ALUMNO (a

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PRESENTACION
Los profesores de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la U niversidad Nacional de Trujillo, han actualizado la Guía de Práctica, donde el estudiante encontrará una breve introducción de la importancia bioquímica y correlato medico de cada práctica, así como el procedimiento a desarrollar, finalizando con un breve cuestionario a fin de ampliar o concretar la aplicación de lo tratado. La Bioquímica es sin duda la ciencia que más ha aportado al desarrollo de la Medicina, basada en una rigurosa apl icación del método científico de la investigación

experimental. En la práctica, los alumnos a partir de los conocimientos adquiridos en los diálogos, seminarios y casos clínicos, tienen la oportunidad de plantear

interrogantes, contrastarlas con un experimento en forma ordenada, obten iendo resultados que al final se discutirán en grupo con el docente. También podrán conocer algunos métodos aplicados al diagnóstico clínico o al estudio nutricional. La práctica en Bioquímica, constituye un estímulo importante en el desarrollo de la investi gación experimental, permitiendo a nuestros estudiantes desarrollar habilidades y destrezas en trabajos de investigación y así obtener logros a nivel nacional para nuestra Facultad. Un recuerdo especial para los profesores que sentaron las bases para la actual guía de práctica como el Dr. Hugo Alpaca Muñoz, el Dr. Jorge García Ventura y un

agradecimiento a todos los docentes que de una u otra manera aportaron con sus conocimientos para disponer de esta herramienta que beneficiará a los alumnos de nuestra Facultad. Dr. CARLOS ARANCIBIA ARROYO Dra. MARIA DAYSI REYES BELTRAN Dr. JUAN VALLADOLID ALZAMORA Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA Dr. WALTER OBESO TERRONES Dr. ALFREDO LARIOS CANTO Dr. JORGE PLASENCIA ALVAREZ Dr. HECTOR RODRIGUEZ BARBOZA

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I UNIDAD SUBESTRUCTURA CELULAR: ENZIMAS Y BIOENERGETICA

REUNION DE LABORATORIO N° 01
PRACTICA N° 01
DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS
I. INTRODUCCION: La vida depende de una serie ordenada de reacciones químicas que son catalizadas por enzimas formadas para este fin. Las enzimas son proteínas relativamente frágiles con tendencia a sufrir desnaturalización e inactivación, es decir alteraciones en su conformación, por efecto de diversos agentes físicos y químicos como: temperatura, ácidos, álcalis fuertes, sales pesadas, pH, etc. Las enzimas se encuentran en pequeñas concentraciones en los materiales biológicos resultando , complicada su individualización o purificación. Para poder verificar directamente las propiedades comunes o similares de la naturaleza proteica que las caracterizan, experimentalmente se pueden utilizar las propiedades de catalizadores específicos que tienen las enzimas, como indicador de las alteraciones que pueden sufrir éstas cuando son sometidas a la acción de diferentes agentes físicos y químicos. De esta manera, sin necesidad de individualizar o purificar una determinada enzima se pueden verificar cómo los agentes físicos y químicos afectan la naturaleza proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad. La finalidad de la presente práctica, es evidenciar las características proteicas de las enzimas y que expuestas a la acción de diversos agentes físicos y químicos hacen variar su comportamiento y actividad catalítica. II. REACTIVOS A UTILIZAR: NaOH 1N SO4 Cu 20% NaCl 0.15M Amilasa salival 1.0% Solución iodada HCl 3N y 0.05N Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 Ácido tricloro acético (A.T.C.A.) al 20%

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Preparar: SISTEMA A TUBOS COMPONENTES (en ml) Amilasa al 1% NaOH 1N HCl 3N Ácido Tricloro acético 20% Sulfato de Cobre al 20% Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 I 1.0 2.4 II 1.0 2.4 III 1.0 2.4 IV 1.0 2.4 V 1.0 2.4 VI 1.0 2.4

6 ml.0 III 1.0 1. Colocar el tubo VI en un baño de agua hirviendo por 10 minutos. Explique los tipos de enlaces fuertes y débiles que existen entre los aminoácidos para conformar una determinada proteína.0 5. .4 2. Observar el color producido e interpretar los resultados.0 IV 1.0 a.0 VI 1.6 NaCl 0.5 0.4 a.05N De los tubos de reacción del sistema (B). Pre incubar por dos minutos a 37 ºC.5 I 5 0.1 M / pH 6.0% en solución acuosa Buffer fosfato 0.5 VI 5 0. 3.4 2.4 2. A continuación armar el siguiente sistema: TUBOS COMPONENTES (en ml) HCl 0. CUESTIONARIO: 1. de cada uno de los tubos del sistema (A) a su correspondiente tubo del último sistema (B).15 M Agua Destilada 5.0 V 1.0 1.0 5.4 2. Dejar los 5 primeros tubos del sistema en reposo por 10 minutos a la temperatura ambiente.5 IV 5 0.0 I 1.5 V 5 0. de la enzima tratada.5 0. c. IV.0 5. Esquematice el procedimiento de la práctica. d. b. c. Observar el aspecto y color producido e interpretar.5 0.5 III 5 0. agregar: Solución yodada 0.5 0. b.5 II 5 0.0 5.0 1.0 1.4 2.0 1. Interprete y explique bioquímicamente cada uno de los pasos realizados durante el desarrollo de la práctica 2. Agregar 0. d.4 2. Durante este lapso construir el siguiente SISTEMA B: SISTEMA B: TUBOS COMPONENTES (en ml) Almidón al 1.0 1.0 5.5 e. 4.0 II 1. Explique la teoría de la acción molecular de las enzimas sobre sus respectivos sustratos.5 0. Dejar en incubación a 37 °C por 20 minutos.

b.1M Agua destilada I 5 ml. entonces en un organismo vivo habría tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes. INTRODUCCION: Las enzimas pueden ser descritas como catalizadores complejos de origen biológico que tienen un alto grado de especificidad y eficiencia.0 al 1% Solución de cloruro de sodio 0. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato. 2. y Colocar los tubos al baño de agua a 37 °C por 5 minutos. 4 ml.Ácido Clorhídrico 0. . y Agregar 1 ml. verificando tanto el sustrato residual y los productos formados en dicha reacción. la vida tal como es no podría existir. permitiendo que las reacciones químicas dentro de la célula ocurran rápidamente a través de vías bien definidas.Solución yodada. Verificando los productos liberados después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura. REACTIVOS A UTILIZAR: . Solución Cúprica alcalina. utilizando la enzima amilasa salival que tiene la capacidad de degradar el almidón en maltosa (disacárido reductor) y algo de glucosa. En general. Para poder mostrar la actividad enzimática se debe tener presente fundamentalmente que cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima. Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada.Reactivo Folin Wu: a. .Cloruro de sodio solución 0.0 al 1%. la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras: 1. solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. II 5 ml. Sin estas proteínas especializadas. . III. La finalidad del presente trabajo experimental es determinar la actividad enzimática. 1 ml.Enzima al 1% (amilasa salival). 3 ml.Solución de almidón pH 6.05N . 1 ml. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) y Armar el siguiente sistema: ETAPA A: TUBOS COMPONENTES Solución de almidón pH 6.1M . Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL ) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura.5 PRACTICA N° 02 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. y Volverlos a colocar al baño de agua a 37 °C durante 10 minutos. de enzima al tubo II. Solución fosfomolíbdica. . II.

1ml. 1ml. Mezclar. 0.5 ml. 1ml. Elabore un gráfica para demostrar la acción de una enzima sobre su sustrato.6 CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL. a este nuevo sistema. 3. 2. Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimático y defínalos. De cada uno de los tubos del sistema anterior. 0. II 1ml. 2ml.5 ml. 0. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante III.05 N De los tubos I y II: Etapa A Solución yodada I 5 ml.5 ml. 4. y Mezclar. 0. TUBOS COMPONENTES Ácido clorhídrico 0. y Inmediatamente cumplidos los 10 minutos.5 ml. II 5 ml. . 1ml. transferir 0. donde se observe la energía de activación y el estado de transición. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué métodos conoce para determinar la actividad enzimática? Explique la acción bioquímica de cada uno de los componentes en los pasos seguidos para determinar la actividad enzimática. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante. CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin WU) TUBOS COMPONENTES De los tubos I y II: etapa A Solución Cúprica alcalina Hervir 8 minutos Enfriar Solución fosfomolíbdica Agua destilada y I 1ml.5 ml. 2ml.

Al contenido anterior del sistema agregar rápidamente 1 ml. . En el tubo N° 9 una vez efectuada la mezcla.NaOH al 10%.2 6. porque el número total de cargas positivas es igual al número total de cargas negativas contenidas en la proteína.0 1. . INTRODUCCION: El punto isoeléctrico es la concentración de iones hidrógeno en el cual la proteína es eléctricamente neutra.0 1.0 1. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que el punto o pH isoeléctrico de las enzimas es una característica físico química común de estas moléculas. de solución del tubo N° 1 y agregarlo al tubo N° 2.0 IV 5.0 VI 5. cuando se encuentran en una solución que tienen pH igual al PI.0 IX 5.0 V 5.7 PRACTICA N° 03 DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LAS PROTEINAS I.0 Mezclar al instante por inversión.0 1.0 II 5.) Ácido Acético 1N Agua Destilada      I 3. produciéndose en consecuencia variaciones en la estructura terciaria o cuaternaria y por lo tanto en su función biológica Aparte de otras propiedades que presentan las proteínas. Aprovechando este comportamiento. de caseína en acetato de sodio 0. TUBOS CONTENIDO ( en ml. Completando del mismo modo hasta completar la serie. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Marcar una serie de tubos de ensayo de 1 al 9 TUBOS REACTIVOS (en ml. del tubo N° 2 y transferir al tubo N° 3.8 II 5 III 5 IV 5 V 5 VI 5 VII 5 VIII 5 IX 5 Mezclar el tubo N° 1 Extraer 5ml. iguales o mayores al PI.0 III 5.Ácido acético 1N .0 1. la proteína sufre variaciones en la constitución de sus grupos químicos.0 1.0 1.1N en cada tubo. que precipitan porque la solubilidad en estas condiciones disminuye al mínimo. se extrae 5 ml.Indicador de pH: Papel Indicador ó pHmetro.Solución de caseína en Acetato de Sodio 0. Cuando una proteína se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pH menores. II. se puede determinar el PI de una proteína observando los cambios de solubilidad que se producen cuando la proteína se encuentra en varias soluciones que tienen pH conocidos. algunas proteínas son muy díficilmente solubles y precipitan.0 VII 5.1N III. cada proteína posee un determinado punto isoeléctrico (PI). de solución y se elimina.1N (sal)  I 5. Mezclar Extraer 5ml. .) Contenido Anterior Caseína 0. REACTIVOS A UTILIZAR: .0 1. Por tanto.0 1.0 VIII 5.

.1 4 NOTA: De la manera indicada en el ejemplo. verificar el pH de cada uno de los tubos con el indicador de pH. de acetato de sodio 0. Etc. Anotar los resultados en la columna respectiva del cuadro anterior. debe calcularse el pH de cada uno de los tubos IV. 0. Cálculo de pH para el tubo N° 3: pH = pK + log.6 ml. Indique el punto isoeléctrico aproximado a la proteína. En el tubo N°2 la concentración de ácido acético es de 8 ml. Así en el tubo N° 1 es de 1. Ver ejemplo. Anotar en el cuadro que se da a continuación Observar después de 30 minutos de reposo y anotar también en el cuadro respectivo.1N). Ecuación de Henderson ± Hasselbach [ sal ] pH = pK + log.6 = 4.1 N en todos los casos. 3. que encontró en su experimento. la concentración de ácido acético varía. TUBOS N°. al 0.1 N. 1 = 4. ¿Cómo interpreta el resultado obtenido del punto isoeléctrico? ¿Qué es el pK? El pH neutro del medio ¿es igual al pH isoeléctrico? De sus razones. lo cual se producirá en el tubo que tiene pH próximo a la solubilidad mínima de la proteína. 0. En el tubo N° 3 la concentración de ácido acético es de 4.  Calcular el pH de cada uno de los tubos aplicando la Ecuación de Henderson ± Hasselbach. 2.  Luego de transcurridos los 30 minutos de reposo.7 Ejemplo : Si la concentración de la sal es de 1 ml. I II III IV V VI VII VIII IX Emplear los símbolos siguientes : O = no cambia + = opalescencia. x = precipitado EFECTO INMEDIATO EFECTO DESPUÉS DE 30 MINUTOS CÁLCULO DEL pH  Determinar el tubo que presenta el máximo de precipitación.8    Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la proteína en los diferentes tubos. de ácido 1 N (16 ml.0 ml.7 ± 0. 4.1 TUBO N° 3 = pH 4. [ Ácido ] pK del Ácido Acético = 4.1 N. CUESTIONARIO: 1.

9 5. Si la concentración de ácido acético en el tubo II es 8 ml a 0.1 N ¿Cuál es el pH de la solución en 1 ml? .

.La concentración del sustrato o los sustratos y cofactores. definible como el número de moléculas de sustrato transformado por minuto y por molécula de enzima (ó por un solo centro activo) en condicionales experimentales tales que se esté midiendo la velocidad máxima (concentración saturante del sustrato).B + C en que dos moléculas reaccionan entre si.Cuando el sustrato es una proteína. entendiéndose por unidad de una enzima a la cantidad de ella que produce cierta velocidad de reacción bajo determinadas condiciones. se recurre a la medida de la velocidad de la reacción que cataliza. Entonces la actividad específica además de cuantificar la enzima. Esto es posible debido a que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima. deben establecerse: . Se denomina Actividad Específica a la cantidad de una enzima expresada en términos del contenido de proteína de la preparación. y se expresa como el número de unidades de la enzima por miligramo de proteína. Dos casos merecen aclaración especial: . . ACTIVIDAD ESPECÍFICA. Esa velocidad de reacción se expresa como la cantidad de sustrato transformado en cierto tiempo. o un polisacárido. .El pH. Esta aumenta durante el proceso de purificación de la enzima en los homogenizados biológicos y llega a ser máxima y constante cuando la enzima se halla en estado puro. y en general de todos aquellos factores que de una u otra manera pueden modificar la actividad de la enzima. constituye una medida del grado de pureza de la enzima durante el proceso de purificación. se debe reemplazar la definición de un Qmol de sustrato por un microequivalente (Q eq) del grupo involucrado. una Unidad será la cantidad de enzima que cataliza la transformación de dos Q Moles de sustrato por minuto. En cuanto a las mencionadas condiciones de medida. se toma como medida de la reacción el número de uniones peptídicas o glicosídicas atacadas respectivamente.En casos de reacciones bimoleculares del tipo: 2 A ----.La temperatura a la cual se define la Unidad. . La definición recomendada por la Unión Internacional de Bioquímica a través de su comisión de enzimas es la siguiente: ³Una Unidad Internacional (UI) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol (Q mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de medida´. A fin de evitar ambigüedades surgidas de la utilización de distintas unidades para expresar la cantidad de sustrato y el tiempo se ha definido por convención una unidad que puede ser aplicada a casi todas las enzimas y que permite comparar las actividades de enzimas diferentes. Es decir en los ejemplos mencionados más que el numero de moléculas completamente hidrolizados. o cualquier otra molécula en la cual son atacados más de una unión. INTRODUCCION: Al no ser posible medir la cantidad de enzima directamente en las estructuras biológicas.10 REUNION DE LABORATORIO N° 02 PRACTICA N° 04 CUANTIFICACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE LAS ENZIMAS I. En éste último caso y siempre que se conozca un peso molecular se puede definir otra unidad ³LA ACTIVIDAD MOLECULAR O MOLAR O NÚMERO DE RECAMBIO´ (ÍNDICE CATALÍTICO). De esta manera se puede expresar la cantidad de una enzima en términos de unidades enzimaticas.

0.17 M Agua destilada y y TUBOS DE ENSAYO I II 0.0 ml. REACTIVOS A UTILIZAR: y Preparado enzimático (homogenizado celular de Fusarium moniliforme) y Buffer de acetato 0.3 ml. 0.5 ml.3 ml.17 M Buffer acetato 0. recomienda el uso de una nueva unidad EL KATAL (Kat) que se define como la cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato en producto por segundo.0 Incubar a 37°C. 0.5 ml.5 ml. Detener la reacción empleando: Hidróxido de bario 0. (Pre ± incubación) Preparado enzimático Mezclar e incubar a 37°C.0 ml.3 N y Sulfato de Zinc al 5 % y Solución fosfomolíbdica y solución cúprico alcalina y Reactivo de Biuret III. 20 minutos 0. DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS DE LA REACCIÓN (azúcar reductor) Se empleará los filtrados libres de proteínas del paso anterior y se determinará azúcar reductor mediante el siguiente procedimiento: .5 ml.11 Actualmente la Unión Internacional de Bioquímica.3 N Sulfato de Zinc 5 % Sacarosa 0. Mezclar: Separar el precipitado de proteínas filtrando o centrifugando por 10 minutos. 8. 2 minutos 0. La finalidad del presente trabajo experimental es cuantificar la Actividad Enzimática determinando la actividad específica. II. 0.2 ml. Su relación con la Unidad Internacional es la siguiente: Un Katal es igual a 6 x 10 7 Unidades Internacionales.02M pH 5.5 ml. 8. 0.67 nanokatales La Actividad Específica se expresa en esta nueva unidad como Katales por kilogramo de proteína (ó Microkatales por miligramo de proteína) y la actividad molar en Katales por mol de enzima.17M y Hidróxido de bario 0.01667 microkatales = 16. Una Unidad Internacional es igual a 0.5 ml.02 M pH 5.2 ml.0 y Sacarosa 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: y Armar el siguiente sistema: SISTEMA DE INCUBACIÓN COMPONENTES Sacarosa 0. 0. 0.

Leer a 420 nm..5 ml. Cálculo de las Unidades (U) (U) = uM de sustrato transformado x ml... = mg.045 uM/ml. 0.0 ml. I) x Factor = mg. III 1. 0.5 ml.. 0. 1. 4. 1.0 ml.5 ml..0 ml.0 ml. II ± Lect. II ± Lect.0 ml..0 ml.0 ml. II 0..... 0. CÁLCULO: (Lect.. 4. de agua destilada. 0..12 TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES Filtrado I Filtrado II Agua destilada Solución cúprica alcalina I 0. y CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA U A. y y y CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Determinación de la concentración de proteínas en el preparado enzimático: (Reacción de Biuret) COMPONENTES Preparado enzimático Agua destilada Reactivo de Biuret 1. Mezclar y dejar en reposo durante 20 minutos.2 ml.5 ml. I II 0. de proteínas por ml.. I ± Lect... 0... el factor es. = Micromoles de Hexosas / 2 Minutos Tiempo de incubación en minutos (20 min). Colocar en un baño de agua hirviendo durante 8 minutos Enfriara al chorro de agua Solución fosfomolíbdica y 1. agregar 7.. Cálculos de la concentración de los productos (hexosas) [(Lect. del blanco)] x Factor = uMoles de Hexosas por ml.5 ml..E.. del blanco) ± (Lect. Leer a 540 nm Para el espectrofotómetro.0 ml.5 ml. Mezclar y dejar en reposo por 30 minutos.5 ml. de Proteínas . Mezclar. Factor = 0.8 ml.

.5 x 10-4 ¿En cual de los dos preparados hay mayor cantidad de enzima? 6. ¿Cómo explica la aparición de la coloración al final del sistema? ¿Por qué es necesario conocer previamente la concentración de proteínas del preparado enzimático y determinar la unidad de enzima (U).13 IV. 3. 4. 5. para calcular la Actividad Específica? ¿Por qué se utiliza el reactivo de Biuret? ¿Por qué una enzima se cuantifica en función de su actividad enzimática y no por el peso de la proteína (enzima)? Si en dos preparados biológicos A y B la actividad específica de una determinada enzima es: (en uM/mg. Cuándo determina el azúcar reductor de una reacción. proteína) a. 2. CUESTIONARIO: 1. A = 1 x 10-3 y B = 1.

Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reacción enzimática sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones.Solución cúprico alcalina.Solución de cloruro de sodio al 2 % . INTRODUCCION: En general. concentración de enzima.Buffer borato 0. todas las enzimas.0 V 1.4 1.Buffer acetato 0.4 VIII 1.4 2.25 % .1M pH 9. retardando o i pidiendo m su actividad.0 5. tomando como ejemplo la hidrólisis enzimática del almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reacción enzimática. II. tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática. varia en forma característica para cada enzima en particular. de tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectada por la variación que pudieran sufrir los otros.05N . Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara de la influencia de los factores (Tiempo.0 1.1M pH 9.0 5.6 Buffer fosfato 0.1M pH 6.4 2.0 1. Este patrón general. IONES INORGÁNICOS I.0 1. pH.0 3.6 .0 5.0 VI 1.Solución yodada (yoduro de potasio + yodato de potasio) . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.0 Solución de ClNa al 2 % Agua destilada I 1.0 5. concentración de sustrato.0 5.4 2.1M pH 4.Amilasa salival dializada al 0.6 Buffer borato 0.0 1.6 .0 1. etc).0 1.4 2.14 PRACTICA N° 05 FACTORES FÍSICOS-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS PARTE I: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMAS. PH.0 1.0 5.1M pH 6.0 VII 1.0 5.) Solución de almidón al 1 % Buffer acetato 0. TIEMPO TEMPERATURA.0 . presentan características comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo. sobre la serie infinita de enzimas que se conoce.4 III 2. La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores.0 . III. independientemente del tipo de reacción que catalizan. temperatura.6 II 1. . concentración de enzima.1M pH 4. concentración de sustrato. pH.Buffer fosfato 0. REACTIVOS A UTILIZAR .Ácido clorhídrico 0.4 2.0 IV 1.0 5.4 2. iones.Solución fosfomolíbdica. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes.Solución de almidón al 1 % . como se comprenderá.

sin color) en el cuadro final.5 5. maltosa) de la siguiente manera: Esta determinación sólo se hará en los tubos III y V del incubado a los 20 minutos.0 Solución iodada 0.0 0. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml. para el equilibrio de la temperatura.5 5.Realizar controles de la actividad enzimática.5 0.El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0 °C y 4 °C durante cinco minutos. I 0. de la siguiente manera: Cumplidos los 20 minutos de incubación sacar los tubos del baño maría y luego armar una serie paralela de tubos marcados del I al VIII. 1.5 5.) Preparado enzimático (en ml.05N 5.) I II III IV V VI VII VIII Incubado correspondiente de 0. Mezclar y poner en baño maría hirviendo por 8 minutos.6 IV 0. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.0 ml.5 5.0 0.El control del sustrato no transformado se realiza por la reacción del yodo.0 ml.5 Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos.5 0. agregando a cada tubo marcado. TUBOS V 1.5 5.2 VIII 0.5 0.6 VI 0. y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS . .0 0. de acuerdo a los sistemas que a continuación se presentan: y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL .6 VII 0.El Control de los productos formados se hará en base a la capacidad reductora de estos (glucosa.5 5.15 .Agregar el preparado enzimático a los tubos: II al VIII.5 0.5 5.5 0. por cinco minutos.6 (Computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimático fue agregado a cada tubo) y Mezclar y continuar la incubación por 20 minutos.5 0.6 III 0.5 ml.0 0. del incubado de su correspondiente tubo.0 0. .Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al baño de agua a 37 °C. según se indica y tomar el tiempo. 0.5 0.0 II 0.0 ml.5 cada uno de los tubos HCl 0. 1.0 ml. .0 0.6 V 0. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES III Incubado correspondientemente a los tubos III y V Solución cúprico alcalina 1. azul claro. Cumplido los 8 minutos sacar los tubos y enfriar con agua corriente y AGREGAR: .0 0. valorando los cambios de coloración (azul oscuro.

sin color) en el cuadro final.0 ml. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la presencia de un ión activador sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? . ¿Cuáles son los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas? 2.0 ml. azul claro.0 ml. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 4. ¿Cómo se determina el sustrato residual y los productos finales cuando se usa almidón como sustrato? 3. CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA POR E L SUSTRATO RESIDUAL: (cambio de color) A los 20 minutos: I II III IV V VI VII VIII CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (cambio de color) A los 20 minutos III V IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cómo puede demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 6. 1. 5. 5. Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de tubos valorando los cambios de coloración (azul oscuro.16 COMPONENTES III Solución fosfomolíbdica Agua destilada TUBOS IV 1. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática? 5.0 ml.

PARTE II: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO. y se dice que la enzima está siendo saturada con su sustrato. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: . cuando la concentración del sustrato es incrementada.6 Tungstato de sodio al 10 % Ácido sulfúrico 2/3 N III. debido a que la velocidad de colisión entre los reactantes es proporcional a la concentración de cada uno de ellos. Las reacciones catalizadas por enzimas son algo diferentes.075 M Solución de ureasa cristalina en Buffer fosfato 0. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD MÁXIMA Y KM. la velocidad de reacción siempre es proporcional a la concentración de cada uno de los reactantes. en esta zona la reacción es de orden mixto.17 REUNION DE LABORATORIO N° 03 PRACTICA N° 06 FACTORES FÍSICO-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. se define mejor en términos de la concentración de sustrato necesario para obtener una velocidad inicial de reacción igual a la mitad de la velocidad máxima. de modo que no es tan directamente proporcional a la concentración del sustrato. A baja concentración de sustrato la velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato y la reacción es de primer orden con respecto al sustrato.005 M Urea 0. Desde el punto de vista operacional la constante de Michaelis (Km). I. la velocidad de la reacción llega a ser esencialmente independiente de la concentración del sustrato y asintóticamente alcanza una velocidad constante. la velocidad inicial se incrementa con menor intensidad. II. La finalidad de la presente práctica es demostrar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática y hallar la velocidad máxima y el Km de la reacción. En este rango de concentración de sustrato la reacción es esencialmente de orden cero con respecto al sustrato.1 M pH 6. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato 0. Con un incremento ulterior en la concentración de sustrato. Sin embargo.1 M pH EDTA 0. INTRODUCCION: En las reacciones no catalizadas.

6 Urea 0.0 2.5 0. dividido entre el tiempo de incubación (15 minutos).5 0. con respecto al tubo blanco (tubo VII).5 VI 0.5 II 0. .MEZCLAR Transferir 1ml.5 0.0 IV 1.0 VI 1.0 VII 1.0 8.0 II 1.5 VII 0.0 I 0.5 VII 0.M¶ Ejemplo: Concentración de úrea en el tubo I.0 V 1.5 0.  Hallar la diferencia de cada uno de los tubos. de cada uno de los siguientes incubados a tubos de ensayo de una segunda serie siguiendo el siguiente esquema: COMPONENTES Del incubado anterior Agua destilada Reactivo de Nessler I 1.0 1. Datos: V = 0.0 1.M.0 0.5 0.0 - Pre incubar a 37 °C durante cinco minutos Incubar cada uno de los tubos exactamente 15 minutos 37°C ES FUNDAMENTAL: Medir exactamente el tiempo de incubación para cada tubo.0 0.0 1.0 8. empleando la concentración de amoníaco producido por ml.5 0.5 V 0.0 8.5 II 2.5 3.5 III 0.5 3.5 2. = V¶. ésta debe agregarse con intervalos de 1 a 2 minutos a cada tubo de tal manera que permita un fácil manejo de los mismos al final de cada tiempo.5 1.18 COMPONENTES Buffer fosfato pH 6.5 0.  Encontrar la concentración de amoníaco producido por ml. V¶ = 4 ml.5 IV 0.5 0.0 1.0 8.0 8.0 1.  Calcular la concentración de sustrato (concentración molar) en cada tubo de incubación empleando la siguiente fórmula: V.5 0.5 III 2.5 0.075 M Ureasa 0.5 ml. Para ello se medirá el tiempo de incubación inmediatamente después de agregar la enzima. Para ello multiplicar la diferencia anterior por el factor de calibración empleado (1660) = µmoles de NH3 /ml.0 8.5 0.0 III 1.0 0.05 % I 3.0 1.  Calcular la velocidad de reacción para cada uno de los sistemas enzimáticos preparados.0 0.5 V 1.0 1.5 IV 1. Transcurridos los 15 minutos agregar rápidamente: COMPONENTES H2SO4 2/3 N Tungstato de sodio 10% Ureasa .0 1. Luego:  Realizar las lecturas en el espectrofotómtero a 540 nm en cada uno de los tubos.0 8.5 VI 0.5 MEZCLAR y dejar en reposo por cinco minutos.

¿Cómo afecta la concentración del sustrato la velocidad de la reacción? 2. ¿Qué métodos conoce para determinar el Km? . Construir una gráfica en un sistema de coordenadas teniendo como parámetros la inversa de la concentración del sustrato (1/S) (abscisas) en función de la inversa de la velocidad inicial de la reacción (ordenada).  Utilizando papel milimetrado. ¿Qué es el Km? 4.19 M = 0.5 ml x 0. ¿Para que sirve la ecuación de Lineweaver? 6. En la curva trazada calcular la Km e indicar la Vmax.  Construir una gráfica en el sistema de coordenadas teniendo como parámetros : La concentración del sustrato (abscisa) en función de la velocidad de la reacción (ordenada). aplicar la ecuación de Lineweaver Burk a los resultados obtenidos. ¿Qué importancia tien el Km? 5.075 M M¶ = ? M¶ = 0. CUESTIONARIO: 1. Calcular en la gráfica obtenida la velocidad máxima y la Km.075 M = 0.0093 M 4ml.  Anotar los resultados de cada uno de los tubos (concentración del sustrato y velocidad de la reacción). ¿Qué establece la ecuación de Micahelis Menten? 3. IV.

EDTA. por que efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazarse mutuamente de la enzima. los cuale enlazan iones metálicos necesarios para la actividad enzimática. pudiéndose formar entonces un complejo ternario enzima-sustrato-inhibidor. Respecto de los inhibidores reversibles es importante destacar que la interacción entre inhibidor y enzima se traduce en varios tipos de inhibición perfectamente diferenciados experimentalmente. INTRODUCCION: Existen sustancias cuya acción sobre una enzima es la disminución de su actividad. Estas sustancias se conocen como los inhibidores enzimáticos. el exceso de inhibidor. La inhibición acompetitiva. Por esta razón la unión de este último con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor. si el sistema deshidrogenasa succínica+succinato. inhiben metaloenzimas por enlazarse al ión metálico. de este tipo de inhibición es el que presenta la succinato deshidrogenasa que tiene como sustrato el succinato y puede ser inhibido por sustancias estructuralmente parecidas a dicho ácido como son el malato. es otro tipo de inhibición reversible. cloruro de mercurio. Un ejemplo clásico. Por ejemplo. eliminamos por algún método. A la inversa. La inhibición no competitiva se caracteriza por que no puede ser revertida por un aumento de la concentración del sustrato ya que este último no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. se dice que el inhibidor es irreversible. entonces la inhibición será de tipo no competitiva. . alcoholes y calor que producen alteraciones en la estructura espacial de la molécula proteica que conduce a la desnaturalización. a las que se pueden agregar las inhibiciones reversibles acompetitivas. y la enzima recupera su actividad original. se agrega malonato como inhibidor. Si después de hacer actuar el inhidor sobre la enzima. Aquí el inhibidor se une a la enzima en otro sitio que no es aquel por el cual se une al sustrato. común en sistemas más complejos en el que el inhibidor se une exclusivamente al complejo enzima -sustrato para dar un complejo enzimasustrato-inhibidor incapaz de transformarse en otro producto. Ejemplos de este tipo de inhibición son los causados por el N-etilamida. Los inhibidores enzimáticos se clasifican en reversibles e irreversibles. que se pueden distinguir en base a un criterio experimental. Experimentalmente se puede identificar si un inhibidor cualquiera es o no competitivo. Si el efecto inhibidor se revierte al incrementar la concentración del sustrato (succinato) entonces se podrá afirmar que el inhibidor es de tipo competitivo. En la inhibición competitiva se dice que un inhibidor obra por competencia si su acción inhibidora se revierte al aumentar la concentración de sustrato.20 REUNION DE LABORATORIO N° 04 PRACTICA N° 07 ACCION DE LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS Y NO COMPETITIVOS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. Los dos tipos más comunes son: las inhibiciones reversibles competitivas y las inhibiciones reversibles no competitivas. Quedando por demostrar si este tipo de inhibición es reversible o no. se dice que el inhibidor es reversible. NO y CO. El inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual se debería unir el sustrato impidiendo por lo tanto la formación del complejo activoenzima-sustrato. que es cataliticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reacción y complejo-enzima-inhibidor. Si la inhibición no se revierte al agregar sustrato (succinato). si la enzima continúa inhibida después de la reacción del inhibidor. Excluyéndose de ésta categoría aquellos agentes como los ácidos fuertes. De allí el nombre de competitivo. ácido oxálico y glutarato.

2 ± 6 Diclorofenolindofenol . III. ¿Cómo podría usted demostrar que la inhibición producida por el cloruro mercúrico es o no reversible? .5 M Buffer fosfato 0.2 Succinato de sodio 0.3 0.Succinato de sodio 0.2 Anotar y luego agregar a los tubos II. ¿Por qué el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo? 3. II. ¿Por qué el malonato es inhibidor competitivo? 2.2 1.5 1.0 II 1.5 III 0.Buffer fosfato 0.Cloruro de mercurio . Dejar en reposo 15 minutos a la temperatura ambiente y luego observar los resultados y anotar. COMPONENTES Succinato de sodio 0.0 0.1M pH 7.3 0.0 1.21 La siguiente práctica tiene por finalidad demostrar en el sistema enzimático Deshidrogenasa succínica+succinato: que el malonato y el cloruro mercúrico producen inhibición de este sistema.0 III 1.1M pH 7.Succinato de sodio 0.5 1.1 M Malonato de sodio 0.1 M 2 ± 6 diclorofenolindofenol Homogenizado 10 % I 2.1 M .0 Dejar en reposo por 30 minutos a la temperatura ambiente.0 IV 1.0 1.2 .1 M.1 M Succinato de sodio 0.5 M .8 0.5 - IV.1 M .5 M Cloruro de mercurio 0.0 1.5 0. que el malonato es un inhibidor competitivo y que el cloruro mercúrico es un inhibidor no competitivo.5 1. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.0 1.Malonato de sodio 0. Observar los resultados en cada uno de los tubos (cambio de color). pH 7.2 0. REACTIVOS A UTILIZAR .5 IV 0. IV. II 0.0 1.Homogenizado hepático 10 % III.0 1.0 V 1. CUESTIONARIO: 1.2 0.

¿Qué diferencias puede usted establecer entre la inhibición competitiva y la inhibición alostérica? 7. Señale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibición no competitiva reversible. . además del malonato utilizado en el presente experimento. 5. 6. De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibición competitiva en el sistema Deshidrogenasa succínica ± succinato.22 4. sin considerar el cloruro de mercurio. De por los menos dos semejanzas entre la inhibición no competitiva reversible e inhibición alostérica.

los detergentes. etc. Si el inhibidor no impide la oxidación del indicador. se les denomina inhibidores del sitio II. se utilizan sustancias indicadoras artificiales que cambian de color cuando se oxidan o se reducen. denominación que pone énfasis en que las oxidaciones reducciones son fenómenos caracterizados por la pérdida o ganancia de electrones. entonces podemos deducir que el mencionado inhibidor actuará en algún sitio comprendido entre la CoQ y el citocromo B inclusive (cercano al sitio II de la cadena). etc. . Como hay flujo de electrones en la cadena. Si se administra un inhibidor que impide el flujo de electrones en algún punto de esta porción de la cadena. los esteroides. Si se administra un inhibidor que no impide la oxidación de la p-fenilendiamina y que tampoco impide la reducción del 2-6 diclorofenolindofenol. De esta manera se puede verificar si la cadena comprendida entre el citocromo C y el oxígeno. bloqueando el transporte de electrones entre la flavina y la ubiquinona. entonces podemos deducir que el inhibidor actúa en algún sitio anterior al citocromo o de la cadena. Este mismo sistema multienzimático es también conocido como cadena de transporte de electrones. Si al administrar un inhibidor de la cadena. El ejemplo clásico de este grupo es la antimicina. mediante el uso de indicadores conocidos como 2 ± 6 diclorofenolindofenol y p ± fenilendiamina. Existen diversas sustancias que actúan como inhibidores de la cadena respiratoria. átomos de hidrógeno o electrones. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que los inhibidores: rotenona. Un grupo de inhibidores actúa sobre el Hemo a3 de la citocromo oxidasa impidiendo su interacción con el oxígeno. ésta cede sus electrones a los indicadores entre la FMN y la CoQ. que al reducirse (recibir electrones) se decoloran. éste impide que el 2-6 diclorofenolindofenol se reduzca (se decolore). respectivamente. Un primer grupo de inhibidores actúa sobre la NADH-deshidrogenasa. pero si el indicador se decolora. Inhibidores de localización son: el amital. barbital sódico y azida de sodio. quiere decir que dicho inhibidor estará actuando en alguna región anterior a la FMN. INTRODUCCION: Los equivalentes de reducción. A estos se les denomina inhibidores del sitio III. es o no permeable al flujo de electrones que provienen del indicador. Para poder determinar la permeabilidad de la cadena de oxidoreducción al paso o no de electrones. la azida. el monóxido de carbono. inhibidores similares son la hidroxiquinolina N-óxido. entonces podemos deducir que el sitio de inhibición estará en alguín sitio posterior a la CoQ inclusive. Cuando se oxida (cede electrones) cambia de color (a marrón oscuro). Este sistema está localizado en la membrana mitocondrial interna y se caracteriza por la cohesión física con la cual sus componentes se encuentran unidos entre si e integrados en la membrana. el citocromo C actuará como primer aceptor de electrones que provienen de la p-fenilendiamina. es decir que es capaz de ceder electrones.23 PRACTICA N° 08 EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE ÓXIDO-REDUCCIÓN I. Los más representativos de este grupo son la rotenona y la piericidina. La p-fenilendiamina. así por ejemplo el 26 diclorofenolindofenol y el azul de metileno son sustancias indicadoras de color azul en estado oxidado. provenientes de la deshidrogenación de los sustratos del ciclo de Krebbs y otros metabolitos son transferidos al oxígeno por un sistema multienzimático denominado cadena respiratoria. En la cadena REDOX. Un segundo grupo de sustancias actúan bloqueando la transf rencia de electrones e entre los citocromos b y c. la p-fenilendiamina no se oxidará (no cambia de color). algunos anestésicos volátiles como el halotano. actúan en las regiones cercanas al sitio I. sitio II y sitio III. el BAL y barbiturato de sódio. Por su acción cercana en el primer sitio de la desfosforilación se les suele denominar inhibidores del sitio I. inclusive de la cadena (región que incluye el sitio I). comprenden el cianuro. Los inhibidores más comúnmente usados pueden reunirse en tres grupos principales según el sitio de la cadena respiratoria donde actúan. es otro indicador que actúa como sustrato.

REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0.1M Barbiturato de sodio Azida de sodio Homogenizado mitocondrial 10% I 1.2 1.5 0.0 II 1. barbital sódico y azida de sodio.5 0.2 0. 6-diclorofenol indofenol 0.5 VI 0. verificar el efecto de los inhibidores: rotenona.02 % p-fenilendiamina 1% Malato de sodio 0.5 0. I 2.2 0.2 0.5 0. ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (en ml.5 reposo a temperatura minutos. barbital sódico y azida de sodio. dejar en 10% ambiente por 20 0.5 1.5 III 1.5 0.1M Rotenona 0.5 0.5 0.5 0.4 2.0 0.0 V 1.1M Rotenona 0.) Buffer fosfato 0.1M Azida de sodio Fracción mitocondrial 10% (hígado de rata) III.1M pH 7.1M pH 7.) Buffer fosfato de sodio 0.1M Barbiturato de sodio 0.5 II 1.5 0.0 0.0 0.5 0.5 Mezclar. dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.0 . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) En el sistema Deshidrogenasa málica + malato + cadena rédox mitocondrial.5 1.4 Azida de sodio Barbiturato de sodio 0.1M Rotenona 0.0 IV 1. En el sistema p±fenilendiamina + cadena rédox mitocondrial.5 1.2 III 1.4 2.1M P±fenilendiamina 1% Homogenizado de mitocondrias Mezclar.5 0.1M.5 0. verificar el efecto de los inhibidores rotenona. pH: 7.5 0.5 0.0 0.02 % Malato 0.2 0.0 1.5 V 0.24 II.6-diclorofenolindofenol 0.5 IV 0. TUBOS COMPONENTES (en ml.0 0. Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos).5 1.0 0.

Grafique usted en una cadena de óxido reducción biológica. que cambios observaría con la rotenona. ¿Si utiliza el indicador rédox 2. CUESTIONARIO: 1. Indique usted los sustratos y enzimas que intervienen en los sistemas realizados en la práctica. la acción de los inhibidores e indicadores utilizados en el experimento. barbiturato de sodio y azida de sodio? 4.25 Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos). IV. ¿Qué inhibidores de la cadena de óxido reducción conoce y a qué nivel actúan? 2.6-diclorofenolindofenol en un sistema con cadena respiratoria. que cambios observaría con la rotenona. . ¿Si utiliza el indicador p±fenilendiamina en un sistema con cadena respiratoria. barbiturato de sodio y azida de sodio? 3. 5.

6 diclorofenilindofenol y p . Fracción microsomal soluble del homogenizado. El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fracción mitocondrial. El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15 minutos en la centrífuga refrigerada.25 M Fracción nuclear del homogenizado. De acuerdo a su estructura y función. Fracción mitocondrial del homogenizado.154 M III. INTRODUCCION: Los carbohidratos. El sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca en un beaker de 100ml. El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocándolo en tubos de polietileno. aminoácidos y algunas otras sustancias sufren oxidaciones en el organismo mediante sistemas enzimáticos simples o complejos. se emplea una centrífuga refrigerada. El sobrenadante es separado en un beaker de 500ml. albicans).1M pH: 7. constituyendo la fracción microsomal con el citosol. hallándolas de modo fundamental en una subestructura celular en donde la energía derivada de las oxidaciones es "capturada" en la forma del intermediario macroérgico ATP. Se separa el sobrenadante en un beaker. Las enzimas de óxido . ácidos grasos. Homogenizado al 10%: se pesa 10gr de hígado y se corta en fragmentos pequeños y se coloca en el homogenizador potter y se le agrega solución de KCl 0.reducción tienen una distribución característica intracelularmente. inmediatamente se hara un corte longitudinal en el abdomen procediendo a extraer el hígado. El animal será sacrificado. Todo debe trabajarse entre 0 y 4ºC.1M p±fenilendiamina 1% Homogenizado total de hígado de rata en sucrosa 0. previa calibración en la balanza. Se hace presión manualmente con el embolo girando hacia el fondo. La finalidad del presente trabajo es objetivizar la distribución intracelular de las enzimas de óxido .26 PRACTICA N° 09 DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE ÓXIDOREDUCCIÓN I. KCl 0.02 % Succinato 0. Se coloca el hígado en un petri se elimina la cápsula del hígado y otros tejidos periféricos.6-diclorofenolindofenol 0.4 2. - - . fosfolípidos. II.154 M. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Fraccionamiento Celular Cada grupo recibirá una rata albina (Rattus rattus var.reducción usando los indicadores redox 2 .fenilendiamina y los componentes celulares de un homogeneizado de hígado de rata obtenidos por centrifugación dif rencial mediante el método de e Schreider y col. las enzimas que intervienen en estos pr cesos se encuentran o clasificadas en diversos grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimológica. grupos prostéticos y átomos metálicos. Estos sistemas están constituidos por proteínas. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0.

¿Qué es un homogenizado de hígado y cómo se obtienen las fracciones celulares por centrifugación diferencial? 5. ¿Qué es el p-fenilendiamina y cómo actúa en la cadena respiratoria? 3.5 III 0.1M.0 0.6 diclorofenolindofenol y p±fenilendiamina. Haga un esquema de la centrifugación diferencial . ¿Qué es el 2.2 0.27 Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Buffer fosfato 0.5 - Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente.5 2 1. pH 7.5 0. pH 7.0 0.5 Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente.0 0.2 0.1M Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal -soluble Homogenizado total I 1.0 0. para interpretar los resultados.5 1 1. CUESTIONARIO: 1. IV.0 0. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador.0 0. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador.5 0. para interpretar los resultados.2 II 0.2 0.1M.4 P ± fenilendiamina 1% (sustrato + indicador) Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal ±soluble Homogenizado total 0.5 3 1.5 5 1. empleando: COMPONENTES Buffer fosfato 0.0 0.5 1.5 0. Grafique usted en una cadena de óxido ± reducción biológica la acción de los indicadores rédox 2.5 1.5 4 1.5 0.2 0.4 2 ± 6 diclorofenolindofenol Succinato de sodio 0. 4.6-diclorofenolindofenol y cómo actúa en la cadena respiratoria? 2.5 IV 0.0 1. Armar otro sistema.5 1.0 0. ¿En que fracciones celulares se encuentran las enzimas de óxido ± reducción? 6.0 0.5 1.5 V 0.

las elevaciones son (con excepción de los niveles obtenidos después de la administración de opiáceos) menos de 500 unidades. trompa de Falopio y tejido adiposo. En el suero humano. La elevación puede ocurrir en otras condiciones que incluyen enfermedad de las glándulas salivales (pancreatitis). así como en la orina existe actividad amilásica. Es posible encontrar valores más altos. encefalitis viral. carcinoma bronconígeno y en neumonía. la amilasa se encuentra grandemente incrementada y retorna a los valores normales lentamente. Bajos niveles pueden encontrarse en pancreatitia crónica y en carcinoma pancreático cuando el daño es extenso y hay insuficiencia de las acinos glandulares. El presente experimento tiene por finalidad determinar la amilasa sérica en personas normales y/o con alteraciones patológicas especialmente del pancreas. el resto es una fracción inosoluble llamada amilopectina. En pancreatitis se llega hasta 2000 a 3000 unidades. uremia después de la administración de codeína. . Entre 2 ± 12 horas después de producida la pancreatitis aguda. pero al año de edad la actividad es igual a la del adulto. músculo estriado. En obstrucción de los conductos puede elevarse. INTRODUCCION: La amilasa es una enzima que hidroliza el almidón. La amilasa salival y pancreática humana esta dentro del grupo de las primeras. úlcera duodenal o gástrica penetrante o perforada. mide la cantidad de almidón hidrolizado y por ende la actividad de amilasa de la muestra. después de la administración secretina. la amilisa sérica se altera. Después de la administración de morfina en normales se incrementa la amilasa sérica. El origen de la amilasa sérica humana incluye al páncreas y glándulas salivales. Si liberan alfa o beta maltosa. Otras fuentes incluyen el hígado. amilasa y amilopectina producen sólo B-glucosa por hidrólisis. con frecuencia 2-3 días después. después de colangiografía. En otros. no es probable el diagnóstico de pancreatitis aguda. edema y pancreatitis están presentes indudablemente. en pacientes con insuficiencias pancreática. Si dentro de 24 horas no se eleva. las cuales explicarían probablemente menos del 25% de la actividad sérica normal. En los casos señalados se ha propuesto la prueba funcional de la amilasa sérica después de la administración de secretina y morfina. Muy raramente permanece elevada 4-6 días. Para la mayor parte. la explicación no es clara. difiere de la amilasa porque contiene además enlaces alfa 1-6 glucosídicos frecuentemente ramificados. En la bilis no hay actividad. Los valores normales de amilasa por el método de Caraway calibrado en unidades Somogy es de 60 a 180. Para la determinación de amilasa usamos el método de Caraway. La amilasa comprende a sólo el 20% del almidón y es soluble en agua. obstrucción intestinal. En normales. trombosis mesentérica. También ha sido informado en leche y en el semen humano. En algunas de estas condiciones. La diferencia entre la cantidad de color azul formado en la muestra incubada y el blanco incubado por la adición de suero después de la incubación. Ambas. morfina. La amilasa puede ser detectada en niños desde 1 a 2 meses de edad y los valores son más bajos que en el adulto normal. se les clasifica en alfa y beta amilasa. diuréticos tiazídicos. La amilasa es un poliglucósido de configuración lineal de unidades de glucosa unidos por enlace alfa 1-4 glucosídicos. La alfa amilasa actúa rompiendo los enlaces alfa 1-4 glucosídicos en la parte central de la amilasa formando una mixtura de pequeñas dextrinas + maltosa. en el que la cantidad de almidón y tiempo de incubación son ajustados de manera que sólo una porción de almidón es hidrolizado cuando la reacci n ó es parada por la adición de yodo. Se ha reportado incremento después de la ingestión de alcohol. peritonitis. enfermedad séptica aguda del coledoco. cirrosis. después de ruptura esplénica.28 PRACTICA N° 10 DETERMINACION DE AMILASA SERICA I.

De qué manera el ión cloruro activa a la amilasa ¿Qué semejanza o diferencia puede establecer usted entre amilasa dializada y no dializada. 35 ml. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): Armar el siguiente sistema: (Utilizar dos frascos volumétricos ± Erlenmeyer de 50 ml.1 ml. 5. pH 7. 3.0 : y Solución Stock de iodo : y Solución iodada de trabajo: III. 0.0 ml.0 ml. debido a que las proteínas séricas disminuyen la cantidad de color producido por el complejo yodo ± almidón y este podría ser diferente). CUESTIONARIO: 1. 35 ml. 5. 4.0 ml. 0.0 ml. en función de la actividad enzimática? ¿Cómo explica usted el diferente comportamiento de la amilasa hepática y pancreática sometidas a electroforesis? ¿Por qué la concentración de amilasa sérica es menor durante los primeros meses de vida lactante? . Leer 660 nm. en CÁLCULO Absorbancia del _ Absorbancia del blanco problema _______________________________________ X Absorbancia del blanco 5.1 ml. II BLANCO 5. REACTIVOS A UTILIZAR: y Sustrato de almidón Bufferado. IV. 2. Mezclar bien.29 II. espectrofotómetro a Incubar a 37°C durante cinco minutos ambos frascos Mezclar e incubar a 37°C durante 7.) I PROBLEMA Sustrato de almidón Bufferado Retirar los frascos y agregar suero Retirar los frascos y agregar suero Agua destilada Solución iodada de trabajo.5 minutos exactamente 800 = Unidades de amilada por 100 ml (Se requiere un blanco por cada muestra de suero.

30 .

con el método de la glucosa oxidasa la concentración varía entre 70 ± 110 mg/dl. el transporte de glucosa al interior de las células es por difusión pasiva. I. . El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a través de las células de la mucosa intestinal no es muy conocido. la constante disponibilidad de este sustrato a los tejidos. en particular en el tejido adiposo. siendo el hepatocito permeable para este metabolito. Según el método l de Folin Wu. que proviene del hígado por glucogenólisis. Este proceso. al salir del Na+ mantenga alta concentración en el líquido extracelular. A su vez. sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento. el corazón y el músculo esquelético. posiblemente porque se une a la misma proteína transportadora que lleva el sodio.31 II UNIDAD METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS REUNION DE LABORATORIO N° 05 PRACTICA N° 11 DEMOSTRACION DE LA DIGESTION Y ABSORCION DE LOS CARBOHIDRATOS: GLICEMIA PRE Y POST-PRANDIAL. En este caso la glucosa entra en la célula. La entrada de la glucosa en estas células está supeditada a que. hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina. En el caso del hígado. producción endógena de glucosa así como la utilización y excreción de la misma. por la bomba de sodio y potasio. el sodio. Este mecanismo requiere ATP como fuente de energía. En el cerebro y los glóbulos rojos es la única fuente de energía. por lo tanto la concentración de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo. La glucosa en sangre. Varía entre los 80 ± 120 mg%. En casi todos los demás tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las células por simple difusión. Por otra parte. Diversos factores que inciden sobre la absorción. y de origen endógeno. Los valores normales de glucosa en sangre son variables de acuerdo al método utiizado. por ello. sino que lo hace por un mecanismo de difusión controlada. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea es una de las fuentes de energía más importantes en el organismo y en algunos tejidos altamente especializados. se llama cotransporte. contribuyen a mantener constante la concentración de glucosa en sangre. con ella. El conocimiento de la glicemia es importante no sólo porque permite tener una idea integral del mecanismo de homeostasis metabólica existente. volvería a salir de la célula. Este es un caso interesante en que un sistema de transporte a través de la membrana favorecería a otro. el organismo dispone de una compleja maquinaria metabólica que permite asegurar la constancia de la concentración de glucosa en la sangre y. y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentración de sodio en fluído extracelular. proviene de dos orígenes: de origen exógeno de los alimentos. Por todo esto. Se cree que está íntimamente ligado al transporte de sodio.

se extraerán 5 ml.00 g/l f = ----------- S y D = Dpre.Estándar: Solución de glucosa 1 g/l . 50 partes de Reactivo Fenol y llevar a 1. Mezclar por inversión sin agitar. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES : Se tomarán dos muestras de sangre : La primera: La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra.000 U/ml) y Peróxidasa (120 U/ml). --------20 ul 2 ml Incubar todos los tubos 10 minutos en baño de agua a 37 ºC Leer en Espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco. Restar a D el Blanco (B) y el resultado se multiplica por f. 50 partes de Reactivo 4. colocar: COMPONENTES Standard Muestra (suero preprandial) Muestra (suero postprandial) Reactivo de trabajo B ------------2 ml S 20 ul --------2 ml Dpre. cuál es el rango considerado normal para la glicemia basal? Explique las variaciones en los valores. Agregar 3 partes de enzimas GOD/POD previamente homogenizadas. que usted puede encontrar por ejemplo en una intolerancia a la glucosa. CUESTIONARIO: 1. luego se centrifuga a 3000 RPM por 10 minutos. S (Standard).92 mol/l. . IV. y Dpost.AF. La determinación de la glicemia se realizará por el método Enzimático de la glucosa oxidasa. Antes de multiplicar D x f. . III. .Reactivo Fenol: Solución de Fenol 55 mmol/l. La segunda: Esta muestra se tomará después de una hora. como máximo. con jeringa hipodérmica de 10 ml. REACTIVOS A UTILIZAR . . (Desconocido preprandial) y Dpost.Preparación del Reactivo de trabajo: 500 partes de agua destilada. tanto en personas normales como en casos patológicos. Separar el suero. Utilizar 4 tubos de ensayo: B (Blanco).GOD/POD: Solución de glucosa oxidasa (1. se deja reposar 10 minutos. Colocar las muestras en tubos de ensayo. ¿Actualmente.32 La finalidad de la siguiente práctica es demostrar la digestión y absorción de la glucosa. Cálculo de los resultados : Glucosa (g/l) = D x f donde 1. por el método de Glucosa oxidasa.000 partes con agua destilada. de sangre de la flexura del codo. cuantificando la glicemia pre y postprandial. Rotular y fechar. (Desconocido post prandial).AF: Solución de 4 ± aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0. Dpre. ----20 ul ----2 ml Dpost. En esos momentos. y con aguja N° 20. después de la ingesta alimenticia.Reactivo 4. II.

La finalidad de la siguiente práctica es cuantificar el glucógeno en ayunas y después de la uingesta de alimentos y evaluar los valores encontrados relacionados con los factores que determinan sus síntesis y degradación II.5 --II --0. 3. pero las concentraciones varían en los diferentes tejidos correspondiendo las concentraciones más altas del hígado y al músculo esquelético. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.KOH al 60 % . La acción de la beta amilasa también rinde una dextrina límite. REACTIVOS A UTILIZAR . ¿Qué variaciones fisiológicas de glicemia puede usted señalar? PRACTICA N° 12 INFLUENCIA DE LA DIETA EN LA FORMACIÓN Y ALMACENAMIENTO DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO I.5 . El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa de fácil disponibilidad.Na2S04 solución saturada. lugares principales de almacenamiento. EXTRACCION DE GLUCOGENO HEPATICO (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Homogenizado de hígado en ayunas Homogenizado de hígado post prandial I 0.H2S04 concentrado. glucógeno sintetasa y algunas otras que regulan la síntesis y degradación.) III.6 los cuales se presentan con frecuencia aproximada de uno por cada 10 residuos. para el diagnóstico de diabetes mellitus? 5. ¿Cuál son los criterios bioquímicos. Se encuentra glucógeno o se puede sintetizar en cualquier célula del organismo.6 son estables.Alcohol absoluto.Homogenizado de hígado de rata al 10 % (pesar 10 g. . La mayoría de los residuos de glucosa en el glucógeno están ligados por enlaces glucosídicos alfa 1. relacionados con la glicemia. En cambio el glucógeno post prandial es debido a que la glucogénesis se incrementa cuando las concentraciones en sangre alcanzan valores de 150 mg/100 ml ó más.Fenol al 80 % . El glucógeno es también fácilmente hidrolizable por alfa y beta amilasa para rendir glucosa y maltosa respectivamente.4 y alfa 1.33 2. En el hígado el glucógeno se incrementa después de la ingesta de alimentos (período post prandial) llegando a los límites máximos cuando la dieta es abundante y/o en base a carbohidratos. ¿Conoce otros métodos para determinar la glicemia? Explique su fundamento 4. . El glucógeno puede ser aislado de los tejidos por digestión con soluciones de hidróxido de potasio caliente en los cuales los enlaces no reductores alfa 1. ¿Cómo esperaría encontrar los valores de la glicemia dosada en la sangre venosa y en la sangre arterial? Fundamente las variaciones que se pueden encontrar.4 y las ramificaciones se forman por enlaces glucosidicos alfa 1. de hígado y homogenizar con agua destilada. . INTRODUCCION: El glucógeno está presente en el citosol en forma de gránulos los que contienen las enzimas glucógeno fosforilasa.

2.0 Disolver el precipitado por agitación. ¿Porqué mecanismo metabólico el glucógeno incrementa cuando la concentración de glucosa en sangre es mayor de 150 mg/dl? 5. motivo del experimento? 4. 0. Colocar los tubos en agua helada durante 5 min.1 Mezclar.1 0.1 0. Eliminar el sobrenadante y colocar boca a bajo los tubos sobre papel de filtro por 5 minutos. .I ± Lect.34 KOH al 60 % 0.1 Mezclar. CUESTIONARIO: 1. Alcohol al 98 % 5. Agregar agua destilada 5.5 Calentar los tubos en baño maría a 100 C por 10 min.0 1. y sin retirar los tubos del baño helado: Agregar H2S04 cc. Explique los mecanismos que regulan la homeostasis de la glucosa y el rol del glucógeno durante el ayuno prolongado.0 2. del Sistema anterior« -1.0 --Muestra del tubo II. Reposo por una hora. Blanco) x Factor IV.1 0. ¿Qué relaciones metabólicas puede usted establecer entre los valores de glucógeno obtenidos en ambas muestras de hígado de rata. 540 n m.0 5. Leer en el fotocolorímetro con filtro verde. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones post prandial? 3.0 5.0 -Agua destilada 1. gota a gotaen el centro de c/tubo 5. CALCULOS: Factor Espectrofotómetro = 7 g % de glucógeno = (Lec. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones de ayuno? Dé usted las razones metabólicas que expliquen su resultado.0 5.0 Mezclar y dejar en el baño de agua helada durante 5 minutos más.5 0. CUANTIFICACION POR METODO COLORIMETRO DEL GLUCOGENO EXTRAIDO Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml)) I II BLANCO Muestra del tubo I del Sistema anterior««««««« 1.0 5. Centrifugar a 3500 RPM por 10 min.0 Fenol al 80 % 0.0 Na 2SO4 solución saturada.

lipogénesis y otras semejantes. La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos. El efecto más importante de una deficiencia insulínica es el de un nivel sanguíneo de glucosa elevado (hiperglicemia). La secreción de insulina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia.Jeringas hipodérmicas de 1 cc. . la glicemia es muy constante. pues es utilizada por todas las células para producir energía y por algunas células para funciones más especializadas por ejemplo glucogénesis. una excesiva excreción de glucosa por la orina (glucosuria) y un reducido nivel de glucógeno en el hígado. REACTIVOS A UTILIZAR . cuya sensibilidad está regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipófisis por el otro. Siendo en la sangre arterial mayor que en la venosa. La administración de insulina va seguida de la glicemia (hipoglicemia) cuya magnitud depende de la dosis administrada. de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la producción y la utilización de la glucosa sanguínea. . Los mecanismos reguladores de la concentración de glucosa son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los primeros actúan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las glándulas de secreción interna.35 REUNION DE LABORATORIO N° 06 PRACTICA N° 13 REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA ACCION DE LA HORMONA INSULINA I. La insulina ejerce efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otros nutrientes. Se explica así que la falta de insulina determina una hiperglicemia que es el signo fundamental del cuadro denominado Diabetes. el efecto se debe fundamentalmente a que la hormona favorece la formación de glucógeno en el hígado y en el músculo. En condiciones normales. en ayunas. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea proviene de: glucógeno hepático. de manera que cada vez se eleva la glicemia. . de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas. Esta hormona es producida por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas y es secretado en respuesta directa al incremento de glucosa en la sangre. a la vez que acelera la oxidación de glucosa en diferentes tejidos. aminoácidos.Conejos adultos de más de 2 kg.Glucómetro. se produce más insulina que tiende a aminorarla. La insulina también favorece la conversión de los hidratos de carbono en ácidos grasos y por otro lado inhibe la gluconeogénesis a partir de los aminoácidos. . La glicemia se eleva después de la ingestión de un alimento rico en hidratos de carbono para luego descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas después de la ingestión vuelve al nivel de ayunas.Solución de insulina cristalizada (Lilly): I Unidad por ml. II. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de administración de insulina. otros carbohidratos y de glucosa absorbida por el intestino.

CUESTIONARIO: 1.36 III. como resultado. Explique el mecanismo de acción de la insulina en la homeostasis de la glucosa. Anotar los resultados en relación al tiempo. ¿Cuáles son las hormonas contrarreguladoras y su mecanismo de acción? 5. Hacer una gráfica de glicemia vs tiempo       IV. 3. que facilita la medida de la dosis. Explique brevemente la regulación de la glicemia.  Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de insulina. Explique la naturaleza química y las acciones biológicas de la insulina. Dosis de la solución de insulina cristalina (I Unidad por ml) inyectar I Unidad por Kilogramo de peso corporal. Utilizar una jeringa hipodérmica de 1 ml. EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE INSULINA. 30 y 60 minutos después de inyectada la insulina. lo que hace un total de tres muestras en una hora. . en términos generales. La que servirá para establecer los valores basales de glicemia. de la tasa de llegada e índice de salida de la glucosa de la sangre. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. y y Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de insulina a inyectar. Explique cómo y porqué se producen los signos y síntomas del cuadro clínico de hipoglicemia.  Luego extraer muestras de sangre a los 15 . 4.  Extraer una primera muestra de sangre del pabellón auricular del conejo. 2.

El efecto glucogenolítico de la adrenalina es debido a que activa a la fosforilasa. Extraer una primera muestra de sangre. 3. lo que hace un total de tres muestras en una hora. INTRODUCCION: La adrenalina.Solución de adrenalina 0. hormona secretada por la médula suprarrenal. Con los resultados así obtenidos. tiene acción hiperglicemiante. sometidos a ayuno de 8 a 12 horas.  Dosis de la solución de adrenalina (0. Servirá para establecer los valores basales de glicemia.37 ACCION DE LA HORMONA ADRENALINA I.Jeringas hipodérmicas de 1 cc. 2. por la ausencia en este de la glucosa 6. con especial referencia al metabolismo de los carbohidratos. CUESTIONARIO: 1. EXTRACCION DE ADRENALINA. tomando las variaciones en relación al tiempo.025 mg por cada kilogramo de peso corporal que corresponde a 0. . 2. II.Conejos adultos de más de 2 kg de peso corporal. 30 y 60 minutos después de inyectada la adrenalina.1 mg/ml) inyectar 0.Glucómetro. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de la administración de adrenalina. ¿Cuál es el efecto metabólico de la adrenalina sobre el hígado y sobre el tejido muscular y que efecto produce sobre la glicemia? . Con cada una de las citadas muestras realizar los dosajes de glucosa según el método de Glucocinta 5. del pabellón auricular del conejo. la glucogenólisis se realiza con la formación de lactato el que va ha contribuir directamente a la formación de glucosa y glucógeno en la célula hepática por los mecanismos gluconeogenéticos. si l aparece hipoglicemia se segrega más adrenalina y glucagón que aceleran la regulación que espontáneamente debe realizar el hígado. . Luego extraer muestras de sangre a los 15 . Anotar los resultados en relación al tiempo. 3. . 4. ello se debe a que favorece la conversión del glucógeno en glucosa (glucogenólisis) en el hígado. REACTIVOS A UTILIZAR .1 mg por ml. Utilizar una jeringa hipodérmica de tuberculina que facilita la medida de la dosis. La secreción de adrenalina parece estar condicionada en forma importante por el nive de glicemia. ¿Cuál es el mecanismo de acción hormonal de la adrenalina a nivel de sus órganos blanco? Explique de manera suscinta el efecto de la adrenalina sobre la glicemia. 4. además de actuar en el músculo.fosfatasa. Explique la naturaleza química y las acciones fisiológicas de la adrenalina. LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE 1. construir una gráfica. Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de adrenalina según el peso del animal. III.25 ml de la solución a utilizar por kg de peso. ¡ ¡ ¡ IV. ACTIVIDADES INTRUCCIONALES: Procedimiento  Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de adrenalina a inyectar.

formaldehído. La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras. es posible encontrar cierta cantidad de elementos reductores que se eliminen diariamente entre 0. en presencia de peroxidasa produce 0-tolidina oxidasa (de color azul) más agua. en presencia de glucosa (sustrato) de la orina remueve de éste 2 iones hidrógeno (2H+) formando gluconolactona). c) Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato cloral. puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que podemos señalar: a) Otros azúcares reductores: lactosa. además de glucosa. El peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa oxida a la 0-tolidina y toma color azul.5 y 1. ¿Qué efectos tiene la adrenalina. ácido úrico. la orina en glucosa aparece aunque ésta se encuentre en concentraciones normales en la sangre (diabetes insípida). cuando existe insuficiencia renal (menor filtración) no aparece glucosa en la orina aunque la concentración de glucosa se encuentra elevada por encima de 180 mg %. Por el contrario. INTRODUCCION: En la orina de sujetos normales no existen cantidades detectables de azúcares en orina. Sin embargo. pero cuando la glicemia supera los 180 mg % se puede producir glucosuria (presencia de glucosa en orina) porque en estas condiciones se supera la capacidad del riñón para reabsorverla (dintel renal). REACTIVOS A UTILIZAR . Los azúcares forman más o menos la décima parte de dicha cantidad y de ella no puede decirse que su totalidad esté constituída por glucosa. La glucosa oxidasa. de uso generalizado en clínica. Los iones hidrógeno removidos se combinan con el oxígeno atmosférico y forman peróxido de hidrógeno (H2O2). Cuando la capacidad de reabsorción renal disminuye. Este. por acción de la glucosa oxidasa produce ácido glucorón más peróxido de ico hidrógeno.5 g/l. y por tanto es explicable que no aparezca glucosa en orina. Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza para determinar glucosa en orina. II.38 5. La prueba está basada en que la glucosa urinaria en presencia de oxígeno. ácido glucorónico. La glucosa puede ser determinada de manera específica utilizando como reactivo básico la glucosa oxidasa (método enzimático). creatinina. b) Otros compuestos orgánicos: ácido homogentísico. el cual es hidratado a ácido glucónico. utilizando un método específico a base de glucosa oxidasa y otro inespecífico en base al reactivo de Benedict. etc. En la orina. La glucosa del filtrado glomerular renal se reabsorbe en su totalidad en los tubos contorneados proximales. sin tomar en cuenta su acción en el metabolismo hidrocarbonado? REUNION DE LABORATORIO N° 07 PRACTICA N° 14 DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA EN ORINAY SU DIFERENCIACIÓN DE OTROS AZUCARES REDUCTORES I. ácido ascórbico. fructuosa. galactosa y pentosas. pero como anotamos éste identifica a las sustancias con capacidad reductora y por tanto es de carácter inespecífico.

Compare la intensidad de la coloración azulada con una escala adjunta que representa aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa. Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recién emitida contenida en un depósito de 5. Observar si hay cambio de color y precipitado. 6.39 - Reactivo de Benedict. 5. 2. da negativo Ante una prueba positiva de glucosa en orina: ¿Qué presunciones diagnósticas. 3. 3. primero con el reactivo de Benedict y luego por el método de la glucosa oxidasa Que presunciones plantearía si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de Benedict da resultado positivo y sin embargo. Llevar al baño de agua hirviendo por 5 min o exponer el tubo al fuego directo hasta que hierva por 1 min. Determinación de sustancias reductoras en orina mediante el reactivo de Benedict. 1. 2. Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas (Glucocinta Lilly). Fundamente la utilización del reactivo de Benedict para la detección de sustancias con capacidad reductora. Explique que es el umbral renal de la glucosa.10 ml. IV. incluida la glucosa Que resultados podrían obtenerse al tratar una muestra problema de orina. 4. . Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras. después de humedecida la cinta. Colocar en baño de agua hirviendo por 5 min o exponer al fuego directo hasta ebullición por 1 min. 4. 3. adquiere o no color azul. CUESTIONARIO: 1. III. Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml. Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del líquido contenido en el tubo. Agregar orina problema: 5 gotas. Determinación enzimática de la glucosa en orina (Método de la glucosa oxidasa). Observar si a los 60 segundos. Procedimiento: 1. Agitar para evitar que el líquido se proyecte hacia fuera del tubo. Si aparece un precipitado de color rojo ladrillo. realizamos la siguiente determinación con la misma muestra de orina. la reacción demuestra la presencia de sustancias reductoras. en relación a la glicemia del paciente podría plantear? Explique el fundamento del método de a glucosa oxidasa para la detección de glucosuria. al ser tratada con el método de la glucosa oxidasa. 2. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.

40 .

De acuerdo a su composición química los mucopolisacáridos están agrupados en dermatán sulfato. . 20 ml. cantidad que es bastante elevada si se compara con los 15 mg/día que excretan las personas normales. en contacto con mucopolisacpáridos forma un complejo de color púrpura metacromático. Dejar por 20 min. IV. 2. cartílago. CUESTIONARIO: 1. Los individuos con MPS secretan grandes cantidades de mucopolisacáridos.41 PRACTICA N° 15 IDENTIFICACION DE MUCOPOLISACARIDURIA I. III.Papel Whatman I impregnado con Azure-A . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. REACTIVOS A UTILIZAR . Si un resultado cualitativo para investigar mucopolisacáridos en orina ha sido positivo ¿Porqué debe ser confirmado y cuantificado por cromatografía o precipitación? ¿Cuál es la constitución química básica de los glicosaminoglicanos (mucopolisacáridos)? ¿Cuál es la constitución química básica de los proteoglicanos? Cite 5 ejemplos de éstos. INTRODUCCION: Determinar desórdenes genéticos puede involucrar los sistemas enzimáticos esenciales del metabolismo de los mucopolisacáridos. . RESULTADOS Positivo: aparición de un color púrpura. los cuales son excretados anormalmente en grandes cantidades en las mucopolisacaridosis (MPS). cordón umbilical. Sacar y secar la tira de papel en estufa a 80º C o con aire caliente. La finalidad del experimento es determinar cualitativamente en orina la excesiva excreción de mucopolisacáridos. 3. resultado obtenido cuando la excreción está sobre el límite superior normal de 15 mg/día. 0. válvulas del corazón y son responsables de las características físicas de estas estructuras. cerca de 100 mg/día. La presencia de mucopolisacáridos en orina puede detectarse por un simple procedimiento o Test de Identificación de Mucopolisacáridos que se basa en que el papel Whatman I impregnado con el colorante AZURE-A.La orina turbia debe ser filtrada o centrifugada previamente. Transferir a una caja Petri llena de solución de lavado. III y IV.1 ml. Los mucopolisacáridos son sustancias de gran peso molecular que se encuentran en varios tejidos: Conectivo.Poner una gota de orina al centro de un papel de prueba con Azure-A. Síndrome de Sanfilippo.Usar orina fresca o de 24 hrs conservadas en refrigeración (no usar preservantes). II.Solución de Lavado :  Metanol  Acido acético glacial  Agua destilada. Síndrome de Hunter. aorta. llamados también MPS I. Estas son subdividas en varios grupos tales como : Síndrome de Morquiolo. Un resultado positivo por este procedimiento debe ser confirmado y cuantificado por columna cromatográfica ó utilizando la reacción de precipitación con cloruro de cetil piridium. . 300 ml . heparán sulfato y queratán sulfato. Síndrome de Hurler. II. Negativo: aparición solamente de un color azul pálido. Dejar 3 min.

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4.

¿Cuál es la importancia biológica del ácido hialurónico, condroitina y heparina?

III UNIDAD METABOLISMO DE LIPIDOS

REUNION DE LABORATORIO N° 08
PRACTICA N° 16
DEMOSTRACIÓN DE LA DIGESTION DE LAS GRASAS IN VITRO. ACCION EMULSIFICANTE DE LAS SALES BILIARES SOBRE LAS GRASAS. ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA SOBRE LOS TRIGLICÉRIDOS Y EFECTO DE LAS SALES BILIARES
I. INTRODUCCION: Los triglicéridos son los principales lípidos de la dieta. En el estómago ocurre la acción de la lipasa gástrica y la licuefacción de la masa de lípidos de los alimentos por contraccion peristálticas. La es principal digestión ocurre en el duodeno, tiene lugar en la interfase agua-lípido y su velocidad depende del área de superficie de la interfase, la cual es grandemente incrementada por el movimiento peristáltico del intestino combinado con la acción emulsificante de los ácidos biliares. Los ácidos biliares son moléculas anfipáticas sintetizados por el hígado a partir del colesterol y secretados como conjugados de glicina y taurina. La lipasa pancreática (Triacilglicerol lipasa) cataliza la hidrólisis de los triglicéridos en sus posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto con ácidos grasos. La actividad enzimática de la lipasa pancreática incrementa grandemente cuando contacta la interfase agua-líquido, un fenómeno conocido como activación interfacial. La unión a la interfase agua-líquido requiera la colipasa, una proteína de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con la lipasa pancreática (449 residuos), con cambios conformacionales que f rma una o superficie hidrofóbica y deja libre el centro activo. La alteración en la digestión o absorción de las grasas produce esteatorrea La finalidad de la práctica es demostrar la acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando su efecto con el agua y el cloroformo. Asimismo la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y el efecto de las sales biliares. II. REACTIVOS A UTILIZAR III. Cloroformo Aceite vegetal, de olivo Solución de sales biliares Buffer fosfato 0.1M pH 8,0 Emulsificación de aceite vegetal Solución de fenolftaleina (Solución alcohólica) Hidróxido de sodio (NaOH) 0.1N

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

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y

Acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas utilizando tubos de 15 x 125 mm. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Aceite de olivo(gotas) Agua destilada (ml) Cloroformo (ml) Sales Biliares (ml) Agitar enérgicamente los tubos Dejar en reposo y anotar los resultados para interpretarlos Acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y efecto de las sales biliares sobre la reacción enzimática utilizando tubos de 20 ± 25 x 150 mm. COMPONENTES (ml) TUBOS Emulsificación de aceite vegetal Buffer fosfato 0.1M pH 8.0 Solución de sales biliares 1 % Solución de extracto pancreático 1 % Agua destilada I 2 2 2 3 II 3 2 2 2 III 3 2 2 2 IV 3 2 2 2 Tubo 1 3 5 Tubo 2 3 3 2 Tubo 3 3 2 -

Mezclar los 4 tubos y llevar al baño maría a 37 °C , por 30 minutos, agitando de vez en cuando. Al finalizar el tiempo de incubación retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftaleína. Mezclar bien y luego realizar la titulación. TITULACION: Utilizando una pipeta graduada de 1 ml, dejar caer gota a gota NaOH 0,1N en el fondo de cada tubo del sistema, mezclar bien hasta la aparición de un color rosado tenue persistente. Anotar la cantidad de NaOH 0,1N gastados. Anotar los resultados para su interpretación. IV. CUESTIONARIO: 1. Explique lo que son sustancias anfipáticas. 2. Diferenciar emulsión de solución, acción de las sales biliares vs cloroformo. 3. ¿Cuántas clases de lipasa pancreática actuán en el intestino? 4. Cuál de los métodos para medir la actividad enzimática se ha empleado en esta práctica. Explique el papel de la fenolftaleína en la titulación. 5. Diferencie la absorción de los ácidos grasos según su tamaño.

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PRACTICA N° 17
DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS PRE Y POST PRANDIAL EN SUERO HUMANO
I. INTRODUCCION: Los lípidos de la dieta son principalmente triglicéridos. Son transportados junto a colesterol y fosfolípidos por los quilomicrones, formados en el enterocito. Los quilomicrones son las lipoproteínas más grandes, menos densas, ricas en triglicéridos, con la apoproteína apo B48. Por el conducto toráxico llegan a la circulación general. El pico máximo de lipemia postprandial se observa entre las 4 y 6 horas de la ingesta, y al cabo de 9 a 10 horas retorna a los valores basales de lípidos, especialmente de los triglicéridos. Los niveles de lípidos postprandiales, especialmente de los triglicéridos dependen de la cantidad de lípido de la dieta, de la digestión y absorción, de los niveles basales sanguíneos, de la acción de la lipasa lipoproteic en los tejidos extrahepáticos. La lipasa a lipoproteica actúa sobre los triglicéridos de los quilomicrones, liberando ácidos grasos que son captados por los tejidos extrahepáticos. Los quilomicrones son convertidos en remanentes de quilomicrones y captados por el hígado. Se ha considerado al incremento de la lipemia postprandial como un factor riesgo de aterogénesis. La finalidad de la práctica es demostra las variaciones de la concentración de trigliceridos en suero después de la ingesta de alimentos de alto contenido de grasas II. REACTIVOS A UTILIZAR - Reactivo enzimático para determinación de Triglicéridos ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Un alumno por cada mesa vendrá en ayunas de al menos 10 horas, a las 7 a.m. se les extraerá una muestra basal. Ingerirán una dieta rica en grasas conteniendo un vaso de leche, un huevo, 2 panes y 10 aceitunas. A las 4 y 7 horas de la ingesta, se obtendrá una segunda muestra. Se obtendrá el suero y se hará la determinación de triglicéridos. Armar el siguiente sistema. COMPONENTES BLANCO STANDARD DESCONOCIDO Muestra --------10 ul Standard ----10 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar e incubar 10 minutos de 20« 25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. Medir la absorbancia del Standard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A). Cálculos:

III.

C ! 200 v

(ADesconocid o ?mg / dl A (AStandar
1.71 mmol/l 2.28 mmol/l

C ! 2.28 v

(ADesconocido ?mmol / l A (AStandar

Valores Referenciales Sospechoso: sobre 150 mg/dl ó Elevado: sobre 200 mg/dl ó

el ejercicio y el género sobre la lipemia postprandial. 5. . CUESTIONARIO: 1. 3. Destino de los productos de acción de la lipasa lipoproteica sobre los triglicéridos. 2. Cuál es el efecto de la edad. 4. Alteración de la lipemia postprandial en diabetes y familiares de diabéticos. Explique porqué el incremento de la lipemia postprandial es considerado un factor de riesgo coronario.45 IV. Grafique los cambios de triglicéridos postprandiales en función del tiempo.

a l denominada cetoacidosis diabética. Prueba de Rothera y Trabajar del tubo identificado como orina patológica y Utilizar nitroprusiato en polvo. DETERMINACION SEMICUANTITATIVA DE CUERPOS CETONICOS EN ORINA I. especialmente de acetona. el hiperinsulinismo.5 g Mezclar hasta disolver los cristales de Sulfato de Amonio. INTRODUCCION: La beta oxidación de los ácidos grasos en el hígado. Los dos primeros pasan a la sangre y son fuente de energía en los tejidos extrahepáticos como el corazón y el músculo esquelético. incluyendo el cerebro en el ayuno prolongado. al superar la capacidad de oxidación de los tejidos extrahepáticos lleva a niveles aumentados de cuerpos cetónicos. en toda hipercatabolia como la fiebre. en los vómitos. rinde un color azul violeta. Prueba de Legal El nitroprusiato de sodio diluido en presencia de cuerpos cetónicos. Dado que éstos son ácidos se produce acidosis metabólica. cristales. solución al 10% en H2O . el ácido beta hidroxibutírico y la acetona. . y en sangre hasta 1mg/dl. . solución al 5% en H2O. sin mezclar) 1ml _________________________________________________________________________ Anotar sus resultados.Sulfato de amonio. en la dieta pobre en carbohidratos. el aumento de la lipólisis. En condiciones patológicas como la Diabetes mellitus.46 PRACTICA N° 18 IDENTIFICACIÓN DE LOS CUERPOS CETONICOS EN LA ORINA.Disponer de dos tubos que contengan orina normal y orina patológica. en el síndrome de Fanconi. a nivel mitocondrial. III. Estos son el ácido acetoacético. en la enfermedad de Von Gierke y otras glucogenosis. En la Diabetes mellitus. produce acetil CoA que ingresa al Ciclo de Krebs y en parte se utiliza en la síntesis de cuerpos cetónicos (cetogénesis).Nitroprusiato de sodio. de la beta oxidación y de la cetogénesis. Procedimiento: Armar el siguiente sistema: COMPONENTES TUBO Orina 3 ml Cristales de sulfato de amonio 0.Cloruro Férrico. de la siguiente manera: II. Nitroprusiato de sodio 10% 3 gotas Amoníaco (agregar lentamente por las paredes del tubo. REACTIVOS A UTILIZAR: . Los cuerpos cetónicos son eliminados por la orina y la a etona también por la c respiración. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento INVESTIGACION DE ACETONA . Su concentración normal en orina es de 125 mg/ 24 horas. Aumentan en sangre (cetonemia) y en orina (cetonuria) por condiciones fisiológicas como el ayuno prolongado. El diagnóstico y monitoreo de su tratamiento se hace con su determinación en sangre o/i orina. hipertiroidismo.

Cuál es la importancia de la cuantificación de los cuerpos cetónicos en el monitoreo de la cetoacidosis. INVESTIGACIÓN DE ACIDO ACETOACETICO . Sumergir la tira en el frasco conteniendo la orina. 15.1 cc 0. 4. para calcular la concentración en orina diluida. CUESTIONARIO: 1. Cuál es el mecanismo fisiopatológico de la cetoacidosis en un paciente que llega al hospital por alcoholismo agudo . etc.9 cc 1. 2. Prueba de Cloruro Férrico o de Gerhart.2 g de reactivo sólido de nitroprusiato de sodio en cada una de éstas. Procedimiento (Se utiliza orina filtrada): COMPONENTES Orina filtrada Cloruro Férrico. Realice una comparación entre la síntesis de cuerpos cetónicos con la etapa inicial de la síntesis de colesterol Defina: cetonemia. Diluir la orina al 1/10. Esto es debido a que el nitroprusiato de sodio en polvo da reacción positiva solo cuando en la orina sin diluir alcanza la concentración mínima de 10 mg% de acetona y por eso. de la siguiente manera: AGUA 0.9 cc + + + + + ORINA 0.9 cc 2. 1/20. estimando la concentración como negativo 5. el ácido acetoacético rinde una coloración rojo burdeos.1 cc 0. 3. 150 mg/dl. para investigar acetona y tener una cifra aproximada en su cuantía. cetoacidosis y de ejemplos de cada uno de ellos.1 cc DILUCION 1/10 1/20 1/30 1/40 1/50   Agregar una gota de cada una de las diluciones. Este método con sus dos variantes es posible aplicarlo al suero sanguíneo. leer en escala colorimétrico. Observar la máxima dilución de la orina en el que aparece color azul violeta y multiplicar por el denominador de la dilución alcanzada por 10 y se tendrá la cantidad aproximada de acetona en mg por 100ml. en cada una de las excavaciones que contiene el reactivo. Se basa en que en presencia de cloruro férrico.1 cc 0. Esperar 20 segundos. solución 5% en agua TUBO 5 ml gota a gota hasta la aparición del Color rojo burdeos si existe ácido Acetoacético IV. 50. 5. Uso de tira reactiva. 1/30.9 cc 4. cetonuria. se debe multiplicar por 10 el número de veces que se ha diluido ésta.9 cc 3. Compare los métodos para determinar los cuerpos cetónicos.Armar dos sistemas que contengan orina normal y patológica.47   En una lámina de porcelana con excavaciones colocar 0.1 cc 0.

3 niveles: Bajo o de riesgo < 40. la hipercolesterolemia poligénica. . El LDL colesterol.Reactivo Standard para colesterol 50 mg/dl. En la presente práctica. la gota. y el resto en la VLDL y HDL. La hipertrigliceridemia puede deberse a causa primarias o familiares. normal a 40 a 59. Son causas secundarias: la diabetes. la hiperlipidemia familiar combinada. la hiperlipidemia familiar combinada la hiperkilomicronemia. incubar 10 minutos de 20«25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. . o secundarias a otras enfermedades.Precipitante para semimicro ensayos (PRECb) ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN DE COLESTEROL SANGUÍNEO Armar el siguiente sistema: COMPONENTE BLANCO PROBLEMA ESTÁNDAR Suero ----10 ul ----Estándar 200 mg/dl --------10 ul Reactivo enzimático 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar. por el método enzimático y la determinación de HDL. INTRODUCCION: El colesterol es un componente importante de las biomembranas. Son hipertrigliceridemias primarias. Medir la absorbancia del Starndard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A) III. En los triglicéridos se considera: normal menos de 150mg/dl. regulando su fluidez. limítrofe de 150 a 199. Los triglicéridos an ayunas circulan unidas a las VLDL y son fuente de energía para los tejidos. previa precipitación de las otras lipoproteínas. obesidad central. La hipertrigliceridemia se asocia a disminución de HDL.48 REUNION DE LABORATORIO N° 09 PRACTICA N° 19 DETERMINACION DE PERFIL LIPIDICO I.Reactivo precipitante de HDL: ácido fosfotungstico. 5 niveles: Óptimo < 100 mg/dl. ictericia obstructiva. etc. El HDL colesterol. el lipoteroidismo. resistencia a la insulina. limítrofe alto 200-239 y alto definitivo > 240 (Hipercolesterolemia > 200 mg/dl). REACTIVOS A UTILIZAR: . Hipertrigliceridemia moderada de 200 a 499. su incremento también es considerado factor de riesgo coronario.El III Panel de Expertos ha establecido los valores de referencia para el colesterol. hiperglicemia e hipertensión. la hipertrigliceridemia familiar. el HDL. .Precipitante para macro ensayos (PRECa) . Entre las secundarias: La diabetes. cirrosis biliar. Es transportado principalmente por la LDL que es considerada aterogénica. en el denominado síndrome metabólico. alto o protector mayor o igual a 60. severa 500 o más La hipercolesterolemia puede deberse a causas primarias o secundarias. II. clorhidrato de magnesio. el hipotiroidismo.. y el LDL. el alcoholismo. La HDL realiza el transporte reverso del colesterol. A partir de él se forman los ácidos biliares y las hormonas esteroideas. Entre las hipercolesterolemias primarias se señalan: La hipercolesterolemia familiar. el síndrome nefrótico. el uso de anticonceptivos orales. de los tejidos hacia el hígado y es considerada antiaterogénica . la disbetalipoproteinemia. En el colesterol se considera 3 niveles: Deseable < 200 mg/dl. se realizará la determinación de colesterol sanguíneo.

17 v ¢ ¢ muestra standard ?mmol/l A ¤ ¤ £ . incubar por 5 minutos a 37 ºC o 10 minutos a 20«25 ºC.7 mmol/l ó 6. Centrifugar for 2 minutos a 10000 RPM. respectivamente. dentro de 60 minutos ( A). alternativamente por 10 minutos a 4000 RPM Después de centrifugar separar el sobrenadante del precipitado y determinar la concentración de colesterol: Componente Blanco Standard Desconocido Agua Destilada 100 ul --------Standard ----100 ul ----HDL sobrenadante --------100 ul Reactivo de trabajo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar. incubar por 10 minutos a temperatura ambiente.7 mmol/l Componente Macro Semi-micro Suero 500 ul 200 ul PRECa 1000 ul ----PRECb ----500 ul Mezclar bien.49 CALCULOS VALORES REFERENCIALES: Sospechoso: sobre 220 mg/dl Elevado: sobre 260 mg/dl DETERMINACIÓN DE HDL -COLESTEROL: Armar el siguiente sistema: ó 5. CALCULOS: Concentración HDL-Colesterol: Macro método : ¤ C ! 150 v A Desconocid o A Standard mg/dl Semi  micro método : ¤ C ! 175 v A Desconocid o A Standard mg/dl TG 5 Concentración de LDL-Colesterol: VALORES DE REFERENCIA: HDL-Colesterol: Hombres LDL  C ! TC  HDL  C  ?mg/dlA Mujeres (mg/dl) ¢ standard £ ¢ ! 200 v muestra ?mg/dl A ó ! 5. comparando con el blanco. Leer las absorbancias del desconocido y del Standard.

Señale la importancia clínica del colesterol. Señale las principales causas de HDL disminuido. 4. Señale la importancia fisiológica del colesterol. 2. Cuál es la importancia de la hipertrigliceridemia en la aterogenesis. 6. Realice una breve descripción de hipercolesterolemia familiar y su relación con la cardiopatía isquémica. Alteraciones del perfil lipídico en la diabetes y en el hipotiroidismo. CUESTIONARIO: > 65 45-65 < 45 150 mg/dl 190 mg/dl 1. 3.50 Normal > 55 Bajo riesgo 35-55 Riesgo elevado < 35 LDL-Colesterol: Sospechoso: Elevado: IV. 8. . Cualés son las causas primarias de hipertrigliceridemia. 7. 5. Realice una breve explicación del rol de la LDL en la aterogénesis.

 Reactivo precipitante para HDL. Con la ayuda del personal de la sección. las que recibiran adicionalmente 2 cc de aceite preparado de sebo de pollo. etc. Se considera aterogénicos el aumento del colesterol y de los tigliceridos. Se dispondran de 20 ratas albinas adultas. o Las diez restantes conformaran el grupo experimental. Y secundarias a otras patologías como la diabetes. especialmente coronario. La ATP III. sidrome nefrotico. bajo la supervisión del personal de la sección. El tratamiento será por 21 días.51 PRACTICA N° 20 HIPERLIPEMIA EXPERIMENTAL I. LDL y triglicéridos entre ambas ratas.  Set de determinación de triglicéridos enzimático. disminución de las grasas saturadas. o Diez de ellas constituirán el grupo control y seguiran su dieta habitual agua y alimentos (maíz) ad libitum. Extracción de las muestras. II.  Sebo de pollo. Se determinará el perfil lipídico antes y después del tratamiento y se compararan los resultados.    . REACTIVOS A UTILIZAR:  Ratas de peso aproximado de 200gr. la hiperlipidemia familiar combinada. III. HDL. Las cuales se dividirán en dos grupos en forma aleatoria. La dieta es importante en el control de la hiperlipidemia. Se extraera el suero y a cada una se determinara el perfil lipídico siguiendo el método enzimático empleado en la práctica anterior. aumento de las grasas monoinsaturadas y polinsaturadas. Las hiperlipidemias pueden ser primarias o familiares como la hipercolesterolemia familiar. En el presente experimento. 1-2 representantes de cada mesa se encargarán del control de la dieta.  Dieta standard para ratas a base de maíz. Se compararán los valores de colesterol. como parte del cambio de estilo de vida junto al ejercicio y control de peso. cada mesa obtendrá de cada rata control y experimental una muestra sanguínea de la cola antes del tratamiento y otra al final. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procemiento  Tratamiento experimental. INTRODUCCION: El aumento de los lípidos sanguíneos o hiperlipidemia constituye una situación metabólica de riesgo. se busca mostrar como la ingesta de una dieta rica en grasa saturada con sebo de pollo por 3 semanas. la hipertrigliceridemia familiar etc.  Set de determinación de colesterol enzimático. Una dieta rica en grasas saturadas aumenta el riesgo de hiperlipidemia y consiguiente mayor riesgo coronario. puede producir el incremento de los lípidos sanguíneos. ha establecido los criterios para una dieta adecuada que incluye disminución de la ingesta de colesterol. hipotiroidismo.

para el tratamiento de la hiperlipidemia. 6. Qué alimentos son ricos en colesterol. 3. Qué alimentos son ricos en grasas saturadas.52 IV. Qué alimentos son fuentes de fibra. Qué alimentos son ricos en grasas polinsaturadas. 5. 4. Señale en detalle la dieta recomendada por la ATP III. Qué alimentos son fuentes de omega 3. 7. . Qué alimentos son ricos en grasas monoinsaturadas. CUESTIONARIO: 1. 2.

elastasas. .Caseína al 1% en buffer fosfato 0. existe hipoproteinemia.Buffer fosfato 0. La elastasa tiene una especificidad amplia.1 M pH 8. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) I II III III. . ataca a los residuos pequeños. . es activada por la enterocinasa en el intestino. y es específica de los enlaces peptidicos sobre el lado carboxílico de residuos de aminoácidos básicos: lisina y arginina solamente. con retardo marcado del crecimiento.Solución de extracto pancreático. Son exopeptidasas: carboxipeptidasa y aminopeptidasa. La tripsina. dipeptidasas. y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados en las heces). como la glicina. . determinado los productos (aminoácidos) con ninhidrina II. La carboxipeptidasa hidroliza el enlace peptídico carboxiterminal en las cadenas polipeptidicas.25% saturada con butanol. La falta de enzimas proteolíticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las heces. .1 M pH 8. quimotripsina. En el lactante con ausencia congénita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de activación de quimotripsinógeno y procarboxipeptidasa. triptofano y fenilalanina. quimotripsina.Acido tricloroacético al 10%. La presente práctica tiene como finalidad demostrar la acción hidrolítica de las enzimas digestivas contenidas en el páncreas sobre la caseína o proteína de la leche.Solución acuosa de ninhidrina al 0. es un proceso complicado que se realiza con el concurso de diversas enzimas proteolíticas Entre estas enzimas proteoliticas tenemos: a) de origen gástrico: pepsina y renina. b) de origen pancreático: tripsina. alanina y serina. que provienen de la carne de los alimentos). tripsina. La quimotripsina es específica para los enlaces peptidicos de los aminoácidos sin carga como los aromáticos: tirosina. o degradación hasta aminoácidos en el tubo digestivo. c) de origen intestinal: aminopeptidasas. elastasa y carboxipeptidasa.53 IV UNIDAD PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS: INTEGRACION DEL METABOLISMO REUNION DE LABORATORIO N° 10 PRACTICA N° 21 DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA I. REACTIVOS A UTILIZAR: . INTRODUCCION: La digestión de las proteínas. Son endopeptidasas: pepsina.

Elabore un esquema con la digestión y absorción de proteínas y aminoácidos. III). de cada uno de los tubos y trasladarlo a otro sistema numerado (I.1 M pH 8. Mezclar y llevar a un baño de agua hirviendo (franca ebullición).0 Solución de extracto pancreático Agua destilada Pasos: * * * * * * * 1 1 1 --- 1 1 --1 --1 1 1 Mezclar y colocar al baño de agua a 37 ºC por 30 minutos. Observe las variaciones que se produce en cada tubo. CUESTIONARIO: 1. Explique el sitio de producción y la acción de las hormonas que intervienen en el proceso de digestión y absorción de los aminoácidos. 3. En este nuevo sistema.5 ml. IV. 4. agregar 1 ml de solución de ninhidrina. durante 3 a 5 minutos. agregue gota a gota 1 ml de ácido tricloroacético al 10% agitando continuamente. Luego a los tubos de incubación del primer sistema. 2. II. Observa los cambios de color de cada tubo. Escriba dos esquemas mostrando dos ejemplos de transaminación y dos de desaminación con los nombres de aminoácidos y alfa cetoácidos que participan. .54 Caseína al 1% Buffer fosfato 0. Después del tiempo de incubado tomar 0. Interprete todos los resultados encontrados en la práctica y explíquelos usando algunos dibujos.

Esta sustancia de naturaleza peptídica es inactivada por el calor.5 0. La finalidad del siguiente experimento es demostrar el efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre el efecto proteolítico de la tripsina.2 IV 2.55 PRACTICA N° 22 INHIBICION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS: ACCION DE LA SOYA HERVIDA Y CRUDA SOBRE EL EFECTO PROTEOLITICO DE LA TRIPSINA I. efecto que desaparece cuando la soya es hervida. ello explica en parte que el valor nutritivo del frijol de Soja aumenta considerablemente si se coce a ebullición por varios minutos. Algunos alimentos en estado natural poseen componentes perjudiciales para la nutrición. INTRODUCCION: La tripsina actúa como una endopeptidasa e hidroliza prácticamente toda clase de proteínas. con mayor rapidez que las originales desdoblándose en polipéptidos de peso variable y algunos aminoácidos. .Solución de tripsina 20 mg%.25% saturada con butanol. .0.5 0.Etanol absoluto III. el gisipol. secretada a la luz intestinal.5 0.1 M pH 8. con actividad antioxidante y antitripsina que disminuye el apetito y dificulta la digestión de las proteínas.5 0. . . Es interesante también que el aceite de semilla de algodón posea un pigmento.2 II 2. Por ejemplo el frijol de soja contiene un principio cuya actividad antitripsina dificulta la digestión de las proteínas. II. Mezclar y centrifugar a 2500 rpm por 10 min.5 III 2.Proteína de soya cruda 30%. I 2. Digiere las proteínas desnaturalizadas y parcialemente digeridas. Después del tiempo de incubación: agregar a cada uno de los tubos 2 ml de etanol absoluto. REACTIVOS A UTILIZAR.5 0. . El ovomucoide de la clara de huevo inhibe también de manera enérgica la tripsina.Buffer fosfato 0.1 M pH 8. Incubar en baño maría a 37°C durante 1 hora. c. b. la alfa-1 antitripsina fecal (1-AT-Fecal) que es una glicoproteína. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.5 - .5 0.Los extractos de páncreas poseen también un péptido inhibidor de la tripsina.Proteína de soya hervida 30%.Solución de ninhidrina 0.0 Proteína de soja cruda 30% Proteína de soja hervida 30% Solución de tripsina 20 mg% Pasos: a. .

2. f. Anotar los resultados. 4. III. En otra serie de tubos numerados I . Explique con sus propias palabras cuál cree que es el objetivo de la práctica que realizó.56 d. IV. II. CUESTIONARIO: 1. IV colocar 1 ml de sobrenadante de los tubos respectivos del paso anterior y agregar 1 ml de ninhidrina 0.25%. Someter los tubos a temperatura de ebullición del agua utilizando baño maría durante 5 minutos. ¿Qué es el gisipol y cómo actúa en su acción antioxidante? Con dibujos represente la práctica realizada. Por qué razón el ovomucoide de la clara del huevo inhibe la acción de la tripsina. 3. e. .

1 a 7. transporte.8. en el kala-azar. etc. II. La concentración sérica de las proteínas totales es de 6. regulación del equilibrio hídrico.9 g/dl de las cuales albúmina: 3. por el método colorimétrico. en la macroglobulinemia de Waldenström. que se pueden determinar por electroforesis. en presencia de un exceso de colorante. excreción. es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra. Determinación de Albúmina: La albúmina reacciona específicamente sin separación previa con la forma aniónica de la bromo Cresolsulfon Ftaleina (BCF).Las fracciones globulínicas contienen varias proteínas específicas: inmunoglobulinas.8 g/dl y globulinas: 2..5 a 4. Los bajos niveles de albúmina pueden ser debidos a: incrementadas pérdidas de albúmina en la orina. disminución de la formación en el hígado como en la cirrosis. para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540nm.6 a 3. cuya intensidad es provisional a la concentración de proteínas totales en la muestra. etc. INTRODUCCION: Las proteínas plasmáticas son importantes para el organismo porque realizan diversas funciones: coagulación. ceruloplasmina. regulación del metabolismo. la transferrina. respecto del Blanco del reactivo.57 REUNION DE LABORATORIO N° 11 PRACTICA N° 23 CUANTIFICACION DE PROTEINAS SERICAS TOTALES Y FRACCIONADAS I. defensa contra las infecciones. En el suero solo albúmina y globulina . haptoglobina. Agammaglobulinemia y la analbuminemia son cuadros demasiado raros. REACTIVOS A UTILIZAR.1 g/dl. insuficiente ingestión de proteína. El aumento de absorbancia a 625 nm. en medio tamponado a pH3. en la gastroenteropatía exudativa con pérdidas fecales de proteínas. Reactivo EDTA/Cu Reactivo BCF . La presente práctica tiene por finalidad determinar las concentraciones séricas de proteínas totales y fraccionadas en personas normales y/o con procesos patológicos. El origen de las proteínas plasmáticas es hepático con excepción de las globulinas gamma que se forman en las células plasmáticas. Las proteínas plasmáticas por métodos químicos se clasifican en albúmina. FUNDAMENTOS DEL METODO Determinación de Proteínas Totales: Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico. Las cifras de proteínas plasmáticas totales pueden aumentar (hiperproteinemia) con cociente A/G normal en la hemoconcentración. con inversión de A/G por aumento de las globulinas: en el mieloma múltiple. globulina y fibrinógeno. etc. inmunodifusión o inmunoelectroforesis. en las colagenopatías. en medio alcalino. conservación del equilibrio ácido básico. La disminución de proteínas totales (hipoproteinemia) son generalmente asociadas con HIPOALBUMINEMIA que a su vez están acompañadas con pequeños cambios en las globulinas.

(g/dl).01 ----1.58 III. Leer las absorbancias a 540 nm.2 . CALCULOS: FACTOR ! Concentrac ión Standard Absorbancia Standard  Proteina Total (g/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: 6. Reactivo BCF 1ml.5 ± 4.2 ± 2. colocar: B S D Suero Patrón 10 ul Muestra 10 ul. S (Standard) y D (Desconocido).(g/dl) Relación A/ ! ¥ VALORES DE REFERENCIA: Albúmina = 3.0 g/dl Determinación de Albúmina. El color resultante es estable por lo menos 30 minutos. PROCEDIMIENTO: En tres tubos de fotocolorímetro marcados B(Blanco). Mantener los tubos entre 15 y 28 ºC durante 10 minutos. 1 ml.0 Standard ----0.8 g/dl Relación A/G = 1. 1 ml. Leer en espectrofotómetro a 625 nm o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo CALCULOS DE LOS RESULTADOS : Alb. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Determinación de Proteínas Totales PROCEDIMIENTO: En tres tubos marcados B (Blanco). ó 20 minutos a temperatura ambiente. S (Standard) y D (Desconocido).0 Mezclar e incubar 10 minutos a 37rC.Alb.0 a 8.(g/dl) Albúmina (g/dl) ! D v f f! S Albúmina(g/dl) PT. Mezclar con varilla. llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo.01 1.0 Desconocido 0. colocar: Componentes Muestra (ml) Standard (ml) Reactivo (ml) Blanco --------1.

3. . Cuáles son las principales características de las proteínas plasmáticas. CUESTIONARIO: 1. 4. 5.59 IV. ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de las proteínas séricas totales y las fracciones albúmina y globulinas? ¿Qué importancia tiene determinar la relación albúmina/ globulina. 2. en clínica? ¿En qué se basa la determinación de las proteínas totales y fraccionadas en nuestro experimento? Elabore un esquema sobre el proceso fisiopatológico de un edema.

Se diluye con cloruro de sodio 0. nefropatía diabética.5% (en agua destilada) Cloruro de sodio 0. Cuando el glomérulo es dañado por alguna enfermedad. se ha hace más intensa o se forma un precipitado. síndrome nefrótico. . El fibrinógeno es una molécula muy larga y escapa solo en enfermedad renal severa. albúmina.60 PRACTICA Nº 24 DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE PROTEINAS EN ORINA I. febril. La proteína de Bence Jones está constituída por las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas que constituye la proteína monoclonal. mieloma múltiple. Acido acético al 2%. COMPONENTE (ml) TUBO Muestra de Orina 5. la cantidad es pequeña alcanzando máximo de 150 mg en orina de 24 horas. III. II. Si la turbidez persiste. INTRODUCCION: La orina normal contiene una pequeña cantidad de proteínas solubles (albúminas. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LAS PROTEÍNAS EN ORI NA: Coagulación por el calor. menos de 10 mg/dl. escapan en el filtrado de forma que los túbulos son incapaces de captar la gran cantidad de proteínas y resulta una masiva proteinuria. Standard de proteína: Pueden usarse suero claro normal de concentración conocido o un suero control adquirido comercialmente. La presente práctica tiene por finalidad determinar la presencia de proteínas en la orina y de cuantificarlas en caso que estén presentes en casos normales y en estados patológicos. nefropatía tóxica.85% a una concentración final de 25 mg/ml. Extrarrenal: proteinuria ortostática. Esta dilución debe ser preparada el mismo día. tuberculosis renal. por ejemplo la proteína de Bence Jones. 12. riñón poliquístico etc. Las proteínas de peso molecular relativamente bajo y de pequeño tamaño pasan primero a través de los glomérulos injuriados. Las proteínas son casi completamente absorbidas en los túbulos.). sin que exista evidencia de lesión renal. Si aparece un precipitado o enturbamiento se puede deber a la presencia de proteínas o fosfatos. Son causas de proteinuria Renal: glomerulonefritis difusa. hemoglobina. aparece la proteína de Bence Jones. se trata de proteínas. luego las globulinas. Añadir: Solución de ácido acético al 2% IV gotas Si desaparece la turbidez. En el mieloma múltiple y macroglubinemia de Waldestrom.0 Someter a ebullición por 1 minuto. en la eclampsia. algunas enzimas. moléculas proteicas de variado tamaño incluyendo las más largas.85%. glomerulonefritis focales proliferativas. gravídica. La proteinuria fisiológica (proteinuria ortóstatica) se presenta después de ejercicios y de permanecer largo tiempo en posición de pie. se trata de fosfatos que se han disuelto en medio ácido. REACTIVOS A UTILIZAR. nefropatía lúpica. La proteinuria puede ser renal o extrarrenal. Acido tricloroacético. etc.

0 II 1.0 1. mg/100 ml orina x 100 IV. CUESTIONARIO: 1. NOTA: Antes de leer los tubos deben ser mezclados totalmente evitando que burbujas de aire puedan interferir con la lectura.0 4.61 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS EN LA ORINA : Método turbidimétrico de Heavy. CALCULO: Desde que 4 ml de orina se trata igual que un standard de 4 ml conteniendo 25 mg/100 ml entonces: Calcular de la siguiente manera: Absorbancia problema ± Absorbancia blanco x 25 = mg/100 ml. 2. ¿Cómo diferencia usted un precipitado en un tubo de ensayo que no c orresponde a proteínas en orina? Señale algunos tipos de proteínas anormales que pueden ser encontradas en la orina. 3.5% I 4. . y leer en fotocolorímetro con filtro (420 um). 5.0 1. Leer el standard (I) calibrando con agua destilada y luego a la lectura del problema (II) restar el blanco de la orina (III).0 Dejar reposar 5 a 10 min.= proteína total de orina de 24 H en mg.0 III 4. 4. orina Absorbancia del standard Volumen total en ml orina -----------------------------------. En tres tubos marcados previamente agregar: COMPONENTES (ml) /TUBOS Solución standard de proteína Orina previamente filtrada Agua destilada Acido tricloroacético 12. En qué consiste el método de Heavy para la determinación de proteínas ¿Cuál es el mecanismo por el cual un paciente con glomeruloesclerosis elimina mucha proteína por la orina? Señale algunas causas de proteinuria fisiológica y patológica.

glutamato. II. Leer la absorbancia inicial (A1) a 340 nm.. Repetir las lecturas a intervalos de 60 segundos. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Reactivo reconstituido (ml) 1. estas enzimas proveen un medio de interconversión de proteínas e intermediarios metabólicos de los carbohidratos y hacen disponibles las reservas proteicas almacenadas en el hígado al ciclo del ácido cítrico.1 Mezclar y transferir a la cubeta del espectrofotómetro. estas enzimas son liberadas dentro de la corriente sanguínea y pueden elevar sus niveles. Las transaminasas están normalmente presentes en la sangre. en la hepatitis o en el infarto de miocardio. relativamente en bajas concentraciones pero en los tejidos están presentes en grandes cantidades. particularmente en el hígado y corazón.5  a-cetoglutarato  L-alanina  LDH  NADH III. hasta por tres minutos. INTRODUCCION: La transaminasa glutámica pirúvica.62 PRACTICA N° 25 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ALANINA AMINOTRANSFERASA SERICA (ALT) o TRANSAMINASA GLUTAMICO PIRUVICA (SGTP) I.Piruvato + L . Incubar 60 segundos a la temperatura de reacción. sacar diferencias y determinar una media que luego se multiplica por el factor determinado.0 Volumen de muestra (ml) 0. se mide colorimétricamente por reacción con dinitrofenil hidrazina en medio alcalino. Cuando se produce destrucción tisular de estos órganos como sucede por ejemplo. CALCULOS: Actividad ALAT (UI/l) = A/min x 1768 Nota: de las absorbancias. llamada también alanina aminotransferasa cataliza la reacción L-alanina + alfa-cetoglutarato .. producto resultante después de la incubación. REACTIVOS A UTILIZAR. En la presente práctica la glutámico pirúvico transaminasa (GPT) es determinada agregando suero a una solución bufferada conteniendo ácido alfa cetoglutarato y L-alanina y el ácido pirúvico formado. Reactivo para SGTP:  Buffer TRIS pH 7. VALORES DE REFERENCIA: Hasta 29 U/l a 30 ºC Hasta 45 U/l a 37 ºC . Con la aspartato transaminasa.

Haga un esquema de una transaminación. ¿Cuáles serían las razones para solicitar. colocando los nombres de las moléculas que participan. en el diagnóstico diferencial clínico? 4. CUESTIONARIO: 1. 2. ¿Cuál es la importancia metabólica de la transaminasa glutámico pirúvico? 3. 6. Diga usted en que consiste el mecanismo de transaminación.63 IV. ¿Cuál es la ubicación intercelular de las TGP y TGO? 5. TGO-S algunas veces separadas y otras veces juntas. . Cuál es la utilidad práctica de la utilización del dosaje de transaminasas.

Leer a 505 nm.4N diluido con agua destilada 1:10) Mezclar y reposar por 15 minutos a temperatura ambiente antes de leer.1 0.4N (NaOH 0.35 0.1 Sustrato AST (ml) 0.1 0. Agregar 5 ml de NaOH 0. sobre todo en la cogestión hepática. las dos suben nuevamente. éstas. sube al máximo entre las 12 y 48 horas y suele volver a lo normal a los 4 ó 7 días.20 0.64 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST) I.30 0. En las lesiones o hepáticas aumentan ambas transaminasas en el suero. cuando sobreviene la mejoría clínica.40 0. pero tiene el inconveniente de elevarse en diversos cuadros.25 Standard 0.1 0. como es el caso de: Las enzimas del tubo digestivo. a veces proporciona datos positivos en casos con datos electrocardiográficos de difícil interpretación. En la clínica son importantes dos transaminasas.5 ml de reactivo de color.4N III. presentes en cantidades muy bajas en el suero aun cuando en ciertas enfermedades suben considerablemente.05 0.15 0.10 0. El color es estable sólo por 30 minutos. proporcional a la extensión del infarto. aunque se hallan en todos los tejidos se relacionan preferentemente con los procesos de ³escape´ de enzimas del mi cardio o el hígado. La finalidad del presente trabajo experimental. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) : 1) CURVA DE CALIBRACIÓN: Antes de usar los reactivos por primera vez. II. Armar el siguiente sistema: Tubo 1 2 3 4 5 6 Agua Destilada (ml) 0. El ascenso es.4 Reactivo de color: 2-4 dinitrofenilhidrazina Standard: Buffer piruvato pH 7.4 NaOH 0. en general. El tejido miocárdico es muy rico en TGO y el ascenso de esta enzima acompaña a los procesos destructivos del corazón.45 0. una vez sintetizadas. es la determinación por método colorimétrico de una de estas transaminasas de importancia clínica como es la aspartato aminotransferasa. descienden en forma paralela y. Otras enzimas.1 0. la glutámico pirúvica (TGP) y la glutámico oxalacética (TGO) o aspartato aminotransferasa (AST). si aparece una recaída. salen de las células y funcionan fuera de ellas.0 0.50 0. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. INTRODUCCION: En condiciones normales. Las enzimas con actividad en el suero sanguíneo (las que intervienen en la coagulación. por ejemplo) y las enzimas de escape.25 AST 0 22 55 96 150 212 Agregar 0. las enzimas se sintetizan en las células y en la mayoría de los casos ejercen su función en su interior. . preparar una curva de calibración para AST. REACTIVOS A UTILIZAR Sustrato AST: Buffer de DL-aspartato y -cetoglutarato pH 7.1 0.

5 ml de reactivo de color. . . 3.Colocar 0. exactamente.Agregar 0. ¿Cuál es la utilidad y el comportamiento en sus concentraciones de la AST en casos de infarto agudo de miocardio? Interprete y explique todo lo actuado en la práctica. . . IV. .1 ml de suero. según instrucciones previas.65 Construir en papel semilogarítmico los valores de transmitancia en el eje vertical y en el eje horizontal las U/ml de AST 2) PROCEDIMIENTO DE LA MUESTRA (disponer de un tubo de ensayo): . 2. Inmediatamente empezar el control de tiempo. agregar 0.Incubar a 37 ºC durante 5 minutos. CUESTIONARIO: 1.Incubar a 37 ºC durante 60 minutos.Agregar 5 ml de Na OH 0.Al cumplirse los 60 minutos.4 N Mezclar y dejar reposar por 15 minutos antes de la lectura. . .Obtener el valor de U/ml de AST a partir de la curva de AST de calibración. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. Haga un resumen de seis líneas sobre AST.5 ml de sustrato AST en cada tubo.

utilizando el método enzimático de determinación de hemoglobina. INTRODUCCION: La hemoglobina es una hemoproteína. que es sin duda uno de los exámenes más solicitados. con dos subunidades alfa y dos beta. Hemoglowiener reactivo Tubos de vidrio Lancetas Pipetas ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: COMPONENTES STANDARD hemogloWiener Reactivo 5 ml Con pipeta limpia y seca. Standard de Hemoglobina. Se sintetiza en la médula ósea por una vía común a la síntesis de porfirinas. menor de 13 g/dl. Buffer/Ferricianuro: comprimidos estabilizados de ferricianuro de potasio y buffer de fosfatos. por diferentes causas. en niños existe variación con la edad. II. La concentración normal es de 12 a 14 g/dl en mujeres y de 14 a 16 g/dl en varones en nuestro medio y a nivel del mar. que también puede deberse a problemas en la maduración de los glóbulos rojos como la deficiencia de ácido fólico. En la práctica médica es por ello importante determinar la concentración de la hemoglobina. agregar: hemogloWiener Standard 20 ul DESCONOCIDO 5 ml ----Armar el siguient e sistema: III. tetramérica. El defecto enzimático en algunas de las etapas de síntesis del grupo Hemo. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración de hemoglobina en sangre de personas normales. En la hipoxia por altura por otro lado se produce aumento de su síntesis llevando a la policitemia. da lugar a las diferentes tipos de porfirias. una causa pueden ser las hemoglobinopatías por defecto en la síntesis de una de las cadenas (talasemias) o de cambios en la estructura de una de las subunidades por mutaciones que cambian un aminoácido por otro como en la hemoglobina S. REACTIVO MATERIAL Y EQUIPOS Tensioactivo/CNX: ampollas autorrompibles conteniendo solución estabilizada de tensioactivo/CNX. que puede tener también otras causas como la Policitemia Vera La OMS basa su definición de anemia en la concentración de hemoglobina.66 REUNION DE LABORATORIO N° 12 PRACTICA N° 26 CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA I. . produce disminución de su concentración dando lugar a la anemia por menor producción como en la anemia ferropénica. Pero la hemoglobina puede también disminuír por pérdida de sangre como en las hemorragias o por hemólisis (anemias hemolíticas). que termina con la adición del hierro por la ferroquelatasa. La disminución de la síntesis de hemoglobina. En este último grupo. de modo que en mujeres se considera si esta es menor de 12 g/dl y en varones. cuya función es el transporte de oxígeno.

. 2.0 ± 16. Haga un esquema con la estructura de la hemoglobina.Hombres: 13. Cuál es la más frecuente y cuántos tipos de anemia conoce. Qué es la anemia. CUESTIONARIO: 1.0 ± 18. Mezclar y luego de 3 minutos leer en espectrofotómetro a 540 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520 -550).0 g/dl .0 g/dl IV. enjuagando tres veces en el propio reactivo antes de agregar cada muestra. Una anemia importante es la anemia de células falciformes: Haga un resumen de las causas de su etiología y su patogenía. llevando el aparato a cero con Reactivo CALCULO DE RESULTADOS: Hemoglobin a (g/dl) ! D v factor factor ! Standard (g/l) S VALORES DE REFERENCIA: . Interprete y explique el procedimiento de la práctica. 4.67 Muestra (sangre total) ----20 ul Medir primero el Standard y luego usar la misma micropipeta. el número de ellos y las interacciones del ión Fe++ dentro del grupo hemo. 3. indicando sus aminoácidos importantes en cada polipéptido.Mujeres: 11.

que utiliza el diazorreactivo de Erlich.Diazorreactivo: Mezclar: 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo sulfanílico. que es finalmente excretada con la bilis al intestino por un proceso de transporte activo. hepático y post hepático. por el método de Malloy Evelyn. por el método enzimático de determinación de bilirrubina. o de la bilirrubina conjugada en las hepatopatías.Bilirrubina Standard.Nitrito de Sodio . éste es convertido en biliverdina y luego en bilirrubina. que no se excreta por orina. da color a las heces y ultrafiltra el glomérulo. Si lee antes. sólo reacciona después de agregar alcohol a la mezcla.5 ml ----Desarrollador --------2. . Total Muestra (suero) 200 ul 200 ul 200 ul Agua destilada 2. La concentración sanguínea de bilirrubina total es de 1 mg / dl. . Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos. La hemoglobina es liberada y se separa la globina del hem. excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. o en las enfermedades extrahepáticas obstructivas. Este pigmento insoluble en agua es transportado unido a la albúmina. al cabo de la cual son destruidos en el sistema retículo endotelial. Si se lee después. siendo en su mayoría bilirrubina indirecta. donde el defecto limitante es la excreción. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total de las fracciones de bilirrubina en el suero o plasma de personas normales y con ictericia. Cada gramo de hemoglobina degradada origina 35 mg de bilirrubina. y el origen de esta alteración obedece a causas de origen pre hepático.Reactivo sulfanílico . leer en espectrofotómetro a 530 nm o fotocolorímtero con filtro verde (520-550 nm). que varían con la edad de presentación y también en cuanto a su gravedad La bilirrubina directa da una reacción inmediata con el diazorreactivo. La manifestación clínica más importante de las hiperbilirrubinemias es la ictericia.Desarrollador o solvente . REACTIVOS .68 CUANTIFICACION DE BILIRRUBINAS SERICAS I. La bilirrubina indirecta o no conjugada llega al hepatocito y se separa de la albúmina.5 ml Reactivo Sulfanílico 200 ul --------Diazorreactivo ----200 ul 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión. se convierte en una forma soluble. la indirecta. habrá III. denominada bilirrubina directa o conjugada. ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Bil. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total y de las fracciones (bilirrubina directa e indirecta) en el suero de personas normales. INTRODUCCION: Los hematíes tienen una vida media de 120 días. Luego de 5 minutos. II. Directa Bil. habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta. La hiperbilirrubinemia puede ser a predominio de la bilirrubina no conjugada como en las anemias hemolíticas o en los defectos congénitos de conjugación.5 ml 2. llevando el aparato a cero con agua destilada. después de un proceso de captación y conjugación con dos moléculas de ácido glucurónico por la enzima bilirrubina glucuronil transferasa.

¿Cuáles son las principales causas de hiperbilirrubinemia no conjugada? 3. Elabore un esquema con los tipos de ictericia que se pueden producir durante el metabolismo de la bilirrubina.69 sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre CALCULOS: Bilirrubina total (mg/l) = (Abs.Abs Blanco.Adultos: o Directa: hasta 2 mg/l o Total: hasta 10 mg/l IV. Por qué? . 2. ¿Cuáles son las causas de hiperbilirrubinemia conjugada? 4.) x F Bilirrubina Libre (indirecta) = Bilirrubina total . Directa . Bil. total . ¿Cuál es la acción bioquímica que realiza cada uno de los reactivos utilizados en la práctica? 5. Blanco) x F Bilirrubina Directa (mg/l) = Abs.Abs. ¿Cuál es el riesgo de aumento de bilirrubina no conjuda en el recién nacido? 6.Bilirrubina Directa VALORES DE REFERENCIA: . ¿Cuál es el comportamiento de las bilirrubinas en caso de una insuficiencia hepática. B. CUESTIONARIO: 1.

Standar: solución de ácido úrico 100 mg/dl Uricasa: solución de uricasa mayor o igual a 3U/I Reactivo 4-AF/POD: frasco conteniendo más de 100 U de peroxidasa (POD). S (Standard) y D (Desconocido). En el plasma. podemos encontrar concentra ciones incrementadas de ácido úrico sérico en la gota. en alcalinidad. Retirar.5 ml Mezclar suavemente e incubar 15 minutos en baño de agua a 37 °C o 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). II. la concentración de ácido úrico en suero o plasma depende de un neto balance entre el grado de síntesis de purinas y fraccionamiento de nucleoproteínas por un lado y. INTRODUCCION: El ácido úrico es un producto de la degradación hepática de las bases nitrogenadas purínicas adenina y guanina. Al pH sanguíneo predomina la forma desprotonada o urato. policitemias. cantidad que puede incrementarse con una dieta rica en purinas. Aproximadamente 80 % de esa cantidad es excretada por orina. En condiciones patológicas. el resto se degrada y es eliminado como CO2 y NH3. Los varones tienen niveles 1 mg/dl más altos que las mujeres. llevando el aparato a cero con el blanco. el pH ácido favorece la formación de ácido úrico no disociado y puede precipitar. ocurre lo contrario. Reactivo de fenol.5 ml 2.5 ml 2. En el hombre. . La presente práctica tiene por finalidad cuantificar las concentraciones séricas de ácido úrico en personas adultas normales y / o con alteraciones patológicas mediante el procedimiento químico de Folin-Dennis que se basa en la acción reductora del ácido úrico en medio alcalino sobre el ácido fosfotúngstico. Un adulto normal produce unos 500 mg de ácido úrico por día.70 PRACTICA N° 27 CUANTIFICACION DEL ACIDO URICO SERICO I. los que se degradan y en un primer momento liberan los ácidos nucleicos de las proteínas. la uricemia se incrementa después de la ingestión de nucleoproteínas con los alimentos. REACTIVOS A UTILIZAR. Como sucede con otros constituyentes séricos. a pH menores predomina la forma protonada no disociada o ácido úrico. por otro. diferencia que desaparece después de los 45-50 años de edad. III. enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm). el ácido úrico alcanza una concentración de 4 a 6 mg/dl.Muestra: suero o plasma heparinizado . más frecuente en hombres. En las alteraciones renales severas son comunes los niveles altos de ácido úrico como resultado de una excreción disminuida. que circulan en la sangre (en el plasma y en los glóbulos rojos humanos) y es la orina su vía de excreción. o urea. etc. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento . En orina. La cantidad de uratos excretados varía normalmente de 250 a 750 mg / 24 hrs. que es el más común de los desórdenes del metabolismo de las purinas.En tres tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas marcadas B (Blanco). del grado de eliminación de ácido úrico. colocar: B S D Standard 50 ul Muestra 50 ul Reactivo de trabajo 2. También existe hiperuricemia proveniente de la destrucción excesiva de células (material nuclear) en leucemias y linfomas.

4. CUESTIONARIO: 1. . IV. Señale la deficiencia parcial enzimática que ha sido encontrada en algunos pacientes con gota. el sexo y las diferentes dietas. 3. con ingesta normal de proteínas. Cuál es la fisiopatología de las hiperuricemias. 6. Y dónde se realiza esta síntesis. incluso se ha observado una variación estacional. ¿Cómo explica el uso del alopurinol en el tratamiento de la gota? ¿Cuál es el proceso de la artritis y de la formación de los tofos en la gota? Explique por qué existe hiperuricemia en las enfermedades de leucemia. 2. 5. se observan los siguientes rangos de valores: Hombres: 26-60 mg/l Mujeres: 20-50 mg/l Los valores de ácido úrico varían de acuerdo a la edad.71 - CALCULO DE RESULTADOS: Acido Urico (mg/dl) ! D v f donde " f " ! 100 mg/dl S - VALORES DE REFERENCIA: En adultos normales. Cómo se sintetiza el ácido úrico.

El suero es depurado de creatinina en el riñón por filtración glomerular proporcionando una buena base para el test de clearance. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento III. ya que los niveles de creatinina sérica dependen del grado de excreción. como las glomerulonefritis o la nefropatía diabética o post renal. las que pueden ser de origen pre renal como el shock o la insuficiencia cardíaca.0 mol/l . La creatinina urinaria disminuye en la insuficiencia renal y es útil para medir el grado de filtración glomerular y lo poco que es transferido a través de las células tubulares.5 a 1. y es excretada en una cantidad casi constante. como las uropatías obstructivas La creatinina en medio alcalino reacciona con el ácido pícrico para dar un tautómero de picrato de creatinina de color anaranjado (reacción de Jaffe). renal. La concentración normal en suero varía de 0.Reactivo 1: Hidróxido de sodio 0. La determinación de hace de ordinario en un filtrado libre de proteínas obtenido a partir del suero. Aproximadamente 2% de la creatina fosfato muscular es convertida en creatinina diariamente. Usando métodos enzimáticos para determinar específicamente creatinina y comparando con los valores obtenidos por la reacción de Jaffe en personas normales y nefriticos se encuentra que la creatinina verdadera del suero comprende aproximadamente un 90% del total. catabolismo de proteínas.72 REUNION DE LABORATORIO N° 13 PRACTICA N° 28 DETERMINACION DE CREATININA SERICA EN PERSONAS SANAS Y NEFROPATAS I. . hace remarcable la necesidad de usar suero y no sangre total para la determinación de creatinina por el método colorimétrico. . Elevadas concentraciones se producen solamente cuando la función renal está muy alterada y aunque el mismo tipo de información acerca del diagnóstico y pronóstico se obtiene por la determinación de nitrógeno ureico o creatinina. siendo la producción endógena constante.5 g/24hs. la cantidad total depende de la masa muscular. aumenta en el cuerpo humano fundamentalmente por síntesis.1. la cual puede alterarse por diversas causas. esta última determinación se prefiere porque proporciona mayor información relacionada con el estado de la función renal. INTRODUCCION: La creatina. 9 . las variaciones fluctúan entre 0. Esto. sexo o ejercicios. La cantidad eliminada por las personas del sexo masculino generalmente es más grande que en las de sexo femenino. La creatina fosfato se forma en los miocitos y es un compuesto importante como fuente de energía en la contracción muscular. La creatinina es un constituyente habitual de la orina. edad. mientras que en eritrocitos sólo corresponde a un 40%. REACTIVOS A UTILIZAR. II. La concentración de creatinina en suero no es afectada por la dieta. precursora de la creatinina. La determinación de creatinina tiene utilidad en la práctica médica para la evaluación de la función renal.Standard: Solución de creatinina 2 mg/l.4 mg /100 ml. El clearence de creatinina normal es mayor de 100 ml / min. La creatininuria es determinada mediante el método enzimático.Reactivo 2: Acido pícrico 4. aunque una pequeña cantidad pre formada es ingerida con los alimentos. Es excretada fundamentalmente por el riñón el cual clarifica el plasma de creatinina. La creatinina es fácilmente difusible y es igualmente distribuida en el agua corporal.16 mmol/l .

CUESTIONARIO: 1. Haga dibujos del procedimiento. CALCULOS: ¨A Muestra (A2-A1) y ¨A Standard (A2-A1) CALCULOS: SUERO/PLASMA : ¦ ¦ Creatinina(mg/dl)! ORINA : Creatinina(mg/dl)! Standard(mg/dl)A v? A Standard A Muestra A Muestra CLEARANCE DE CREATININA : /100 ?mg/min/1. 3.73m2A ! mgcreatinina mlOrinav mlorina/24h mgcreatinina ml suerov 1440 /100 VALORES REFERENCIA: DE SUERO/PLASMA: Mujeres Varones ORINA: Mujeres Varones Clearance de Creatinina: Mujeres Varones IV. Incubar exactamente por 2 minutos y leer A2. luego agregar: Reactivo 2 250 ul 250 ul 250 ul Llevar el espectrofotómetro a cero con el blanco.3 mg/dl 11 ± 20 mg/kg/d 14 ± 26 mg/kg/d 95 ± 160 ml/min/1. En tubos de ensayo marcados B (Blanco).6 ± 1.1 mg/dl 0.73 m2 98 ± 156 ml/min/1. S (Standard). Incubar 5 minutos a 20-25 °C/30 °C/37 °C. Mezclar. Explique por qué se incrementa la creatinina en tres estados patológicos que conozca. A que se denomina clearence de creatinina y que importancia tiene. su determinación. 2.73 PROCEDIMIENTO En caso de que la muestra a utilizar sea en suero. ¿Qué información o presunción obtiene al dosar la creatinina sérica? ¿Por qué se prefiere la determinación de creatinina urinaria a la de nitrógeno ureico? Interprete y explique el procedimiento de la práctica. ¦ ¦ Standard(mg/dl)Av 50 v? A Standard 0. 4. Incubar 1 minuto a 20-25 °C y leer A1. 5.9 ± 1.73 m2 . M (Muestra) Componentes Blanco Standard Muestra Reactivo 1 1000 ul 1000 ul 1000 ul Muestra --------50 ul Standard ----50 ul ----Mezclar.

son muy similares. en personas normales y / o con procesos patológicos.00 Incubar 5 minutos a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C). es el principal producto final del catabolismo de las proteínas y se distribuye en todos los tejidos. suero o plasma. REACTIVOS A UTILIZAR. La finalidad de la presente práctica es cuantificar la uremia por el método de la ureasa. La urea en el plasma es filtrada por los glomérulos renales.00 1. Este método es altamente específico y aunque está basado en reacciones de urea. éste reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimétricamente.Reactivo de salicilato.Reactivo hipoclorito.01 Standard (ml) ----0.Solución standard III. . ésta transforma a la urea en carbonato de amonio y con la adición del reactivo de Nessler el amoníaco liberado forma un compuesto de color amarillo bruno cuya intensidad se mide en fotocolorímetro.00 1. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento PROCEDIMIENTO Componentes Blanco Standard Desconocido Muestra (ml) --------0.00 1. . Las concentraciones de urea en sangre total. II. La uremia es determinada colorimétricamente por el uso de ureasa. pero en condiciones normales aproximadamente el 40% de este filtrado regresa p difusión a la sangre. La concentración de la urea en la corriente sanguínea es el resultado del balance entre el grado de degradación de las proteínas y el grado de eliminación por los riñones.14 = UREA En sentido inverso. El grado de azoemia depende de la extensión y tipo de lesión renal.00 Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente (20 a 25 °C) o 5 . Cuando el nitrógeno ureico es determinado por el método de la ureasa. La or importancia clínica de la urea viene del hecho de una elevada concentración sanguínea puede estar asociada con una mala función renal.01 ----Reactivo de trabajo (ml) 1. Los valores normales de urea en suero (como nitrógeno ureico sanguíneo o BUN) es de 9 ± 19 mg/100 ml. INTRODUCCION: La urea es sintetizada en el hígado. . . o 3 minutos a 37 °C. Agregar a cada tubo: Reactivo hipoclorito (ml) 1. conociendo los valores de urea. Los valores de urea se mo reportan siguiendo la siguiente fórmula: Nitrógeno ureico sanguíneo x 2. es convencionalmente reportado co nitrógeno ureico.Suspensión de ureasa. se informa el BUN según la siguiente fórmula: Urea x 0.74 PRACTICA N° 29 CUANTIFICACION DE UREA EN SANGRE I.00 1. La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoniaco. Normalmente no tiene función útil en el organismo. es excretado casi enteramente por los riñones.4665 = Nitrógeno ureico sanguíneo Los riñones eliminan diariamente entre 20 a 40 gramos de urea.

4.7 mg/dl 7 a 14 g/24 hrs. : 4. CUESTIONARIO: 1. 5. ¿Qué importancia clínica tiene para usted. ¿Qué alteraciones en las concentraciones séricas de úrea y NH4+ podrían encontrarse en el coma hepático? ¿Cuál es la importancia metabólica de la existencia del ciclo de la ornitina en el hígado de los seres humanos? ¿Cuál es la importancia metabólica que en el hígado humano exista una relación entre el ciclo de los ácidos tricarboxilicos y el ciclo de la ornitina? 10 a 50 mg/dl : 15 a 30 g/24 hrs. Leer las absorbancias dentro del plazo de una hora CALCULOS: FACTOR ! 66 Absorbancia Standard Urea (mg/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: SUERO/PLASMA: Urea : Nitrógeno Ureico ORINA: Urea : Nitrógeno Ureico IV.75 minutos a 37 °C.5 a 22. 2. 6. Señale las características comunes que se encuentran en los efectos enzimáticos hereditarios del ciclo de la úrea. . 3. conocer las concentraciones séricas de úrea? ¿Qué influencia tiene la ingesta proteica sobre la concentración sérica de úrea? En relación a las concentraciones séricas de úrea y NH4+.

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente esquema de incubación: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0. INTRODUCCION: La remoción del grupo amino de las L-aminoácidos es el primer paso en la degradación metabólica general de estos compuestos (catabolismo).4 .1% en HCl 2 N.76 PRACTICA N° 30 DEMOSTRACION DE LOS PROCESOS DE DESAMINACION OXIDATIVA DE LOS L-E-AMINOACIDOS I.0 1.5 1. La presencia de estos cetoácidos se debe fundamentalmente a los procesos de transdesaminación y desaminación del ácido glutámico (transdesaminación) que se estimula fundamentalmente y en mucha menor proporción por desaminación de la L-Alanina por la acción de la L-aminoácido. Filtrar y medir a otros tubos previamente marcados: .0 0.0 3. todo el nitrógeno amino proveniente de los aminoácidos que puede experimentar transaminación se puede concentrar en el glutamato.0 0.0 3. .2M .Acido tricloroacético al 10% .1 M pH 7.0 0. . Dos sistemas enzimáticos de transaminación: la alanina piruvato transaminasa(ALT) y la glutamato alfa-cetoglutarato transaminasa (AST) catalizan la transferencia de grupos amino de la mayor parte de los aminoácidos para formar alanina a partir del piruvato o glutamato a partir de alfa-cetoglutarato. REACTIVOS A UTILIZAR.5 III 4.2M Agua destilada Homogeneizado de hígado Colocar en baño maría a 37°C durante treinta minutos. Puesto que la alanina es también sustrato para la reacción de glutamato transaminasa.Buffer fosfato 0.0 3. Esto es importante porque el L-glutamato es el único aminoácido en el hígado que experimentan desaminación oxidativa a una tasa apreciable y esta reacción se cataliza por la L glutamato deshidrogenasa. II.5 1.5 TUBOS DE ENSAYO II 4. La finalidad de la práctica es demostrar los procesos de desaminación (oxidativa o no) que sufren los L aminoácidos en el hígado utilizando a la L-Alanina como un ejemplo de éstos y al 2-4 Dinitrofenilhidrazina como indicador de los cetoácidos formados provenientes de la desaminación.Homogeneizado de hígado o riñón de rata 10% y conservado en baño helado.NaOH: solución 2N .4 Solución L-alanina 0.2-4-Dinitrofenilhidrazina: solución 0. Añadir ácido tricloroacético al 10% Mezclar y añadir agua destilada I 4.0 1.1M pH 7. Si se agrega una determinada cantidad de L-alanina a un homogeneizado de hígado después de un período de incubación (30 minutos) podemos demostrar que se ha producido desaminación si encontramos determinada cantidad de cetoácidos (ácido pirúvico y ácido alfa-cetoglutarato) los que pueden ser identificados frente a una solución de 2-4 Fenihidrazina en medio alcalino.5 III.0 1.L-alanina: solución 0.5 1.

IV. de los resultados de su práctica de laboratorio? .0 1.0 4.77 COMPONENTES (ml) Filtrado 2. CUESTIONARIO: 1 2 3 4 5 6 I 4.0 1.0 TUBOS DE ENSAYO II 4. ¿Cuál es la razón por la que se utiliza 2.0 1. Realizar las lecturas con el espectrofotómetro.0 Señale los sistemas enzimáticos flavinodependientes que producen desaminación oxidativa de los aminoácidos. De un ejemplo de desaminación oxidativa de un aminoácido. NaOH 2N Dejar en reposo durante 10 minutos.0 4.4-Dinitrofenilhidrazina solución al 1% Mezclar y dejar en reposo durante veinte minutos.0 4.0 III 4.4-Dinitrofenilhidrazina en el sistema? ¿Cómo explica usted los resultados fotocolorimétricos obtenidos en los tres diferentes tubos de experimentación del sistema? ¿Cuál es la importancia biológica de la desaminación oxidativa de los aminoácidos? ¿Qué conclusiones puede establecer usted.

En el escorbuto no tratado. VITAMINAS Y MINERALES REUNION DE LABORATORIO N° 14 PRACTICA N° 31 DOSAJE DE VITAMINA ³A´ El instructivo de la presente práctica se les proporcionará durante la práctica respectiva. una enfermedad caracterizada por debilidad. Ciertas células sin vitamina C no son capaces de producir o mantener sustancias de importancia intracelular. Para ello es necesario que los. el nivel plasmático de ácido ascórbico es inferior de 0. lesiones en las encías y ligera anemia. Aunque no se conoce con seguridad sus funciones metabólicas precisas hay pruebas que señalan su requerimiento para el metabolismo de la tirosina . Un excelente test clínico para la deficiencia de vitamina C es la determinación del promedio de resistencia capilar. Los síntomas son vagos y generalmente limitadas alteraciones del crecimiento de los dientes. Muchas de estas propiedades podrían depender de las propiedades reversibles de óxido reducción (redox) de esta vitamina (ácido ascórbico . Se estima que una ingestión diaria de 2. Antes de la intervención quirúrgica las cifras plasmáticas inferiores de 0. alimentos antes del cocimiento contengan 70 mg de vitamina C. La corteza suprarrenal. En los leucocitos la concentración es mucho mayor que en el plasma (15 mg/100 g) de capa blanca leucocitaria. INTRODUCCION: La vitamina C o ácido ascórbico es hidrosoluble y antiescorbútica. PROTEICOS.2 mg/100ml. hemorragias subcutáneas y sangrado de encías. En caso de alimentación deficiente. Esto puede ser hecho con un simple aparato para medir la presión sanguínea con la cual la presión dentro de los capilares se incrementa por la constricción de . la hipófisis y el ojo son espacialmente ricos en vitamina C. dolor de las extremidades. Las necesidades mínimas diarias de vitamina C son 10 mg y son preferibles 30 mg por día.ácido dehidroascórbico).1 gm/100ml y en glóbulos blancos menos de 2 mg/100 g. Se presenta en alimentos frescos y en vegetales. La única acción en el cuerpo es debido principalmente a que es una clase especial de agente reductor que influye en los procesos de óxido reducción. Casos subclínicos de deficiencia de vitamina C son muy comunes entre la población pobre de las grandes ciudades.2 mg/100ml o en glóbulos blancos a 8 mg/100 g indican una deficiencia importante que puede significar cicatrización tardía o dehiscencia de las suturas. PRACTICA N° 32 DOSAJE DE VITAMINA ³C´ I. La vitamina C es destruida rápidamente por el calor de cocimiento o la pasteurización. El principal resultado de tal deficiencia es el escorbuto.5 y 1. Se necesita también para la producción normal de fibrinas del tejido conectivo y de la sustancia del baso intercelular (por ello el aumento de fragilidad capilar en el escorbuto). Las intervenciones quirúrgicas dan lugar a disminuciones de 17 a 20% de contenido en el plasma y en glóbulos blancos.5 mg de ácido ascórbico para niños y 7.5 mg para adultos es suficiente para prevenir síntomas de deficiencia. Los nivelas ² plasmáticos en una población bien alimentada varían entre 5.78 V UNIDAD NUTRICION: REQUERIMIENTOS ENERGETICOS. el escorbuto clínico tarda 6 meses en manifestarse.

5 0. y Agregar 1.1 de la solución tioúrea. y Leer en fotocolorimetro (540 nm). ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento y Extraer más o menos 5 mi de sangre de la flexura del codo e introducirlos en frascos previamente oxalatados. Absorbancia se compara con patrones adecuados de ácido ascórbico. el acide dehisroascórbico se transforma rápidamente en ácido dicetoglucónico que se une a 2 dinitrofenilhidracina -4 para formar una hidrazona de color pardo. se tapan en tubos con papel parafinado y se colocan en baño de agua a 56°C durante una hora.).6 ml de agua destilada. y Standard de ácido ascórbico 2 ml/100ml. y El ácido ascórbico utilizado para preparar la solución patrón debe ser de grado analítico.4 0.5% III.5%. CÁLCULOS: Abs. En un pH ácido. y Solución de tioúrea al 10% en etanol al 50%. esta debe ser fresca (no después de 30 min.4 dinitrofenilhidracina. 0. mezclando: 5 ml del reactivo 2.Blanco NOTA: y El ácido ascórbico es muy inestable. Para la determinación del ácido ascórbico en sangre.4 - y Se mezclan los reactivos. 2 mi de ácido sulfúrico al Q5°o.5 0. y Dejar los tubos en reposo por 30 min. enfriando el hielo. y Acido sulfúrico al 85%.4 III 0. Transcurrido el tiempo se enfrian los tubos en baño de hielo durante 5 minutos. y Solución de sulfato cúprico al 1. total o plasma.2 mg/dl pueden preceder en 2-3 meses a la aparición de un escorbuto clínico. y Oxalato de litio al 6. Del Standard . y Reactivo de color.Blanco x 2. Del problema .79 la vena del brazo. por el método colorimétrico de Roe y Ructher modificado. y Los valores inferiores a 0. Se utilizará el método de Roe y Kutcher modificado para la cuantificación del ácido del ácido ascórbico en sangre. REACTIVOS A UTILIZAR: y Acido tricloroacético al 10& (P/V). Por ello es indispensable separa el plasma de ids glóbulos rojos y realizar el análisis sin tardar. Mezclar: COMPONENTES (ml) TUBOS Liquido sobrenadante de paso anterior Acido tricloroacético al 10% Standard de ácido ascórbico.1 mil de la solución de sulfato cúprico. Se prepara en el mismo dia de uso.5 = mg/dl Abs. II. El ácido ascórbico es estable durante varias horas en el filtro.4 dinitrifenilhidracina al 2% en ácido sulfúrico 9 N. Esta sufre rearreglo molecular en ácido fuerte dando un compuesto rojo. El propósito de la siguiente práctica es determinar la concentración de ácido ascórbico en el plasma de personas adultas normales o carenciales. La excreción normal diaria de vitamina C en orina de adultos varia entre 10 y 30 mg. y Agregar a cada tubo lentamente y mezclando. y Reactivos 2. Agua destilada Reactivo de color combinado I II 1 0. y Mezclar nuevamente. Por 6'ste procedimiento el ácido ascórbico del plasma o sangre es oxidado a ácido dehidroascórbico. Hemorragias que en la piel aparecen con excesiva frecuencia podrían indicar fragilidad capilar. .5 0. y 0.5 0.

hipertiroidismo. embarazo. lactancia e intervenciones quirúrgicas? 4. . Desde el punto de vista metabólico ¿Cómo explica que los requerimientos de vitamina C sean mayores en el curso de las enfermedades infecciosas. Mencione algunas funciones metabólicas importantes del ácido ascórbico. ¿Cómo explicaría que las dosis superiores a 1 g/dia pueden ocasionar hemolisis en portadores de deficiencia eritrocitica de G-6-P-deshidrogenasa? 5. CUESTIONARIO 1. neoplasias.80 IV. ¿Qué relaciones metabólicas podría mencionar entre el ácido fólico y Fe+++ en la producción de anemia en el escorbuto? 3. ¿Por qué las necesidades de vitamina C deben ser satisfechas en la dieta normal? 2.

De la misma manera. hidroxilamina clorhidrato. Buffer alcalino: buffer TRIS pH 8. INTRODUCCION: El hierro sérico es importante en el organismo porque es componente esencial de la hemoglobina encargada del transporte de oxígeno. El hierro forma parte de los centros Fe-S de la cadena respiratoria. así como de otras hemoproteínas como los citocromos ± componentes de la cadena respiratoria. etc. fiebre reumática. tumores. dado que no sólo es relativamente insoluble. enzimas y varios tipos de proteínas. hidroxilamina clorhidrato. aumento de Capacidad Total de Fijación de Hierro y disminución de la Saturación de Hierro  Anemia por deficiencia de hierro: microcítica hipocrómica. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACION DE HIERRO Armar el siguiente sistema Componentes Blanco (suero) Muestra Buffer Acido (ml) 2. defectos en el mecanismo de almacenaje. El hierro es absorbido en el intestino delgado como Fe2+ y su regulación ocurre a ese nivel y es transferido a la transferrina para su transporte sérico.5 2. El 90 % de anemias en las mujeres es por deficiencia de Fe. Solución Standard: Fe (II) en hidroxilamina clorhidrato 500 ug/dl III. lo que lleva a la disminución de la ferritina sérica  Disminución de hierro sérico.50 Reactivo color (ml) ----0. el hierro en uso.05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos.y la mioglobina. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm . etc.0 Reactivo color: ferrozina. La deficiencia de hierro pasa por tres estadios:  Deficiencia de los depósitos de hierro. II.50 0. y el circulante. El contenido de hierro en el cuerpo humano se encuentra distribuido en tres formas: el almacenado. su disminución se asocia entre otras patologías a problemas de absorción y almacenaje.81 REUNION DE LABORATORIO N° 15 PRACTICA N° 33 DETERMINACION DE HIERRO SERICO TOTAL Y TIBC I. sino que además es tóxico. La capacidad de fijación de hierro (TIBC) aumenta en casos de anemias ferroprivas y disminuye en las hemocromatosis. Prácticamente todo el hierro corporal se encuentra unido a proteína. dado que un aumento en sus niveles se encuentra asociado a diversas patologías tales como destrucción aumentada de los glóbulos rojos. etc. REACTIVOS A UTILIZAR: Buffer ácido: buffer acetato pH 4. que se encuentra en la hemoglobina.5 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) --------Muestra (ml) 0. que se encuentra dentro de las células. La evaluación de la concentración de hierro sérico es de gran utilidad.0.

Standard Abs. CUESTIONARIO: 1.Reactivo v 500 Abs.Bl.160 ug/dl  Mujeres : 40-150 ug/dl DETERMINACION PARA TIBC (capacidad de fijación de hierro) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Muestra Muestra Buffer Alcalino (ml) 2.standard Abs.82 Cálculos: Ferremia (ug/dl) ! Valores de referencia:  Varones: 50 .50 0. 5.00 2. 2.Bl.50 0. : : : 100 ± 400 ug/dl 250 ± 400 ug/dl 20 ± 55 % Señale al menos 5 funciones del hierro Causas de deficiencia de hierro Informe sobre estructura de la ferritina ¿Qué exámenes solicitaría para evaluar la deficiencia de hierro? ¿Qué importancia tiene medir la saturación de hierro? ©¨ § (ug/dl) ! Ferremia(ud/dl) I (ug/dl) ©¨ v 100 .00 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) 0.muestra Abs.Muestra Abs.50 Reactivo color (ml) ----0. 4.Bl.reactivo Abs. 3.50 Muestra (ml) 0.muestra % Saturación! Ferremia (ug/dl) TIBC (ug/dl) Valores de Referencia: TIBC: Hasta 6 años Sobre 6 años % Saturación IV.Bl. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm Calculos: UIBC (ug/dl) ! 500  TI v 500 Abs.05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos.Muestra Abs.

Se puede presentar concentración de cloruro disminuido (hipocloremia) en hipoventilación causada por: 1) depresión del sistema nervioso central. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES ESTANDAR PROBLEMA Estándar diluido 20 ul --Suero diluido --20 ul Reactivo de color 1 ml 1 ml Mezcla.4. 3) enfermedad pulmonar.Reactivo de Color 2.6 TPZ existente parcialmente como complejo Hg(II)+Sulfato de Hierro .Estándar de cloruro: 355 mg/dl III. Este tipo de alcalosis que es de tipo respiratorio resulta por hiperventilación que puede ser causada a su vez por: a) drogas. después de incubar 5 minutos a oscuras. b) enfermedades que producen estímulo del centro respiratorio como: histeria. 6) dieta alta en grasas o en ayuno prolongado el cloro es desplazado por los cuerpos cetónico por sobre producción de estos. SODIO Y POTASIO EN EL SUERO DE PERSONAS SANAS Y EN ESTADO PATOLOGICO DETEMINACION DE CLORO I. ansiedad. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Antes de la determinación el estándar y las muestras de suero deben ser diluidas en relación 1/50 con agua destilada (20 µL de muestra/1 ml de agua). No exponer a la luz CALCULOS Lectura tandard   ! 355 v Lectura uestra ?mg/dlA  . De todos los aniones es uno de los de más baja concentración en el líquido intracelular. d) excesiva ingestión de ClNH4 (cloruro de amonio) produce acidosis que puede ser seguida de altos niveles de cloruro sérico. Medir en el transcurso de 60 minutos la absorbancia de problema y estándar. c) algunos tipos de enfermedad tubular renal con acidosis pueden producir incremento del cloruro sérico. tensión de oxígeno disminuida (altura). INTRODUCCION: El ión cloro comprende aproximadamente el 65% del total de aniones del liquido extracelular. 2) parálisis de los músculos respiratorios. 4) enfermedad renal crónica.83 PRACTICA N° 34 DETEMINACION DE CLORO. En el suero normal el cloruro se encuentra en concentraciones que varían entre 100 y 106 mEqL. II. REACTIVOS A UTILIZAR: . 5) en la diabetes mellitus no controlada. igualmente sucede en el ClK. fiebre. La concentración de cloruro se puede incrementar (hipercloremia) en muchos casos como resultado del déficit primario de C02. todas estas alteraciones tienen exceso de C02 (que produce hipocloremia). 7) en hiper o en s hipofunción de las glándulas adrenales (corteza).

¿Puede señalar cinco causas de hipercloremia? 4.55) IV.84 VALORES NORMALES : 335 .383 mg/dl. ¿Qué influencia tiene la Aldosterona en el metabolismo del cloro? 2. (Convertir en mEq/l dividiendo entre 3. ¿Cómo explicaría usted. CUESTIONARIO: 1. la deficiencia acentuada del cloro en la enfermedad de Addison? 3. ¿Puede señalar cinco causas de hipocloremia? 5 ¿Cual es la relación de las alteraciones de la cloremia con el equilibrio ácido básico? .

y en niños es mayor. INTRODUCCIÓN Debido a la predominante concentración del ión sodio en el líquido extracelular éste influye sobre la presión osmótica que juega un rol preponderante en la distribución del agua entre el espacio extra o intra celular. en pacientes con diarrea. con pequeñas diferencias debido al equilibrio de Donnan. El ión sodio es importante en el mantenimiento del equilibrio ácido básico ya que constituye aproximadamente el 90% del total de cationes extra celulares. Se puede encontrar incremento de sodio con hiperosmolaridad en individuos con deficiencia predominante de agua corporal. La cantidad presente dentro de la célula no puede ser medida sin biopsio del tejido. En el suero. en mujeres hay sólo 39 mEq por kg. En el hombre adulto hay cerca de 43 mEq de sodio intercambiable por kg. cuando el líquido ingerido no es suficiente para eliminar la sobrecarga de solutos por el riñón. tratado sólo con insulina y solución salina. Algunos pacientes con enfermedad cerebral.85 DETERMINACION DE SODIO I. es el principal factor de regulación de este ion corporal y de sus concentraciones. Un adulto de 70 kg de peso contiene aproximadamente 80 g de sodio de los cuales 44 se encuentra en el % líquido extra celular y el 35% en los huesos. Puede ocurrir deshidratación con sodio sérico elevado. La concentración sérica es representativa de toda la concentración celular. si el líquido ingerido es insuficiente por razones anormales. Se observan concentraciones bajas si las concentraciones de sodio exceden a las del agua. por peso corporal. Del total de sodio corporal hay un 18% que fundamentalmente se encuentra en los huesos. El estado clínico de hidratación es importante para evaluar el significado de los niveles séricos de sodio. Diariamente y tiene acceso al suero por difusión a través de la mucosa intestinal o sea que cerca del 4% del sodio corporal total se recambia.diariamente. Tales valores no dan información acerca del volumen y distribución de la cantidad total presente ni de la cantidad intracelular existente. Pequeñas cantidades aparecen también en las heces. fístula intestinal. enfermedad renal con disfunción tubular. hay por lo tanto un 82% del total que es capaz de recambio y participa en las reacciones fisiológicas. El exceso de sodio se elimina por el riñón. como en el coma diabético. El suero o plasma contiene más del 90% del sodio total de la sangre. es aparentemente inerte (no ionizable). el sodio esta en equilibrio con el del líquido intersticial. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante: Acetato de uranilo más acetato de magnesio  Reactivo de color: tioglicolatop de amonio  Standard de sodio: 50 mmol/l . sulfato y otros aniones (sales). La concentración sérica normal es de 135 a 145 mEq por L (310 A 340 mg%). sudor y saliva. La determinación del sodio de los fluidos biológicos se realiza sea por electrodo ión selectivo o menos frecuentemente por método colorimétrico II. El riñon puede regular la excreción de sodio y agua por lo tanto. en diabetes mellitus no controlada. El ion sodio es ingerido en los alimentos en combinación con el cloro fosfato. pacientes con diarrea. En condiciones anormales pueden ser muy considerables las pérdidas de agua por el sudor u otr s o fluidos. por ejemplo en pacientes con diabetes insípida no controlada. El sodio se excreta casi exclusivamente en la orina. alimentación nasogástrica con alto contenido de proteínas. Son ingeridos cerca de 3 gr. Como sucede con el agua corporal los valores varían inversamente con la grasa corporal.

¿Cuál es el principal factor de regulación del ion sodio corporal? 3. Después de 5 a 30 minutos medir las absorbancias contra agua destilada a 405 nm CALCULOS: Factor: 150 /Lectura Bco Reactivo-Lectura Standard Na (mmol/l)= (Lectura Bco Reactivo-Lectura Muestra) x factor IV.86 III. 5. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (PROCEDIMIENTO) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco de Standard Problema Reactivo Standard 20 ul Problema 20 ul Precipitante 1 ml 1ml Tapar los tubos y mezclar cuidadosamente. Señale las concentraciones séricas normales. ¿Qué semejanza existe en la absorción intestinal de este ion y la glucosa? 4. ¿Por qué la clasificación de deshidratación por alteración de la osmolaridad. Emplear el sobrenadante Precipitante 20 ul Sobrenadante 20 ul Standard Sobrenadante 20 ul Problema Reactivo de color 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar bien. CUESTIONARIO: 1. Dejar reaccionar durante 30 minutos Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). Dejar reaccionar durante 5 minutos Agitar fuertemente por 50 segundos. ¿Cuál es la importancia biológica del ion sodio? 2. incluye básicamente las concentraciones de esté ion? .

El potasio es rápidamente removido del líquido extracelular después que es ingerido. en alcalosis con hiperventilación. en intoxicación temprana con salicilatos. Aproximadamente 293 gr. del cual el 98% es intracelular mientras que el 2% está presente en el liquido extracelular. Déficit de potasio corporal puede resultar en: Pobre ingestión de alimentos. Bajo condiciones de incremento de pH (alcalosis) asociado con la disminución de cloruros. pues la falta de esferoides adrenales provocan retención de potasio sérico. (3300 mEq) de potasio en un adulto de 70 kg.9 mEq/L. El déficit de potasio celular es reflejado en los hallazgos séricos y bajo estas condiciones la regla es hipopotasemia debido a la elevada excreción urinaria de cloruro de potasio. se produce intercambio entre el sodio intersticial y el potasio intracelular. El potasio se pierde en el cuerpo principalmente en la orina aunque pequeñas cantidades son perdidas en la respiración insensible. De potasio en forma de sal son ingeridos diariamente y recambiados con el potasio corporal. Los niños tienen relativamente menos contenido de potasio por kilogramo de peso debido a que la relación de agua intracelular/extracelular es menor que en adultos. en deshidratación. Bajo estas condiciones el potasio se eleva si el riñon no puede excretar esta sobrecarga. cerebro y de los glóbulos rojos se recambia más lentamente que en otros órganos. influye activamente en el metabolismo celular ya que es cofactor de muchas reacciones enzimáticas intercelulares. El potasio del hueso. Se produce hiperpotasemia con pérdida intracelular de potasio cuando la permeabilidad de la membrana celular está alterada por lesión tisular. El 95% del total del potasio corporal es intercambiable aunque el grado de recambio de cada tejido varía en los diferentes órganos. diarrea o fístula gastrointestinal segundo por excreción urinaria incrementada en individuos con anormalidades tubulares renales. Además de este rol pasivo. la excesiva destrucción de células del cuerpo y la utilización de proteínas para propósitos calóricos se acompañaría de pérdida de potasio celular. La concentración de potasio en el suero de personas normales es de 3. en mujeres solamente 40 mEq por kilogramo de peso. en administración continua de glucosa endovenosa y terapia salina. La concentración de potasio intracelular varia con los cambios del agua que gene ralmente acompaña a las alteraciones de los niveles de sodio extracelular. el potasio es liberado de las células y excretado dando como resultado hipopotasemia.5 -5-3 mEq/L. Entonces el 2<26 del total del potasio corporal son recambiados diariamente. Existe aproximadamente 130 gr. en íleo paralitico y anastomosis intestinal no funcionante. en hiperfunción adrenocortical o sobredosis de cortisona o ACTH. En los niños donde la ingestión de potasio es relativamente más grande.87 DETERMINACION DE POTASIO I. son perdidos a través del vómito. en hipoventilación tanto central como periférica cuyo incremento de potasio es frecuente. Hiperpotasemia se puede encontrar en: Shock o falla circulatoria de cualquier causa. en insuficiencia de la corteza adrenal. así mismo en algunos casos de . Excesiva cantidad de potasio puede liberarse del cuerpo bajo dos condiciones: primero cuando las secreciones intestinales con su contenido relativamente alto de potasio. Existe también una pérdida lenta de potasio de los glóbulos rojos hacia el suero cuando la sangre permanece guardada. esto es debido a que la excreción de potasio por orina se mantiene constante. asi mismo en algunos casos de insuficiencia renal se encuentra elevada la concentración de potasio. en la diabetes no controlada. el recambio diario es de 14%. INTRODUCCIÓN El potasio es el principal catión intracelular y por lo tanto es un factor importante de la presión osmótica que determina la distribución de agua entre las células y el líquido extracelular. varían entre 4-5. en recién nacidos los niveles son algo más altos. en fístulas gastrointestinales y vómitos. en adultos masculinos hay aproximadamente 46 mEq de recambio de potasio. Del sue el ro potasio es transferido el líquido intersticial antes de penetrar a las células o al filtrado glomerular a través de la membrana de los capilares glomerulares del riñón. Se debe evitar la hemolisis en la toma de muestras de sangre porque el potasio puede ser liberado de los eritrocitos lisados. Con ingestión calórica inadecuada y la utilización de proteínas celular para propósitos calóricos.

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insuficiencia renal crónica. II. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante :ácido tricloroacético  Reactivo TPB-Na: tetrafenilborato de sodio  NaOH  Estándar de Potasio III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): 1. Precipitación: en un tubo de ensayo pequeño añadir 50 ul de suero y 500 ul de reactivo precipitante. Mezclar cuidadosamente. Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). 2. Armar el siguiente sistema: Componentes Reactivo de trabajo Standard Sobrenadante Standard 1 ml 100 ul 100 ul Problema 1 ml

Para producir una turbidez homogénea el Standard y el sobrenadante transparente deben de ser agregados en el centro de la superficie del reactivo de trabajo Mezclar cuidadosamente Dejar reposar por lo menos 5 minutos Medir las absorbancias dentro de los 5 y 30 minutos CÁLCULOS: Factor: 5/Lectura del Standard Problema: lectura del problema x factor VALORES NORMALES: Suero de 3.5 a 5.5 mmol/l IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es el principio o fundamento del método de Hoffman para determinación del potasio sérico? 2. ¿Cómo explica metabólicamente la influencia sobre la concentración sérica de potasio producida por la administración de glucosa e insulina? 3. Explique usted los efectos metabólicos de la aldosterona en la excreción renal de potasio. 4. De ejemplos de hiperpotasemia y de hipopotasemia

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PRACTICA N° 35
DETERMINACION DE CALCIO SERICO
I. INTRODUCCION: El calcio sérico se encuentra en dos formas: Una combinada con proteínas séricas, inactivo e incapaz de difundir a través de las membranas de los capilares. Y la forma no unida a las proteínas, es principalmente iónico, difusible y activo. Varios factores influyen en la concentración de calcio sérico total. La hiperproteinemia está asociada con una elevación en los niveles de calcio, mientras que la hipoproteinemia se acompaña con disminución de la concentración de calcio; sin embargo la concentración de calcio ionizado no se altera. El calcio ionizado se altera en las siguientes situaciones: 1) Por variaciones del pH sérico; la alcalosis tiende a disminuir el calcio y la acidosis tiende a incrementarlo. 2) La ingestión de vitamina D aumenta el calcio ionizado a través de la absorción de calcio y por la excreción del fósforo. 3) La hormona paratiroidea es el factor más importante que controla los niveles de calcio sérico y su efecto es casi exclusivamente limitado a la forma iónica del calcio. La concentración del calcio sérico en individuos normales es de 9 a 11,5 mg por 100 ml Aproximadamente 4,5 a 5,5 mg% es ionizado y cerca de 0,5 mg% está presente como citrato de calcio y el resto se encuentra unido a las proteínas. El propósito de la presente práctica es determinar la concentración sérica de calcio total en personas adultas normales y/o en estado patológico por el método colorimétrico directo

II.

REACTIVOS A UTILIZAR: - Buffer alcalino: buffer lisina pH 11,1 - Reactivo de Color: 8-hidroxiquinolina, o-cresolftaleina-complexona, ácido clorhídrico - Solución estándar de calcio: 8 mg/dl

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Standard Muestra Muestra --------20 ul Standard ----20 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar y medir la absorbancia de la muestra (¨A muestra) y del Standard (¨A Standard) contra el blanco en un lapso de 5 a 30 minutos CALCULOS: A muestra C ! 8v ?mg/dlA A standard VALORES DE REFERENCIA: Suero o Plasma: 8,1 ± 10,4 mg/dl 


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IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es la importancia biológica del calcio en el ser humano? 2. ¿Cuáles son las formas de calcio sérico? 3. ¿Cuáles son los factores que controlan los niveles de calcio sérico? 4. ¿Cuál es la concentración normal de calcio sérico total? 5. Señale algunas alteraciones fisiológicas y/o patológicas que producen alteraciones de los niveles séricos de calcio.

2. Cuidar que las gotas de sangre caigan directamente en las soluciones salinas.5% EXPERIMENTO N°2 . .2H2O (4. Las células esferociticas se rompen más rápidamente que las demás y de hecho la prueba de la fragilidad osmótica puede ser considerada como un índice más sensible que la de la magnitud de eritrocitos a la lisis en solución hipotónica. Utilizar heparina como anticoagulante de elección.NaCl al 8. El uso de anticoagulantes del tipo de los oxalatos que comprende la adición de sales osmóticamente activas son indeseables. La muestra debe ser procesada tan pronto como sea posible después de tomada. . anemia falciforme y en la anemia hipocrónica ordinaria (ferropénica). lo que se conoce con el nombre de fragilidad osmótica de los eritrocitos (0.91 PRACTICA N° 36 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS ERITROCITOS : PRECAUCIONES: 1.Na2P04 (27. de allí que se emplee el término de fragilidad. . Demostrar la fragilidad osmótica de los eritrocitos cuando éstos son colocados en diversas soluciones de CINa de diversas concentraciones. REACTIVOS A UTILIZAR: EXPERIMENTO N°1 . cuando estos son puestos en soluciones hipertónica e hipotónica respectivamente. 4.5 .31 g).5% .Heparina III.NaCl al 4. Sin embargo en ciertas anemias hemolíticas adquiridas. Sin embargo cuando los eritrocitos son colocados en solución hipotónica aceptan líquido (hinchándose) hasta que se alcanza el equilibrio osmótico o hasta que se rompen.Cloruro de sodio (180 g).NaH2 PO4. . no deben hacer contacto con las paredes de los tubos secos porque estos pueden causar . Si utilizamos una serie de soluciones de CINa de concentraciones gradualmente progresivas es posible comprobar que la hemolisis de los eritrocitos se producen dentro de ciertos limites de hipotonicidad. La presente práctica tiene la finalidad de: Verificar el desplazamiento de agua desde el medio extracelular hacia el medio intracelular y viceversa en los eritrocitos.86 g).0.Solución salina amortiguada concentrada 10%. Cuando éstos son colocados en una solución hipertónica pierden líquido arrugándose y destruyéndose hasta que se establece el equilibrio osmótico con el líquido circulante.NaCl al 15%.3%). Aunque en la prueba de la osmosis la ruptura de las células resulta de la alteración de su forma y disminución de su resistencia a las fuerzas osmóticas más que a un cambio en la composición de la célula o su osmolaridad. La muestra de sangre debe ser obtenida con un mínimo de estancamiento y de trauma. 3. es observada en la talasemia. INTRODUCCION: La membrana de los eritrocitos es semipermeable. . Se afora con 2 litros de agua destilada y se conserva a 0° C (dura varios meses). II. la resistencia de los eritrocitos a las soluciones hipotónicas disminuye.

50 0. Utilizando con precisión una pipeta para hemoglobina o una pipeta Pasteur calibrada. Colocar cantidades similares de sangre control del sujeto normal en cada uno de los tubos de una segunda hilera. en tubos heparinizados.40 6 2.00 1. objetivado por el color rojizo pálido que toma el líquido sobrenadante en los tubos centrifugados.70 12 4.75 2.75 0.50 1.60 10 3. 4. La sangre del paciente y del sujeto normal son tomadas. 5.20 3 1.10 2 1. EFECTO DE LAS SOLUCIONES HIPERTÓNICAS E HIPOTONICAS SOBRE LA INTEGRIDAD DE LOS ERITROCITOS: (Verificar por inferencia el desplazamiento del agua entre los medios intra y extracelular.45 7 2.25 2. con las precauciones señaladas.55 9 3. Volver a mezclar y luego centrifugar a 2000 rpm.00 0.02 ml de sangre del paciente a cada uno de los doce tubos de una primera hilera.80 2. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 1 y 3 de cada mesa de trabajo). Utilizando lancetas descartables o lanceta de Link estéril pinchar el dedo.50 8 2. Observar que la fragilidad globular media de los eritrocitos se produce entre los tubos 5 y 6 (0.50 0.50 2.00 4. añadir 0.25 1. Proceder de la siguiente manera: Láminas (gotas) I II III . por acción de soluciones salinas de diferente concentración).35 5 2.00 0. Mezclar correctamente cada tubo y dejar a temperatura ambiente por 30 minutos. Conviene preparar una solución al 1% a partir de la solución concentrada al 10% y armar la siguiente serie de tubos: N° de NaCl al 1% Agua destilada % de NaCl tubo (ml) (ml) 1 0. 6.00 2.50 3. Procedimiento: Realizar asepsia del pulpejo del dedo escogido de la mano. Se debe rotar cada muestra suavemente en el tubo hasta que el color sea rojo brillante (plenamente oxidado). LECTURA: Observar cuidadosamente y marcar los tubos donde se inicia la hemólisis.40 y 0.00 0.50 4.00 0. Marcar el tubo donde la hemólisis es completa (color rojo intenso).00 3.75 0.50 0.30 4 1. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 2 y 4 de cada mesa de trabajo). con un algodón empapado en alcohol yodado.50 0. PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES Las diluciones se pueden preparar inmediatamente antes de la prueba: 1. Mezclar el contenido de cada tubo antes de agregar la sangre.75 3.65 11 3. 3.92 hemólisis.25 0. Anotar los resultados. 7. Depositar una gota de sangre en cada una de las tres láminas porta-objeto.25 0.45% de NaCl).

De acuerdo a los valores normales del test de fragilidad osmótica de los eritrocitos.5% Mezclar bien. Establecer las comparaciones morfológicas y/o lisis de los glóbulos rojos en rel ción a cada tipo de a soluciones empleadas en cada caso. IV. señale la concentración o porcentaje de NaCl del tubo en el cual empezó la hemólisis. Según observación cuidadosa. Señale causas de alteraciones en la fragilidad osmótica. ¿Cuál es la relación normal existente que permite la forma de disco bicóncavo del eritrocito? B. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuáles son las relaciones normales existentes para la formación de los esferocitos y de las células tipo tiro al blanco? (target cell). Si el test de fragilidad osmótica de los eritrocitos de un modo general evalúa la relación entre el área superficial y el volumen de la célula. 1 2 - 1 2 - 1 2 Utilizando el microscopio observar los eritrocitos de cada una de las láminas. Anotar los resultados. 2.93 Sangre del pulpejo de dedo Solución isotónica de CINa 8. así mismo el tubo en donde la hemólisis fue completa. 3.5% Solución hipertónica de CINa 15% Solución hipotónica de CINa 4. . diga: A. 4. señale los porcentajes de inicio y finalización (total) de la hemólisis.

en la superficie de los eritrocitos del donador (Prueba indirecta de Coombs). Algunas personas son poseedoras de un antígeno de superficie designado en forma arbitraria como antígeno A (eritrocitos tipo A). en la Prueba de Paul-Bunnell (Prueba de aglutinación en pacientes con mononucleosis infecciosa). bastante reproducibles y sumamente sensibles. como el tifus endémico). Por lo general la aglutinación puede observarse a simple vista. Al igual que las reacciones de precipitación las pruebas de aglutinación requieren de un pH apropiado y de la moralidad de amortiguadores salinos y debe existir una proporción adecuada de antígeno respecto del anticuerpo. Pasteurella).).94 PRACTICA N° 37 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. Se denomina reacción de aglutinación al fenómeno en que la mezcla de las partículas de antígeno con los antisueros específicos provoca una agrupación de dichas partículas antigénicas. dirigidos contra el mismo antígeno. etc. En la membrana de los glóbulos rojos de cualquier persona normal se pueden encontrar determinados antígenos (antígeno de superficie o determinantes antígenos). en el diagnóstico de las anemias hemolíticas por autoinmunidad (en la que los pacientes producen anticuerpos para las membranas de sus propios eritrocitos). Algunas personas . INTRODUCCION: Frecuentemente los antígenos se asocian con partículas que son demasiado grandes para formar soluciones o suspensiones coloidales en los medios acuosos. en la Prueba de Weil Felix (en pacientes con enfermedades provocadas por Ricketsias. En otras palabras. en las condiciones empleadas en la prueba. con cinco sitios eficaces de fijación de antígeno por cada moléculas de 19S tengan una actividad aglutinante superior a la de los anticuerpos IgG con dos sitios de fijación de antígeno por cada molécula. El mecanismo de una reacción de aglutinación es semejante al de las reacciones de precipitación. Las pruebas de aglutinación tienen muchos usos en el laboratorio clínico. Los anticuerpos de las distintas clases de inmunoglobulinas difieren en su capacidad de producir reacciones de aglutinación. para descubrir la presencia de anticuerpos del receptor. eritrocitos. Estas diferencias dependen principalmente de la valencia del sitio de fijación del antígeno en las diversas clases de los anticuerpos. ambos tipos de reacciones se producen por medio de anticuerpos multivalientes que se combinan con partículas de antígeno formando complejos de antígeno anticuerpos. pero en algunos casos se necesita el examen microscópico de la preparación estudiada. otras personas tienen otro tipo de antígeno de superficie que se llama antígeno B (eritrocitos tipo B). pueden quedar suspendidas en una solución salina y mezclarse con antisueros específicos. etc. Brucella. La concentración del anticuerpo aglutinante se define como la mayor dilución de antisuero que aglutina el antígeno examinado.1 Ugr de anticuerpos/ml de suero Las pruebas de aglutinación se utilizan rutinariamente en las pruebas cruzadas con sangre antes de administrar transfusiones endovenosas en pacientes. tanto para medir antígenos como para determinar las concentraciones de los anticuerpos. La única diferencia entre una reacción de precipitación y otro de aglutinación es que los antígenos son moléculas pequeñas en tanto que los antígenos aglutinantes están asociados con partículas de mayor tamaño. en la Prueba de Widal (en pacientes infectados con bacterias gram negativas como Salmonella. Por lo tanto no es sorprendente que los anticuerpos IgM. en la prueba del factor reumatoideo (en pacientes con artritis reumatoides). En general las pruebas de aglutinación son fáciles de prac ticar. partículas de látex. Estas partículas (bacterias. una baja concentración de anticuerpos IgM produce una reacción de aglutinación cuya intensidad es igual a la que se produce con una elevada concentración de anticuerpos IgG. en pruebas inmunitarias del embarazo. En efecto dichas pruebas permiten habitualmente descubrir hasta 0.

CUESTIONARIO: 1. Como existe un desarrollo gradual de estas isoglutininas. Observar si hay o no aglutinación de los glóbulos rojos en 1 y/o en 2 de isoaglutininas en el suero problema del estudiante y deducir el grupo sanguíneo que posee. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo B sobre la gota de suero con marca 2 y mezclar. Por otra parte. y Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos y descartar el plasma. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. aunque quizá sea más realista una cifra de 5000.95 pueden tener ambos antígenos A y B (eritrocitos AB) y una cuarta posibilidad es que no tengan ninguno de los antígenos mencionados (eritrocitos tipo 0 o H). II. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo A sobre la gota de suero con marca 1 y mezclar. Los antígenos aparecen a comienzos de la edad fetal en cuanto se forman los eritrocitos . pero aumentan con rapidez su titulación en los primeros meses de vida. Utilizando los símbolos (+ )= positivo y (-)= negativo complete el cuadro de aglutinación de los grupos sanguíneos ABO: . Es un hecho bien conocido que muchas bacterias instestinales (salmonellas y shigellas) tienen antígenos que reaccionan en forma cruzada con los antígenos humanos AB0 (H). y Llevar los glóbulos rojos sedimentados con suero fisiológico por tres veces. y Preparar una suspensión al 5% de glóbulos rojos lavados. La misma lógica explicaría que una persona del grupo B forma sólo anti A y no anti B. ya que su propio antígeno A. del tipo A y B en solución salina fisiológica. y y y y IV. en el suero existe también normalmente anticuerpos contra los antígenos A y B. previamente identificadas. le ha conferido una tolerancia inmunológica específica hacia él. De acuerdo con esta hipótesis todos los recié nacidos n están expuestos a los antígenos A y B. porque producen aglutinación de los glóbulos rojos que poseen el correspondiente antígeno y porque los antígenos son de origen humano (iso=de una misma especie).  Identificación de isoaglutininas en suero: y De uno de los estudiantes de cada grupo (o masa) de trabajo. con hepsrina como anticoagulante. En cada extremo de una lámina porta objetos poner una gota del suero recientemente obtenido y marcar 1 y 2 respectivamente. REACTIVOS A UTILIZAR: y Kit para identificar grupos sanguíneos (Diagnóstica). tomar una muestra de sangre sin anticoagulante y obtener el suero por centrifugación. llamados isoaglutininas. Pero una persona del grupo A forma sólo anti B y no anti A. III. se ha sugerido que las inmunizaciones inaparentes durante la infancia y el comienzo de la niñez pueden ser responsables de la producción de anti A o anti B. y Obtener muestras de sangre tipo A y tipo B. Los antígenos de superficie A y B son llamados también aglutinógenos y se ha estimado que pueden haber hasta un millón de sitios antigénicos A o B en un solo hematíe.000. Estos anticuerpos (isoaglutininas) son del tipo IgH y son poco detectables en los sueros de los recién nacidos. para eliminar los anticuerpos inespecíficos adicionados a la superficie de los glóbulos rojos.

96 SUERO DEL GRUPO O B A AB ( ( ( ( AB ) ) ) ) ERITROCITOS DEL GRUPO A B ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( C ) ) ) ) 2. Diga usted ¿Por qué ya no es costumbre corriente utilizar sujetos de tipo O como ³donadores universales´ y personas de tipo AB como ³receptores universales´? 3. ¿Qué aplicaciones de las reacciones antígeno anticuerpo puede señalar? 5. SANG) A B O AB ANTICUER. (G. ¿Cuál es el fundamento de las reacciones antígeno-anticuerpo? . En el siguiente cuadro anote los anticuerpos en el suero: GRUPOS SANGUÍNEOS ABO ANTIGENOS EN LOS POS ERITROCI. EN EL SUERO Anti Anti Anti Anti POSIBILIDADES DE TRANSFUSIÓN Puede recibir Puede donar De A AyO ByO O Todos (receptor Universal) A y AB B y AB Todos (donador Universal) AB 4.