1 --1 --1 1 1 Mezclar y colocar al baño de agua a 37 ºC por 30 minutos. Después del tiempo de incubado tomar 0,5 ml, de cada uno de los tubos y trasladarlo a otro sistema numerado (I, II, III). En este nuevo sistema, agregar 1 ml de solución de ninhidrina. Mezclar y llevar a un baño de agua hirviendo (franca ebullición), durante 3 a 5 minutos. Observa los cambios de color de cada tubo. Luego a los tubos de incubación del primer sistema, agregue gota a gota 1 ml de ácido tricloroacético al 10% agitando continuamente. Observe las variaciones que se produce en cada tubo. IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. Elabore un esquema con la digestión y absorción de proteínas y aminoácidos. Explique el sitio de producción y la acción de las hormonas que intervienen en el proceso de digestión y absorción de los aminoácidos. Escriba dos esquemas mostrando dos ejemplos de transaminación y dos de desaminación con los nombres de aminoácidos y alfa cetoácidos que participan. Interprete todos los resultados encontrados en la práctica y explíquelos usando algunos dibujos. 55 PRACTICA N° 22 INHIBICION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS: ACCION DE LA SOYA HERVIDA Y CRUDA SOBRE EL EFECTO PROTEOLITICO DE LA TRIPSINA I. INTRODUCCION: La tripsina actúa como una endopeptidasa e hidroliza prácticamente toda clase de proteínas. Digiere las proteínas desnaturalizadas y parcialemente digeridas, con mayor rapidez que las originales desdoblándose en polipéptidos de peso variable y algunos aminoácidos. Algunos alimentos en estado natural poseen componentes perjudiciales para la nutrición. Por ejemplo el frijol de soja contiene un principio cuya actividad antitripsina dificulta la digestión de las proteínas. Esta sustancia de naturaleza peptídica es inactivada por el calor, ello explica en parte que el valor nutritivo del frijol de Soja aumenta considerablemente si se coce a ebullición por varios minutos. El ovomucoide de la clara de huevo inhibe también de manera enérgica la tripsina. Es interesante también que el aceite de semilla de algodón posea un pigmento, el gisipol, con actividad antioxidante y antitripsina que disminuye el apetito y dificulta la digestión de las proteínas.Los extractos de páncreas poseen también un péptido inhibidor de la tripsina, la alfa-1 antitripsina fecal (1-AT-Fecal) que es una glicoproteína, secretada a la luz intestinal. La finalidad del siguiente experimento es demostrar el efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre el efecto proteolítico de la tripsina, efecto que desaparece cuando la soya es hervida. II. REACTIVOS A UTILIZAR. - Buffer fosfato 0,1 M pH 8,0. - Solución de ninhidrina 0,25% saturada con butanol. - Solución de tripsina 20 mg%. - Proteína de soya cruda 30%. - Proteína de soya hervida 30%. - Etanol absoluto III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.1 M pH 8.0 Proteína de soja cruda 30% Proteína de soja hervida 30% Solución de tripsina 20 mg% Pasos: a. Incubar en baño maría a 37°C durante 1 hora. b. Después del tiempo de incubación: agregar a cada uno de los tubos 2 ml de etanol absoluto. c. Mezclar y centrifugar a 2500 rpm por 10 min. I 2,5 0.5 0,2 II 2,5 0,5 III 2,5 0,5 0,2 IV 2,5 0,5 - 56 d. En otra serie de tubos numerados I , II, III, IV colocar 1 ml de sobrenadante de los tubos respectivos del paso anterior y agregar 1 ml de ninhidrina 0,25%. e. Someter los tubos a temperatura de ebullición del agua utilizando baño maría durante 5 minutos. f. Anotar los resultados. IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. Explique con sus propias palabras cuál cree que es el objetivo de la práctica que realizó. Por qué razón el ovomucoide de la clara del huevo inhibe la acción de la tripsina. ¿Qué es el gisipol y cómo actúa en su acción antioxidante? Con dibujos represente la práctica realizada. 57 REUNION DE LABORATORIO N° 11 PRACTICA N° 23 CUANTIFICACION DE PROTEINAS SERICAS TOTALES Y FRACCIONADAS I. INTRODUCCION: Las proteínas plasmáticas son importantes para el organismo porque realizan diversas funciones: coagulación, excreción, conservación del equilibrio ácido básico, regulación del equilibrio hídrico, defensa contra las infecciones, transporte, regulación del metabolismo, etc. El origen de las proteínas plasmáticas es hepático con excepción de las globulinas gamma que se forman en las células plasmáticas. Las proteínas plasmáticas por métodos químicos se clasifican en albúmina, globulina y fibrinógeno. En el suero solo albúmina y globulina - Las fracciones globulínicas contienen varias proteínas específicas: inmunoglobulinas, haptoglobina, la transferrina, ceruloplasmina, etc; que se pueden determinar por electroforesis, inmunodifusión o inmunoelectroforesis. La concentración sérica de las proteínas totales es de 6.1 a 7.9 g/dl de las cuales albúmina: 3.5 a 4.8 g/dl y globulinas: 2.6 a 3.1 g/dl. Las cifras de proteínas plasmáticas totales pueden aumentar (hiperproteinemia) con cociente A/G normal en la hemoconcentración; con inversión de A/G por aumento de las globulinas: en el mieloma múltiple, en la macroglobulinemia de Waldenström, en el kala-azar, en las colagenopatías, etc. La disminución de proteínas totales (hipoproteinemia) son generalmente asociadas con HIPOALBUMINEMIA que a su vez están acompañadas con pequeños cambios en las globulinas. Los bajos niveles de albúmina pueden ser debidos a: incrementadas pérdidas de albúmina en la orina, disminución de la formación en el hígado como en la cirrosis, insuficiente ingestión de proteína., en la gastroenteropatía exudativa con pérdidas fecales de proteínas. Agammaglobulinemia y la analbuminemia son cuadros demasiado raros. FUNDAMENTOS DEL METODO Determinación de Proteínas Totales: Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico, en medio alcalino, para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540nm, cuya intensidad es provisional a la concentración de proteínas totales en la muestra. Determinación de Albúmina: La albúmina reacciona específicamente sin separación previa con la forma aniónica de la bromo Cresolsulfon Ftaleina (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm, respecto del Blanco del reactivo, es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra. La presente práctica tiene por finalidad determinar las concentraciones séricas de proteínas totales y fraccionadas en personas normales y/o con procesos patológicos, por el método colorimétrico. II. REACTIVOS A UTILIZAR. Reactivo EDTA/Cu Reactivo BCF 58 III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Determinación de Proteínas Totales PROCEDIMIENTO: En tres tubos marcados B (Blanco). S (Standard) y D (Desconocido), colocar: Componentes Muestra (ml) Standard (ml) Reactivo (ml) Blanco --------1.0 Standard ----0.01 1.0 Desconocido 0.01 ----1.0 Mezclar e incubar 10 minutos a 37rC, ó 20 minutos a temperatura ambiente. Leer las absorbancias a 540 nm, llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo. El color resultante es estable por lo menos 30 minutos. CALCULOS: FACTOR ! Concentrac ión Standard Absorbancia Standard  Proteina Total (g/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: 6.0 a 8.0 g/dl Determinación de Albúmina. PROCEDIMIENTO: En tres tubos de fotocolorímetro marcados B(Blanco). S (Standard) y D (Desconocido), colocar: B S D Suero Patrón 10 ul Muestra 10 ul. Reactivo BCF 1ml. 1 ml. 1 ml. Mezclar con varilla. Mantener los tubos entre 15 y 28 ºC durante 10 minutos. Leer en espectrofotómetro a 625 nm o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo CALCULOS DE LOS RESULTADOS : Alb.(g/dl) Albúmina (g/dl) ! D v f f! S Albúmina(g/dl) PT. (g/dl)- Alb.(g/dl) Relación A/ ! ¥ VALORES DE REFERENCIA: Albúmina = 3.5 ± 4.8 g/dl Relación A/G = 1.2 ± 2.2 59 IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. 5. Cuáles son las principales características de las proteínas plasmáticas. ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de las proteínas séricas totales y las fracciones albúmina y globulinas? ¿Qué importancia tiene determinar la relación albúmina/ globulina, en clínica? ¿En qué se basa la determinación de las proteínas totales y fraccionadas en nuestro experimento? Elabore un esquema sobre el proceso fisiopatológico de un edema. 60 PRACTICA Nº 24 DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE PROTEINAS EN ORINA I. INTRODUCCION: La orina normal contiene una pequeña cantidad de proteínas solubles (albúminas, algunas enzimas, etc.); la cantidad es pequeña alcanzando máximo de 150 mg en orina de 24 horas, menos de 10 mg/dl. Las proteínas son casi completamente absorbidas en los túbulos. Cuando el glomérulo es dañado por alguna enfermedad; moléculas proteicas de variado tamaño incluyendo las más largas, escapan en el filtrado de forma que los túbulos son incapaces de captar la gran cantidad de proteínas y resulta una masiva proteinuria. Las proteínas de peso molecular relativamente bajo y de pequeño tamaño pasan primero a través de los glomérulos injuriados, por ejemplo la proteína de Bence Jones, hemoglobina, albúmina; luego las globulinas. El fibrinógeno es una molécula muy larga y escapa solo en enfermedad renal severa. La proteinuria puede ser renal o extrarrenal. Son causas de proteinuria Renal: glomerulonefritis difusa, glomerulonefritis focales proliferativas, síndrome nefrótico, nefropatía diabética, nefropatía lúpica, nefropatía tóxica, en la eclampsia, tuberculosis renal, riñón poliquístico etc. Extrarrenal: proteinuria ortostática, gravídica, febril, mieloma múltiple. La proteinuria fisiológica (proteinuria ortóstatica) se presenta después de ejercicios y de permanecer largo tiempo en posición de pie, sin que exista evidencia de lesión renal. En el mieloma múltiple y macroglubinemia de Waldestrom, aparece la proteína de Bence Jones. La proteína de Bence Jones está constituída por las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas que constituye la proteína monoclonal. La presente práctica tiene por finalidad determinar la presencia de proteínas en la orina y de cuantificarlas en caso que estén presentes en casos normales y en estados patológicos. II. REACTIVOS A UTILIZAR. Acido tricloroacético, 12,5% (en agua destilada) Cloruro de sodio 0,85%. Standard de proteína: Pueden usarse suero claro normal de concentración conocido o un suero control adquirido comercialmente. Se diluye con cloruro de sodio 0,85% a una concentración final de 25 mg/ml. Esta dilución debe ser preparada el mismo día. Acido acético al 2%. III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LAS PROTEÍNAS EN ORI NA: Coagulación por el calor. COMPONENTE (ml) TUBO Muestra de Orina 5,0 Someter a ebullición por 1 minuto. Si aparece un precipitado o enturbamiento se puede deber a la presencia de proteínas o fosfatos. Añadir: Solución de ácido acético al 2% IV gotas Si desaparece la turbidez, se trata de fosfatos que se han disuelto en medio ácido. Si la turbidez persiste, se ha hace más intensa o se forma un precipitado, se trata de proteínas. 61 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS EN LA ORINA : Método turbidimétrico de Heavy. En tres tubos marcados previamente agregar: COMPONENTES (ml) /TUBOS Solución standard de proteína Orina previamente filtrada Agua destilada Acido tricloroacético 12,5% I 4,0 4,0 1,0 II 1,0 III 4,0 1,0 Dejar reposar 5 a 10 min. y leer en fotocolorímetro con filtro (420 um). Leer el standard (I) calibrando con agua destilada y luego a la lectura del problema (II) restar el blanco de la orina (III). NOTA: Antes de leer los tubos deben ser mezclados totalmente evitando que burbujas de aire puedan interferir con la lectura. CALCULO: Desde que 4 ml de orina se trata igual que un standard de 4 ml conteniendo 25 mg/100 ml entonces: Calcular de la siguiente manera: Absorbancia problema ± Absorbancia blanco x 25 = mg/100 ml. orina Absorbancia del standard Volumen total en ml orina ------------------------------------ = proteína total de orina de 24 H en mg. mg/100 ml orina x 100 IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. 5. ¿Cómo diferencia usted un precipitado en un tubo de ensayo que no c orresponde a proteínas en orina? Señale algunos tipos de proteínas anormales que pueden ser encontradas en la orina. En qué consiste el método de Heavy para la determinación de proteínas ¿Cuál es el mecanismo por el cual un paciente con glomeruloesclerosis elimina mucha proteína por la orina? Señale algunas causas de proteinuria fisiológica y patológica. 62 PRACTICA N° 25 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ALANINA AMINOTRANSFERASA SERICA (ALT) o TRANSAMINASA GLUTAMICO PIRUVICA (SGTP) I. INTRODUCCION: La transaminasa glutámica pirúvica, llamada también alanina aminotransferasa cataliza la reacción L-alanina + alfa-cetoglutarato - - - Piruvato + L - glutamato. Con la aspartato transaminasa, estas enzimas proveen un medio de interconversión de proteínas e intermediarios metabólicos de los carbohidratos y hacen disponibles las reservas proteicas almacenadas en el hígado al ciclo del ácido cítrico. Las transaminasas están normalmente presentes en la sangre, relativamente en bajas concentraciones pero en los tejidos están presentes en grandes cantidades, particularmente en el hígado y corazón. Cuando se produce destrucción tisular de estos órganos como sucede por ejemplo, en la hepatitis o en el infarto de miocardio, estas enzimas son liberadas dentro de la corriente sanguínea y pueden elevar sus niveles. En la presente práctica la glutámico pirúvico transaminasa (GPT) es determinada agregando suero a una solución bufferada conteniendo ácido alfa cetoglutarato y L-alanina y el ácido pirúvico formado, producto resultante después de la incubación, se mide colorimétricamente por reacción con dinitrofenil hidrazina en medio alcalino. II. REACTIVOS A UTILIZAR. Reactivo para SGTP:  Buffer TRIS pH 7.5  a-cetoglutarato  L-alanina  LDH  NADH III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Reactivo reconstituido (ml) 1.0 Volumen de muestra (ml) 0.1 Mezclar y transferir a la cubeta del espectrofotómetro. Incubar 60 segundos a la temperatura de reacción. Leer la absorbancia inicial (A1) a 340 nm. Repetir las lecturas a intervalos de 60 segundos, hasta por tres minutos. CALCULOS: Actividad ALAT (UI/l) = A/min x 1768 Nota: de las absorbancias, sacar diferencias y determinar una media que luego se multiplica por el factor determinado. VALORES DE REFERENCIA: Hasta 29 U/l a 30 ºC Hasta 45 U/l a 37 ºC 63 IV. CUESTIONARIO: 1. Diga usted en que consiste el mecanismo de transaminación. 2. ¿Cuál es la importancia metabólica de la transaminasa glutámico pirúvico? 3. ¿Cuáles serían las razones para solicitar, TGO-S algunas veces separadas y otras veces juntas, en el diagnóstico diferencial clínico? 4. ¿Cuál es la ubicación intercelular de las TGP y TGO? 5. Cuál es la utilidad práctica de la utilización del dosaje de transaminasas. 6. Haga un esquema de una transaminación, colocando los nombres de las moléculas que participan. 64 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST) I. INTRODUCCION: En condiciones normales, las enzimas se sintetizan en las células y en la mayoría de los casos ejercen su función en su interior. Otras enzimas, una vez sintetizadas, salen de las células y funcionan fuera de ellas, como es el caso de: Las enzimas del tubo digestivo; Las enzimas con actividad en el suero sanguíneo (las que intervienen en la coagulación, por ejemplo) y las enzimas de escape, presentes en cantidades muy bajas en el suero aun cuando en ciertas enfermedades suben considerablemente. En la clínica son importantes dos transaminasas; la glutámico pirúvica (TGP) y la glutámico oxalacética (TGO) o aspartato aminotransferasa (AST); éstas, aunque se hallan en todos los tejidos se relacionan preferentemente con los procesos de ³escape´ de enzimas del mi cardio o el hígado. En las lesiones o hepáticas aumentan ambas transaminasas en el suero; cuando sobreviene la mejoría clínica, descienden en forma paralela y, si aparece una recaída, las dos suben nuevamente. El tejido miocárdico es muy rico en TGO y el ascenso de esta enzima acompaña a los procesos destructivos del corazón; sube al máximo entre las 12 y 48 horas y suele volver a lo normal a los 4 ó 7 días. El ascenso es, en general, proporcional a la extensión del infarto; a veces proporciona datos positivos en casos con datos electrocardiográficos de difícil interpretación, pero tiene el inconveniente de elevarse en diversos cuadros, sobre todo en la cogestión hepática. La finalidad del presente trabajo experimental, es la determinación por método colorimétrico de una de estas transaminasas de importancia clínica como es la aspartato aminotransferasa. II. REACTIVOS A UTILIZAR Sustrato AST: Buffer de DL-aspartato y -cetoglutarato pH 7.4 Reactivo de color: 2-4 dinitrofenilhidrazina Standard: Buffer piruvato pH 7.4 NaOH 0.4N III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) : 1) CURVA DE CALIBRACIÓN: Antes de usar los reactivos por primera vez, preparar una curva de calibración para AST. Armar el siguiente sistema: Tubo 1 2 3 4 5 6 Agua Destilada (ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 Sustrato AST (ml) 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 Standard 0.0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 AST 0 22 55 96 150 212 Agregar 0.5 ml de reactivo de color. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. Agregar 5 ml de NaOH 0.4N (NaOH 0.4N diluido con agua destilada 1:10) Mezclar y reposar por 15 minutos a temperatura ambiente antes de leer. Leer a 505 nm. El color es estable sólo por 30 minutos. 65 Construir en papel semilogarítmico los valores de transmitancia en el eje vertical y en el eje horizontal las U/ml de AST 2) PROCEDIMIENTO DE LA MUESTRA (disponer de un tubo de ensayo): - Colocar 0.5 ml de sustrato AST en cada tubo. - Incubar a 37 ºC durante 5 minutos. - Agregar 0.1 ml de suero. Inmediatamente empezar el control de tiempo. - Incubar a 37 ºC durante 60 minutos, exactamente. - Al cumplirse los 60 minutos, agregar 0.5 ml de reactivo de color. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. - Agregar 5 ml de Na OH 0.4 N Mezclar y dejar reposar por 15 minutos antes de la lectura. - Obtener el valor de U/ml de AST a partir de la curva de AST de calibración, según instrucciones previas. IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. ¿Cuál es la utilidad y el comportamiento en sus concentraciones de la AST en casos de infarto agudo de miocardio? Interprete y explique todo lo actuado en la práctica. Haga un resumen de seis líneas sobre AST. 66 REUNION DE LABORATORIO N° 12 PRACTICA N° 26 CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA I. INTRODUCCION: La hemoglobina es una hemoproteína, tetramérica, con dos subunidades alfa y dos beta, cuya función es el transporte de oxígeno. Se sintetiza en la médula ósea por una vía común a la síntesis de porfirinas, que termina con la adición del hierro por la ferroquelatasa. La concentración normal es de 12 a 14 g/dl en mujeres y de 14 a 16 g/dl en varones en nuestro medio y a nivel del mar. El defecto enzimático en algunas de las etapas de síntesis del grupo Hemo, da lugar a las diferentes tipos de porfirias. La disminución de la síntesis de hemoglobina, por diferentes causas, produce disminución de su concentración dando lugar a la anemia por menor producción como en la anemia ferropénica, que también puede deberse a problemas en la maduración de los glóbulos rojos como la deficiencia de ácido fólico. Pero la hemoglobina puede también disminuír por pérdida de sangre como en las hemorragias o por hemólisis (anemias hemolíticas). En este último grupo, una causa pueden ser las hemoglobinopatías por defecto en la síntesis de una de las cadenas (talasemias) o de cambios en la estructura de una de las subunidades por mutaciones que cambian un aminoácido por otro como en la hemoglobina S. En la hipoxia por altura por otro lado se produce aumento de su síntesis llevando a la policitemia, que puede tener también otras causas como la Policitemia Vera La OMS basa su definición de anemia en la concentración de hemoglobina, de modo que en mujeres se considera si esta es menor de 12 g/dl y en varones; menor de 13 g/dl, en niños existe variación con la edad. En la práctica médica es por ello importante determinar la concentración de la hemoglobina, que es sin duda uno de los exámenes más solicitados. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración de hemoglobina en sangre de personas normales, utilizando el método enzimático de determinación de hemoglobina. II. REACTIVO MATERIAL Y EQUIPOS Tensioactivo/CNX: ampollas autorrompibles conteniendo solución estabilizada de tensioactivo/CNX. Buffer/Ferricianuro: comprimidos estabilizados de ferricianuro de potasio y buffer de fosfatos. Standard de Hemoglobina. Hemoglowiener reactivo Tubos de vidrio Lancetas Pipetas ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: COMPONENTES STANDARD hemogloWiener Reactivo 5 ml Con pipeta limpia y seca, agregar: hemogloWiener Standard 20 ul DESCONOCIDO 5 ml ----Armar el siguient e sistema: III. 67 Muestra (sangre total) ----20 ul Medir primero el Standard y luego usar la misma micropipeta, enjuagando tres veces en el propio reactivo antes de agregar cada muestra. Mezclar y luego de 3 minutos leer en espectrofotómetro a 540 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520 -550), llevando el aparato a cero con Reactivo CALCULO DE RESULTADOS: Hemoglobin a (g/dl) ! D v factor factor ! Standard (g/l) S VALORES DE REFERENCIA: - Hombres: 13.0 ± 18.0 g/dl - Mujeres: 11.0 ± 16.0 g/dl IV. CUESTIONARIO: 1. Haga un esquema con la estructura de la hemoglobina, indicando sus aminoácidos importantes en cada polipéptido, el número de ellos y las interacciones del ión Fe++ dentro del grupo hemo. 2. Interprete y explique el procedimiento de la práctica. 3. Qué es la anemia. Cuál es la más frecuente y cuántos tipos de anemia conoce. 4. Una anemia importante es la anemia de células falciformes: Haga un resumen de las causas de su etiología y su patogenía. 68 CUANTIFICACION DE BILIRRUBINAS SERICAS I. INTRODUCCION: Los hematíes tienen una vida media de 120 días, al cabo de la cual son destruidos en el sistema retículo endotelial. La hemoglobina es liberada y se separa la globina del hem, éste es convertido en biliverdina y luego en bilirrubina. Este pigmento insoluble en agua es transportado unido a la albúmina. La bilirrubina indirecta o no conjugada llega al hepatocito y se separa de la albúmina, después de un proceso de captación y conjugación con dos moléculas de ácido glucurónico por la enzima bilirrubina glucuronil transferasa, se convierte en una forma soluble, denominada bilirrubina directa o conjugada, que es finalmente excretada con la bilis al intestino por un proceso de transporte activo; da color a las heces y ultrafiltra el glomérulo. Cada gramo de hemoglobina degradada origina 35 mg de bilirrubina. La concentración sanguínea de bilirrubina total es de 1 mg / dl, siendo en su mayoría bilirrubina indirecta, que no se excreta por orina. La hiperbilirrubinemia puede ser a predominio de la bilirrubina no conjugada como en las anemias hemolíticas o en los defectos congénitos de conjugación, o de la bilirrubina conjugada en las hepatopatías, donde el defecto limitante es la excreción, o en las enfermedades extrahepáticas obstructivas. La manifestación clínica más importante de las hiperbilirrubinemias es la ictericia, y el origen de esta alteración obedece a causas de origen pre hepático, hepático y post hepático, que varían con la edad de presentación y también en cuanto a su gravedad La bilirrubina directa da una reacción inmediata con el diazorreactivo; la indirecta, sólo reacciona después de agregar alcohol a la mezcla. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total de las fracciones de bilirrubina en el suero o plasma de personas normales y con ictericia, por el método de Malloy Evelyn, que utiliza el diazorreactivo de Erlich. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total y de las fracciones (bilirrubina directa e indirecta) en el suero de personas normales, por el método enzimático de determinación de bilirrubina. II. REACTIVOS - Desarrollador o solvente - Reactivo sulfanílico - Nitrito de Sodio - Diazorreactivo: Mezclar: 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo sulfanílico. - Bilirrubina Standard. ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Bil. Directa Bil. Total Muestra (suero) 200 ul 200 ul 200 ul Agua destilada 2.5 ml 2.5 ml ----Desarrollador --------2.5 ml Reactivo Sulfanílico 200 ul --------Diazorreactivo ----200 ul 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión. Luego de 5 minutos, leer en espectrofotómetro a 530 nm o fotocolorímtero con filtro verde (520-550 nm), llevando el aparato a cero con agua destilada. Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos, excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. Si lee antes, habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta. Si se lee después, habrá III. 69 sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre CALCULOS: Bilirrubina total (mg/l) = (Abs. Bil. total - Abs. Blanco) x F Bilirrubina Directa (mg/l) = Abs. B. Directa - Abs Blanco.) x F Bilirrubina Libre (indirecta) = Bilirrubina total - Bilirrubina Directa VALORES DE REFERENCIA: - Adultos: o Directa: hasta 2 mg/l o Total: hasta 10 mg/l IV. CUESTIONARIO: 1. Elabore un esquema con los tipos de ictericia que se pueden producir durante el metabolismo de la bilirrubina. 2. ¿Cuáles son las principales causas de hiperbilirrubinemia no conjugada? 3. ¿Cuáles son las causas de hiperbilirrubinemia conjugada? 4. ¿Cuál es la acción bioquímica que realiza cada uno de los reactivos utilizados en la práctica? 5. ¿Cuál es el riesgo de aumento de bilirrubina no conjuda en el recién nacido? 6. ¿Cuál es el comportamiento de las bilirrubinas en caso de una insuficiencia hepática. Por qué? 70 PRACTICA N° 27 CUANTIFICACION DEL ACIDO URICO SERICO I. INTRODUCCION: El ácido úrico es un producto de la degradación hepática de las bases nitrogenadas purínicas adenina y guanina, que circulan en la sangre (en el plasma y en los glóbulos rojos humanos) y es la orina su vía de excreción. Un adulto normal produce unos 500 mg de ácido úrico por día. Aproximadamente 80 % de esa cantidad es excretada por orina, el resto se degrada y es eliminado como CO2 y NH3, o urea. En el plasma, el ácido úrico alcanza una concentración de 4 a 6 mg/dl. Los varones tienen niveles 1 mg/dl más altos que las mujeres, diferencia que desaparece después de los 45-50 años de edad. Al pH sanguíneo predomina la forma desprotonada o urato; a pH menores predomina la forma protonada no disociada o ácido úrico. En orina, el pH ácido favorece la formación de ácido úrico no disociado y puede precipitar; en alcalinidad, ocurre lo contrario. La cantidad de uratos excretados varía normalmente de 250 a 750 mg / 24 hrs, cantidad que puede incrementarse con una dieta rica en purinas. En el hombre, la uricemia se incrementa después de la ingestión de nucleoproteínas con los alimentos, los que se degradan y en un primer momento liberan los ácidos nucleicos de las proteínas. Como sucede con otros constituyentes séricos, la concentración de ácido úrico en suero o plasma depende de un neto balance entre el grado de síntesis de purinas y fraccionamiento de nucleoproteínas por un lado y, por otro, del grado de eliminación de ácido úrico. En condiciones patológicas, podemos encontrar concentra ciones incrementadas de ácido úrico sérico en la gota, que es el más común de los desórdenes del metabolismo de las purinas, más frecuente en hombres. También existe hiperuricemia proveniente de la destrucción excesiva de células (material nuclear) en leucemias y linfomas, policitemias, etc. En las alteraciones renales severas son comunes los niveles altos de ácido úrico como resultado de una excreción disminuida. La presente práctica tiene por finalidad cuantificar las concentraciones séricas de ácido úrico en personas adultas normales y / o con alteraciones patológicas mediante el procedimiento químico de Folin-Dennis que se basa en la acción reductora del ácido úrico en medio alcalino sobre el ácido fosfotúngstico. II. REACTIVOS A UTILIZAR. Standar: solución de ácido úrico 100 mg/dl Uricasa: solución de uricasa mayor o igual a 3U/I Reactivo 4-AF/POD: frasco conteniendo más de 100 U de peroxidasa (POD). Reactivo de fenol. III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento - Muestra: suero o plasma heparinizado - En tres tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas marcadas B (Blanco), S (Standard) y D (Desconocido), colocar: B S D Standard 50 ul Muestra 50 ul Reactivo de trabajo 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml Mezclar suavemente e incubar 15 minutos en baño de agua a 37 °C o 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). Retirar, enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm), llevando el aparato a cero con el blanco. 71 - CALCULO DE RESULTADOS: Acido Urico (mg/dl) ! D v f donde " f " ! 100 mg/dl S - VALORES DE REFERENCIA: En adultos normales, con ingesta normal de proteínas, se observan los siguientes rangos de valores: Hombres: 26-60 mg/l Mujeres: 20-50 mg/l Los valores de ácido úrico varían de acuerdo a la edad, el sexo y las diferentes dietas; incluso se ha observado una variación estacional. IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Cómo se sintetiza el ácido úrico. Y dónde se realiza esta síntesis. Cuál es la fisiopatología de las hiperuricemias. Señale la deficiencia parcial enzimática que ha sido encontrada en algunos pacientes con gota. ¿Cómo explica el uso del alopurinol en el tratamiento de la gota? ¿Cuál es el proceso de la artritis y de la formación de los tofos en la gota? Explique por qué existe hiperuricemia en las enfermedades de leucemia. 72 REUNION DE LABORATORIO N° 13 PRACTICA N° 28 DETERMINACION DE CREATININA SERICA EN PERSONAS SANAS Y NEFROPATAS I. INTRODUCCION: La creatina, precursora de la creatinina, aumenta en el cuerpo humano fundamentalmente por síntesis, aunque una pequeña cantidad pre formada es ingerida con los alimentos. La creatina fosfato se forma en los miocitos y es un compuesto importante como fuente de energía en la contracción muscular. Aproximadamente 2% de la creatina fosfato muscular es convertida en creatinina diariamente; la cantidad total depende de la masa muscular. La creatinina es fácilmente difusible y es igualmente distribuida en el agua corporal. Es excretada fundamentalmente por el riñón el cual clarifica el plasma de creatinina. La concentración de creatinina en suero no es afectada por la dieta, catabolismo de proteínas, edad, sexo o ejercicios. Elevadas concentraciones se producen solamente cuando la función renal está muy alterada y aunque el mismo tipo de información acerca del diagnóstico y pronóstico se obtiene por la determinación de nitrógeno ureico o creatinina, esta última determinación se prefiere porque proporciona mayor información relacionada con el estado de la función renal, ya que los niveles de creatinina sérica dependen del grado de excreción, siendo la producción endógena constante. El suero es depurado de creatinina en el riñón por filtración glomerular proporcionando una buena base para el test de clearance. La concentración normal en suero varía de 0,5 a 1,4 mg /100 ml. El clearence de creatinina normal es mayor de 100 ml / min. La determinación de creatinina tiene utilidad en la práctica médica para la evaluación de la función renal, la cual puede alterarse por diversas causas; las que pueden ser de origen pre renal como el shock o la insuficiencia cardíaca; renal, como las glomerulonefritis o la nefropatía diabética o post renal, como las uropatías obstructivas La creatinina en medio alcalino reacciona con el ácido pícrico para dar un tautómero de picrato de creatinina de color anaranjado (reacción de Jaffe). La determinación de hace de ordinario en un filtrado libre de proteínas obtenido a partir del suero. Usando métodos enzimáticos para determinar específicamente creatinina y comparando con los valores obtenidos por la reacción de Jaffe en personas normales y nefriticos se encuentra que la creatinina verdadera del suero comprende aproximadamente un 90% del total, mientras que en eritrocitos sólo corresponde a un 40%. Esto, hace remarcable la necesidad de usar suero y no sangre total para la determinación de creatinina por el método colorimétrico. La creatinina es un constituyente habitual de la orina, y es excretada en una cantidad casi constante, las variaciones fluctúan entre 0, 9 - 1,5 g/24hs. La cantidad eliminada por las personas del sexo masculino generalmente es más grande que en las de sexo femenino. La creatinina urinaria disminuye en la insuficiencia renal y es útil para medir el grado de filtración glomerular y lo poco que es transferido a través de las células tubulares. La creatininuria es determinada mediante el método enzimático. II. REACTIVOS A UTILIZAR. - Reactivo 1: Hidróxido de sodio 0.16 mmol/l - Reactivo 2: Acido pícrico 4.0 mol/l - Standard: Solución de creatinina 2 mg/l. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento III. 73 PROCEDIMIENTO En caso de que la muestra a utilizar sea en suero, En tubos de ensayo marcados B (Blanco), S (Standard), M (Muestra) Componentes Blanco Standard Muestra Reactivo 1 1000 ul 1000 ul 1000 ul Muestra --------50 ul Standard ----50 ul ----Mezclar. Incubar 5 minutos a 20-25 °C/30 °C/37 °C, luego agregar: Reactivo 2 250 ul 250 ul 250 ul Llevar el espectrofotómetro a cero con el blanco. Mezclar. Incubar 1 minuto a 20-25 °C y leer A1. Incubar exactamente por 2 minutos y leer A2. CALCULOS: ¨A Muestra (A2-A1) y ¨A Standard (A2-A1) CALCULOS: SUERO/PLASMA : ¦ ¦ Creatinina(mg/dl)! ORINA : Creatinina(mg/dl)! Standard(mg/dl)A v? A Standard A Muestra A Muestra CLEARANCE DE CREATININA : /100 ?mg/min/1.73m2A ! mgcreatinina mlOrinav mlorina/24h mgcreatinina ml suerov 1440 /100 VALORES REFERENCIA: DE SUERO/PLASMA: Mujeres Varones ORINA: Mujeres Varones Clearance de Creatinina: Mujeres Varones IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. 5. ¿Qué información o presunción obtiene al dosar la creatinina sérica? ¿Por qué se prefiere la determinación de creatinina urinaria a la de nitrógeno ureico? Interprete y explique el procedimiento de la práctica. Haga dibujos del procedimiento. Explique por qué se incrementa la creatinina en tres estados patológicos que conozca. A que se denomina clearence de creatinina y que importancia tiene, su determinación. ¦ ¦ Standard(mg/dl)Av 50 v? A Standard 0.6 ± 1.1 mg/dl 0.9 ± 1.3 mg/dl 11 ± 20 mg/kg/d 14 ± 26 mg/kg/d 95 ± 160 ml/min/1.73 m2 98 ± 156 ml/min/1.73 m2 74 PRACTICA N° 29 CUANTIFICACION DE UREA EN SANGRE I. INTRODUCCION: La urea es sintetizada en el hígado, es el principal producto final del catabolismo de las proteínas y se distribuye en todos los tejidos. Normalmente no tiene función útil en el organismo, es excretado casi enteramente por los riñones. La urea en el plasma es filtrada por los glomérulos renales, pero en condiciones normales aproximadamente el 40% de este filtrado regresa p difusión a la sangre. La or importancia clínica de la urea viene del hecho de una elevada concentración sanguínea puede estar asociada con una mala función renal. El grado de azoemia depende de la extensión y tipo de lesión renal. La concentración de la urea en la corriente sanguínea es el resultado del balance entre el grado de degradación de las proteínas y el grado de eliminación por los riñones. Los valores normales de urea en suero (como nitrógeno ureico sanguíneo o BUN) es de 9 ± 19 mg/100 ml. Las concentraciones de urea en sangre total, suero o plasma, son muy similares. La uremia es determinada colorimétricamente por el uso de ureasa. Este método es altamente específico y aunque está basado en reacciones de urea, es convencionalmente reportado co nitrógeno ureico. Los valores de urea se mo reportan siguiendo la siguiente fórmula: Nitrógeno ureico sanguíneo x 2,14 = UREA En sentido inverso, conociendo los valores de urea, se informa el BUN según la siguiente fórmula: Urea x 0,4665 = Nitrógeno ureico sanguíneo Los riñones eliminan diariamente entre 20 a 40 gramos de urea. La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoniaco; éste reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimétricamente. Cuando el nitrógeno ureico es determinado por el método de la ureasa, ésta transforma a la urea en carbonato de amonio y con la adición del reactivo de Nessler el amoníaco liberado forma un compuesto de color amarillo bruno cuya intensidad se mide en fotocolorímetro. La finalidad de la presente práctica es cuantificar la uremia por el método de la ureasa, en personas normales y / o con procesos patológicos. II. REACTIVOS A UTILIZAR. - Suspensión de ureasa. - Reactivo de salicilato. - Reactivo hipoclorito. - Solución standard III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento PROCEDIMIENTO Componentes Blanco Standard Desconocido Muestra (ml) --------0.01 Standard (ml) ----0.01 ----Reactivo de trabajo (ml) 1.00 1.00 1.00 Incubar 5 minutos a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C), o 3 minutos a 37 °C. Agregar a cada tubo: Reactivo hipoclorito (ml) 1.00 1.00 1.00 Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente (20 a 25 °C) o 5 75 minutos a 37 °C. Leer las absorbancias dentro del plazo de una hora CALCULOS: FACTOR ! 66 Absorbancia Standard Urea (mg/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: SUERO/PLASMA: Urea : Nitrógeno Ureico ORINA: Urea : Nitrógeno Ureico IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. 5. 6. ¿Qué importancia clínica tiene para usted, conocer las concentraciones séricas de úrea? ¿Qué influencia tiene la ingesta proteica sobre la concentración sérica de úrea? En relación a las concentraciones séricas de úrea y NH4+. Señale las características comunes que se encuentran en los efectos enzimáticos hereditarios del ciclo de la úrea. ¿Qué alteraciones en las concentraciones séricas de úrea y NH4+ podrían encontrarse en el coma hepático? ¿Cuál es la importancia metabólica de la existencia del ciclo de la ornitina en el hígado de los seres humanos? ¿Cuál es la importancia metabólica que en el hígado humano exista una relación entre el ciclo de los ácidos tricarboxilicos y el ciclo de la ornitina? 10 a 50 mg/dl : 15 a 30 g/24 hrs. : 4.5 a 22.7 mg/dl 7 a 14 g/24 hrs. 76 PRACTICA N° 30 DEMOSTRACION DE LOS PROCESOS DE DESAMINACION OXIDATIVA DE LOS L-E-AMINOACIDOS I. INTRODUCCION: La remoción del grupo amino de las L-aminoácidos es el primer paso en la degradación metabólica general de estos compuestos (catabolismo). Dos sistemas enzimáticos de transaminación: la alanina piruvato transaminasa(ALT) y la glutamato alfa-cetoglutarato transaminasa (AST) catalizan la transferencia de grupos amino de la mayor parte de los aminoácidos para formar alanina a partir del piruvato o glutamato a partir de alfa-cetoglutarato. Puesto que la alanina es también sustrato para la reacción de glutamato transaminasa, todo el nitrógeno amino proveniente de los aminoácidos que puede experimentar transaminación se puede concentrar en el glutamato. Esto es importante porque el L-glutamato es el único aminoácido en el hígado que experimentan desaminación oxidativa a una tasa apreciable y esta reacción se cataliza por la L glutamato deshidrogenasa, Si se agrega una determinada cantidad de L-alanina a un homogeneizado de hígado después de un período de incubación (30 minutos) podemos demostrar que se ha producido desaminación si encontramos determinada cantidad de cetoácidos (ácido pirúvico y ácido alfa-cetoglutarato) los que pueden ser identificados frente a una solución de 2-4 Fenihidrazina en medio alcalino. La presencia de estos cetoácidos se debe fundamentalmente a los procesos de transdesaminación y desaminación del ácido glutámico (transdesaminación) que se estimula fundamentalmente y en mucha menor proporción por desaminación de la L-Alanina por la acción de la L-aminoácido. La finalidad de la práctica es demostrar los procesos de desaminación (oxidativa o no) que sufren los L aminoácidos en el hígado utilizando a la L-Alanina como un ejemplo de éstos y al 2-4 Dinitrofenilhidrazina como indicador de los cetoácidos formados provenientes de la desaminación. II. REACTIVOS A UTILIZAR. - Buffer fosfato 0,1M pH 7,4 - L-alanina: solución 0,2M - Acido tricloroacético al 10% - 2-4-Dinitrofenilhidrazina: solución 0,1% en HCl 2 N. - NaOH: solución 2N - Homogeneizado de hígado o riñón de rata 10% y conservado en baño helado. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente esquema de incubación: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.1 M pH 7,4 Solución L-alanina 0,2M Agua destilada Homogeneizado de hígado Colocar en baño maría a 37°C durante treinta minutos. Añadir ácido tricloroacético al 10% Mezclar y añadir agua destilada I 4,0 0,5 1,0 1,0 3,5 TUBOS DE ENSAYO II 4,0 0,5 1,0 1,0 3,5 III 4,0 0,5 1,0 1,0 3,5 III. Filtrar y medir a otros tubos previamente marcados: 77 COMPONENTES (ml) Filtrado 2,4-Dinitrofenilhidrazina solución al 1% Mezclar y dejar en reposo durante veinte minutos. NaOH 2N Dejar en reposo durante 10 minutos. Realizar las lecturas con el espectrofotómetro. IV. CUESTIONARIO: 1 2 3 4 5 6 I 4,0 1,0 4,0 TUBOS DE ENSAYO II 4,0 1,0 4,0 III 4,0 1,0 4,0 Señale los sistemas enzimáticos flavinodependientes que producen desaminación oxidativa de los aminoácidos. De un ejemplo de desaminación oxidativa de un aminoácido. ¿Cuál es la razón por la que se utiliza 2,4-Dinitrofenilhidrazina en el sistema? ¿Cómo explica usted los resultados fotocolorimétricos obtenidos en los tres diferentes tubos de experimentación del sistema? ¿Cuál es la importancia biológica de la desaminación oxidativa de los aminoácidos? ¿Qué conclusiones puede establecer usted, de los resultados de su práctica de laboratorio? 78 V UNIDAD NUTRICION: REQUERIMIENTOS ENERGETICOS, PROTEICOS, VITAMINAS Y MINERALES REUNION DE LABORATORIO N° 14 PRACTICA N° 31 DOSAJE DE VITAMINA ³A´ El instructivo de la presente práctica se les proporcionará durante la práctica respectiva. PRACTICA N° 32 DOSAJE DE VITAMINA ³C´ I. INTRODUCCION: La vitamina C o ácido ascórbico es hidrosoluble y antiescorbútica. Se presenta en alimentos frescos y en vegetales. La única acción en el cuerpo es debido principalmente a que es una clase especial de agente reductor que influye en los procesos de óxido reducción. Ciertas células sin vitamina C no son capaces de producir o mantener sustancias de importancia intracelular. Aunque no se conoce con seguridad sus funciones metabólicas precisas hay pruebas que señalan su requerimiento para el metabolismo de la tirosina . Se necesita también para la producción normal de fibrinas del tejido conectivo y de la sustancia del baso intercelular (por ello el aumento de fragilidad capilar en el escorbuto). Muchas de estas propiedades podrían depender de las propiedades reversibles de óxido reducción (redox) de esta vitamina (ácido ascórbico - ácido dehidroascórbico). Las necesidades mínimas diarias de vitamina C son 10 mg y son preferibles 30 mg por día. Para ello es necesario que los, alimentos antes del cocimiento contengan 70 mg de vitamina C. Los nivelas ² plasmáticos en una población bien alimentada varían entre 5,5 y 1,2 mg/100ml. En los leucocitos la concentración es mucho mayor que en el plasma (15 mg/100 g) de capa blanca leucocitaria. La corteza suprarrenal, la hipófisis y el ojo son espacialmente ricos en vitamina C. La vitamina C es destruida rápidamente por el calor de cocimiento o la pasteurización. En caso de alimentación deficiente, el escorbuto clínico tarda 6 meses en manifestarse. En el escorbuto no tratado, el nivel plasmático de ácido ascórbico es inferior de 0,1 gm/100ml y en glóbulos blancos menos de 2 mg/100 g. Las intervenciones quirúrgicas dan lugar a disminuciones de 17 a 20% de contenido en el plasma y en glóbulos blancos. Antes de la intervención quirúrgica las cifras plasmáticas inferiores de 0,2 mg/100ml o en glóbulos blancos a 8 mg/100 g indican una deficiencia importante que puede significar cicatrización tardía o dehiscencia de las suturas. Se estima que una ingestión diaria de 2,5 mg de ácido ascórbico para niños y 7,5 mg para adultos es suficiente para prevenir síntomas de deficiencia. El principal resultado de tal deficiencia es el escorbuto, una enfermedad caracterizada por debilidad, dolor de las extremidades, hemorragias subcutáneas y sangrado de encías. Casos subclínicos de deficiencia de vitamina C son muy comunes entre la población pobre de las grandes ciudades. Los síntomas son vagos y generalmente limitadas alteraciones del crecimiento de los dientes, lesiones en las encías y ligera anemia. Un excelente test clínico para la deficiencia de vitamina C es la determinación del promedio de resistencia capilar. Esto puede ser hecho con un simple aparato para medir la presión sanguínea con la cual la presión dentro de los capilares se incrementa por la constricción de 79 la vena del brazo. Hemorragias que en la piel aparecen con excesiva frecuencia podrían indicar fragilidad capilar. La excreción normal diaria de vitamina C en orina de adultos varia entre 10 y 30 mg. Para la determinación del ácido ascórbico en sangre, esta debe ser fresca (no después de 30 min.). El ácido ascórbico es estable durante varias horas en el filtro. Se utilizará el método de Roe y Kutcher modificado para la cuantificación del ácido del ácido ascórbico en sangre, total o plasma. Por 6'ste procedimiento el ácido ascórbico del plasma o sangre es oxidado a ácido dehidroascórbico. En un pH ácido, el acide dehisroascórbico se transforma rápidamente en ácido dicetoglucónico que se une a 2 dinitrofenilhidracina -4 para formar una hidrazona de color pardo. Esta sufre rearreglo molecular en ácido fuerte dando un compuesto rojo. Absorbancia se compara con patrones adecuados de ácido ascórbico. El propósito de la siguiente práctica es determinar la concentración de ácido ascórbico en el plasma de personas adultas normales o carenciales, por el método colorimétrico de Roe y Ructher modificado. II. REACTIVOS A UTILIZAR: y Acido tricloroacético al 10& (P/V). y Reactivos 2,4 dinitrifenilhidracina al 2% en ácido sulfúrico 9 N. y Solución de tioúrea al 10% en etanol al 50%. y Solución de sulfato cúprico al 1,5%. y Reactivo de color. Se prepara en el mismo dia de uso, mezclando: 5 ml del reactivo 2,4 dinitrofenilhidracina, 0,1 mil de la solución de sulfato cúprico, y 0,1 de la solución tioúrea. y Acido sulfúrico al 85%. y Standard de ácido ascórbico 2 ml/100ml. y Oxalato de litio al 6,5% III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento y Extraer más o menos 5 mi de sangre de la flexura del codo e introducirlos en frascos previamente oxalatados. Mezclar: COMPONENTES (ml) TUBOS Liquido sobrenadante de paso anterior Acido tricloroacético al 10% Standard de ácido ascórbico. Agua destilada Reactivo de color combinado I II 1 0,5 0,4 III 0,5 0,4 0,5 0,5 0,4 - y Se mezclan los reactivos, se tapan en tubos con papel parafinado y se colocan en baño de agua a 56°C durante una hora. Transcurrido el tiempo se enfrian los tubos en baño de hielo durante 5 minutos. y Agregar a cada tubo lentamente y mezclando, 2 mi de ácido sulfúrico al Q5°o, enfriando el hielo. y Dejar los tubos en reposo por 30 min. y Agregar 1,6 ml de agua destilada. y Mezclar nuevamente. y Leer en fotocolorimetro (540 nm). CÁLCULOS: Abs. Del problema - Blanco x 2,5 = mg/dl Abs. Del Standard - Blanco NOTA: y El ácido ascórbico es muy inestable. Por ello es indispensable separa el plasma de ids glóbulos rojos y realizar el análisis sin tardar. y El ácido ascórbico utilizado para preparar la solución patrón debe ser de grado analítico. y Los valores inferiores a 0,2 mg/dl pueden preceder en 2-3 meses a la aparición de un escorbuto clínico. 80 IV. CUESTIONARIO 1. ¿Por qué las necesidades de vitamina C deben ser satisfechas en la dieta normal? 2. ¿Qué relaciones metabólicas podría mencionar entre el ácido fólico y Fe+++ en la producción de anemia en el escorbuto? 3. Desde el punto de vista metabólico ¿Cómo explica que los requerimientos de vitamina C sean mayores en el curso de las enfermedades infecciosas, hipertiroidismo, neoplasias, embarazo, lactancia e intervenciones quirúrgicas? 4. ¿Cómo explicaría que las dosis superiores a 1 g/dia pueden ocasionar hemolisis en portadores de deficiencia eritrocitica de G-6-P-deshidrogenasa? 5. Mencione algunas funciones metabólicas importantes del ácido ascórbico. 81 REUNION DE LABORATORIO N° 15 PRACTICA N° 33 DETERMINACION DE HIERRO SERICO TOTAL Y TIBC I. INTRODUCCION: El hierro sérico es importante en el organismo porque es componente esencial de la hemoglobina encargada del transporte de oxígeno, así como de otras hemoproteínas como los citocromos ± componentes de la cadena respiratoria- y la mioglobina. El hierro forma parte de los centros Fe-S de la cadena respiratoria. El hierro es absorbido en el intestino delgado como Fe2+ y su regulación ocurre a ese nivel y es transferido a la transferrina para su transporte sérico. El contenido de hierro en el cuerpo humano se encuentra distribuido en tres formas: el almacenado, que se encuentra dentro de las células; el hierro en uso, que se encuentra en la hemoglobina, enzimas y varios tipos de proteínas; y el circulante. Prácticamente todo el hierro corporal se encuentra unido a proteína, dado que no sólo es relativamente insoluble, sino que además es tóxico. La deficiencia de hierro pasa por tres estadios:  Deficiencia de los depósitos de hierro, lo que lleva a la disminución de la ferritina sérica  Disminución de hierro sérico, aumento de Capacidad Total de Fijación de Hierro y disminución de la Saturación de Hierro  Anemia por deficiencia de hierro: microcítica hipocrómica. El 90 % de anemias en las mujeres es por deficiencia de Fe. La evaluación de la concentración de hierro sérico es de gran utilidad, dado que un aumento en sus niveles se encuentra asociado a diversas patologías tales como destrucción aumentada de los glóbulos rojos, defectos en el mecanismo de almacenaje, etc. De la misma manera, su disminución se asocia entre otras patologías a problemas de absorción y almacenaje, etc. La capacidad de fijación de hierro (TIBC) aumenta en casos de anemias ferroprivas y disminuye en las hemocromatosis, tumores, fiebre reumática, etc. II. REACTIVOS A UTILIZAR: Buffer ácido: buffer acetato pH 4.0, hidroxilamina clorhidrato. Buffer alcalino: buffer TRIS pH 8.0 Reactivo color: ferrozina, hidroxilamina clorhidrato. Solución Standard: Fe (II) en hidroxilamina clorhidrato 500 ug/dl III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACION DE HIERRO Armar el siguiente sistema Componentes Blanco (suero) Muestra Buffer Acido (ml) 2,5 2,5 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) --------Muestra (ml) 0,50 0,50 Reactivo color (ml) ----0,05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm 82 Cálculos: Ferremia (ug/dl) ! Valores de referencia:  Varones: 50 - 160 ug/dl  Mujeres : 40-150 ug/dl DETERMINACION PARA TIBC (capacidad de fijación de hierro) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Muestra Muestra Buffer Alcalino (ml) 2,00 2,00 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) 0,50 0,50 Muestra (ml) 0,50 0,50 Reactivo color (ml) ----0,05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm Calculos: UIBC (ug/dl) ! 500  TI v 500 Abs.standard Abs.Bl.reactivo Abs.Muestra Abs.Bl.Muestra Abs.Standard Abs.Bl.Reactivo v 500 Abs.muestra Abs.Bl.muestra % Saturación! Ferremia (ug/dl) TIBC (ug/dl) Valores de Referencia: TIBC: Hasta 6 años Sobre 6 años % Saturación IV. CUESTIONARIO: 1. 2. 3. 4. 5. : : : 100 ± 400 ug/dl 250 ± 400 ug/dl 20 ± 55 % Señale al menos 5 funciones del hierro Causas de deficiencia de hierro Informe sobre estructura de la ferritina ¿Qué exámenes solicitaría para evaluar la deficiencia de hierro? ¿Qué importancia tiene medir la saturación de hierro? ©¨ § (ug/dl) ! Ferremia(ud/dl) I (ug/dl) ©¨ v 100 83 PRACTICA N° 34 DETEMINACION DE CLORO, SODIO Y POTASIO EN EL SUERO DE PERSONAS SANAS Y EN ESTADO PATOLOGICO DETEMINACION DE CLORO I. INTRODUCCION: El ión cloro comprende aproximadamente el 65% del total de aniones del liquido extracelular. De todos los aniones es uno de los de más baja concentración en el líquido intracelular. En el suero normal el cloruro se encuentra en concentraciones que varían entre 100 y 106 mEqL. La concentración de cloruro se puede incrementar (hipercloremia) en muchos casos como resultado del déficit primario de C02. Este tipo de alcalosis que es de tipo respiratorio resulta por hiperventilación que puede ser causada a su vez por: a) drogas, b) enfermedades que producen estímulo del centro respiratorio como: histeria, ansiedad, fiebre, tensión de oxígeno disminuida (altura), c) algunos tipos de enfermedad tubular renal con acidosis pueden producir incremento del cloruro sérico, d) excesiva ingestión de ClNH4 (cloruro de amonio) produce acidosis que puede ser seguida de altos niveles de cloruro sérico, igualmente sucede en el ClK. Se puede presentar concentración de cloruro disminuido (hipocloremia) en hipoventilación causada por: 1) depresión del sistema nervioso central, 2) parálisis de los músculos respiratorios, 3) enfermedad pulmonar; todas estas alteraciones tienen exceso de C02 (que produce hipocloremia), 4) enfermedad renal crónica, 5) en la diabetes mellitus no controlada, 6) dieta alta en grasas o en ayuno prolongado el cloro es desplazado por los cuerpos cetónico por sobre producción de estos, 7) en hiper o en s hipofunción de las glándulas adrenales (corteza). II. REACTIVOS A UTILIZAR: - Reactivo de Color 2,4,6 TPZ existente parcialmente como complejo Hg(II)+Sulfato de Hierro - Estándar de cloruro: 355 mg/dl III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Antes de la determinación el estándar y las muestras de suero deben ser diluidas en relación 1/50 con agua destilada (20 µL de muestra/1 ml de agua). Armar el siguiente sistema: COMPONENTES ESTANDAR PROBLEMA Estándar diluido 20 ul --Suero diluido --20 ul Reactivo de color 1 ml 1 ml Mezcla, después de incubar 5 minutos a oscuras. Medir en el transcurso de 60 minutos la absorbancia de problema y estándar. No exponer a la luz CALCULOS Lectura tandard   ! 355 v Lectura uestra ?mg/dlA  84 VALORES NORMALES : 335 - 383 mg/dl. (Convertir en mEq/l dividiendo entre 3.55) IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué influencia tiene la Aldosterona en el metabolismo del cloro? 2. ¿Cómo explicaría usted, la deficiencia acentuada del cloro en la enfermedad de Addison? 3. ¿Puede señalar cinco causas de hipercloremia? 4. ¿Puede señalar cinco causas de hipocloremia? 5 ¿Cual es la relación de las alteraciones de la cloremia con el equilibrio ácido básico? 85 DETERMINACION DE SODIO I. INTRODUCCIÓN Debido a la predominante concentración del ión sodio en el líquido extracelular éste influye sobre la presión osmótica que juega un rol preponderante en la distribución del agua entre el espacio extra o intra celular. El ión sodio es importante en el mantenimiento del equilibrio ácido básico ya que constituye aproximadamente el 90% del total de cationes extra celulares. Un adulto de 70 kg de peso contiene aproximadamente 80 g de sodio de los cuales 44 se encuentra en el % líquido extra celular y el 35% en los huesos. Del total de sodio corporal hay un 18% que fundamentalmente se encuentra en los huesos, es aparentemente inerte (no ionizable), hay por lo tanto un 82% del total que es capaz de recambio y participa en las reacciones fisiológicas. En el hombre adulto hay cerca de 43 mEq de sodio intercambiable por kg. por peso corporal; en mujeres hay sólo 39 mEq por kg. y en niños es mayor. Como sucede con el agua corporal los valores varían inversamente con la grasa corporal. El ion sodio es ingerido en los alimentos en combinación con el cloro fosfato, sulfato y otros aniones (sales). Son ingeridos cerca de 3 gr. Diariamente y tiene acceso al suero por difusión a través de la mucosa intestinal o sea que cerca del 4% del sodio corporal total se recambia- diariamente. En el suero, el sodio esta en equilibrio con el del líquido intersticial, con pequeñas diferencias debido al equilibrio de Donnan. La concentración sérica es representativa de toda la concentración celular. La cantidad presente dentro de la célula no puede ser medida sin biopsio del tejido. El exceso de sodio se elimina por el riñón. El sodio se excreta casi exclusivamente en la orina. El riñon puede regular la excreción de sodio y agua por lo tanto, es el principal factor de regulación de este ion corporal y de sus concentraciones. Pequeñas cantidades aparecen también en las heces, sudor y saliva. En condiciones anormales pueden ser muy considerables las pérdidas de agua por el sudor u otr s o fluidos. El suero o plasma contiene más del 90% del sodio total de la sangre. La concentración sérica normal es de 135 a 145 mEq por L (310 A 340 mg%). Tales valores no dan información acerca del volumen y distribución de la cantidad total presente ni de la cantidad intracelular existente. El estado clínico de hidratación es importante para evaluar el significado de los niveles séricos de sodio. Se puede encontrar incremento de sodio con hiperosmolaridad en individuos con deficiencia predominante de agua corporal. Puede ocurrir deshidratación con sodio sérico elevado, si el líquido ingerido es insuficiente por razones anormales, por ejemplo en pacientes con diabetes insípida no controlada, alimentación nasogástrica con alto contenido de proteínas, cuando el líquido ingerido no es suficiente para eliminar la sobrecarga de solutos por el riñón, como en el coma diabético, tratado sólo con insulina y solución salina. Algunos pacientes con enfermedad cerebral, pacientes con diarrea. Se observan concentraciones bajas si las concentraciones de sodio exceden a las del agua; en pacientes con diarrea, fístula intestinal, enfermedad renal con disfunción tubular, en diabetes mellitus no controlada. La determinación del sodio de los fluidos biológicos se realiza sea por electrodo ión selectivo o menos frecuentemente por método colorimétrico II. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante: Acetato de uranilo más acetato de magnesio  Reactivo de color: tioglicolatop de amonio  Standard de sodio: 50 mmol/l 86 III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (PROCEDIMIENTO) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco de Standard Problema Reactivo Standard 20 ul Problema 20 ul Precipitante 1 ml 1ml Tapar los tubos y mezclar cuidadosamente. Dejar reaccionar durante 5 minutos Agitar fuertemente por 50 segundos. Dejar reaccionar durante 30 minutos Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). Emplear el sobrenadante Precipitante 20 ul Sobrenadante 20 ul Standard Sobrenadante 20 ul Problema Reactivo de color 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar bien. Después de 5 a 30 minutos medir las absorbancias contra agua destilada a 405 nm CALCULOS: Factor: 150 /Lectura Bco Reactivo-Lectura Standard Na (mmol/l)= (Lectura Bco Reactivo-Lectura Muestra) x factor IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es la importancia biológica del ion sodio? 2. ¿Cuál es el principal factor de regulación del ion sodio corporal? 3. ¿Qué semejanza existe en la absorción intestinal de este ion y la glucosa? 4. Señale las concentraciones séricas normales. 5. ¿Por qué la clasificación de deshidratación por alteración de la osmolaridad, incluye básicamente las concentraciones de esté ion? 87 DETERMINACION DE POTASIO I. INTRODUCCIÓN El potasio es el principal catión intracelular y por lo tanto es un factor importante de la presión osmótica que determina la distribución de agua entre las células y el líquido extracelular. Además de este rol pasivo, influye activamente en el metabolismo celular ya que es cofactor de muchas reacciones enzimáticas intercelulares. Existe aproximadamente 130 gr. (3300 mEq) de potasio en un adulto de 70 kg. del cual el 98% es intracelular mientras que el 2% está presente en el liquido extracelular. El 95% del total del potasio corporal es intercambiable aunque el grado de recambio de cada tejido varía en los diferentes órganos. El potasio del hueso, cerebro y de los glóbulos rojos se recambia más lentamente que en otros órganos, en adultos masculinos hay aproximadamente 46 mEq de recambio de potasio, en mujeres solamente 40 mEq por kilogramo de peso. Los niños tienen relativamente menos contenido de potasio por kilogramo de peso debido a que la relación de agua intracelular/extracelular es menor que en adultos. Aproximadamente 293 gr. De potasio en forma de sal son ingeridos diariamente y recambiados con el potasio corporal. Entonces el 2<26 del total del potasio corporal son recambiados diariamente. En los niños donde la ingestión de potasio es relativamente más grande, el recambio diario es de 14%. El potasio es rápidamente removido del líquido extracelular después que es ingerido. Del sue el ro potasio es transferido el líquido intersticial antes de penetrar a las células o al filtrado glomerular a través de la membrana de los capilares glomerulares del riñón. La concentración de potasio intracelular varia con los cambios del agua que gene ralmente acompaña a las alteraciones de los niveles de sodio extracelular. Bajo condiciones de incremento de pH (alcalosis) asociado con la disminución de cloruros, se produce intercambio entre el sodio intersticial y el potasio intracelular. El déficit de potasio celular es reflejado en los hallazgos séricos y bajo estas condiciones la regla es hipopotasemia debido a la elevada excreción urinaria de cloruro de potasio. Con ingestión calórica inadecuada y la utilización de proteínas celular para propósitos calóricos, el potasio es liberado de las células y excretado dando como resultado hipopotasemia. El potasio se pierde en el cuerpo principalmente en la orina aunque pequeñas cantidades son perdidas en la respiración insensible. Excesiva cantidad de potasio puede liberarse del cuerpo bajo dos condiciones: primero cuando las secreciones intestinales con su contenido relativamente alto de potasio, son perdidos a través del vómito, diarrea o fístula gastrointestinal segundo por excreción urinaria incrementada en individuos con anormalidades tubulares renales. La concentración de potasio en el suero de personas normales es de 3,5 -5-3 mEq/L; en recién nacidos los niveles son algo más altos, varían entre 4-5,9 mEq/L. Se debe evitar la hemolisis en la toma de muestras de sangre porque el potasio puede ser liberado de los eritrocitos lisados. Existe también una pérdida lenta de potasio de los glóbulos rojos hacia el suero cuando la sangre permanece guardada. Se produce hiperpotasemia con pérdida intracelular de potasio cuando la permeabilidad de la membrana celular está alterada por lesión tisular. Bajo estas condiciones el potasio se eleva si el riñon no puede excretar esta sobrecarga. Hiperpotasemia se puede encontrar en: Shock o falla circulatoria de cualquier causa; en hipoventilación tanto central como periférica cuyo incremento de potasio es frecuente; en la diabetes no controlada, la excesiva destrucción de células del cuerpo y la utilización de proteínas para propósitos calóricos se acompañaría de pérdida de potasio celular; en deshidratación, en insuficiencia de la corteza adrenal, pues la falta de esferoides adrenales provocan retención de potasio sérico; asi mismo en algunos casos de insuficiencia renal se encuentra elevada la concentración de potasio. Déficit de potasio corporal puede resultar en: Pobre ingestión de alimentos, en administración continua de glucosa endovenosa y terapia salina, esto es debido a que la excreción de potasio por orina se mantiene constante; en alcalosis con hiperventilación; en intoxicación temprana con salicilatos; en fístulas gastrointestinales y vómitos; en íleo paralitico y anastomosis intestinal no funcionante; en hiperfunción adrenocortical o sobredosis de cortisona o ACTH; así mismo en algunos casos de 88 insuficiencia renal crónica. II. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante :ácido tricloroacético  Reactivo TPB-Na: tetrafenilborato de sodio  NaOH  Estándar de Potasio III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): 1. Precipitación: en un tubo de ensayo pequeño añadir 50 ul de suero y 500 ul de reactivo precipitante. Mezclar cuidadosamente. Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). 2. Armar el siguiente sistema: Componentes Reactivo de trabajo Standard Sobrenadante Standard 1 ml 100 ul 100 ul Problema 1 ml Para producir una turbidez homogénea el Standard y el sobrenadante transparente deben de ser agregados en el centro de la superficie del reactivo de trabajo Mezclar cuidadosamente Dejar reposar por lo menos 5 minutos Medir las absorbancias dentro de los 5 y 30 minutos CÁLCULOS: Factor: 5/Lectura del Standard Problema: lectura del problema x factor VALORES NORMALES: Suero de 3.5 a 5.5 mmol/l IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es el principio o fundamento del método de Hoffman para determinación del potasio sérico? 2. ¿Cómo explica metabólicamente la influencia sobre la concentración sérica de potasio producida por la administración de glucosa e insulina? 3. Explique usted los efectos metabólicos de la aldosterona en la excreción renal de potasio. 4. De ejemplos de hiperpotasemia y de hipopotasemia 89 PRACTICA N° 35 DETERMINACION DE CALCIO SERICO I. INTRODUCCION: El calcio sérico se encuentra en dos formas: Una combinada con proteínas séricas, inactivo e incapaz de difundir a través de las membranas de los capilares. Y la forma no unida a las proteínas, es principalmente iónico, difusible y activo. Varios factores influyen en la concentración de calcio sérico total. La hiperproteinemia está asociada con una elevación en los niveles de calcio, mientras que la hipoproteinemia se acompaña con disminución de la concentración de calcio; sin embargo la concentración de calcio ionizado no se altera. El calcio ionizado se altera en las siguientes situaciones: 1) Por variaciones del pH sérico; la alcalosis tiende a disminuir el calcio y la acidosis tiende a incrementarlo. 2) La ingestión de vitamina D aumenta el calcio ionizado a través de la absorción de calcio y por la excreción del fósforo. 3) La hormona paratiroidea es el factor más importante que controla los niveles de calcio sérico y su efecto es casi exclusivamente limitado a la forma iónica del calcio. La concentración del calcio sérico en individuos normales es de 9 a 11,5 mg por 100 ml Aproximadamente 4,5 a 5,5 mg% es ionizado y cerca de 0,5 mg% está presente como citrato de calcio y el resto se encuentra unido a las proteínas. El propósito de la presente práctica es determinar la concentración sérica de calcio total en personas adultas normales y/o en estado patológico por el método colorimétrico directo II. REACTIVOS A UTILIZAR: - Buffer alcalino: buffer lisina pH 11,1 - Reactivo de Color: 8-hidroxiquinolina, o-cresolftaleina-complexona, ácido clorhídrico - Solución estándar de calcio: 8 mg/dl III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Standard Muestra Muestra --------20 ul Standard ----20 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar y medir la absorbancia de la muestra (¨A muestra) y del Standard (¨A Standard) contra el blanco en un lapso de 5 a 30 minutos CALCULOS: A muestra C ! 8v ?mg/dlA A standard VALORES DE REFERENCIA: Suero o Plasma: 8,1 ± 10,4 mg/dl   90 IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es la importancia biológica del calcio en el ser humano? 2. ¿Cuáles son las formas de calcio sérico? 3. ¿Cuáles son los factores que controlan los niveles de calcio sérico? 4. ¿Cuál es la concentración normal de calcio sérico total? 5. Señale algunas alteraciones fisiológicas y/o patológicas que producen alteraciones de los niveles séricos de calcio. 91 PRACTICA N° 36 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. INTRODUCCION: La membrana de los eritrocitos es semipermeable. Cuando éstos son colocados en una solución hipertónica pierden líquido arrugándose y destruyéndose hasta que se establece el equilibrio osmótico con el líquido circulante. Sin embargo cuando los eritrocitos son colocados en solución hipotónica aceptan líquido (hinchándose) hasta que se alcanza el equilibrio osmótico o hasta que se rompen. Sin embargo en ciertas anemias hemolíticas adquiridas, la resistencia de los eritrocitos a las soluciones hipotónicas disminuye. Aunque en la prueba de la osmosis la ruptura de las células resulta de la alteración de su forma y disminución de su resistencia a las fuerzas osmóticas más que a un cambio en la composición de la célula o su osmolaridad, de allí que se emplee el término de fragilidad. Las células esferociticas se rompen más rápidamente que las demás y de hecho la prueba de la fragilidad osmótica puede ser considerada como un índice más sensible que la de la magnitud de eritrocitos a la lisis en solución hipotónica, es observada en la talasemia, anemia falciforme y en la anemia hipocrónica ordinaria (ferropénica). Si utilizamos una serie de soluciones de CINa de concentraciones gradualmente progresivas es posible comprobar que la hemolisis de los eritrocitos se producen dentro de ciertos limites de hipotonicidad, lo que se conoce con el nombre de fragilidad osmótica de los eritrocitos (0,5 - 0,3%). La presente práctica tiene la finalidad de: Verificar el desplazamiento de agua desde el medio extracelular hacia el medio intracelular y viceversa en los eritrocitos, cuando estos son puestos en soluciones hipertónica e hipotónica respectivamente. Demostrar la fragilidad osmótica de los eritrocitos cuando éstos son colocados en diversas soluciones de CINa de diversas concentraciones. II. REACTIVOS A UTILIZAR: EXPERIMENTO N°1 - NaCl al 4,5% - NaCl al 15%. - NaCl al 8,5% EXPERIMENTO N°2 - Solución salina amortiguada concentrada 10%. - Cloruro de sodio (180 g). - Na2P04 (27,31 g). - NaH2 PO4.2H2O (4,86 g). Se afora con 2 litros de agua destilada y se conserva a 0° C (dura varios meses). - Heparina III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS ERITROCITOS : PRECAUCIONES: 1. La muestra de sangre debe ser obtenida con un mínimo de estancamiento y de trauma. 2. La muestra debe ser procesada tan pronto como sea posible después de tomada. 3. Utilizar heparina como anticoagulante de elección. El uso de anticoagulantes del tipo de los oxalatos que comprende la adición de sales osmóticamente activas son indeseables. 4. Cuidar que las gotas de sangre caigan directamente en las soluciones salinas, no deben hacer contacto con las paredes de los tubos secos porque estos pueden causar 92 hemólisis. PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES Las diluciones se pueden preparar inmediatamente antes de la prueba: 1. Conviene preparar una solución al 1% a partir de la solución concentrada al 10% y armar la siguiente serie de tubos: N° de NaCl al 1% Agua destilada % de NaCl tubo (ml) (ml) 1 0.50 4.50 0.10 2 1.00 4.00 0.20 3 1.50 3.50 0.30 4 1.75 3.25 0.35 5 2.00 3.00 0.40 6 2.25 2.75 0.45 7 2.50 2.50 0.50 8 2.75 2.25 0.55 9 3.00 2.00 0.60 10 3.25 1.75 0.65 11 3.50 1.50 0.70 12 4.00 1.00 0.80 2. Mezclar el contenido de cada tubo antes de agregar la sangre. 3. La sangre del paciente y del sujeto normal son tomadas, con las precauciones señaladas, en tubos heparinizados. Se debe rotar cada muestra suavemente en el tubo hasta que el color sea rojo brillante (plenamente oxidado). 4. Utilizando con precisión una pipeta para hemoglobina o una pipeta Pasteur calibrada, añadir 0,02 ml de sangre del paciente a cada uno de los doce tubos de una primera hilera. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 1 y 3 de cada mesa de trabajo). 5. Colocar cantidades similares de sangre control del sujeto normal en cada uno de los tubos de una segunda hilera. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 2 y 4 de cada mesa de trabajo). 6. Mezclar correctamente cada tubo y dejar a temperatura ambiente por 30 minutos. Volver a mezclar y luego centrifugar a 2000 rpm. 7. LECTURA: Observar cuidadosamente y marcar los tubos donde se inicia la hemólisis, objetivado por el color rojizo pálido que toma el líquido sobrenadante en los tubos centrifugados. Marcar el tubo donde la hemólisis es completa (color rojo intenso). Observar que la fragilidad globular media de los eritrocitos se produce entre los tubos 5 y 6 (0,40 y 0,45% de NaCl). Anotar los resultados. EFECTO DE LAS SOLUCIONES HIPERTÓNICAS E HIPOTONICAS SOBRE LA INTEGRIDAD DE LOS ERITROCITOS: (Verificar por inferencia el desplazamiento del agua entre los medios intra y extracelular, por acción de soluciones salinas de diferente concentración). Procedimiento: Realizar asepsia del pulpejo del dedo escogido de la mano, con un algodón empapado en alcohol yodado. Utilizando lancetas descartables o lanceta de Link estéril pinchar el dedo. Depositar una gota de sangre en cada una de las tres láminas porta-objeto. Proceder de la siguiente manera: Láminas (gotas) I II III 93 Sangre del pulpejo de dedo Solución isotónica de CINa 8,5% Solución hipertónica de CINa 15% Solución hipotónica de CINa 4,5% Mezclar bien. 1 2 - 1 2 - 1 2 Utilizando el microscopio observar los eritrocitos de cada una de las láminas. Establecer las comparaciones morfológicas y/o lisis de los glóbulos rojos en rel ción a cada tipo de a soluciones empleadas en cada caso. Anotar los resultados. IV. CUESTIONARIO: 1. Si el test de fragilidad osmótica de los eritrocitos de un modo general evalúa la relación entre el área superficial y el volumen de la célula, diga: A. ¿Cuál es la relación normal existente que permite la forma de disco bicóncavo del eritrocito? B. ¿Cuáles son las relaciones normales existentes para la formación de los esferocitos y de las células tipo tiro al blanco? (target cell). Según observación cuidadosa, señale la concentración o porcentaje de NaCl del tubo en el cual empezó la hemólisis; así mismo el tubo en donde la hemólisis fue completa. De acuerdo a los valores normales del test de fragilidad osmótica de los eritrocitos, señale los porcentajes de inicio y finalización (total) de la hemólisis. Señale causas de alteraciones en la fragilidad osmótica. 2. 3. 4. 94 PRACTICA N° 37 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. INTRODUCCION: Frecuentemente los antígenos se asocian con partículas que son demasiado grandes para formar soluciones o suspensiones coloidales en los medios acuosos. Estas partículas (bacterias, eritrocitos, partículas de látex, etc.), pueden quedar suspendidas en una solución salina y mezclarse con antisueros específicos. Se denomina reacción de aglutinación al fenómeno en que la mezcla de las partículas de antígeno con los antisueros específicos provoca una agrupación de dichas partículas antigénicas. Por lo general la aglutinación puede observarse a simple vista, pero en algunos casos se necesita el examen microscópico de la preparación estudiada. Los anticuerpos de las distintas clases de inmunoglobulinas difieren en su capacidad de producir reacciones de aglutinación. Estas diferencias dependen principalmente de la valencia del sitio de fijación del antígeno en las diversas clases de los anticuerpos. Por lo tanto no es sorprendente que los anticuerpos IgM, con cinco sitios eficaces de fijación de antígeno por cada moléculas de 19S tengan una actividad aglutinante superior a la de los anticuerpos IgG con dos sitios de fijación de antígeno por cada molécula, dirigidos contra el mismo antígeno. En otras palabras, una baja concentración de anticuerpos IgM produce una reacción de aglutinación cuya intensidad es igual a la que se produce con una elevada concentración de anticuerpos IgG. El mecanismo de una reacción de aglutinación es semejante al de las reacciones de precipitación; ambos tipos de reacciones se producen por medio de anticuerpos multivalientes que se combinan con partículas de antígeno formando complejos de antígeno anticuerpos. La única diferencia entre una reacción de precipitación y otro de aglutinación es que los antígenos son moléculas pequeñas en tanto que los antígenos aglutinantes están asociados con partículas de mayor tamaño. Al igual que las reacciones de precipitación las pruebas de aglutinación requieren de un pH apropiado y de la moralidad de amortiguadores salinos y debe existir una proporción adecuada de antígeno respecto del anticuerpo. Las pruebas de aglutinación tienen muchos usos en el laboratorio clínico, tanto para medir antígenos como para determinar las concentraciones de los anticuerpos. La concentración del anticuerpo aglutinante se define como la mayor dilución de antisuero que aglutina el antígeno examinado, en las condiciones empleadas en la prueba. En general las pruebas de aglutinación son fáciles de prac ticar, bastante reproducibles y sumamente sensibles. En efecto dichas pruebas permiten habitualmente descubrir hasta 0.1 Ugr de anticuerpos/ml de suero Las pruebas de aglutinación se utilizan rutinariamente en las pruebas cruzadas con sangre antes de administrar transfusiones endovenosas en pacientes, para descubrir la presencia de anticuerpos del receptor, en la superficie de los eritrocitos del donador (Prueba indirecta de Coombs), en el diagnóstico de las anemias hemolíticas por autoinmunidad (en la que los pacientes producen anticuerpos para las membranas de sus propios eritrocitos), en la Prueba de Paul-Bunnell (Prueba de aglutinación en pacientes con mononucleosis infecciosa), en la Prueba de Widal (en pacientes infectados con bacterias gram negativas como Salmonella, Brucella, Pasteurella), en la Prueba de Weil Felix (en pacientes con enfermedades provocadas por Ricketsias, como el tifus endémico), en la prueba del factor reumatoideo (en pacientes con artritis reumatoides), en pruebas inmunitarias del embarazo, etc. En la membrana de los glóbulos rojos de cualquier persona normal se pueden encontrar determinados antígenos (antígeno de superficie o determinantes antígenos). Algunas personas son poseedoras de un antígeno de superficie designado en forma arbitraria como antígeno A (eritrocitos tipo A); otras personas tienen otro tipo de antígeno de superficie que se llama antígeno B (eritrocitos tipo B). Algunas personas 95 pueden tener ambos antígenos A y B (eritrocitos AB) y una cuarta posibilidad es que no tengan ninguno de los antígenos mencionados (eritrocitos tipo 0 o H). Los antígenos de superficie A y B son llamados también aglutinógenos y se ha estimado que pueden haber hasta un millón de sitios antigénicos A o B en un solo hematíe, aunque quizá sea más realista una cifra de 5000,000. Los antígenos aparecen a comienzos de la edad fetal en cuanto se forman los eritrocitos . Por otra parte, en el suero existe también normalmente anticuerpos contra los antígenos A y B, llamados isoaglutininas, porque producen aglutinación de los glóbulos rojos que poseen el correspondiente antígeno y porque los antígenos son de origen humano (iso=de una misma especie). Estos anticuerpos (isoaglutininas) son del tipo IgH y son poco detectables en los sueros de los recién nacidos, pero aumentan con rapidez su titulación en los primeros meses de vida. Como existe un desarrollo gradual de estas isoglutininas, se ha sugerido que las inmunizaciones inaparentes durante la infancia y el comienzo de la niñez pueden ser responsables de la producción de anti A o anti B. Es un hecho bien conocido que muchas bacterias instestinales (salmonellas y shigellas) tienen antígenos que reaccionan en forma cruzada con los antígenos humanos AB0 (H). De acuerdo con esta hipótesis todos los recié nacidos n están expuestos a los antígenos A y B. Pero una persona del grupo A forma sólo anti B y no anti A, ya que su propio antígeno A, le ha conferido una tolerancia inmunológica específica hacia él. La misma lógica explicaría que una persona del grupo B forma sólo anti A y no anti B. II. REACTIVOS A UTILIZAR: y Kit para identificar grupos sanguíneos (Diagnóstica). y Obtener muestras de sangre tipo A y tipo B, previamente identificadas, con hepsrina como anticoagulante. y Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos y descartar el plasma. y Llevar los glóbulos rojos sedimentados con suero fisiológico por tres veces, para eliminar los anticuerpos inespecíficos adicionados a la superficie de los glóbulos rojos. y Preparar una suspensión al 5% de glóbulos rojos lavados, del tipo A y B en solución salina fisiológica. III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.  Identificación de isoaglutininas en suero: y De uno de los estudiantes de cada grupo (o masa) de trabajo, tomar una muestra de sangre sin anticoagulante y obtener el suero por centrifugación. En cada extremo de una lámina porta objetos poner una gota del suero recientemente obtenido y marcar 1 y 2 respectivamente. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo A sobre la gota de suero con marca 1 y mezclar. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo B sobre la gota de suero con marca 2 y mezclar. Observar si hay o no aglutinación de los glóbulos rojos en 1 y/o en 2 de isoaglutininas en el suero problema del estudiante y deducir el grupo sanguíneo que posee. y y y y IV. CUESTIONARIO: 1. Utilizando los símbolos (+ )= positivo y (-)= negativo complete el cuadro de aglutinación de los grupos sanguíneos ABO: 96 SUERO DEL GRUPO O B A AB ( ( ( ( AB ) ) ) ) ERITROCITOS DEL GRUPO A B ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( C ) ) ) ) 2. Diga usted ¿Por qué ya no es costumbre corriente utilizar sujetos de tipo O como ³donadores universales´ y personas de tipo AB como ³receptores universales´? 3. En el siguiente cuadro anote los anticuerpos en el suero: GRUPOS SANGUÍNEOS ABO ANTIGENOS EN LOS POS ERITROCI. (G. SANG) A B O AB ANTICUER. EN EL SUERO Anti Anti Anti Anti POSIBILIDADES DE TRANSFUSIÓN Puede recibir Puede donar De A AyO ByO O Todos (receptor Universal) A y AB B y AB Todos (donador Universal) AB 4. ¿Qué aplicaciones de las reacciones antígeno anticuerpo puede señalar? 5. ¿Cuál es el fundamento de las reacciones antígeno-anticuerpo?
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