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GUIA_DE_PRACTICA_2011

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PRESENTACION
Los profesores de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la U niversidad Nacional de Trujillo, han actualizado la Guía de Práctica, donde el estudiante encontrará una breve introducción de la importancia bioquímica y correlato medico de cada práctica, así como el procedimiento a desarrollar, finalizando con un breve cuestionario a fin de ampliar o concretar la aplicación de lo tratado. La Bioquímica es sin duda la ciencia que más ha aportado al desarrollo de la Medicina, basada en una rigurosa apl icación del método científico de la investigación

experimental. En la práctica, los alumnos a partir de los conocimientos adquiridos en los diálogos, seminarios y casos clínicos, tienen la oportunidad de plantear

interrogantes, contrastarlas con un experimento en forma ordenada, obten iendo resultados que al final se discutirán en grupo con el docente. También podrán conocer algunos métodos aplicados al diagnóstico clínico o al estudio nutricional. La práctica en Bioquímica, constituye un estímulo importante en el desarrollo de la investi gación experimental, permitiendo a nuestros estudiantes desarrollar habilidades y destrezas en trabajos de investigación y así obtener logros a nivel nacional para nuestra Facultad. Un recuerdo especial para los profesores que sentaron las bases para la actual guía de práctica como el Dr. Hugo Alpaca Muñoz, el Dr. Jorge García Ventura y un

agradecimiento a todos los docentes que de una u otra manera aportaron con sus conocimientos para disponer de esta herramienta que beneficiará a los alumnos de nuestra Facultad. Dr. CARLOS ARANCIBIA ARROYO Dra. MARIA DAYSI REYES BELTRAN Dr. JUAN VALLADOLID ALZAMORA Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA Dr. WALTER OBESO TERRONES Dr. ALFREDO LARIOS CANTO Dr. JORGE PLASENCIA ALVAREZ Dr. HECTOR RODRIGUEZ BARBOZA

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I UNIDAD SUBESTRUCTURA CELULAR: ENZIMAS Y BIOENERGETICA

REUNION DE LABORATORIO N° 01
PRACTICA N° 01
DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS
I. INTRODUCCION: La vida depende de una serie ordenada de reacciones químicas que son catalizadas por enzimas formadas para este fin. Las enzimas son proteínas relativamente frágiles con tendencia a sufrir desnaturalización e inactivación, es decir alteraciones en su conformación, por efecto de diversos agentes físicos y químicos como: temperatura, ácidos, álcalis fuertes, sales pesadas, pH, etc. Las enzimas se encuentran en pequeñas concentraciones en los materiales biológicos resultando , complicada su individualización o purificación. Para poder verificar directamente las propiedades comunes o similares de la naturaleza proteica que las caracterizan, experimentalmente se pueden utilizar las propiedades de catalizadores específicos que tienen las enzimas, como indicador de las alteraciones que pueden sufrir éstas cuando son sometidas a la acción de diferentes agentes físicos y químicos. De esta manera, sin necesidad de individualizar o purificar una determinada enzima se pueden verificar cómo los agentes físicos y químicos afectan la naturaleza proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad. La finalidad de la presente práctica, es evidenciar las características proteicas de las enzimas y que expuestas a la acción de diversos agentes físicos y químicos hacen variar su comportamiento y actividad catalítica. II. REACTIVOS A UTILIZAR: NaOH 1N SO4 Cu 20% NaCl 0.15M Amilasa salival 1.0% Solución iodada HCl 3N y 0.05N Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 Ácido tricloro acético (A.T.C.A.) al 20%

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Preparar: SISTEMA A TUBOS COMPONENTES (en ml) Amilasa al 1% NaOH 1N HCl 3N Ácido Tricloro acético 20% Sulfato de Cobre al 20% Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 I 1.0 2.4 II 1.0 2.4 III 1.0 2.4 IV 1.0 2.4 V 1.0 2.4 VI 1.0 2.4

6 ml.5 e.5 V 5 0.0 1.0 5.0 1.4 2.0 1. Esquematice el procedimiento de la práctica.4 2. Observar el aspecto y color producido e interpretar. d.4 2.0 5.0 II 1.0 VI 1. b.5 0.0 IV 1.0 5. IV. Observar el color producido e interpretar los resultados. b. Durante este lapso construir el siguiente SISTEMA B: SISTEMA B: TUBOS COMPONENTES (en ml) Almidón al 1. c.0 1.05N De los tubos de reacción del sistema (B). Explique los tipos de enlaces fuertes y débiles que existen entre los aminoácidos para conformar una determinada proteína.0% en solución acuosa Buffer fosfato 0.0 5.4 2. d. Dejar los 5 primeros tubos del sistema en reposo por 10 minutos a la temperatura ambiente. . Pre incubar por dos minutos a 37 ºC.5 0.5 III 5 0.5 0.6 NaCl 0. Explique la teoría de la acción molecular de las enzimas sobre sus respectivos sustratos.1 M / pH 6.4 2.0 1.0 5.4 2. de la enzima tratada. A continuación armar el siguiente sistema: TUBOS COMPONENTES (en ml) HCl 0. 4.5 I 5 0. Interprete y explique bioquímicamente cada uno de los pasos realizados durante el desarrollo de la práctica 2. c. 3. Agregar 0. CUESTIONARIO: 1.0 III 1.5 0.5 VI 5 0.0 1. de cada uno de los tubos del sistema (A) a su correspondiente tubo del último sistema (B).4 a.0 I 1.5 II 5 0. agregar: Solución yodada 0.5 IV 5 0. Dejar en incubación a 37 °C por 20 minutos.0 a.5 0. Colocar el tubo VI en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.0 V 1.15 M Agua Destilada 5.

entonces en un organismo vivo habría tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes. Verificando los productos liberados después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura.Solución yodada. verificando tanto el sustrato residual y los productos formados en dicha reacción. la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras: 1. . y Colocar los tubos al baño de agua a 37 °C por 5 minutos. II 5 ml. REACTIVOS A UTILIZAR: . permitiendo que las reacciones químicas dentro de la célula ocurran rápidamente a través de vías bien definidas. Solución Cúprica alcalina. Solución fosfomolíbdica. La finalidad del presente trabajo experimental es determinar la actividad enzimática. y Agregar 1 ml. solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. utilizando la enzima amilasa salival que tiene la capacidad de degradar el almidón en maltosa (disacárido reductor) y algo de glucosa. .Cloruro de sodio solución 0. Sin estas proteínas especializadas.0 al 1% Solución de cloruro de sodio 0.0 al 1%. 1 ml.Solución de almidón pH 6. 4 ml.Ácido Clorhídrico 0. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato.05N . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) y Armar el siguiente sistema: ETAPA A: TUBOS COMPONENTES Solución de almidón pH 6.1M . .1M Agua destilada I 5 ml. En general. INTRODUCCION: Las enzimas pueden ser descritas como catalizadores complejos de origen biológico que tienen un alto grado de especificidad y eficiencia. de enzima al tubo II.5 PRACTICA N° 02 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. . 3 ml.Reactivo Folin Wu: a. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL ) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura. b. III. II. 1 ml. Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada. Para poder mostrar la actividad enzimática se debe tener presente fundamentalmente que cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima. la vida tal como es no podría existir.Enzima al 1% (amilasa salival). y Volverlos a colocar al baño de agua a 37 °C durante 10 minutos. 2.

0. 0.05 N De los tubos I y II: Etapa A Solución yodada I 5 ml. CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin WU) TUBOS COMPONENTES De los tubos I y II: etapa A Solución Cúprica alcalina Hervir 8 minutos Enfriar Solución fosfomolíbdica Agua destilada y I 1ml. 2ml. 2ml.5 ml. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante III. transferir 0.5 ml. 1ml. II 1ml.5 ml. De cada uno de los tubos del sistema anterior. 0. y Mezclar. 1ml. 3. 0. Mezclar. II 5 ml. y Inmediatamente cumplidos los 10 minutos. TUBOS COMPONENTES Ácido clorhídrico 0. 1ml. Elabore un gráfica para demostrar la acción de una enzima sobre su sustrato. CUESTIONARIO: 1.5 ml. 4. Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimático y defínalos. ¿Qué métodos conoce para determinar la actividad enzimática? Explique la acción bioquímica de cada uno de los componentes en los pasos seguidos para determinar la actividad enzimática. a este nuevo sistema.5 ml. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante. . 2.6 CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL. donde se observe la energía de activación y el estado de transición. 1ml.

Ácido acético 1N .Indicador de pH: Papel Indicador ó pHmetro.0 VI 5. del tubo N° 2 y transferir al tubo N° 3.) Ácido Acético 1N Agua Destilada      I 3. de solución y se elimina. porque el número total de cargas positivas es igual al número total de cargas negativas contenidas en la proteína. .8 II 5 III 5 IV 5 V 5 VI 5 VII 5 VIII 5 IX 5 Mezclar el tubo N° 1 Extraer 5ml.0 IV 5. REACTIVOS A UTILIZAR: . se puede determinar el PI de una proteína observando los cambios de solubilidad que se producen cuando la proteína se encuentra en varias soluciones que tienen pH conocidos. . de caseína en acetato de sodio 0.0 1. la proteína sufre variaciones en la constitución de sus grupos químicos.0 II 5.1N (sal)  I 5.NaOH al 10%.0 VII 5. cuando se encuentran en una solución que tienen pH igual al PI.0 1.0 1. Por tanto. algunas proteínas son muy díficilmente solubles y precipitan. se extrae 5 ml. INTRODUCCION: El punto isoeléctrico es la concentración de iones hidrógeno en el cual la proteína es eléctricamente neutra. Aprovechando este comportamiento.0 1.7 PRACTICA N° 03 DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LAS PROTEINAS I. cada proteína posee un determinado punto isoeléctrico (PI).0 1. de solución del tubo N° 1 y agregarlo al tubo N° 2. .0 VIII 5. TUBOS CONTENIDO ( en ml.0 V 5. iguales o mayores al PI. que precipitan porque la solubilidad en estas condiciones disminuye al mínimo.0 Mezclar al instante por inversión.0 IX 5.Solución de caseína en Acetato de Sodio 0. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que el punto o pH isoeléctrico de las enzimas es una característica físico química común de estas moléculas. En el tubo N° 9 una vez efectuada la mezcla.0 1.1N en cada tubo.1N III.0 III 5. Completando del mismo modo hasta completar la serie. Mezclar Extraer 5ml.0 1.) Contenido Anterior Caseína 0. produciéndose en consecuencia variaciones en la estructura terciaria o cuaternaria y por lo tanto en su función biológica Aparte de otras propiedades que presentan las proteínas.0 1.0 1. II.2 6. Cuando una proteína se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pH menores. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Marcar una serie de tubos de ensayo de 1 al 9 TUBOS REACTIVOS (en ml. Al contenido anterior del sistema agregar rápidamente 1 ml.

0.6 = 4. x = precipitado EFECTO INMEDIATO EFECTO DESPUÉS DE 30 MINUTOS CÁLCULO DEL pH  Determinar el tubo que presenta el máximo de precipitación. 3.1N). ¿Cómo interpreta el resultado obtenido del punto isoeléctrico? ¿Qué es el pK? El pH neutro del medio ¿es igual al pH isoeléctrico? De sus razones. Cálculo de pH para el tubo N° 3: pH = pK + log.  Luego de transcurridos los 30 minutos de reposo.8    Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la proteína en los diferentes tubos. [ Ácido ] pK del Ácido Acético = 4. debe calcularse el pH de cada uno de los tubos IV. Ver ejemplo. la concentración de ácido acético varía. lo cual se producirá en el tubo que tiene pH próximo a la solubilidad mínima de la proteína. Ecuación de Henderson ± Hasselbach [ sal ] pH = pK + log. En el tubo N°2 la concentración de ácido acético es de 8 ml. 2.7 ± 0. que encontró en su experimento.6 ml.  Calcular el pH de cada uno de los tubos aplicando la Ecuación de Henderson ± Hasselbach. verificar el pH de cada uno de los tubos con el indicador de pH. 0. Anotar en el cuadro que se da a continuación Observar después de 30 minutos de reposo y anotar también en el cuadro respectivo. 1 = 4.1 N en todos los casos. Etc. 4. CUESTIONARIO: 1.1 N. Así en el tubo N° 1 es de 1. I II III IV V VI VII VIII IX Emplear los símbolos siguientes : O = no cambia + = opalescencia.1 N. de ácido 1 N (16 ml. Anotar los resultados en la columna respectiva del cuadro anterior.7 Ejemplo : Si la concentración de la sal es de 1 ml.0 ml. . al 0. Indique el punto isoeléctrico aproximado a la proteína.1 4 NOTA: De la manera indicada en el ejemplo. de acetato de sodio 0. TUBOS N°.1 TUBO N° 3 = pH 4. En el tubo N° 3 la concentración de ácido acético es de 4.

1 N ¿Cuál es el pH de la solución en 1 ml? .9 5. Si la concentración de ácido acético en el tubo II es 8 ml a 0.

B + C en que dos moléculas reaccionan entre si. . constituye una medida del grado de pureza de la enzima durante el proceso de purificación. ACTIVIDAD ESPECÍFICA. .El pH. En cuanto a las mencionadas condiciones de medida. . Esto es posible debido a que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima. Esta aumenta durante el proceso de purificación de la enzima en los homogenizados biológicos y llega a ser máxima y constante cuando la enzima se halla en estado puro. deben establecerse: . Entonces la actividad específica además de cuantificar la enzima. una Unidad será la cantidad de enzima que cataliza la transformación de dos Q Moles de sustrato por minuto. o un polisacárido. Se denomina Actividad Específica a la cantidad de una enzima expresada en términos del contenido de proteína de la preparación. o cualquier otra molécula en la cual son atacados más de una unión.En casos de reacciones bimoleculares del tipo: 2 A ----. se recurre a la medida de la velocidad de la reacción que cataliza. y se expresa como el número de unidades de la enzima por miligramo de proteína.10 REUNION DE LABORATORIO N° 02 PRACTICA N° 04 CUANTIFICACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE LAS ENZIMAS I. Es decir en los ejemplos mencionados más que el numero de moléculas completamente hidrolizados. entendiéndose por unidad de una enzima a la cantidad de ella que produce cierta velocidad de reacción bajo determinadas condiciones. y en general de todos aquellos factores que de una u otra manera pueden modificar la actividad de la enzima. En éste último caso y siempre que se conozca un peso molecular se puede definir otra unidad ³LA ACTIVIDAD MOLECULAR O MOLAR O NÚMERO DE RECAMBIO´ (ÍNDICE CATALÍTICO).La temperatura a la cual se define la Unidad.Cuando el sustrato es una proteína. Esa velocidad de reacción se expresa como la cantidad de sustrato transformado en cierto tiempo. se debe reemplazar la definición de un Qmol de sustrato por un microequivalente (Q eq) del grupo involucrado. Dos casos merecen aclaración especial: . se toma como medida de la reacción el número de uniones peptídicas o glicosídicas atacadas respectivamente. INTRODUCCION: Al no ser posible medir la cantidad de enzima directamente en las estructuras biológicas. A fin de evitar ambigüedades surgidas de la utilización de distintas unidades para expresar la cantidad de sustrato y el tiempo se ha definido por convención una unidad que puede ser aplicada a casi todas las enzimas y que permite comparar las actividades de enzimas diferentes. La definición recomendada por la Unión Internacional de Bioquímica a través de su comisión de enzimas es la siguiente: ³Una Unidad Internacional (UI) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol (Q mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de medida´. . De esta manera se puede expresar la cantidad de una enzima en términos de unidades enzimaticas.La concentración del sustrato o los sustratos y cofactores. definible como el número de moléculas de sustrato transformado por minuto y por molécula de enzima (ó por un solo centro activo) en condicionales experimentales tales que se esté midiendo la velocidad máxima (concentración saturante del sustrato).

0 ml.5 ml.02 M pH 5.0 Incubar a 37°C.5 ml.01667 microkatales = 16. Su relación con la Unidad Internacional es la siguiente: Un Katal es igual a 6 x 10 7 Unidades Internacionales. 8. La finalidad del presente trabajo experimental es cuantificar la Actividad Enzimática determinando la actividad específica. Detener la reacción empleando: Hidróxido de bario 0.5 ml.2 ml. (Pre ± incubación) Preparado enzimático Mezclar e incubar a 37°C.3 ml. 0. 20 minutos 0. 0.3 N Sulfato de Zinc 5 % Sacarosa 0. DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS DE LA REACCIÓN (azúcar reductor) Se empleará los filtrados libres de proteínas del paso anterior y se determinará azúcar reductor mediante el siguiente procedimiento: . 0. recomienda el uso de una nueva unidad EL KATAL (Kat) que se define como la cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato en producto por segundo. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: y Armar el siguiente sistema: SISTEMA DE INCUBACIÓN COMPONENTES Sacarosa 0.02M pH 5.3 ml. II. 0. 8.5 ml. REACTIVOS A UTILIZAR: y Preparado enzimático (homogenizado celular de Fusarium moniliforme) y Buffer de acetato 0.3 N y Sulfato de Zinc al 5 % y Solución fosfomolíbdica y solución cúprico alcalina y Reactivo de Biuret III. 0.0 y Sacarosa 0. Una Unidad Internacional es igual a 0.5 ml. Mezclar: Separar el precipitado de proteínas filtrando o centrifugando por 10 minutos.0 ml. 2 minutos 0.67 nanokatales La Actividad Específica se expresa en esta nueva unidad como Katales por kilogramo de proteína (ó Microkatales por miligramo de proteína) y la actividad molar en Katales por mol de enzima.17 M Agua destilada y y TUBOS DE ENSAYO I II 0.2 ml.17 M Buffer acetato 0. 0.11 Actualmente la Unión Internacional de Bioquímica. 0.17M y Hidróxido de bario 0.5 ml.

5 ml..5 ml.0 ml..E.. I II 0. 1. II ± Lect. Mezclar y dejar en reposo durante 20 minutos. 4. 1. del blanco)] x Factor = uMoles de Hexosas por ml.5 ml. 0.5 ml.. y CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA U A. de Proteínas ..5 ml.0 ml.....0 ml. = mg. I ± Lect. II ± Lect. Cálculos de la concentración de los productos (hexosas) [(Lect.... del blanco) ± (Lect.0 ml. 0. = Micromoles de Hexosas / 2 Minutos Tiempo de incubación en minutos (20 min).. de proteínas por ml. III 1.. y y y CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Determinación de la concentración de proteínas en el preparado enzimático: (Reacción de Biuret) COMPONENTES Preparado enzimático Agua destilada Reactivo de Biuret 1.. CÁLCULO: (Lect. de agua destilada. Cálculo de las Unidades (U) (U) = uM de sustrato transformado x ml.5 ml.12 TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES Filtrado I Filtrado II Agua destilada Solución cúprica alcalina I 0.. Mezclar.2 ml. Colocar en un baño de agua hirviendo durante 8 minutos Enfriara al chorro de agua Solución fosfomolíbdica y 1.0 ml.8 ml.0 ml.. II 0. Leer a 540 nm Para el espectrofotómetro.5 ml.. 0. Leer a 420 nm. Mezclar y dejar en reposo por 30 minutos. 0.0 ml. agregar 7. 0. 4.045 uM/ml... I) x Factor = mg. Factor = 0.0 ml. el factor es. 0.

Cuándo determina el azúcar reductor de una reacción.5 x 10-4 ¿En cual de los dos preparados hay mayor cantidad de enzima? 6. 4.13 IV. 5. proteína) a. A = 1 x 10-3 y B = 1. para calcular la Actividad Específica? ¿Por qué se utiliza el reactivo de Biuret? ¿Por qué una enzima se cuantifica en función de su actividad enzimática y no por el peso de la proteína (enzima)? Si en dos preparados biológicos A y B la actividad específica de una determinada enzima es: (en uM/mg. 3. 2. ¿Cómo explica la aparición de la coloración al final del sistema? ¿Por qué es necesario conocer previamente la concentración de proteínas del preparado enzimático y determinar la unidad de enzima (U). . CUESTIONARIO: 1.

1M pH 9. La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores.6 . concentración de sustrato.4 2. TIEMPO TEMPERATURA.25 % .Buffer fosfato 0. REACTIVOS A UTILIZAR .4 2. IONES INORGÁNICOS I.0 5. sobre la serie infinita de enzimas que se conoce.0 VII 1.0 VI 1.0 5. tomando como ejemplo la hidrólisis enzimática del almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reacción enzimática.Solución de almidón al 1 % .1M pH 6.Solución yodada (yoduro de potasio + yodato de potasio) .4 2. varia en forma característica para cada enzima en particular. .4 2.14 PRACTICA N° 05 FACTORES FÍSICOS-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS PARTE I: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMAS.6 . INTRODUCCION: En general.4 1.6 Buffer borato 0.0 1.Buffer borato 0.Solución de cloruro de sodio al 2 % . concentración de sustrato. independientemente del tipo de reacción que catalizan.4 VIII 1. concentración de enzima. Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara de la influencia de los factores (Tiempo.0 Solución de ClNa al 2 % Agua destilada I 1.1M pH 4. presentan características comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo.Amilasa salival dializada al 0. como se comprenderá.0 1. II.Ácido clorhídrico 0.0 1. etc).0 1.1M pH 6. III. todas las enzimas.0 5.1M pH 4.0 5.) Solución de almidón al 1 % Buffer acetato 0. temperatura.0 5.0 V 1. iones.Solución cúprico alcalina. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.4 2.0 . de tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectada por la variación que pudieran sufrir los otros.0 5. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reacción enzimática sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones.Buffer acetato 0.0 3. Este patrón general.05N .Solución fosfomolíbdica.6 Buffer fosfato 0.4 III 2. pH. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes.0 .0 1.0 5.0 1. PH. tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática. retardando o i pidiendo m su actividad. pH.0 1.0 IV 1.6 II 1. concentración de enzima.4 2.0 5.1M pH 9.

5 5.5 5.0 ml.5 cada uno de los tubos HCl 0. 1. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.El Control de los productos formados se hará en base a la capacidad reductora de estos (glucosa.05N 5.5 0.0 ml. sin color) en el cuadro final. agregando a cada tubo marcado. 0.5 0.0 0.0 0. I 0.0 ml.5 0. según se indica y tomar el tiempo. azul claro.5 5.6 III 0. de la siguiente manera: Cumplidos los 20 minutos de incubación sacar los tubos del baño maría y luego armar una serie paralela de tubos marcados del I al VIII.5 5.5 0.0 ml.) I II III IV V VI VII VIII Incubado correspondiente de 0.15 .0 0.0 0.El control del sustrato no transformado se realiza por la reacción del yodo.Agregar el preparado enzimático a los tubos: II al VIII. por cinco minutos.5 Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos. de acuerdo a los sistemas que a continuación se presentan: y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL . .5 5. maltosa) de la siguiente manera: Esta determinación sólo se hará en los tubos III y V del incubado a los 20 minutos.5 ml.Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al baño de agua a 37 °C.0 II 0. valorando los cambios de coloración (azul oscuro.El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0 °C y 4 °C durante cinco minutos. 1. .2 VIII 0.0 0.6 IV 0.5 0. TUBOS V 1.0 Solución iodada 0. del incubado de su correspondiente tubo.6 VI 0. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml. .0 0.5 0.6 V 0. y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS . Cumplido los 8 minutos sacar los tubos y enfriar con agua corriente y AGREGAR: .0 0.6 (Computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimático fue agregado a cada tubo) y Mezclar y continuar la incubación por 20 minutos. Mezclar y poner en baño maría hirviendo por 8 minutos.5 5.6 VII 0. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES III Incubado correspondientemente a los tubos III y V Solución cúprico alcalina 1.5 5.5 0.) Preparado enzimático (en ml. para el equilibrio de la temperatura.Realizar controles de la actividad enzimática.

sin color) en el cuadro final.0 ml. ¿Cómo se determina el sustrato residual y los productos finales cuando se usa almidón como sustrato? 3. CUESTIONARIO: 1.16 COMPONENTES III Solución fosfomolíbdica Agua destilada TUBOS IV 1. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática? 5.0 ml. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 4. 1. azul claro.0 ml. 5.0 ml. ¿Cómo puede demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 6. 5. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la presencia de un ión activador sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? . ¿Cuáles son los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas? 2. Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de tubos valorando los cambios de coloración (azul oscuro. CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA POR E L SUSTRATO RESIDUAL: (cambio de color) A los 20 minutos: I II III IV V VI VII VIII CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (cambio de color) A los 20 minutos III V IV.

A baja concentración de sustrato la velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato y la reacción es de primer orden con respecto al sustrato. La finalidad de la presente práctica es demostrar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática y hallar la velocidad máxima y el Km de la reacción. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato 0.1 M pH 6. y se dice que la enzima está siendo saturada con su sustrato.17 REUNION DE LABORATORIO N° 03 PRACTICA N° 06 FACTORES FÍSICO-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. I. Sin embargo. PARTE II: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: . se define mejor en términos de la concentración de sustrato necesario para obtener una velocidad inicial de reacción igual a la mitad de la velocidad máxima. debido a que la velocidad de colisión entre los reactantes es proporcional a la concentración de cada uno de ellos. cuando la concentración del sustrato es incrementada. la velocidad inicial se incrementa con menor intensidad. Con un incremento ulterior en la concentración de sustrato.075 M Solución de ureasa cristalina en Buffer fosfato 0. la velocidad de reacción siempre es proporcional a la concentración de cada uno de los reactantes. En este rango de concentración de sustrato la reacción es esencialmente de orden cero con respecto al sustrato. de modo que no es tan directamente proporcional a la concentración del sustrato.1 M pH EDTA 0. Desde el punto de vista operacional la constante de Michaelis (Km). DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD MÁXIMA Y KM. II. la velocidad de la reacción llega a ser esencialmente independiente de la concentración del sustrato y asintóticamente alcanza una velocidad constante.005 M Urea 0. Las reacciones catalizadas por enzimas son algo diferentes.6 Tungstato de sodio al 10 % Ácido sulfúrico 2/3 N III. INTRODUCCION: En las reacciones no catalizadas. en esta zona la reacción es de orden mixto.

0 - Pre incubar a 37 °C durante cinco minutos Incubar cada uno de los tubos exactamente 15 minutos 37°C ES FUNDAMENTAL: Medir exactamente el tiempo de incubación para cada tubo.0 II 1.5 0. ésta debe agregarse con intervalos de 1 a 2 minutos a cada tubo de tal manera que permita un fácil manejo de los mismos al final de cada tiempo.M¶ Ejemplo: Concentración de úrea en el tubo I.5 0.0 0.0 I 0.0 8.5 0.5 IV 1.5 1.5 VII 0.0 8.5 VII 0.05 % I 3. Para ello se medirá el tiempo de incubación inmediatamente después de agregar la enzima.5 0. Transcurridos los 15 minutos agregar rápidamente: COMPONENTES H2SO4 2/3 N Tungstato de sodio 10% Ureasa .0 IV 1.0 1.5 VI 0.0 0.0 8.5 0.18 COMPONENTES Buffer fosfato pH 6.6 Urea 0.0 1.5 3.5 0. de cada uno de los siguientes incubados a tubos de ensayo de una segunda serie siguiendo el siguiente esquema: COMPONENTES Del incubado anterior Agua destilada Reactivo de Nessler I 1. Para ello multiplicar la diferencia anterior por el factor de calibración empleado (1660) = µmoles de NH3 /ml.0 8.0 1.0 8. dividido entre el tiempo de incubación (15 minutos).0 0.5 VI 0.0 1. empleando la concentración de amoníaco producido por ml. V¶ = 4 ml. con respecto al tubo blanco (tubo VII).0 1.5 V 1.5 0. Luego:  Realizar las lecturas en el espectrofotómtero a 540 nm en cada uno de los tubos.5 II 2.M.0 1.0 1.5 III 2.5 MEZCLAR y dejar en reposo por cinco minutos.0 8.5 0.5 IV 0.5 0.5 ml.  Hallar la diferencia de cada uno de los tubos.5 3. Datos: V = 0.0 0.5 II 0.MEZCLAR Transferir 1ml.0 III 1.  Calcular la concentración de sustrato (concentración molar) en cada tubo de incubación empleando la siguiente fórmula: V.075 M Ureasa 0.0 8.5 V 0.0 VII 1.5 III 0.0 VI 1.5 2.5 0. = V¶.  Calcular la velocidad de reacción para cada uno de los sistemas enzimáticos preparados.  Encontrar la concentración de amoníaco producido por ml.5 0.0 1.0 V 1. .0 2.

19 M = 0.0093 M 4ml. ¿Qué métodos conoce para determinar el Km? . ¿Qué importancia tien el Km? 5. ¿Cómo afecta la concentración del sustrato la velocidad de la reacción? 2.075 M M¶ = ? M¶ = 0.075 M = 0.5 ml x 0. Construir una gráfica en un sistema de coordenadas teniendo como parámetros la inversa de la concentración del sustrato (1/S) (abscisas) en función de la inversa de la velocidad inicial de la reacción (ordenada). IV.  Anotar los resultados de cada uno de los tubos (concentración del sustrato y velocidad de la reacción). ¿Para que sirve la ecuación de Lineweaver? 6. CUESTIONARIO: 1.  Utilizando papel milimetrado. Calcular en la gráfica obtenida la velocidad máxima y la Km. aplicar la ecuación de Lineweaver Burk a los resultados obtenidos. ¿Qué establece la ecuación de Micahelis Menten? 3. En la curva trazada calcular la Km e indicar la Vmax. ¿Qué es el Km? 4.  Construir una gráfica en el sistema de coordenadas teniendo como parámetros : La concentración del sustrato (abscisa) en función de la velocidad de la reacción (ordenada).

En la inhibición competitiva se dice que un inhibidor obra por competencia si su acción inhibidora se revierte al aumentar la concentración de sustrato. Si la inhibición no se revierte al agregar sustrato (succinato). Respecto de los inhibidores reversibles es importante destacar que la interacción entre inhibidor y enzima se traduce en varios tipos de inhibición perfectamente diferenciados experimentalmente. . entonces la inhibición será de tipo no competitiva. Si el efecto inhibidor se revierte al incrementar la concentración del sustrato (succinato) entonces se podrá afirmar que el inhibidor es de tipo competitivo. inhiben metaloenzimas por enlazarse al ión metálico. A la inversa. Por ejemplo. Aquí el inhibidor se une a la enzima en otro sitio que no es aquel por el cual se une al sustrato. NO y CO. La inhibición acompetitiva. Si después de hacer actuar el inhidor sobre la enzima. que es cataliticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reacción y complejo-enzima-inhibidor. De allí el nombre de competitivo.20 REUNION DE LABORATORIO N° 04 PRACTICA N° 07 ACCION DE LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS Y NO COMPETITIVOS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. Experimentalmente se puede identificar si un inhibidor cualquiera es o no competitivo. Un ejemplo clásico. si la enzima continúa inhibida después de la reacción del inhibidor. Los inhibidores enzimáticos se clasifican en reversibles e irreversibles. que se pueden distinguir en base a un criterio experimental. se dice que el inhibidor es reversible. alcoholes y calor que producen alteraciones en la estructura espacial de la molécula proteica que conduce a la desnaturalización. se agrega malonato como inhibidor. cloruro de mercurio. La inhibición no competitiva se caracteriza por que no puede ser revertida por un aumento de la concentración del sustrato ya que este último no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. se dice que el inhibidor es irreversible. por que efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazarse mutuamente de la enzima. EDTA. si el sistema deshidrogenasa succínica+succinato. de este tipo de inhibición es el que presenta la succinato deshidrogenasa que tiene como sustrato el succinato y puede ser inhibido por sustancias estructuralmente parecidas a dicho ácido como son el malato. ácido oxálico y glutarato. el exceso de inhibidor. los cuale enlazan iones metálicos necesarios para la actividad enzimática. Los dos tipos más comunes son: las inhibiciones reversibles competitivas y las inhibiciones reversibles no competitivas. Excluyéndose de ésta categoría aquellos agentes como los ácidos fuertes. eliminamos por algún método. El inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual se debería unir el sustrato impidiendo por lo tanto la formación del complejo activoenzima-sustrato. Ejemplos de este tipo de inhibición son los causados por el N-etilamida. INTRODUCCION: Existen sustancias cuya acción sobre una enzima es la disminución de su actividad. es otro tipo de inhibición reversible. Estas sustancias se conocen como los inhibidores enzimáticos. Quedando por demostrar si este tipo de inhibición es reversible o no. a las que se pueden agregar las inhibiciones reversibles acompetitivas. Por esta razón la unión de este último con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor. común en sistemas más complejos en el que el inhibidor se une exclusivamente al complejo enzima -sustrato para dar un complejo enzimasustrato-inhibidor incapaz de transformarse en otro producto. pudiéndose formar entonces un complejo ternario enzima-sustrato-inhibidor. y la enzima recupera su actividad original.

0 1. ¿Por qué el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo? 3.5 1. Dejar en reposo 15 minutos a la temperatura ambiente y luego observar los resultados y anotar.Succinato de sodio 0.5 0.5 III 0.0 1.3 0.2 Anotar y luego agregar a los tubos II.2 Succinato de sodio 0.1M pH 7.0 II 1.1 M Succinato de sodio 0. II.1 M Malonato de sodio 0.0 Dejar en reposo por 30 minutos a la temperatura ambiente. IV.21 La siguiente práctica tiene por finalidad demostrar en el sistema enzimático Deshidrogenasa succínica+succinato: que el malonato y el cloruro mercúrico producen inhibición de este sistema. CUESTIONARIO: 1.Succinato de sodio 0.3 0.0 0.8 0.2 0.Buffer fosfato 0.2 1.5 M Cloruro de mercurio 0.5 1.0 1. COMPONENTES Succinato de sodio 0.5 M . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.0 1.Malonato de sodio 0.Cloruro de mercurio . II 0.0 V 1.0 IV 1.1M pH 7.5 M Buffer fosfato 0.0 1.2 0.0 III 1. que el malonato es un inhibidor competitivo y que el cloruro mercúrico es un inhibidor no competitivo. REACTIVOS A UTILIZAR .1 M.0 1.2 ± 6 Diclorofenolindofenol . Observar los resultados en cada uno de los tubos (cambio de color).1 M . III. pH 7.5 1.Homogenizado hepático 10 % III. ¿Por qué el malonato es inhibidor competitivo? 2.5 IV 0.5 - IV. ¿Cómo podría usted demostrar que la inhibición producida por el cloruro mercúrico es o no reversible? .1 M 2 ± 6 diclorofenolindofenol Homogenizado 10 % I 2.2 .1 M .

. sin considerar el cloruro de mercurio. ¿Qué diferencias puede usted establecer entre la inhibición competitiva y la inhibición alostérica? 7. De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibición competitiva en el sistema Deshidrogenasa succínica ± succinato. 5.22 4. Señale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibición no competitiva reversible. 6. De por los menos dos semejanzas entre la inhibición no competitiva reversible e inhibición alostérica. además del malonato utilizado en el presente experimento.

Cuando se oxida (cede electrones) cambia de color (a marrón oscuro). éste impide que el 2-6 diclorofenolindofenol se reduzca (se decolore). INTRODUCCION: Los equivalentes de reducción. ésta cede sus electrones a los indicadores entre la FMN y la CoQ. los esteroides. comprenden el cianuro. quiere decir que dicho inhibidor estará actuando en alguna región anterior a la FMN. así por ejemplo el 26 diclorofenolindofenol y el azul de metileno son sustancias indicadoras de color azul en estado oxidado. Existen diversas sustancias que actúan como inhibidores de la cadena respiratoria. A estos se les denomina inhibidores del sitio III. entonces podemos deducir que el mencionado inhibidor actuará en algún sitio comprendido entre la CoQ y el citocromo B inclusive (cercano al sitio II de la cadena). el monóxido de carbono. átomos de hidrógeno o electrones. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que los inhibidores: rotenona. Para poder determinar la permeabilidad de la cadena de oxidoreducción al paso o no de electrones. En la cadena REDOX. respectivamente. . Si se administra un inhibidor que impide el flujo de electrones en algún punto de esta porción de la cadena. Por su acción cercana en el primer sitio de la desfosforilación se les suele denominar inhibidores del sitio I. es decir que es capaz de ceder electrones. se les denomina inhibidores del sitio II. es o no permeable al flujo de electrones que provienen del indicador. etc. Si al administrar un inhibidor de la cadena. La p-fenilendiamina.23 PRACTICA N° 08 EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE ÓXIDO-REDUCCIÓN I. entonces podemos deducir que el sitio de inhibición estará en alguín sitio posterior a la CoQ inclusive. inclusive de la cadena (región que incluye el sitio I). mediante el uso de indicadores conocidos como 2 ± 6 diclorofenolindofenol y p ± fenilendiamina. provenientes de la deshidrogenación de los sustratos del ciclo de Krebbs y otros metabolitos son transferidos al oxígeno por un sistema multienzimático denominado cadena respiratoria. Un grupo de inhibidores actúa sobre el Hemo a3 de la citocromo oxidasa impidiendo su interacción con el oxígeno. Si se administra un inhibidor que no impide la oxidación de la p-fenilendiamina y que tampoco impide la reducción del 2-6 diclorofenolindofenol. los detergentes. bloqueando el transporte de electrones entre la flavina y la ubiquinona. De esta manera se puede verificar si la cadena comprendida entre el citocromo C y el oxígeno. etc. algunos anestésicos volátiles como el halotano. Los inhibidores más comúnmente usados pueden reunirse en tres grupos principales según el sitio de la cadena respiratoria donde actúan. que al reducirse (recibir electrones) se decoloran. Este mismo sistema multienzimático es también conocido como cadena de transporte de electrones. Como hay flujo de electrones en la cadena. barbital sódico y azida de sodio. Un segundo grupo de sustancias actúan bloqueando la transf rencia de electrones e entre los citocromos b y c. el BAL y barbiturato de sódio. inhibidores similares son la hidroxiquinolina N-óxido. es otro indicador que actúa como sustrato. se utilizan sustancias indicadoras artificiales que cambian de color cuando se oxidan o se reducen. actúan en las regiones cercanas al sitio I. el citocromo C actuará como primer aceptor de electrones que provienen de la p-fenilendiamina. la p-fenilendiamina no se oxidará (no cambia de color). El ejemplo clásico de este grupo es la antimicina. pero si el indicador se decolora. Este sistema está localizado en la membrana mitocondrial interna y se caracteriza por la cohesión física con la cual sus componentes se encuentran unidos entre si e integrados en la membrana. Inhibidores de localización son: el amital. entonces podemos deducir que el inhibidor actúa en algún sitio anterior al citocromo o de la cadena. Si el inhibidor no impide la oxidación del indicador. denominación que pone énfasis en que las oxidaciones reducciones son fenómenos caracterizados por la pérdida o ganancia de electrones. la azida. sitio II y sitio III. Un primer grupo de inhibidores actúa sobre la NADH-deshidrogenasa. Los más representativos de este grupo son la rotenona y la piericidina.

1M Rotenona 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) En el sistema Deshidrogenasa málica + malato + cadena rédox mitocondrial.0 V 1.0 0.5 0.5 II 1. dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.5 1.0 II 1.5 0.5 0.2 0. I 2.5 0.5 0.) Buffer fosfato de sodio 0.5 0.5 0.5 1.5 III 1.4 2. 6-diclorofenol indofenol 0.4 2.2 0.1M Azida de sodio Fracción mitocondrial 10% (hígado de rata) III.5 0. barbital sódico y azida de sodio. En el sistema p±fenilendiamina + cadena rédox mitocondrial.5 0.1M P±fenilendiamina 1% Homogenizado de mitocondrias Mezclar.1M pH 7. dejar en 10% ambiente por 20 0.5 0.1M Rotenona 0.5 Mezclar.5 0.1M Barbiturato de sodio 0.0 0.5 1. ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (en ml.0 0.) Buffer fosfato 0.0 0.5 0.1M Rotenona 0.0 0. Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos).5 0.1M Barbiturato de sodio Azida de sodio Homogenizado mitocondrial 10% I 1.2 0.1M pH 7.4 Azida de sodio Barbiturato de sodio 0.02 % Malato 0. pH: 7.02 % p-fenilendiamina 1% Malato de sodio 0.24 II. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0.2 III 1.0 1. verificar el efecto de los inhibidores rotenona.5 V 0.5 1. barbital sódico y azida de sodio.0 .6-diclorofenolindofenol 0.5 VI 0.5 IV 0.2 1. verificar el efecto de los inhibidores: rotenona.0 0.5 reposo a temperatura minutos.2 0.0 IV 1. TUBOS COMPONENTES (en ml.5 0.1M.

¿Qué inhibidores de la cadena de óxido reducción conoce y a qué nivel actúan? 2. ¿Si utiliza el indicador p±fenilendiamina en un sistema con cadena respiratoria. barbiturato de sodio y azida de sodio? 4. que cambios observaría con la rotenona. IV. Grafique usted en una cadena de óxido reducción biológica. CUESTIONARIO: 1.6-diclorofenolindofenol en un sistema con cadena respiratoria. la acción de los inhibidores e indicadores utilizados en el experimento. barbiturato de sodio y azida de sodio? 3. 5. que cambios observaría con la rotenona.25 Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos). ¿Si utiliza el indicador rédox 2. Indique usted los sustratos y enzimas que intervienen en los sistemas realizados en la práctica. .

02 % Succinato 0. Las enzimas de óxido .1M p±fenilendiamina 1% Homogenizado total de hígado de rata en sucrosa 0. El sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca en un beaker de 100ml. Se coloca el hígado en un petri se elimina la cápsula del hígado y otros tejidos periféricos.25 M Fracción nuclear del homogenizado.fenilendiamina y los componentes celulares de un homogeneizado de hígado de rata obtenidos por centrifugación dif rencial mediante el método de e Schreider y col. II. KCl 0. Se separa el sobrenadante en un beaker.154 M III.reducción usando los indicadores redox 2 . albicans). El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fracción mitocondrial. El animal será sacrificado. inmediatamente se hara un corte longitudinal en el abdomen procediendo a extraer el hígado. INTRODUCCION: Los carbohidratos. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0.6-diclorofenolindofenol 0.6 diclorofenilindofenol y p .4 2. Estos sistemas están constituidos por proteínas. El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocándolo en tubos de polietileno. El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15 minutos en la centrífuga refrigerada.26 PRACTICA N° 09 DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE ÓXIDOREDUCCIÓN I. - - . fosfolípidos. La finalidad del presente trabajo es objetivizar la distribución intracelular de las enzimas de óxido .1M pH: 7.reducción tienen una distribución característica intracelularmente. las enzimas que intervienen en estos pr cesos se encuentran o clasificadas en diversos grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimológica. Fracción microsomal soluble del homogenizado. ácidos grasos. aminoácidos y algunas otras sustancias sufren oxidaciones en el organismo mediante sistemas enzimáticos simples o complejos. grupos prostéticos y átomos metálicos. Fracción mitocondrial del homogenizado.154 M. previa calibración en la balanza. De acuerdo a su estructura y función. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Fraccionamiento Celular Cada grupo recibirá una rata albina (Rattus rattus var. constituyendo la fracción microsomal con el citosol. Todo debe trabajarse entre 0 y 4ºC. Homogenizado al 10%: se pesa 10gr de hígado y se corta en fragmentos pequeños y se coloca en el homogenizador potter y se le agrega solución de KCl 0. Se hace presión manualmente con el embolo girando hacia el fondo. se emplea una centrífuga refrigerada. hallándolas de modo fundamental en una subestructura celular en donde la energía derivada de las oxidaciones es "capturada" en la forma del intermediario macroérgico ATP. El sobrenadante es separado en un beaker de 500ml.

5 0.4 2 ± 6 diclorofenolindofenol Succinato de sodio 0.0 0.5 IV 0.0 0.5 1. ¿Qué es un homogenizado de hígado y cómo se obtienen las fracciones celulares por centrifugación diferencial? 5.5 3 1. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador.5 1.2 II 0. Armar otro sistema. 4.0 0. CUESTIONARIO: 1.5 2 1. ¿Qué es el p-fenilendiamina y cómo actúa en la cadena respiratoria? 3. para interpretar los resultados.2 0.2 0. ¿En que fracciones celulares se encuentran las enzimas de óxido ± reducción? 6. empleando: COMPONENTES Buffer fosfato 0. Grafique usted en una cadena de óxido ± reducción biológica la acción de los indicadores rédox 2.5 - Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente.0 0.5 4 1. para interpretar los resultados. ¿Qué es el 2.5 Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador.0 0.5 0.5 III 0.5 V 0. pH 7. IV.5 1.5 1. Haga un esquema de la centrifugación diferencial .5 5 1.1M.0 0.5 0. pH 7.6-diclorofenolindofenol y cómo actúa en la cadena respiratoria? 2.0 0.2 0.5 0.0 0.5 1 1.27 Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Buffer fosfato 0.1M Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal -soluble Homogenizado total I 1.2 0.0 0.6 diclorofenolindofenol y p±fenilendiamina.0 1.4 P ± fenilendiamina 1% (sustrato + indicador) Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal ±soluble Homogenizado total 0.1M.

pero al año de edad la actividad es igual a la del adulto. después de colangiografía. el resto es una fracción inosoluble llamada amilopectina. En el suero humano. INTRODUCCION: La amilasa es una enzima que hidroliza el almidón. se les clasifica en alfa y beta amilasa. edema y pancreatitis están presentes indudablemente. trombosis mesentérica. después de ruptura esplénica. uremia después de la administración de codeína. no es probable el diagnóstico de pancreatitis aguda. después de la administración secretina. La amilasa salival y pancreática humana esta dentro del grupo de las primeras. con frecuencia 2-3 días después. difiere de la amilasa porque contiene además enlaces alfa 1-6 glucosídicos frecuentemente ramificados. Se ha reportado incremento después de la ingestión de alcohol. El origen de la amilasa sérica humana incluye al páncreas y glándulas salivales. En pancreatitis se llega hasta 2000 a 3000 unidades. amilasa y amilopectina producen sólo B-glucosa por hidrólisis. En normales. en pacientes con insuficiencias pancreática. Ambas. Después de la administración de morfina en normales se incrementa la amilasa sérica. En los casos señalados se ha propuesto la prueba funcional de la amilasa sérica después de la administración de secretina y morfina. morfina. mide la cantidad de almidón hidrolizado y por ende la actividad de amilasa de la muestra.28 PRACTICA N° 10 DETERMINACION DE AMILASA SERICA I. En la bilis no hay actividad. Si liberan alfa o beta maltosa. las elevaciones son (con excepción de los niveles obtenidos después de la administración de opiáceos) menos de 500 unidades. Es posible encontrar valores más altos. . úlcera duodenal o gástrica penetrante o perforada. músculo estriado. enfermedad séptica aguda del coledoco. El presente experimento tiene por finalidad determinar la amilasa sérica en personas normales y/o con alteraciones patológicas especialmente del pancreas. las cuales explicarían probablemente menos del 25% de la actividad sérica normal. Los valores normales de amilasa por el método de Caraway calibrado en unidades Somogy es de 60 a 180. en el que la cantidad de almidón y tiempo de incubación son ajustados de manera que sólo una porción de almidón es hidrolizado cuando la reacci n ó es parada por la adición de yodo. Bajos niveles pueden encontrarse en pancreatitia crónica y en carcinoma pancreático cuando el daño es extenso y hay insuficiencia de las acinos glandulares. La amilasa comprende a sólo el 20% del almidón y es soluble en agua. trompa de Falopio y tejido adiposo. Para la mayor parte. la explicación no es clara. La amilasa puede ser detectada en niños desde 1 a 2 meses de edad y los valores son más bajos que en el adulto normal. Si dentro de 24 horas no se eleva. obstrucción intestinal. diuréticos tiazídicos. la amilasa se encuentra grandemente incrementada y retorna a los valores normales lentamente. así como en la orina existe actividad amilásica. La diferencia entre la cantidad de color azul formado en la muestra incubada y el blanco incubado por la adición de suero después de la incubación. También ha sido informado en leche y en el semen humano. Para la determinación de amilasa usamos el método de Caraway. La alfa amilasa actúa rompiendo los enlaces alfa 1-4 glucosídicos en la parte central de la amilasa formando una mixtura de pequeñas dextrinas + maltosa. peritonitis. carcinoma bronconígeno y en neumonía. La amilasa es un poliglucósido de configuración lineal de unidades de glucosa unidos por enlace alfa 1-4 glucosídicos. En otros. En obstrucción de los conductos puede elevarse. cirrosis. Muy raramente permanece elevada 4-6 días. Otras fuentes incluyen el hígado. encefalitis viral. En algunas de estas condiciones. La elevación puede ocurrir en otras condiciones que incluyen enfermedad de las glándulas salivales (pancreatitis). Entre 2 ± 12 horas después de producida la pancreatitis aguda. la amilisa sérica se altera.

5. II BLANCO 5. CUESTIONARIO: 1. 0. 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): Armar el siguiente sistema: (Utilizar dos frascos volumétricos ± Erlenmeyer de 50 ml. en función de la actividad enzimática? ¿Cómo explica usted el diferente comportamiento de la amilasa hepática y pancreática sometidas a electroforesis? ¿Por qué la concentración de amilasa sérica es menor durante los primeros meses de vida lactante? . 4.0 : y Solución Stock de iodo : y Solución iodada de trabajo: III. De qué manera el ión cloruro activa a la amilasa ¿Qué semejanza o diferencia puede establecer usted entre amilasa dializada y no dializada. Leer 660 nm.29 II.0 ml.0 ml.1 ml. debido a que las proteínas séricas disminuyen la cantidad de color producido por el complejo yodo ± almidón y este podría ser diferente). 2.0 ml. 5.5 minutos exactamente 800 = Unidades de amilada por 100 ml (Se requiere un blanco por cada muestra de suero. IV. 35 ml. pH 7. espectrofotómetro a Incubar a 37°C durante cinco minutos ambos frascos Mezclar e incubar a 37°C durante 7. en CÁLCULO Absorbancia del _ Absorbancia del blanco problema _______________________________________ X Absorbancia del blanco 5. 3. Mezclar bien.0 ml. REACTIVOS A UTILIZAR: y Sustrato de almidón Bufferado.1 ml. 35 ml.) I PROBLEMA Sustrato de almidón Bufferado Retirar los frascos y agregar suero Retirar los frascos y agregar suero Agua destilada Solución iodada de trabajo.

30 .

La entrada de la glucosa en estas células está supeditada a que. la constante disponibilidad de este sustrato a los tejidos. Por otra parte. En casi todos los demás tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las células por simple difusión. el organismo dispone de una compleja maquinaria metabólica que permite asegurar la constancia de la concentración de glucosa en la sangre y. Este es un caso interesante en que un sistema de transporte a través de la membrana favorecería a otro. . y de origen endógeno. Este mecanismo requiere ATP como fuente de energía. por lo tanto la concentración de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo. producción endógena de glucosa así como la utilización y excreción de la misma. posiblemente porque se une a la misma proteína transportadora que lleva el sodio. proviene de dos orígenes: de origen exógeno de los alimentos. por la bomba de sodio y potasio. Este proceso. Por todo esto. al salir del Na+ mantenga alta concentración en el líquido extracelular. Según el método l de Folin Wu. por ello.31 II UNIDAD METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS REUNION DE LABORATORIO N° 05 PRACTICA N° 11 DEMOSTRACION DE LA DIGESTION Y ABSORCION DE LOS CARBOHIDRATOS: GLICEMIA PRE Y POST-PRANDIAL. que proviene del hígado por glucogenólisis. El conocimiento de la glicemia es importante no sólo porque permite tener una idea integral del mecanismo de homeostasis metabólica existente. con el método de la glucosa oxidasa la concentración varía entre 70 ± 110 mg/dl. Diversos factores que inciden sobre la absorción. hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina. y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentración de sodio en fluído extracelular. el transporte de glucosa al interior de las células es por difusión pasiva. Se cree que está íntimamente ligado al transporte de sodio. La glucosa en sangre. el sodio. en particular en el tejido adiposo. El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a través de las células de la mucosa intestinal no es muy conocido. el corazón y el músculo esquelético. sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea es una de las fuentes de energía más importantes en el organismo y en algunos tejidos altamente especializados. con ella. En este caso la glucosa entra en la célula. Los valores normales de glucosa en sangre son variables de acuerdo al método utiizado. I. se llama cotransporte. sino que lo hace por un mecanismo de difusión controlada. En el cerebro y los glóbulos rojos es la única fuente de energía. volvería a salir de la célula. Varía entre los 80 ± 120 mg%. siendo el hepatocito permeable para este metabolito. contribuyen a mantener constante la concentración de glucosa en sangre. En el caso del hígado. A su vez.

Agregar 3 partes de enzimas GOD/POD previamente homogenizadas. Antes de multiplicar D x f. Rotular y fechar. La determinación de la glicemia se realizará por el método Enzimático de la glucosa oxidasa. --------20 ul 2 ml Incubar todos los tubos 10 minutos en baño de agua a 37 ºC Leer en Espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco. se deja reposar 10 minutos. cuál es el rango considerado normal para la glicemia basal? Explique las variaciones en los valores.Reactivo Fenol: Solución de Fenol 55 mmol/l. S (Standard). que usted puede encontrar por ejemplo en una intolerancia a la glucosa. 50 partes de Reactivo 4. (Desconocido post prandial).GOD/POD: Solución de glucosa oxidasa (1. Colocar las muestras en tubos de ensayo. luego se centrifuga a 3000 RPM por 10 minutos. colocar: COMPONENTES Standard Muestra (suero preprandial) Muestra (suero postprandial) Reactivo de trabajo B ------------2 ml S 20 ul --------2 ml Dpre. Dpre. Utilizar 4 tubos de ensayo: B (Blanco). . . de sangre de la flexura del codo.Estándar: Solución de glucosa 1 g/l . ¿Actualmente. Cálculo de los resultados : Glucosa (g/l) = D x f donde 1. Mezclar por inversión sin agitar.00 g/l f = ----------- S y D = Dpre. II. se extraerán 5 ml.AF: Solución de 4 ± aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0.32 La finalidad de la siguiente práctica es demostrar la digestión y absorción de la glucosa.Preparación del Reactivo de trabajo: 500 partes de agua destilada. CUESTIONARIO: 1. cuantificando la glicemia pre y postprandial. por el método de Glucosa oxidasa. REACTIVOS A UTILIZAR . III. . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES : Se tomarán dos muestras de sangre : La primera: La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra.Reactivo 4. después de la ingesta alimenticia.000 U/ml) y Peróxidasa (120 U/ml). Separar el suero. con jeringa hipodérmica de 10 ml. ----20 ul ----2 ml Dpost.000 partes con agua destilada. Restar a D el Blanco (B) y el resultado se multiplica por f.92 mol/l. IV. tanto en personas normales como en casos patológicos.AF. 50 partes de Reactivo Fenol y llevar a 1. (Desconocido preprandial) y Dpost. como máximo. En esos momentos. y con aguja N° 20. La segunda: Esta muestra se tomará después de una hora. y Dpost. .

lugares principales de almacenamiento. En el hígado el glucógeno se incrementa después de la ingesta de alimentos (período post prandial) llegando a los límites máximos cuando la dieta es abundante y/o en base a carbohidratos. ¿Cuál son los criterios bioquímicos. glucógeno sintetasa y algunas otras que regulan la síntesis y degradación.KOH al 60 % . para el diagnóstico de diabetes mellitus? 5.Na2S04 solución saturada. . .Homogenizado de hígado de rata al 10 % (pesar 10 g.) III. El glucógeno es también fácilmente hidrolizable por alfa y beta amilasa para rendir glucosa y maltosa respectivamente.Fenol al 80 % .4 y las ramificaciones se forman por enlaces glucosidicos alfa 1. EXTRACCION DE GLUCOGENO HEPATICO (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Homogenizado de hígado en ayunas Homogenizado de hígado post prandial I 0.4 y alfa 1. relacionados con la glicemia.Alcohol absoluto.6 los cuales se presentan con frecuencia aproximada de uno por cada 10 residuos. El glucógeno puede ser aislado de los tejidos por digestión con soluciones de hidróxido de potasio caliente en los cuales los enlaces no reductores alfa 1. INTRODUCCION: El glucógeno está presente en el citosol en forma de gránulos los que contienen las enzimas glucógeno fosforilasa. de hígado y homogenizar con agua destilada. pero las concentraciones varían en los diferentes tejidos correspondiendo las concentraciones más altas del hígado y al músculo esquelético.5 . ¿Conoce otros métodos para determinar la glicemia? Explique su fundamento 4.6 son estables. La finalidad de la siguiente práctica es cuantificar el glucógeno en ayunas y después de la uingesta de alimentos y evaluar los valores encontrados relacionados con los factores que determinan sus síntesis y degradación II. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.5 --II --0. La acción de la beta amilasa también rinde una dextrina límite. . REACTIVOS A UTILIZAR . Se encuentra glucógeno o se puede sintetizar en cualquier célula del organismo. ¿Qué variaciones fisiológicas de glicemia puede usted señalar? PRACTICA N° 12 INFLUENCIA DE LA DIETA EN LA FORMACIÓN Y ALMACENAMIENTO DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO I. 3. La mayoría de los residuos de glucosa en el glucógeno están ligados por enlaces glucosídicos alfa 1.H2S04 concentrado. El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa de fácil disponibilidad. ¿Cómo esperaría encontrar los valores de la glicemia dosada en la sangre venosa y en la sangre arterial? Fundamente las variaciones que se pueden encontrar.33 2. En cambio el glucógeno post prandial es debido a que la glucogénesis se incrementa cuando las concentraciones en sangre alcanzan valores de 150 mg/100 ml ó más.

0 --Muestra del tubo II. motivo del experimento? 4.5 Calentar los tubos en baño maría a 100 C por 10 min.1 0. Alcohol al 98 % 5. CUANTIFICACION POR METODO COLORIMETRO DEL GLUCOGENO EXTRAIDO Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml)) I II BLANCO Muestra del tubo I del Sistema anterior««««««« 1.1 Mezclar.0 5. CUESTIONARIO: 1.0 5.0 Mezclar y dejar en el baño de agua helada durante 5 minutos más. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones de ayuno? Dé usted las razones metabólicas que expliquen su resultado. Blanco) x Factor IV. ¿Qué relaciones metabólicas puede usted establecer entre los valores de glucógeno obtenidos en ambas muestras de hígado de rata. Eliminar el sobrenadante y colocar boca a bajo los tubos sobre papel de filtro por 5 minutos.I ± Lect.34 KOH al 60 % 0.1 0. CALCULOS: Factor Espectrofotómetro = 7 g % de glucógeno = (Lec.1 Mezclar. Agregar agua destilada 5. gota a gotaen el centro de c/tubo 5. 2. del Sistema anterior« -1. Reposo por una hora.0 Disolver el precipitado por agitación. Centrifugar a 3500 RPM por 10 min. . Leer en el fotocolorímetro con filtro verde.5 0. Colocar los tubos en agua helada durante 5 min. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones post prandial? 3. ¿Porqué mecanismo metabólico el glucógeno incrementa cuando la concentración de glucosa en sangre es mayor de 150 mg/dl? 5.0 5. 540 n m. Explique los mecanismos que regulan la homeostasis de la glucosa y el rol del glucógeno durante el ayuno prolongado.1 0.0 Fenol al 80 % 0. y sin retirar los tubos del baño helado: Agregar H2S04 cc.0 -Agua destilada 1.0 5.0 1.0 2.0 Na 2SO4 solución saturada. 0.

Siendo en la sangre arterial mayor que en la venosa. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas.35 REUNION DE LABORATORIO N° 06 PRACTICA N° 13 REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA ACCION DE LA HORMONA INSULINA I. La secreción de insulina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia.Conejos adultos de más de 2 kg. REACTIVOS A UTILIZAR . El efecto más importante de una deficiencia insulínica es el de un nivel sanguíneo de glucosa elevado (hiperglicemia).Jeringas hipodérmicas de 1 cc. aminoácidos. La insulina ejerce efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otros nutrientes. de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la producción y la utilización de la glucosa sanguínea. una excesiva excreción de glucosa por la orina (glucosuria) y un reducido nivel de glucógeno en el hígado. La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos. La insulina también favorece la conversión de los hidratos de carbono en ácidos grasos y por otro lado inhibe la gluconeogénesis a partir de los aminoácidos. la glicemia es muy constante.Glucómetro. a la vez que acelera la oxidación de glucosa en diferentes tejidos. el efecto se debe fundamentalmente a que la hormona favorece la formación de glucógeno en el hígado y en el músculo. En condiciones normales. . de manera que cada vez se eleva la glicemia. cuya sensibilidad está regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipófisis por el otro. Esta hormona es producida por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas y es secretado en respuesta directa al incremento de glucosa en la sangre. lipogénesis y otras semejantes. otros carbohidratos y de glucosa absorbida por el intestino. II. . . pues es utilizada por todas las células para producir energía y por algunas células para funciones más especializadas por ejemplo glucogénesis.Solución de insulina cristalizada (Lilly): I Unidad por ml. . se produce más insulina que tiende a aminorarla. La glicemia se eleva después de la ingestión de un alimento rico en hidratos de carbono para luego descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas después de la ingestión vuelve al nivel de ayunas. Se explica así que la falta de insulina determina una hiperglicemia que es el signo fundamental del cuadro denominado Diabetes. Los mecanismos reguladores de la concentración de glucosa son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los primeros actúan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las glándulas de secreción interna. La administración de insulina va seguida de la glicemia (hipoglicemia) cuya magnitud depende de la dosis administrada. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de administración de insulina. en ayunas. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea proviene de: glucógeno hepático.

CUESTIONARIO: 1. Hacer una gráfica de glicemia vs tiempo       IV. lo que hace un total de tres muestras en una hora. Explique brevemente la regulación de la glicemia. EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE INSULINA.36 III.  Luego extraer muestras de sangre a los 15 . 3. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. 4. Utilizar una jeringa hipodérmica de 1 ml. 2. que facilita la medida de la dosis. La que servirá para establecer los valores basales de glicemia. como resultado. Explique cómo y porqué se producen los signos y síntomas del cuadro clínico de hipoglicemia. Dosis de la solución de insulina cristalina (I Unidad por ml) inyectar I Unidad por Kilogramo de peso corporal. de la tasa de llegada e índice de salida de la glucosa de la sangre. . 30 y 60 minutos después de inyectada la insulina. Explique el mecanismo de acción de la insulina en la homeostasis de la glucosa. en términos generales. Anotar los resultados en relación al tiempo. Explique la naturaleza química y las acciones biológicas de la insulina. y y Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de insulina a inyectar.  Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de insulina.  Extraer una primera muestra de sangre del pabellón auricular del conejo. ¿Cuáles son las hormonas contrarreguladoras y su mecanismo de acción? 5.

fosfatasa. INTRODUCCION: La adrenalina. Servirá para establecer los valores basales de glicemia. 4. tiene acción hiperglicemiante. sometidos a ayuno de 8 a 12 horas.025 mg por cada kilogramo de peso corporal que corresponde a 0. . II. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de la administración de adrenalina. lo que hace un total de tres muestras en una hora. con especial referencia al metabolismo de los carbohidratos. 2. además de actuar en el músculo. 4. La secreción de adrenalina parece estar condicionada en forma importante por el nive de glicemia. por la ausencia en este de la glucosa 6. Explique la naturaleza química y las acciones fisiológicas de la adrenalina. Extraer una primera muestra de sangre. LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE 1. REACTIVOS A UTILIZAR . del pabellón auricular del conejo. . construir una gráfica. III.Conejos adultos de más de 2 kg de peso corporal. tomando las variaciones en relación al tiempo.Glucómetro. 3. ACTIVIDADES INTRUCCIONALES: Procedimiento  Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de adrenalina a inyectar. ¡ ¡ ¡ IV. Con los resultados así obtenidos. Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de adrenalina según el peso del animal.Solución de adrenalina 0.25 ml de la solución a utilizar por kg de peso.1 mg/ml) inyectar 0.1 mg por ml. Luego extraer muestras de sangre a los 15 . ¿Cuál es el mecanismo de acción hormonal de la adrenalina a nivel de sus órganos blanco? Explique de manera suscinta el efecto de la adrenalina sobre la glicemia. El efecto glucogenolítico de la adrenalina es debido a que activa a la fosforilasa. ¿Cuál es el efecto metabólico de la adrenalina sobre el hígado y sobre el tejido muscular y que efecto produce sobre la glicemia? . hormona secretada por la médula suprarrenal. CUESTIONARIO: 1. . Utilizar una jeringa hipodérmica de tuberculina que facilita la medida de la dosis. 2. ello se debe a que favorece la conversión del glucógeno en glucosa (glucogenólisis) en el hígado. 3. Con cada una de las citadas muestras realizar los dosajes de glucosa según el método de Glucocinta 5.Jeringas hipodérmicas de 1 cc. EXTRACCION DE ADRENALINA. la glucogenólisis se realiza con la formación de lactato el que va ha contribuir directamente a la formación de glucosa y glucógeno en la célula hepática por los mecanismos gluconeogenéticos. 30 y 60 minutos después de inyectada la adrenalina. si l aparece hipoglicemia se segrega más adrenalina y glucagón que aceleran la regulación que espontáneamente debe realizar el hígado.  Dosis de la solución de adrenalina (0. Anotar los resultados en relación al tiempo.37 ACCION DE LA HORMONA ADRENALINA I.

en presencia de glucosa (sustrato) de la orina remueve de éste 2 iones hidrógeno (2H+) formando gluconolactona). Los azúcares forman más o menos la décima parte de dicha cantidad y de ella no puede decirse que su totalidad esté constituída por glucosa. formaldehído. sin tomar en cuenta su acción en el metabolismo hidrocarbonado? REUNION DE LABORATORIO N° 07 PRACTICA N° 14 DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA EN ORINAY SU DIFERENCIACIÓN DE OTROS AZUCARES REDUCTORES I. por acción de la glucosa oxidasa produce ácido glucorón más peróxido de ico hidrógeno. Sin embargo. ¿Qué efectos tiene la adrenalina. En la orina. puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que podemos señalar: a) Otros azúcares reductores: lactosa.5 y 1. el cual es hidratado a ácido glucónico. Cuando la capacidad de reabsorción renal disminuye. creatinina. c) Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato cloral. Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza para determinar glucosa en orina.38 5. La glucosa puede ser determinada de manera específica utilizando como reactivo básico la glucosa oxidasa (método enzimático). ácido glucorónico. además de glucosa. La glucosa del filtrado glomerular renal se reabsorbe en su totalidad en los tubos contorneados proximales. REACTIVOS A UTILIZAR . Este. de uso generalizado en clínica. II. El peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa oxida a la 0-tolidina y toma color azul. ácido úrico. ácido ascórbico. pero como anotamos éste identifica a las sustancias con capacidad reductora y por tanto es de carácter inespecífico. Los iones hidrógeno removidos se combinan con el oxígeno atmosférico y forman peróxido de hidrógeno (H2O2). La glucosa oxidasa. Por el contrario. INTRODUCCION: En la orina de sujetos normales no existen cantidades detectables de azúcares en orina. pero cuando la glicemia supera los 180 mg % se puede producir glucosuria (presencia de glucosa en orina) porque en estas condiciones se supera la capacidad del riñón para reabsorverla (dintel renal). es posible encontrar cierta cantidad de elementos reductores que se eliminen diariamente entre 0. La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras. La prueba está basada en que la glucosa urinaria en presencia de oxígeno. fructuosa. la orina en glucosa aparece aunque ésta se encuentre en concentraciones normales en la sangre (diabetes insípida). etc. utilizando un método específico a base de glucosa oxidasa y otro inespecífico en base al reactivo de Benedict. galactosa y pentosas. y por tanto es explicable que no aparezca glucosa en orina. en presencia de peroxidasa produce 0-tolidina oxidasa (de color azul) más agua.5 g/l. b) Otros compuestos orgánicos: ácido homogentísico. cuando existe insuficiencia renal (menor filtración) no aparece glucosa en la orina aunque la concentración de glucosa se encuentra elevada por encima de 180 mg %.

Explique que es el umbral renal de la glucosa.39 - Reactivo de Benedict. Determinación de sustancias reductoras en orina mediante el reactivo de Benedict. Fundamente la utilización del reactivo de Benedict para la detección de sustancias con capacidad reductora. Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recién emitida contenida en un depósito de 5. III. 5. 2. Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml. 3. Compare la intensidad de la coloración azulada con una escala adjunta que representa aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa. Observar si a los 60 segundos. 2. primero con el reactivo de Benedict y luego por el método de la glucosa oxidasa Que presunciones plantearía si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de Benedict da resultado positivo y sin embargo. 4.10 ml. CUESTIONARIO: 1. 2. Agitar para evitar que el líquido se proyecte hacia fuera del tubo. realizamos la siguiente determinación con la misma muestra de orina. adquiere o no color azul. incluida la glucosa Que resultados podrían obtenerse al tratar una muestra problema de orina. 3. la reacción demuestra la presencia de sustancias reductoras. Colocar en baño de agua hirviendo por 5 min o exponer al fuego directo hasta ebullición por 1 min. Determinación enzimática de la glucosa en orina (Método de la glucosa oxidasa). en relación a la glicemia del paciente podría plantear? Explique el fundamento del método de a glucosa oxidasa para la detección de glucosuria. IV. después de humedecida la cinta. Si aparece un precipitado de color rojo ladrillo. 3. 6. Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del líquido contenido en el tubo. 4. Agregar orina problema: 5 gotas. Observar si hay cambio de color y precipitado. al ser tratada con el método de la glucosa oxidasa. da negativo Ante una prueba positiva de glucosa en orina: ¿Qué presunciones diagnósticas. Procedimiento: 1. Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas (Glucocinta Lilly). ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. . 1. Llevar al baño de agua hirviendo por 5 min o exponer el tubo al fuego directo hasta que hierva por 1 min. Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras.

40 .

III y IV. Síndrome de Hurler. REACTIVOS A UTILIZAR . II. De acuerdo a su composición química los mucopolisacáridos están agrupados en dermatán sulfato. La finalidad del experimento es determinar cualitativamente en orina la excesiva excreción de mucopolisacáridos. Los individuos con MPS secretan grandes cantidades de mucopolisacáridos. IV. . 20 ml.Papel Whatman I impregnado con Azure-A .Usar orina fresca o de 24 hrs conservadas en refrigeración (no usar preservantes).Solución de Lavado :  Metanol  Acido acético glacial  Agua destilada. RESULTADOS Positivo: aparición de un color púrpura. 0. en contacto con mucopolisacpáridos forma un complejo de color púrpura metacromático. Síndrome de Hunter. Dejar por 20 min. INTRODUCCION: Determinar desórdenes genéticos puede involucrar los sistemas enzimáticos esenciales del metabolismo de los mucopolisacáridos. Síndrome de Sanfilippo. resultado obtenido cuando la excreción está sobre el límite superior normal de 15 mg/día.41 PRACTICA N° 15 IDENTIFICACION DE MUCOPOLISACARIDURIA I. cordón umbilical. Los mucopolisacáridos son sustancias de gran peso molecular que se encuentran en varios tejidos: Conectivo. Dejar 3 min. Transferir a una caja Petri llena de solución de lavado. II. 300 ml . válvulas del corazón y son responsables de las características físicas de estas estructuras. Si un resultado cualitativo para investigar mucopolisacáridos en orina ha sido positivo ¿Porqué debe ser confirmado y cuantificado por cromatografía o precipitación? ¿Cuál es la constitución química básica de los glicosaminoglicanos (mucopolisacáridos)? ¿Cuál es la constitución química básica de los proteoglicanos? Cite 5 ejemplos de éstos. CUESTIONARIO: 1.Poner una gota de orina al centro de un papel de prueba con Azure-A. Estas son subdividas en varios grupos tales como : Síndrome de Morquiolo. Un resultado positivo por este procedimiento debe ser confirmado y cuantificado por columna cromatográfica ó utilizando la reacción de precipitación con cloruro de cetil piridium.1 ml. 2. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. Negativo: aparición solamente de un color azul pálido. . llamados también MPS I. cerca de 100 mg/día. . cantidad que es bastante elevada si se compara con los 15 mg/día que excretan las personas normales. 3. III. heparán sulfato y queratán sulfato. Sacar y secar la tira de papel en estufa a 80º C o con aire caliente. los cuales son excretados anormalmente en grandes cantidades en las mucopolisacaridosis (MPS). cartílago. La presencia de mucopolisacáridos en orina puede detectarse por un simple procedimiento o Test de Identificación de Mucopolisacáridos que se basa en que el papel Whatman I impregnado con el colorante AZURE-A.La orina turbia debe ser filtrada o centrifugada previamente. aorta.

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4.

¿Cuál es la importancia biológica del ácido hialurónico, condroitina y heparina?

III UNIDAD METABOLISMO DE LIPIDOS

REUNION DE LABORATORIO N° 08
PRACTICA N° 16
DEMOSTRACIÓN DE LA DIGESTION DE LAS GRASAS IN VITRO. ACCION EMULSIFICANTE DE LAS SALES BILIARES SOBRE LAS GRASAS. ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA SOBRE LOS TRIGLICÉRIDOS Y EFECTO DE LAS SALES BILIARES
I. INTRODUCCION: Los triglicéridos son los principales lípidos de la dieta. En el estómago ocurre la acción de la lipasa gástrica y la licuefacción de la masa de lípidos de los alimentos por contraccion peristálticas. La es principal digestión ocurre en el duodeno, tiene lugar en la interfase agua-lípido y su velocidad depende del área de superficie de la interfase, la cual es grandemente incrementada por el movimiento peristáltico del intestino combinado con la acción emulsificante de los ácidos biliares. Los ácidos biliares son moléculas anfipáticas sintetizados por el hígado a partir del colesterol y secretados como conjugados de glicina y taurina. La lipasa pancreática (Triacilglicerol lipasa) cataliza la hidrólisis de los triglicéridos en sus posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto con ácidos grasos. La actividad enzimática de la lipasa pancreática incrementa grandemente cuando contacta la interfase agua-líquido, un fenómeno conocido como activación interfacial. La unión a la interfase agua-líquido requiera la colipasa, una proteína de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con la lipasa pancreática (449 residuos), con cambios conformacionales que f rma una o superficie hidrofóbica y deja libre el centro activo. La alteración en la digestión o absorción de las grasas produce esteatorrea La finalidad de la práctica es demostrar la acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando su efecto con el agua y el cloroformo. Asimismo la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y el efecto de las sales biliares. II. REACTIVOS A UTILIZAR III. Cloroformo Aceite vegetal, de olivo Solución de sales biliares Buffer fosfato 0.1M pH 8,0 Emulsificación de aceite vegetal Solución de fenolftaleina (Solución alcohólica) Hidróxido de sodio (NaOH) 0.1N

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

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y

Acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas utilizando tubos de 15 x 125 mm. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Aceite de olivo(gotas) Agua destilada (ml) Cloroformo (ml) Sales Biliares (ml) Agitar enérgicamente los tubos Dejar en reposo y anotar los resultados para interpretarlos Acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y efecto de las sales biliares sobre la reacción enzimática utilizando tubos de 20 ± 25 x 150 mm. COMPONENTES (ml) TUBOS Emulsificación de aceite vegetal Buffer fosfato 0.1M pH 8.0 Solución de sales biliares 1 % Solución de extracto pancreático 1 % Agua destilada I 2 2 2 3 II 3 2 2 2 III 3 2 2 2 IV 3 2 2 2 Tubo 1 3 5 Tubo 2 3 3 2 Tubo 3 3 2 -

Mezclar los 4 tubos y llevar al baño maría a 37 °C , por 30 minutos, agitando de vez en cuando. Al finalizar el tiempo de incubación retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftaleína. Mezclar bien y luego realizar la titulación. TITULACION: Utilizando una pipeta graduada de 1 ml, dejar caer gota a gota NaOH 0,1N en el fondo de cada tubo del sistema, mezclar bien hasta la aparición de un color rosado tenue persistente. Anotar la cantidad de NaOH 0,1N gastados. Anotar los resultados para su interpretación. IV. CUESTIONARIO: 1. Explique lo que son sustancias anfipáticas. 2. Diferenciar emulsión de solución, acción de las sales biliares vs cloroformo. 3. ¿Cuántas clases de lipasa pancreática actuán en el intestino? 4. Cuál de los métodos para medir la actividad enzimática se ha empleado en esta práctica. Explique el papel de la fenolftaleína en la titulación. 5. Diferencie la absorción de los ácidos grasos según su tamaño.

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PRACTICA N° 17
DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS PRE Y POST PRANDIAL EN SUERO HUMANO
I. INTRODUCCION: Los lípidos de la dieta son principalmente triglicéridos. Son transportados junto a colesterol y fosfolípidos por los quilomicrones, formados en el enterocito. Los quilomicrones son las lipoproteínas más grandes, menos densas, ricas en triglicéridos, con la apoproteína apo B48. Por el conducto toráxico llegan a la circulación general. El pico máximo de lipemia postprandial se observa entre las 4 y 6 horas de la ingesta, y al cabo de 9 a 10 horas retorna a los valores basales de lípidos, especialmente de los triglicéridos. Los niveles de lípidos postprandiales, especialmente de los triglicéridos dependen de la cantidad de lípido de la dieta, de la digestión y absorción, de los niveles basales sanguíneos, de la acción de la lipasa lipoproteic en los tejidos extrahepáticos. La lipasa a lipoproteica actúa sobre los triglicéridos de los quilomicrones, liberando ácidos grasos que son captados por los tejidos extrahepáticos. Los quilomicrones son convertidos en remanentes de quilomicrones y captados por el hígado. Se ha considerado al incremento de la lipemia postprandial como un factor riesgo de aterogénesis. La finalidad de la práctica es demostra las variaciones de la concentración de trigliceridos en suero después de la ingesta de alimentos de alto contenido de grasas II. REACTIVOS A UTILIZAR - Reactivo enzimático para determinación de Triglicéridos ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Un alumno por cada mesa vendrá en ayunas de al menos 10 horas, a las 7 a.m. se les extraerá una muestra basal. Ingerirán una dieta rica en grasas conteniendo un vaso de leche, un huevo, 2 panes y 10 aceitunas. A las 4 y 7 horas de la ingesta, se obtendrá una segunda muestra. Se obtendrá el suero y se hará la determinación de triglicéridos. Armar el siguiente sistema. COMPONENTES BLANCO STANDARD DESCONOCIDO Muestra --------10 ul Standard ----10 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar e incubar 10 minutos de 20« 25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. Medir la absorbancia del Standard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A). Cálculos:

III.

C ! 200 v

(ADesconocid o ?mg / dl A (AStandar
1.71 mmol/l 2.28 mmol/l

C ! 2.28 v

(ADesconocido ?mmol / l A (AStandar

Valores Referenciales Sospechoso: sobre 150 mg/dl ó Elevado: sobre 200 mg/dl ó

Alteración de la lipemia postprandial en diabetes y familiares de diabéticos. Grafique los cambios de triglicéridos postprandiales en función del tiempo. Cuál es el efecto de la edad. Destino de los productos de acción de la lipasa lipoproteica sobre los triglicéridos. 4. 3. .45 IV. 2. 5. el ejercicio y el género sobre la lipemia postprandial. Explique porqué el incremento de la lipemia postprandial es considerado un factor de riesgo coronario. CUESTIONARIO: 1.

. de la siguiente manera: II. y en sangre hasta 1mg/dl. DETERMINACION SEMICUANTITATIVA DE CUERPOS CETONICOS EN ORINA I. de la beta oxidación y de la cetogénesis. Nitroprusiato de sodio 10% 3 gotas Amoníaco (agregar lentamente por las paredes del tubo.Nitroprusiato de sodio. Estos son el ácido acetoacético. cristales. Prueba de Rothera y Trabajar del tubo identificado como orina patológica y Utilizar nitroprusiato en polvo. en la dieta pobre en carbohidratos. INTRODUCCION: La beta oxidación de los ácidos grasos en el hígado. hipertiroidismo. sin mezclar) 1ml _________________________________________________________________________ Anotar sus resultados.Sulfato de amonio. a nivel mitocondrial. en toda hipercatabolia como la fiebre. . en los vómitos. el aumento de la lipólisis. Aumentan en sangre (cetonemia) y en orina (cetonuria) por condiciones fisiológicas como el ayuno prolongado. rinde un color azul violeta. al superar la capacidad de oxidación de los tejidos extrahepáticos lleva a niveles aumentados de cuerpos cetónicos. Procedimiento: Armar el siguiente sistema: COMPONENTES TUBO Orina 3 ml Cristales de sulfato de amonio 0.5 g Mezclar hasta disolver los cristales de Sulfato de Amonio. III.Disponer de dos tubos que contengan orina normal y orina patológica. Su concentración normal en orina es de 125 mg/ 24 horas. Los dos primeros pasan a la sangre y son fuente de energía en los tejidos extrahepáticos como el corazón y el músculo esquelético. Dado que éstos son ácidos se produce acidosis metabólica. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento INVESTIGACION DE ACETONA . solución al 5% en H2O.46 PRACTICA N° 18 IDENTIFICACIÓN DE LOS CUERPOS CETONICOS EN LA ORINA. incluyendo el cerebro en el ayuno prolongado. el ácido beta hidroxibutírico y la acetona. Prueba de Legal El nitroprusiato de sodio diluido en presencia de cuerpos cetónicos. el hiperinsulinismo. En la Diabetes mellitus. especialmente de acetona. a l denominada cetoacidosis diabética. produce acetil CoA que ingresa al Ciclo de Krebs y en parte se utiliza en la síntesis de cuerpos cetónicos (cetogénesis).Cloruro Férrico. En condiciones patológicas como la Diabetes mellitus. en la enfermedad de Von Gierke y otras glucogenosis. solución al 10% en H2O . en el síndrome de Fanconi. REACTIVOS A UTILIZAR: . Los cuerpos cetónicos son eliminados por la orina y la a etona también por la c respiración. El diagnóstico y monitoreo de su tratamiento se hace con su determinación en sangre o/i orina.

1 cc DILUCION 1/10 1/20 1/30 1/40 1/50   Agregar una gota de cada una de las diluciones. cetonuria. CUESTIONARIO: 1.9 cc + + + + + ORINA 0. Compare los métodos para determinar los cuerpos cetónicos. Procedimiento (Se utiliza orina filtrada): COMPONENTES Orina filtrada Cloruro Férrico.9 cc 2. etc. 150 mg/dl. para investigar acetona y tener una cifra aproximada en su cuantía. Esto es debido a que el nitroprusiato de sodio en polvo da reacción positiva solo cuando en la orina sin diluir alcanza la concentración mínima de 10 mg% de acetona y por eso.1 cc 0. 2. se debe multiplicar por 10 el número de veces que se ha diluido ésta. 5. Esperar 20 segundos. Observar la máxima dilución de la orina en el que aparece color azul violeta y multiplicar por el denominador de la dilución alcanzada por 10 y se tendrá la cantidad aproximada de acetona en mg por 100ml. 50. para calcular la concentración en orina diluida. en cada una de las excavaciones que contiene el reactivo.9 cc 1. el ácido acetoacético rinde una coloración rojo burdeos. estimando la concentración como negativo 5. 3. leer en escala colorimétrico. Prueba de Cloruro Férrico o de Gerhart.1 cc 0. Sumergir la tira en el frasco conteniendo la orina. Este método con sus dos variantes es posible aplicarlo al suero sanguíneo. solución 5% en agua TUBO 5 ml gota a gota hasta la aparición del Color rojo burdeos si existe ácido Acetoacético IV. 4.2 g de reactivo sólido de nitroprusiato de sodio en cada una de éstas.9 cc 4. Cuál es el mecanismo fisiopatológico de la cetoacidosis en un paciente que llega al hospital por alcoholismo agudo . Realice una comparación entre la síntesis de cuerpos cetónicos con la etapa inicial de la síntesis de colesterol Defina: cetonemia. INVESTIGACIÓN DE ACIDO ACETOACETICO . 15.1 cc 0. Cuál es la importancia de la cuantificación de los cuerpos cetónicos en el monitoreo de la cetoacidosis.Armar dos sistemas que contengan orina normal y patológica. Se basa en que en presencia de cloruro férrico. Uso de tira reactiva. de la siguiente manera: AGUA 0.47   En una lámina de porcelana con excavaciones colocar 0. 1/20. Diluir la orina al 1/10. 1/30. cetoacidosis y de ejemplos de cada uno de ellos.1 cc 0.9 cc 3.

el síndrome nefrótico. por el método enzimático y la determinación de HDL.El III Panel de Expertos ha establecido los valores de referencia para el colesterol. regulando su fluidez. Es transportado principalmente por la LDL que es considerada aterogénica. resistencia a la insulina. Hipertrigliceridemia moderada de 200 a 499. REACTIVOS A UTILIZAR: .Precipitante para macro ensayos (PRECa) . En el colesterol se considera 3 niveles: Deseable < 200 mg/dl. o secundarias a otras enfermedades. . cirrosis biliar. La hipertrigliceridemia puede deberse a causa primarias o familiares. El HDL colesterol. la hiperlipidemia familiar combinada la hiperkilomicronemia. Son causas secundarias: la diabetes. y el LDL. . se realizará la determinación de colesterol sanguíneo. alto o protector mayor o igual a 60. la hiperlipidemia familiar combinada. A partir de él se forman los ácidos biliares y las hormonas esteroideas. El LDL colesterol. la gota. hiperglicemia e hipertensión.. de los tejidos hacia el hígado y es considerada antiaterogénica . La hipertrigliceridemia se asocia a disminución de HDL. la disbetalipoproteinemia. severa 500 o más La hipercolesterolemia puede deberse a causas primarias o secundarias. la hipercolesterolemia poligénica. 3 niveles: Bajo o de riesgo < 40. su incremento también es considerado factor de riesgo coronario. Son hipertrigliceridemias primarias. 5 niveles: Óptimo < 100 mg/dl. limítrofe de 150 a 199. la hipertrigliceridemia familiar. el uso de anticonceptivos orales. el hipotiroidismo. INTRODUCCION: El colesterol es un componente importante de las biomembranas. y el resto en la VLDL y HDL. ictericia obstructiva.Reactivo precipitante de HDL: ácido fosfotungstico. el HDL. En la presente práctica. el alcoholismo.Reactivo Standard para colesterol 50 mg/dl. Entre las secundarias: La diabetes. previa precipitación de las otras lipoproteínas. Los triglicéridos an ayunas circulan unidas a las VLDL y son fuente de energía para los tejidos. II.48 REUNION DE LABORATORIO N° 09 PRACTICA N° 19 DETERMINACION DE PERFIL LIPIDICO I. clorhidrato de magnesio. el lipoteroidismo. limítrofe alto 200-239 y alto definitivo > 240 (Hipercolesterolemia > 200 mg/dl). etc. normal a 40 a 59. obesidad central. .Precipitante para semimicro ensayos (PRECb) ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN DE COLESTEROL SANGUÍNEO Armar el siguiente sistema: COMPONENTE BLANCO PROBLEMA ESTÁNDAR Suero ----10 ul ----Estándar 200 mg/dl --------10 ul Reactivo enzimático 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar. Medir la absorbancia del Starndard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A) III. incubar 10 minutos de 20«25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. En los triglicéridos se considera: normal menos de 150mg/dl. Entre las hipercolesterolemias primarias se señalan: La hipercolesterolemia familiar. en el denominado síndrome metabólico. La HDL realiza el transporte reverso del colesterol.

49 CALCULOS VALORES REFERENCIALES: Sospechoso: sobre 220 mg/dl Elevado: sobre 260 mg/dl DETERMINACIÓN DE HDL -COLESTEROL: Armar el siguiente sistema: ó 5.17 v ¢ ¢ muestra standard ?mmol/l A ¤ ¤ £ . Centrifugar for 2 minutos a 10000 RPM. respectivamente. incubar por 10 minutos a temperatura ambiente. CALCULOS: Concentración HDL-Colesterol: Macro método : ¤ C ! 150 v A Desconocid o A Standard mg/dl Semi  micro método : ¤ C ! 175 v A Desconocid o A Standard mg/dl TG 5 Concentración de LDL-Colesterol: VALORES DE REFERENCIA: HDL-Colesterol: Hombres LDL  C ! TC  HDL  C  ?mg/dlA Mujeres (mg/dl) ¢ standard £ ¢ ! 200 v muestra ?mg/dl A ó ! 5. incubar por 5 minutos a 37 ºC o 10 minutos a 20«25 ºC.7 mmol/l ó 6. alternativamente por 10 minutos a 4000 RPM Después de centrifugar separar el sobrenadante del precipitado y determinar la concentración de colesterol: Componente Blanco Standard Desconocido Agua Destilada 100 ul --------Standard ----100 ul ----HDL sobrenadante --------100 ul Reactivo de trabajo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar. Leer las absorbancias del desconocido y del Standard. dentro de 60 minutos ( A). comparando con el blanco.7 mmol/l Componente Macro Semi-micro Suero 500 ul 200 ul PRECa 1000 ul ----PRECb ----500 ul Mezclar bien.

7. Cualés son las causas primarias de hipertrigliceridemia. Alteraciones del perfil lipídico en la diabetes y en el hipotiroidismo. 2. Cuál es la importancia de la hipertrigliceridemia en la aterogenesis. 3. 6. 4. Señale la importancia clínica del colesterol. 5.50 Normal > 55 Bajo riesgo 35-55 Riesgo elevado < 35 LDL-Colesterol: Sospechoso: Elevado: IV. Señale las principales causas de HDL disminuido. Realice una breve explicación del rol de la LDL en la aterogénesis. 8. CUESTIONARIO: > 65 45-65 < 45 150 mg/dl 190 mg/dl 1. Señale la importancia fisiológica del colesterol. Realice una breve descripción de hipercolesterolemia familiar y su relación con la cardiopatía isquémica. .

especialmente coronario.  Set de determinación de triglicéridos enzimático. El tratamiento será por 21 días. La dieta es importante en el control de la hiperlipidemia. bajo la supervisión del personal de la sección. LDL y triglicéridos entre ambas ratas.    . como parte del cambio de estilo de vida junto al ejercicio y control de peso.  Dieta standard para ratas a base de maíz. puede producir el incremento de los lípidos sanguíneos. 1-2 representantes de cada mesa se encargarán del control de la dieta. En el presente experimento. Se compararán los valores de colesterol. Con la ayuda del personal de la sección. III. INTRODUCCION: El aumento de los lípidos sanguíneos o hiperlipidemia constituye una situación metabólica de riesgo. aumento de las grasas monoinsaturadas y polinsaturadas. Y secundarias a otras patologías como la diabetes. Se determinará el perfil lipídico antes y después del tratamiento y se compararan los resultados. disminución de las grasas saturadas. Se considera aterogénicos el aumento del colesterol y de los tigliceridos. Las cuales se dividirán en dos grupos en forma aleatoria.  Set de determinación de colesterol enzimático. ha establecido los criterios para una dieta adecuada que incluye disminución de la ingesta de colesterol. Una dieta rica en grasas saturadas aumenta el riesgo de hiperlipidemia y consiguiente mayor riesgo coronario. las que recibiran adicionalmente 2 cc de aceite preparado de sebo de pollo. Extracción de las muestras. etc. Se dispondran de 20 ratas albinas adultas.  Reactivo precipitante para HDL. Se extraera el suero y a cada una se determinara el perfil lipídico siguiendo el método enzimático empleado en la práctica anterior. La ATP III. II.  Sebo de pollo. la hipertrigliceridemia familiar etc. se busca mostrar como la ingesta de una dieta rica en grasa saturada con sebo de pollo por 3 semanas. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procemiento  Tratamiento experimental. sidrome nefrotico.51 PRACTICA N° 20 HIPERLIPEMIA EXPERIMENTAL I. o Las diez restantes conformaran el grupo experimental. REACTIVOS A UTILIZAR:  Ratas de peso aproximado de 200gr. hipotiroidismo. cada mesa obtendrá de cada rata control y experimental una muestra sanguínea de la cola antes del tratamiento y otra al final. o Diez de ellas constituirán el grupo control y seguiran su dieta habitual agua y alimentos (maíz) ad libitum. Las hiperlipidemias pueden ser primarias o familiares como la hipercolesterolemia familiar. HDL. la hiperlipidemia familiar combinada.

7. Qué alimentos son fuentes de omega 3. . CUESTIONARIO: 1. Qué alimentos son fuentes de fibra. Qué alimentos son ricos en grasas monoinsaturadas. Qué alimentos son ricos en colesterol. 5. para el tratamiento de la hiperlipidemia. Qué alimentos son ricos en grasas saturadas.52 IV. Señale en detalle la dieta recomendada por la ATP III. 6. 2. 3. Qué alimentos son ricos en grasas polinsaturadas. 4.

Son exopeptidasas: carboxipeptidasa y aminopeptidasa. . .1 M pH 8. La presente práctica tiene como finalidad demostrar la acción hidrolítica de las enzimas digestivas contenidas en el páncreas sobre la caseína o proteína de la leche. es un proceso complicado que se realiza con el concurso de diversas enzimas proteolíticas Entre estas enzimas proteoliticas tenemos: a) de origen gástrico: pepsina y renina. En el lactante con ausencia congénita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de activación de quimotripsinógeno y procarboxipeptidasa. dipeptidasas.1 M pH 8. y es específica de los enlaces peptidicos sobre el lado carboxílico de residuos de aminoácidos básicos: lisina y arginina solamente. . con retardo marcado del crecimiento.Solución acuosa de ninhidrina al 0. b) de origen pancreático: tripsina. elastasa y carboxipeptidasa. alanina y serina. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) I II III III. existe hipoproteinemia. que provienen de la carne de los alimentos). tripsina.Caseína al 1% en buffer fosfato 0.53 IV UNIDAD PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS: INTEGRACION DEL METABOLISMO REUNION DE LABORATORIO N° 10 PRACTICA N° 21 DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA I. La falta de enzimas proteolíticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las heces. La quimotripsina es específica para los enlaces peptidicos de los aminoácidos sin carga como los aromáticos: tirosina. INTRODUCCION: La digestión de las proteínas. . La tripsina. La carboxipeptidasa hidroliza el enlace peptídico carboxiterminal en las cadenas polipeptidicas. quimotripsina. Son endopeptidasas: pepsina. determinado los productos (aminoácidos) con ninhidrina II.Acido tricloroacético al 10%. o degradación hasta aminoácidos en el tubo digestivo. c) de origen intestinal: aminopeptidasas. elastasas. quimotripsina. como la glicina. ataca a los residuos pequeños.Solución de extracto pancreático. es activada por la enterocinasa en el intestino. triptofano y fenilalanina.25% saturada con butanol.Buffer fosfato 0. REACTIVOS A UTILIZAR: . . y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados en las heces). La elastasa tiene una especificidad amplia.

Observa los cambios de color de cada tubo. durante 3 a 5 minutos. agregar 1 ml de solución de ninhidrina. Elabore un esquema con la digestión y absorción de proteínas y aminoácidos. IV. Observe las variaciones que se produce en cada tubo. Luego a los tubos de incubación del primer sistema.5 ml. agregue gota a gota 1 ml de ácido tricloroacético al 10% agitando continuamente.0 Solución de extracto pancreático Agua destilada Pasos: * * * * * * * 1 1 1 --- 1 1 --1 --1 1 1 Mezclar y colocar al baño de agua a 37 ºC por 30 minutos. Escriba dos esquemas mostrando dos ejemplos de transaminación y dos de desaminación con los nombres de aminoácidos y alfa cetoácidos que participan. En este nuevo sistema. II. .54 Caseína al 1% Buffer fosfato 0. Después del tiempo de incubado tomar 0. CUESTIONARIO: 1. Explique el sitio de producción y la acción de las hormonas que intervienen en el proceso de digestión y absorción de los aminoácidos. Mezclar y llevar a un baño de agua hirviendo (franca ebullición). 3.1 M pH 8. de cada uno de los tubos y trasladarlo a otro sistema numerado (I. 4. Interprete todos los resultados encontrados en la práctica y explíquelos usando algunos dibujos. III). 2.

efecto que desaparece cuando la soya es hervida.Solución de tripsina 20 mg%.25% saturada con butanol. La finalidad del siguiente experimento es demostrar el efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre el efecto proteolítico de la tripsina.2 II 2. . Algunos alimentos en estado natural poseen componentes perjudiciales para la nutrición.55 PRACTICA N° 22 INHIBICION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS: ACCION DE LA SOYA HERVIDA Y CRUDA SOBRE EL EFECTO PROTEOLITICO DE LA TRIPSINA I.5 - .5 0.1 M pH 8. I 2. b.Los extractos de páncreas poseen también un péptido inhibidor de la tripsina. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0. la alfa-1 antitripsina fecal (1-AT-Fecal) que es una glicoproteína.Etanol absoluto III. c. con mayor rapidez que las originales desdoblándose en polipéptidos de peso variable y algunos aminoácidos. . ello explica en parte que el valor nutritivo del frijol de Soja aumenta considerablemente si se coce a ebullición por varios minutos.5 0. Incubar en baño maría a 37°C durante 1 hora. .2 IV 2. Mezclar y centrifugar a 2500 rpm por 10 min.Proteína de soya hervida 30%. REACTIVOS A UTILIZAR.5 0. Por ejemplo el frijol de soja contiene un principio cuya actividad antitripsina dificulta la digestión de las proteínas.5 0.Buffer fosfato 0. Esta sustancia de naturaleza peptídica es inactivada por el calor.5 III 2. el gisipol.0 Proteína de soja cruda 30% Proteína de soja hervida 30% Solución de tripsina 20 mg% Pasos: a. secretada a la luz intestinal.5 0.1 M pH 8.Solución de ninhidrina 0.0. II. INTRODUCCION: La tripsina actúa como una endopeptidasa e hidroliza prácticamente toda clase de proteínas.Proteína de soya cruda 30%. . con actividad antioxidante y antitripsina que disminuye el apetito y dificulta la digestión de las proteínas. . . Digiere las proteínas desnaturalizadas y parcialemente digeridas.5 0. Después del tiempo de incubación: agregar a cada uno de los tubos 2 ml de etanol absoluto. Es interesante también que el aceite de semilla de algodón posea un pigmento. El ovomucoide de la clara de huevo inhibe también de manera enérgica la tripsina.

Anotar los resultados. 4. 3. Por qué razón el ovomucoide de la clara del huevo inhibe la acción de la tripsina. f. e. En otra serie de tubos numerados I . 2. IV colocar 1 ml de sobrenadante de los tubos respectivos del paso anterior y agregar 1 ml de ninhidrina 0. II. Explique con sus propias palabras cuál cree que es el objetivo de la práctica que realizó. . IV. CUESTIONARIO: 1. III. Someter los tubos a temperatura de ebullición del agua utilizando baño maría durante 5 minutos. ¿Qué es el gisipol y cómo actúa en su acción antioxidante? Con dibujos represente la práctica realizada.25%.56 d.

Agammaglobulinemia y la analbuminemia son cuadros demasiado raros. Reactivo EDTA/Cu Reactivo BCF . en la macroglobulinemia de Waldenström. En el suero solo albúmina y globulina . excreción. FUNDAMENTOS DEL METODO Determinación de Proteínas Totales: Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico. haptoglobina. en medio alcalino. Las cifras de proteínas plasmáticas totales pueden aumentar (hiperproteinemia) con cociente A/G normal en la hemoconcentración.5 a 4. en medio tamponado a pH3. ceruloplasmina. Determinación de Albúmina: La albúmina reacciona específicamente sin separación previa con la forma aniónica de la bromo Cresolsulfon Ftaleina (BCF). cuya intensidad es provisional a la concentración de proteínas totales en la muestra. El aumento de absorbancia a 625 nm. inmunodifusión o inmunoelectroforesis. REACTIVOS A UTILIZAR. por el método colorimétrico. respecto del Blanco del reactivo.1 g/dl.Las fracciones globulínicas contienen varias proteínas específicas: inmunoglobulinas. etc. en la gastroenteropatía exudativa con pérdidas fecales de proteínas. en el kala-azar. es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra. La disminución de proteínas totales (hipoproteinemia) son generalmente asociadas con HIPOALBUMINEMIA que a su vez están acompañadas con pequeños cambios en las globulinas. insuficiente ingestión de proteína. la transferrina. conservación del equilibrio ácido básico.1 a 7. para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540nm. en presencia de un exceso de colorante. La concentración sérica de las proteínas totales es de 6. INTRODUCCION: Las proteínas plasmáticas son importantes para el organismo porque realizan diversas funciones: coagulación. etc..8. transporte. disminución de la formación en el hígado como en la cirrosis. que se pueden determinar por electroforesis. regulación del equilibrio hídrico.57 REUNION DE LABORATORIO N° 11 PRACTICA N° 23 CUANTIFICACION DE PROTEINAS SERICAS TOTALES Y FRACCIONADAS I. en las colagenopatías. etc. defensa contra las infecciones. El origen de las proteínas plasmáticas es hepático con excepción de las globulinas gamma que se forman en las células plasmáticas. II. globulina y fibrinógeno. La presente práctica tiene por finalidad determinar las concentraciones séricas de proteínas totales y fraccionadas en personas normales y/o con procesos patológicos.9 g/dl de las cuales albúmina: 3. Los bajos niveles de albúmina pueden ser debidos a: incrementadas pérdidas de albúmina en la orina.8 g/dl y globulinas: 2. con inversión de A/G por aumento de las globulinas: en el mieloma múltiple. Las proteínas plasmáticas por métodos químicos se clasifican en albúmina.6 a 3. regulación del metabolismo.

colocar: Componentes Muestra (ml) Standard (ml) Reactivo (ml) Blanco --------1. S (Standard) y D (Desconocido). El color resultante es estable por lo menos 30 minutos. Leer en espectrofotómetro a 625 nm o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo CALCULOS DE LOS RESULTADOS : Alb. colocar: B S D Suero Patrón 10 ul Muestra 10 ul. Mantener los tubos entre 15 y 28 ºC durante 10 minutos.58 III. ó 20 minutos a temperatura ambiente.01 1.2 . 1 ml. CALCULOS: FACTOR ! Concentrac ión Standard Absorbancia Standard  Proteina Total (g/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: 6.Alb.8 g/dl Relación A/G = 1. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Determinación de Proteínas Totales PROCEDIMIENTO: En tres tubos marcados B (Blanco).01 ----1. 1 ml. Leer las absorbancias a 540 nm. Reactivo BCF 1ml.0 Desconocido 0. PROCEDIMIENTO: En tres tubos de fotocolorímetro marcados B(Blanco).0 Standard ----0.0 g/dl Determinación de Albúmina.2 ± 2.0 Mezclar e incubar 10 minutos a 37rC.(g/dl) Relación A/ ! ¥ VALORES DE REFERENCIA: Albúmina = 3. Mezclar con varilla. (g/dl).0 a 8. llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo.5 ± 4.(g/dl) Albúmina (g/dl) ! D v f f! S Albúmina(g/dl) PT. S (Standard) y D (Desconocido).

. 5. en clínica? ¿En qué se basa la determinación de las proteínas totales y fraccionadas en nuestro experimento? Elabore un esquema sobre el proceso fisiopatológico de un edema.59 IV. 2. Cuáles son las principales características de las proteínas plasmáticas. 4. ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de las proteínas séricas totales y las fracciones albúmina y globulinas? ¿Qué importancia tiene determinar la relación albúmina/ globulina. 3. CUESTIONARIO: 1.

se trata de fosfatos que se han disuelto en medio ácido. síndrome nefrótico.85% a una concentración final de 25 mg/ml. Añadir: Solución de ácido acético al 2% IV gotas Si desaparece la turbidez. Si aparece un precipitado o enturbamiento se puede deber a la presencia de proteínas o fosfatos. La proteína de Bence Jones está constituída por las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas que constituye la proteína monoclonal. albúmina. Esta dilución debe ser preparada el mismo día. algunas enzimas. nefropatía diabética. La proteinuria fisiológica (proteinuria ortóstatica) se presenta después de ejercicios y de permanecer largo tiempo en posición de pie. la cantidad es pequeña alcanzando máximo de 150 mg en orina de 24 horas. El fibrinógeno es una molécula muy larga y escapa solo en enfermedad renal severa. menos de 10 mg/dl. mieloma múltiple. COMPONENTE (ml) TUBO Muestra de Orina 5. Las proteínas son casi completamente absorbidas en los túbulos. riñón poliquístico etc. II. .0 Someter a ebullición por 1 minuto. 12. Son causas de proteinuria Renal: glomerulonefritis difusa. glomerulonefritis focales proliferativas. moléculas proteicas de variado tamaño incluyendo las más largas. aparece la proteína de Bence Jones. tuberculosis renal. Standard de proteína: Pueden usarse suero claro normal de concentración conocido o un suero control adquirido comercialmente.85%.5% (en agua destilada) Cloruro de sodio 0. La proteinuria puede ser renal o extrarrenal. INTRODUCCION: La orina normal contiene una pequeña cantidad de proteínas solubles (albúminas. se ha hace más intensa o se forma un precipitado. Acido acético al 2%. En el mieloma múltiple y macroglubinemia de Waldestrom. luego las globulinas. etc. febril. por ejemplo la proteína de Bence Jones. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LAS PROTEÍNAS EN ORI NA: Coagulación por el calor. Acido tricloroacético. Las proteínas de peso molecular relativamente bajo y de pequeño tamaño pasan primero a través de los glomérulos injuriados. en la eclampsia.). sin que exista evidencia de lesión renal. hemoglobina. III. nefropatía tóxica. Se diluye con cloruro de sodio 0. Cuando el glomérulo es dañado por alguna enfermedad. Extrarrenal: proteinuria ortostática. REACTIVOS A UTILIZAR.60 PRACTICA Nº 24 DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE PROTEINAS EN ORINA I. nefropatía lúpica. gravídica. La presente práctica tiene por finalidad determinar la presencia de proteínas en la orina y de cuantificarlas en caso que estén presentes en casos normales y en estados patológicos. escapan en el filtrado de forma que los túbulos son incapaces de captar la gran cantidad de proteínas y resulta una masiva proteinuria. Si la turbidez persiste. se trata de proteínas.

NOTA: Antes de leer los tubos deben ser mezclados totalmente evitando que burbujas de aire puedan interferir con la lectura. orina Absorbancia del standard Volumen total en ml orina -----------------------------------. mg/100 ml orina x 100 IV. ¿Cómo diferencia usted un precipitado en un tubo de ensayo que no c orresponde a proteínas en orina? Señale algunos tipos de proteínas anormales que pueden ser encontradas en la orina.0 Dejar reposar 5 a 10 min. 3. 5. CUESTIONARIO: 1.5% I 4.= proteína total de orina de 24 H en mg. y leer en fotocolorímetro con filtro (420 um). 2.0 4. CALCULO: Desde que 4 ml de orina se trata igual que un standard de 4 ml conteniendo 25 mg/100 ml entonces: Calcular de la siguiente manera: Absorbancia problema ± Absorbancia blanco x 25 = mg/100 ml.0 II 1.61 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS EN LA ORINA : Método turbidimétrico de Heavy. 4. .0 III 4. En qué consiste el método de Heavy para la determinación de proteínas ¿Cuál es el mecanismo por el cual un paciente con glomeruloesclerosis elimina mucha proteína por la orina? Señale algunas causas de proteinuria fisiológica y patológica.0 1. Leer el standard (I) calibrando con agua destilada y luego a la lectura del problema (II) restar el blanco de la orina (III).0 1. En tres tubos marcados previamente agregar: COMPONENTES (ml) /TUBOS Solución standard de proteína Orina previamente filtrada Agua destilada Acido tricloroacético 12.

REACTIVOS A UTILIZAR.Piruvato + L . se mide colorimétricamente por reacción con dinitrofenil hidrazina en medio alcalino. estas enzimas son liberadas dentro de la corriente sanguínea y pueden elevar sus niveles. en la hepatitis o en el infarto de miocardio.1 Mezclar y transferir a la cubeta del espectrofotómetro. CALCULOS: Actividad ALAT (UI/l) = A/min x 1768 Nota: de las absorbancias.62 PRACTICA N° 25 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ALANINA AMINOTRANSFERASA SERICA (ALT) o TRANSAMINASA GLUTAMICO PIRUVICA (SGTP) I. INTRODUCCION: La transaminasa glutámica pirúvica. hasta por tres minutos. Leer la absorbancia inicial (A1) a 340 nm.5  a-cetoglutarato  L-alanina  LDH  NADH III. relativamente en bajas concentraciones pero en los tejidos están presentes en grandes cantidades. producto resultante después de la incubación. particularmente en el hígado y corazón.. Repetir las lecturas a intervalos de 60 segundos.. llamada también alanina aminotransferasa cataliza la reacción L-alanina + alfa-cetoglutarato .0 Volumen de muestra (ml) 0. estas enzimas proveen un medio de interconversión de proteínas e intermediarios metabólicos de los carbohidratos y hacen disponibles las reservas proteicas almacenadas en el hígado al ciclo del ácido cítrico. Reactivo para SGTP:  Buffer TRIS pH 7.glutamato. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Reactivo reconstituido (ml) 1. En la presente práctica la glutámico pirúvico transaminasa (GPT) es determinada agregando suero a una solución bufferada conteniendo ácido alfa cetoglutarato y L-alanina y el ácido pirúvico formado. sacar diferencias y determinar una media que luego se multiplica por el factor determinado. Las transaminasas están normalmente presentes en la sangre. II. VALORES DE REFERENCIA: Hasta 29 U/l a 30 ºC Hasta 45 U/l a 37 ºC . Con la aspartato transaminasa. Incubar 60 segundos a la temperatura de reacción. Cuando se produce destrucción tisular de estos órganos como sucede por ejemplo.

2. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es la importancia metabólica de la transaminasa glutámico pirúvico? 3. ¿Cuál es la ubicación intercelular de las TGP y TGO? 5. ¿Cuáles serían las razones para solicitar. TGO-S algunas veces separadas y otras veces juntas.63 IV. Haga un esquema de una transaminación. Cuál es la utilidad práctica de la utilización del dosaje de transaminasas. Diga usted en que consiste el mecanismo de transaminación. . 6. en el diagnóstico diferencial clínico? 4. colocando los nombres de las moléculas que participan.

4N (NaOH 0.1 0. sube al máximo entre las 12 y 48 horas y suele volver a lo normal a los 4 ó 7 días. El color es estable sólo por 30 minutos. cuando sobreviene la mejoría clínica.1 Sustrato AST (ml) 0. por ejemplo) y las enzimas de escape. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente.10 0. La finalidad del presente trabajo experimental.4N III.05 0.1 0. Armar el siguiente sistema: Tubo 1 2 3 4 5 6 Agua Destilada (ml) 0. Leer a 505 nm. las dos suben nuevamente.15 0. la glutámico pirúvica (TGP) y la glutámico oxalacética (TGO) o aspartato aminotransferasa (AST).64 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST) I. una vez sintetizadas. en general.4 NaOH 0.50 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) : 1) CURVA DE CALIBRACIÓN: Antes de usar los reactivos por primera vez. INTRODUCCION: En condiciones normales. como es el caso de: Las enzimas del tubo digestivo.1 0. a veces proporciona datos positivos en casos con datos electrocardiográficos de difícil interpretación.25 Standard 0. . El tejido miocárdico es muy rico en TGO y el ascenso de esta enzima acompaña a los procesos destructivos del corazón. presentes en cantidades muy bajas en el suero aun cuando en ciertas enfermedades suben considerablemente. En la clínica son importantes dos transaminasas. proporcional a la extensión del infarto. Las enzimas con actividad en el suero sanguíneo (las que intervienen en la coagulación. pero tiene el inconveniente de elevarse en diversos cuadros. es la determinación por método colorimétrico de una de estas transaminasas de importancia clínica como es la aspartato aminotransferasa. El ascenso es.5 ml de reactivo de color.45 0. si aparece una recaída. sobre todo en la cogestión hepática.4 Reactivo de color: 2-4 dinitrofenilhidrazina Standard: Buffer piruvato pH 7.25 AST 0 22 55 96 150 212 Agregar 0.35 0. Otras enzimas. Agregar 5 ml de NaOH 0. REACTIVOS A UTILIZAR Sustrato AST: Buffer de DL-aspartato y -cetoglutarato pH 7. II.1 0.30 0.1 0. preparar una curva de calibración para AST.40 0. salen de las células y funcionan fuera de ellas. las enzimas se sintetizan en las células y en la mayoría de los casos ejercen su función en su interior.4N diluido con agua destilada 1:10) Mezclar y reposar por 15 minutos a temperatura ambiente antes de leer. éstas. descienden en forma paralela y.20 0. En las lesiones o hepáticas aumentan ambas transaminasas en el suero.0 0. aunque se hallan en todos los tejidos se relacionan preferentemente con los procesos de ³escape´ de enzimas del mi cardio o el hígado.

Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. .Obtener el valor de U/ml de AST a partir de la curva de AST de calibración. 3.5 ml de reactivo de color. Haga un resumen de seis líneas sobre AST.1 ml de suero.Incubar a 37 ºC durante 5 minutos. .5 ml de sustrato AST en cada tubo. Inmediatamente empezar el control de tiempo. 2. CUESTIONARIO: 1. agregar 0. .4 N Mezclar y dejar reposar por 15 minutos antes de la lectura. . según instrucciones previas. IV. ¿Cuál es la utilidad y el comportamiento en sus concentraciones de la AST en casos de infarto agudo de miocardio? Interprete y explique todo lo actuado en la práctica. .Agregar 0. .Al cumplirse los 60 minutos.Agregar 5 ml de Na OH 0.Colocar 0.Incubar a 37 ºC durante 60 minutos.65 Construir en papel semilogarítmico los valores de transmitancia en el eje vertical y en el eje horizontal las U/ml de AST 2) PROCEDIMIENTO DE LA MUESTRA (disponer de un tubo de ensayo): . . exactamente.

Buffer/Ferricianuro: comprimidos estabilizados de ferricianuro de potasio y buffer de fosfatos. En este último grupo. por diferentes causas. II.66 REUNION DE LABORATORIO N° 12 PRACTICA N° 26 CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA I. Hemoglowiener reactivo Tubos de vidrio Lancetas Pipetas ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: COMPONENTES STANDARD hemogloWiener Reactivo 5 ml Con pipeta limpia y seca. En la hipoxia por altura por otro lado se produce aumento de su síntesis llevando a la policitemia. da lugar a las diferentes tipos de porfirias. de modo que en mujeres se considera si esta es menor de 12 g/dl y en varones. que es sin duda uno de los exámenes más solicitados. con dos subunidades alfa y dos beta. En la práctica médica es por ello importante determinar la concentración de la hemoglobina. INTRODUCCION: La hemoglobina es una hemoproteína. Pero la hemoglobina puede también disminuír por pérdida de sangre como en las hemorragias o por hemólisis (anemias hemolíticas). La disminución de la síntesis de hemoglobina. utilizando el método enzimático de determinación de hemoglobina. Se sintetiza en la médula ósea por una vía común a la síntesis de porfirinas. tetramérica. en niños existe variación con la edad. que puede tener también otras causas como la Policitemia Vera La OMS basa su definición de anemia en la concentración de hemoglobina. que termina con la adición del hierro por la ferroquelatasa. El defecto enzimático en algunas de las etapas de síntesis del grupo Hemo. Standard de Hemoglobina. cuya función es el transporte de oxígeno. La concentración normal es de 12 a 14 g/dl en mujeres y de 14 a 16 g/dl en varones en nuestro medio y a nivel del mar. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración de hemoglobina en sangre de personas normales. agregar: hemogloWiener Standard 20 ul DESCONOCIDO 5 ml ----Armar el siguient e sistema: III. menor de 13 g/dl. . que también puede deberse a problemas en la maduración de los glóbulos rojos como la deficiencia de ácido fólico. REACTIVO MATERIAL Y EQUIPOS Tensioactivo/CNX: ampollas autorrompibles conteniendo solución estabilizada de tensioactivo/CNX. produce disminución de su concentración dando lugar a la anemia por menor producción como en la anemia ferropénica. una causa pueden ser las hemoglobinopatías por defecto en la síntesis de una de las cadenas (talasemias) o de cambios en la estructura de una de las subunidades por mutaciones que cambian un aminoácido por otro como en la hemoglobina S.

67 Muestra (sangre total) ----20 ul Medir primero el Standard y luego usar la misma micropipeta.Mujeres: 11. indicando sus aminoácidos importantes en cada polipéptido. Interprete y explique el procedimiento de la práctica. 3. enjuagando tres veces en el propio reactivo antes de agregar cada muestra.0 ± 18. .0 g/dl . Haga un esquema con la estructura de la hemoglobina. 4. CUESTIONARIO: 1.Hombres: 13. Una anemia importante es la anemia de células falciformes: Haga un resumen de las causas de su etiología y su patogenía. Mezclar y luego de 3 minutos leer en espectrofotómetro a 540 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520 -550).0 ± 16. Cuál es la más frecuente y cuántos tipos de anemia conoce. el número de ellos y las interacciones del ión Fe++ dentro del grupo hemo.0 g/dl IV. Qué es la anemia. 2. llevando el aparato a cero con Reactivo CALCULO DE RESULTADOS: Hemoglobin a (g/dl) ! D v factor factor ! Standard (g/l) S VALORES DE REFERENCIA: .

leer en espectrofotómetro a 530 nm o fotocolorímtero con filtro verde (520-550 nm). donde el defecto limitante es la excreción. Luego de 5 minutos. sólo reacciona después de agregar alcohol a la mezcla. que utiliza el diazorreactivo de Erlich. La manifestación clínica más importante de las hiperbilirrubinemias es la ictericia. o en las enfermedades extrahepáticas obstructivas. por el método enzimático de determinación de bilirrubina.Nitrito de Sodio . Si lee antes. La hemoglobina es liberada y se separa la globina del hem. y el origen de esta alteración obedece a causas de origen pre hepático. Este pigmento insoluble en agua es transportado unido a la albúmina. La bilirrubina indirecta o no conjugada llega al hepatocito y se separa de la albúmina. que varían con la edad de presentación y también en cuanto a su gravedad La bilirrubina directa da una reacción inmediata con el diazorreactivo.5 ml ----Desarrollador --------2. REACTIVOS . Directa Bil. La concentración sanguínea de bilirrubina total es de 1 mg / dl. excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. o de la bilirrubina conjugada en las hepatopatías.5 ml 2. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total de las fracciones de bilirrubina en el suero o plasma de personas normales y con ictericia. da color a las heces y ultrafiltra el glomérulo. . INTRODUCCION: Los hematíes tienen una vida media de 120 días. Cada gramo de hemoglobina degradada origina 35 mg de bilirrubina. .Reactivo sulfanílico .68 CUANTIFICACION DE BILIRRUBINAS SERICAS I. La hiperbilirrubinemia puede ser a predominio de la bilirrubina no conjugada como en las anemias hemolíticas o en los defectos congénitos de conjugación. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total y de las fracciones (bilirrubina directa e indirecta) en el suero de personas normales. ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Bil.Bilirrubina Standard. éste es convertido en biliverdina y luego en bilirrubina. después de un proceso de captación y conjugación con dos moléculas de ácido glucurónico por la enzima bilirrubina glucuronil transferasa. hepático y post hepático. se convierte en una forma soluble. Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos. llevando el aparato a cero con agua destilada. que no se excreta por orina. Total Muestra (suero) 200 ul 200 ul 200 ul Agua destilada 2. por el método de Malloy Evelyn. que es finalmente excretada con la bilis al intestino por un proceso de transporte activo. Si se lee después.5 ml Reactivo Sulfanílico 200 ul --------Diazorreactivo ----200 ul 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión. II. siendo en su mayoría bilirrubina indirecta. la indirecta.Diazorreactivo: Mezclar: 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo sulfanílico. habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta.Desarrollador o solvente . al cabo de la cual son destruidos en el sistema retículo endotelial. habrá III. denominada bilirrubina directa o conjugada.

Directa . total .) x F Bilirrubina Libre (indirecta) = Bilirrubina total . Bil. ¿Cuál es el riesgo de aumento de bilirrubina no conjuda en el recién nacido? 6. Por qué? . ¿Cuáles son las causas de hiperbilirrubinemia conjugada? 4.69 sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre CALCULOS: Bilirrubina total (mg/l) = (Abs. Blanco) x F Bilirrubina Directa (mg/l) = Abs.Abs.Abs Blanco.Bilirrubina Directa VALORES DE REFERENCIA: . Elabore un esquema con los tipos de ictericia que se pueden producir durante el metabolismo de la bilirrubina. B. CUESTIONARIO: 1. 2. ¿Cuáles son las principales causas de hiperbilirrubinemia no conjugada? 3.Adultos: o Directa: hasta 2 mg/l o Total: hasta 10 mg/l IV. ¿Cuál es el comportamiento de las bilirrubinas en caso de una insuficiencia hepática. ¿Cuál es la acción bioquímica que realiza cada uno de los reactivos utilizados en la práctica? 5.

REACTIVOS A UTILIZAR. La presente práctica tiene por finalidad cuantificar las concentraciones séricas de ácido úrico en personas adultas normales y / o con alteraciones patológicas mediante el procedimiento químico de Folin-Dennis que se basa en la acción reductora del ácido úrico en medio alcalino sobre el ácido fosfotúngstico. por otro. La cantidad de uratos excretados varía normalmente de 250 a 750 mg / 24 hrs. Como sucede con otros constituyentes séricos. o urea.Muestra: suero o plasma heparinizado . llevando el aparato a cero con el blanco. III. diferencia que desaparece después de los 45-50 años de edad. Un adulto normal produce unos 500 mg de ácido úrico por día. Aproximadamente 80 % de esa cantidad es excretada por orina. a pH menores predomina la forma protonada no disociada o ácido úrico. que es el más común de los desórdenes del metabolismo de las purinas. la concentración de ácido úrico en suero o plasma depende de un neto balance entre el grado de síntesis de purinas y fraccionamiento de nucleoproteínas por un lado y. . policitemias. Al pH sanguíneo predomina la forma desprotonada o urato.5 ml 2. En el plasma. En el hombre. En las alteraciones renales severas son comunes los niveles altos de ácido úrico como resultado de una excreción disminuida. En condiciones patológicas. Los varones tienen niveles 1 mg/dl más altos que las mujeres. En orina. II. en alcalinidad. del grado de eliminación de ácido úrico. etc. colocar: B S D Standard 50 ul Muestra 50 ul Reactivo de trabajo 2. S (Standard) y D (Desconocido). Reactivo de fenol. la uricemia se incrementa después de la ingestión de nucleoproteínas con los alimentos. que circulan en la sangre (en el plasma y en los glóbulos rojos humanos) y es la orina su vía de excreción.5 ml 2. enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm). ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento .70 PRACTICA N° 27 CUANTIFICACION DEL ACIDO URICO SERICO I. el pH ácido favorece la formación de ácido úrico no disociado y puede precipitar. podemos encontrar concentra ciones incrementadas de ácido úrico sérico en la gota. más frecuente en hombres. el resto se degrada y es eliminado como CO2 y NH3. Standar: solución de ácido úrico 100 mg/dl Uricasa: solución de uricasa mayor o igual a 3U/I Reactivo 4-AF/POD: frasco conteniendo más de 100 U de peroxidasa (POD). INTRODUCCION: El ácido úrico es un producto de la degradación hepática de las bases nitrogenadas purínicas adenina y guanina. los que se degradan y en un primer momento liberan los ácidos nucleicos de las proteínas.5 ml Mezclar suavemente e incubar 15 minutos en baño de agua a 37 °C o 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). Retirar.En tres tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas marcadas B (Blanco). el ácido úrico alcanza una concentración de 4 a 6 mg/dl. ocurre lo contrario. cantidad que puede incrementarse con una dieta rica en purinas. También existe hiperuricemia proveniente de la destrucción excesiva de células (material nuclear) en leucemias y linfomas.

con ingesta normal de proteínas. 4.71 - CALCULO DE RESULTADOS: Acido Urico (mg/dl) ! D v f donde " f " ! 100 mg/dl S - VALORES DE REFERENCIA: En adultos normales. el sexo y las diferentes dietas. 3. Señale la deficiencia parcial enzimática que ha sido encontrada en algunos pacientes con gota. Y dónde se realiza esta síntesis. 6. 2. se observan los siguientes rangos de valores: Hombres: 26-60 mg/l Mujeres: 20-50 mg/l Los valores de ácido úrico varían de acuerdo a la edad. Cómo se sintetiza el ácido úrico. CUESTIONARIO: 1. Cuál es la fisiopatología de las hiperuricemias. ¿Cómo explica el uso del alopurinol en el tratamiento de la gota? ¿Cuál es el proceso de la artritis y de la formación de los tofos en la gota? Explique por qué existe hiperuricemia en las enfermedades de leucemia. 5. . IV. incluso se ha observado una variación estacional.

La creatinina es fácilmente difusible y es igualmente distribuida en el agua corporal.Standard: Solución de creatinina 2 mg/l.5 a 1. catabolismo de proteínas. y es excretada en una cantidad casi constante. Es excretada fundamentalmente por el riñón el cual clarifica el plasma de creatinina. . REACTIVOS A UTILIZAR. Aproximadamente 2% de la creatina fosfato muscular es convertida en creatinina diariamente.1.72 REUNION DE LABORATORIO N° 13 PRACTICA N° 28 DETERMINACION DE CREATININA SERICA EN PERSONAS SANAS Y NEFROPATAS I. La concentración de creatinina en suero no es afectada por la dieta. La determinación de creatinina tiene utilidad en la práctica médica para la evaluación de la función renal. mientras que en eritrocitos sólo corresponde a un 40%. aumenta en el cuerpo humano fundamentalmente por síntesis. 9 . La cantidad eliminada por las personas del sexo masculino generalmente es más grande que en las de sexo femenino. II. esta última determinación se prefiere porque proporciona mayor información relacionada con el estado de la función renal. La creatina fosfato se forma en los miocitos y es un compuesto importante como fuente de energía en la contracción muscular. El suero es depurado de creatinina en el riñón por filtración glomerular proporcionando una buena base para el test de clearance. Elevadas concentraciones se producen solamente cuando la función renal está muy alterada y aunque el mismo tipo de información acerca del diagnóstico y pronóstico se obtiene por la determinación de nitrógeno ureico o creatinina. edad. siendo la producción endógena constante. . La creatinina urinaria disminuye en la insuficiencia renal y es útil para medir el grado de filtración glomerular y lo poco que es transferido a través de las células tubulares. ya que los niveles de creatinina sérica dependen del grado de excreción. como las glomerulonefritis o la nefropatía diabética o post renal. La creatininuria es determinada mediante el método enzimático. Usando métodos enzimáticos para determinar específicamente creatinina y comparando con los valores obtenidos por la reacción de Jaffe en personas normales y nefriticos se encuentra que la creatinina verdadera del suero comprende aproximadamente un 90% del total.4 mg /100 ml. las variaciones fluctúan entre 0. la cual puede alterarse por diversas causas. INTRODUCCION: La creatina. La creatinina es un constituyente habitual de la orina. las que pueden ser de origen pre renal como el shock o la insuficiencia cardíaca. precursora de la creatinina. renal. La concentración normal en suero varía de 0.Reactivo 1: Hidróxido de sodio 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento III.0 mol/l .16 mmol/l .5 g/24hs. como las uropatías obstructivas La creatinina en medio alcalino reacciona con el ácido pícrico para dar un tautómero de picrato de creatinina de color anaranjado (reacción de Jaffe). La determinación de hace de ordinario en un filtrado libre de proteínas obtenido a partir del suero. El clearence de creatinina normal es mayor de 100 ml / min. la cantidad total depende de la masa muscular. aunque una pequeña cantidad pre formada es ingerida con los alimentos. Esto. sexo o ejercicios.Reactivo 2: Acido pícrico 4. hace remarcable la necesidad de usar suero y no sangre total para la determinación de creatinina por el método colorimétrico.

2.73 m2 98 ± 156 ml/min/1. S (Standard).1 mg/dl 0. luego agregar: Reactivo 2 250 ul 250 ul 250 ul Llevar el espectrofotómetro a cero con el blanco. Incubar exactamente por 2 minutos y leer A2. Explique por qué se incrementa la creatinina en tres estados patológicos que conozca.73m2A ! mgcreatinina mlOrinav mlorina/24h mgcreatinina ml suerov 1440 /100 VALORES REFERENCIA: DE SUERO/PLASMA: Mujeres Varones ORINA: Mujeres Varones Clearance de Creatinina: Mujeres Varones IV.3 mg/dl 11 ± 20 mg/kg/d 14 ± 26 mg/kg/d 95 ± 160 ml/min/1. Haga dibujos del procedimiento. Incubar 5 minutos a 20-25 °C/30 °C/37 °C. Incubar 1 minuto a 20-25 °C y leer A1. Mezclar.73 PROCEDIMIENTO En caso de que la muestra a utilizar sea en suero. 3. CUESTIONARIO: 1. 4. En tubos de ensayo marcados B (Blanco).73 m2 .6 ± 1. 5. CALCULOS: ¨A Muestra (A2-A1) y ¨A Standard (A2-A1) CALCULOS: SUERO/PLASMA : ¦ ¦ Creatinina(mg/dl)! ORINA : Creatinina(mg/dl)! Standard(mg/dl)A v? A Standard A Muestra A Muestra CLEARANCE DE CREATININA : /100 ?mg/min/1. ¦ ¦ Standard(mg/dl)Av 50 v? A Standard 0. ¿Qué información o presunción obtiene al dosar la creatinina sérica? ¿Por qué se prefiere la determinación de creatinina urinaria a la de nitrógeno ureico? Interprete y explique el procedimiento de la práctica.9 ± 1. M (Muestra) Componentes Blanco Standard Muestra Reactivo 1 1000 ul 1000 ul 1000 ul Muestra --------50 ul Standard ----50 ul ----Mezclar. A que se denomina clearence de creatinina y que importancia tiene. su determinación.

74 PRACTICA N° 29 CUANTIFICACION DE UREA EN SANGRE I. son muy similares. La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoniaco. Los valores de urea se mo reportan siguiendo la siguiente fórmula: Nitrógeno ureico sanguíneo x 2. La finalidad de la presente práctica es cuantificar la uremia por el método de la ureasa. éste reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimétricamente.01 Standard (ml) ----0. Normalmente no tiene función útil en el organismo. II.01 ----Reactivo de trabajo (ml) 1. ésta transforma a la urea en carbonato de amonio y con la adición del reactivo de Nessler el amoníaco liberado forma un compuesto de color amarillo bruno cuya intensidad se mide en fotocolorímetro. en personas normales y / o con procesos patológicos.Suspensión de ureasa. es excretado casi enteramente por los riñones.00 Incubar 5 minutos a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C).00 1. conociendo los valores de urea.Solución standard III. INTRODUCCION: La urea es sintetizada en el hígado.Reactivo hipoclorito. es convencionalmente reportado co nitrógeno ureico. La uremia es determinada colorimétricamente por el uso de ureasa. es el principal producto final del catabolismo de las proteínas y se distribuye en todos los tejidos. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento PROCEDIMIENTO Componentes Blanco Standard Desconocido Muestra (ml) --------0. El grado de azoemia depende de la extensión y tipo de lesión renal.00 1. se informa el BUN según la siguiente fórmula: Urea x 0. Las concentraciones de urea en sangre total.00 1. . . La concentración de la urea en la corriente sanguínea es el resultado del balance entre el grado de degradación de las proteínas y el grado de eliminación por los riñones. . La or importancia clínica de la urea viene del hecho de una elevada concentración sanguínea puede estar asociada con una mala función renal. Este método es altamente específico y aunque está basado en reacciones de urea. Agregar a cada tubo: Reactivo hipoclorito (ml) 1. La urea en el plasma es filtrada por los glomérulos renales.00 Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente (20 a 25 °C) o 5 . . REACTIVOS A UTILIZAR.00 1.14 = UREA En sentido inverso. pero en condiciones normales aproximadamente el 40% de este filtrado regresa p difusión a la sangre. suero o plasma. o 3 minutos a 37 °C. Cuando el nitrógeno ureico es determinado por el método de la ureasa.4665 = Nitrógeno ureico sanguíneo Los riñones eliminan diariamente entre 20 a 40 gramos de urea.Reactivo de salicilato. Los valores normales de urea en suero (como nitrógeno ureico sanguíneo o BUN) es de 9 ± 19 mg/100 ml.

¿Qué importancia clínica tiene para usted. 2. 6. 5.75 minutos a 37 °C.7 mg/dl 7 a 14 g/24 hrs. 3. ¿Qué alteraciones en las concentraciones séricas de úrea y NH4+ podrían encontrarse en el coma hepático? ¿Cuál es la importancia metabólica de la existencia del ciclo de la ornitina en el hígado de los seres humanos? ¿Cuál es la importancia metabólica que en el hígado humano exista una relación entre el ciclo de los ácidos tricarboxilicos y el ciclo de la ornitina? 10 a 50 mg/dl : 15 a 30 g/24 hrs. Leer las absorbancias dentro del plazo de una hora CALCULOS: FACTOR ! 66 Absorbancia Standard Urea (mg/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: SUERO/PLASMA: Urea : Nitrógeno Ureico ORINA: Urea : Nitrógeno Ureico IV. CUESTIONARIO: 1. .5 a 22. conocer las concentraciones séricas de úrea? ¿Qué influencia tiene la ingesta proteica sobre la concentración sérica de úrea? En relación a las concentraciones séricas de úrea y NH4+. Señale las características comunes que se encuentran en los efectos enzimáticos hereditarios del ciclo de la úrea. 4. : 4.

Puesto que la alanina es también sustrato para la reacción de glutamato transaminasa. Añadir ácido tricloroacético al 10% Mezclar y añadir agua destilada I 4. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente esquema de incubación: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0. todo el nitrógeno amino proveniente de los aminoácidos que puede experimentar transaminación se puede concentrar en el glutamato.5 III 4.0 0.2-4-Dinitrofenilhidrazina: solución 0.1 M pH 7.5 1. .L-alanina: solución 0.Homogeneizado de hígado o riñón de rata 10% y conservado en baño helado.0 1.4 .0 0. II.5 III.1% en HCl 2 N.2M .5 TUBOS DE ENSAYO II 4.5 1.0 3. Si se agrega una determinada cantidad de L-alanina a un homogeneizado de hígado después de un período de incubación (30 minutos) podemos demostrar que se ha producido desaminación si encontramos determinada cantidad de cetoácidos (ácido pirúvico y ácido alfa-cetoglutarato) los que pueden ser identificados frente a una solución de 2-4 Fenihidrazina en medio alcalino.1M pH 7. INTRODUCCION: La remoción del grupo amino de las L-aminoácidos es el primer paso en la degradación metabólica general de estos compuestos (catabolismo).4 Solución L-alanina 0.Buffer fosfato 0.Acido tricloroacético al 10% . La finalidad de la práctica es demostrar los procesos de desaminación (oxidativa o no) que sufren los L aminoácidos en el hígado utilizando a la L-Alanina como un ejemplo de éstos y al 2-4 Dinitrofenilhidrazina como indicador de los cetoácidos formados provenientes de la desaminación.NaOH: solución 2N .0 3. Filtrar y medir a otros tubos previamente marcados: .76 PRACTICA N° 30 DEMOSTRACION DE LOS PROCESOS DE DESAMINACION OXIDATIVA DE LOS L-E-AMINOACIDOS I.0 3.5 1.2M Agua destilada Homogeneizado de hígado Colocar en baño maría a 37°C durante treinta minutos. Dos sistemas enzimáticos de transaminación: la alanina piruvato transaminasa(ALT) y la glutamato alfa-cetoglutarato transaminasa (AST) catalizan la transferencia de grupos amino de la mayor parte de los aminoácidos para formar alanina a partir del piruvato o glutamato a partir de alfa-cetoglutarato. REACTIVOS A UTILIZAR. .0 1.0 1. La presencia de estos cetoácidos se debe fundamentalmente a los procesos de transdesaminación y desaminación del ácido glutámico (transdesaminación) que se estimula fundamentalmente y en mucha menor proporción por desaminación de la L-Alanina por la acción de la L-aminoácido. Esto es importante porque el L-glutamato es el único aminoácido en el hígado que experimentan desaminación oxidativa a una tasa apreciable y esta reacción se cataliza por la L glutamato deshidrogenasa.0 0.

0 1. IV.0 III 4.0 1. de los resultados de su práctica de laboratorio? . Realizar las lecturas con el espectrofotómetro.4-Dinitrofenilhidrazina en el sistema? ¿Cómo explica usted los resultados fotocolorimétricos obtenidos en los tres diferentes tubos de experimentación del sistema? ¿Cuál es la importancia biológica de la desaminación oxidativa de los aminoácidos? ¿Qué conclusiones puede establecer usted.4-Dinitrofenilhidrazina solución al 1% Mezclar y dejar en reposo durante veinte minutos. NaOH 2N Dejar en reposo durante 10 minutos.77 COMPONENTES (ml) Filtrado 2.0 4.0 4.0 4. CUESTIONARIO: 1 2 3 4 5 6 I 4.0 1. ¿Cuál es la razón por la que se utiliza 2.0 Señale los sistemas enzimáticos flavinodependientes que producen desaminación oxidativa de los aminoácidos. De un ejemplo de desaminación oxidativa de un aminoácido.0 TUBOS DE ENSAYO II 4.

Se estima que una ingestión diaria de 2. VITAMINAS Y MINERALES REUNION DE LABORATORIO N° 14 PRACTICA N° 31 DOSAJE DE VITAMINA ³A´ El instructivo de la presente práctica se les proporcionará durante la práctica respectiva. dolor de las extremidades. Antes de la intervención quirúrgica las cifras plasmáticas inferiores de 0. El principal resultado de tal deficiencia es el escorbuto. La única acción en el cuerpo es debido principalmente a que es una clase especial de agente reductor que influye en los procesos de óxido reducción. PROTEICOS. Se necesita también para la producción normal de fibrinas del tejido conectivo y de la sustancia del baso intercelular (por ello el aumento de fragilidad capilar en el escorbuto). Las intervenciones quirúrgicas dan lugar a disminuciones de 17 a 20% de contenido en el plasma y en glóbulos blancos. Las necesidades mínimas diarias de vitamina C son 10 mg y son preferibles 30 mg por día. Para ello es necesario que los.2 mg/100ml o en glóbulos blancos a 8 mg/100 g indican una deficiencia importante que puede significar cicatrización tardía o dehiscencia de las suturas. En el escorbuto no tratado.1 gm/100ml y en glóbulos blancos menos de 2 mg/100 g. Muchas de estas propiedades podrían depender de las propiedades reversibles de óxido reducción (redox) de esta vitamina (ácido ascórbico . La vitamina C es destruida rápidamente por el calor de cocimiento o la pasteurización. una enfermedad caracterizada por debilidad. la hipófisis y el ojo son espacialmente ricos en vitamina C.78 V UNIDAD NUTRICION: REQUERIMIENTOS ENERGETICOS. En caso de alimentación deficiente. Se presenta en alimentos frescos y en vegetales. el escorbuto clínico tarda 6 meses en manifestarse. En los leucocitos la concentración es mucho mayor que en el plasma (15 mg/100 g) de capa blanca leucocitaria. hemorragias subcutáneas y sangrado de encías. PRACTICA N° 32 DOSAJE DE VITAMINA ³C´ I.5 mg de ácido ascórbico para niños y 7. Esto puede ser hecho con un simple aparato para medir la presión sanguínea con la cual la presión dentro de los capilares se incrementa por la constricción de . Los síntomas son vagos y generalmente limitadas alteraciones del crecimiento de los dientes. Aunque no se conoce con seguridad sus funciones metabólicas precisas hay pruebas que señalan su requerimiento para el metabolismo de la tirosina . INTRODUCCION: La vitamina C o ácido ascórbico es hidrosoluble y antiescorbútica.5 mg para adultos es suficiente para prevenir síntomas de deficiencia.2 mg/100ml. el nivel plasmático de ácido ascórbico es inferior de 0. Casos subclínicos de deficiencia de vitamina C son muy comunes entre la población pobre de las grandes ciudades. Un excelente test clínico para la deficiencia de vitamina C es la determinación del promedio de resistencia capilar. lesiones en las encías y ligera anemia. La corteza suprarrenal. Los nivelas ² plasmáticos en una población bien alimentada varían entre 5. alimentos antes del cocimiento contengan 70 mg de vitamina C. Ciertas células sin vitamina C no son capaces de producir o mantener sustancias de importancia intracelular.5 y 1.ácido dehidroascórbico).

y Standard de ácido ascórbico 2 ml/100ml. Transcurrido el tiempo se enfrian los tubos en baño de hielo durante 5 minutos.4 0. y El ácido ascórbico utilizado para preparar la solución patrón debe ser de grado analítico. Por ello es indispensable separa el plasma de ids glóbulos rojos y realizar el análisis sin tardar. enfriando el hielo.2 mg/dl pueden preceder en 2-3 meses a la aparición de un escorbuto clínico. y Reactivos 2. Absorbancia se compara con patrones adecuados de ácido ascórbico. 2 mi de ácido sulfúrico al Q5°o.5 0. y Reactivo de color. Esta sufre rearreglo molecular en ácido fuerte dando un compuesto rojo.). y 0. mezclando: 5 ml del reactivo 2.Blanco NOTA: y El ácido ascórbico es muy inestable. En un pH ácido. y Acido sulfúrico al 85%. Para la determinación del ácido ascórbico en sangre. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento y Extraer más o menos 5 mi de sangre de la flexura del codo e introducirlos en frascos previamente oxalatados.4 III 0.4 - y Se mezclan los reactivos. Por 6'ste procedimiento el ácido ascórbico del plasma o sangre es oxidado a ácido dehidroascórbico. se tapan en tubos con papel parafinado y se colocan en baño de agua a 56°C durante una hora.5 = mg/dl Abs.5 0. y Agregar 1.Blanco x 2. El ácido ascórbico es estable durante varias horas en el filtro.1 mil de la solución de sulfato cúprico. y Solución de tioúrea al 10% en etanol al 50%.4 dinitrofenilhidracina. REACTIVOS A UTILIZAR: y Acido tricloroacético al 10& (P/V). La excreción normal diaria de vitamina C en orina de adultos varia entre 10 y 30 mg. y Leer en fotocolorimetro (540 nm). . por el método colorimétrico de Roe y Ructher modificado. II. Del problema . Mezclar: COMPONENTES (ml) TUBOS Liquido sobrenadante de paso anterior Acido tricloroacético al 10% Standard de ácido ascórbico. Se prepara en el mismo dia de uso.6 ml de agua destilada. y Solución de sulfato cúprico al 1.79 la vena del brazo. Hemorragias que en la piel aparecen con excesiva frecuencia podrían indicar fragilidad capilar.1 de la solución tioúrea. Se utilizará el método de Roe y Kutcher modificado para la cuantificación del ácido del ácido ascórbico en sangre. Del Standard . y Los valores inferiores a 0. 0. CÁLCULOS: Abs.5% III.5 0.5 0. el acide dehisroascórbico se transforma rápidamente en ácido dicetoglucónico que se une a 2 dinitrofenilhidracina -4 para formar una hidrazona de color pardo. total o plasma. Agua destilada Reactivo de color combinado I II 1 0. y Oxalato de litio al 6. y Agregar a cada tubo lentamente y mezclando. El propósito de la siguiente práctica es determinar la concentración de ácido ascórbico en el plasma de personas adultas normales o carenciales.4 dinitrifenilhidracina al 2% en ácido sulfúrico 9 N. y Dejar los tubos en reposo por 30 min. esta debe ser fresca (no después de 30 min. y Mezclar nuevamente.5%.

lactancia e intervenciones quirúrgicas? 4. neoplasias. Mencione algunas funciones metabólicas importantes del ácido ascórbico. hipertiroidismo.80 IV. CUESTIONARIO 1. Desde el punto de vista metabólico ¿Cómo explica que los requerimientos de vitamina C sean mayores en el curso de las enfermedades infecciosas. ¿Qué relaciones metabólicas podría mencionar entre el ácido fólico y Fe+++ en la producción de anemia en el escorbuto? 3. embarazo. ¿Por qué las necesidades de vitamina C deben ser satisfechas en la dieta normal? 2. ¿Cómo explicaría que las dosis superiores a 1 g/dia pueden ocasionar hemolisis en portadores de deficiencia eritrocitica de G-6-P-deshidrogenasa? 5. .

lo que lleva a la disminución de la ferritina sérica  Disminución de hierro sérico. que se encuentra dentro de las células. hidroxilamina clorhidrato. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm .5 2. aumento de Capacidad Total de Fijación de Hierro y disminución de la Saturación de Hierro  Anemia por deficiencia de hierro: microcítica hipocrómica. El hierro es absorbido en el intestino delgado como Fe2+ y su regulación ocurre a ese nivel y es transferido a la transferrina para su transporte sérico. dado que un aumento en sus niveles se encuentra asociado a diversas patologías tales como destrucción aumentada de los glóbulos rojos.0. Solución Standard: Fe (II) en hidroxilamina clorhidrato 500 ug/dl III.05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos. INTRODUCCION: El hierro sérico es importante en el organismo porque es componente esencial de la hemoglobina encargada del transporte de oxígeno. El 90 % de anemias en las mujeres es por deficiencia de Fe. El hierro forma parte de los centros Fe-S de la cadena respiratoria.0 Reactivo color: ferrozina. así como de otras hemoproteínas como los citocromos ± componentes de la cadena respiratoria. y el circulante. el hierro en uso. etc. Prácticamente todo el hierro corporal se encuentra unido a proteína. De la misma manera. Buffer alcalino: buffer TRIS pH 8. dado que no sólo es relativamente insoluble. tumores.5 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) --------Muestra (ml) 0. etc. enzimas y varios tipos de proteínas. su disminución se asocia entre otras patologías a problemas de absorción y almacenaje. etc.50 Reactivo color (ml) ----0. REACTIVOS A UTILIZAR: Buffer ácido: buffer acetato pH 4. La evaluación de la concentración de hierro sérico es de gran utilidad. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACION DE HIERRO Armar el siguiente sistema Componentes Blanco (suero) Muestra Buffer Acido (ml) 2.81 REUNION DE LABORATORIO N° 15 PRACTICA N° 33 DETERMINACION DE HIERRO SERICO TOTAL Y TIBC I.50 0. defectos en el mecanismo de almacenaje.y la mioglobina. El contenido de hierro en el cuerpo humano se encuentra distribuido en tres formas: el almacenado. La capacidad de fijación de hierro (TIBC) aumenta en casos de anemias ferroprivas y disminuye en las hemocromatosis. hidroxilamina clorhidrato. sino que además es tóxico. fiebre reumática. que se encuentra en la hemoglobina. La deficiencia de hierro pasa por tres estadios:  Deficiencia de los depósitos de hierro. II.

: : : 100 ± 400 ug/dl 250 ± 400 ug/dl 20 ± 55 % Señale al menos 5 funciones del hierro Causas de deficiencia de hierro Informe sobre estructura de la ferritina ¿Qué exámenes solicitaría para evaluar la deficiencia de hierro? ¿Qué importancia tiene medir la saturación de hierro? ©¨ § (ug/dl) ! Ferremia(ud/dl) I (ug/dl) ©¨ v 100 .muestra Abs.50 0.muestra % Saturación! Ferremia (ug/dl) TIBC (ug/dl) Valores de Referencia: TIBC: Hasta 6 años Sobre 6 años % Saturación IV.Bl. 5. 4.standard Abs.160 ug/dl  Mujeres : 40-150 ug/dl DETERMINACION PARA TIBC (capacidad de fijación de hierro) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Muestra Muestra Buffer Alcalino (ml) 2.Reactivo v 500 Abs.Bl.Standard Abs. 3. CUESTIONARIO: 1.50 Reactivo color (ml) ----0.50 Muestra (ml) 0.05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos. 2.Muestra Abs.00 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) 0.Bl. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm Calculos: UIBC (ug/dl) ! 500  TI v 500 Abs.Muestra Abs.82 Cálculos: Ferremia (ug/dl) ! Valores de referencia:  Varones: 50 .reactivo Abs.Bl.00 2.50 0.

83 PRACTICA N° 34 DETEMINACION DE CLORO.Estándar de cloruro: 355 mg/dl III. b) enfermedades que producen estímulo del centro respiratorio como: histeria. fiebre. No exponer a la luz CALCULOS Lectura tandard   ! 355 v Lectura uestra ?mg/dlA  . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Antes de la determinación el estándar y las muestras de suero deben ser diluidas en relación 1/50 con agua destilada (20 µL de muestra/1 ml de agua). 2) parálisis de los músculos respiratorios. tensión de oxígeno disminuida (altura). 6) dieta alta en grasas o en ayuno prolongado el cloro es desplazado por los cuerpos cetónico por sobre producción de estos. Este tipo de alcalosis que es de tipo respiratorio resulta por hiperventilación que puede ser causada a su vez por: a) drogas. Se puede presentar concentración de cloruro disminuido (hipocloremia) en hipoventilación causada por: 1) depresión del sistema nervioso central. II. 3) enfermedad pulmonar. todas estas alteraciones tienen exceso de C02 (que produce hipocloremia). c) algunos tipos de enfermedad tubular renal con acidosis pueden producir incremento del cloruro sérico.4. 7) en hiper o en s hipofunción de las glándulas adrenales (corteza). La concentración de cloruro se puede incrementar (hipercloremia) en muchos casos como resultado del déficit primario de C02.Reactivo de Color 2. De todos los aniones es uno de los de más baja concentración en el líquido intracelular. d) excesiva ingestión de ClNH4 (cloruro de amonio) produce acidosis que puede ser seguida de altos niveles de cloruro sérico. 5) en la diabetes mellitus no controlada. ansiedad. igualmente sucede en el ClK.6 TPZ existente parcialmente como complejo Hg(II)+Sulfato de Hierro . Armar el siguiente sistema: COMPONENTES ESTANDAR PROBLEMA Estándar diluido 20 ul --Suero diluido --20 ul Reactivo de color 1 ml 1 ml Mezcla. después de incubar 5 minutos a oscuras. 4) enfermedad renal crónica. INTRODUCCION: El ión cloro comprende aproximadamente el 65% del total de aniones del liquido extracelular. SODIO Y POTASIO EN EL SUERO DE PERSONAS SANAS Y EN ESTADO PATOLOGICO DETEMINACION DE CLORO I. REACTIVOS A UTILIZAR: . En el suero normal el cloruro se encuentra en concentraciones que varían entre 100 y 106 mEqL. Medir en el transcurso de 60 minutos la absorbancia de problema y estándar.

CUESTIONARIO: 1. la deficiencia acentuada del cloro en la enfermedad de Addison? 3.383 mg/dl. ¿Puede señalar cinco causas de hipercloremia? 4. (Convertir en mEq/l dividiendo entre 3. ¿Cómo explicaría usted. ¿Puede señalar cinco causas de hipocloremia? 5 ¿Cual es la relación de las alteraciones de la cloremia con el equilibrio ácido básico? .84 VALORES NORMALES : 335 . ¿Qué influencia tiene la Aldosterona en el metabolismo del cloro? 2.55) IV.

Diariamente y tiene acceso al suero por difusión a través de la mucosa intestinal o sea que cerca del 4% del sodio corporal total se recambia. en diabetes mellitus no controlada. El ion sodio es ingerido en los alimentos en combinación con el cloro fosfato. fístula intestinal.85 DETERMINACION DE SODIO I. con pequeñas diferencias debido al equilibrio de Donnan. La concentración sérica normal es de 135 a 145 mEq por L (310 A 340 mg%). La concentración sérica es representativa de toda la concentración celular. es aparentemente inerte (no ionizable). Tales valores no dan información acerca del volumen y distribución de la cantidad total presente ni de la cantidad intracelular existente. En condiciones anormales pueden ser muy considerables las pérdidas de agua por el sudor u otr s o fluidos. El suero o plasma contiene más del 90% del sodio total de la sangre. El riñon puede regular la excreción de sodio y agua por lo tanto. pacientes con diarrea.diariamente. La cantidad presente dentro de la célula no puede ser medida sin biopsio del tejido. en mujeres hay sólo 39 mEq por kg. y en niños es mayor. sudor y saliva. hay por lo tanto un 82% del total que es capaz de recambio y participa en las reacciones fisiológicas. INTRODUCCIÓN Debido a la predominante concentración del ión sodio en el líquido extracelular éste influye sobre la presión osmótica que juega un rol preponderante en la distribución del agua entre el espacio extra o intra celular. En el hombre adulto hay cerca de 43 mEq de sodio intercambiable por kg. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante: Acetato de uranilo más acetato de magnesio  Reactivo de color: tioglicolatop de amonio  Standard de sodio: 50 mmol/l . en pacientes con diarrea. El exceso de sodio se elimina por el riñón. si el líquido ingerido es insuficiente por razones anormales. es el principal factor de regulación de este ion corporal y de sus concentraciones. Se observan concentraciones bajas si las concentraciones de sodio exceden a las del agua. por peso corporal. El estado clínico de hidratación es importante para evaluar el significado de los niveles séricos de sodio. el sodio esta en equilibrio con el del líquido intersticial. Del total de sodio corporal hay un 18% que fundamentalmente se encuentra en los huesos. sulfato y otros aniones (sales). Puede ocurrir deshidratación con sodio sérico elevado. En el suero. tratado sólo con insulina y solución salina. enfermedad renal con disfunción tubular. Son ingeridos cerca de 3 gr. por ejemplo en pacientes con diabetes insípida no controlada. alimentación nasogástrica con alto contenido de proteínas. Como sucede con el agua corporal los valores varían inversamente con la grasa corporal. cuando el líquido ingerido no es suficiente para eliminar la sobrecarga de solutos por el riñón. Algunos pacientes con enfermedad cerebral. Un adulto de 70 kg de peso contiene aproximadamente 80 g de sodio de los cuales 44 se encuentra en el % líquido extra celular y el 35% en los huesos. La determinación del sodio de los fluidos biológicos se realiza sea por electrodo ión selectivo o menos frecuentemente por método colorimétrico II. como en el coma diabético. Pequeñas cantidades aparecen también en las heces. El ión sodio es importante en el mantenimiento del equilibrio ácido básico ya que constituye aproximadamente el 90% del total de cationes extra celulares. El sodio se excreta casi exclusivamente en la orina. Se puede encontrar incremento de sodio con hiperosmolaridad en individuos con deficiencia predominante de agua corporal.

¿Por qué la clasificación de deshidratación por alteración de la osmolaridad. ¿Cuál es la importancia biológica del ion sodio? 2. Dejar reaccionar durante 30 minutos Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). ¿Cuál es el principal factor de regulación del ion sodio corporal? 3. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (PROCEDIMIENTO) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco de Standard Problema Reactivo Standard 20 ul Problema 20 ul Precipitante 1 ml 1ml Tapar los tubos y mezclar cuidadosamente. incluye básicamente las concentraciones de esté ion? . Dejar reaccionar durante 5 minutos Agitar fuertemente por 50 segundos. Emplear el sobrenadante Precipitante 20 ul Sobrenadante 20 ul Standard Sobrenadante 20 ul Problema Reactivo de color 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar bien. CUESTIONARIO: 1.86 III. Después de 5 a 30 minutos medir las absorbancias contra agua destilada a 405 nm CALCULOS: Factor: 150 /Lectura Bco Reactivo-Lectura Standard Na (mmol/l)= (Lectura Bco Reactivo-Lectura Muestra) x factor IV. Señale las concentraciones séricas normales. ¿Qué semejanza existe en la absorción intestinal de este ion y la glucosa? 4. 5.

El potasio del hueso. en alcalosis con hiperventilación. El 95% del total del potasio corporal es intercambiable aunque el grado de recambio de cada tejido varía en los diferentes órganos. en hipoventilación tanto central como periférica cuyo incremento de potasio es frecuente. cerebro y de los glóbulos rojos se recambia más lentamente que en otros órganos. la excesiva destrucción de células del cuerpo y la utilización de proteínas para propósitos calóricos se acompañaría de pérdida de potasio celular. Con ingestión calórica inadecuada y la utilización de proteínas celular para propósitos calóricos. De potasio en forma de sal son ingeridos diariamente y recambiados con el potasio corporal. En los niños donde la ingestión de potasio es relativamente más grande. en la diabetes no controlada. en insuficiencia de la corteza adrenal.87 DETERMINACION DE POTASIO I. en deshidratación. Del sue el ro potasio es transferido el líquido intersticial antes de penetrar a las células o al filtrado glomerular a través de la membrana de los capilares glomerulares del riñón. Además de este rol pasivo. Déficit de potasio corporal puede resultar en: Pobre ingestión de alimentos. son perdidos a través del vómito. el recambio diario es de 14%. en fístulas gastrointestinales y vómitos. Hiperpotasemia se puede encontrar en: Shock o falla circulatoria de cualquier causa. INTRODUCCIÓN El potasio es el principal catión intracelular y por lo tanto es un factor importante de la presión osmótica que determina la distribución de agua entre las células y el líquido extracelular. pues la falta de esferoides adrenales provocan retención de potasio sérico. en íleo paralitico y anastomosis intestinal no funcionante. influye activamente en el metabolismo celular ya que es cofactor de muchas reacciones enzimáticas intercelulares.9 mEq/L. en recién nacidos los niveles son algo más altos. Bajo condiciones de incremento de pH (alcalosis) asociado con la disminución de cloruros. esto es debido a que la excreción de potasio por orina se mantiene constante. Se produce hiperpotasemia con pérdida intracelular de potasio cuando la permeabilidad de la membrana celular está alterada por lesión tisular. Se debe evitar la hemolisis en la toma de muestras de sangre porque el potasio puede ser liberado de los eritrocitos lisados. en administración continua de glucosa endovenosa y terapia salina. Los niños tienen relativamente menos contenido de potasio por kilogramo de peso debido a que la relación de agua intracelular/extracelular es menor que en adultos. varían entre 4-5. el potasio es liberado de las células y excretado dando como resultado hipopotasemia. Existe también una pérdida lenta de potasio de los glóbulos rojos hacia el suero cuando la sangre permanece guardada. Entonces el 2<26 del total del potasio corporal son recambiados diariamente. diarrea o fístula gastrointestinal segundo por excreción urinaria incrementada en individuos con anormalidades tubulares renales. del cual el 98% es intracelular mientras que el 2% está presente en el liquido extracelular. El déficit de potasio celular es reflejado en los hallazgos séricos y bajo estas condiciones la regla es hipopotasemia debido a la elevada excreción urinaria de cloruro de potasio. El potasio se pierde en el cuerpo principalmente en la orina aunque pequeñas cantidades son perdidas en la respiración insensible. El potasio es rápidamente removido del líquido extracelular después que es ingerido. La concentración de potasio intracelular varia con los cambios del agua que gene ralmente acompaña a las alteraciones de los niveles de sodio extracelular. Aproximadamente 293 gr. así mismo en algunos casos de . en mujeres solamente 40 mEq por kilogramo de peso. Bajo estas condiciones el potasio se eleva si el riñon no puede excretar esta sobrecarga. asi mismo en algunos casos de insuficiencia renal se encuentra elevada la concentración de potasio. se produce intercambio entre el sodio intersticial y el potasio intracelular. La concentración de potasio en el suero de personas normales es de 3. en hiperfunción adrenocortical o sobredosis de cortisona o ACTH. Excesiva cantidad de potasio puede liberarse del cuerpo bajo dos condiciones: primero cuando las secreciones intestinales con su contenido relativamente alto de potasio. (3300 mEq) de potasio en un adulto de 70 kg. en intoxicación temprana con salicilatos. Existe aproximadamente 130 gr.5 -5-3 mEq/L. en adultos masculinos hay aproximadamente 46 mEq de recambio de potasio.

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insuficiencia renal crónica. II. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante :ácido tricloroacético  Reactivo TPB-Na: tetrafenilborato de sodio  NaOH  Estándar de Potasio III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): 1. Precipitación: en un tubo de ensayo pequeño añadir 50 ul de suero y 500 ul de reactivo precipitante. Mezclar cuidadosamente. Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). 2. Armar el siguiente sistema: Componentes Reactivo de trabajo Standard Sobrenadante Standard 1 ml 100 ul 100 ul Problema 1 ml

Para producir una turbidez homogénea el Standard y el sobrenadante transparente deben de ser agregados en el centro de la superficie del reactivo de trabajo Mezclar cuidadosamente Dejar reposar por lo menos 5 minutos Medir las absorbancias dentro de los 5 y 30 minutos CÁLCULOS: Factor: 5/Lectura del Standard Problema: lectura del problema x factor VALORES NORMALES: Suero de 3.5 a 5.5 mmol/l IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es el principio o fundamento del método de Hoffman para determinación del potasio sérico? 2. ¿Cómo explica metabólicamente la influencia sobre la concentración sérica de potasio producida por la administración de glucosa e insulina? 3. Explique usted los efectos metabólicos de la aldosterona en la excreción renal de potasio. 4. De ejemplos de hiperpotasemia y de hipopotasemia

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PRACTICA N° 35
DETERMINACION DE CALCIO SERICO
I. INTRODUCCION: El calcio sérico se encuentra en dos formas: Una combinada con proteínas séricas, inactivo e incapaz de difundir a través de las membranas de los capilares. Y la forma no unida a las proteínas, es principalmente iónico, difusible y activo. Varios factores influyen en la concentración de calcio sérico total. La hiperproteinemia está asociada con una elevación en los niveles de calcio, mientras que la hipoproteinemia se acompaña con disminución de la concentración de calcio; sin embargo la concentración de calcio ionizado no se altera. El calcio ionizado se altera en las siguientes situaciones: 1) Por variaciones del pH sérico; la alcalosis tiende a disminuir el calcio y la acidosis tiende a incrementarlo. 2) La ingestión de vitamina D aumenta el calcio ionizado a través de la absorción de calcio y por la excreción del fósforo. 3) La hormona paratiroidea es el factor más importante que controla los niveles de calcio sérico y su efecto es casi exclusivamente limitado a la forma iónica del calcio. La concentración del calcio sérico en individuos normales es de 9 a 11,5 mg por 100 ml Aproximadamente 4,5 a 5,5 mg% es ionizado y cerca de 0,5 mg% está presente como citrato de calcio y el resto se encuentra unido a las proteínas. El propósito de la presente práctica es determinar la concentración sérica de calcio total en personas adultas normales y/o en estado patológico por el método colorimétrico directo

II.

REACTIVOS A UTILIZAR: - Buffer alcalino: buffer lisina pH 11,1 - Reactivo de Color: 8-hidroxiquinolina, o-cresolftaleina-complexona, ácido clorhídrico - Solución estándar de calcio: 8 mg/dl

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Standard Muestra Muestra --------20 ul Standard ----20 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar y medir la absorbancia de la muestra (¨A muestra) y del Standard (¨A Standard) contra el blanco en un lapso de 5 a 30 minutos CALCULOS: A muestra C ! 8v ?mg/dlA A standard VALORES DE REFERENCIA: Suero o Plasma: 8,1 ± 10,4 mg/dl 


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IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es la importancia biológica del calcio en el ser humano? 2. ¿Cuáles son las formas de calcio sérico? 3. ¿Cuáles son los factores que controlan los niveles de calcio sérico? 4. ¿Cuál es la concentración normal de calcio sérico total? 5. Señale algunas alteraciones fisiológicas y/o patológicas que producen alteraciones de los niveles séricos de calcio.

Las células esferociticas se rompen más rápidamente que las demás y de hecho la prueba de la fragilidad osmótica puede ser considerada como un índice más sensible que la de la magnitud de eritrocitos a la lisis en solución hipotónica. es observada en la talasemia. Cuidar que las gotas de sangre caigan directamente en las soluciones salinas. La presente práctica tiene la finalidad de: Verificar el desplazamiento de agua desde el medio extracelular hacia el medio intracelular y viceversa en los eritrocitos.0. . cuando estos son puestos en soluciones hipertónica e hipotónica respectivamente.Solución salina amortiguada concentrada 10%. .5% .NaCl al 8. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS ERITROCITOS : PRECAUCIONES: 1. lo que se conoce con el nombre de fragilidad osmótica de los eritrocitos (0. Aunque en la prueba de la osmosis la ruptura de las células resulta de la alteración de su forma y disminución de su resistencia a las fuerzas osmóticas más que a un cambio en la composición de la célula o su osmolaridad.NaCl al 4.Na2P04 (27.NaH2 PO4. La muestra de sangre debe ser obtenida con un mínimo de estancamiento y de trauma. no deben hacer contacto con las paredes de los tubos secos porque estos pueden causar .91 PRACTICA N° 36 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. Si utilizamos una serie de soluciones de CINa de concentraciones gradualmente progresivas es posible comprobar que la hemolisis de los eritrocitos se producen dentro de ciertos limites de hipotonicidad.31 g). Utilizar heparina como anticoagulante de elección.86 g). 3. El uso de anticoagulantes del tipo de los oxalatos que comprende la adición de sales osmóticamente activas son indeseables. Se afora con 2 litros de agua destilada y se conserva a 0° C (dura varios meses). Cuando éstos son colocados en una solución hipertónica pierden líquido arrugándose y destruyéndose hasta que se establece el equilibrio osmótico con el líquido circulante. anemia falciforme y en la anemia hipocrónica ordinaria (ferropénica).3%). 2. de allí que se emplee el término de fragilidad. la resistencia de los eritrocitos a las soluciones hipotónicas disminuye. La muestra debe ser procesada tan pronto como sea posible después de tomada. REACTIVOS A UTILIZAR: EXPERIMENTO N°1 . Sin embargo en ciertas anemias hemolíticas adquiridas. 4.5% EXPERIMENTO N°2 . Demostrar la fragilidad osmótica de los eritrocitos cuando éstos son colocados en diversas soluciones de CINa de diversas concentraciones. II. INTRODUCCION: La membrana de los eritrocitos es semipermeable. Sin embargo cuando los eritrocitos son colocados en solución hipotónica aceptan líquido (hinchándose) hasta que se alcanza el equilibrio osmótico o hasta que se rompen. . .5 .NaCl al 15%. .2H2O (4.Cloruro de sodio (180 g).Heparina III.

00 3.00 0.00 0.75 0.92 hemólisis.60 10 3.40 y 0.25 0. 5. Marcar el tubo donde la hemólisis es completa (color rojo intenso).70 12 4.40 6 2. en tubos heparinizados.65 11 3.00 2.50 8 2.00 1. 7.50 0. Anotar los resultados.00 0.75 0. Colocar cantidades similares de sangre control del sujeto normal en cada uno de los tubos de una segunda hilera.00 0. EFECTO DE LAS SOLUCIONES HIPERTÓNICAS E HIPOTONICAS SOBRE LA INTEGRIDAD DE LOS ERITROCITOS: (Verificar por inferencia el desplazamiento del agua entre los medios intra y extracelular.45 7 2. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 1 y 3 de cada mesa de trabajo).02 ml de sangre del paciente a cada uno de los doce tubos de una primera hilera. Se debe rotar cada muestra suavemente en el tubo hasta que el color sea rojo brillante (plenamente oxidado). LECTURA: Observar cuidadosamente y marcar los tubos donde se inicia la hemólisis.75 3.10 2 1. objetivado por el color rojizo pálido que toma el líquido sobrenadante en los tubos centrifugados. Volver a mezclar y luego centrifugar a 2000 rpm.00 4. La sangre del paciente y del sujeto normal son tomadas.75 2. 4. Utilizando con precisión una pipeta para hemoglobina o una pipeta Pasteur calibrada. con las precauciones señaladas.25 1.25 2. Utilizando lancetas descartables o lanceta de Link estéril pinchar el dedo. Conviene preparar una solución al 1% a partir de la solución concentrada al 10% y armar la siguiente serie de tubos: N° de NaCl al 1% Agua destilada % de NaCl tubo (ml) (ml) 1 0.50 1. Mezclar correctamente cada tubo y dejar a temperatura ambiente por 30 minutos.30 4 1. Proceder de la siguiente manera: Láminas (gotas) I II III .50 0. por acción de soluciones salinas de diferente concentración). PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES Las diluciones se pueden preparar inmediatamente antes de la prueba: 1.50 3. Observar que la fragilidad globular media de los eritrocitos se produce entre los tubos 5 y 6 (0.45% de NaCl).35 5 2. Depositar una gota de sangre en cada una de las tres láminas porta-objeto.50 0.20 3 1. 3.50 4.50 2. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 2 y 4 de cada mesa de trabajo). añadir 0.80 2. 6. con un algodón empapado en alcohol yodado.55 9 3.50 0.25 0. Procedimiento: Realizar asepsia del pulpejo del dedo escogido de la mano. Mezclar el contenido de cada tubo antes de agregar la sangre.

Según observación cuidadosa. 1 2 - 1 2 - 1 2 Utilizando el microscopio observar los eritrocitos de cada una de las láminas. Anotar los resultados. 2. ¿Cuál es la relación normal existente que permite la forma de disco bicóncavo del eritrocito? B. De acuerdo a los valores normales del test de fragilidad osmótica de los eritrocitos. 4. 3. IV. Establecer las comparaciones morfológicas y/o lisis de los glóbulos rojos en rel ción a cada tipo de a soluciones empleadas en cada caso. ¿Cuáles son las relaciones normales existentes para la formación de los esferocitos y de las células tipo tiro al blanco? (target cell). así mismo el tubo en donde la hemólisis fue completa.93 Sangre del pulpejo de dedo Solución isotónica de CINa 8. señale los porcentajes de inicio y finalización (total) de la hemólisis. Si el test de fragilidad osmótica de los eritrocitos de un modo general evalúa la relación entre el área superficial y el volumen de la célula. CUESTIONARIO: 1. señale la concentración o porcentaje de NaCl del tubo en el cual empezó la hemólisis.5% Mezclar bien. Señale causas de alteraciones en la fragilidad osmótica.5% Solución hipertónica de CINa 15% Solución hipotónica de CINa 4. diga: A. .

INTRODUCCION: Frecuentemente los antígenos se asocian con partículas que son demasiado grandes para formar soluciones o suspensiones coloidales en los medios acuosos. Se denomina reacción de aglutinación al fenómeno en que la mezcla de las partículas de antígeno con los antisueros específicos provoca una agrupación de dichas partículas antigénicas. en las condiciones empleadas en la prueba. Estas diferencias dependen principalmente de la valencia del sitio de fijación del antígeno en las diversas clases de los anticuerpos. La concentración del anticuerpo aglutinante se define como la mayor dilución de antisuero que aglutina el antígeno examinado. Por lo general la aglutinación puede observarse a simple vista. En efecto dichas pruebas permiten habitualmente descubrir hasta 0. para descubrir la presencia de anticuerpos del receptor. etc. en el diagnóstico de las anemias hemolíticas por autoinmunidad (en la que los pacientes producen anticuerpos para las membranas de sus propios eritrocitos). Algunas personas son poseedoras de un antígeno de superficie designado en forma arbitraria como antígeno A (eritrocitos tipo A). una baja concentración de anticuerpos IgM produce una reacción de aglutinación cuya intensidad es igual a la que se produce con una elevada concentración de anticuerpos IgG. pero en algunos casos se necesita el examen microscópico de la preparación estudiada. Al igual que las reacciones de precipitación las pruebas de aglutinación requieren de un pH apropiado y de la moralidad de amortiguadores salinos y debe existir una proporción adecuada de antígeno respecto del anticuerpo.1 Ugr de anticuerpos/ml de suero Las pruebas de aglutinación se utilizan rutinariamente en las pruebas cruzadas con sangre antes de administrar transfusiones endovenosas en pacientes. dirigidos contra el mismo antígeno.). Pasteurella). con cinco sitios eficaces de fijación de antígeno por cada moléculas de 19S tengan una actividad aglutinante superior a la de los anticuerpos IgG con dos sitios de fijación de antígeno por cada molécula. En general las pruebas de aglutinación son fáciles de prac ticar. otras personas tienen otro tipo de antígeno de superficie que se llama antígeno B (eritrocitos tipo B). Por lo tanto no es sorprendente que los anticuerpos IgM. como el tifus endémico). en la Prueba de Paul-Bunnell (Prueba de aglutinación en pacientes con mononucleosis infecciosa). en la superficie de los eritrocitos del donador (Prueba indirecta de Coombs). Brucella. en la Prueba de Widal (en pacientes infectados con bacterias gram negativas como Salmonella. en la Prueba de Weil Felix (en pacientes con enfermedades provocadas por Ricketsias. En otras palabras. Los anticuerpos de las distintas clases de inmunoglobulinas difieren en su capacidad de producir reacciones de aglutinación. en la prueba del factor reumatoideo (en pacientes con artritis reumatoides). ambos tipos de reacciones se producen por medio de anticuerpos multivalientes que se combinan con partículas de antígeno formando complejos de antígeno anticuerpos. Algunas personas .94 PRACTICA N° 37 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. eritrocitos. El mecanismo de una reacción de aglutinación es semejante al de las reacciones de precipitación. Estas partículas (bacterias. partículas de látex. La única diferencia entre una reacción de precipitación y otro de aglutinación es que los antígenos son moléculas pequeñas en tanto que los antígenos aglutinantes están asociados con partículas de mayor tamaño. pueden quedar suspendidas en una solución salina y mezclarse con antisueros específicos. Las pruebas de aglutinación tienen muchos usos en el laboratorio clínico. bastante reproducibles y sumamente sensibles. etc. en pruebas inmunitarias del embarazo. tanto para medir antígenos como para determinar las concentraciones de los anticuerpos. En la membrana de los glóbulos rojos de cualquier persona normal se pueden encontrar determinados antígenos (antígeno de superficie o determinantes antígenos).

En cada extremo de una lámina porta objetos poner una gota del suero recientemente obtenido y marcar 1 y 2 respectivamente. y Llevar los glóbulos rojos sedimentados con suero fisiológico por tres veces. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. se ha sugerido que las inmunizaciones inaparentes durante la infancia y el comienzo de la niñez pueden ser responsables de la producción de anti A o anti B. le ha conferido una tolerancia inmunológica específica hacia él. Pero una persona del grupo A forma sólo anti B y no anti A. Los antígenos aparecen a comienzos de la edad fetal en cuanto se forman los eritrocitos . III. Observar si hay o no aglutinación de los glóbulos rojos en 1 y/o en 2 de isoaglutininas en el suero problema del estudiante y deducir el grupo sanguíneo que posee. y Obtener muestras de sangre tipo A y tipo B. La misma lógica explicaría que una persona del grupo B forma sólo anti A y no anti B. De acuerdo con esta hipótesis todos los recié nacidos n están expuestos a los antígenos A y B. Es un hecho bien conocido que muchas bacterias instestinales (salmonellas y shigellas) tienen antígenos que reaccionan en forma cruzada con los antígenos humanos AB0 (H). Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo B sobre la gota de suero con marca 2 y mezclar.000. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo A sobre la gota de suero con marca 1 y mezclar. para eliminar los anticuerpos inespecíficos adicionados a la superficie de los glóbulos rojos. Utilizando los símbolos (+ )= positivo y (-)= negativo complete el cuadro de aglutinación de los grupos sanguíneos ABO: .  Identificación de isoaglutininas en suero: y De uno de los estudiantes de cada grupo (o masa) de trabajo. y Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos y descartar el plasma. tomar una muestra de sangre sin anticoagulante y obtener el suero por centrifugación. y Preparar una suspensión al 5% de glóbulos rojos lavados. Por otra parte. II. aunque quizá sea más realista una cifra de 5000. Estos anticuerpos (isoaglutininas) son del tipo IgH y son poco detectables en los sueros de los recién nacidos. previamente identificadas. Los antígenos de superficie A y B son llamados también aglutinógenos y se ha estimado que pueden haber hasta un millón de sitios antigénicos A o B en un solo hematíe. Como existe un desarrollo gradual de estas isoglutininas. pero aumentan con rapidez su titulación en los primeros meses de vida. del tipo A y B en solución salina fisiológica. con hepsrina como anticoagulante. CUESTIONARIO: 1. llamados isoaglutininas. porque producen aglutinación de los glóbulos rojos que poseen el correspondiente antígeno y porque los antígenos son de origen humano (iso=de una misma especie). REACTIVOS A UTILIZAR: y Kit para identificar grupos sanguíneos (Diagnóstica). y y y y IV. en el suero existe también normalmente anticuerpos contra los antígenos A y B. ya que su propio antígeno A.95 pueden tener ambos antígenos A y B (eritrocitos AB) y una cuarta posibilidad es que no tengan ninguno de los antígenos mencionados (eritrocitos tipo 0 o H).

EN EL SUERO Anti Anti Anti Anti POSIBILIDADES DE TRANSFUSIÓN Puede recibir Puede donar De A AyO ByO O Todos (receptor Universal) A y AB B y AB Todos (donador Universal) AB 4. ¿Qué aplicaciones de las reacciones antígeno anticuerpo puede señalar? 5. En el siguiente cuadro anote los anticuerpos en el suero: GRUPOS SANGUÍNEOS ABO ANTIGENOS EN LOS POS ERITROCI. SANG) A B O AB ANTICUER. (G.96 SUERO DEL GRUPO O B A AB ( ( ( ( AB ) ) ) ) ERITROCITOS DEL GRUPO A B ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( C ) ) ) ) 2. Diga usted ¿Por qué ya no es costumbre corriente utilizar sujetos de tipo O como ³donadores universales´ y personas de tipo AB como ³receptores universales´? 3. ¿Cuál es el fundamento de las reacciones antígeno-anticuerpo? .

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