ALUMNO (a

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PRESENTACION
Los profesores de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la U niversidad Nacional de Trujillo, han actualizado la Guía de Práctica, donde el estudiante encontrará una breve introducción de la importancia bioquímica y correlato medico de cada práctica, así como el procedimiento a desarrollar, finalizando con un breve cuestionario a fin de ampliar o concretar la aplicación de lo tratado. La Bioquímica es sin duda la ciencia que más ha aportado al desarrollo de la Medicina, basada en una rigurosa apl icación del método científico de la investigación

experimental. En la práctica, los alumnos a partir de los conocimientos adquiridos en los diálogos, seminarios y casos clínicos, tienen la oportunidad de plantear

interrogantes, contrastarlas con un experimento en forma ordenada, obten iendo resultados que al final se discutirán en grupo con el docente. También podrán conocer algunos métodos aplicados al diagnóstico clínico o al estudio nutricional. La práctica en Bioquímica, constituye un estímulo importante en el desarrollo de la investi gación experimental, permitiendo a nuestros estudiantes desarrollar habilidades y destrezas en trabajos de investigación y así obtener logros a nivel nacional para nuestra Facultad. Un recuerdo especial para los profesores que sentaron las bases para la actual guía de práctica como el Dr. Hugo Alpaca Muñoz, el Dr. Jorge García Ventura y un

agradecimiento a todos los docentes que de una u otra manera aportaron con sus conocimientos para disponer de esta herramienta que beneficiará a los alumnos de nuestra Facultad. Dr. CARLOS ARANCIBIA ARROYO Dra. MARIA DAYSI REYES BELTRAN Dr. JUAN VALLADOLID ALZAMORA Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA Dr. WALTER OBESO TERRONES Dr. ALFREDO LARIOS CANTO Dr. JORGE PLASENCIA ALVAREZ Dr. HECTOR RODRIGUEZ BARBOZA

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I UNIDAD SUBESTRUCTURA CELULAR: ENZIMAS Y BIOENERGETICA

REUNION DE LABORATORIO N° 01
PRACTICA N° 01
DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS
I. INTRODUCCION: La vida depende de una serie ordenada de reacciones químicas que son catalizadas por enzimas formadas para este fin. Las enzimas son proteínas relativamente frágiles con tendencia a sufrir desnaturalización e inactivación, es decir alteraciones en su conformación, por efecto de diversos agentes físicos y químicos como: temperatura, ácidos, álcalis fuertes, sales pesadas, pH, etc. Las enzimas se encuentran en pequeñas concentraciones en los materiales biológicos resultando , complicada su individualización o purificación. Para poder verificar directamente las propiedades comunes o similares de la naturaleza proteica que las caracterizan, experimentalmente se pueden utilizar las propiedades de catalizadores específicos que tienen las enzimas, como indicador de las alteraciones que pueden sufrir éstas cuando son sometidas a la acción de diferentes agentes físicos y químicos. De esta manera, sin necesidad de individualizar o purificar una determinada enzima se pueden verificar cómo los agentes físicos y químicos afectan la naturaleza proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad. La finalidad de la presente práctica, es evidenciar las características proteicas de las enzimas y que expuestas a la acción de diversos agentes físicos y químicos hacen variar su comportamiento y actividad catalítica. II. REACTIVOS A UTILIZAR: NaOH 1N SO4 Cu 20% NaCl 0.15M Amilasa salival 1.0% Solución iodada HCl 3N y 0.05N Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 Ácido tricloro acético (A.T.C.A.) al 20%

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Preparar: SISTEMA A TUBOS COMPONENTES (en ml) Amilasa al 1% NaOH 1N HCl 3N Ácido Tricloro acético 20% Sulfato de Cobre al 20% Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 I 1.0 2.4 II 1.0 2.4 III 1.0 2.4 IV 1.0 2.4 V 1.0 2.4 VI 1.0 2.4

Esquematice el procedimiento de la práctica.5 VI 5 0. Dejar los 5 primeros tubos del sistema en reposo por 10 minutos a la temperatura ambiente.4 2.5 0.0 a.0 1.0 5.5 0. d.0 VI 1. Observar el aspecto y color producido e interpretar.15 M Agua Destilada 5.1 M / pH 6. c.4 2.0 IV 1. Observar el color producido e interpretar los resultados. b. de la enzima tratada.6 NaCl 0.4 2.0 II 1.4 2.0 1. Agregar 0.6 ml.0 1. .5 0. d.5 0.5 V 5 0. Colocar el tubo VI en un baño de agua hirviendo por 10 minutos. IV. agregar: Solución yodada 0.5 III 5 0. Pre incubar por dos minutos a 37 ºC. Dejar en incubación a 37 °C por 20 minutos.0 I 1. 4.0 5. b.05N De los tubos de reacción del sistema (B).4 a.0 III 1. Explique los tipos de enlaces fuertes y débiles que existen entre los aminoácidos para conformar una determinada proteína. de cada uno de los tubos del sistema (A) a su correspondiente tubo del último sistema (B).4 2.5 e.5 0. CUESTIONARIO: 1.0% en solución acuosa Buffer fosfato 0.0 5. c. Explique la teoría de la acción molecular de las enzimas sobre sus respectivos sustratos.5 IV 5 0.0 1.0 1. A continuación armar el siguiente sistema: TUBOS COMPONENTES (en ml) HCl 0.5 I 5 0.5 II 5 0. Durante este lapso construir el siguiente SISTEMA B: SISTEMA B: TUBOS COMPONENTES (en ml) Almidón al 1.0 5.0 V 1. Interprete y explique bioquímicamente cada uno de los pasos realizados durante el desarrollo de la práctica 2.0 1.0 5. 3.4 2.

verificando tanto el sustrato residual y los productos formados en dicha reacción. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato.Solución de almidón pH 6.0 al 1% Solución de cloruro de sodio 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) y Armar el siguiente sistema: ETAPA A: TUBOS COMPONENTES Solución de almidón pH 6. permitiendo que las reacciones químicas dentro de la célula ocurran rápidamente a través de vías bien definidas.Enzima al 1% (amilasa salival). y Colocar los tubos al baño de agua a 37 °C por 5 minutos.Reactivo Folin Wu: a.0 al 1%.5 PRACTICA N° 02 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. 4 ml. de enzima al tubo II. Solución Cúprica alcalina. b. . II. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL ) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura. la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras: 1.Solución yodada. Para poder mostrar la actividad enzimática se debe tener presente fundamentalmente que cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima.05N . entonces en un organismo vivo habría tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes. la vida tal como es no podría existir.1M . .1M Agua destilada I 5 ml. REACTIVOS A UTILIZAR: .Ácido Clorhídrico 0. . III. II 5 ml. Sin estas proteínas especializadas. y Agregar 1 ml. Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada. Verificando los productos liberados después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura. INTRODUCCION: Las enzimas pueden ser descritas como catalizadores complejos de origen biológico que tienen un alto grado de especificidad y eficiencia. y Volverlos a colocar al baño de agua a 37 °C durante 10 minutos. Solución fosfomolíbdica. 1 ml.Cloruro de sodio solución 0. 1 ml. En general. 2. 3 ml. La finalidad del presente trabajo experimental es determinar la actividad enzimática. utilizando la enzima amilasa salival que tiene la capacidad de degradar el almidón en maltosa (disacárido reductor) y algo de glucosa. .

II 5 ml. 2. y Inmediatamente cumplidos los 10 minutos.5 ml. ¿Qué métodos conoce para determinar la actividad enzimática? Explique la acción bioquímica de cada uno de los componentes en los pasos seguidos para determinar la actividad enzimática. CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin WU) TUBOS COMPONENTES De los tubos I y II: etapa A Solución Cúprica alcalina Hervir 8 minutos Enfriar Solución fosfomolíbdica Agua destilada y I 1ml.5 ml.5 ml. 2ml. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante III. donde se observe la energía de activación y el estado de transición. 0. 1ml. 0. 2ml. Mezclar. Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimático y defínalos. 1ml.6 CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL. . a este nuevo sistema. CUESTIONARIO: 1. 0. 1ml. 1ml. Elabore un gráfica para demostrar la acción de una enzima sobre su sustrato. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante. TUBOS COMPONENTES Ácido clorhídrico 0. y Mezclar.5 ml. transferir 0.5 ml. De cada uno de los tubos del sistema anterior. II 1ml.05 N De los tubos I y II: Etapa A Solución yodada I 5 ml. 3. 4. 0.

se extrae 5 ml. Cuando una proteína se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pH menores.0 Mezclar al instante por inversión.Solución de caseína en Acetato de Sodio 0. Por tanto. se puede determinar el PI de una proteína observando los cambios de solubilidad que se producen cuando la proteína se encuentra en varias soluciones que tienen pH conocidos.0 III 5. .0 1.) Ácido Acético 1N Agua Destilada      I 3. de caseína en acetato de sodio 0. .Indicador de pH: Papel Indicador ó pHmetro.1N III. Al contenido anterior del sistema agregar rápidamente 1 ml. TUBOS CONTENIDO ( en ml. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Marcar una serie de tubos de ensayo de 1 al 9 TUBOS REACTIVOS (en ml.0 IV 5.0 VIII 5. que precipitan porque la solubilidad en estas condiciones disminuye al mínimo. Completando del mismo modo hasta completar la serie. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que el punto o pH isoeléctrico de las enzimas es una característica físico química común de estas moléculas.1N (sal)  I 5.0 VII 5.0 1.0 1. Mezclar Extraer 5ml.Ácido acético 1N . Aprovechando este comportamiento. algunas proteínas son muy díficilmente solubles y precipitan. II. de solución y se elimina.0 V 5. de solución del tubo N° 1 y agregarlo al tubo N° 2.0 VI 5.0 1.NaOH al 10%.0 II 5. produciéndose en consecuencia variaciones en la estructura terciaria o cuaternaria y por lo tanto en su función biológica Aparte de otras propiedades que presentan las proteínas.1N en cada tubo.0 1.0 1. INTRODUCCION: El punto isoeléctrico es la concentración de iones hidrógeno en el cual la proteína es eléctricamente neutra.0 1. cada proteína posee un determinado punto isoeléctrico (PI).0 IX 5.7 PRACTICA N° 03 DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LAS PROTEINAS I. REACTIVOS A UTILIZAR: . iguales o mayores al PI. la proteína sufre variaciones en la constitución de sus grupos químicos.0 1. porque el número total de cargas positivas es igual al número total de cargas negativas contenidas en la proteína.0 1. cuando se encuentran en una solución que tienen pH igual al PI. En el tubo N° 9 una vez efectuada la mezcla.) Contenido Anterior Caseína 0.8 II 5 III 5 IV 5 V 5 VI 5 VII 5 VIII 5 IX 5 Mezclar el tubo N° 1 Extraer 5ml.2 6. . del tubo N° 2 y transferir al tubo N° 3.

que encontró en su experimento. En el tubo N°2 la concentración de ácido acético es de 8 ml. debe calcularse el pH de cada uno de los tubos IV. Indique el punto isoeléctrico aproximado a la proteína. 0. Así en el tubo N° 1 es de 1.1N). Anotar los resultados en la columna respectiva del cuadro anterior.  Luego de transcurridos los 30 minutos de reposo. En el tubo N° 3 la concentración de ácido acético es de 4. TUBOS N°.1 TUBO N° 3 = pH 4. .1 N. [ Ácido ] pK del Ácido Acético = 4. 1 = 4. verificar el pH de cada uno de los tubos con el indicador de pH. ¿Cómo interpreta el resultado obtenido del punto isoeléctrico? ¿Qué es el pK? El pH neutro del medio ¿es igual al pH isoeléctrico? De sus razones. I II III IV V VI VII VIII IX Emplear los símbolos siguientes : O = no cambia + = opalescencia. 4. lo cual se producirá en el tubo que tiene pH próximo a la solubilidad mínima de la proteína.0 ml. x = precipitado EFECTO INMEDIATO EFECTO DESPUÉS DE 30 MINUTOS CÁLCULO DEL pH  Determinar el tubo que presenta el máximo de precipitación. Ver ejemplo. 0.  Calcular el pH de cada uno de los tubos aplicando la Ecuación de Henderson ± Hasselbach.1 4 NOTA: De la manera indicada en el ejemplo.7 Ejemplo : Si la concentración de la sal es de 1 ml.7 ± 0. Anotar en el cuadro que se da a continuación Observar después de 30 minutos de reposo y anotar también en el cuadro respectivo.6 = 4. la concentración de ácido acético varía. Etc.1 N en todos los casos.8    Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la proteína en los diferentes tubos. 2. Cálculo de pH para el tubo N° 3: pH = pK + log. de ácido 1 N (16 ml. al 0.6 ml. Ecuación de Henderson ± Hasselbach [ sal ] pH = pK + log. CUESTIONARIO: 1. 3.1 N. de acetato de sodio 0.

1 N ¿Cuál es el pH de la solución en 1 ml? .9 5. Si la concentración de ácido acético en el tubo II es 8 ml a 0.

se toma como medida de la reacción el número de uniones peptídicas o glicosídicas atacadas respectivamente. De esta manera se puede expresar la cantidad de una enzima en términos de unidades enzimaticas. . Esa velocidad de reacción se expresa como la cantidad de sustrato transformado en cierto tiempo. definible como el número de moléculas de sustrato transformado por minuto y por molécula de enzima (ó por un solo centro activo) en condicionales experimentales tales que se esté midiendo la velocidad máxima (concentración saturante del sustrato). se debe reemplazar la definición de un Qmol de sustrato por un microequivalente (Q eq) del grupo involucrado. se recurre a la medida de la velocidad de la reacción que cataliza. INTRODUCCION: Al no ser posible medir la cantidad de enzima directamente en las estructuras biológicas. En éste último caso y siempre que se conozca un peso molecular se puede definir otra unidad ³LA ACTIVIDAD MOLECULAR O MOLAR O NÚMERO DE RECAMBIO´ (ÍNDICE CATALÍTICO).La concentración del sustrato o los sustratos y cofactores. Esta aumenta durante el proceso de purificación de la enzima en los homogenizados biológicos y llega a ser máxima y constante cuando la enzima se halla en estado puro.Cuando el sustrato es una proteína. Esto es posible debido a que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima. Dos casos merecen aclaración especial: . . . .En casos de reacciones bimoleculares del tipo: 2 A ----. y en general de todos aquellos factores que de una u otra manera pueden modificar la actividad de la enzima.La temperatura a la cual se define la Unidad. y se expresa como el número de unidades de la enzima por miligramo de proteína. entendiéndose por unidad de una enzima a la cantidad de ella que produce cierta velocidad de reacción bajo determinadas condiciones. ACTIVIDAD ESPECÍFICA.10 REUNION DE LABORATORIO N° 02 PRACTICA N° 04 CUANTIFICACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE LAS ENZIMAS I. En cuanto a las mencionadas condiciones de medida. constituye una medida del grado de pureza de la enzima durante el proceso de purificación. una Unidad será la cantidad de enzima que cataliza la transformación de dos Q Moles de sustrato por minuto. A fin de evitar ambigüedades surgidas de la utilización de distintas unidades para expresar la cantidad de sustrato y el tiempo se ha definido por convención una unidad que puede ser aplicada a casi todas las enzimas y que permite comparar las actividades de enzimas diferentes.B + C en que dos moléculas reaccionan entre si.El pH. deben establecerse: . Entonces la actividad específica además de cuantificar la enzima. o cualquier otra molécula en la cual son atacados más de una unión. La definición recomendada por la Unión Internacional de Bioquímica a través de su comisión de enzimas es la siguiente: ³Una Unidad Internacional (UI) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol (Q mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de medida´. Es decir en los ejemplos mencionados más que el numero de moléculas completamente hidrolizados. o un polisacárido. Se denomina Actividad Específica a la cantidad de una enzima expresada en términos del contenido de proteína de la preparación.

17M y Hidróxido de bario 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: y Armar el siguiente sistema: SISTEMA DE INCUBACIÓN COMPONENTES Sacarosa 0. REACTIVOS A UTILIZAR: y Preparado enzimático (homogenizado celular de Fusarium moniliforme) y Buffer de acetato 0. (Pre ± incubación) Preparado enzimático Mezclar e incubar a 37°C.2 ml.02M pH 5.0 ml.5 ml.5 ml. 0.3 N Sulfato de Zinc 5 % Sacarosa 0.11 Actualmente la Unión Internacional de Bioquímica. La finalidad del presente trabajo experimental es cuantificar la Actividad Enzimática determinando la actividad específica.17 M Agua destilada y y TUBOS DE ENSAYO I II 0.01667 microkatales = 16.02 M pH 5. Detener la reacción empleando: Hidróxido de bario 0. DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS DE LA REACCIÓN (azúcar reductor) Se empleará los filtrados libres de proteínas del paso anterior y se determinará azúcar reductor mediante el siguiente procedimiento: . Una Unidad Internacional es igual a 0.0 y Sacarosa 0. 0. 2 minutos 0. 0. Mezclar: Separar el precipitado de proteínas filtrando o centrifugando por 10 minutos.5 ml.3 N y Sulfato de Zinc al 5 % y Solución fosfomolíbdica y solución cúprico alcalina y Reactivo de Biuret III.5 ml. 8.5 ml. 8.0 ml. 0.67 nanokatales La Actividad Específica se expresa en esta nueva unidad como Katales por kilogramo de proteína (ó Microkatales por miligramo de proteína) y la actividad molar en Katales por mol de enzima. 0. recomienda el uso de una nueva unidad EL KATAL (Kat) que se define como la cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato en producto por segundo.3 ml.0 Incubar a 37°C. 0.3 ml. Su relación con la Unidad Internacional es la siguiente: Un Katal es igual a 6 x 10 7 Unidades Internacionales. 20 minutos 0.5 ml. II.17 M Buffer acetato 0.2 ml. 0.

0 ml.. Leer a 420 nm. y y y CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Determinación de la concentración de proteínas en el preparado enzimático: (Reacción de Biuret) COMPONENTES Preparado enzimático Agua destilada Reactivo de Biuret 1.. 0. 0. de proteínas por ml..5 ml.0 ml.0 ml. de agua destilada.E. 1.12 TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES Filtrado I Filtrado II Agua destilada Solución cúprica alcalina I 0. 0...8 ml. Mezclar.. Cálculo de las Unidades (U) (U) = uM de sustrato transformado x ml...5 ml.0 ml. Cálculos de la concentración de los productos (hexosas) [(Lect. = Micromoles de Hexosas / 2 Minutos Tiempo de incubación en minutos (20 min)..045 uM/ml..5 ml. Mezclar y dejar en reposo durante 20 minutos. II ± Lect. 0. 0... el factor es. Leer a 540 nm Para el espectrofotómetro.. I ± Lect. III 1. 0. agregar 7.0 ml..5 ml.. I II 0.. y CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA U A.. CÁLCULO: (Lect. I) x Factor = mg.0 ml. II ± Lect.5 ml.. 4. del blanco) ± (Lect. 4. Factor = 0. 1. Colocar en un baño de agua hirviendo durante 8 minutos Enfriara al chorro de agua Solución fosfomolíbdica y 1. del blanco)] x Factor = uMoles de Hexosas por ml. II 0.2 ml. = mg.5 ml.5 ml.0 ml.0 ml.. de Proteínas . Mezclar y dejar en reposo por 30 minutos..

CUESTIONARIO: 1. Cuándo determina el azúcar reductor de una reacción.13 IV. para calcular la Actividad Específica? ¿Por qué se utiliza el reactivo de Biuret? ¿Por qué una enzima se cuantifica en función de su actividad enzimática y no por el peso de la proteína (enzima)? Si en dos preparados biológicos A y B la actividad específica de una determinada enzima es: (en uM/mg. 5. proteína) a. 4. . 3. 2. ¿Cómo explica la aparición de la coloración al final del sistema? ¿Por qué es necesario conocer previamente la concentración de proteínas del preparado enzimático y determinar la unidad de enzima (U). A = 1 x 10-3 y B = 1.5 x 10-4 ¿En cual de los dos preparados hay mayor cantidad de enzima? 6.

1M pH 9.0 .0 1.4 2. PH. Este patrón general.0 5.0 5.Solución de cloruro de sodio al 2 % . presentan características comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo. independientemente del tipo de reacción que catalizan. III.4 2. tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática.0 1.Solución cúprico alcalina.0 1.0 5. La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores.4 2.4 2.4 III 2. concentración de enzima.1M pH 4. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reacción enzimática sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones. REACTIVOS A UTILIZAR .0 1.0 3.4 2. pH.6 Buffer borato 0.0 1. concentración de sustrato. de tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectada por la variación que pudieran sufrir los otros. varia en forma característica para cada enzima en particular. retardando o i pidiendo m su actividad. todas las enzimas.4 1.1M pH 4. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.Solución yodada (yoduro de potasio + yodato de potasio) .25 % . II.1M pH 9.Solución de almidón al 1 % . concentración de sustrato.4 2.) Solución de almidón al 1 % Buffer acetato 0.6 . Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara de la influencia de los factores (Tiempo.0 5. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes.0 5.0 1.0 VII 1.0 5. etc).6 .05N .6 II 1.6 Buffer fosfato 0. . TIEMPO TEMPERATURA. concentración de enzima. IONES INORGÁNICOS I.1M pH 6.0 .Amilasa salival dializada al 0. temperatura. tomando como ejemplo la hidrólisis enzimática del almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reacción enzimática. como se comprenderá.0 Solución de ClNa al 2 % Agua destilada I 1.Buffer fosfato 0.Buffer acetato 0.0 5.0 5.0 1. INTRODUCCION: En general.Buffer borato 0.4 VIII 1.0 IV 1. pH.1M pH 6.0 V 1.Ácido clorhídrico 0.0 VI 1.Solución fosfomolíbdica. iones.14 PRACTICA N° 05 FACTORES FÍSICOS-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS PARTE I: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMAS. sobre la serie infinita de enzimas que se conoce.

0 0. de la siguiente manera: Cumplidos los 20 minutos de incubación sacar los tubos del baño maría y luego armar una serie paralela de tubos marcados del I al VIII.5 0.0 0. para el equilibrio de la temperatura.0 0. Cumplido los 8 minutos sacar los tubos y enfriar con agua corriente y AGREGAR: .5 0.05N 5.0 Solución iodada 0. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.5 0.0 ml. sin color) en el cuadro final. y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS .5 5.6 VII 0.5 5.5 0.El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0 °C y 4 °C durante cinco minutos.5 0.6 III 0.) Preparado enzimático (en ml.5 5. 1.6 VI 0. agregando a cada tubo marcado. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES III Incubado correspondientemente a los tubos III y V Solución cúprico alcalina 1. .5 5.6 (Computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimático fue agregado a cada tubo) y Mezclar y continuar la incubación por 20 minutos.5 Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos.El Control de los productos formados se hará en base a la capacidad reductora de estos (glucosa.5 cada uno de los tubos HCl 0.5 5.15 . según se indica y tomar el tiempo.5 0.0 0. Mezclar y poner en baño maría hirviendo por 8 minutos. I 0.) I II III IV V VI VII VIII Incubado correspondiente de 0. azul claro. 1.0 II 0.Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al baño de agua a 37 °C.0 ml.El control del sustrato no transformado se realiza por la reacción del yodo.6 IV 0.5 0.Agregar el preparado enzimático a los tubos: II al VIII. por cinco minutos. . maltosa) de la siguiente manera: Esta determinación sólo se hará en los tubos III y V del incubado a los 20 minutos.0 0.0 ml.2 VIII 0. .Realizar controles de la actividad enzimática. de acuerdo a los sistemas que a continuación se presentan: y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL . 0.5 5.6 V 0. TUBOS V 1.0 0.0 ml. del incubado de su correspondiente tubo.5 ml.5 5. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.0 0. valorando los cambios de coloración (azul oscuro.

0 ml. azul claro. 1. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática? 5.16 COMPONENTES III Solución fosfomolíbdica Agua destilada TUBOS IV 1. 5. sin color) en el cuadro final. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 4. Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de tubos valorando los cambios de coloración (azul oscuro.0 ml.0 ml. CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA POR E L SUSTRATO RESIDUAL: (cambio de color) A los 20 minutos: I II III IV V VI VII VIII CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (cambio de color) A los 20 minutos III V IV. ¿Cuáles son los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas? 2. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la presencia de un ión activador sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? . CUESTIONARIO: 1. 5.0 ml. ¿Cómo se determina el sustrato residual y los productos finales cuando se usa almidón como sustrato? 3. ¿Cómo puede demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 6.

de modo que no es tan directamente proporcional a la concentración del sustrato. PARTE II: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO. Las reacciones catalizadas por enzimas son algo diferentes. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: . En este rango de concentración de sustrato la reacción es esencialmente de orden cero con respecto al sustrato. cuando la concentración del sustrato es incrementada. y se dice que la enzima está siendo saturada con su sustrato. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD MÁXIMA Y KM.005 M Urea 0. INTRODUCCION: En las reacciones no catalizadas. Con un incremento ulterior en la concentración de sustrato. la velocidad de la reacción llega a ser esencialmente independiente de la concentración del sustrato y asintóticamente alcanza una velocidad constante.1 M pH 6. La finalidad de la presente práctica es demostrar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática y hallar la velocidad máxima y el Km de la reacción.17 REUNION DE LABORATORIO N° 03 PRACTICA N° 06 FACTORES FÍSICO-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. I.075 M Solución de ureasa cristalina en Buffer fosfato 0. Sin embargo. debido a que la velocidad de colisión entre los reactantes es proporcional a la concentración de cada uno de ellos. la velocidad de reacción siempre es proporcional a la concentración de cada uno de los reactantes.1 M pH EDTA 0. en esta zona la reacción es de orden mixto.6 Tungstato de sodio al 10 % Ácido sulfúrico 2/3 N III. la velocidad inicial se incrementa con menor intensidad. se define mejor en términos de la concentración de sustrato necesario para obtener una velocidad inicial de reacción igual a la mitad de la velocidad máxima. II. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato 0. Desde el punto de vista operacional la constante de Michaelis (Km). A baja concentración de sustrato la velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato y la reacción es de primer orden con respecto al sustrato.

5 0. Para ello se medirá el tiempo de incubación inmediatamente después de agregar la enzima.0 1.M.5 3. Datos: V = 0. empleando la concentración de amoníaco producido por ml.M¶ Ejemplo: Concentración de úrea en el tubo I. .5 ml.5 IV 1.18 COMPONENTES Buffer fosfato pH 6.0 8.0 1.5 0.0 8.5 0.  Calcular la concentración de sustrato (concentración molar) en cada tubo de incubación empleando la siguiente fórmula: V.5 0.5 IV 0.  Hallar la diferencia de cada uno de los tubos. ésta debe agregarse con intervalos de 1 a 2 minutos a cada tubo de tal manera que permita un fácil manejo de los mismos al final de cada tiempo.0 I 0.075 M Ureasa 0.5 VII 0. V¶ = 4 ml.MEZCLAR Transferir 1ml.0 0.0 1. Transcurridos los 15 minutos agregar rápidamente: COMPONENTES H2SO4 2/3 N Tungstato de sodio 10% Ureasa .5 V 1. con respecto al tubo blanco (tubo VII).0 8.0 1. Luego:  Realizar las lecturas en el espectrofotómtero a 540 nm en cada uno de los tubos.0 2. Para ello multiplicar la diferencia anterior por el factor de calibración empleado (1660) = µmoles de NH3 /ml.5 MEZCLAR y dejar en reposo por cinco minutos.0 1.5 2.0 0.0 0.5 0.0 III 1.5 VII 0.0 0.5 0.0 8.0 VII 1.5 II 0.  Calcular la velocidad de reacción para cada uno de los sistemas enzimáticos preparados.0 - Pre incubar a 37 °C durante cinco minutos Incubar cada uno de los tubos exactamente 15 minutos 37°C ES FUNDAMENTAL: Medir exactamente el tiempo de incubación para cada tubo.0 8. = V¶.0 8.5 0.0 IV 1.0 VI 1.0 V 1. de cada uno de los siguientes incubados a tubos de ensayo de una segunda serie siguiendo el siguiente esquema: COMPONENTES Del incubado anterior Agua destilada Reactivo de Nessler I 1.6 Urea 0.0 1.5 0.0 1.5 V 0.5 II 2.5 0.0 8. dividido entre el tiempo de incubación (15 minutos).05 % I 3.5 III 0.5 VI 0.  Encontrar la concentración de amoníaco producido por ml.5 0.5 VI 0.5 3.0 1.5 0.5 III 2.5 1.0 II 1.

 Utilizando papel milimetrado.19 M = 0. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué importancia tien el Km? 5.0093 M 4ml. ¿Para que sirve la ecuación de Lineweaver? 6.075 M M¶ = ? M¶ = 0. ¿Qué es el Km? 4. aplicar la ecuación de Lineweaver Burk a los resultados obtenidos.  Construir una gráfica en el sistema de coordenadas teniendo como parámetros : La concentración del sustrato (abscisa) en función de la velocidad de la reacción (ordenada).075 M = 0. En la curva trazada calcular la Km e indicar la Vmax. ¿Qué métodos conoce para determinar el Km? . IV.5 ml x 0. Calcular en la gráfica obtenida la velocidad máxima y la Km.  Anotar los resultados de cada uno de los tubos (concentración del sustrato y velocidad de la reacción). ¿Qué establece la ecuación de Micahelis Menten? 3. Construir una gráfica en un sistema de coordenadas teniendo como parámetros la inversa de la concentración del sustrato (1/S) (abscisas) en función de la inversa de la velocidad inicial de la reacción (ordenada). ¿Cómo afecta la concentración del sustrato la velocidad de la reacción? 2.

por que efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazarse mutuamente de la enzima. NO y CO. si la enzima continúa inhibida después de la reacción del inhibidor. En la inhibición competitiva se dice que un inhibidor obra por competencia si su acción inhibidora se revierte al aumentar la concentración de sustrato. De allí el nombre de competitivo. Quedando por demostrar si este tipo de inhibición es reversible o no. Respecto de los inhibidores reversibles es importante destacar que la interacción entre inhibidor y enzima se traduce en varios tipos de inhibición perfectamente diferenciados experimentalmente. Estas sustancias se conocen como los inhibidores enzimáticos. cloruro de mercurio. y la enzima recupera su actividad original. entonces la inhibición será de tipo no competitiva. común en sistemas más complejos en el que el inhibidor se une exclusivamente al complejo enzima -sustrato para dar un complejo enzimasustrato-inhibidor incapaz de transformarse en otro producto. A la inversa. La inhibición no competitiva se caracteriza por que no puede ser revertida por un aumento de la concentración del sustrato ya que este último no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. Si la inhibición no se revierte al agregar sustrato (succinato). Un ejemplo clásico. Experimentalmente se puede identificar si un inhibidor cualquiera es o no competitivo. EDTA. Por ejemplo. inhiben metaloenzimas por enlazarse al ión metálico. de este tipo de inhibición es el que presenta la succinato deshidrogenasa que tiene como sustrato el succinato y puede ser inhibido por sustancias estructuralmente parecidas a dicho ácido como son el malato. Excluyéndose de ésta categoría aquellos agentes como los ácidos fuertes. pudiéndose formar entonces un complejo ternario enzima-sustrato-inhibidor. los cuale enlazan iones metálicos necesarios para la actividad enzimática. Ejemplos de este tipo de inhibición son los causados por el N-etilamida. Los inhibidores enzimáticos se clasifican en reversibles e irreversibles. el exceso de inhibidor. El inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual se debería unir el sustrato impidiendo por lo tanto la formación del complejo activoenzima-sustrato. Por esta razón la unión de este último con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor. Si después de hacer actuar el inhidor sobre la enzima. si el sistema deshidrogenasa succínica+succinato. La inhibición acompetitiva. Si el efecto inhibidor se revierte al incrementar la concentración del sustrato (succinato) entonces se podrá afirmar que el inhibidor es de tipo competitivo. es otro tipo de inhibición reversible. ácido oxálico y glutarato. INTRODUCCION: Existen sustancias cuya acción sobre una enzima es la disminución de su actividad. a las que se pueden agregar las inhibiciones reversibles acompetitivas. Aquí el inhibidor se une a la enzima en otro sitio que no es aquel por el cual se une al sustrato. alcoholes y calor que producen alteraciones en la estructura espacial de la molécula proteica que conduce a la desnaturalización. se dice que el inhibidor es irreversible. se agrega malonato como inhibidor. Los dos tipos más comunes son: las inhibiciones reversibles competitivas y las inhibiciones reversibles no competitivas. se dice que el inhibidor es reversible. . que es cataliticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reacción y complejo-enzima-inhibidor. que se pueden distinguir en base a un criterio experimental.20 REUNION DE LABORATORIO N° 04 PRACTICA N° 07 ACCION DE LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS Y NO COMPETITIVOS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. eliminamos por algún método.

0 1.2 ± 6 Diclorofenolindofenol . ¿Por qué el malonato es inhibidor competitivo? 2. IV. III.0 V 1.5 M Cloruro de mercurio 0.5 IV 0.21 La siguiente práctica tiene por finalidad demostrar en el sistema enzimático Deshidrogenasa succínica+succinato: que el malonato y el cloruro mercúrico producen inhibición de este sistema. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.1M pH 7.Succinato de sodio 0.5 1.2 0.1 M Succinato de sodio 0.1 M .5 0.3 0.2 Succinato de sodio 0.5 - IV.3 0.Buffer fosfato 0. II 0.0 1.5 1.5 M Buffer fosfato 0.1 M.0 II 1. REACTIVOS A UTILIZAR .2 Anotar y luego agregar a los tubos II.0 1.Malonato de sodio 0. pH 7.0 0.2 . que el malonato es un inhibidor competitivo y que el cloruro mercúrico es un inhibidor no competitivo. ¿Por qué el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo? 3.1M pH 7. Observar los resultados en cada uno de los tubos (cambio de color).5 1. Dejar en reposo 15 minutos a la temperatura ambiente y luego observar los resultados y anotar. COMPONENTES Succinato de sodio 0.0 1.Homogenizado hepático 10 % III.0 1.Succinato de sodio 0.0 Dejar en reposo por 30 minutos a la temperatura ambiente.2 1.0 IV 1. II.1 M 2 ± 6 diclorofenolindofenol Homogenizado 10 % I 2.2 0.0 1.5 III 0.8 0. CUESTIONARIO: 1.Cloruro de mercurio .0 III 1.1 M . ¿Cómo podría usted demostrar que la inhibición producida por el cloruro mercúrico es o no reversible? .1 M Malonato de sodio 0.5 M .

Señale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibición no competitiva reversible. De por los menos dos semejanzas entre la inhibición no competitiva reversible e inhibición alostérica.22 4. De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibición competitiva en el sistema Deshidrogenasa succínica ± succinato. además del malonato utilizado en el presente experimento. sin considerar el cloruro de mercurio. ¿Qué diferencias puede usted establecer entre la inhibición competitiva y la inhibición alostérica? 7. 6. 5. .

Si se administra un inhibidor que impide el flujo de electrones en algún punto de esta porción de la cadena. la azida. así por ejemplo el 26 diclorofenolindofenol y el azul de metileno son sustancias indicadoras de color azul en estado oxidado. De esta manera se puede verificar si la cadena comprendida entre el citocromo C y el oxígeno. es otro indicador que actúa como sustrato. inclusive de la cadena (región que incluye el sitio I). Existen diversas sustancias que actúan como inhibidores de la cadena respiratoria.23 PRACTICA N° 08 EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE ÓXIDO-REDUCCIÓN I. A estos se les denomina inhibidores del sitio III. Este sistema está localizado en la membrana mitocondrial interna y se caracteriza por la cohesión física con la cual sus componentes se encuentran unidos entre si e integrados en la membrana. respectivamente. se utilizan sustancias indicadoras artificiales que cambian de color cuando se oxidan o se reducen. Por su acción cercana en el primer sitio de la desfosforilación se les suele denominar inhibidores del sitio I. Como hay flujo de electrones en la cadena. bloqueando el transporte de electrones entre la flavina y la ubiquinona. el citocromo C actuará como primer aceptor de electrones que provienen de la p-fenilendiamina. entonces podemos deducir que el inhibidor actúa en algún sitio anterior al citocromo o de la cadena. que al reducirse (recibir electrones) se decoloran. Un primer grupo de inhibidores actúa sobre la NADH-deshidrogenasa. actúan en las regiones cercanas al sitio I. es decir que es capaz de ceder electrones. Si al administrar un inhibidor de la cadena. Un segundo grupo de sustancias actúan bloqueando la transf rencia de electrones e entre los citocromos b y c. En la cadena REDOX. sitio II y sitio III. etc. átomos de hidrógeno o electrones. Los más representativos de este grupo son la rotenona y la piericidina. la p-fenilendiamina no se oxidará (no cambia de color). provenientes de la deshidrogenación de los sustratos del ciclo de Krebbs y otros metabolitos son transferidos al oxígeno por un sistema multienzimático denominado cadena respiratoria. es o no permeable al flujo de electrones que provienen del indicador. Un grupo de inhibidores actúa sobre el Hemo a3 de la citocromo oxidasa impidiendo su interacción con el oxígeno. pero si el indicador se decolora. . comprenden el cianuro. etc. Para poder determinar la permeabilidad de la cadena de oxidoreducción al paso o no de electrones. Los inhibidores más comúnmente usados pueden reunirse en tres grupos principales según el sitio de la cadena respiratoria donde actúan. los detergentes. se les denomina inhibidores del sitio II. Este mismo sistema multienzimático es también conocido como cadena de transporte de electrones. éste impide que el 2-6 diclorofenolindofenol se reduzca (se decolore). inhibidores similares son la hidroxiquinolina N-óxido. entonces podemos deducir que el sitio de inhibición estará en alguín sitio posterior a la CoQ inclusive. ésta cede sus electrones a los indicadores entre la FMN y la CoQ. Inhibidores de localización son: el amital. el BAL y barbiturato de sódio. algunos anestésicos volátiles como el halotano. denominación que pone énfasis en que las oxidaciones reducciones son fenómenos caracterizados por la pérdida o ganancia de electrones. los esteroides. el monóxido de carbono. barbital sódico y azida de sodio. El ejemplo clásico de este grupo es la antimicina. INTRODUCCION: Los equivalentes de reducción. mediante el uso de indicadores conocidos como 2 ± 6 diclorofenolindofenol y p ± fenilendiamina. Si el inhibidor no impide la oxidación del indicador. quiere decir que dicho inhibidor estará actuando en alguna región anterior a la FMN. Cuando se oxida (cede electrones) cambia de color (a marrón oscuro). La p-fenilendiamina. Si se administra un inhibidor que no impide la oxidación de la p-fenilendiamina y que tampoco impide la reducción del 2-6 diclorofenolindofenol. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que los inhibidores: rotenona. entonces podemos deducir que el mencionado inhibidor actuará en algún sitio comprendido entre la CoQ y el citocromo B inclusive (cercano al sitio II de la cadena).

5 0. barbital sódico y azida de sodio.5 0.02 % Malato 0.5 0.2 0.0 . Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos).2 III 1.4 2.5 0. verificar el efecto de los inhibidores: rotenona.5 0.5 0.4 Azida de sodio Barbiturato de sodio 0.0 0.5 V 0.0 II 1.0 0.0 0.5 IV 0.4 2.0 0.5 0.5 0.5 0.1M pH 7. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) En el sistema Deshidrogenasa málica + malato + cadena rédox mitocondrial.5 0.1M pH 7. pH: 7.5 1.5 reposo a temperatura minutos. dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.) Buffer fosfato 0.5 1. 6-diclorofenol indofenol 0.) Buffer fosfato de sodio 0.1M Barbiturato de sodio 0. I 2.6-diclorofenolindofenol 0. barbital sódico y azida de sodio.1M.1M Rotenona 0.1M Barbiturato de sodio Azida de sodio Homogenizado mitocondrial 10% I 1. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0.5 1.1M Rotenona 0.5 VI 0.2 1. ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (en ml.5 0.0 IV 1.2 0. dejar en 10% ambiente por 20 0.0 V 1.02 % p-fenilendiamina 1% Malato de sodio 0.5 0.0 0.5 II 1.0 1.1M Rotenona 0. TUBOS COMPONENTES (en ml.5 Mezclar.2 0.5 1.5 0. verificar el efecto de los inhibidores rotenona.2 0.24 II.0 0. En el sistema p±fenilendiamina + cadena rédox mitocondrial.1M Azida de sodio Fracción mitocondrial 10% (hígado de rata) III.1M P±fenilendiamina 1% Homogenizado de mitocondrias Mezclar.5 III 1.5 0.

¿Si utiliza el indicador p±fenilendiamina en un sistema con cadena respiratoria. 5. Indique usted los sustratos y enzimas que intervienen en los sistemas realizados en la práctica. que cambios observaría con la rotenona. la acción de los inhibidores e indicadores utilizados en el experimento. . Grafique usted en una cadena de óxido reducción biológica. ¿Si utiliza el indicador rédox 2. IV. que cambios observaría con la rotenona.6-diclorofenolindofenol en un sistema con cadena respiratoria. barbiturato de sodio y azida de sodio? 3. barbiturato de sodio y azida de sodio? 4.25 Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos). CUESTIONARIO: 1. ¿Qué inhibidores de la cadena de óxido reducción conoce y a qué nivel actúan? 2.

ácidos grasos. se emplea una centrífuga refrigerada. Todo debe trabajarse entre 0 y 4ºC. hallándolas de modo fundamental en una subestructura celular en donde la energía derivada de las oxidaciones es "capturada" en la forma del intermediario macroérgico ATP.26 PRACTICA N° 09 DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE ÓXIDOREDUCCIÓN I.4 2. El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocándolo en tubos de polietileno.154 M III. - - . El sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca en un beaker de 100ml. El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15 minutos en la centrífuga refrigerada.6 diclorofenilindofenol y p .154 M.6-diclorofenolindofenol 0. Fracción microsomal soluble del homogenizado. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Fraccionamiento Celular Cada grupo recibirá una rata albina (Rattus rattus var.1M pH: 7. El sobrenadante es separado en un beaker de 500ml. previa calibración en la balanza. El animal será sacrificado.25 M Fracción nuclear del homogenizado.reducción tienen una distribución característica intracelularmente. fosfolípidos. constituyendo la fracción microsomal con el citosol.fenilendiamina y los componentes celulares de un homogeneizado de hígado de rata obtenidos por centrifugación dif rencial mediante el método de e Schreider y col. Homogenizado al 10%: se pesa 10gr de hígado y se corta en fragmentos pequeños y se coloca en el homogenizador potter y se le agrega solución de KCl 0. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0. Fracción mitocondrial del homogenizado. KCl 0. INTRODUCCION: Los carbohidratos. Estos sistemas están constituidos por proteínas. Se separa el sobrenadante en un beaker. albicans). las enzimas que intervienen en estos pr cesos se encuentran o clasificadas en diversos grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimológica. grupos prostéticos y átomos metálicos. La finalidad del presente trabajo es objetivizar la distribución intracelular de las enzimas de óxido . inmediatamente se hara un corte longitudinal en el abdomen procediendo a extraer el hígado. El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fracción mitocondrial. Las enzimas de óxido . aminoácidos y algunas otras sustancias sufren oxidaciones en el organismo mediante sistemas enzimáticos simples o complejos.02 % Succinato 0.reducción usando los indicadores redox 2 . Se hace presión manualmente con el embolo girando hacia el fondo. Se coloca el hígado en un petri se elimina la cápsula del hígado y otros tejidos periféricos.1M p±fenilendiamina 1% Homogenizado total de hígado de rata en sucrosa 0. II. De acuerdo a su estructura y función.

0 0.2 0.5 2 1. pH 7.5 1. Armar otro sistema.5 III 0.6-diclorofenolindofenol y cómo actúa en la cadena respiratoria? 2.5 - Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente. ¿Qué es el 2. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador.1M Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal -soluble Homogenizado total I 1. pH 7.0 0. ¿Qué es el p-fenilendiamina y cómo actúa en la cadena respiratoria? 3. para interpretar los resultados.5 1 1.4 2 ± 6 diclorofenolindofenol Succinato de sodio 0. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador.5 3 1.2 0.5 IV 0.5 0.2 II 0.5 1. CUESTIONARIO: 1.5 V 0.27 Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Buffer fosfato 0.0 0.5 1.1M.0 0.0 0.5 4 1.0 0.5 1. empleando: COMPONENTES Buffer fosfato 0. 4. ¿Qué es un homogenizado de hígado y cómo se obtienen las fracciones celulares por centrifugación diferencial? 5.2 0.0 0. ¿En que fracciones celulares se encuentran las enzimas de óxido ± reducción? 6.0 0.0 0.5 Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente. Grafique usted en una cadena de óxido ± reducción biológica la acción de los indicadores rédox 2.1M. Haga un esquema de la centrifugación diferencial .5 0.5 0.6 diclorofenolindofenol y p±fenilendiamina.5 0.5 5 1.2 0.4 P ± fenilendiamina 1% (sustrato + indicador) Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal ±soluble Homogenizado total 0.0 1. para interpretar los resultados. IV.

mide la cantidad de almidón hidrolizado y por ende la actividad de amilasa de la muestra. La amilasa puede ser detectada en niños desde 1 a 2 meses de edad y los valores son más bajos que en el adulto normal. Para la determinación de amilasa usamos el método de Caraway. las elevaciones son (con excepción de los niveles obtenidos después de la administración de opiáceos) menos de 500 unidades. Si liberan alfa o beta maltosa. la amilisa sérica se altera. La amilasa es un poliglucósido de configuración lineal de unidades de glucosa unidos por enlace alfa 1-4 glucosídicos. amilasa y amilopectina producen sólo B-glucosa por hidrólisis. El origen de la amilasa sérica humana incluye al páncreas y glándulas salivales. En el suero humano. úlcera duodenal o gástrica penetrante o perforada. peritonitis. Ambas. Después de la administración de morfina en normales se incrementa la amilasa sérica. Los valores normales de amilasa por el método de Caraway calibrado en unidades Somogy es de 60 a 180. La amilasa comprende a sólo el 20% del almidón y es soluble en agua. . después de ruptura esplénica. morfina. La amilasa salival y pancreática humana esta dentro del grupo de las primeras. Entre 2 ± 12 horas después de producida la pancreatitis aguda. Otras fuentes incluyen el hígado. En los casos señalados se ha propuesto la prueba funcional de la amilasa sérica después de la administración de secretina y morfina. después de la administración secretina. no es probable el diagnóstico de pancreatitis aguda. La alfa amilasa actúa rompiendo los enlaces alfa 1-4 glucosídicos en la parte central de la amilasa formando una mixtura de pequeñas dextrinas + maltosa. músculo estriado. difiere de la amilasa porque contiene además enlaces alfa 1-6 glucosídicos frecuentemente ramificados. La elevación puede ocurrir en otras condiciones que incluyen enfermedad de las glándulas salivales (pancreatitis). enfermedad séptica aguda del coledoco. En otros. trombosis mesentérica. Para la mayor parte. En pancreatitis se llega hasta 2000 a 3000 unidades. obstrucción intestinal. El presente experimento tiene por finalidad determinar la amilasa sérica en personas normales y/o con alteraciones patológicas especialmente del pancreas. edema y pancreatitis están presentes indudablemente. También ha sido informado en leche y en el semen humano. trompa de Falopio y tejido adiposo. en pacientes con insuficiencias pancreática. Muy raramente permanece elevada 4-6 días. Es posible encontrar valores más altos. En algunas de estas condiciones. uremia después de la administración de codeína. después de colangiografía. INTRODUCCION: La amilasa es una enzima que hidroliza el almidón. Si dentro de 24 horas no se eleva. el resto es una fracción inosoluble llamada amilopectina. Se ha reportado incremento después de la ingestión de alcohol. diuréticos tiazídicos. la amilasa se encuentra grandemente incrementada y retorna a los valores normales lentamente. las cuales explicarían probablemente menos del 25% de la actividad sérica normal.28 PRACTICA N° 10 DETERMINACION DE AMILASA SERICA I. así como en la orina existe actividad amilásica. con frecuencia 2-3 días después. En obstrucción de los conductos puede elevarse. se les clasifica en alfa y beta amilasa. cirrosis. en el que la cantidad de almidón y tiempo de incubación son ajustados de manera que sólo una porción de almidón es hidrolizado cuando la reacci n ó es parada por la adición de yodo. la explicación no es clara. pero al año de edad la actividad es igual a la del adulto. La diferencia entre la cantidad de color azul formado en la muestra incubada y el blanco incubado por la adición de suero después de la incubación. En la bilis no hay actividad. Bajos niveles pueden encontrarse en pancreatitia crónica y en carcinoma pancreático cuando el daño es extenso y hay insuficiencia de las acinos glandulares. encefalitis viral. carcinoma bronconígeno y en neumonía. En normales.

pH 7. REACTIVOS A UTILIZAR: y Sustrato de almidón Bufferado.5 minutos exactamente 800 = Unidades de amilada por 100 ml (Se requiere un blanco por cada muestra de suero. espectrofotómetro a Incubar a 37°C durante cinco minutos ambos frascos Mezclar e incubar a 37°C durante 7.0 ml. en función de la actividad enzimática? ¿Cómo explica usted el diferente comportamiento de la amilasa hepática y pancreática sometidas a electroforesis? ¿Por qué la concentración de amilasa sérica es menor durante los primeros meses de vida lactante? . Leer 660 nm.0 ml. CUESTIONARIO: 1.) I PROBLEMA Sustrato de almidón Bufferado Retirar los frascos y agregar suero Retirar los frascos y agregar suero Agua destilada Solución iodada de trabajo.0 : y Solución Stock de iodo : y Solución iodada de trabajo: III. 2. 5. debido a que las proteínas séricas disminuyen la cantidad de color producido por el complejo yodo ± almidón y este podría ser diferente). IV. Mezclar bien. 3. en CÁLCULO Absorbancia del _ Absorbancia del blanco problema _______________________________________ X Absorbancia del blanco 5. 4. 35 ml. De qué manera el ión cloruro activa a la amilasa ¿Qué semejanza o diferencia puede establecer usted entre amilasa dializada y no dializada.1 ml.0 ml.1 ml. 5. 35 ml. 0.29 II. II BLANCO 5. 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): Armar el siguiente sistema: (Utilizar dos frascos volumétricos ± Erlenmeyer de 50 ml.0 ml.

30 .

Por todo esto. A su vez. posiblemente porque se une a la misma proteína transportadora que lleva el sodio. La entrada de la glucosa en estas células está supeditada a que. con el método de la glucosa oxidasa la concentración varía entre 70 ± 110 mg/dl. Por otra parte. La glucosa en sangre. Este es un caso interesante en que un sistema de transporte a través de la membrana favorecería a otro. por la bomba de sodio y potasio. En el caso del hígado. Los valores normales de glucosa en sangre son variables de acuerdo al método utiizado. producción endógena de glucosa así como la utilización y excreción de la misma. I. y de origen endógeno. En casi todos los demás tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las células por simple difusión. Este mecanismo requiere ATP como fuente de energía. Diversos factores que inciden sobre la absorción. y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentración de sodio en fluído extracelular. proviene de dos orígenes: de origen exógeno de los alimentos. Se cree que está íntimamente ligado al transporte de sodio. en particular en el tejido adiposo. contribuyen a mantener constante la concentración de glucosa en sangre. volvería a salir de la célula. la constante disponibilidad de este sustrato a los tejidos. El conocimiento de la glicemia es importante no sólo porque permite tener una idea integral del mecanismo de homeostasis metabólica existente. el organismo dispone de una compleja maquinaria metabólica que permite asegurar la constancia de la concentración de glucosa en la sangre y. por ello. siendo el hepatocito permeable para este metabolito. En este caso la glucosa entra en la célula. Según el método l de Folin Wu. el sodio. por lo tanto la concentración de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo. se llama cotransporte. el corazón y el músculo esquelético. con ella.31 II UNIDAD METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS REUNION DE LABORATORIO N° 05 PRACTICA N° 11 DEMOSTRACION DE LA DIGESTION Y ABSORCION DE LOS CARBOHIDRATOS: GLICEMIA PRE Y POST-PRANDIAL. sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento. sino que lo hace por un mecanismo de difusión controlada. El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a través de las células de la mucosa intestinal no es muy conocido. En el cerebro y los glóbulos rojos es la única fuente de energía. el transporte de glucosa al interior de las células es por difusión pasiva. . al salir del Na+ mantenga alta concentración en el líquido extracelular. Varía entre los 80 ± 120 mg%. hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina. Este proceso. que proviene del hígado por glucogenólisis. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea es una de las fuentes de energía más importantes en el organismo y en algunos tejidos altamente especializados.

Reactivo 4. En esos momentos.000 partes con agua destilada. 50 partes de Reactivo 4. Colocar las muestras en tubos de ensayo. y Dpost. se extraerán 5 ml. IV. 50 partes de Reactivo Fenol y llevar a 1. . --------20 ul 2 ml Incubar todos los tubos 10 minutos en baño de agua a 37 ºC Leer en Espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco.000 U/ml) y Peróxidasa (120 U/ml). Rotular y fechar. y con aguja N° 20. Restar a D el Blanco (B) y el resultado se multiplica por f. tanto en personas normales como en casos patológicos. La segunda: Esta muestra se tomará después de una hora. Agregar 3 partes de enzimas GOD/POD previamente homogenizadas. Antes de multiplicar D x f. ----20 ul ----2 ml Dpost.Preparación del Reactivo de trabajo: 500 partes de agua destilada. Cálculo de los resultados : Glucosa (g/l) = D x f donde 1.00 g/l f = ----------- S y D = Dpre. CUESTIONARIO: 1. S (Standard).Estándar: Solución de glucosa 1 g/l .Reactivo Fenol: Solución de Fenol 55 mmol/l.GOD/POD: Solución de glucosa oxidasa (1. . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES : Se tomarán dos muestras de sangre : La primera: La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra. después de la ingesta alimenticia. se deja reposar 10 minutos. ¿Actualmente. con jeringa hipodérmica de 10 ml. Dpre.AF: Solución de 4 ± aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0. Mezclar por inversión sin agitar. . Separar el suero. La determinación de la glicemia se realizará por el método Enzimático de la glucosa oxidasa. III. colocar: COMPONENTES Standard Muestra (suero preprandial) Muestra (suero postprandial) Reactivo de trabajo B ------------2 ml S 20 ul --------2 ml Dpre. . cuantificando la glicemia pre y postprandial. de sangre de la flexura del codo. luego se centrifuga a 3000 RPM por 10 minutos. que usted puede encontrar por ejemplo en una intolerancia a la glucosa.32 La finalidad de la siguiente práctica es demostrar la digestión y absorción de la glucosa. Utilizar 4 tubos de ensayo: B (Blanco). REACTIVOS A UTILIZAR . cuál es el rango considerado normal para la glicemia basal? Explique las variaciones en los valores.92 mol/l.AF. por el método de Glucosa oxidasa. como máximo. (Desconocido post prandial). II. (Desconocido preprandial) y Dpost.

3.6 son estables.H2S04 concentrado. relacionados con la glicemia.5 --II --0. La acción de la beta amilasa también rinde una dextrina límite. El glucógeno es también fácilmente hidrolizable por alfa y beta amilasa para rendir glucosa y maltosa respectivamente. glucógeno sintetasa y algunas otras que regulan la síntesis y degradación. pero las concentraciones varían en los diferentes tejidos correspondiendo las concentraciones más altas del hígado y al músculo esquelético. ¿Conoce otros métodos para determinar la glicemia? Explique su fundamento 4. . EXTRACCION DE GLUCOGENO HEPATICO (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Homogenizado de hígado en ayunas Homogenizado de hígado post prandial I 0. de hígado y homogenizar con agua destilada. ¿Cuál son los criterios bioquímicos. El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa de fácil disponibilidad. para el diagnóstico de diabetes mellitus? 5. REACTIVOS A UTILIZAR .6 los cuales se presentan con frecuencia aproximada de uno por cada 10 residuos.33 2. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.4 y alfa 1. INTRODUCCION: El glucógeno está presente en el citosol en forma de gránulos los que contienen las enzimas glucógeno fosforilasa. . El glucógeno puede ser aislado de los tejidos por digestión con soluciones de hidróxido de potasio caliente en los cuales los enlaces no reductores alfa 1. En el hígado el glucógeno se incrementa después de la ingesta de alimentos (período post prandial) llegando a los límites máximos cuando la dieta es abundante y/o en base a carbohidratos.Fenol al 80 % .) III. .Alcohol absoluto. En cambio el glucógeno post prandial es debido a que la glucogénesis se incrementa cuando las concentraciones en sangre alcanzan valores de 150 mg/100 ml ó más.Homogenizado de hígado de rata al 10 % (pesar 10 g. ¿Qué variaciones fisiológicas de glicemia puede usted señalar? PRACTICA N° 12 INFLUENCIA DE LA DIETA EN LA FORMACIÓN Y ALMACENAMIENTO DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO I.Na2S04 solución saturada. La mayoría de los residuos de glucosa en el glucógeno están ligados por enlaces glucosídicos alfa 1. Se encuentra glucógeno o se puede sintetizar en cualquier célula del organismo. La finalidad de la siguiente práctica es cuantificar el glucógeno en ayunas y después de la uingesta de alimentos y evaluar los valores encontrados relacionados con los factores que determinan sus síntesis y degradación II.5 .4 y las ramificaciones se forman por enlaces glucosidicos alfa 1.KOH al 60 % . ¿Cómo esperaría encontrar los valores de la glicemia dosada en la sangre venosa y en la sangre arterial? Fundamente las variaciones que se pueden encontrar. lugares principales de almacenamiento.

¿Qué relaciones metabólicas puede usted establecer entre los valores de glucógeno obtenidos en ambas muestras de hígado de rata. CUANTIFICACION POR METODO COLORIMETRO DEL GLUCOGENO EXTRAIDO Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml)) I II BLANCO Muestra del tubo I del Sistema anterior««««««« 1. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones de ayuno? Dé usted las razones metabólicas que expliquen su resultado.0 5. 0.1 Mezclar. del Sistema anterior« -1. Centrifugar a 3500 RPM por 10 min.0 --Muestra del tubo II.0 5.5 Calentar los tubos en baño maría a 100 C por 10 min. Leer en el fotocolorímetro con filtro verde. CUESTIONARIO: 1. 2.34 KOH al 60 % 0.5 0.0 5. Blanco) x Factor IV. Colocar los tubos en agua helada durante 5 min.1 0. ¿Porqué mecanismo metabólico el glucógeno incrementa cuando la concentración de glucosa en sangre es mayor de 150 mg/dl? 5.1 0. Reposo por una hora. motivo del experimento? 4.0 Fenol al 80 % 0. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones post prandial? 3.I ± Lect. gota a gotaen el centro de c/tubo 5.0 5. Explique los mecanismos que regulan la homeostasis de la glucosa y el rol del glucógeno durante el ayuno prolongado.0 2. .1 Mezclar. 540 n m. Eliminar el sobrenadante y colocar boca a bajo los tubos sobre papel de filtro por 5 minutos.0 Disolver el precipitado por agitación. Alcohol al 98 % 5.1 0.0 Mezclar y dejar en el baño de agua helada durante 5 minutos más.0 1. Agregar agua destilada 5.0 -Agua destilada 1. y sin retirar los tubos del baño helado: Agregar H2S04 cc. CALCULOS: Factor Espectrofotómetro = 7 g % de glucógeno = (Lec.0 Na 2SO4 solución saturada.

Jeringas hipodérmicas de 1 cc.Solución de insulina cristalizada (Lilly): I Unidad por ml. La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea proviene de: glucógeno hepático. una excesiva excreción de glucosa por la orina (glucosuria) y un reducido nivel de glucógeno en el hígado. El efecto más importante de una deficiencia insulínica es el de un nivel sanguíneo de glucosa elevado (hiperglicemia). otros carbohidratos y de glucosa absorbida por el intestino. Se explica así que la falta de insulina determina una hiperglicemia que es el signo fundamental del cuadro denominado Diabetes. aminoácidos. La glicemia se eleva después de la ingestión de un alimento rico en hidratos de carbono para luego descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas después de la ingestión vuelve al nivel de ayunas. Siendo en la sangre arterial mayor que en la venosa. La insulina también favorece la conversión de los hidratos de carbono en ácidos grasos y por otro lado inhibe la gluconeogénesis a partir de los aminoácidos. . II. la glicemia es muy constante. .Conejos adultos de más de 2 kg. en ayunas. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de administración de insulina. La administración de insulina va seguida de la glicemia (hipoglicemia) cuya magnitud depende de la dosis administrada. La secreción de insulina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia. se produce más insulina que tiende a aminorarla. el efecto se debe fundamentalmente a que la hormona favorece la formación de glucógeno en el hígado y en el músculo. lipogénesis y otras semejantes. . pues es utilizada por todas las células para producir energía y por algunas células para funciones más especializadas por ejemplo glucogénesis. de manera que cada vez se eleva la glicemia. . REACTIVOS A UTILIZAR . En condiciones normales. Los mecanismos reguladores de la concentración de glucosa son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los primeros actúan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las glándulas de secreción interna. a la vez que acelera la oxidación de glucosa en diferentes tejidos. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas. La insulina ejerce efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otros nutrientes. Esta hormona es producida por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas y es secretado en respuesta directa al incremento de glucosa en la sangre. cuya sensibilidad está regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipófisis por el otro. de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la producción y la utilización de la glucosa sanguínea.35 REUNION DE LABORATORIO N° 06 PRACTICA N° 13 REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA ACCION DE LA HORMONA INSULINA I.Glucómetro.

4. La que servirá para establecer los valores basales de glicemia. Explique brevemente la regulación de la glicemia. de la tasa de llegada e índice de salida de la glucosa de la sangre. EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE INSULINA. como resultado. y y Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de insulina a inyectar. 30 y 60 minutos después de inyectada la insulina. Dosis de la solución de insulina cristalina (I Unidad por ml) inyectar I Unidad por Kilogramo de peso corporal.  Luego extraer muestras de sangre a los 15 . Anotar los resultados en relación al tiempo. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. Explique cómo y porqué se producen los signos y síntomas del cuadro clínico de hipoglicemia. Hacer una gráfica de glicemia vs tiempo       IV. CUESTIONARIO: 1.  Extraer una primera muestra de sangre del pabellón auricular del conejo. lo que hace un total de tres muestras en una hora. 3. que facilita la medida de la dosis. 2.36 III. Utilizar una jeringa hipodérmica de 1 ml. Explique el mecanismo de acción de la insulina en la homeostasis de la glucosa. Explique la naturaleza química y las acciones biológicas de la insulina. . ¿Cuáles son las hormonas contrarreguladoras y su mecanismo de acción? 5.  Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de insulina. en términos generales.

ello se debe a que favorece la conversión del glucógeno en glucosa (glucogenólisis) en el hígado. El efecto glucogenolítico de la adrenalina es debido a que activa a la fosforilasa. si l aparece hipoglicemia se segrega más adrenalina y glucagón que aceleran la regulación que espontáneamente debe realizar el hígado.Jeringas hipodérmicas de 1 cc. . 3. tomando las variaciones en relación al tiempo. EXTRACCION DE ADRENALINA. ¿Cuál es el mecanismo de acción hormonal de la adrenalina a nivel de sus órganos blanco? Explique de manera suscinta el efecto de la adrenalina sobre la glicemia. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de la administración de adrenalina. Utilizar una jeringa hipodérmica de tuberculina que facilita la medida de la dosis. con especial referencia al metabolismo de los carbohidratos.Solución de adrenalina 0. 30 y 60 minutos después de inyectada la adrenalina.025 mg por cada kilogramo de peso corporal que corresponde a 0. III. La secreción de adrenalina parece estar condicionada en forma importante por el nive de glicemia. REACTIVOS A UTILIZAR . ¿Cuál es el efecto metabólico de la adrenalina sobre el hígado y sobre el tejido muscular y que efecto produce sobre la glicemia? . Extraer una primera muestra de sangre.25 ml de la solución a utilizar por kg de peso. II. 4. Servirá para establecer los valores basales de glicemia. sometidos a ayuno de 8 a 12 horas. 3. Explique la naturaleza química y las acciones fisiológicas de la adrenalina. además de actuar en el músculo. por la ausencia en este de la glucosa 6.fosfatasa. INTRODUCCION: La adrenalina. Con cada una de las citadas muestras realizar los dosajes de glucosa según el método de Glucocinta 5. . del pabellón auricular del conejo. CUESTIONARIO: 1. ACTIVIDADES INTRUCCIONALES: Procedimiento  Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de adrenalina a inyectar. hormona secretada por la médula suprarrenal. lo que hace un total de tres muestras en una hora.1 mg/ml) inyectar 0.1 mg por ml. tiene acción hiperglicemiante. 2. 4. la glucogenólisis se realiza con la formación de lactato el que va ha contribuir directamente a la formación de glucosa y glucógeno en la célula hepática por los mecanismos gluconeogenéticos. Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de adrenalina según el peso del animal. construir una gráfica.Glucómetro. Anotar los resultados en relación al tiempo. 2.  Dosis de la solución de adrenalina (0.Conejos adultos de más de 2 kg de peso corporal. Con los resultados así obtenidos. LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE 1. ¡ ¡ ¡ IV.37 ACCION DE LA HORMONA ADRENALINA I. Luego extraer muestras de sangre a los 15 . .

¿Qué efectos tiene la adrenalina. ácido glucorónico. utilizando un método específico a base de glucosa oxidasa y otro inespecífico en base al reactivo de Benedict. c) Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato cloral. creatinina. La glucosa del filtrado glomerular renal se reabsorbe en su totalidad en los tubos contorneados proximales. en presencia de peroxidasa produce 0-tolidina oxidasa (de color azul) más agua. La glucosa oxidasa. fructuosa. de uso generalizado en clínica. En la orina. formaldehído. galactosa y pentosas. Los iones hidrógeno removidos se combinan con el oxígeno atmosférico y forman peróxido de hidrógeno (H2O2). pero como anotamos éste identifica a las sustancias con capacidad reductora y por tanto es de carácter inespecífico. II.5 g/l. la orina en glucosa aparece aunque ésta se encuentre en concentraciones normales en la sangre (diabetes insípida). cuando existe insuficiencia renal (menor filtración) no aparece glucosa en la orina aunque la concentración de glucosa se encuentra elevada por encima de 180 mg %. en presencia de glucosa (sustrato) de la orina remueve de éste 2 iones hidrógeno (2H+) formando gluconolactona). Este. La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras. etc. El peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa oxida a la 0-tolidina y toma color azul. ácido ascórbico. el cual es hidratado a ácido glucónico. pero cuando la glicemia supera los 180 mg % se puede producir glucosuria (presencia de glucosa en orina) porque en estas condiciones se supera la capacidad del riñón para reabsorverla (dintel renal). INTRODUCCION: En la orina de sujetos normales no existen cantidades detectables de azúcares en orina. ácido úrico. sin tomar en cuenta su acción en el metabolismo hidrocarbonado? REUNION DE LABORATORIO N° 07 PRACTICA N° 14 DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA EN ORINAY SU DIFERENCIACIÓN DE OTROS AZUCARES REDUCTORES I. por acción de la glucosa oxidasa produce ácido glucorón más peróxido de ico hidrógeno. REACTIVOS A UTILIZAR . b) Otros compuestos orgánicos: ácido homogentísico. La glucosa puede ser determinada de manera específica utilizando como reactivo básico la glucosa oxidasa (método enzimático). La prueba está basada en que la glucosa urinaria en presencia de oxígeno.38 5. es posible encontrar cierta cantidad de elementos reductores que se eliminen diariamente entre 0. además de glucosa. Sin embargo. y por tanto es explicable que no aparezca glucosa en orina. puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que podemos señalar: a) Otros azúcares reductores: lactosa.5 y 1. Cuando la capacidad de reabsorción renal disminuye. Los azúcares forman más o menos la décima parte de dicha cantidad y de ella no puede decirse que su totalidad esté constituída por glucosa. Por el contrario. Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza para determinar glucosa en orina.

2. al ser tratada con el método de la glucosa oxidasa. 3. Compare la intensidad de la coloración azulada con una escala adjunta que representa aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa. Explique que es el umbral renal de la glucosa. incluida la glucosa Que resultados podrían obtenerse al tratar una muestra problema de orina. 4. Procedimiento: 1. Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas (Glucocinta Lilly). Colocar en baño de agua hirviendo por 5 min o exponer al fuego directo hasta ebullición por 1 min. IV. primero con el reactivo de Benedict y luego por el método de la glucosa oxidasa Que presunciones plantearía si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de Benedict da resultado positivo y sin embargo. 5. 2. 1. Llevar al baño de agua hirviendo por 5 min o exponer el tubo al fuego directo hasta que hierva por 1 min. Determinación enzimática de la glucosa en orina (Método de la glucosa oxidasa).39 - Reactivo de Benedict. III. 6. realizamos la siguiente determinación con la misma muestra de orina. da negativo Ante una prueba positiva de glucosa en orina: ¿Qué presunciones diagnósticas. Observar si hay cambio de color y precipitado. Observar si a los 60 segundos. después de humedecida la cinta. Agregar orina problema: 5 gotas. Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras. Fundamente la utilización del reactivo de Benedict para la detección de sustancias con capacidad reductora.10 ml. Determinación de sustancias reductoras en orina mediante el reactivo de Benedict. adquiere o no color azul. la reacción demuestra la presencia de sustancias reductoras. en relación a la glicemia del paciente podría plantear? Explique el fundamento del método de a glucosa oxidasa para la detección de glucosuria. CUESTIONARIO: 1. Agitar para evitar que el líquido se proyecte hacia fuera del tubo. 3. Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. . 2. 4. Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recién emitida contenida en un depósito de 5. Si aparece un precipitado de color rojo ladrillo. Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del líquido contenido en el tubo. 3.

40 .

Solución de Lavado :  Metanol  Acido acético glacial  Agua destilada. REACTIVOS A UTILIZAR . . La presencia de mucopolisacáridos en orina puede detectarse por un simple procedimiento o Test de Identificación de Mucopolisacáridos que se basa en que el papel Whatman I impregnado con el colorante AZURE-A. 20 ml. resultado obtenido cuando la excreción está sobre el límite superior normal de 15 mg/día. CUESTIONARIO: 1. II. Un resultado positivo por este procedimiento debe ser confirmado y cuantificado por columna cromatográfica ó utilizando la reacción de precipitación con cloruro de cetil piridium. Negativo: aparición solamente de un color azul pálido. Si un resultado cualitativo para investigar mucopolisacáridos en orina ha sido positivo ¿Porqué debe ser confirmado y cuantificado por cromatografía o precipitación? ¿Cuál es la constitución química básica de los glicosaminoglicanos (mucopolisacáridos)? ¿Cuál es la constitución química básica de los proteoglicanos? Cite 5 ejemplos de éstos.La orina turbia debe ser filtrada o centrifugada previamente. 3.1 ml. cartílago. válvulas del corazón y son responsables de las características físicas de estas estructuras. RESULTADOS Positivo: aparición de un color púrpura. INTRODUCCION: Determinar desórdenes genéticos puede involucrar los sistemas enzimáticos esenciales del metabolismo de los mucopolisacáridos. cerca de 100 mg/día. Transferir a una caja Petri llena de solución de lavado. Síndrome de Hunter. 2. Síndrome de Hurler. De acuerdo a su composición química los mucopolisacáridos están agrupados en dermatán sulfato. los cuales son excretados anormalmente en grandes cantidades en las mucopolisacaridosis (MPS). Los mucopolisacáridos son sustancias de gran peso molecular que se encuentran en varios tejidos: Conectivo. . heparán sulfato y queratán sulfato. 300 ml . . en contacto con mucopolisacpáridos forma un complejo de color púrpura metacromático. II. Dejar 3 min.Papel Whatman I impregnado con Azure-A .Usar orina fresca o de 24 hrs conservadas en refrigeración (no usar preservantes).41 PRACTICA N° 15 IDENTIFICACION DE MUCOPOLISACARIDURIA I. IV. aorta. cantidad que es bastante elevada si se compara con los 15 mg/día que excretan las personas normales. Estas son subdividas en varios grupos tales como : Síndrome de Morquiolo. III. llamados también MPS I. 0. Dejar por 20 min.Poner una gota de orina al centro de un papel de prueba con Azure-A. Los individuos con MPS secretan grandes cantidades de mucopolisacáridos. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. Síndrome de Sanfilippo. III y IV. cordón umbilical. La finalidad del experimento es determinar cualitativamente en orina la excesiva excreción de mucopolisacáridos. Sacar y secar la tira de papel en estufa a 80º C o con aire caliente.

42

4.

¿Cuál es la importancia biológica del ácido hialurónico, condroitina y heparina?

III UNIDAD METABOLISMO DE LIPIDOS

REUNION DE LABORATORIO N° 08
PRACTICA N° 16
DEMOSTRACIÓN DE LA DIGESTION DE LAS GRASAS IN VITRO. ACCION EMULSIFICANTE DE LAS SALES BILIARES SOBRE LAS GRASAS. ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA SOBRE LOS TRIGLICÉRIDOS Y EFECTO DE LAS SALES BILIARES
I. INTRODUCCION: Los triglicéridos son los principales lípidos de la dieta. En el estómago ocurre la acción de la lipasa gástrica y la licuefacción de la masa de lípidos de los alimentos por contraccion peristálticas. La es principal digestión ocurre en el duodeno, tiene lugar en la interfase agua-lípido y su velocidad depende del área de superficie de la interfase, la cual es grandemente incrementada por el movimiento peristáltico del intestino combinado con la acción emulsificante de los ácidos biliares. Los ácidos biliares son moléculas anfipáticas sintetizados por el hígado a partir del colesterol y secretados como conjugados de glicina y taurina. La lipasa pancreática (Triacilglicerol lipasa) cataliza la hidrólisis de los triglicéridos en sus posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto con ácidos grasos. La actividad enzimática de la lipasa pancreática incrementa grandemente cuando contacta la interfase agua-líquido, un fenómeno conocido como activación interfacial. La unión a la interfase agua-líquido requiera la colipasa, una proteína de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con la lipasa pancreática (449 residuos), con cambios conformacionales que f rma una o superficie hidrofóbica y deja libre el centro activo. La alteración en la digestión o absorción de las grasas produce esteatorrea La finalidad de la práctica es demostrar la acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando su efecto con el agua y el cloroformo. Asimismo la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y el efecto de las sales biliares. II. REACTIVOS A UTILIZAR III. Cloroformo Aceite vegetal, de olivo Solución de sales biliares Buffer fosfato 0.1M pH 8,0 Emulsificación de aceite vegetal Solución de fenolftaleina (Solución alcohólica) Hidróxido de sodio (NaOH) 0.1N

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

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y

Acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas utilizando tubos de 15 x 125 mm. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Aceite de olivo(gotas) Agua destilada (ml) Cloroformo (ml) Sales Biliares (ml) Agitar enérgicamente los tubos Dejar en reposo y anotar los resultados para interpretarlos Acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y efecto de las sales biliares sobre la reacción enzimática utilizando tubos de 20 ± 25 x 150 mm. COMPONENTES (ml) TUBOS Emulsificación de aceite vegetal Buffer fosfato 0.1M pH 8.0 Solución de sales biliares 1 % Solución de extracto pancreático 1 % Agua destilada I 2 2 2 3 II 3 2 2 2 III 3 2 2 2 IV 3 2 2 2 Tubo 1 3 5 Tubo 2 3 3 2 Tubo 3 3 2 -

Mezclar los 4 tubos y llevar al baño maría a 37 °C , por 30 minutos, agitando de vez en cuando. Al finalizar el tiempo de incubación retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftaleína. Mezclar bien y luego realizar la titulación. TITULACION: Utilizando una pipeta graduada de 1 ml, dejar caer gota a gota NaOH 0,1N en el fondo de cada tubo del sistema, mezclar bien hasta la aparición de un color rosado tenue persistente. Anotar la cantidad de NaOH 0,1N gastados. Anotar los resultados para su interpretación. IV. CUESTIONARIO: 1. Explique lo que son sustancias anfipáticas. 2. Diferenciar emulsión de solución, acción de las sales biliares vs cloroformo. 3. ¿Cuántas clases de lipasa pancreática actuán en el intestino? 4. Cuál de los métodos para medir la actividad enzimática se ha empleado en esta práctica. Explique el papel de la fenolftaleína en la titulación. 5. Diferencie la absorción de los ácidos grasos según su tamaño.

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PRACTICA N° 17
DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS PRE Y POST PRANDIAL EN SUERO HUMANO
I. INTRODUCCION: Los lípidos de la dieta son principalmente triglicéridos. Son transportados junto a colesterol y fosfolípidos por los quilomicrones, formados en el enterocito. Los quilomicrones son las lipoproteínas más grandes, menos densas, ricas en triglicéridos, con la apoproteína apo B48. Por el conducto toráxico llegan a la circulación general. El pico máximo de lipemia postprandial se observa entre las 4 y 6 horas de la ingesta, y al cabo de 9 a 10 horas retorna a los valores basales de lípidos, especialmente de los triglicéridos. Los niveles de lípidos postprandiales, especialmente de los triglicéridos dependen de la cantidad de lípido de la dieta, de la digestión y absorción, de los niveles basales sanguíneos, de la acción de la lipasa lipoproteic en los tejidos extrahepáticos. La lipasa a lipoproteica actúa sobre los triglicéridos de los quilomicrones, liberando ácidos grasos que son captados por los tejidos extrahepáticos. Los quilomicrones son convertidos en remanentes de quilomicrones y captados por el hígado. Se ha considerado al incremento de la lipemia postprandial como un factor riesgo de aterogénesis. La finalidad de la práctica es demostra las variaciones de la concentración de trigliceridos en suero después de la ingesta de alimentos de alto contenido de grasas II. REACTIVOS A UTILIZAR - Reactivo enzimático para determinación de Triglicéridos ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Un alumno por cada mesa vendrá en ayunas de al menos 10 horas, a las 7 a.m. se les extraerá una muestra basal. Ingerirán una dieta rica en grasas conteniendo un vaso de leche, un huevo, 2 panes y 10 aceitunas. A las 4 y 7 horas de la ingesta, se obtendrá una segunda muestra. Se obtendrá el suero y se hará la determinación de triglicéridos. Armar el siguiente sistema. COMPONENTES BLANCO STANDARD DESCONOCIDO Muestra --------10 ul Standard ----10 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar e incubar 10 minutos de 20« 25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. Medir la absorbancia del Standard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A). Cálculos:

III.

C ! 200 v

(ADesconocid o ?mg / dl A (AStandar
1.71 mmol/l 2.28 mmol/l

C ! 2.28 v

(ADesconocido ?mmol / l A (AStandar

Valores Referenciales Sospechoso: sobre 150 mg/dl ó Elevado: sobre 200 mg/dl ó

2.45 IV. Cuál es el efecto de la edad. Explique porqué el incremento de la lipemia postprandial es considerado un factor de riesgo coronario. Alteración de la lipemia postprandial en diabetes y familiares de diabéticos. 5. . CUESTIONARIO: 1. el ejercicio y el género sobre la lipemia postprandial. Destino de los productos de acción de la lipasa lipoproteica sobre los triglicéridos. Grafique los cambios de triglicéridos postprandiales en función del tiempo. 4. 3.

solución al 5% en H2O. rinde un color azul violeta. Nitroprusiato de sodio 10% 3 gotas Amoníaco (agregar lentamente por las paredes del tubo. Prueba de Rothera y Trabajar del tubo identificado como orina patológica y Utilizar nitroprusiato en polvo. incluyendo el cerebro en el ayuno prolongado. en los vómitos.46 PRACTICA N° 18 IDENTIFICACIÓN DE LOS CUERPOS CETONICOS EN LA ORINA. en la dieta pobre en carbohidratos.5 g Mezclar hasta disolver los cristales de Sulfato de Amonio. produce acetil CoA que ingresa al Ciclo de Krebs y en parte se utiliza en la síntesis de cuerpos cetónicos (cetogénesis). el aumento de la lipólisis. el ácido beta hidroxibutírico y la acetona. En condiciones patológicas como la Diabetes mellitus. En la Diabetes mellitus. Los dos primeros pasan a la sangre y son fuente de energía en los tejidos extrahepáticos como el corazón y el músculo esquelético. . en la enfermedad de Von Gierke y otras glucogenosis. Aumentan en sangre (cetonemia) y en orina (cetonuria) por condiciones fisiológicas como el ayuno prolongado.Cloruro Férrico. . cristales. solución al 10% en H2O . a nivel mitocondrial. Estos son el ácido acetoacético. hipertiroidismo. Su concentración normal en orina es de 125 mg/ 24 horas. especialmente de acetona. de la beta oxidación y de la cetogénesis. El diagnóstico y monitoreo de su tratamiento se hace con su determinación en sangre o/i orina.Nitroprusiato de sodio. Dado que éstos son ácidos se produce acidosis metabólica. de la siguiente manera: II.Disponer de dos tubos que contengan orina normal y orina patológica. Procedimiento: Armar el siguiente sistema: COMPONENTES TUBO Orina 3 ml Cristales de sulfato de amonio 0. en el síndrome de Fanconi. REACTIVOS A UTILIZAR: . sin mezclar) 1ml _________________________________________________________________________ Anotar sus resultados. Los cuerpos cetónicos son eliminados por la orina y la a etona también por la c respiración. a l denominada cetoacidosis diabética. al superar la capacidad de oxidación de los tejidos extrahepáticos lleva a niveles aumentados de cuerpos cetónicos.Sulfato de amonio. y en sangre hasta 1mg/dl. Prueba de Legal El nitroprusiato de sodio diluido en presencia de cuerpos cetónicos. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento INVESTIGACION DE ACETONA . DETERMINACION SEMICUANTITATIVA DE CUERPOS CETONICOS EN ORINA I. en toda hipercatabolia como la fiebre. III. INTRODUCCION: La beta oxidación de los ácidos grasos en el hígado. el hiperinsulinismo.

1 cc DILUCION 1/10 1/20 1/30 1/40 1/50   Agregar una gota de cada una de las diluciones.Armar dos sistemas que contengan orina normal y patológica. 2. Observar la máxima dilución de la orina en el que aparece color azul violeta y multiplicar por el denominador de la dilución alcanzada por 10 y se tendrá la cantidad aproximada de acetona en mg por 100ml. Diluir la orina al 1/10. cetoacidosis y de ejemplos de cada uno de ellos.9 cc 3.1 cc 0. Prueba de Cloruro Férrico o de Gerhart. Cuál es la importancia de la cuantificación de los cuerpos cetónicos en el monitoreo de la cetoacidosis. para investigar acetona y tener una cifra aproximada en su cuantía. Realice una comparación entre la síntesis de cuerpos cetónicos con la etapa inicial de la síntesis de colesterol Defina: cetonemia.9 cc 1. INVESTIGACIÓN DE ACIDO ACETOACETICO .9 cc 4. se debe multiplicar por 10 el número de veces que se ha diluido ésta. 3. de la siguiente manera: AGUA 0. Procedimiento (Se utiliza orina filtrada): COMPONENTES Orina filtrada Cloruro Férrico. Esto es debido a que el nitroprusiato de sodio en polvo da reacción positiva solo cuando en la orina sin diluir alcanza la concentración mínima de 10 mg% de acetona y por eso.1 cc 0. 150 mg/dl. Se basa en que en presencia de cloruro férrico. en cada una de las excavaciones que contiene el reactivo.2 g de reactivo sólido de nitroprusiato de sodio en cada una de éstas.47   En una lámina de porcelana con excavaciones colocar 0. solución 5% en agua TUBO 5 ml gota a gota hasta la aparición del Color rojo burdeos si existe ácido Acetoacético IV.1 cc 0. Sumergir la tira en el frasco conteniendo la orina.1 cc 0. Uso de tira reactiva. CUESTIONARIO: 1. 5. 4. el ácido acetoacético rinde una coloración rojo burdeos.9 cc + + + + + ORINA 0. Cuál es el mecanismo fisiopatológico de la cetoacidosis en un paciente que llega al hospital por alcoholismo agudo . para calcular la concentración en orina diluida. Esperar 20 segundos. 15. Compare los métodos para determinar los cuerpos cetónicos. leer en escala colorimétrico. etc. 50. Este método con sus dos variantes es posible aplicarlo al suero sanguíneo. 1/30. estimando la concentración como negativo 5. 1/20.9 cc 2. cetonuria.

3 niveles: Bajo o de riesgo < 40. y el LDL. el lipoteroidismo. En los triglicéridos se considera: normal menos de 150mg/dl. y el resto en la VLDL y HDL.. Son hipertrigliceridemias primarias. Es transportado principalmente por la LDL que es considerada aterogénica. normal a 40 a 59. En la presente práctica. Medir la absorbancia del Starndard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A) III. INTRODUCCION: El colesterol es un componente importante de las biomembranas. o secundarias a otras enfermedades. Entre las secundarias: La diabetes. etc. la disbetalipoproteinemia. El HDL colesterol. la hiperlipidemia familiar combinada la hiperkilomicronemia. el síndrome nefrótico. regulando su fluidez. previa precipitación de las otras lipoproteínas.48 REUNION DE LABORATORIO N° 09 PRACTICA N° 19 DETERMINACION DE PERFIL LIPIDICO I. el alcoholismo. La hipertrigliceridemia puede deberse a causa primarias o familiares. el uso de anticonceptivos orales.Reactivo Standard para colesterol 50 mg/dl. el hipotiroidismo. de los tejidos hacia el hígado y es considerada antiaterogénica .El III Panel de Expertos ha establecido los valores de referencia para el colesterol. En el colesterol se considera 3 niveles: Deseable < 200 mg/dl. cirrosis biliar. la hipertrigliceridemia familiar. Son causas secundarias: la diabetes. hiperglicemia e hipertensión. .Precipitante para macro ensayos (PRECa) . en el denominado síndrome metabólico. 5 niveles: Óptimo < 100 mg/dl. obesidad central. Los triglicéridos an ayunas circulan unidas a las VLDL y son fuente de energía para los tejidos. ictericia obstructiva. la gota. REACTIVOS A UTILIZAR: . la hiperlipidemia familiar combinada. clorhidrato de magnesio. por el método enzimático y la determinación de HDL. II. el HDL. . resistencia a la insulina. Entre las hipercolesterolemias primarias se señalan: La hipercolesterolemia familiar. alto o protector mayor o igual a 60. La HDL realiza el transporte reverso del colesterol. su incremento también es considerado factor de riesgo coronario. La hipertrigliceridemia se asocia a disminución de HDL. limítrofe alto 200-239 y alto definitivo > 240 (Hipercolesterolemia > 200 mg/dl). A partir de él se forman los ácidos biliares y las hormonas esteroideas. El LDL colesterol. limítrofe de 150 a 199. Hipertrigliceridemia moderada de 200 a 499.Reactivo precipitante de HDL: ácido fosfotungstico. severa 500 o más La hipercolesterolemia puede deberse a causas primarias o secundarias. se realizará la determinación de colesterol sanguíneo. . incubar 10 minutos de 20«25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. la hipercolesterolemia poligénica.Precipitante para semimicro ensayos (PRECb) ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN DE COLESTEROL SANGUÍNEO Armar el siguiente sistema: COMPONENTE BLANCO PROBLEMA ESTÁNDAR Suero ----10 ul ----Estándar 200 mg/dl --------10 ul Reactivo enzimático 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar.

incubar por 10 minutos a temperatura ambiente.49 CALCULOS VALORES REFERENCIALES: Sospechoso: sobre 220 mg/dl Elevado: sobre 260 mg/dl DETERMINACIÓN DE HDL -COLESTEROL: Armar el siguiente sistema: ó 5. alternativamente por 10 minutos a 4000 RPM Después de centrifugar separar el sobrenadante del precipitado y determinar la concentración de colesterol: Componente Blanco Standard Desconocido Agua Destilada 100 ul --------Standard ----100 ul ----HDL sobrenadante --------100 ul Reactivo de trabajo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar. respectivamente. incubar por 5 minutos a 37 ºC o 10 minutos a 20«25 ºC. CALCULOS: Concentración HDL-Colesterol: Macro método : ¤ C ! 150 v A Desconocid o A Standard mg/dl Semi  micro método : ¤ C ! 175 v A Desconocid o A Standard mg/dl TG 5 Concentración de LDL-Colesterol: VALORES DE REFERENCIA: HDL-Colesterol: Hombres LDL  C ! TC  HDL  C  ?mg/dlA Mujeres (mg/dl) ¢ standard £ ¢ ! 200 v muestra ?mg/dl A ó ! 5. comparando con el blanco.17 v ¢ ¢ muestra standard ?mmol/l A ¤ ¤ £ .7 mmol/l Componente Macro Semi-micro Suero 500 ul 200 ul PRECa 1000 ul ----PRECb ----500 ul Mezclar bien. Leer las absorbancias del desconocido y del Standard.7 mmol/l ó 6. Centrifugar for 2 minutos a 10000 RPM. dentro de 60 minutos ( A).

Cuál es la importancia de la hipertrigliceridemia en la aterogenesis. Cualés son las causas primarias de hipertrigliceridemia. 7. Señale las principales causas de HDL disminuido. 8. 3. 4. Alteraciones del perfil lipídico en la diabetes y en el hipotiroidismo. 5. CUESTIONARIO: > 65 45-65 < 45 150 mg/dl 190 mg/dl 1. Señale la importancia fisiológica del colesterol. . Señale la importancia clínica del colesterol. 2. Realice una breve descripción de hipercolesterolemia familiar y su relación con la cardiopatía isquémica. Realice una breve explicación del rol de la LDL en la aterogénesis. 6.50 Normal > 55 Bajo riesgo 35-55 Riesgo elevado < 35 LDL-Colesterol: Sospechoso: Elevado: IV.

Con la ayuda del personal de la sección. Se determinará el perfil lipídico antes y después del tratamiento y se compararan los resultados. Las hiperlipidemias pueden ser primarias o familiares como la hipercolesterolemia familiar. sidrome nefrotico. bajo la supervisión del personal de la sección. HDL. la hiperlipidemia familiar combinada.  Set de determinación de colesterol enzimático. Extracción de las muestras.51 PRACTICA N° 20 HIPERLIPEMIA EXPERIMENTAL I. Se extraera el suero y a cada una se determinara el perfil lipídico siguiendo el método enzimático empleado en la práctica anterior. La dieta es importante en el control de la hiperlipidemia. Las cuales se dividirán en dos grupos en forma aleatoria. aumento de las grasas monoinsaturadas y polinsaturadas. ha establecido los criterios para una dieta adecuada que incluye disminución de la ingesta de colesterol. Y secundarias a otras patologías como la diabetes. disminución de las grasas saturadas. etc. como parte del cambio de estilo de vida junto al ejercicio y control de peso. II. La ATP III. puede producir el incremento de los lípidos sanguíneos. El tratamiento será por 21 días. 1-2 representantes de cada mesa se encargarán del control de la dieta. Se compararán los valores de colesterol. las que recibiran adicionalmente 2 cc de aceite preparado de sebo de pollo. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procemiento  Tratamiento experimental. la hipertrigliceridemia familiar etc. o Las diez restantes conformaran el grupo experimental. INTRODUCCION: El aumento de los lípidos sanguíneos o hiperlipidemia constituye una situación metabólica de riesgo. cada mesa obtendrá de cada rata control y experimental una muestra sanguínea de la cola antes del tratamiento y otra al final.  Dieta standard para ratas a base de maíz.  Sebo de pollo. o Diez de ellas constituirán el grupo control y seguiran su dieta habitual agua y alimentos (maíz) ad libitum. III. Se considera aterogénicos el aumento del colesterol y de los tigliceridos. Una dieta rica en grasas saturadas aumenta el riesgo de hiperlipidemia y consiguiente mayor riesgo coronario.  Set de determinación de triglicéridos enzimático. En el presente experimento.  Reactivo precipitante para HDL. especialmente coronario. LDL y triglicéridos entre ambas ratas. REACTIVOS A UTILIZAR:  Ratas de peso aproximado de 200gr. se busca mostrar como la ingesta de una dieta rica en grasa saturada con sebo de pollo por 3 semanas. hipotiroidismo. Se dispondran de 20 ratas albinas adultas.    .

3. Señale en detalle la dieta recomendada por la ATP III. . para el tratamiento de la hiperlipidemia. Qué alimentos son fuentes de fibra. CUESTIONARIO: 1. Qué alimentos son ricos en grasas saturadas. Qué alimentos son ricos en grasas monoinsaturadas. 5. Qué alimentos son ricos en colesterol. 4. Qué alimentos son ricos en grasas polinsaturadas. 2. 7. Qué alimentos son fuentes de omega 3. 6.52 IV.

con retardo marcado del crecimiento. c) de origen intestinal: aminopeptidasas. determinado los productos (aminoácidos) con ninhidrina II. La quimotripsina es específica para los enlaces peptidicos de los aminoácidos sin carga como los aromáticos: tirosina. b) de origen pancreático: tripsina. alanina y serina. La tripsina. existe hipoproteinemia. es un proceso complicado que se realiza con el concurso de diversas enzimas proteolíticas Entre estas enzimas proteoliticas tenemos: a) de origen gástrico: pepsina y renina. triptofano y fenilalanina. quimotripsina. como la glicina. La carboxipeptidasa hidroliza el enlace peptídico carboxiterminal en las cadenas polipeptidicas.25% saturada con butanol. o degradación hasta aminoácidos en el tubo digestivo. y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados en las heces).Solución acuosa de ninhidrina al 0. quimotripsina. y es específica de los enlaces peptidicos sobre el lado carboxílico de residuos de aminoácidos básicos: lisina y arginina solamente. Son endopeptidasas: pepsina.1 M pH 8. . tripsina. La presente práctica tiene como finalidad demostrar la acción hidrolítica de las enzimas digestivas contenidas en el páncreas sobre la caseína o proteína de la leche. elastasa y carboxipeptidasa.Caseína al 1% en buffer fosfato 0. que provienen de la carne de los alimentos). .Acido tricloroacético al 10%. . REACTIVOS A UTILIZAR: . . INTRODUCCION: La digestión de las proteínas. .1 M pH 8. es activada por la enterocinasa en el intestino.Solución de extracto pancreático. elastasas. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) I II III III. La elastasa tiene una especificidad amplia. ataca a los residuos pequeños. Son exopeptidasas: carboxipeptidasa y aminopeptidasa. La falta de enzimas proteolíticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las heces.Buffer fosfato 0.53 IV UNIDAD PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS: INTEGRACION DEL METABOLISMO REUNION DE LABORATORIO N° 10 PRACTICA N° 21 DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA I. dipeptidasas. En el lactante con ausencia congénita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de activación de quimotripsinógeno y procarboxipeptidasa.

durante 3 a 5 minutos.54 Caseína al 1% Buffer fosfato 0. agregar 1 ml de solución de ninhidrina. Observa los cambios de color de cada tubo. . IV. de cada uno de los tubos y trasladarlo a otro sistema numerado (I. Escriba dos esquemas mostrando dos ejemplos de transaminación y dos de desaminación con los nombres de aminoácidos y alfa cetoácidos que participan. En este nuevo sistema. III). 2.0 Solución de extracto pancreático Agua destilada Pasos: * * * * * * * 1 1 1 --- 1 1 --1 --1 1 1 Mezclar y colocar al baño de agua a 37 ºC por 30 minutos. Elabore un esquema con la digestión y absorción de proteínas y aminoácidos. Luego a los tubos de incubación del primer sistema. Observe las variaciones que se produce en cada tubo. agregue gota a gota 1 ml de ácido tricloroacético al 10% agitando continuamente. Mezclar y llevar a un baño de agua hirviendo (franca ebullición). Después del tiempo de incubado tomar 0. Explique el sitio de producción y la acción de las hormonas que intervienen en el proceso de digestión y absorción de los aminoácidos.5 ml.1 M pH 8. II. 3. CUESTIONARIO: 1. Interprete todos los resultados encontrados en la práctica y explíquelos usando algunos dibujos. 4.

Solución de tripsina 20 mg%. INTRODUCCION: La tripsina actúa como una endopeptidasa e hidroliza prácticamente toda clase de proteínas.Solución de ninhidrina 0. La finalidad del siguiente experimento es demostrar el efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre el efecto proteolítico de la tripsina. Digiere las proteínas desnaturalizadas y parcialemente digeridas. Incubar en baño maría a 37°C durante 1 hora.Buffer fosfato 0. . . con mayor rapidez que las originales desdoblándose en polipéptidos de peso variable y algunos aminoácidos.Proteína de soya cruda 30%.2 IV 2. . ello explica en parte que el valor nutritivo del frijol de Soja aumenta considerablemente si se coce a ebullición por varios minutos.1 M pH 8.5 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0. I 2. Mezclar y centrifugar a 2500 rpm por 10 min.5 0. .Los extractos de páncreas poseen también un péptido inhibidor de la tripsina. b.5 III 2.25% saturada con butanol.5 0. Esta sustancia de naturaleza peptídica es inactivada por el calor. el gisipol. .0. . Después del tiempo de incubación: agregar a cada uno de los tubos 2 ml de etanol absoluto. El ovomucoide de la clara de huevo inhibe también de manera enérgica la tripsina. con actividad antioxidante y antitripsina que disminuye el apetito y dificulta la digestión de las proteínas.5 0. Es interesante también que el aceite de semilla de algodón posea un pigmento. c.2 II 2. REACTIVOS A UTILIZAR.0 Proteína de soja cruda 30% Proteína de soja hervida 30% Solución de tripsina 20 mg% Pasos: a. Algunos alimentos en estado natural poseen componentes perjudiciales para la nutrición. secretada a la luz intestinal.5 0.Proteína de soya hervida 30%. Por ejemplo el frijol de soja contiene un principio cuya actividad antitripsina dificulta la digestión de las proteínas.5 - .1 M pH 8.55 PRACTICA N° 22 INHIBICION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS: ACCION DE LA SOYA HERVIDA Y CRUDA SOBRE EL EFECTO PROTEOLITICO DE LA TRIPSINA I. II. efecto que desaparece cuando la soya es hervida. la alfa-1 antitripsina fecal (1-AT-Fecal) que es una glicoproteína.5 0.Etanol absoluto III.

II. Someter los tubos a temperatura de ebullición del agua utilizando baño maría durante 5 minutos. IV colocar 1 ml de sobrenadante de los tubos respectivos del paso anterior y agregar 1 ml de ninhidrina 0. e. . Explique con sus propias palabras cuál cree que es el objetivo de la práctica que realizó. CUESTIONARIO: 1. En otra serie de tubos numerados I .25%. 2. 4. f. ¿Qué es el gisipol y cómo actúa en su acción antioxidante? Con dibujos represente la práctica realizada. Anotar los resultados. III. 3. IV. Por qué razón el ovomucoide de la clara del huevo inhibe la acción de la tripsina.56 d.

la transferrina. La presente práctica tiene por finalidad determinar las concentraciones séricas de proteínas totales y fraccionadas en personas normales y/o con procesos patológicos.57 REUNION DE LABORATORIO N° 11 PRACTICA N° 23 CUANTIFICACION DE PROTEINAS SERICAS TOTALES Y FRACCIONADAS I. respecto del Blanco del reactivo. transporte. Reactivo EDTA/Cu Reactivo BCF . regulación del equilibrio hídrico. excreción.1 g/dl..9 g/dl de las cuales albúmina: 3. en medio tamponado a pH3. defensa contra las infecciones.Las fracciones globulínicas contienen varias proteínas específicas: inmunoglobulinas. inmunodifusión o inmunoelectroforesis. Las cifras de proteínas plasmáticas totales pueden aumentar (hiperproteinemia) con cociente A/G normal en la hemoconcentración. haptoglobina. La concentración sérica de las proteínas totales es de 6. insuficiente ingestión de proteína. El origen de las proteínas plasmáticas es hepático con excepción de las globulinas gamma que se forman en las células plasmáticas.8 g/dl y globulinas: 2. en la macroglobulinemia de Waldenström. cuya intensidad es provisional a la concentración de proteínas totales en la muestra. regulación del metabolismo. INTRODUCCION: Las proteínas plasmáticas son importantes para el organismo porque realizan diversas funciones: coagulación. En el suero solo albúmina y globulina .1 a 7. Determinación de Albúmina: La albúmina reacciona específicamente sin separación previa con la forma aniónica de la bromo Cresolsulfon Ftaleina (BCF). por el método colorimétrico. ceruloplasmina. en la gastroenteropatía exudativa con pérdidas fecales de proteínas. Agammaglobulinemia y la analbuminemia son cuadros demasiado raros. globulina y fibrinógeno. en medio alcalino. II.5 a 4. conservación del equilibrio ácido básico. REACTIVOS A UTILIZAR. etc. La disminución de proteínas totales (hipoproteinemia) son generalmente asociadas con HIPOALBUMINEMIA que a su vez están acompañadas con pequeños cambios en las globulinas.6 a 3. FUNDAMENTOS DEL METODO Determinación de Proteínas Totales: Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico. Los bajos niveles de albúmina pueden ser debidos a: incrementadas pérdidas de albúmina en la orina. que se pueden determinar por electroforesis. en el kala-azar. en presencia de un exceso de colorante. con inversión de A/G por aumento de las globulinas: en el mieloma múltiple. disminución de la formación en el hígado como en la cirrosis. etc. Las proteínas plasmáticas por métodos químicos se clasifican en albúmina. etc. El aumento de absorbancia a 625 nm. es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra. en las colagenopatías. para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540nm.8.

1 ml. Leer en espectrofotómetro a 625 nm o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo CALCULOS DE LOS RESULTADOS : Alb.(g/dl) Albúmina (g/dl) ! D v f f! S Albúmina(g/dl) PT.5 ± 4.Alb.0 a 8.(g/dl) Relación A/ ! ¥ VALORES DE REFERENCIA: Albúmina = 3. ó 20 minutos a temperatura ambiente.2 ± 2.2 . Reactivo BCF 1ml. 1 ml. PROCEDIMIENTO: En tres tubos de fotocolorímetro marcados B(Blanco).01 ----1.0 Desconocido 0. colocar: Componentes Muestra (ml) Standard (ml) Reactivo (ml) Blanco --------1.01 1. colocar: B S D Suero Patrón 10 ul Muestra 10 ul. Mantener los tubos entre 15 y 28 ºC durante 10 minutos.58 III. llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo. El color resultante es estable por lo menos 30 minutos. CALCULOS: FACTOR ! Concentrac ión Standard Absorbancia Standard  Proteina Total (g/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: 6.0 Standard ----0. S (Standard) y D (Desconocido). Leer las absorbancias a 540 nm.8 g/dl Relación A/G = 1. Mezclar con varilla. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Determinación de Proteínas Totales PROCEDIMIENTO: En tres tubos marcados B (Blanco).0 g/dl Determinación de Albúmina.0 Mezclar e incubar 10 minutos a 37rC. (g/dl). S (Standard) y D (Desconocido).

en clínica? ¿En qué se basa la determinación de las proteínas totales y fraccionadas en nuestro experimento? Elabore un esquema sobre el proceso fisiopatológico de un edema. . 3. CUESTIONARIO: 1.59 IV. ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de las proteínas séricas totales y las fracciones albúmina y globulinas? ¿Qué importancia tiene determinar la relación albúmina/ globulina. Cuáles son las principales características de las proteínas plasmáticas. 4. 2. 5.

La presente práctica tiene por finalidad determinar la presencia de proteínas en la orina y de cuantificarlas en caso que estén presentes en casos normales y en estados patológicos. gravídica. Cuando el glomérulo es dañado por alguna enfermedad. etc. menos de 10 mg/dl. albúmina. Si aparece un precipitado o enturbamiento se puede deber a la presencia de proteínas o fosfatos. la cantidad es pequeña alcanzando máximo de 150 mg en orina de 24 horas. 12.5% (en agua destilada) Cloruro de sodio 0. La proteína de Bence Jones está constituída por las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas que constituye la proteína monoclonal.0 Someter a ebullición por 1 minuto.). febril. en la eclampsia. sin que exista evidencia de lesión renal. Se diluye con cloruro de sodio 0. por ejemplo la proteína de Bence Jones.85% a una concentración final de 25 mg/ml. Son causas de proteinuria Renal: glomerulonefritis difusa. Si la turbidez persiste. Añadir: Solución de ácido acético al 2% IV gotas Si desaparece la turbidez. Las proteínas de peso molecular relativamente bajo y de pequeño tamaño pasan primero a través de los glomérulos injuriados. II. . La proteinuria puede ser renal o extrarrenal. se trata de proteínas. nefropatía diabética. Acido acético al 2%. Esta dilución debe ser preparada el mismo día. En el mieloma múltiple y macroglubinemia de Waldestrom. glomerulonefritis focales proliferativas. INTRODUCCION: La orina normal contiene una pequeña cantidad de proteínas solubles (albúminas. se trata de fosfatos que se han disuelto en medio ácido. Acido tricloroacético. escapan en el filtrado de forma que los túbulos son incapaces de captar la gran cantidad de proteínas y resulta una masiva proteinuria. Extrarrenal: proteinuria ortostática. III. Las proteínas son casi completamente absorbidas en los túbulos. se ha hace más intensa o se forma un precipitado. El fibrinógeno es una molécula muy larga y escapa solo en enfermedad renal severa. algunas enzimas. moléculas proteicas de variado tamaño incluyendo las más largas. hemoglobina. COMPONENTE (ml) TUBO Muestra de Orina 5.60 PRACTICA Nº 24 DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE PROTEINAS EN ORINA I. aparece la proteína de Bence Jones. mieloma múltiple. nefropatía tóxica. Standard de proteína: Pueden usarse suero claro normal de concentración conocido o un suero control adquirido comercialmente.85%. La proteinuria fisiológica (proteinuria ortóstatica) se presenta después de ejercicios y de permanecer largo tiempo en posición de pie. síndrome nefrótico. REACTIVOS A UTILIZAR. riñón poliquístico etc. luego las globulinas. tuberculosis renal. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LAS PROTEÍNAS EN ORI NA: Coagulación por el calor. nefropatía lúpica.

¿Cómo diferencia usted un precipitado en un tubo de ensayo que no c orresponde a proteínas en orina? Señale algunos tipos de proteínas anormales que pueden ser encontradas en la orina. 3.5% I 4. NOTA: Antes de leer los tubos deben ser mezclados totalmente evitando que burbujas de aire puedan interferir con la lectura. y leer en fotocolorímetro con filtro (420 um). mg/100 ml orina x 100 IV.0 Dejar reposar 5 a 10 min. 5. CUESTIONARIO: 1.0 III 4.0 II 1. Leer el standard (I) calibrando con agua destilada y luego a la lectura del problema (II) restar el blanco de la orina (III). En tres tubos marcados previamente agregar: COMPONENTES (ml) /TUBOS Solución standard de proteína Orina previamente filtrada Agua destilada Acido tricloroacético 12. .0 4.0 1.61 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS EN LA ORINA : Método turbidimétrico de Heavy. En qué consiste el método de Heavy para la determinación de proteínas ¿Cuál es el mecanismo por el cual un paciente con glomeruloesclerosis elimina mucha proteína por la orina? Señale algunas causas de proteinuria fisiológica y patológica. 4. CALCULO: Desde que 4 ml de orina se trata igual que un standard de 4 ml conteniendo 25 mg/100 ml entonces: Calcular de la siguiente manera: Absorbancia problema ± Absorbancia blanco x 25 = mg/100 ml. orina Absorbancia del standard Volumen total en ml orina -----------------------------------.0 1. 2.= proteína total de orina de 24 H en mg.

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Reactivo reconstituido (ml) 1. Leer la absorbancia inicial (A1) a 340 nm. sacar diferencias y determinar una media que luego se multiplica por el factor determinado. hasta por tres minutos. estas enzimas proveen un medio de interconversión de proteínas e intermediarios metabólicos de los carbohidratos y hacen disponibles las reservas proteicas almacenadas en el hígado al ciclo del ácido cítrico. En la presente práctica la glutámico pirúvico transaminasa (GPT) es determinada agregando suero a una solución bufferada conteniendo ácido alfa cetoglutarato y L-alanina y el ácido pirúvico formado. REACTIVOS A UTILIZAR. Las transaminasas están normalmente presentes en la sangre. particularmente en el hígado y corazón. producto resultante después de la incubación. VALORES DE REFERENCIA: Hasta 29 U/l a 30 ºC Hasta 45 U/l a 37 ºC . CALCULOS: Actividad ALAT (UI/l) = A/min x 1768 Nota: de las absorbancias. en la hepatitis o en el infarto de miocardio. estas enzimas son liberadas dentro de la corriente sanguínea y pueden elevar sus niveles. Cuando se produce destrucción tisular de estos órganos como sucede por ejemplo. INTRODUCCION: La transaminasa glutámica pirúvica. Incubar 60 segundos a la temperatura de reacción.5  a-cetoglutarato  L-alanina  LDH  NADH III. Repetir las lecturas a intervalos de 60 segundos..glutamato. se mide colorimétricamente por reacción con dinitrofenil hidrazina en medio alcalino. relativamente en bajas concentraciones pero en los tejidos están presentes en grandes cantidades.62 PRACTICA N° 25 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ALANINA AMINOTRANSFERASA SERICA (ALT) o TRANSAMINASA GLUTAMICO PIRUVICA (SGTP) I..1 Mezclar y transferir a la cubeta del espectrofotómetro.0 Volumen de muestra (ml) 0. II. Con la aspartato transaminasa. llamada también alanina aminotransferasa cataliza la reacción L-alanina + alfa-cetoglutarato . Reactivo para SGTP:  Buffer TRIS pH 7.Piruvato + L .

Diga usted en que consiste el mecanismo de transaminación. colocando los nombres de las moléculas que participan.63 IV. Haga un esquema de una transaminación. 2. Cuál es la utilidad práctica de la utilización del dosaje de transaminasas. ¿Cuál es la importancia metabólica de la transaminasa glutámico pirúvico? 3. ¿Cuál es la ubicación intercelular de las TGP y TGO? 5. CUESTIONARIO: 1. 6. . TGO-S algunas veces separadas y otras veces juntas. ¿Cuáles serían las razones para solicitar. en el diagnóstico diferencial clínico? 4.

REACTIVOS A UTILIZAR Sustrato AST: Buffer de DL-aspartato y -cetoglutarato pH 7. aunque se hallan en todos los tejidos se relacionan preferentemente con los procesos de ³escape´ de enzimas del mi cardio o el hígado.0 0.1 0.10 0. éstas. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) : 1) CURVA DE CALIBRACIÓN: Antes de usar los reactivos por primera vez. en general.64 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST) I. Las enzimas con actividad en el suero sanguíneo (las que intervienen en la coagulación.4N diluido con agua destilada 1:10) Mezclar y reposar por 15 minutos a temperatura ambiente antes de leer. El color es estable sólo por 30 minutos. por ejemplo) y las enzimas de escape. las dos suben nuevamente.1 0.15 0. es la determinación por método colorimétrico de una de estas transaminasas de importancia clínica como es la aspartato aminotransferasa.35 0.1 0. Agregar 5 ml de NaOH 0.4 NaOH 0. INTRODUCCION: En condiciones normales. la glutámico pirúvica (TGP) y la glutámico oxalacética (TGO) o aspartato aminotransferasa (AST). El tejido miocárdico es muy rico en TGO y el ascenso de esta enzima acompaña a los procesos destructivos del corazón. . a veces proporciona datos positivos en casos con datos electrocardiográficos de difícil interpretación.30 0. Armar el siguiente sistema: Tubo 1 2 3 4 5 6 Agua Destilada (ml) 0.4 Reactivo de color: 2-4 dinitrofenilhidrazina Standard: Buffer piruvato pH 7. II.4N (NaOH 0.1 0. En las lesiones o hepáticas aumentan ambas transaminasas en el suero. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. una vez sintetizadas.50 0. como es el caso de: Las enzimas del tubo digestivo. La finalidad del presente trabajo experimental.4N III. pero tiene el inconveniente de elevarse en diversos cuadros.1 Sustrato AST (ml) 0.20 0. si aparece una recaída.40 0. presentes en cantidades muy bajas en el suero aun cuando en ciertas enfermedades suben considerablemente.45 0. sobre todo en la cogestión hepática. Otras enzimas. En la clínica son importantes dos transaminasas. descienden en forma paralela y.5 ml de reactivo de color.05 0. El ascenso es.25 Standard 0. las enzimas se sintetizan en las células y en la mayoría de los casos ejercen su función en su interior. salen de las células y funcionan fuera de ellas. Leer a 505 nm.1 0. sube al máximo entre las 12 y 48 horas y suele volver a lo normal a los 4 ó 7 días. proporcional a la extensión del infarto.25 AST 0 22 55 96 150 212 Agregar 0. cuando sobreviene la mejoría clínica. preparar una curva de calibración para AST.

.5 ml de sustrato AST en cada tubo. 2.1 ml de suero. . . Inmediatamente empezar el control de tiempo. . 3. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente.Al cumplirse los 60 minutos. ¿Cuál es la utilidad y el comportamiento en sus concentraciones de la AST en casos de infarto agudo de miocardio? Interprete y explique todo lo actuado en la práctica.65 Construir en papel semilogarítmico los valores de transmitancia en el eje vertical y en el eje horizontal las U/ml de AST 2) PROCEDIMIENTO DE LA MUESTRA (disponer de un tubo de ensayo): . .Agregar 0.Colocar 0.Obtener el valor de U/ml de AST a partir de la curva de AST de calibración.4 N Mezclar y dejar reposar por 15 minutos antes de la lectura. Haga un resumen de seis líneas sobre AST.Incubar a 37 ºC durante 5 minutos. CUESTIONARIO: 1. .Agregar 5 ml de Na OH 0.5 ml de reactivo de color.Incubar a 37 ºC durante 60 minutos. IV. según instrucciones previas. exactamente. . agregar 0.

una causa pueden ser las hemoglobinopatías por defecto en la síntesis de una de las cadenas (talasemias) o de cambios en la estructura de una de las subunidades por mutaciones que cambian un aminoácido por otro como en la hemoglobina S. por diferentes causas.66 REUNION DE LABORATORIO N° 12 PRACTICA N° 26 CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA I. utilizando el método enzimático de determinación de hemoglobina. que puede tener también otras causas como la Policitemia Vera La OMS basa su definición de anemia en la concentración de hemoglobina. Standard de Hemoglobina. cuya función es el transporte de oxígeno. menor de 13 g/dl. Pero la hemoglobina puede también disminuír por pérdida de sangre como en las hemorragias o por hemólisis (anemias hemolíticas). da lugar a las diferentes tipos de porfirias. En la hipoxia por altura por otro lado se produce aumento de su síntesis llevando a la policitemia. que termina con la adición del hierro por la ferroquelatasa. que es sin duda uno de los exámenes más solicitados. II. INTRODUCCION: La hemoglobina es una hemoproteína. con dos subunidades alfa y dos beta. de modo que en mujeres se considera si esta es menor de 12 g/dl y en varones. La concentración normal es de 12 a 14 g/dl en mujeres y de 14 a 16 g/dl en varones en nuestro medio y a nivel del mar. En este último grupo. que también puede deberse a problemas en la maduración de los glóbulos rojos como la deficiencia de ácido fólico. La disminución de la síntesis de hemoglobina. REACTIVO MATERIAL Y EQUIPOS Tensioactivo/CNX: ampollas autorrompibles conteniendo solución estabilizada de tensioactivo/CNX. Hemoglowiener reactivo Tubos de vidrio Lancetas Pipetas ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: COMPONENTES STANDARD hemogloWiener Reactivo 5 ml Con pipeta limpia y seca. tetramérica. El defecto enzimático en algunas de las etapas de síntesis del grupo Hemo. . en niños existe variación con la edad. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración de hemoglobina en sangre de personas normales. produce disminución de su concentración dando lugar a la anemia por menor producción como en la anemia ferropénica. Buffer/Ferricianuro: comprimidos estabilizados de ferricianuro de potasio y buffer de fosfatos. agregar: hemogloWiener Standard 20 ul DESCONOCIDO 5 ml ----Armar el siguient e sistema: III. Se sintetiza en la médula ósea por una vía común a la síntesis de porfirinas. En la práctica médica es por ello importante determinar la concentración de la hemoglobina.

Mujeres: 11. indicando sus aminoácidos importantes en cada polipéptido.0 g/dl .0 g/dl IV. Mezclar y luego de 3 minutos leer en espectrofotómetro a 540 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520 -550).67 Muestra (sangre total) ----20 ul Medir primero el Standard y luego usar la misma micropipeta. Haga un esquema con la estructura de la hemoglobina. Interprete y explique el procedimiento de la práctica. enjuagando tres veces en el propio reactivo antes de agregar cada muestra. CUESTIONARIO: 1. Qué es la anemia.Hombres: 13. Una anemia importante es la anemia de células falciformes: Haga un resumen de las causas de su etiología y su patogenía. Cuál es la más frecuente y cuántos tipos de anemia conoce. el número de ellos y las interacciones del ión Fe++ dentro del grupo hemo.0 ± 16. 2. 3. 4. llevando el aparato a cero con Reactivo CALCULO DE RESULTADOS: Hemoglobin a (g/dl) ! D v factor factor ! Standard (g/l) S VALORES DE REFERENCIA: .0 ± 18. .

o en las enfermedades extrahepáticas obstructivas. por el método enzimático de determinación de bilirrubina.Desarrollador o solvente . II. Luego de 5 minutos. Cada gramo de hemoglobina degradada origina 35 mg de bilirrubina. La hemoglobina es liberada y se separa la globina del hem. que es finalmente excretada con la bilis al intestino por un proceso de transporte activo. excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos. . habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta. sólo reacciona después de agregar alcohol a la mezcla. éste es convertido en biliverdina y luego en bilirrubina. que no se excreta por orina.Reactivo sulfanílico . La bilirrubina indirecta o no conjugada llega al hepatocito y se separa de la albúmina. Si lee antes. La concentración sanguínea de bilirrubina total es de 1 mg / dl.5 ml ----Desarrollador --------2. donde el defecto limitante es la excreción. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total de las fracciones de bilirrubina en el suero o plasma de personas normales y con ictericia. REACTIVOS . al cabo de la cual son destruidos en el sistema retículo endotelial. INTRODUCCION: Los hematíes tienen una vida media de 120 días.Bilirrubina Standard. hepático y post hepático.Nitrito de Sodio . La hiperbilirrubinemia puede ser a predominio de la bilirrubina no conjugada como en las anemias hemolíticas o en los defectos congénitos de conjugación. La manifestación clínica más importante de las hiperbilirrubinemias es la ictericia. que varían con la edad de presentación y también en cuanto a su gravedad La bilirrubina directa da una reacción inmediata con el diazorreactivo. por el método de Malloy Evelyn. llevando el aparato a cero con agua destilada. leer en espectrofotómetro a 530 nm o fotocolorímtero con filtro verde (520-550 nm). Directa Bil.68 CUANTIFICACION DE BILIRRUBINAS SERICAS I. se convierte en una forma soluble.5 ml Reactivo Sulfanílico 200 ul --------Diazorreactivo ----200 ul 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión.5 ml 2. Si se lee después. Total Muestra (suero) 200 ul 200 ul 200 ul Agua destilada 2.Diazorreactivo: Mezclar: 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo sulfanílico. y el origen de esta alteración obedece a causas de origen pre hepático. da color a las heces y ultrafiltra el glomérulo. denominada bilirrubina directa o conjugada. siendo en su mayoría bilirrubina indirecta. que utiliza el diazorreactivo de Erlich. después de un proceso de captación y conjugación con dos moléculas de ácido glucurónico por la enzima bilirrubina glucuronil transferasa. . la indirecta. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total y de las fracciones (bilirrubina directa e indirecta) en el suero de personas normales. habrá III. Este pigmento insoluble en agua es transportado unido a la albúmina. o de la bilirrubina conjugada en las hepatopatías. ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Bil.

Abs Blanco.Bilirrubina Directa VALORES DE REFERENCIA: . 2. Por qué? .Adultos: o Directa: hasta 2 mg/l o Total: hasta 10 mg/l IV. Bil. ¿Cuál es la acción bioquímica que realiza cada uno de los reactivos utilizados en la práctica? 5. Directa . ¿Cuáles son las principales causas de hiperbilirrubinemia no conjugada? 3.Abs. CUESTIONARIO: 1. Blanco) x F Bilirrubina Directa (mg/l) = Abs. B. ¿Cuál es el riesgo de aumento de bilirrubina no conjuda en el recién nacido? 6. total . ¿Cuáles son las causas de hiperbilirrubinemia conjugada? 4. ¿Cuál es el comportamiento de las bilirrubinas en caso de una insuficiencia hepática.) x F Bilirrubina Libre (indirecta) = Bilirrubina total .69 sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre CALCULOS: Bilirrubina total (mg/l) = (Abs. Elabore un esquema con los tipos de ictericia que se pueden producir durante el metabolismo de la bilirrubina.

La cantidad de uratos excretados varía normalmente de 250 a 750 mg / 24 hrs. REACTIVOS A UTILIZAR. Un adulto normal produce unos 500 mg de ácido úrico por día. Al pH sanguíneo predomina la forma desprotonada o urato. en alcalinidad. del grado de eliminación de ácido úrico. el pH ácido favorece la formación de ácido úrico no disociado y puede precipitar. a pH menores predomina la forma protonada no disociada o ácido úrico. que es el más común de los desórdenes del metabolismo de las purinas. más frecuente en hombres.5 ml 2. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento . Standar: solución de ácido úrico 100 mg/dl Uricasa: solución de uricasa mayor o igual a 3U/I Reactivo 4-AF/POD: frasco conteniendo más de 100 U de peroxidasa (POD). cantidad que puede incrementarse con una dieta rica en purinas. llevando el aparato a cero con el blanco. diferencia que desaparece después de los 45-50 años de edad. III. En condiciones patológicas. la uricemia se incrementa después de la ingestión de nucleoproteínas con los alimentos. policitemias. los que se degradan y en un primer momento liberan los ácidos nucleicos de las proteínas.Muestra: suero o plasma heparinizado . o urea.5 ml Mezclar suavemente e incubar 15 minutos en baño de agua a 37 °C o 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). Aproximadamente 80 % de esa cantidad es excretada por orina. Retirar. En el hombre.5 ml 2. el resto se degrada y es eliminado como CO2 y NH3. por otro. En las alteraciones renales severas son comunes los niveles altos de ácido úrico como resultado de una excreción disminuida. También existe hiperuricemia proveniente de la destrucción excesiva de células (material nuclear) en leucemias y linfomas. la concentración de ácido úrico en suero o plasma depende de un neto balance entre el grado de síntesis de purinas y fraccionamiento de nucleoproteínas por un lado y. S (Standard) y D (Desconocido). ocurre lo contrario. etc. INTRODUCCION: El ácido úrico es un producto de la degradación hepática de las bases nitrogenadas purínicas adenina y guanina.En tres tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas marcadas B (Blanco). La presente práctica tiene por finalidad cuantificar las concentraciones séricas de ácido úrico en personas adultas normales y / o con alteraciones patológicas mediante el procedimiento químico de Folin-Dennis que se basa en la acción reductora del ácido úrico en medio alcalino sobre el ácido fosfotúngstico. Los varones tienen niveles 1 mg/dl más altos que las mujeres. Como sucede con otros constituyentes séricos. que circulan en la sangre (en el plasma y en los glóbulos rojos humanos) y es la orina su vía de excreción. enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm). En el plasma. Reactivo de fenol. colocar: B S D Standard 50 ul Muestra 50 ul Reactivo de trabajo 2. . podemos encontrar concentra ciones incrementadas de ácido úrico sérico en la gota. el ácido úrico alcanza una concentración de 4 a 6 mg/dl.70 PRACTICA N° 27 CUANTIFICACION DEL ACIDO URICO SERICO I. En orina. II.

¿Cómo explica el uso del alopurinol en el tratamiento de la gota? ¿Cuál es el proceso de la artritis y de la formación de los tofos en la gota? Explique por qué existe hiperuricemia en las enfermedades de leucemia. con ingesta normal de proteínas. 6. 2. IV. incluso se ha observado una variación estacional. 4. Cómo se sintetiza el ácido úrico. el sexo y las diferentes dietas. . 3. Cuál es la fisiopatología de las hiperuricemias. Señale la deficiencia parcial enzimática que ha sido encontrada en algunos pacientes con gota.71 - CALCULO DE RESULTADOS: Acido Urico (mg/dl) ! D v f donde " f " ! 100 mg/dl S - VALORES DE REFERENCIA: En adultos normales. 5. se observan los siguientes rangos de valores: Hombres: 26-60 mg/l Mujeres: 20-50 mg/l Los valores de ácido úrico varían de acuerdo a la edad. Y dónde se realiza esta síntesis. CUESTIONARIO: 1.

La cantidad eliminada por las personas del sexo masculino generalmente es más grande que en las de sexo femenino. Elevadas concentraciones se producen solamente cuando la función renal está muy alterada y aunque el mismo tipo de información acerca del diagnóstico y pronóstico se obtiene por la determinación de nitrógeno ureico o creatinina. como las glomerulonefritis o la nefropatía diabética o post renal. La concentración de creatinina en suero no es afectada por la dieta. Es excretada fundamentalmente por el riñón el cual clarifica el plasma de creatinina. La determinación de hace de ordinario en un filtrado libre de proteínas obtenido a partir del suero. La determinación de creatinina tiene utilidad en la práctica médica para la evaluación de la función renal. mientras que en eritrocitos sólo corresponde a un 40%.0 mol/l . las variaciones fluctúan entre 0. catabolismo de proteínas. 9 . aunque una pequeña cantidad pre formada es ingerida con los alimentos. El suero es depurado de creatinina en el riñón por filtración glomerular proporcionando una buena base para el test de clearance.16 mmol/l . Aproximadamente 2% de la creatina fosfato muscular es convertida en creatinina diariamente. siendo la producción endógena constante. ya que los niveles de creatinina sérica dependen del grado de excreción. II. aumenta en el cuerpo humano fundamentalmente por síntesis. La creatinina urinaria disminuye en la insuficiencia renal y es útil para medir el grado de filtración glomerular y lo poco que es transferido a través de las células tubulares.Standard: Solución de creatinina 2 mg/l.Reactivo 1: Hidróxido de sodio 0. precursora de la creatinina. La creatinina es un constituyente habitual de la orina. hace remarcable la necesidad de usar suero y no sangre total para la determinación de creatinina por el método colorimétrico. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento III. El clearence de creatinina normal es mayor de 100 ml / min.5 a 1. edad. la cual puede alterarse por diversas causas. sexo o ejercicios. y es excretada en una cantidad casi constante.5 g/24hs. Esto. La concentración normal en suero varía de 0. renal.72 REUNION DE LABORATORIO N° 13 PRACTICA N° 28 DETERMINACION DE CREATININA SERICA EN PERSONAS SANAS Y NEFROPATAS I. esta última determinación se prefiere porque proporciona mayor información relacionada con el estado de la función renal. como las uropatías obstructivas La creatinina en medio alcalino reacciona con el ácido pícrico para dar un tautómero de picrato de creatinina de color anaranjado (reacción de Jaffe).Reactivo 2: Acido pícrico 4. La creatininuria es determinada mediante el método enzimático. las que pueden ser de origen pre renal como el shock o la insuficiencia cardíaca. . La creatina fosfato se forma en los miocitos y es un compuesto importante como fuente de energía en la contracción muscular.1. . REACTIVOS A UTILIZAR.4 mg /100 ml. la cantidad total depende de la masa muscular. La creatinina es fácilmente difusible y es igualmente distribuida en el agua corporal. INTRODUCCION: La creatina. Usando métodos enzimáticos para determinar específicamente creatinina y comparando con los valores obtenidos por la reacción de Jaffe en personas normales y nefriticos se encuentra que la creatinina verdadera del suero comprende aproximadamente un 90% del total.

Mezclar.1 mg/dl 0.9 ± 1. su determinación. A que se denomina clearence de creatinina y que importancia tiene. M (Muestra) Componentes Blanco Standard Muestra Reactivo 1 1000 ul 1000 ul 1000 ul Muestra --------50 ul Standard ----50 ul ----Mezclar.73 m2 98 ± 156 ml/min/1.6 ± 1. 5.3 mg/dl 11 ± 20 mg/kg/d 14 ± 26 mg/kg/d 95 ± 160 ml/min/1. Incubar 5 minutos a 20-25 °C/30 °C/37 °C.73 PROCEDIMIENTO En caso de que la muestra a utilizar sea en suero.73m2A ! mgcreatinina mlOrinav mlorina/24h mgcreatinina ml suerov 1440 /100 VALORES REFERENCIA: DE SUERO/PLASMA: Mujeres Varones ORINA: Mujeres Varones Clearance de Creatinina: Mujeres Varones IV. Incubar exactamente por 2 minutos y leer A2.73 m2 . 3. Haga dibujos del procedimiento. luego agregar: Reactivo 2 250 ul 250 ul 250 ul Llevar el espectrofotómetro a cero con el blanco. En tubos de ensayo marcados B (Blanco). Explique por qué se incrementa la creatinina en tres estados patológicos que conozca. S (Standard). CALCULOS: ¨A Muestra (A2-A1) y ¨A Standard (A2-A1) CALCULOS: SUERO/PLASMA : ¦ ¦ Creatinina(mg/dl)! ORINA : Creatinina(mg/dl)! Standard(mg/dl)A v? A Standard A Muestra A Muestra CLEARANCE DE CREATININA : /100 ?mg/min/1. ¿Qué información o presunción obtiene al dosar la creatinina sérica? ¿Por qué se prefiere la determinación de creatinina urinaria a la de nitrógeno ureico? Interprete y explique el procedimiento de la práctica. 2. Incubar 1 minuto a 20-25 °C y leer A1. ¦ ¦ Standard(mg/dl)Av 50 v? A Standard 0. CUESTIONARIO: 1. 4.

Solución standard III. es convencionalmente reportado co nitrógeno ureico. La urea en el plasma es filtrada por los glomérulos renales. Cuando el nitrógeno ureico es determinado por el método de la ureasa. La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoniaco. .00 1.00 1. II. es excretado casi enteramente por los riñones. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento PROCEDIMIENTO Componentes Blanco Standard Desconocido Muestra (ml) --------0. La or importancia clínica de la urea viene del hecho de una elevada concentración sanguínea puede estar asociada con una mala función renal. . Normalmente no tiene función útil en el organismo. Las concentraciones de urea en sangre total.4665 = Nitrógeno ureico sanguíneo Los riñones eliminan diariamente entre 20 a 40 gramos de urea. pero en condiciones normales aproximadamente el 40% de este filtrado regresa p difusión a la sangre. Este método es altamente específico y aunque está basado en reacciones de urea. ésta transforma a la urea en carbonato de amonio y con la adición del reactivo de Nessler el amoníaco liberado forma un compuesto de color amarillo bruno cuya intensidad se mide en fotocolorímetro.Reactivo hipoclorito. La uremia es determinada colorimétricamente por el uso de ureasa. Los valores de urea se mo reportan siguiendo la siguiente fórmula: Nitrógeno ureico sanguíneo x 2.00 1. suero o plasma. conociendo los valores de urea. La finalidad de la presente práctica es cuantificar la uremia por el método de la ureasa. REACTIVOS A UTILIZAR. .14 = UREA En sentido inverso. o 3 minutos a 37 °C.00 Incubar 5 minutos a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C). .Reactivo de salicilato. INTRODUCCION: La urea es sintetizada en el hígado. Agregar a cada tubo: Reactivo hipoclorito (ml) 1.74 PRACTICA N° 29 CUANTIFICACION DE UREA EN SANGRE I. La concentración de la urea en la corriente sanguínea es el resultado del balance entre el grado de degradación de las proteínas y el grado de eliminación por los riñones.01 Standard (ml) ----0.00 Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente (20 a 25 °C) o 5 . El grado de azoemia depende de la extensión y tipo de lesión renal. es el principal producto final del catabolismo de las proteínas y se distribuye en todos los tejidos. éste reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimétricamente.Suspensión de ureasa. Los valores normales de urea en suero (como nitrógeno ureico sanguíneo o BUN) es de 9 ± 19 mg/100 ml. son muy similares.00 1.01 ----Reactivo de trabajo (ml) 1. en personas normales y / o con procesos patológicos. se informa el BUN según la siguiente fórmula: Urea x 0.

Señale las características comunes que se encuentran en los efectos enzimáticos hereditarios del ciclo de la úrea. Leer las absorbancias dentro del plazo de una hora CALCULOS: FACTOR ! 66 Absorbancia Standard Urea (mg/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: SUERO/PLASMA: Urea : Nitrógeno Ureico ORINA: Urea : Nitrógeno Ureico IV. 5.7 mg/dl 7 a 14 g/24 hrs. ¿Qué alteraciones en las concentraciones séricas de úrea y NH4+ podrían encontrarse en el coma hepático? ¿Cuál es la importancia metabólica de la existencia del ciclo de la ornitina en el hígado de los seres humanos? ¿Cuál es la importancia metabólica que en el hígado humano exista una relación entre el ciclo de los ácidos tricarboxilicos y el ciclo de la ornitina? 10 a 50 mg/dl : 15 a 30 g/24 hrs. 3. 6. 4. ¿Qué importancia clínica tiene para usted. .75 minutos a 37 °C. conocer las concentraciones séricas de úrea? ¿Qué influencia tiene la ingesta proteica sobre la concentración sérica de úrea? En relación a las concentraciones séricas de úrea y NH4+.5 a 22. 2. CUESTIONARIO: 1. : 4.

.Acido tricloroacético al 10% .76 PRACTICA N° 30 DEMOSTRACION DE LOS PROCESOS DE DESAMINACION OXIDATIVA DE LOS L-E-AMINOACIDOS I. La presencia de estos cetoácidos se debe fundamentalmente a los procesos de transdesaminación y desaminación del ácido glutámico (transdesaminación) que se estimula fundamentalmente y en mucha menor proporción por desaminación de la L-Alanina por la acción de la L-aminoácido.NaOH: solución 2N . Puesto que la alanina es también sustrato para la reacción de glutamato transaminasa. Filtrar y medir a otros tubos previamente marcados: .2M .5 III 4.5 1.0 0. .0 0.5 1.0 0. Añadir ácido tricloroacético al 10% Mezclar y añadir agua destilada I 4.2-4-Dinitrofenilhidrazina: solución 0.5 TUBOS DE ENSAYO II 4. Si se agrega una determinada cantidad de L-alanina a un homogeneizado de hígado después de un período de incubación (30 minutos) podemos demostrar que se ha producido desaminación si encontramos determinada cantidad de cetoácidos (ácido pirúvico y ácido alfa-cetoglutarato) los que pueden ser identificados frente a una solución de 2-4 Fenihidrazina en medio alcalino.Buffer fosfato 0. Dos sistemas enzimáticos de transaminación: la alanina piruvato transaminasa(ALT) y la glutamato alfa-cetoglutarato transaminasa (AST) catalizan la transferencia de grupos amino de la mayor parte de los aminoácidos para formar alanina a partir del piruvato o glutamato a partir de alfa-cetoglutarato.1M pH 7. II. La finalidad de la práctica es demostrar los procesos de desaminación (oxidativa o no) que sufren los L aminoácidos en el hígado utilizando a la L-Alanina como un ejemplo de éstos y al 2-4 Dinitrofenilhidrazina como indicador de los cetoácidos formados provenientes de la desaminación.0 1.1 M pH 7.L-alanina: solución 0.0 3.4 Solución L-alanina 0.5 III.4 .Homogeneizado de hígado o riñón de rata 10% y conservado en baño helado.0 1.0 3. todo el nitrógeno amino proveniente de los aminoácidos que puede experimentar transaminación se puede concentrar en el glutamato.0 1.0 3.2M Agua destilada Homogeneizado de hígado Colocar en baño maría a 37°C durante treinta minutos. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente esquema de incubación: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0. INTRODUCCION: La remoción del grupo amino de las L-aminoácidos es el primer paso en la degradación metabólica general de estos compuestos (catabolismo). Esto es importante porque el L-glutamato es el único aminoácido en el hígado que experimentan desaminación oxidativa a una tasa apreciable y esta reacción se cataliza por la L glutamato deshidrogenasa.1% en HCl 2 N. REACTIVOS A UTILIZAR.5 1.

0 Señale los sistemas enzimáticos flavinodependientes que producen desaminación oxidativa de los aminoácidos. De un ejemplo de desaminación oxidativa de un aminoácido.0 4. IV.0 4. CUESTIONARIO: 1 2 3 4 5 6 I 4.0 1. de los resultados de su práctica de laboratorio? .77 COMPONENTES (ml) Filtrado 2.0 1. NaOH 2N Dejar en reposo durante 10 minutos.0 TUBOS DE ENSAYO II 4. ¿Cuál es la razón por la que se utiliza 2.0 III 4.0 4.4-Dinitrofenilhidrazina en el sistema? ¿Cómo explica usted los resultados fotocolorimétricos obtenidos en los tres diferentes tubos de experimentación del sistema? ¿Cuál es la importancia biológica de la desaminación oxidativa de los aminoácidos? ¿Qué conclusiones puede establecer usted.4-Dinitrofenilhidrazina solución al 1% Mezclar y dejar en reposo durante veinte minutos.0 1. Realizar las lecturas con el espectrofotómetro.

Para ello es necesario que los. Se estima que una ingestión diaria de 2. la hipófisis y el ojo son espacialmente ricos en vitamina C.5 mg para adultos es suficiente para prevenir síntomas de deficiencia. PROTEICOS. alimentos antes del cocimiento contengan 70 mg de vitamina C.5 y 1. El principal resultado de tal deficiencia es el escorbuto. Antes de la intervención quirúrgica las cifras plasmáticas inferiores de 0. INTRODUCCION: La vitamina C o ácido ascórbico es hidrosoluble y antiescorbútica.2 mg/100ml o en glóbulos blancos a 8 mg/100 g indican una deficiencia importante que puede significar cicatrización tardía o dehiscencia de las suturas.1 gm/100ml y en glóbulos blancos menos de 2 mg/100 g. Ciertas células sin vitamina C no son capaces de producir o mantener sustancias de importancia intracelular.78 V UNIDAD NUTRICION: REQUERIMIENTOS ENERGETICOS. En el escorbuto no tratado.5 mg de ácido ascórbico para niños y 7. lesiones en las encías y ligera anemia. dolor de las extremidades. La corteza suprarrenal. Se necesita también para la producción normal de fibrinas del tejido conectivo y de la sustancia del baso intercelular (por ello el aumento de fragilidad capilar en el escorbuto). hemorragias subcutáneas y sangrado de encías.2 mg/100ml. En caso de alimentación deficiente. Se presenta en alimentos frescos y en vegetales. Las intervenciones quirúrgicas dan lugar a disminuciones de 17 a 20% de contenido en el plasma y en glóbulos blancos. Un excelente test clínico para la deficiencia de vitamina C es la determinación del promedio de resistencia capilar.ácido dehidroascórbico). Los síntomas son vagos y generalmente limitadas alteraciones del crecimiento de los dientes. Las necesidades mínimas diarias de vitamina C son 10 mg y son preferibles 30 mg por día. el nivel plasmático de ácido ascórbico es inferior de 0. Aunque no se conoce con seguridad sus funciones metabólicas precisas hay pruebas que señalan su requerimiento para el metabolismo de la tirosina . Muchas de estas propiedades podrían depender de las propiedades reversibles de óxido reducción (redox) de esta vitamina (ácido ascórbico . VITAMINAS Y MINERALES REUNION DE LABORATORIO N° 14 PRACTICA N° 31 DOSAJE DE VITAMINA ³A´ El instructivo de la presente práctica se les proporcionará durante la práctica respectiva. Los nivelas ² plasmáticos en una población bien alimentada varían entre 5. En los leucocitos la concentración es mucho mayor que en el plasma (15 mg/100 g) de capa blanca leucocitaria. PRACTICA N° 32 DOSAJE DE VITAMINA ³C´ I. La única acción en el cuerpo es debido principalmente a que es una clase especial de agente reductor que influye en los procesos de óxido reducción. Casos subclínicos de deficiencia de vitamina C son muy comunes entre la población pobre de las grandes ciudades. Esto puede ser hecho con un simple aparato para medir la presión sanguínea con la cual la presión dentro de los capilares se incrementa por la constricción de . La vitamina C es destruida rápidamente por el calor de cocimiento o la pasteurización. una enfermedad caracterizada por debilidad. el escorbuto clínico tarda 6 meses en manifestarse.

y Los valores inferiores a 0.1 mil de la solución de sulfato cúprico. el acide dehisroascórbico se transforma rápidamente en ácido dicetoglucónico que se une a 2 dinitrofenilhidracina -4 para formar una hidrazona de color pardo.4 dinitrofenilhidracina. CÁLCULOS: Abs. Para la determinación del ácido ascórbico en sangre. esta debe ser fresca (no después de 30 min. El ácido ascórbico es estable durante varias horas en el filtro. enfriando el hielo. Se prepara en el mismo dia de uso.5 0. y Oxalato de litio al 6. y Leer en fotocolorimetro (540 nm). y Solución de tioúrea al 10% en etanol al 50%. Del Standard .5 = mg/dl Abs.5 0. 0. Se utilizará el método de Roe y Kutcher modificado para la cuantificación del ácido del ácido ascórbico en sangre. total o plasma. y Acido sulfúrico al 85%. . y Reactivo de color. y Solución de sulfato cúprico al 1. La excreción normal diaria de vitamina C en orina de adultos varia entre 10 y 30 mg. REACTIVOS A UTILIZAR: y Acido tricloroacético al 10& (P/V). Mezclar: COMPONENTES (ml) TUBOS Liquido sobrenadante de paso anterior Acido tricloroacético al 10% Standard de ácido ascórbico. y Agregar 1. Absorbancia se compara con patrones adecuados de ácido ascórbico.4 - y Se mezclan los reactivos. y Standard de ácido ascórbico 2 ml/100ml.Blanco x 2. Transcurrido el tiempo se enfrian los tubos en baño de hielo durante 5 minutos. por el método colorimétrico de Roe y Ructher modificado. y 0. y Dejar los tubos en reposo por 30 min. y Reactivos 2. Por 6'ste procedimiento el ácido ascórbico del plasma o sangre es oxidado a ácido dehidroascórbico.6 ml de agua destilada. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento y Extraer más o menos 5 mi de sangre de la flexura del codo e introducirlos en frascos previamente oxalatados. mezclando: 5 ml del reactivo 2. Del problema .1 de la solución tioúrea. y El ácido ascórbico utilizado para preparar la solución patrón debe ser de grado analítico. y Agregar a cada tubo lentamente y mezclando.). se tapan en tubos con papel parafinado y se colocan en baño de agua a 56°C durante una hora.4 III 0. Por ello es indispensable separa el plasma de ids glóbulos rojos y realizar el análisis sin tardar.4 0.5 0. En un pH ácido. y Mezclar nuevamente. El propósito de la siguiente práctica es determinar la concentración de ácido ascórbico en el plasma de personas adultas normales o carenciales. Agua destilada Reactivo de color combinado I II 1 0. Esta sufre rearreglo molecular en ácido fuerte dando un compuesto rojo.4 dinitrifenilhidracina al 2% en ácido sulfúrico 9 N. 2 mi de ácido sulfúrico al Q5°o.2 mg/dl pueden preceder en 2-3 meses a la aparición de un escorbuto clínico. II.5% III.5 0.79 la vena del brazo.5%. Hemorragias que en la piel aparecen con excesiva frecuencia podrían indicar fragilidad capilar.Blanco NOTA: y El ácido ascórbico es muy inestable.

80 IV. CUESTIONARIO 1. Desde el punto de vista metabólico ¿Cómo explica que los requerimientos de vitamina C sean mayores en el curso de las enfermedades infecciosas. embarazo. ¿Qué relaciones metabólicas podría mencionar entre el ácido fólico y Fe+++ en la producción de anemia en el escorbuto? 3. lactancia e intervenciones quirúrgicas? 4. ¿Por qué las necesidades de vitamina C deben ser satisfechas en la dieta normal? 2. Mencione algunas funciones metabólicas importantes del ácido ascórbico. hipertiroidismo. . ¿Cómo explicaría que las dosis superiores a 1 g/dia pueden ocasionar hemolisis en portadores de deficiencia eritrocitica de G-6-P-deshidrogenasa? 5. neoplasias.

REACTIVOS A UTILIZAR: Buffer ácido: buffer acetato pH 4. hidroxilamina clorhidrato. De la misma manera. fiebre reumática. II. hidroxilamina clorhidrato. Prácticamente todo el hierro corporal se encuentra unido a proteína. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm . su disminución se asocia entre otras patologías a problemas de absorción y almacenaje. dado que no sólo es relativamente insoluble. El 90 % de anemias en las mujeres es por deficiencia de Fe. que se encuentra en la hemoglobina.5 2.0. y el circulante. etc. Solución Standard: Fe (II) en hidroxilamina clorhidrato 500 ug/dl III. defectos en el mecanismo de almacenaje. El hierro es absorbido en el intestino delgado como Fe2+ y su regulación ocurre a ese nivel y es transferido a la transferrina para su transporte sérico. Buffer alcalino: buffer TRIS pH 8.50 0. El hierro forma parte de los centros Fe-S de la cadena respiratoria. lo que lleva a la disminución de la ferritina sérica  Disminución de hierro sérico. INTRODUCCION: El hierro sérico es importante en el organismo porque es componente esencial de la hemoglobina encargada del transporte de oxígeno. sino que además es tóxico. aumento de Capacidad Total de Fijación de Hierro y disminución de la Saturación de Hierro  Anemia por deficiencia de hierro: microcítica hipocrómica.81 REUNION DE LABORATORIO N° 15 PRACTICA N° 33 DETERMINACION DE HIERRO SERICO TOTAL Y TIBC I. etc.50 Reactivo color (ml) ----0. dado que un aumento en sus niveles se encuentra asociado a diversas patologías tales como destrucción aumentada de los glóbulos rojos. El contenido de hierro en el cuerpo humano se encuentra distribuido en tres formas: el almacenado. el hierro en uso. etc. La deficiencia de hierro pasa por tres estadios:  Deficiencia de los depósitos de hierro.y la mioglobina.5 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) --------Muestra (ml) 0. que se encuentra dentro de las células. La evaluación de la concentración de hierro sérico es de gran utilidad.0 Reactivo color: ferrozina. La capacidad de fijación de hierro (TIBC) aumenta en casos de anemias ferroprivas y disminuye en las hemocromatosis. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACION DE HIERRO Armar el siguiente sistema Componentes Blanco (suero) Muestra Buffer Acido (ml) 2. enzimas y varios tipos de proteínas. tumores.05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos. así como de otras hemoproteínas como los citocromos ± componentes de la cadena respiratoria.

2.Reactivo v 500 Abs.50 0.standard Abs.Muestra Abs.Bl. 3.50 Reactivo color (ml) ----0.Bl.Standard Abs.00 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) 0. 5. CUESTIONARIO: 1.muestra % Saturación! Ferremia (ug/dl) TIBC (ug/dl) Valores de Referencia: TIBC: Hasta 6 años Sobre 6 años % Saturación IV.50 Muestra (ml) 0.160 ug/dl  Mujeres : 40-150 ug/dl DETERMINACION PARA TIBC (capacidad de fijación de hierro) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Muestra Muestra Buffer Alcalino (ml) 2.82 Cálculos: Ferremia (ug/dl) ! Valores de referencia:  Varones: 50 . Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm Calculos: UIBC (ug/dl) ! 500  TI v 500 Abs.Bl.05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos.Muestra Abs.muestra Abs.Bl.00 2.50 0. 4.reactivo Abs. : : : 100 ± 400 ug/dl 250 ± 400 ug/dl 20 ± 55 % Señale al menos 5 funciones del hierro Causas de deficiencia de hierro Informe sobre estructura de la ferritina ¿Qué exámenes solicitaría para evaluar la deficiencia de hierro? ¿Qué importancia tiene medir la saturación de hierro? ©¨ § (ug/dl) ! Ferremia(ud/dl) I (ug/dl) ©¨ v 100 .

Armar el siguiente sistema: COMPONENTES ESTANDAR PROBLEMA Estándar diluido 20 ul --Suero diluido --20 ul Reactivo de color 1 ml 1 ml Mezcla. En el suero normal el cloruro se encuentra en concentraciones que varían entre 100 y 106 mEqL. Medir en el transcurso de 60 minutos la absorbancia de problema y estándar. fiebre. 6) dieta alta en grasas o en ayuno prolongado el cloro es desplazado por los cuerpos cetónico por sobre producción de estos. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Antes de la determinación el estándar y las muestras de suero deben ser diluidas en relación 1/50 con agua destilada (20 µL de muestra/1 ml de agua).Estándar de cloruro: 355 mg/dl III. 3) enfermedad pulmonar.6 TPZ existente parcialmente como complejo Hg(II)+Sulfato de Hierro . REACTIVOS A UTILIZAR: . ansiedad. Este tipo de alcalosis que es de tipo respiratorio resulta por hiperventilación que puede ser causada a su vez por: a) drogas. igualmente sucede en el ClK. De todos los aniones es uno de los de más baja concentración en el líquido intracelular.83 PRACTICA N° 34 DETEMINACION DE CLORO. 4) enfermedad renal crónica. La concentración de cloruro se puede incrementar (hipercloremia) en muchos casos como resultado del déficit primario de C02. c) algunos tipos de enfermedad tubular renal con acidosis pueden producir incremento del cloruro sérico. todas estas alteraciones tienen exceso de C02 (que produce hipocloremia).Reactivo de Color 2. 2) parálisis de los músculos respiratorios. tensión de oxígeno disminuida (altura). Se puede presentar concentración de cloruro disminuido (hipocloremia) en hipoventilación causada por: 1) depresión del sistema nervioso central. d) excesiva ingestión de ClNH4 (cloruro de amonio) produce acidosis que puede ser seguida de altos niveles de cloruro sérico. INTRODUCCION: El ión cloro comprende aproximadamente el 65% del total de aniones del liquido extracelular. II. después de incubar 5 minutos a oscuras.4. 7) en hiper o en s hipofunción de las glándulas adrenales (corteza). 5) en la diabetes mellitus no controlada. SODIO Y POTASIO EN EL SUERO DE PERSONAS SANAS Y EN ESTADO PATOLOGICO DETEMINACION DE CLORO I. b) enfermedades que producen estímulo del centro respiratorio como: histeria. No exponer a la luz CALCULOS Lectura tandard   ! 355 v Lectura uestra ?mg/dlA  .

(Convertir en mEq/l dividiendo entre 3. la deficiencia acentuada del cloro en la enfermedad de Addison? 3. ¿Qué influencia tiene la Aldosterona en el metabolismo del cloro? 2. ¿Puede señalar cinco causas de hipercloremia? 4.55) IV. ¿Puede señalar cinco causas de hipocloremia? 5 ¿Cual es la relación de las alteraciones de la cloremia con el equilibrio ácido básico? . CUESTIONARIO: 1.84 VALORES NORMALES : 335 .383 mg/dl. ¿Cómo explicaría usted.

si el líquido ingerido es insuficiente por razones anormales. por ejemplo en pacientes con diabetes insípida no controlada. El ion sodio es ingerido en los alimentos en combinación con el cloro fosfato. en pacientes con diarrea. en diabetes mellitus no controlada. por peso corporal. En el hombre adulto hay cerca de 43 mEq de sodio intercambiable por kg. cuando el líquido ingerido no es suficiente para eliminar la sobrecarga de solutos por el riñón. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante: Acetato de uranilo más acetato de magnesio  Reactivo de color: tioglicolatop de amonio  Standard de sodio: 50 mmol/l . El estado clínico de hidratación es importante para evaluar el significado de los niveles séricos de sodio. hay por lo tanto un 82% del total que es capaz de recambio y participa en las reacciones fisiológicas. Un adulto de 70 kg de peso contiene aproximadamente 80 g de sodio de los cuales 44 se encuentra en el % líquido extra celular y el 35% en los huesos. El exceso de sodio se elimina por el riñón. Algunos pacientes con enfermedad cerebral. sudor y saliva. La concentración sérica es representativa de toda la concentración celular. El riñon puede regular la excreción de sodio y agua por lo tanto.85 DETERMINACION DE SODIO I. El suero o plasma contiene más del 90% del sodio total de la sangre. Como sucede con el agua corporal los valores varían inversamente con la grasa corporal. Diariamente y tiene acceso al suero por difusión a través de la mucosa intestinal o sea que cerca del 4% del sodio corporal total se recambia. En condiciones anormales pueden ser muy considerables las pérdidas de agua por el sudor u otr s o fluidos. sulfato y otros aniones (sales). Pequeñas cantidades aparecen también en las heces. La determinación del sodio de los fluidos biológicos se realiza sea por electrodo ión selectivo o menos frecuentemente por método colorimétrico II. tratado sólo con insulina y solución salina. Se observan concentraciones bajas si las concentraciones de sodio exceden a las del agua. pacientes con diarrea. alimentación nasogástrica con alto contenido de proteínas. Puede ocurrir deshidratación con sodio sérico elevado. Del total de sodio corporal hay un 18% que fundamentalmente se encuentra en los huesos. es el principal factor de regulación de este ion corporal y de sus concentraciones. y en niños es mayor. enfermedad renal con disfunción tubular. con pequeñas diferencias debido al equilibrio de Donnan. INTRODUCCIÓN Debido a la predominante concentración del ión sodio en el líquido extracelular éste influye sobre la presión osmótica que juega un rol preponderante en la distribución del agua entre el espacio extra o intra celular. como en el coma diabético. en mujeres hay sólo 39 mEq por kg. La cantidad presente dentro de la célula no puede ser medida sin biopsio del tejido. Tales valores no dan información acerca del volumen y distribución de la cantidad total presente ni de la cantidad intracelular existente. el sodio esta en equilibrio con el del líquido intersticial. En el suero. Son ingeridos cerca de 3 gr. La concentración sérica normal es de 135 a 145 mEq por L (310 A 340 mg%). El ión sodio es importante en el mantenimiento del equilibrio ácido básico ya que constituye aproximadamente el 90% del total de cationes extra celulares. fístula intestinal. Se puede encontrar incremento de sodio con hiperosmolaridad en individuos con deficiencia predominante de agua corporal. es aparentemente inerte (no ionizable).diariamente. El sodio se excreta casi exclusivamente en la orina.

Dejar reaccionar durante 5 minutos Agitar fuertemente por 50 segundos. Emplear el sobrenadante Precipitante 20 ul Sobrenadante 20 ul Standard Sobrenadante 20 ul Problema Reactivo de color 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar bien. incluye básicamente las concentraciones de esté ion? . Señale las concentraciones séricas normales. ¿Por qué la clasificación de deshidratación por alteración de la osmolaridad. 5. ¿Cuál es el principal factor de regulación del ion sodio corporal? 3. CUESTIONARIO: 1. Dejar reaccionar durante 30 minutos Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). Después de 5 a 30 minutos medir las absorbancias contra agua destilada a 405 nm CALCULOS: Factor: 150 /Lectura Bco Reactivo-Lectura Standard Na (mmol/l)= (Lectura Bco Reactivo-Lectura Muestra) x factor IV.86 III. ¿Cuál es la importancia biológica del ion sodio? 2. ¿Qué semejanza existe en la absorción intestinal de este ion y la glucosa? 4. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (PROCEDIMIENTO) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco de Standard Problema Reactivo Standard 20 ul Problema 20 ul Precipitante 1 ml 1ml Tapar los tubos y mezclar cuidadosamente.

en hiperfunción adrenocortical o sobredosis de cortisona o ACTH.9 mEq/L. Aproximadamente 293 gr. Excesiva cantidad de potasio puede liberarse del cuerpo bajo dos condiciones: primero cuando las secreciones intestinales con su contenido relativamente alto de potasio. Bajo estas condiciones el potasio se eleva si el riñon no puede excretar esta sobrecarga. diarrea o fístula gastrointestinal segundo por excreción urinaria incrementada en individuos con anormalidades tubulares renales. en mujeres solamente 40 mEq por kilogramo de peso. esto es debido a que la excreción de potasio por orina se mantiene constante. Del sue el ro potasio es transferido el líquido intersticial antes de penetrar a las células o al filtrado glomerular a través de la membrana de los capilares glomerulares del riñón. El déficit de potasio celular es reflejado en los hallazgos séricos y bajo estas condiciones la regla es hipopotasemia debido a la elevada excreción urinaria de cloruro de potasio. Se produce hiperpotasemia con pérdida intracelular de potasio cuando la permeabilidad de la membrana celular está alterada por lesión tisular. Déficit de potasio corporal puede resultar en: Pobre ingestión de alimentos. en la diabetes no controlada. influye activamente en el metabolismo celular ya que es cofactor de muchas reacciones enzimáticas intercelulares. asi mismo en algunos casos de insuficiencia renal se encuentra elevada la concentración de potasio. en recién nacidos los niveles son algo más altos. así mismo en algunos casos de . La concentración de potasio en el suero de personas normales es de 3. Existe también una pérdida lenta de potasio de los glóbulos rojos hacia el suero cuando la sangre permanece guardada. De potasio en forma de sal son ingeridos diariamente y recambiados con el potasio corporal. Se debe evitar la hemolisis en la toma de muestras de sangre porque el potasio puede ser liberado de los eritrocitos lisados. En los niños donde la ingestión de potasio es relativamente más grande. en alcalosis con hiperventilación.87 DETERMINACION DE POTASIO I. Bajo condiciones de incremento de pH (alcalosis) asociado con la disminución de cloruros. la excesiva destrucción de células del cuerpo y la utilización de proteínas para propósitos calóricos se acompañaría de pérdida de potasio celular. son perdidos a través del vómito.5 -5-3 mEq/L. en intoxicación temprana con salicilatos. cerebro y de los glóbulos rojos se recambia más lentamente que en otros órganos. pues la falta de esferoides adrenales provocan retención de potasio sérico. en íleo paralitico y anastomosis intestinal no funcionante. El potasio es rápidamente removido del líquido extracelular después que es ingerido. Los niños tienen relativamente menos contenido de potasio por kilogramo de peso debido a que la relación de agua intracelular/extracelular es menor que en adultos. se produce intercambio entre el sodio intersticial y el potasio intracelular. Hiperpotasemia se puede encontrar en: Shock o falla circulatoria de cualquier causa. en insuficiencia de la corteza adrenal. Existe aproximadamente 130 gr. el potasio es liberado de las células y excretado dando como resultado hipopotasemia. Entonces el 2<26 del total del potasio corporal son recambiados diariamente. El potasio del hueso. del cual el 98% es intracelular mientras que el 2% está presente en el liquido extracelular. INTRODUCCIÓN El potasio es el principal catión intracelular y por lo tanto es un factor importante de la presión osmótica que determina la distribución de agua entre las células y el líquido extracelular. en adultos masculinos hay aproximadamente 46 mEq de recambio de potasio. en administración continua de glucosa endovenosa y terapia salina. en fístulas gastrointestinales y vómitos. (3300 mEq) de potasio en un adulto de 70 kg. Con ingestión calórica inadecuada y la utilización de proteínas celular para propósitos calóricos. varían entre 4-5. en hipoventilación tanto central como periférica cuyo incremento de potasio es frecuente. el recambio diario es de 14%. Además de este rol pasivo. La concentración de potasio intracelular varia con los cambios del agua que gene ralmente acompaña a las alteraciones de los niveles de sodio extracelular. en deshidratación. El 95% del total del potasio corporal es intercambiable aunque el grado de recambio de cada tejido varía en los diferentes órganos. El potasio se pierde en el cuerpo principalmente en la orina aunque pequeñas cantidades son perdidas en la respiración insensible.

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insuficiencia renal crónica. II. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante :ácido tricloroacético  Reactivo TPB-Na: tetrafenilborato de sodio  NaOH  Estándar de Potasio III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): 1. Precipitación: en un tubo de ensayo pequeño añadir 50 ul de suero y 500 ul de reactivo precipitante. Mezclar cuidadosamente. Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). 2. Armar el siguiente sistema: Componentes Reactivo de trabajo Standard Sobrenadante Standard 1 ml 100 ul 100 ul Problema 1 ml

Para producir una turbidez homogénea el Standard y el sobrenadante transparente deben de ser agregados en el centro de la superficie del reactivo de trabajo Mezclar cuidadosamente Dejar reposar por lo menos 5 minutos Medir las absorbancias dentro de los 5 y 30 minutos CÁLCULOS: Factor: 5/Lectura del Standard Problema: lectura del problema x factor VALORES NORMALES: Suero de 3.5 a 5.5 mmol/l IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es el principio o fundamento del método de Hoffman para determinación del potasio sérico? 2. ¿Cómo explica metabólicamente la influencia sobre la concentración sérica de potasio producida por la administración de glucosa e insulina? 3. Explique usted los efectos metabólicos de la aldosterona en la excreción renal de potasio. 4. De ejemplos de hiperpotasemia y de hipopotasemia

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PRACTICA N° 35
DETERMINACION DE CALCIO SERICO
I. INTRODUCCION: El calcio sérico se encuentra en dos formas: Una combinada con proteínas séricas, inactivo e incapaz de difundir a través de las membranas de los capilares. Y la forma no unida a las proteínas, es principalmente iónico, difusible y activo. Varios factores influyen en la concentración de calcio sérico total. La hiperproteinemia está asociada con una elevación en los niveles de calcio, mientras que la hipoproteinemia se acompaña con disminución de la concentración de calcio; sin embargo la concentración de calcio ionizado no se altera. El calcio ionizado se altera en las siguientes situaciones: 1) Por variaciones del pH sérico; la alcalosis tiende a disminuir el calcio y la acidosis tiende a incrementarlo. 2) La ingestión de vitamina D aumenta el calcio ionizado a través de la absorción de calcio y por la excreción del fósforo. 3) La hormona paratiroidea es el factor más importante que controla los niveles de calcio sérico y su efecto es casi exclusivamente limitado a la forma iónica del calcio. La concentración del calcio sérico en individuos normales es de 9 a 11,5 mg por 100 ml Aproximadamente 4,5 a 5,5 mg% es ionizado y cerca de 0,5 mg% está presente como citrato de calcio y el resto se encuentra unido a las proteínas. El propósito de la presente práctica es determinar la concentración sérica de calcio total en personas adultas normales y/o en estado patológico por el método colorimétrico directo

II.

REACTIVOS A UTILIZAR: - Buffer alcalino: buffer lisina pH 11,1 - Reactivo de Color: 8-hidroxiquinolina, o-cresolftaleina-complexona, ácido clorhídrico - Solución estándar de calcio: 8 mg/dl

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Standard Muestra Muestra --------20 ul Standard ----20 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar y medir la absorbancia de la muestra (¨A muestra) y del Standard (¨A Standard) contra el blanco en un lapso de 5 a 30 minutos CALCULOS: A muestra C ! 8v ?mg/dlA A standard VALORES DE REFERENCIA: Suero o Plasma: 8,1 ± 10,4 mg/dl 


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IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es la importancia biológica del calcio en el ser humano? 2. ¿Cuáles son las formas de calcio sérico? 3. ¿Cuáles son los factores que controlan los niveles de calcio sérico? 4. ¿Cuál es la concentración normal de calcio sérico total? 5. Señale algunas alteraciones fisiológicas y/o patológicas que producen alteraciones de los niveles séricos de calcio.

Cuidar que las gotas de sangre caigan directamente en las soluciones salinas. II. no deben hacer contacto con las paredes de los tubos secos porque estos pueden causar . . Cuando éstos son colocados en una solución hipertónica pierden líquido arrugándose y destruyéndose hasta que se establece el equilibrio osmótico con el líquido circulante. lo que se conoce con el nombre de fragilidad osmótica de los eritrocitos (0. Si utilizamos una serie de soluciones de CINa de concentraciones gradualmente progresivas es posible comprobar que la hemolisis de los eritrocitos se producen dentro de ciertos limites de hipotonicidad. la resistencia de los eritrocitos a las soluciones hipotónicas disminuye. La presente práctica tiene la finalidad de: Verificar el desplazamiento de agua desde el medio extracelular hacia el medio intracelular y viceversa en los eritrocitos. es observada en la talasemia. cuando estos son puestos en soluciones hipertónica e hipotónica respectivamente. de allí que se emplee el término de fragilidad. . La muestra de sangre debe ser obtenida con un mínimo de estancamiento y de trauma. 2. .Cloruro de sodio (180 g).NaCl al 8.86 g). Utilizar heparina como anticoagulante de elección. La muestra debe ser procesada tan pronto como sea posible después de tomada. 3.31 g).Na2P04 (27.Heparina III. REACTIVOS A UTILIZAR: EXPERIMENTO N°1 .NaCl al 4.5% .2H2O (4. Las células esferociticas se rompen más rápidamente que las demás y de hecho la prueba de la fragilidad osmótica puede ser considerada como un índice más sensible que la de la magnitud de eritrocitos a la lisis en solución hipotónica. . anemia falciforme y en la anemia hipocrónica ordinaria (ferropénica).NaH2 PO4. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS ERITROCITOS : PRECAUCIONES: 1.0.Solución salina amortiguada concentrada 10%.NaCl al 15%. Demostrar la fragilidad osmótica de los eritrocitos cuando éstos son colocados en diversas soluciones de CINa de diversas concentraciones. Sin embargo cuando los eritrocitos son colocados en solución hipotónica aceptan líquido (hinchándose) hasta que se alcanza el equilibrio osmótico o hasta que se rompen. .91 PRACTICA N° 36 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I.3%). El uso de anticoagulantes del tipo de los oxalatos que comprende la adición de sales osmóticamente activas son indeseables. INTRODUCCION: La membrana de los eritrocitos es semipermeable. 4.5 . Aunque en la prueba de la osmosis la ruptura de las células resulta de la alteración de su forma y disminución de su resistencia a las fuerzas osmóticas más que a un cambio en la composición de la célula o su osmolaridad. Se afora con 2 litros de agua destilada y se conserva a 0° C (dura varios meses).5% EXPERIMENTO N°2 . Sin embargo en ciertas anemias hemolíticas adquiridas.

6.00 0.00 0.00 1. LECTURA: Observar cuidadosamente y marcar los tubos donde se inicia la hemólisis. 4. Observar que la fragilidad globular media de los eritrocitos se produce entre los tubos 5 y 6 (0.00 2. con las precauciones señaladas.00 3. Procedimiento: Realizar asepsia del pulpejo del dedo escogido de la mano.25 1. por acción de soluciones salinas de diferente concentración). añadir 0. La sangre del paciente y del sujeto normal son tomadas. en tubos heparinizados.00 0.40 6 2. Depositar una gota de sangre en cada una de las tres láminas porta-objeto. Colocar cantidades similares de sangre control del sujeto normal en cada uno de los tubos de una segunda hilera. EFECTO DE LAS SOLUCIONES HIPERTÓNICAS E HIPOTONICAS SOBRE LA INTEGRIDAD DE LOS ERITROCITOS: (Verificar por inferencia el desplazamiento del agua entre los medios intra y extracelular.75 0.25 2.50 8 2.45% de NaCl). Anotar los resultados.75 2. PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES Las diluciones se pueden preparar inmediatamente antes de la prueba: 1.50 2. 3.30 4 1.40 y 0.80 2. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 1 y 3 de cada mesa de trabajo).35 5 2. con un algodón empapado en alcohol yodado.20 3 1.65 11 3. Marcar el tubo donde la hemólisis es completa (color rojo intenso).25 0.70 12 4. 5. objetivado por el color rojizo pálido que toma el líquido sobrenadante en los tubos centrifugados.50 1. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 2 y 4 de cada mesa de trabajo).50 0. Conviene preparar una solución al 1% a partir de la solución concentrada al 10% y armar la siguiente serie de tubos: N° de NaCl al 1% Agua destilada % de NaCl tubo (ml) (ml) 1 0. Utilizando con precisión una pipeta para hemoglobina o una pipeta Pasteur calibrada. Utilizando lancetas descartables o lanceta de Link estéril pinchar el dedo. Proceder de la siguiente manera: Láminas (gotas) I II III .25 0.92 hemólisis.50 0.60 10 3.10 2 1. Mezclar el contenido de cada tubo antes de agregar la sangre. Mezclar correctamente cada tubo y dejar a temperatura ambiente por 30 minutos.00 0. Se debe rotar cada muestra suavemente en el tubo hasta que el color sea rojo brillante (plenamente oxidado).45 7 2.75 0.50 0. 7.75 3.50 0.50 3. Volver a mezclar y luego centrifugar a 2000 rpm.00 4.55 9 3.02 ml de sangre del paciente a cada uno de los doce tubos de una primera hilera.50 4.

Establecer las comparaciones morfológicas y/o lisis de los glóbulos rojos en rel ción a cada tipo de a soluciones empleadas en cada caso. Anotar los resultados. 1 2 - 1 2 - 1 2 Utilizando el microscopio observar los eritrocitos de cada una de las láminas. De acuerdo a los valores normales del test de fragilidad osmótica de los eritrocitos.93 Sangre del pulpejo de dedo Solución isotónica de CINa 8. Si el test de fragilidad osmótica de los eritrocitos de un modo general evalúa la relación entre el área superficial y el volumen de la célula. diga: A. ¿Cuáles son las relaciones normales existentes para la formación de los esferocitos y de las células tipo tiro al blanco? (target cell). Señale causas de alteraciones en la fragilidad osmótica. IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es la relación normal existente que permite la forma de disco bicóncavo del eritrocito? B.5% Mezclar bien. señale los porcentajes de inicio y finalización (total) de la hemólisis. señale la concentración o porcentaje de NaCl del tubo en el cual empezó la hemólisis. 3. Según observación cuidadosa. así mismo el tubo en donde la hemólisis fue completa. 2. 4.5% Solución hipertónica de CINa 15% Solución hipotónica de CINa 4. .

en la superficie de los eritrocitos del donador (Prueba indirecta de Coombs). Algunas personas son poseedoras de un antígeno de superficie designado en forma arbitraria como antígeno A (eritrocitos tipo A). dirigidos contra el mismo antígeno. una baja concentración de anticuerpos IgM produce una reacción de aglutinación cuya intensidad es igual a la que se produce con una elevada concentración de anticuerpos IgG. pero en algunos casos se necesita el examen microscópico de la preparación estudiada. En efecto dichas pruebas permiten habitualmente descubrir hasta 0.1 Ugr de anticuerpos/ml de suero Las pruebas de aglutinación se utilizan rutinariamente en las pruebas cruzadas con sangre antes de administrar transfusiones endovenosas en pacientes. etc. en el diagnóstico de las anemias hemolíticas por autoinmunidad (en la que los pacientes producen anticuerpos para las membranas de sus propios eritrocitos). como el tifus endémico). partículas de látex. pueden quedar suspendidas en una solución salina y mezclarse con antisueros específicos. en las condiciones empleadas en la prueba.94 PRACTICA N° 37 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. Al igual que las reacciones de precipitación las pruebas de aglutinación requieren de un pH apropiado y de la moralidad de amortiguadores salinos y debe existir una proporción adecuada de antígeno respecto del anticuerpo. Algunas personas . en la Prueba de Weil Felix (en pacientes con enfermedades provocadas por Ricketsias. tanto para medir antígenos como para determinar las concentraciones de los anticuerpos. etc. Brucella. En la membrana de los glóbulos rojos de cualquier persona normal se pueden encontrar determinados antígenos (antígeno de superficie o determinantes antígenos). en la Prueba de Widal (en pacientes infectados con bacterias gram negativas como Salmonella. en la prueba del factor reumatoideo (en pacientes con artritis reumatoides). Los anticuerpos de las distintas clases de inmunoglobulinas difieren en su capacidad de producir reacciones de aglutinación. Las pruebas de aglutinación tienen muchos usos en el laboratorio clínico. Estas partículas (bacterias. INTRODUCCION: Frecuentemente los antígenos se asocian con partículas que son demasiado grandes para formar soluciones o suspensiones coloidales en los medios acuosos.). para descubrir la presencia de anticuerpos del receptor. otras personas tienen otro tipo de antígeno de superficie que se llama antígeno B (eritrocitos tipo B). La única diferencia entre una reacción de precipitación y otro de aglutinación es que los antígenos son moléculas pequeñas en tanto que los antígenos aglutinantes están asociados con partículas de mayor tamaño. con cinco sitios eficaces de fijación de antígeno por cada moléculas de 19S tengan una actividad aglutinante superior a la de los anticuerpos IgG con dos sitios de fijación de antígeno por cada molécula. En otras palabras. bastante reproducibles y sumamente sensibles. Por lo general la aglutinación puede observarse a simple vista. El mecanismo de una reacción de aglutinación es semejante al de las reacciones de precipitación. eritrocitos. ambos tipos de reacciones se producen por medio de anticuerpos multivalientes que se combinan con partículas de antígeno formando complejos de antígeno anticuerpos. La concentración del anticuerpo aglutinante se define como la mayor dilución de antisuero que aglutina el antígeno examinado. Estas diferencias dependen principalmente de la valencia del sitio de fijación del antígeno en las diversas clases de los anticuerpos. En general las pruebas de aglutinación son fáciles de prac ticar. en la Prueba de Paul-Bunnell (Prueba de aglutinación en pacientes con mononucleosis infecciosa). en pruebas inmunitarias del embarazo. Se denomina reacción de aglutinación al fenómeno en que la mezcla de las partículas de antígeno con los antisueros específicos provoca una agrupación de dichas partículas antigénicas. Por lo tanto no es sorprendente que los anticuerpos IgM. Pasteurella).

y Preparar una suspensión al 5% de glóbulos rojos lavados. Utilizando los símbolos (+ )= positivo y (-)= negativo complete el cuadro de aglutinación de los grupos sanguíneos ABO: . ya que su propio antígeno A. CUESTIONARIO: 1. REACTIVOS A UTILIZAR: y Kit para identificar grupos sanguíneos (Diagnóstica). Por otra parte. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo B sobre la gota de suero con marca 2 y mezclar. Es un hecho bien conocido que muchas bacterias instestinales (salmonellas y shigellas) tienen antígenos que reaccionan en forma cruzada con los antígenos humanos AB0 (H).000. En cada extremo de una lámina porta objetos poner una gota del suero recientemente obtenido y marcar 1 y 2 respectivamente. se ha sugerido que las inmunizaciones inaparentes durante la infancia y el comienzo de la niñez pueden ser responsables de la producción de anti A o anti B. y Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos y descartar el plasma. y Llevar los glóbulos rojos sedimentados con suero fisiológico por tres veces. II. le ha conferido una tolerancia inmunológica específica hacia él. III. La misma lógica explicaría que una persona del grupo B forma sólo anti A y no anti B. para eliminar los anticuerpos inespecíficos adicionados a la superficie de los glóbulos rojos. con hepsrina como anticoagulante. tomar una muestra de sangre sin anticoagulante y obtener el suero por centrifugación. porque producen aglutinación de los glóbulos rojos que poseen el correspondiente antígeno y porque los antígenos son de origen humano (iso=de una misma especie). Pero una persona del grupo A forma sólo anti B y no anti A. De acuerdo con esta hipótesis todos los recié nacidos n están expuestos a los antígenos A y B.  Identificación de isoaglutininas en suero: y De uno de los estudiantes de cada grupo (o masa) de trabajo. y y y y IV. Los antígenos aparecen a comienzos de la edad fetal en cuanto se forman los eritrocitos . en el suero existe también normalmente anticuerpos contra los antígenos A y B. del tipo A y B en solución salina fisiológica. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo A sobre la gota de suero con marca 1 y mezclar. previamente identificadas. Estos anticuerpos (isoaglutininas) son del tipo IgH y son poco detectables en los sueros de los recién nacidos. Como existe un desarrollo gradual de estas isoglutininas. Los antígenos de superficie A y B son llamados también aglutinógenos y se ha estimado que pueden haber hasta un millón de sitios antigénicos A o B en un solo hematíe. llamados isoaglutininas. y Obtener muestras de sangre tipo A y tipo B. aunque quizá sea más realista una cifra de 5000.95 pueden tener ambos antígenos A y B (eritrocitos AB) y una cuarta posibilidad es que no tengan ninguno de los antígenos mencionados (eritrocitos tipo 0 o H). ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. Observar si hay o no aglutinación de los glóbulos rojos en 1 y/o en 2 de isoaglutininas en el suero problema del estudiante y deducir el grupo sanguíneo que posee. pero aumentan con rapidez su titulación en los primeros meses de vida.

(G. EN EL SUERO Anti Anti Anti Anti POSIBILIDADES DE TRANSFUSIÓN Puede recibir Puede donar De A AyO ByO O Todos (receptor Universal) A y AB B y AB Todos (donador Universal) AB 4. ¿Qué aplicaciones de las reacciones antígeno anticuerpo puede señalar? 5. Diga usted ¿Por qué ya no es costumbre corriente utilizar sujetos de tipo O como ³donadores universales´ y personas de tipo AB como ³receptores universales´? 3. En el siguiente cuadro anote los anticuerpos en el suero: GRUPOS SANGUÍNEOS ABO ANTIGENOS EN LOS POS ERITROCI.96 SUERO DEL GRUPO O B A AB ( ( ( ( AB ) ) ) ) ERITROCITOS DEL GRUPO A B ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( C ) ) ) ) 2. ¿Cuál es el fundamento de las reacciones antígeno-anticuerpo? . SANG) A B O AB ANTICUER.

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