ALUMNO (a

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PRESENTACION
Los profesores de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la U niversidad Nacional de Trujillo, han actualizado la Guía de Práctica, donde el estudiante encontrará una breve introducción de la importancia bioquímica y correlato medico de cada práctica, así como el procedimiento a desarrollar, finalizando con un breve cuestionario a fin de ampliar o concretar la aplicación de lo tratado. La Bioquímica es sin duda la ciencia que más ha aportado al desarrollo de la Medicina, basada en una rigurosa apl icación del método científico de la investigación

experimental. En la práctica, los alumnos a partir de los conocimientos adquiridos en los diálogos, seminarios y casos clínicos, tienen la oportunidad de plantear

interrogantes, contrastarlas con un experimento en forma ordenada, obten iendo resultados que al final se discutirán en grupo con el docente. También podrán conocer algunos métodos aplicados al diagnóstico clínico o al estudio nutricional. La práctica en Bioquímica, constituye un estímulo importante en el desarrollo de la investi gación experimental, permitiendo a nuestros estudiantes desarrollar habilidades y destrezas en trabajos de investigación y así obtener logros a nivel nacional para nuestra Facultad. Un recuerdo especial para los profesores que sentaron las bases para la actual guía de práctica como el Dr. Hugo Alpaca Muñoz, el Dr. Jorge García Ventura y un

agradecimiento a todos los docentes que de una u otra manera aportaron con sus conocimientos para disponer de esta herramienta que beneficiará a los alumnos de nuestra Facultad. Dr. CARLOS ARANCIBIA ARROYO Dra. MARIA DAYSI REYES BELTRAN Dr. JUAN VALLADOLID ALZAMORA Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA Dr. WALTER OBESO TERRONES Dr. ALFREDO LARIOS CANTO Dr. JORGE PLASENCIA ALVAREZ Dr. HECTOR RODRIGUEZ BARBOZA

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I UNIDAD SUBESTRUCTURA CELULAR: ENZIMAS Y BIOENERGETICA

REUNION DE LABORATORIO N° 01
PRACTICA N° 01
DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS
I. INTRODUCCION: La vida depende de una serie ordenada de reacciones químicas que son catalizadas por enzimas formadas para este fin. Las enzimas son proteínas relativamente frágiles con tendencia a sufrir desnaturalización e inactivación, es decir alteraciones en su conformación, por efecto de diversos agentes físicos y químicos como: temperatura, ácidos, álcalis fuertes, sales pesadas, pH, etc. Las enzimas se encuentran en pequeñas concentraciones en los materiales biológicos resultando , complicada su individualización o purificación. Para poder verificar directamente las propiedades comunes o similares de la naturaleza proteica que las caracterizan, experimentalmente se pueden utilizar las propiedades de catalizadores específicos que tienen las enzimas, como indicador de las alteraciones que pueden sufrir éstas cuando son sometidas a la acción de diferentes agentes físicos y químicos. De esta manera, sin necesidad de individualizar o purificar una determinada enzima se pueden verificar cómo los agentes físicos y químicos afectan la naturaleza proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad. La finalidad de la presente práctica, es evidenciar las características proteicas de las enzimas y que expuestas a la acción de diversos agentes físicos y químicos hacen variar su comportamiento y actividad catalítica. II. REACTIVOS A UTILIZAR: NaOH 1N SO4 Cu 20% NaCl 0.15M Amilasa salival 1.0% Solución iodada HCl 3N y 0.05N Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 Ácido tricloro acético (A.T.C.A.) al 20%

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Preparar: SISTEMA A TUBOS COMPONENTES (en ml) Amilasa al 1% NaOH 1N HCl 3N Ácido Tricloro acético 20% Sulfato de Cobre al 20% Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 I 1.0 2.4 II 1.0 2.4 III 1.0 2.4 IV 1.0 2.4 V 1.0 2.4 VI 1.0 2.4

0 III 1. Pre incubar por dos minutos a 37 ºC.0 5. Colocar el tubo VI en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.0 II 1. Explique la teoría de la acción molecular de las enzimas sobre sus respectivos sustratos.0 1.0 V 1.0 1.05N De los tubos de reacción del sistema (B).5 0.5 0.4 a.4 2. 3.0 IV 1. Esquematice el procedimiento de la práctica.5 III 5 0.4 2.4 2. Observar el aspecto y color producido e interpretar.5 IV 5 0. c. Agregar 0.5 V 5 0. b.4 2. IV.6 NaCl 0.5 0.0 5.6 ml. c. .0 a. Durante este lapso construir el siguiente SISTEMA B: SISTEMA B: TUBOS COMPONENTES (en ml) Almidón al 1.0 1. Dejar en incubación a 37 °C por 20 minutos. Interprete y explique bioquímicamente cada uno de los pasos realizados durante el desarrollo de la práctica 2.5 e. 4.0 5.5 II 5 0.1 M / pH 6.0 5. A continuación armar el siguiente sistema: TUBOS COMPONENTES (en ml) HCl 0.0% en solución acuosa Buffer fosfato 0.5 0. de cada uno de los tubos del sistema (A) a su correspondiente tubo del último sistema (B).5 0. CUESTIONARIO: 1. d.0 1.0 VI 1.5 VI 5 0.5 I 5 0.0 I 1.4 2.4 2.0 1. Dejar los 5 primeros tubos del sistema en reposo por 10 minutos a la temperatura ambiente. agregar: Solución yodada 0. Explique los tipos de enlaces fuertes y débiles que existen entre los aminoácidos para conformar una determinada proteína. Observar el color producido e interpretar los resultados.0 5.0 1. d.15 M Agua Destilada 5. b. de la enzima tratada.

y Volverlos a colocar al baño de agua a 37 °C durante 10 minutos.Cloruro de sodio solución 0. 4 ml. En general. . INTRODUCCION: Las enzimas pueden ser descritas como catalizadores complejos de origen biológico que tienen un alto grado de especificidad y eficiencia. Solución Cúprica alcalina. . Verificando los productos liberados después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura. Solución fosfomolíbdica. . solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. y Agregar 1 ml. II 5 ml. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL ) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura.0 al 1%. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) y Armar el siguiente sistema: ETAPA A: TUBOS COMPONENTES Solución de almidón pH 6. REACTIVOS A UTILIZAR: . Sin estas proteínas especializadas. 1 ml.1M . 1 ml.05N . La finalidad del presente trabajo experimental es determinar la actividad enzimática. Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada.Reactivo Folin Wu: a. III.5 PRACTICA N° 02 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I.Ácido Clorhídrico 0. 3 ml.0 al 1% Solución de cloruro de sodio 0. de enzima al tubo II. verificando tanto el sustrato residual y los productos formados en dicha reacción.Enzima al 1% (amilasa salival). entonces en un organismo vivo habría tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes. . 2. utilizando la enzima amilasa salival que tiene la capacidad de degradar el almidón en maltosa (disacárido reductor) y algo de glucosa. Para poder mostrar la actividad enzimática se debe tener presente fundamentalmente que cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima. b.Solución de almidón pH 6. la vida tal como es no podría existir.1M Agua destilada I 5 ml.Solución yodada. y Colocar los tubos al baño de agua a 37 °C por 5 minutos. la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras: 1. II. permitiendo que las reacciones químicas dentro de la célula ocurran rápidamente a través de vías bien definidas.

CUESTIONARIO: 1. 4. Mezclar. transferir 0. 0. 1ml.5 ml. 0. ¿Qué métodos conoce para determinar la actividad enzimática? Explique la acción bioquímica de cada uno de los componentes en los pasos seguidos para determinar la actividad enzimática. II 5 ml. 0. 3. 1ml. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante III. donde se observe la energía de activación y el estado de transición. TUBOS COMPONENTES Ácido clorhídrico 0. a este nuevo sistema.5 ml.05 N De los tubos I y II: Etapa A Solución yodada I 5 ml. y Inmediatamente cumplidos los 10 minutos. Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimático y defínalos.5 ml. 0. II 1ml. 1ml. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante. De cada uno de los tubos del sistema anterior. Elabore un gráfica para demostrar la acción de una enzima sobre su sustrato. .5 ml. 2.6 CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL. 1ml. CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin WU) TUBOS COMPONENTES De los tubos I y II: etapa A Solución Cúprica alcalina Hervir 8 minutos Enfriar Solución fosfomolíbdica Agua destilada y I 1ml. 2ml. 2ml.5 ml. y Mezclar.

0 1.0 1. que precipitan porque la solubilidad en estas condiciones disminuye al mínimo.7 PRACTICA N° 03 DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LAS PROTEINAS I. Completando del mismo modo hasta completar la serie.8 II 5 III 5 IV 5 V 5 VI 5 VII 5 VIII 5 IX 5 Mezclar el tubo N° 1 Extraer 5ml. Por tanto. REACTIVOS A UTILIZAR: .NaOH al 10%.0 1.) Ácido Acético 1N Agua Destilada      I 3. Aprovechando este comportamiento.0 1. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que el punto o pH isoeléctrico de las enzimas es una característica físico química común de estas moléculas. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Marcar una serie de tubos de ensayo de 1 al 9 TUBOS REACTIVOS (en ml. cada proteína posee un determinado punto isoeléctrico (PI).Indicador de pH: Papel Indicador ó pHmetro. iguales o mayores al PI. En el tubo N° 9 una vez efectuada la mezcla.1N III. Mezclar Extraer 5ml. produciéndose en consecuencia variaciones en la estructura terciaria o cuaternaria y por lo tanto en su función biológica Aparte de otras propiedades que presentan las proteínas.0 V 5.0 1. de solución y se elimina.Solución de caseína en Acetato de Sodio 0.0 1. se puede determinar el PI de una proteína observando los cambios de solubilidad que se producen cuando la proteína se encuentra en varias soluciones que tienen pH conocidos. algunas proteínas son muy díficilmente solubles y precipitan.1N en cada tubo. de solución del tubo N° 1 y agregarlo al tubo N° 2.) Contenido Anterior Caseína 0. TUBOS CONTENIDO ( en ml.0 1. cuando se encuentran en una solución que tienen pH igual al PI. de caseína en acetato de sodio 0.0 1.Ácido acético 1N . del tubo N° 2 y transferir al tubo N° 3.2 6. II.0 IX 5. .0 1. Cuando una proteína se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pH menores. Al contenido anterior del sistema agregar rápidamente 1 ml. la proteína sufre variaciones en la constitución de sus grupos químicos.0 VI 5. INTRODUCCION: El punto isoeléctrico es la concentración de iones hidrógeno en el cual la proteína es eléctricamente neutra. se extrae 5 ml. .0 IV 5.1N (sal)  I 5.0 Mezclar al instante por inversión.0 VIII 5. . porque el número total de cargas positivas es igual al número total de cargas negativas contenidas en la proteína.0 VII 5.0 III 5.0 II 5.

Anotar los resultados en la columna respectiva del cuadro anterior. Cálculo de pH para el tubo N° 3: pH = pK + log. Ecuación de Henderson ± Hasselbach [ sal ] pH = pK + log.6 ml.1 4 NOTA: De la manera indicada en el ejemplo.1N). [ Ácido ] pK del Ácido Acético = 4. la concentración de ácido acético varía. Anotar en el cuadro que se da a continuación Observar después de 30 minutos de reposo y anotar también en el cuadro respectivo. al 0. verificar el pH de cada uno de los tubos con el indicador de pH.7 ± 0. Así en el tubo N° 1 es de 1.  Luego de transcurridos los 30 minutos de reposo.1 N. 0. que encontró en su experimento. 4. CUESTIONARIO: 1. de ácido 1 N (16 ml. Ver ejemplo. I II III IV V VI VII VIII IX Emplear los símbolos siguientes : O = no cambia + = opalescencia.0 ml. de acetato de sodio 0.  Calcular el pH de cada uno de los tubos aplicando la Ecuación de Henderson ± Hasselbach. debe calcularse el pH de cada uno de los tubos IV. x = precipitado EFECTO INMEDIATO EFECTO DESPUÉS DE 30 MINUTOS CÁLCULO DEL pH  Determinar el tubo que presenta el máximo de precipitación.8    Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la proteína en los diferentes tubos. 1 = 4. Etc.6 = 4. 2.7 Ejemplo : Si la concentración de la sal es de 1 ml. 0.1 TUBO N° 3 = pH 4. Indique el punto isoeléctrico aproximado a la proteína.1 N. En el tubo N° 3 la concentración de ácido acético es de 4. ¿Cómo interpreta el resultado obtenido del punto isoeléctrico? ¿Qué es el pK? El pH neutro del medio ¿es igual al pH isoeléctrico? De sus razones. 3. .1 N en todos los casos. lo cual se producirá en el tubo que tiene pH próximo a la solubilidad mínima de la proteína. TUBOS N°. En el tubo N°2 la concentración de ácido acético es de 8 ml.

Si la concentración de ácido acético en el tubo II es 8 ml a 0.9 5.1 N ¿Cuál es el pH de la solución en 1 ml? .

10 REUNION DE LABORATORIO N° 02 PRACTICA N° 04 CUANTIFICACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE LAS ENZIMAS I. En cuanto a las mencionadas condiciones de medida.Cuando el sustrato es una proteína. una Unidad será la cantidad de enzima que cataliza la transformación de dos Q Moles de sustrato por minuto. Entonces la actividad específica además de cuantificar la enzima. . entendiéndose por unidad de una enzima a la cantidad de ella que produce cierta velocidad de reacción bajo determinadas condiciones. constituye una medida del grado de pureza de la enzima durante el proceso de purificación. se debe reemplazar la definición de un Qmol de sustrato por un microequivalente (Q eq) del grupo involucrado. definible como el número de moléculas de sustrato transformado por minuto y por molécula de enzima (ó por un solo centro activo) en condicionales experimentales tales que se esté midiendo la velocidad máxima (concentración saturante del sustrato). De esta manera se puede expresar la cantidad de una enzima en términos de unidades enzimaticas. Se denomina Actividad Específica a la cantidad de una enzima expresada en términos del contenido de proteína de la preparación. La definición recomendada por la Unión Internacional de Bioquímica a través de su comisión de enzimas es la siguiente: ³Una Unidad Internacional (UI) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol (Q mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de medida´. Es decir en los ejemplos mencionados más que el numero de moléculas completamente hidrolizados. . Esa velocidad de reacción se expresa como la cantidad de sustrato transformado en cierto tiempo. Esta aumenta durante el proceso de purificación de la enzima en los homogenizados biológicos y llega a ser máxima y constante cuando la enzima se halla en estado puro. . . y en general de todos aquellos factores que de una u otra manera pueden modificar la actividad de la enzima. ACTIVIDAD ESPECÍFICA. Esto es posible debido a que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima. deben establecerse: .El pH. se recurre a la medida de la velocidad de la reacción que cataliza. Dos casos merecen aclaración especial: .B + C en que dos moléculas reaccionan entre si.La temperatura a la cual se define la Unidad. y se expresa como el número de unidades de la enzima por miligramo de proteína. o un polisacárido.En casos de reacciones bimoleculares del tipo: 2 A ----. INTRODUCCION: Al no ser posible medir la cantidad de enzima directamente en las estructuras biológicas. En éste último caso y siempre que se conozca un peso molecular se puede definir otra unidad ³LA ACTIVIDAD MOLECULAR O MOLAR O NÚMERO DE RECAMBIO´ (ÍNDICE CATALÍTICO). se toma como medida de la reacción el número de uniones peptídicas o glicosídicas atacadas respectivamente. A fin de evitar ambigüedades surgidas de la utilización de distintas unidades para expresar la cantidad de sustrato y el tiempo se ha definido por convención una unidad que puede ser aplicada a casi todas las enzimas y que permite comparar las actividades de enzimas diferentes. o cualquier otra molécula en la cual son atacados más de una unión.La concentración del sustrato o los sustratos y cofactores.

0.11 Actualmente la Unión Internacional de Bioquímica. REACTIVOS A UTILIZAR: y Preparado enzimático (homogenizado celular de Fusarium moniliforme) y Buffer de acetato 0.2 ml. II.17M y Hidróxido de bario 0.5 ml. Una Unidad Internacional es igual a 0. Mezclar: Separar el precipitado de proteínas filtrando o centrifugando por 10 minutos. 0.3 N Sulfato de Zinc 5 % Sacarosa 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: y Armar el siguiente sistema: SISTEMA DE INCUBACIÓN COMPONENTES Sacarosa 0.3 ml.0 y Sacarosa 0.5 ml. 20 minutos 0. Detener la reacción empleando: Hidróxido de bario 0. 2 minutos 0.5 ml.17 M Agua destilada y y TUBOS DE ENSAYO I II 0. (Pre ± incubación) Preparado enzimático Mezclar e incubar a 37°C.5 ml. Su relación con la Unidad Internacional es la siguiente: Un Katal es igual a 6 x 10 7 Unidades Internacionales.17 M Buffer acetato 0. 0.2 ml.5 ml. 0. 0.0 ml. 8. 8.3 ml.67 nanokatales La Actividad Específica se expresa en esta nueva unidad como Katales por kilogramo de proteína (ó Microkatales por miligramo de proteína) y la actividad molar en Katales por mol de enzima.02M pH 5. recomienda el uso de una nueva unidad EL KATAL (Kat) que se define como la cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato en producto por segundo.0 Incubar a 37°C.02 M pH 5. La finalidad del presente trabajo experimental es cuantificar la Actividad Enzimática determinando la actividad específica. DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS DE LA REACCIÓN (azúcar reductor) Se empleará los filtrados libres de proteínas del paso anterior y se determinará azúcar reductor mediante el siguiente procedimiento: .0 ml.3 N y Sulfato de Zinc al 5 % y Solución fosfomolíbdica y solución cúprico alcalina y Reactivo de Biuret III.01667 microkatales = 16. 0.5 ml. 0.

. = mg.8 ml. Colocar en un baño de agua hirviendo durante 8 minutos Enfriara al chorro de agua Solución fosfomolíbdica y 1.5 ml. de proteínas por ml. 1.5 ml. y y y CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Determinación de la concentración de proteínas en el preparado enzimático: (Reacción de Biuret) COMPONENTES Preparado enzimático Agua destilada Reactivo de Biuret 1. 0. 4.. II ± Lect.E.5 ml.2 ml. agregar 7. III 1. y CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA U A. el factor es.0 ml.. I) x Factor = mg.. 0...0 ml.0 ml...12 TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES Filtrado I Filtrado II Agua destilada Solución cúprica alcalina I 0. 1.... Factor = 0. 4. del blanco)] x Factor = uMoles de Hexosas por ml. de agua destilada. 0. Leer a 540 nm Para el espectrofotómetro. I ± Lect.5 ml..045 uM/ml. II 0. 0. = Micromoles de Hexosas / 2 Minutos Tiempo de incubación en minutos (20 min).. 0... de Proteínas .. CÁLCULO: (Lect.0 ml.. II ± Lect.5 ml. Mezclar y dejar en reposo durante 20 minutos. Cálculo de las Unidades (U) (U) = uM de sustrato transformado x ml. Cálculos de la concentración de los productos (hexosas) [(Lect. Mezclar.5 ml.0 ml. Leer a 420 nm..5 ml.0 ml...0 ml. Mezclar y dejar en reposo por 30 minutos. del blanco) ± (Lect. I II 0.0 ml. 0.

.5 x 10-4 ¿En cual de los dos preparados hay mayor cantidad de enzima? 6. 2. 5.13 IV. proteína) a. CUESTIONARIO: 1. para calcular la Actividad Específica? ¿Por qué se utiliza el reactivo de Biuret? ¿Por qué una enzima se cuantifica en función de su actividad enzimática y no por el peso de la proteína (enzima)? Si en dos preparados biológicos A y B la actividad específica de una determinada enzima es: (en uM/mg. A = 1 x 10-3 y B = 1. Cuándo determina el azúcar reductor de una reacción. 3. ¿Cómo explica la aparición de la coloración al final del sistema? ¿Por qué es necesario conocer previamente la concentración de proteínas del preparado enzimático y determinar la unidad de enzima (U). 4.

Buffer fosfato 0.0 VII 1.0 1.4 III 2. presentan características comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo. Este patrón general.Amilasa salival dializada al 0. pH. concentración de enzima.0 5.Buffer acetato 0.Solución cúprico alcalina. II.1M pH 9.14 PRACTICA N° 05 FACTORES FÍSICOS-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS PARTE I: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMAS.Solución fosfomolíbdica.0 5.4 2. concentración de sustrato.4 2. todas las enzimas.0 V 1. . temperatura. varia en forma característica para cada enzima en particular.6 Buffer fosfato 0. tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática.Solución yodada (yoduro de potasio + yodato de potasio) .6 II 1. de tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectada por la variación que pudieran sufrir los otros.Buffer borato 0.0 1.0 .05N .Solución de almidón al 1 % . INTRODUCCION: En general. concentración de enzima.0 5.6 . REACTIVOS A UTILIZAR .0 1. retardando o i pidiendo m su actividad.25 % . iones.0 VI 1.1M pH 6.0 1.1M pH 9. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes.0 . IONES INORGÁNICOS I.0 Solución de ClNa al 2 % Agua destilada I 1.0 3.6 .0 5. pH.4 2. La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores.1M pH 6. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.4 2.0 5.1M pH 4. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reacción enzimática sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones.Ácido clorhídrico 0.0 5. TIEMPO TEMPERATURA.0 5. sobre la serie infinita de enzimas que se conoce.0 IV 1. etc).0 1. tomando como ejemplo la hidrólisis enzimática del almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reacción enzimática.) Solución de almidón al 1 % Buffer acetato 0.0 1. Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara de la influencia de los factores (Tiempo.6 Buffer borato 0. independientemente del tipo de reacción que catalizan.0 5.4 VIII 1. como se comprenderá.4 2.1M pH 4.Solución de cloruro de sodio al 2 % . III.4 2.4 1.0 1. concentración de sustrato. PH.

.) I II III IV V VI VII VIII Incubado correspondiente de 0.5 5. para el equilibrio de la temperatura.0 ml.5 cada uno de los tubos HCl 0.0 0. de la siguiente manera: Cumplidos los 20 minutos de incubación sacar los tubos del baño maría y luego armar una serie paralela de tubos marcados del I al VIII. Cumplido los 8 minutos sacar los tubos y enfriar con agua corriente y AGREGAR: . I 0. de acuerdo a los sistemas que a continuación se presentan: y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL .0 0. azul claro. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES III Incubado correspondientemente a los tubos III y V Solución cúprico alcalina 1.5 5. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.5 0. valorando los cambios de coloración (azul oscuro. 0.6 IV 0.Realizar controles de la actividad enzimática. 1.5 0.5 0.0 Solución iodada 0.6 V 0. y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS .5 0. .5 5.0 0.0 0.2 VIII 0.5 0.6 VII 0. por cinco minutos. 1.5 0. Mezclar y poner en baño maría hirviendo por 8 minutos.0 0. TUBOS V 1.0 II 0. según se indica y tomar el tiempo.5 0.6 VI 0.0 ml. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.5 5.05N 5.5 5.0 0.5 5.0 ml. del incubado de su correspondiente tubo. sin color) en el cuadro final.5 5. .6 (Computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimático fue agregado a cada tubo) y Mezclar y continuar la incubación por 20 minutos.Agregar el preparado enzimático a los tubos: II al VIII.0 ml.) Preparado enzimático (en ml. maltosa) de la siguiente manera: Esta determinación sólo se hará en los tubos III y V del incubado a los 20 minutos.El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0 °C y 4 °C durante cinco minutos.5 Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos.El control del sustrato no transformado se realiza por la reacción del yodo.6 III 0.15 .Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al baño de agua a 37 °C.0 0.El Control de los productos formados se hará en base a la capacidad reductora de estos (glucosa. agregando a cada tubo marcado.5 ml.

0 ml. azul claro. 1. CUESTIONARIO: 1.16 COMPONENTES III Solución fosfomolíbdica Agua destilada TUBOS IV 1.0 ml. ¿Cómo se determina el sustrato residual y los productos finales cuando se usa almidón como sustrato? 3. ¿Cómo puede demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 6. 5. CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA POR E L SUSTRATO RESIDUAL: (cambio de color) A los 20 minutos: I II III IV V VI VII VIII CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (cambio de color) A los 20 minutos III V IV. 5.0 ml. ¿Cuáles son los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas? 2. Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de tubos valorando los cambios de coloración (azul oscuro. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la presencia de un ión activador sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? . ¿Cómo puede demostrar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática? 5. sin color) en el cuadro final. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 4.0 ml.

075 M Solución de ureasa cristalina en Buffer fosfato 0. y se dice que la enzima está siendo saturada con su sustrato. la velocidad de la reacción llega a ser esencialmente independiente de la concentración del sustrato y asintóticamente alcanza una velocidad constante. En este rango de concentración de sustrato la reacción es esencialmente de orden cero con respecto al sustrato.1 M pH 6.005 M Urea 0. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD MÁXIMA Y KM. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: . Las reacciones catalizadas por enzimas son algo diferentes. PARTE II: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO. INTRODUCCION: En las reacciones no catalizadas.1 M pH EDTA 0. A baja concentración de sustrato la velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato y la reacción es de primer orden con respecto al sustrato. debido a que la velocidad de colisión entre los reactantes es proporcional a la concentración de cada uno de ellos. la velocidad inicial se incrementa con menor intensidad. Con un incremento ulterior en la concentración de sustrato.6 Tungstato de sodio al 10 % Ácido sulfúrico 2/3 N III. Sin embargo. la velocidad de reacción siempre es proporcional a la concentración de cada uno de los reactantes. en esta zona la reacción es de orden mixto. La finalidad de la presente práctica es demostrar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática y hallar la velocidad máxima y el Km de la reacción.17 REUNION DE LABORATORIO N° 03 PRACTICA N° 06 FACTORES FÍSICO-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. Desde el punto de vista operacional la constante de Michaelis (Km). cuando la concentración del sustrato es incrementada. II. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato 0. de modo que no es tan directamente proporcional a la concentración del sustrato. I. se define mejor en términos de la concentración de sustrato necesario para obtener una velocidad inicial de reacción igual a la mitad de la velocidad máxima.

5 IV 1.  Hallar la diferencia de cada uno de los tubos.0 0.5 III 2.0 1.5 III 0. Luego:  Realizar las lecturas en el espectrofotómtero a 540 nm en cada uno de los tubos.5 IV 0. . de cada uno de los siguientes incubados a tubos de ensayo de una segunda serie siguiendo el siguiente esquema: COMPONENTES Del incubado anterior Agua destilada Reactivo de Nessler I 1.0 VII 1.0 8.0 8. con respecto al tubo blanco (tubo VII).0 2.6 Urea 0.5 0.5 VII 0.  Calcular la velocidad de reacción para cada uno de los sistemas enzimáticos preparados. V¶ = 4 ml. empleando la concentración de amoníaco producido por ml.5 0.M.0 8.5 VII 0.0 I 0.5 II 0.0 II 1. ésta debe agregarse con intervalos de 1 a 2 minutos a cada tubo de tal manera que permita un fácil manejo de los mismos al final de cada tiempo.5 0.0 1.5 0.0 0.0 III 1.5 3.5 2. = V¶.0 8.18 COMPONENTES Buffer fosfato pH 6.MEZCLAR Transferir 1ml.0 1.0 - Pre incubar a 37 °C durante cinco minutos Incubar cada uno de los tubos exactamente 15 minutos 37°C ES FUNDAMENTAL: Medir exactamente el tiempo de incubación para cada tubo.5 ml.0 1.0 8.5 VI 0.0 1.5 II 2. Datos: V = 0.  Calcular la concentración de sustrato (concentración molar) en cada tubo de incubación empleando la siguiente fórmula: V.5 V 0.0 IV 1. Transcurridos los 15 minutos agregar rápidamente: COMPONENTES H2SO4 2/3 N Tungstato de sodio 10% Ureasa .5 VI 0.5 3.5 0.0 8.5 0.  Encontrar la concentración de amoníaco producido por ml.5 0.0 1.0 0.0 1.0 VI 1. dividido entre el tiempo de incubación (15 minutos).5 MEZCLAR y dejar en reposo por cinco minutos.075 M Ureasa 0.5 0. Para ello multiplicar la diferencia anterior por el factor de calibración empleado (1660) = µmoles de NH3 /ml.5 0.0 8.5 V 1.5 1. Para ello se medirá el tiempo de incubación inmediatamente después de agregar la enzima.05 % I 3.0 V 1.0 1.5 0.5 0.M¶ Ejemplo: Concentración de úrea en el tubo I.0 0.

0093 M 4ml. ¿Qué es el Km? 4. Calcular en la gráfica obtenida la velocidad máxima y la Km. CUESTIONARIO: 1. ¿Cómo afecta la concentración del sustrato la velocidad de la reacción? 2. Construir una gráfica en un sistema de coordenadas teniendo como parámetros la inversa de la concentración del sustrato (1/S) (abscisas) en función de la inversa de la velocidad inicial de la reacción (ordenada).075 M M¶ = ? M¶ = 0. ¿Qué importancia tien el Km? 5.19 M = 0. En la curva trazada calcular la Km e indicar la Vmax. ¿Para que sirve la ecuación de Lineweaver? 6.5 ml x 0.  Utilizando papel milimetrado. ¿Qué establece la ecuación de Micahelis Menten? 3. aplicar la ecuación de Lineweaver Burk a los resultados obtenidos.  Anotar los resultados de cada uno de los tubos (concentración del sustrato y velocidad de la reacción).075 M = 0.  Construir una gráfica en el sistema de coordenadas teniendo como parámetros : La concentración del sustrato (abscisa) en función de la velocidad de la reacción (ordenada). ¿Qué métodos conoce para determinar el Km? . IV.

pudiéndose formar entonces un complejo ternario enzima-sustrato-inhibidor. Experimentalmente se puede identificar si un inhibidor cualquiera es o no competitivo. a las que se pueden agregar las inhibiciones reversibles acompetitivas. Si el efecto inhibidor se revierte al incrementar la concentración del sustrato (succinato) entonces se podrá afirmar que el inhibidor es de tipo competitivo. Quedando por demostrar si este tipo de inhibición es reversible o no. Un ejemplo clásico. EDTA. La inhibición acompetitiva. Si después de hacer actuar el inhidor sobre la enzima. eliminamos por algún método. de este tipo de inhibición es el que presenta la succinato deshidrogenasa que tiene como sustrato el succinato y puede ser inhibido por sustancias estructuralmente parecidas a dicho ácido como son el malato. si la enzima continúa inhibida después de la reacción del inhibidor. El inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual se debería unir el sustrato impidiendo por lo tanto la formación del complejo activoenzima-sustrato. se agrega malonato como inhibidor. Si la inhibición no se revierte al agregar sustrato (succinato). es otro tipo de inhibición reversible. INTRODUCCION: Existen sustancias cuya acción sobre una enzima es la disminución de su actividad. que se pueden distinguir en base a un criterio experimental. se dice que el inhibidor es reversible. el exceso de inhibidor. Aquí el inhibidor se une a la enzima en otro sitio que no es aquel por el cual se une al sustrato. Ejemplos de este tipo de inhibición son los causados por el N-etilamida. Los dos tipos más comunes son: las inhibiciones reversibles competitivas y las inhibiciones reversibles no competitivas. si el sistema deshidrogenasa succínica+succinato. Los inhibidores enzimáticos se clasifican en reversibles e irreversibles. que es cataliticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reacción y complejo-enzima-inhibidor. por que efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazarse mutuamente de la enzima. Excluyéndose de ésta categoría aquellos agentes como los ácidos fuertes. entonces la inhibición será de tipo no competitiva. . común en sistemas más complejos en el que el inhibidor se une exclusivamente al complejo enzima -sustrato para dar un complejo enzimasustrato-inhibidor incapaz de transformarse en otro producto. A la inversa. y la enzima recupera su actividad original. Por ejemplo. NO y CO. inhiben metaloenzimas por enlazarse al ión metálico. alcoholes y calor que producen alteraciones en la estructura espacial de la molécula proteica que conduce a la desnaturalización. En la inhibición competitiva se dice que un inhibidor obra por competencia si su acción inhibidora se revierte al aumentar la concentración de sustrato. los cuale enlazan iones metálicos necesarios para la actividad enzimática.20 REUNION DE LABORATORIO N° 04 PRACTICA N° 07 ACCION DE LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS Y NO COMPETITIVOS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. La inhibición no competitiva se caracteriza por que no puede ser revertida por un aumento de la concentración del sustrato ya que este último no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. cloruro de mercurio. Estas sustancias se conocen como los inhibidores enzimáticos. Por esta razón la unión de este último con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor. se dice que el inhibidor es irreversible. ácido oxálico y glutarato. Respecto de los inhibidores reversibles es importante destacar que la interacción entre inhibidor y enzima se traduce en varios tipos de inhibición perfectamente diferenciados experimentalmente. De allí el nombre de competitivo.

0 1.0 II 1.5 IV 0. que el malonato es un inhibidor competitivo y que el cloruro mercúrico es un inhibidor no competitivo.Succinato de sodio 0.Succinato de sodio 0.2 1.0 1.0 1.5 III 0.0 1.Buffer fosfato 0.1M pH 7. Dejar en reposo 15 minutos a la temperatura ambiente y luego observar los resultados y anotar. ¿Por qué el malonato es inhibidor competitivo? 2.Cloruro de mercurio .1 M .8 0. II 0. IV.5 - IV.5 1.1 M.5 M . III.3 0.5 1.0 1. Observar los resultados en cada uno de los tubos (cambio de color).0 0. COMPONENTES Succinato de sodio 0.1 M Malonato de sodio 0.2 Succinato de sodio 0.2 0.5 1.5 M Cloruro de mercurio 0.0 III 1.0 Dejar en reposo por 30 minutos a la temperatura ambiente. ¿Cómo podría usted demostrar que la inhibición producida por el cloruro mercúrico es o no reversible? . REACTIVOS A UTILIZAR . pH 7.0 IV 1.1 M Succinato de sodio 0.5 0.0 V 1.2 0. II. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.5 M Buffer fosfato 0.2 .3 0.21 La siguiente práctica tiene por finalidad demostrar en el sistema enzimático Deshidrogenasa succínica+succinato: que el malonato y el cloruro mercúrico producen inhibición de este sistema.1M pH 7. ¿Por qué el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo? 3.1 M 2 ± 6 diclorofenolindofenol Homogenizado 10 % I 2.1 M .Malonato de sodio 0. CUESTIONARIO: 1.0 1.Homogenizado hepático 10 % III.2 ± 6 Diclorofenolindofenol .2 Anotar y luego agregar a los tubos II.

5. Señale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibición no competitiva reversible. 6. además del malonato utilizado en el presente experimento. De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibición competitiva en el sistema Deshidrogenasa succínica ± succinato. ¿Qué diferencias puede usted establecer entre la inhibición competitiva y la inhibición alostérica? 7. De por los menos dos semejanzas entre la inhibición no competitiva reversible e inhibición alostérica. . sin considerar el cloruro de mercurio.22 4.

Este sistema está localizado en la membrana mitocondrial interna y se caracteriza por la cohesión física con la cual sus componentes se encuentran unidos entre si e integrados en la membrana. . bloqueando el transporte de electrones entre la flavina y la ubiquinona. sitio II y sitio III. barbital sódico y azida de sodio. etc. El ejemplo clásico de este grupo es la antimicina. pero si el indicador se decolora. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que los inhibidores: rotenona. el BAL y barbiturato de sódio. que al reducirse (recibir electrones) se decoloran. A estos se les denomina inhibidores del sitio III. Si se administra un inhibidor que impide el flujo de electrones en algún punto de esta porción de la cadena. la azida. el monóxido de carbono. Por su acción cercana en el primer sitio de la desfosforilación se les suele denominar inhibidores del sitio I. mediante el uso de indicadores conocidos como 2 ± 6 diclorofenolindofenol y p ± fenilendiamina. En la cadena REDOX. se les denomina inhibidores del sitio II. los detergentes. éste impide que el 2-6 diclorofenolindofenol se reduzca (se decolore). es decir que es capaz de ceder electrones. átomos de hidrógeno o electrones. se utilizan sustancias indicadoras artificiales que cambian de color cuando se oxidan o se reducen. inclusive de la cadena (región que incluye el sitio I). Si el inhibidor no impide la oxidación del indicador. es o no permeable al flujo de electrones que provienen del indicador. así por ejemplo el 26 diclorofenolindofenol y el azul de metileno son sustancias indicadoras de color azul en estado oxidado. inhibidores similares son la hidroxiquinolina N-óxido. Los más representativos de este grupo son la rotenona y la piericidina. De esta manera se puede verificar si la cadena comprendida entre el citocromo C y el oxígeno. etc. denominación que pone énfasis en que las oxidaciones reducciones son fenómenos caracterizados por la pérdida o ganancia de electrones. provenientes de la deshidrogenación de los sustratos del ciclo de Krebbs y otros metabolitos son transferidos al oxígeno por un sistema multienzimático denominado cadena respiratoria. la p-fenilendiamina no se oxidará (no cambia de color). Cuando se oxida (cede electrones) cambia de color (a marrón oscuro). el citocromo C actuará como primer aceptor de electrones que provienen de la p-fenilendiamina. entonces podemos deducir que el inhibidor actúa en algún sitio anterior al citocromo o de la cadena. Este mismo sistema multienzimático es también conocido como cadena de transporte de electrones. respectivamente. La p-fenilendiamina.23 PRACTICA N° 08 EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE ÓXIDO-REDUCCIÓN I. algunos anestésicos volátiles como el halotano. quiere decir que dicho inhibidor estará actuando en alguna región anterior a la FMN. entonces podemos deducir que el mencionado inhibidor actuará en algún sitio comprendido entre la CoQ y el citocromo B inclusive (cercano al sitio II de la cadena). actúan en las regiones cercanas al sitio I. Los inhibidores más comúnmente usados pueden reunirse en tres grupos principales según el sitio de la cadena respiratoria donde actúan. Un segundo grupo de sustancias actúan bloqueando la transf rencia de electrones e entre los citocromos b y c. es otro indicador que actúa como sustrato. Como hay flujo de electrones en la cadena. Si se administra un inhibidor que no impide la oxidación de la p-fenilendiamina y que tampoco impide la reducción del 2-6 diclorofenolindofenol. entonces podemos deducir que el sitio de inhibición estará en alguín sitio posterior a la CoQ inclusive. INTRODUCCION: Los equivalentes de reducción. comprenden el cianuro. Si al administrar un inhibidor de la cadena. ésta cede sus electrones a los indicadores entre la FMN y la CoQ. los esteroides. Inhibidores de localización son: el amital. Para poder determinar la permeabilidad de la cadena de oxidoreducción al paso o no de electrones. Un grupo de inhibidores actúa sobre el Hemo a3 de la citocromo oxidasa impidiendo su interacción con el oxígeno. Existen diversas sustancias que actúan como inhibidores de la cadena respiratoria. Un primer grupo de inhibidores actúa sobre la NADH-deshidrogenasa.

0 1. En el sistema p±fenilendiamina + cadena rédox mitocondrial.5 V 0. Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos). I 2.5 VI 0.5 0.5 0.5 1.5 0.5 0.5 III 1.2 0.5 0.0 0.0 IV 1.5 0.0 0.1M.) Buffer fosfato de sodio 0.0 .5 0.0 0.02 % p-fenilendiamina 1% Malato de sodio 0. barbital sódico y azida de sodio.5 reposo a temperatura minutos.0 V 1.5 0.2 0.0 0.1M Rotenona 0.0 0.5 II 1. dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.02 % Malato 0.6-diclorofenolindofenol 0. dejar en 10% ambiente por 20 0.5 0. 6-diclorofenol indofenol 0.) Buffer fosfato 0.5 IV 0.5 0. pH: 7.5 0. TUBOS COMPONENTES (en ml.24 II.0 0.1M P±fenilendiamina 1% Homogenizado de mitocondrias Mezclar.1M Rotenona 0.1M Rotenona 0.1M pH 7. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0.1M Barbiturato de sodio Azida de sodio Homogenizado mitocondrial 10% I 1.5 0.5 1.1M Barbiturato de sodio 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) En el sistema Deshidrogenasa málica + malato + cadena rédox mitocondrial.1M Azida de sodio Fracción mitocondrial 10% (hígado de rata) III. barbital sódico y azida de sodio.5 0.2 0.0 II 1.2 III 1.5 0.1M pH 7. verificar el efecto de los inhibidores: rotenona. ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (en ml.5 1. verificar el efecto de los inhibidores rotenona.5 1.4 2.5 Mezclar.2 0.4 2.4 Azida de sodio Barbiturato de sodio 0.2 1.

¿Qué inhibidores de la cadena de óxido reducción conoce y a qué nivel actúan? 2. Grafique usted en una cadena de óxido reducción biológica. la acción de los inhibidores e indicadores utilizados en el experimento. ¿Si utiliza el indicador rédox 2. 5. barbiturato de sodio y azida de sodio? 4. ¿Si utiliza el indicador p±fenilendiamina en un sistema con cadena respiratoria. que cambios observaría con la rotenona. CUESTIONARIO: 1.6-diclorofenolindofenol en un sistema con cadena respiratoria.25 Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos). que cambios observaría con la rotenona. IV. Indique usted los sustratos y enzimas que intervienen en los sistemas realizados en la práctica. barbiturato de sodio y azida de sodio? 3. .

grupos prostéticos y átomos metálicos.fenilendiamina y los componentes celulares de un homogeneizado de hígado de rata obtenidos por centrifugación dif rencial mediante el método de e Schreider y col. Las enzimas de óxido . Se separa el sobrenadante en un beaker.02 % Succinato 0. El animal será sacrificado. Se hace presión manualmente con el embolo girando hacia el fondo. Todo debe trabajarse entre 0 y 4ºC. albicans). Se coloca el hígado en un petri se elimina la cápsula del hígado y otros tejidos periféricos. El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fracción mitocondrial. El sobrenadante es separado en un beaker de 500ml.25 M Fracción nuclear del homogenizado.reducción usando los indicadores redox 2 . REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0.1M p±fenilendiamina 1% Homogenizado total de hígado de rata en sucrosa 0. inmediatamente se hara un corte longitudinal en el abdomen procediendo a extraer el hígado. aminoácidos y algunas otras sustancias sufren oxidaciones en el organismo mediante sistemas enzimáticos simples o complejos. fosfolípidos. Estos sistemas están constituidos por proteínas. hallándolas de modo fundamental en una subestructura celular en donde la energía derivada de las oxidaciones es "capturada" en la forma del intermediario macroérgico ATP.26 PRACTICA N° 09 DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE ÓXIDOREDUCCIÓN I.6-diclorofenolindofenol 0. se emplea una centrífuga refrigerada. El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15 minutos en la centrífuga refrigerada. previa calibración en la balanza.6 diclorofenilindofenol y p . - - . El sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca en un beaker de 100ml.reducción tienen una distribución característica intracelularmente. Fracción microsomal soluble del homogenizado.1M pH: 7.154 M. La finalidad del presente trabajo es objetivizar la distribución intracelular de las enzimas de óxido . Homogenizado al 10%: se pesa 10gr de hígado y se corta en fragmentos pequeños y se coloca en el homogenizador potter y se le agrega solución de KCl 0. INTRODUCCION: Los carbohidratos. II.154 M III. El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocándolo en tubos de polietileno. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Fraccionamiento Celular Cada grupo recibirá una rata albina (Rattus rattus var. las enzimas que intervienen en estos pr cesos se encuentran o clasificadas en diversos grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimológica. Fracción mitocondrial del homogenizado. KCl 0. ácidos grasos.4 2. De acuerdo a su estructura y función. constituyendo la fracción microsomal con el citosol.

0 0.5 0. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador.5 0.0 0.5 5 1. pH 7.6-diclorofenolindofenol y cómo actúa en la cadena respiratoria? 2.5 1 1.4 P ± fenilendiamina 1% (sustrato + indicador) Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal ±soluble Homogenizado total 0. CUESTIONARIO: 1. IV.1M Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal -soluble Homogenizado total I 1.0 0.0 1.0 0. Haga un esquema de la centrifugación diferencial .5 1.5 1.5 IV 0. ¿En que fracciones celulares se encuentran las enzimas de óxido ± reducción? 6.5 1.2 0.0 0.5 0.5 0. empleando: COMPONENTES Buffer fosfato 0.5 2 1. para interpretar los resultados. ¿Qué es el p-fenilendiamina y cómo actúa en la cadena respiratoria? 3.27 Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Buffer fosfato 0.5 III 0.5 1.0 0. Grafique usted en una cadena de óxido ± reducción biológica la acción de los indicadores rédox 2.4 2 ± 6 diclorofenolindofenol Succinato de sodio 0. para interpretar los resultados. ¿Qué es el 2.1M.2 0. ¿Qué es un homogenizado de hígado y cómo se obtienen las fracciones celulares por centrifugación diferencial? 5. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador.5 3 1. Armar otro sistema.2 0.0 0.2 II 0.0 0. pH 7. 4.5 4 1.2 0.5 Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente.0 0.1M.6 diclorofenolindofenol y p±fenilendiamina.5 V 0.5 - Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente.

trompa de Falopio y tejido adiposo. las cuales explicarían probablemente menos del 25% de la actividad sérica normal. trombosis mesentérica. La alfa amilasa actúa rompiendo los enlaces alfa 1-4 glucosídicos en la parte central de la amilasa formando una mixtura de pequeñas dextrinas + maltosa. uremia después de la administración de codeína. la explicación no es clara. Otras fuentes incluyen el hígado. después de ruptura esplénica. Para la mayor parte. Bajos niveles pueden encontrarse en pancreatitia crónica y en carcinoma pancreático cuando el daño es extenso y hay insuficiencia de las acinos glandulares. músculo estriado. obstrucción intestinal. La amilasa comprende a sólo el 20% del almidón y es soluble en agua. cirrosis. mide la cantidad de almidón hidrolizado y por ende la actividad de amilasa de la muestra. las elevaciones son (con excepción de los niveles obtenidos después de la administración de opiáceos) menos de 500 unidades. morfina. encefalitis viral. así como en la orina existe actividad amilásica. Si liberan alfa o beta maltosa. En el suero humano. Después de la administración de morfina en normales se incrementa la amilasa sérica. peritonitis. La diferencia entre la cantidad de color azul formado en la muestra incubada y el blanco incubado por la adición de suero después de la incubación. difiere de la amilasa porque contiene además enlaces alfa 1-6 glucosídicos frecuentemente ramificados. Si dentro de 24 horas no se eleva. En normales. En pancreatitis se llega hasta 2000 a 3000 unidades. después de la administración secretina. úlcera duodenal o gástrica penetrante o perforada. pero al año de edad la actividad es igual a la del adulto. la amilisa sérica se altera. En obstrucción de los conductos puede elevarse.28 PRACTICA N° 10 DETERMINACION DE AMILASA SERICA I. diuréticos tiazídicos. En otros. El presente experimento tiene por finalidad determinar la amilasa sérica en personas normales y/o con alteraciones patológicas especialmente del pancreas. en el que la cantidad de almidón y tiempo de incubación son ajustados de manera que sólo una porción de almidón es hidrolizado cuando la reacci n ó es parada por la adición de yodo. Los valores normales de amilasa por el método de Caraway calibrado en unidades Somogy es de 60 a 180. Se ha reportado incremento después de la ingestión de alcohol. enfermedad séptica aguda del coledoco. en pacientes con insuficiencias pancreática. La amilasa salival y pancreática humana esta dentro del grupo de las primeras. se les clasifica en alfa y beta amilasa. La amilasa es un poliglucósido de configuración lineal de unidades de glucosa unidos por enlace alfa 1-4 glucosídicos. La amilasa puede ser detectada en niños desde 1 a 2 meses de edad y los valores son más bajos que en el adulto normal. Ambas. carcinoma bronconígeno y en neumonía. Muy raramente permanece elevada 4-6 días. También ha sido informado en leche y en el semen humano. el resto es una fracción inosoluble llamada amilopectina. con frecuencia 2-3 días después. no es probable el diagnóstico de pancreatitis aguda. después de colangiografía. Entre 2 ± 12 horas después de producida la pancreatitis aguda. En los casos señalados se ha propuesto la prueba funcional de la amilasa sérica después de la administración de secretina y morfina. En la bilis no hay actividad. . El origen de la amilasa sérica humana incluye al páncreas y glándulas salivales. INTRODUCCION: La amilasa es una enzima que hidroliza el almidón. Es posible encontrar valores más altos. En algunas de estas condiciones. Para la determinación de amilasa usamos el método de Caraway. edema y pancreatitis están presentes indudablemente. la amilasa se encuentra grandemente incrementada y retorna a los valores normales lentamente. amilasa y amilopectina producen sólo B-glucosa por hidrólisis. La elevación puede ocurrir en otras condiciones que incluyen enfermedad de las glándulas salivales (pancreatitis).

debido a que las proteínas séricas disminuyen la cantidad de color producido por el complejo yodo ± almidón y este podría ser diferente).29 II.1 ml.1 ml. 35 ml.0 ml.0 : y Solución Stock de iodo : y Solución iodada de trabajo: III.) I PROBLEMA Sustrato de almidón Bufferado Retirar los frascos y agregar suero Retirar los frascos y agregar suero Agua destilada Solución iodada de trabajo. II BLANCO 5.5 minutos exactamente 800 = Unidades de amilada por 100 ml (Se requiere un blanco por cada muestra de suero. 0. 4. Mezclar bien. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): Armar el siguiente sistema: (Utilizar dos frascos volumétricos ± Erlenmeyer de 50 ml. espectrofotómetro a Incubar a 37°C durante cinco minutos ambos frascos Mezclar e incubar a 37°C durante 7. De qué manera el ión cloruro activa a la amilasa ¿Qué semejanza o diferencia puede establecer usted entre amilasa dializada y no dializada.0 ml. REACTIVOS A UTILIZAR: y Sustrato de almidón Bufferado. pH 7.0 ml. 2. 5. Leer 660 nm. en función de la actividad enzimática? ¿Cómo explica usted el diferente comportamiento de la amilasa hepática y pancreática sometidas a electroforesis? ¿Por qué la concentración de amilasa sérica es menor durante los primeros meses de vida lactante? . 0. IV. en CÁLCULO Absorbancia del _ Absorbancia del blanco problema _______________________________________ X Absorbancia del blanco 5. 5.0 ml. 3. 35 ml. CUESTIONARIO: 1.

30 .

Este es un caso interesante en que un sistema de transporte a través de la membrana favorecería a otro. Según el método l de Folin Wu. el transporte de glucosa al interior de las células es por difusión pasiva. por ello.31 II UNIDAD METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS REUNION DE LABORATORIO N° 05 PRACTICA N° 11 DEMOSTRACION DE LA DIGESTION Y ABSORCION DE LOS CARBOHIDRATOS: GLICEMIA PRE Y POST-PRANDIAL. proviene de dos orígenes: de origen exógeno de los alimentos. producción endógena de glucosa así como la utilización y excreción de la misma. En el caso del hígado. siendo el hepatocito permeable para este metabolito. sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento. se llama cotransporte. y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentración de sodio en fluído extracelular. La glucosa en sangre. . Por todo esto. La entrada de la glucosa en estas células está supeditada a que. el sodio. posiblemente porque se une a la misma proteína transportadora que lleva el sodio. En casi todos los demás tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las células por simple difusión. I. sino que lo hace por un mecanismo de difusión controlada. Diversos factores que inciden sobre la absorción. que proviene del hígado por glucogenólisis. la constante disponibilidad de este sustrato a los tejidos. contribuyen a mantener constante la concentración de glucosa en sangre. Varía entre los 80 ± 120 mg%. con ella. hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina. A su vez. En este caso la glucosa entra en la célula. y de origen endógeno. El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a través de las células de la mucosa intestinal no es muy conocido. El conocimiento de la glicemia es importante no sólo porque permite tener una idea integral del mecanismo de homeostasis metabólica existente. Este proceso. con el método de la glucosa oxidasa la concentración varía entre 70 ± 110 mg/dl. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea es una de las fuentes de energía más importantes en el organismo y en algunos tejidos altamente especializados. Los valores normales de glucosa en sangre son variables de acuerdo al método utiizado. el organismo dispone de una compleja maquinaria metabólica que permite asegurar la constancia de la concentración de glucosa en la sangre y. Este mecanismo requiere ATP como fuente de energía. el corazón y el músculo esquelético. Se cree que está íntimamente ligado al transporte de sodio. por la bomba de sodio y potasio. volvería a salir de la célula. En el cerebro y los glóbulos rojos es la única fuente de energía. por lo tanto la concentración de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo. al salir del Na+ mantenga alta concentración en el líquido extracelular. Por otra parte. en particular en el tejido adiposo.

Preparación del Reactivo de trabajo: 500 partes de agua destilada.Reactivo Fenol: Solución de Fenol 55 mmol/l. por el método de Glucosa oxidasa. colocar: COMPONENTES Standard Muestra (suero preprandial) Muestra (suero postprandial) Reactivo de trabajo B ------------2 ml S 20 ul --------2 ml Dpre. y Dpost. 50 partes de Reactivo Fenol y llevar a 1. como máximo. . REACTIVOS A UTILIZAR .32 La finalidad de la siguiente práctica es demostrar la digestión y absorción de la glucosa. IV. III. CUESTIONARIO: 1. .000 U/ml) y Peróxidasa (120 U/ml). S (Standard).00 g/l f = ----------- S y D = Dpre.AF: Solución de 4 ± aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0. (Desconocido preprandial) y Dpost. La segunda: Esta muestra se tomará después de una hora. (Desconocido post prandial). Cálculo de los resultados : Glucosa (g/l) = D x f donde 1. --------20 ul 2 ml Incubar todos los tubos 10 minutos en baño de agua a 37 ºC Leer en Espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco. cuantificando la glicemia pre y postprandial.GOD/POD: Solución de glucosa oxidasa (1. . Utilizar 4 tubos de ensayo: B (Blanco). ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES : Se tomarán dos muestras de sangre : La primera: La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra. se extraerán 5 ml.Reactivo 4. Separar el suero.000 partes con agua destilada. tanto en personas normales como en casos patológicos. . y con aguja N° 20. cuál es el rango considerado normal para la glicemia basal? Explique las variaciones en los valores. ----20 ul ----2 ml Dpost. Rotular y fechar. La determinación de la glicemia se realizará por el método Enzimático de la glucosa oxidasa. Antes de multiplicar D x f. Mezclar por inversión sin agitar. En esos momentos. Restar a D el Blanco (B) y el resultado se multiplica por f. Agregar 3 partes de enzimas GOD/POD previamente homogenizadas. se deja reposar 10 minutos. con jeringa hipodérmica de 10 ml. Dpre. que usted puede encontrar por ejemplo en una intolerancia a la glucosa. después de la ingesta alimenticia. de sangre de la flexura del codo.Estándar: Solución de glucosa 1 g/l .AF.92 mol/l. ¿Actualmente. luego se centrifuga a 3000 RPM por 10 minutos. 50 partes de Reactivo 4. II. Colocar las muestras en tubos de ensayo.

KOH al 60 % . REACTIVOS A UTILIZAR .6 son estables. . INTRODUCCION: El glucógeno está presente en el citosol en forma de gránulos los que contienen las enzimas glucógeno fosforilasa. EXTRACCION DE GLUCOGENO HEPATICO (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Homogenizado de hígado en ayunas Homogenizado de hígado post prandial I 0. . La finalidad de la siguiente práctica es cuantificar el glucógeno en ayunas y después de la uingesta de alimentos y evaluar los valores encontrados relacionados con los factores que determinan sus síntesis y degradación II. La acción de la beta amilasa también rinde una dextrina límite. Se encuentra glucógeno o se puede sintetizar en cualquier célula del organismo.Na2S04 solución saturada. glucógeno sintetasa y algunas otras que regulan la síntesis y degradación.Alcohol absoluto.) III.5 --II --0.4 y alfa 1. . 3. pero las concentraciones varían en los diferentes tejidos correspondiendo las concentraciones más altas del hígado y al músculo esquelético. ¿Qué variaciones fisiológicas de glicemia puede usted señalar? PRACTICA N° 12 INFLUENCIA DE LA DIETA EN LA FORMACIÓN Y ALMACENAMIENTO DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO I. El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa de fácil disponibilidad.6 los cuales se presentan con frecuencia aproximada de uno por cada 10 residuos. En el hígado el glucógeno se incrementa después de la ingesta de alimentos (período post prandial) llegando a los límites máximos cuando la dieta es abundante y/o en base a carbohidratos.4 y las ramificaciones se forman por enlaces glucosidicos alfa 1.5 . En cambio el glucógeno post prandial es debido a que la glucogénesis se incrementa cuando las concentraciones en sangre alcanzan valores de 150 mg/100 ml ó más.Homogenizado de hígado de rata al 10 % (pesar 10 g. de hígado y homogenizar con agua destilada. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. ¿Cómo esperaría encontrar los valores de la glicemia dosada en la sangre venosa y en la sangre arterial? Fundamente las variaciones que se pueden encontrar. El glucógeno puede ser aislado de los tejidos por digestión con soluciones de hidróxido de potasio caliente en los cuales los enlaces no reductores alfa 1. ¿Conoce otros métodos para determinar la glicemia? Explique su fundamento 4. ¿Cuál son los criterios bioquímicos.H2S04 concentrado. lugares principales de almacenamiento. para el diagnóstico de diabetes mellitus? 5. El glucógeno es también fácilmente hidrolizable por alfa y beta amilasa para rendir glucosa y maltosa respectivamente. La mayoría de los residuos de glucosa en el glucógeno están ligados por enlaces glucosídicos alfa 1.33 2.Fenol al 80 % . relacionados con la glicemia.

5 0.1 0. Explique los mecanismos que regulan la homeostasis de la glucosa y el rol del glucógeno durante el ayuno prolongado. del Sistema anterior« -1.0 Disolver el precipitado por agitación.0 Fenol al 80 % 0.0 --Muestra del tubo II. Eliminar el sobrenadante y colocar boca a bajo los tubos sobre papel de filtro por 5 minutos. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones post prandial? 3. Centrifugar a 3500 RPM por 10 min.0 5.0 5. Colocar los tubos en agua helada durante 5 min. Leer en el fotocolorímetro con filtro verde. CUESTIONARIO: 1.0 5. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones de ayuno? Dé usted las razones metabólicas que expliquen su resultado. Blanco) x Factor IV. 0.34 KOH al 60 % 0. .1 Mezclar.0 Mezclar y dejar en el baño de agua helada durante 5 minutos más. CALCULOS: Factor Espectrofotómetro = 7 g % de glucógeno = (Lec.0 Na 2SO4 solución saturada.1 Mezclar.0 1. ¿Porqué mecanismo metabólico el glucógeno incrementa cuando la concentración de glucosa en sangre es mayor de 150 mg/dl? 5.I ± Lect.5 Calentar los tubos en baño maría a 100 C por 10 min. gota a gotaen el centro de c/tubo 5.1 0.0 -Agua destilada 1. motivo del experimento? 4. y sin retirar los tubos del baño helado: Agregar H2S04 cc. ¿Qué relaciones metabólicas puede usted establecer entre los valores de glucógeno obtenidos en ambas muestras de hígado de rata. Reposo por una hora. Agregar agua destilada 5. 2.0 5.0 2. CUANTIFICACION POR METODO COLORIMETRO DEL GLUCOGENO EXTRAIDO Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml)) I II BLANCO Muestra del tubo I del Sistema anterior««««««« 1. Alcohol al 98 % 5.1 0. 540 n m.

La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos.Jeringas hipodérmicas de 1 cc.Glucómetro. . II. Esta hormona es producida por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas y es secretado en respuesta directa al incremento de glucosa en la sangre.Conejos adultos de más de 2 kg. se produce más insulina que tiende a aminorarla. En condiciones normales. El efecto más importante de una deficiencia insulínica es el de un nivel sanguíneo de glucosa elevado (hiperglicemia). Los mecanismos reguladores de la concentración de glucosa son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los primeros actúan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las glándulas de secreción interna. cuya sensibilidad está regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipófisis por el otro. . en ayunas. pues es utilizada por todas las células para producir energía y por algunas células para funciones más especializadas por ejemplo glucogénesis. . a la vez que acelera la oxidación de glucosa en diferentes tejidos. La glicemia se eleva después de la ingestión de un alimento rico en hidratos de carbono para luego descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas después de la ingestión vuelve al nivel de ayunas. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de administración de insulina. el efecto se debe fundamentalmente a que la hormona favorece la formación de glucógeno en el hígado y en el músculo. una excesiva excreción de glucosa por la orina (glucosuria) y un reducido nivel de glucógeno en el hígado. aminoácidos. Se explica así que la falta de insulina determina una hiperglicemia que es el signo fundamental del cuadro denominado Diabetes. La insulina también favorece la conversión de los hidratos de carbono en ácidos grasos y por otro lado inhibe la gluconeogénesis a partir de los aminoácidos.35 REUNION DE LABORATORIO N° 06 PRACTICA N° 13 REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA ACCION DE LA HORMONA INSULINA I. REACTIVOS A UTILIZAR . La secreción de insulina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia. lipogénesis y otras semejantes.Solución de insulina cristalizada (Lilly): I Unidad por ml. la glicemia es muy constante. . de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la producción y la utilización de la glucosa sanguínea. otros carbohidratos y de glucosa absorbida por el intestino. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea proviene de: glucógeno hepático. La administración de insulina va seguida de la glicemia (hipoglicemia) cuya magnitud depende de la dosis administrada. La insulina ejerce efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otros nutrientes. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas. Siendo en la sangre arterial mayor que en la venosa. de manera que cada vez se eleva la glicemia.

de la tasa de llegada e índice de salida de la glucosa de la sangre. Hacer una gráfica de glicemia vs tiempo       IV. Explique brevemente la regulación de la glicemia. 3. 30 y 60 minutos después de inyectada la insulina. en términos generales. Explique la naturaleza química y las acciones biológicas de la insulina.36 III.  Extraer una primera muestra de sangre del pabellón auricular del conejo. Explique cómo y porqué se producen los signos y síntomas del cuadro clínico de hipoglicemia. lo que hace un total de tres muestras en una hora. como resultado. . Dosis de la solución de insulina cristalina (I Unidad por ml) inyectar I Unidad por Kilogramo de peso corporal. 4. La que servirá para establecer los valores basales de glicemia.  Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de insulina. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.  Luego extraer muestras de sangre a los 15 . y y Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de insulina a inyectar. Explique el mecanismo de acción de la insulina en la homeostasis de la glucosa. EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE INSULINA. que facilita la medida de la dosis. 2. ¿Cuáles son las hormonas contrarreguladoras y su mecanismo de acción? 5. Anotar los resultados en relación al tiempo. CUESTIONARIO: 1. Utilizar una jeringa hipodérmica de 1 ml.

III. 2. 30 y 60 minutos después de inyectada la adrenalina. LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE 1.25 ml de la solución a utilizar por kg de peso. 4. ¿Cuál es el mecanismo de acción hormonal de la adrenalina a nivel de sus órganos blanco? Explique de manera suscinta el efecto de la adrenalina sobre la glicemia. INTRODUCCION: La adrenalina. El efecto glucogenolítico de la adrenalina es debido a que activa a la fosforilasa. 3. Servirá para establecer los valores basales de glicemia. Luego extraer muestras de sangre a los 15 . La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de la administración de adrenalina. sometidos a ayuno de 8 a 12 horas. 2. II. Con los resultados así obtenidos. hormona secretada por la médula suprarrenal. además de actuar en el músculo. 4. . Utilizar una jeringa hipodérmica de tuberculina que facilita la medida de la dosis. CUESTIONARIO: 1.  Dosis de la solución de adrenalina (0. lo que hace un total de tres muestras en una hora. La secreción de adrenalina parece estar condicionada en forma importante por el nive de glicemia. Extraer una primera muestra de sangre. Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de adrenalina según el peso del animal. tiene acción hiperglicemiante. .1 mg por ml. por la ausencia en este de la glucosa 6.025 mg por cada kilogramo de peso corporal que corresponde a 0. si l aparece hipoglicemia se segrega más adrenalina y glucagón que aceleran la regulación que espontáneamente debe realizar el hígado.Jeringas hipodérmicas de 1 cc. tomando las variaciones en relación al tiempo.37 ACCION DE LA HORMONA ADRENALINA I. EXTRACCION DE ADRENALINA.fosfatasa.Solución de adrenalina 0.1 mg/ml) inyectar 0. 3. con especial referencia al metabolismo de los carbohidratos. Anotar los resultados en relación al tiempo. ¿Cuál es el efecto metabólico de la adrenalina sobre el hígado y sobre el tejido muscular y que efecto produce sobre la glicemia? . del pabellón auricular del conejo. REACTIVOS A UTILIZAR . construir una gráfica.Glucómetro. ACTIVIDADES INTRUCCIONALES: Procedimiento  Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de adrenalina a inyectar. Con cada una de las citadas muestras realizar los dosajes de glucosa según el método de Glucocinta 5. Explique la naturaleza química y las acciones fisiológicas de la adrenalina. ello se debe a que favorece la conversión del glucógeno en glucosa (glucogenólisis) en el hígado. . la glucogenólisis se realiza con la formación de lactato el que va ha contribuir directamente a la formación de glucosa y glucógeno en la célula hepática por los mecanismos gluconeogenéticos. ¡ ¡ ¡ IV.Conejos adultos de más de 2 kg de peso corporal.

Por el contrario. INTRODUCCION: En la orina de sujetos normales no existen cantidades detectables de azúcares en orina. y por tanto es explicable que no aparezca glucosa en orina. utilizando un método específico a base de glucosa oxidasa y otro inespecífico en base al reactivo de Benedict. Los azúcares forman más o menos la décima parte de dicha cantidad y de ella no puede decirse que su totalidad esté constituída por glucosa. c) Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato cloral. en presencia de glucosa (sustrato) de la orina remueve de éste 2 iones hidrógeno (2H+) formando gluconolactona). etc. el cual es hidratado a ácido glucónico. formaldehído. El peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa oxida a la 0-tolidina y toma color azul. en presencia de peroxidasa produce 0-tolidina oxidasa (de color azul) más agua. Cuando la capacidad de reabsorción renal disminuye. sin tomar en cuenta su acción en el metabolismo hidrocarbonado? REUNION DE LABORATORIO N° 07 PRACTICA N° 14 DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA EN ORINAY SU DIFERENCIACIÓN DE OTROS AZUCARES REDUCTORES I. creatinina. por acción de la glucosa oxidasa produce ácido glucorón más peróxido de ico hidrógeno. pero como anotamos éste identifica a las sustancias con capacidad reductora y por tanto es de carácter inespecífico. II. fructuosa. b) Otros compuestos orgánicos: ácido homogentísico. Este. la orina en glucosa aparece aunque ésta se encuentre en concentraciones normales en la sangre (diabetes insípida). además de glucosa. La prueba está basada en que la glucosa urinaria en presencia de oxígeno. La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras.5 y 1.38 5. La glucosa oxidasa. Los iones hidrógeno removidos se combinan con el oxígeno atmosférico y forman peróxido de hidrógeno (H2O2). La glucosa del filtrado glomerular renal se reabsorbe en su totalidad en los tubos contorneados proximales. REACTIVOS A UTILIZAR . de uso generalizado en clínica. cuando existe insuficiencia renal (menor filtración) no aparece glucosa en la orina aunque la concentración de glucosa se encuentra elevada por encima de 180 mg %. Sin embargo. pero cuando la glicemia supera los 180 mg % se puede producir glucosuria (presencia de glucosa en orina) porque en estas condiciones se supera la capacidad del riñón para reabsorverla (dintel renal). ácido úrico. puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que podemos señalar: a) Otros azúcares reductores: lactosa. es posible encontrar cierta cantidad de elementos reductores que se eliminen diariamente entre 0. ¿Qué efectos tiene la adrenalina. ácido glucorónico. La glucosa puede ser determinada de manera específica utilizando como reactivo básico la glucosa oxidasa (método enzimático). ácido ascórbico. galactosa y pentosas.5 g/l. En la orina. Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza para determinar glucosa en orina.

6. al ser tratada con el método de la glucosa oxidasa. 5. primero con el reactivo de Benedict y luego por el método de la glucosa oxidasa Que presunciones plantearía si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de Benedict da resultado positivo y sin embargo. incluida la glucosa Que resultados podrían obtenerse al tratar una muestra problema de orina. Colocar en baño de agua hirviendo por 5 min o exponer al fuego directo hasta ebullición por 1 min. da negativo Ante una prueba positiva de glucosa en orina: ¿Qué presunciones diagnósticas. 4. 2. después de humedecida la cinta. 3. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. Compare la intensidad de la coloración azulada con una escala adjunta que representa aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa. 1. Procedimiento: 1. Si aparece un precipitado de color rojo ladrillo. CUESTIONARIO: 1. Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recién emitida contenida en un depósito de 5. IV. 3. Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras.10 ml. Fundamente la utilización del reactivo de Benedict para la detección de sustancias con capacidad reductora. Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del líquido contenido en el tubo. 2. 3. Llevar al baño de agua hirviendo por 5 min o exponer el tubo al fuego directo hasta que hierva por 1 min. Observar si a los 60 segundos. Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas (Glucocinta Lilly). . en relación a la glicemia del paciente podría plantear? Explique el fundamento del método de a glucosa oxidasa para la detección de glucosuria. adquiere o no color azul. Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml. Agitar para evitar que el líquido se proyecte hacia fuera del tubo. 2. Agregar orina problema: 5 gotas. Observar si hay cambio de color y precipitado. Determinación enzimática de la glucosa en orina (Método de la glucosa oxidasa). realizamos la siguiente determinación con la misma muestra de orina. III. Explique que es el umbral renal de la glucosa. 4. la reacción demuestra la presencia de sustancias reductoras. Determinación de sustancias reductoras en orina mediante el reactivo de Benedict.39 - Reactivo de Benedict.

40 .

De acuerdo a su composición química los mucopolisacáridos están agrupados en dermatán sulfato. III y IV. INTRODUCCION: Determinar desórdenes genéticos puede involucrar los sistemas enzimáticos esenciales del metabolismo de los mucopolisacáridos. Negativo: aparición solamente de un color azul pálido. III.Usar orina fresca o de 24 hrs conservadas en refrigeración (no usar preservantes). Transferir a una caja Petri llena de solución de lavado. II. CUESTIONARIO: 1. cartílago. Estas son subdividas en varios grupos tales como : Síndrome de Morquiolo. cordón umbilical. heparán sulfato y queratán sulfato. . Síndrome de Sanfilippo.Poner una gota de orina al centro de un papel de prueba con Azure-A. 3. RESULTADOS Positivo: aparición de un color púrpura. Dejar por 20 min.1 ml. cerca de 100 mg/día. en contacto con mucopolisacpáridos forma un complejo de color púrpura metacromático. La finalidad del experimento es determinar cualitativamente en orina la excesiva excreción de mucopolisacáridos. 0.Solución de Lavado :  Metanol  Acido acético glacial  Agua destilada. 2. Dejar 3 min. aorta. Síndrome de Hurler. válvulas del corazón y son responsables de las características físicas de estas estructuras. IV. II. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. REACTIVOS A UTILIZAR . Los mucopolisacáridos son sustancias de gran peso molecular que se encuentran en varios tejidos: Conectivo. Un resultado positivo por este procedimiento debe ser confirmado y cuantificado por columna cromatográfica ó utilizando la reacción de precipitación con cloruro de cetil piridium. La presencia de mucopolisacáridos en orina puede detectarse por un simple procedimiento o Test de Identificación de Mucopolisacáridos que se basa en que el papel Whatman I impregnado con el colorante AZURE-A. Si un resultado cualitativo para investigar mucopolisacáridos en orina ha sido positivo ¿Porqué debe ser confirmado y cuantificado por cromatografía o precipitación? ¿Cuál es la constitución química básica de los glicosaminoglicanos (mucopolisacáridos)? ¿Cuál es la constitución química básica de los proteoglicanos? Cite 5 ejemplos de éstos. llamados también MPS I. cantidad que es bastante elevada si se compara con los 15 mg/día que excretan las personas normales. los cuales son excretados anormalmente en grandes cantidades en las mucopolisacaridosis (MPS).Papel Whatman I impregnado con Azure-A . . 300 ml .41 PRACTICA N° 15 IDENTIFICACION DE MUCOPOLISACARIDURIA I. 20 ml. . Sacar y secar la tira de papel en estufa a 80º C o con aire caliente. Síndrome de Hunter. resultado obtenido cuando la excreción está sobre el límite superior normal de 15 mg/día.La orina turbia debe ser filtrada o centrifugada previamente. Los individuos con MPS secretan grandes cantidades de mucopolisacáridos.

42

4.

¿Cuál es la importancia biológica del ácido hialurónico, condroitina y heparina?

III UNIDAD METABOLISMO DE LIPIDOS

REUNION DE LABORATORIO N° 08
PRACTICA N° 16
DEMOSTRACIÓN DE LA DIGESTION DE LAS GRASAS IN VITRO. ACCION EMULSIFICANTE DE LAS SALES BILIARES SOBRE LAS GRASAS. ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA SOBRE LOS TRIGLICÉRIDOS Y EFECTO DE LAS SALES BILIARES
I. INTRODUCCION: Los triglicéridos son los principales lípidos de la dieta. En el estómago ocurre la acción de la lipasa gástrica y la licuefacción de la masa de lípidos de los alimentos por contraccion peristálticas. La es principal digestión ocurre en el duodeno, tiene lugar en la interfase agua-lípido y su velocidad depende del área de superficie de la interfase, la cual es grandemente incrementada por el movimiento peristáltico del intestino combinado con la acción emulsificante de los ácidos biliares. Los ácidos biliares son moléculas anfipáticas sintetizados por el hígado a partir del colesterol y secretados como conjugados de glicina y taurina. La lipasa pancreática (Triacilglicerol lipasa) cataliza la hidrólisis de los triglicéridos en sus posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto con ácidos grasos. La actividad enzimática de la lipasa pancreática incrementa grandemente cuando contacta la interfase agua-líquido, un fenómeno conocido como activación interfacial. La unión a la interfase agua-líquido requiera la colipasa, una proteína de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con la lipasa pancreática (449 residuos), con cambios conformacionales que f rma una o superficie hidrofóbica y deja libre el centro activo. La alteración en la digestión o absorción de las grasas produce esteatorrea La finalidad de la práctica es demostrar la acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando su efecto con el agua y el cloroformo. Asimismo la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y el efecto de las sales biliares. II. REACTIVOS A UTILIZAR III. Cloroformo Aceite vegetal, de olivo Solución de sales biliares Buffer fosfato 0.1M pH 8,0 Emulsificación de aceite vegetal Solución de fenolftaleina (Solución alcohólica) Hidróxido de sodio (NaOH) 0.1N

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

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y

Acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas utilizando tubos de 15 x 125 mm. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Aceite de olivo(gotas) Agua destilada (ml) Cloroformo (ml) Sales Biliares (ml) Agitar enérgicamente los tubos Dejar en reposo y anotar los resultados para interpretarlos Acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y efecto de las sales biliares sobre la reacción enzimática utilizando tubos de 20 ± 25 x 150 mm. COMPONENTES (ml) TUBOS Emulsificación de aceite vegetal Buffer fosfato 0.1M pH 8.0 Solución de sales biliares 1 % Solución de extracto pancreático 1 % Agua destilada I 2 2 2 3 II 3 2 2 2 III 3 2 2 2 IV 3 2 2 2 Tubo 1 3 5 Tubo 2 3 3 2 Tubo 3 3 2 -

Mezclar los 4 tubos y llevar al baño maría a 37 °C , por 30 minutos, agitando de vez en cuando. Al finalizar el tiempo de incubación retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftaleína. Mezclar bien y luego realizar la titulación. TITULACION: Utilizando una pipeta graduada de 1 ml, dejar caer gota a gota NaOH 0,1N en el fondo de cada tubo del sistema, mezclar bien hasta la aparición de un color rosado tenue persistente. Anotar la cantidad de NaOH 0,1N gastados. Anotar los resultados para su interpretación. IV. CUESTIONARIO: 1. Explique lo que son sustancias anfipáticas. 2. Diferenciar emulsión de solución, acción de las sales biliares vs cloroformo. 3. ¿Cuántas clases de lipasa pancreática actuán en el intestino? 4. Cuál de los métodos para medir la actividad enzimática se ha empleado en esta práctica. Explique el papel de la fenolftaleína en la titulación. 5. Diferencie la absorción de los ácidos grasos según su tamaño.

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PRACTICA N° 17
DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS PRE Y POST PRANDIAL EN SUERO HUMANO
I. INTRODUCCION: Los lípidos de la dieta son principalmente triglicéridos. Son transportados junto a colesterol y fosfolípidos por los quilomicrones, formados en el enterocito. Los quilomicrones son las lipoproteínas más grandes, menos densas, ricas en triglicéridos, con la apoproteína apo B48. Por el conducto toráxico llegan a la circulación general. El pico máximo de lipemia postprandial se observa entre las 4 y 6 horas de la ingesta, y al cabo de 9 a 10 horas retorna a los valores basales de lípidos, especialmente de los triglicéridos. Los niveles de lípidos postprandiales, especialmente de los triglicéridos dependen de la cantidad de lípido de la dieta, de la digestión y absorción, de los niveles basales sanguíneos, de la acción de la lipasa lipoproteic en los tejidos extrahepáticos. La lipasa a lipoproteica actúa sobre los triglicéridos de los quilomicrones, liberando ácidos grasos que son captados por los tejidos extrahepáticos. Los quilomicrones son convertidos en remanentes de quilomicrones y captados por el hígado. Se ha considerado al incremento de la lipemia postprandial como un factor riesgo de aterogénesis. La finalidad de la práctica es demostra las variaciones de la concentración de trigliceridos en suero después de la ingesta de alimentos de alto contenido de grasas II. REACTIVOS A UTILIZAR - Reactivo enzimático para determinación de Triglicéridos ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Un alumno por cada mesa vendrá en ayunas de al menos 10 horas, a las 7 a.m. se les extraerá una muestra basal. Ingerirán una dieta rica en grasas conteniendo un vaso de leche, un huevo, 2 panes y 10 aceitunas. A las 4 y 7 horas de la ingesta, se obtendrá una segunda muestra. Se obtendrá el suero y se hará la determinación de triglicéridos. Armar el siguiente sistema. COMPONENTES BLANCO STANDARD DESCONOCIDO Muestra --------10 ul Standard ----10 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar e incubar 10 minutos de 20« 25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. Medir la absorbancia del Standard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A). Cálculos:

III.

C ! 200 v

(ADesconocid o ?mg / dl A (AStandar
1.71 mmol/l 2.28 mmol/l

C ! 2.28 v

(ADesconocido ?mmol / l A (AStandar

Valores Referenciales Sospechoso: sobre 150 mg/dl ó Elevado: sobre 200 mg/dl ó

5. 2. . CUESTIONARIO: 1. Cuál es el efecto de la edad. Grafique los cambios de triglicéridos postprandiales en función del tiempo. 3. Alteración de la lipemia postprandial en diabetes y familiares de diabéticos. el ejercicio y el género sobre la lipemia postprandial. 4. Destino de los productos de acción de la lipasa lipoproteica sobre los triglicéridos. Explique porqué el incremento de la lipemia postprandial es considerado un factor de riesgo coronario.45 IV.

cristales. Los cuerpos cetónicos son eliminados por la orina y la a etona también por la c respiración. de la beta oxidación y de la cetogénesis. el aumento de la lipólisis. DETERMINACION SEMICUANTITATIVA DE CUERPOS CETONICOS EN ORINA I. el ácido beta hidroxibutírico y la acetona. En condiciones patológicas como la Diabetes mellitus. Su concentración normal en orina es de 125 mg/ 24 horas. y en sangre hasta 1mg/dl. Prueba de Rothera y Trabajar del tubo identificado como orina patológica y Utilizar nitroprusiato en polvo. . al superar la capacidad de oxidación de los tejidos extrahepáticos lleva a niveles aumentados de cuerpos cetónicos.Sulfato de amonio. produce acetil CoA que ingresa al Ciclo de Krebs y en parte se utiliza en la síntesis de cuerpos cetónicos (cetogénesis). III. INTRODUCCION: La beta oxidación de los ácidos grasos en el hígado.46 PRACTICA N° 18 IDENTIFICACIÓN DE LOS CUERPOS CETONICOS EN LA ORINA. Aumentan en sangre (cetonemia) y en orina (cetonuria) por condiciones fisiológicas como el ayuno prolongado. Prueba de Legal El nitroprusiato de sodio diluido en presencia de cuerpos cetónicos. en la dieta pobre en carbohidratos. en toda hipercatabolia como la fiebre. sin mezclar) 1ml _________________________________________________________________________ Anotar sus resultados. de la siguiente manera: II. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento INVESTIGACION DE ACETONA . a l denominada cetoacidosis diabética.Nitroprusiato de sodio.5 g Mezclar hasta disolver los cristales de Sulfato de Amonio. REACTIVOS A UTILIZAR: . Procedimiento: Armar el siguiente sistema: COMPONENTES TUBO Orina 3 ml Cristales de sulfato de amonio 0. en los vómitos. en el síndrome de Fanconi.Cloruro Férrico. . Nitroprusiato de sodio 10% 3 gotas Amoníaco (agregar lentamente por las paredes del tubo. Estos son el ácido acetoacético. El diagnóstico y monitoreo de su tratamiento se hace con su determinación en sangre o/i orina. a nivel mitocondrial. especialmente de acetona. el hiperinsulinismo. solución al 5% en H2O. Dado que éstos son ácidos se produce acidosis metabólica.Disponer de dos tubos que contengan orina normal y orina patológica. Los dos primeros pasan a la sangre y son fuente de energía en los tejidos extrahepáticos como el corazón y el músculo esquelético. rinde un color azul violeta. solución al 10% en H2O . hipertiroidismo. en la enfermedad de Von Gierke y otras glucogenosis. incluyendo el cerebro en el ayuno prolongado. En la Diabetes mellitus.

15.9 cc 2. para calcular la concentración en orina diluida. Compare los métodos para determinar los cuerpos cetónicos.Armar dos sistemas que contengan orina normal y patológica.1 cc DILUCION 1/10 1/20 1/30 1/40 1/50   Agregar una gota de cada una de las diluciones.9 cc 3. Cuál es el mecanismo fisiopatológico de la cetoacidosis en un paciente que llega al hospital por alcoholismo agudo .9 cc 1. etc. INVESTIGACIÓN DE ACIDO ACETOACETICO .1 cc 0. Observar la máxima dilución de la orina en el que aparece color azul violeta y multiplicar por el denominador de la dilución alcanzada por 10 y se tendrá la cantidad aproximada de acetona en mg por 100ml. Procedimiento (Se utiliza orina filtrada): COMPONENTES Orina filtrada Cloruro Férrico. 3. en cada una de las excavaciones que contiene el reactivo. cetonuria. Realice una comparación entre la síntesis de cuerpos cetónicos con la etapa inicial de la síntesis de colesterol Defina: cetonemia. 150 mg/dl. Prueba de Cloruro Férrico o de Gerhart. de la siguiente manera: AGUA 0.9 cc + + + + + ORINA 0.1 cc 0. Se basa en que en presencia de cloruro férrico. 50. 1/20. 5. cetoacidosis y de ejemplos de cada uno de ellos.2 g de reactivo sólido de nitroprusiato de sodio en cada una de éstas. 1/30. Esperar 20 segundos. estimando la concentración como negativo 5. Esto es debido a que el nitroprusiato de sodio en polvo da reacción positiva solo cuando en la orina sin diluir alcanza la concentración mínima de 10 mg% de acetona y por eso. 4.9 cc 4. se debe multiplicar por 10 el número de veces que se ha diluido ésta. Diluir la orina al 1/10. CUESTIONARIO: 1. el ácido acetoacético rinde una coloración rojo burdeos. leer en escala colorimétrico. Sumergir la tira en el frasco conteniendo la orina. Cuál es la importancia de la cuantificación de los cuerpos cetónicos en el monitoreo de la cetoacidosis. solución 5% en agua TUBO 5 ml gota a gota hasta la aparición del Color rojo burdeos si existe ácido Acetoacético IV. Este método con sus dos variantes es posible aplicarlo al suero sanguíneo.1 cc 0.1 cc 0. Uso de tira reactiva. 2. para investigar acetona y tener una cifra aproximada en su cuantía.47   En una lámina de porcelana con excavaciones colocar 0.

En los triglicéridos se considera: normal menos de 150mg/dl. limítrofe de 150 a 199. Son hipertrigliceridemias primarias. . regulando su fluidez. Medir la absorbancia del Starndard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A) III. normal a 40 a 59.Reactivo precipitante de HDL: ácido fosfotungstico. el lipoteroidismo. la hiperlipidemia familiar combinada. por el método enzimático y la determinación de HDL. cirrosis biliar. se realizará la determinación de colesterol sanguíneo. y el resto en la VLDL y HDL.Reactivo Standard para colesterol 50 mg/dl. Entre las secundarias: La diabetes. Los triglicéridos an ayunas circulan unidas a las VLDL y son fuente de energía para los tejidos.Precipitante para macro ensayos (PRECa) . el síndrome nefrótico. alto o protector mayor o igual a 60. la hipercolesterolemia poligénica. 3 niveles: Bajo o de riesgo < 40. obesidad central. etc. INTRODUCCION: El colesterol es un componente importante de las biomembranas. A partir de él se forman los ácidos biliares y las hormonas esteroideas. en el denominado síndrome metabólico. la hipertrigliceridemia familiar..Precipitante para semimicro ensayos (PRECb) ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN DE COLESTEROL SANGUÍNEO Armar el siguiente sistema: COMPONENTE BLANCO PROBLEMA ESTÁNDAR Suero ----10 ul ----Estándar 200 mg/dl --------10 ul Reactivo enzimático 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar. En la presente práctica. clorhidrato de magnesio. el hipotiroidismo. el HDL. la disbetalipoproteinemia. La HDL realiza el transporte reverso del colesterol. la gota.48 REUNION DE LABORATORIO N° 09 PRACTICA N° 19 DETERMINACION DE PERFIL LIPIDICO I. Es transportado principalmente por la LDL que es considerada aterogénica. Son causas secundarias: la diabetes. El HDL colesterol. incubar 10 minutos de 20«25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. hiperglicemia e hipertensión. el alcoholismo. La hipertrigliceridemia puede deberse a causa primarias o familiares. y el LDL. Entre las hipercolesterolemias primarias se señalan: La hipercolesterolemia familiar. de los tejidos hacia el hígado y es considerada antiaterogénica . II. la hiperlipidemia familiar combinada la hiperkilomicronemia. 5 niveles: Óptimo < 100 mg/dl. . severa 500 o más La hipercolesterolemia puede deberse a causas primarias o secundarias. o secundarias a otras enfermedades. En el colesterol se considera 3 niveles: Deseable < 200 mg/dl. resistencia a la insulina. ictericia obstructiva.El III Panel de Expertos ha establecido los valores de referencia para el colesterol. Hipertrigliceridemia moderada de 200 a 499. su incremento también es considerado factor de riesgo coronario. previa precipitación de las otras lipoproteínas. limítrofe alto 200-239 y alto definitivo > 240 (Hipercolesterolemia > 200 mg/dl). el uso de anticonceptivos orales. La hipertrigliceridemia se asocia a disminución de HDL. REACTIVOS A UTILIZAR: . . El LDL colesterol.

Centrifugar for 2 minutos a 10000 RPM.7 mmol/l Componente Macro Semi-micro Suero 500 ul 200 ul PRECa 1000 ul ----PRECb ----500 ul Mezclar bien. incubar por 10 minutos a temperatura ambiente. incubar por 5 minutos a 37 ºC o 10 minutos a 20«25 ºC.7 mmol/l ó 6.17 v ¢ ¢ muestra standard ?mmol/l A ¤ ¤ £ . CALCULOS: Concentración HDL-Colesterol: Macro método : ¤ C ! 150 v A Desconocid o A Standard mg/dl Semi  micro método : ¤ C ! 175 v A Desconocid o A Standard mg/dl TG 5 Concentración de LDL-Colesterol: VALORES DE REFERENCIA: HDL-Colesterol: Hombres LDL  C ! TC  HDL  C  ?mg/dlA Mujeres (mg/dl) ¢ standard £ ¢ ! 200 v muestra ?mg/dl A ó ! 5. comparando con el blanco. respectivamente. alternativamente por 10 minutos a 4000 RPM Después de centrifugar separar el sobrenadante del precipitado y determinar la concentración de colesterol: Componente Blanco Standard Desconocido Agua Destilada 100 ul --------Standard ----100 ul ----HDL sobrenadante --------100 ul Reactivo de trabajo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar.49 CALCULOS VALORES REFERENCIALES: Sospechoso: sobre 220 mg/dl Elevado: sobre 260 mg/dl DETERMINACIÓN DE HDL -COLESTEROL: Armar el siguiente sistema: ó 5. Leer las absorbancias del desconocido y del Standard. dentro de 60 minutos ( A).

Realice una breve explicación del rol de la LDL en la aterogénesis. Señale la importancia clínica del colesterol. Señale las principales causas de HDL disminuido. 3. . 8. CUESTIONARIO: > 65 45-65 < 45 150 mg/dl 190 mg/dl 1. 4. 2.50 Normal > 55 Bajo riesgo 35-55 Riesgo elevado < 35 LDL-Colesterol: Sospechoso: Elevado: IV. 5. Cualés son las causas primarias de hipertrigliceridemia. Señale la importancia fisiológica del colesterol. 7. Alteraciones del perfil lipídico en la diabetes y en el hipotiroidismo. 6. Cuál es la importancia de la hipertrigliceridemia en la aterogenesis. Realice una breve descripción de hipercolesterolemia familiar y su relación con la cardiopatía isquémica.

la hiperlipidemia familiar combinada. etc. LDL y triglicéridos entre ambas ratas. En el presente experimento. Se determinará el perfil lipídico antes y después del tratamiento y se compararan los resultados. INTRODUCCION: El aumento de los lípidos sanguíneos o hiperlipidemia constituye una situación metabólica de riesgo. Se considera aterogénicos el aumento del colesterol y de los tigliceridos. la hipertrigliceridemia familiar etc. bajo la supervisión del personal de la sección. Se dispondran de 20 ratas albinas adultas. especialmente coronario.  Reactivo precipitante para HDL. REACTIVOS A UTILIZAR:  Ratas de peso aproximado de 200gr. o Diez de ellas constituirán el grupo control y seguiran su dieta habitual agua y alimentos (maíz) ad libitum. puede producir el incremento de los lípidos sanguíneos. Con la ayuda del personal de la sección. Una dieta rica en grasas saturadas aumenta el riesgo de hiperlipidemia y consiguiente mayor riesgo coronario. disminución de las grasas saturadas.    . las que recibiran adicionalmente 2 cc de aceite preparado de sebo de pollo. se busca mostrar como la ingesta de una dieta rica en grasa saturada con sebo de pollo por 3 semanas. como parte del cambio de estilo de vida junto al ejercicio y control de peso. Extracción de las muestras. El tratamiento será por 21 días. o Las diez restantes conformaran el grupo experimental. 1-2 representantes de cada mesa se encargarán del control de la dieta.  Dieta standard para ratas a base de maíz. La ATP III.51 PRACTICA N° 20 HIPERLIPEMIA EXPERIMENTAL I. Se compararán los valores de colesterol. La dieta es importante en el control de la hiperlipidemia.  Sebo de pollo. aumento de las grasas monoinsaturadas y polinsaturadas. II. sidrome nefrotico. Las cuales se dividirán en dos grupos en forma aleatoria. III. Las hiperlipidemias pueden ser primarias o familiares como la hipercolesterolemia familiar. Se extraera el suero y a cada una se determinara el perfil lipídico siguiendo el método enzimático empleado en la práctica anterior. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procemiento  Tratamiento experimental. HDL.  Set de determinación de triglicéridos enzimático. ha establecido los criterios para una dieta adecuada que incluye disminución de la ingesta de colesterol. hipotiroidismo. cada mesa obtendrá de cada rata control y experimental una muestra sanguínea de la cola antes del tratamiento y otra al final. Y secundarias a otras patologías como la diabetes.  Set de determinación de colesterol enzimático.

Qué alimentos son ricos en colesterol. 2. 4. . Señale en detalle la dieta recomendada por la ATP III. Qué alimentos son fuentes de omega 3. Qué alimentos son fuentes de fibra. 7. para el tratamiento de la hiperlipidemia. 6. 5. Qué alimentos son ricos en grasas saturadas. Qué alimentos son ricos en grasas polinsaturadas. 3. CUESTIONARIO: 1.52 IV. Qué alimentos son ricos en grasas monoinsaturadas.

Solución acuosa de ninhidrina al 0. La falta de enzimas proteolíticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las heces.1 M pH 8. y es específica de los enlaces peptidicos sobre el lado carboxílico de residuos de aminoácidos básicos: lisina y arginina solamente. dipeptidasas. que provienen de la carne de los alimentos).53 IV UNIDAD PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS: INTEGRACION DEL METABOLISMO REUNION DE LABORATORIO N° 10 PRACTICA N° 21 DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA I. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) I II III III. . La elastasa tiene una especificidad amplia.25% saturada con butanol. con retardo marcado del crecimiento. c) de origen intestinal: aminopeptidasas. . y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados en las heces). elastasas. como la glicina. determinado los productos (aminoácidos) con ninhidrina II.Solución de extracto pancreático. La presente práctica tiene como finalidad demostrar la acción hidrolítica de las enzimas digestivas contenidas en el páncreas sobre la caseína o proteína de la leche. La tripsina. quimotripsina. .Caseína al 1% en buffer fosfato 0. o degradación hasta aminoácidos en el tubo digestivo. La carboxipeptidasa hidroliza el enlace peptídico carboxiterminal en las cadenas polipeptidicas. Son endopeptidasas: pepsina. alanina y serina.1 M pH 8. triptofano y fenilalanina. existe hipoproteinemia. Son exopeptidasas: carboxipeptidasa y aminopeptidasa. La quimotripsina es específica para los enlaces peptidicos de los aminoácidos sin carga como los aromáticos: tirosina. ataca a los residuos pequeños. . En el lactante con ausencia congénita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de activación de quimotripsinógeno y procarboxipeptidasa. elastasa y carboxipeptidasa. tripsina. . INTRODUCCION: La digestión de las proteínas.Acido tricloroacético al 10%. b) de origen pancreático: tripsina. REACTIVOS A UTILIZAR: . es activada por la enterocinasa en el intestino. quimotripsina.Buffer fosfato 0. es un proceso complicado que se realiza con el concurso de diversas enzimas proteolíticas Entre estas enzimas proteoliticas tenemos: a) de origen gástrico: pepsina y renina.

Interprete todos los resultados encontrados en la práctica y explíquelos usando algunos dibujos. IV.0 Solución de extracto pancreático Agua destilada Pasos: * * * * * * * 1 1 1 --- 1 1 --1 --1 1 1 Mezclar y colocar al baño de agua a 37 ºC por 30 minutos. Observa los cambios de color de cada tubo.5 ml. . Explique el sitio de producción y la acción de las hormonas que intervienen en el proceso de digestión y absorción de los aminoácidos. Escriba dos esquemas mostrando dos ejemplos de transaminación y dos de desaminación con los nombres de aminoácidos y alfa cetoácidos que participan. En este nuevo sistema. Después del tiempo de incubado tomar 0. Observe las variaciones que se produce en cada tubo. de cada uno de los tubos y trasladarlo a otro sistema numerado (I.54 Caseína al 1% Buffer fosfato 0. 4. III). agregar 1 ml de solución de ninhidrina. agregue gota a gota 1 ml de ácido tricloroacético al 10% agitando continuamente. Luego a los tubos de incubación del primer sistema. Elabore un esquema con la digestión y absorción de proteínas y aminoácidos. 3. II. Mezclar y llevar a un baño de agua hirviendo (franca ebullición). CUESTIONARIO: 1.1 M pH 8. durante 3 a 5 minutos. 2.

Los extractos de páncreas poseen también un péptido inhibidor de la tripsina.25% saturada con butanol.Solución de ninhidrina 0. . ello explica en parte que el valor nutritivo del frijol de Soja aumenta considerablemente si se coce a ebullición por varios minutos.Proteína de soya hervida 30%. la alfa-1 antitripsina fecal (1-AT-Fecal) que es una glicoproteína.5 0.1 M pH 8.Etanol absoluto III.0 Proteína de soja cruda 30% Proteína de soja hervida 30% Solución de tripsina 20 mg% Pasos: a. Algunos alimentos en estado natural poseen componentes perjudiciales para la nutrición. secretada a la luz intestinal. El ovomucoide de la clara de huevo inhibe también de manera enérgica la tripsina.55 PRACTICA N° 22 INHIBICION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS: ACCION DE LA SOYA HERVIDA Y CRUDA SOBRE EL EFECTO PROTEOLITICO DE LA TRIPSINA I. Por ejemplo el frijol de soja contiene un principio cuya actividad antitripsina dificulta la digestión de las proteínas. Después del tiempo de incubación: agregar a cada uno de los tubos 2 ml de etanol absoluto.5 0. b.5 - . INTRODUCCION: La tripsina actúa como una endopeptidasa e hidroliza prácticamente toda clase de proteínas. . . II. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0. efecto que desaparece cuando la soya es hervida. c. . Digiere las proteínas desnaturalizadas y parcialemente digeridas.2 II 2.5 III 2.5 0. . con actividad antioxidante y antitripsina que disminuye el apetito y dificulta la digestión de las proteínas. .0. La finalidad del siguiente experimento es demostrar el efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre el efecto proteolítico de la tripsina.5 0. con mayor rapidez que las originales desdoblándose en polipéptidos de peso variable y algunos aminoácidos. REACTIVOS A UTILIZAR.Solución de tripsina 20 mg%.Proteína de soya cruda 30%.5 0. Mezclar y centrifugar a 2500 rpm por 10 min.5 0.1 M pH 8. Esta sustancia de naturaleza peptídica es inactivada por el calor.Buffer fosfato 0.2 IV 2. Es interesante también que el aceite de semilla de algodón posea un pigmento. Incubar en baño maría a 37°C durante 1 hora. el gisipol. I 2.

CUESTIONARIO: 1. f. e. 4. 3. Explique con sus propias palabras cuál cree que es el objetivo de la práctica que realizó.56 d.25%. Someter los tubos a temperatura de ebullición del agua utilizando baño maría durante 5 minutos. IV colocar 1 ml de sobrenadante de los tubos respectivos del paso anterior y agregar 1 ml de ninhidrina 0. Anotar los resultados. III. 2. En otra serie de tubos numerados I . II. ¿Qué es el gisipol y cómo actúa en su acción antioxidante? Con dibujos represente la práctica realizada. IV. . Por qué razón el ovomucoide de la clara del huevo inhibe la acción de la tripsina.

57 REUNION DE LABORATORIO N° 11 PRACTICA N° 23 CUANTIFICACION DE PROTEINAS SERICAS TOTALES Y FRACCIONADAS I. II. respecto del Blanco del reactivo. para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540nm. por el método colorimétrico.8.Las fracciones globulínicas contienen varias proteínas específicas: inmunoglobulinas. Las proteínas plasmáticas por métodos químicos se clasifican en albúmina. conservación del equilibrio ácido básico. insuficiente ingestión de proteína. con inversión de A/G por aumento de las globulinas: en el mieloma múltiple. Agammaglobulinemia y la analbuminemia son cuadros demasiado raros.6 a 3. en la macroglobulinemia de Waldenström. Reactivo EDTA/Cu Reactivo BCF . que se pueden determinar por electroforesis. excreción. FUNDAMENTOS DEL METODO Determinación de Proteínas Totales: Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico. ceruloplasmina. REACTIVOS A UTILIZAR.8 g/dl y globulinas: 2. globulina y fibrinógeno. en presencia de un exceso de colorante.. Las cifras de proteínas plasmáticas totales pueden aumentar (hiperproteinemia) con cociente A/G normal en la hemoconcentración. etc.1 a 7. en medio tamponado a pH3.1 g/dl. inmunodifusión o inmunoelectroforesis. El origen de las proteínas plasmáticas es hepático con excepción de las globulinas gamma que se forman en las células plasmáticas. La presente práctica tiene por finalidad determinar las concentraciones séricas de proteínas totales y fraccionadas en personas normales y/o con procesos patológicos. La concentración sérica de las proteínas totales es de 6. transporte. en las colagenopatías. haptoglobina. La disminución de proteínas totales (hipoproteinemia) son generalmente asociadas con HIPOALBUMINEMIA que a su vez están acompañadas con pequeños cambios en las globulinas. regulación del equilibrio hídrico. la transferrina. es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra. en medio alcalino. etc.5 a 4. regulación del metabolismo. cuya intensidad es provisional a la concentración de proteínas totales en la muestra. En el suero solo albúmina y globulina . defensa contra las infecciones. Determinación de Albúmina: La albúmina reacciona específicamente sin separación previa con la forma aniónica de la bromo Cresolsulfon Ftaleina (BCF). en la gastroenteropatía exudativa con pérdidas fecales de proteínas.9 g/dl de las cuales albúmina: 3. en el kala-azar. disminución de la formación en el hígado como en la cirrosis. Los bajos niveles de albúmina pueden ser debidos a: incrementadas pérdidas de albúmina en la orina. etc. El aumento de absorbancia a 625 nm. INTRODUCCION: Las proteínas plasmáticas son importantes para el organismo porque realizan diversas funciones: coagulación.

8 g/dl Relación A/G = 1.01 ----1.0 g/dl Determinación de Albúmina. colocar: Componentes Muestra (ml) Standard (ml) Reactivo (ml) Blanco --------1. Mantener los tubos entre 15 y 28 ºC durante 10 minutos.5 ± 4.2 .58 III. Leer las absorbancias a 540 nm. llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo. El color resultante es estable por lo menos 30 minutos. colocar: B S D Suero Patrón 10 ul Muestra 10 ul.0 Desconocido 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Determinación de Proteínas Totales PROCEDIMIENTO: En tres tubos marcados B (Blanco).(g/dl) Relación A/ ! ¥ VALORES DE REFERENCIA: Albúmina = 3. Leer en espectrofotómetro a 625 nm o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo CALCULOS DE LOS RESULTADOS : Alb. S (Standard) y D (Desconocido). Reactivo BCF 1ml.(g/dl) Albúmina (g/dl) ! D v f f! S Albúmina(g/dl) PT.0 Standard ----0. 1 ml.0 Mezclar e incubar 10 minutos a 37rC. CALCULOS: FACTOR ! Concentrac ión Standard Absorbancia Standard  Proteina Total (g/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: 6. ó 20 minutos a temperatura ambiente. 1 ml. Mezclar con varilla.2 ± 2. S (Standard) y D (Desconocido). PROCEDIMIENTO: En tres tubos de fotocolorímetro marcados B(Blanco).Alb.0 a 8.01 1. (g/dl).

5. Cuáles son las principales características de las proteínas plasmáticas. en clínica? ¿En qué se basa la determinación de las proteínas totales y fraccionadas en nuestro experimento? Elabore un esquema sobre el proceso fisiopatológico de un edema. 4.59 IV. 2. . ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de las proteínas séricas totales y las fracciones albúmina y globulinas? ¿Qué importancia tiene determinar la relación albúmina/ globulina. CUESTIONARIO: 1. 3.

Son causas de proteinuria Renal: glomerulonefritis difusa. nefropatía lúpica. III. moléculas proteicas de variado tamaño incluyendo las más largas. hemoglobina. síndrome nefrótico. escapan en el filtrado de forma que los túbulos son incapaces de captar la gran cantidad de proteínas y resulta una masiva proteinuria. Cuando el glomérulo es dañado por alguna enfermedad. sin que exista evidencia de lesión renal. menos de 10 mg/dl. . Esta dilución debe ser preparada el mismo día. tuberculosis renal. La presente práctica tiene por finalidad determinar la presencia de proteínas en la orina y de cuantificarlas en caso que estén presentes en casos normales y en estados patológicos. REACTIVOS A UTILIZAR.85% a una concentración final de 25 mg/ml. se trata de proteínas. COMPONENTE (ml) TUBO Muestra de Orina 5. Si la turbidez persiste. aparece la proteína de Bence Jones. Las proteínas de peso molecular relativamente bajo y de pequeño tamaño pasan primero a través de los glomérulos injuriados. se trata de fosfatos que se han disuelto en medio ácido. La proteína de Bence Jones está constituída por las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas que constituye la proteína monoclonal. Si aparece un precipitado o enturbamiento se puede deber a la presencia de proteínas o fosfatos. Las proteínas son casi completamente absorbidas en los túbulos. luego las globulinas. Añadir: Solución de ácido acético al 2% IV gotas Si desaparece la turbidez. se ha hace más intensa o se forma un precipitado. El fibrinógeno es una molécula muy larga y escapa solo en enfermedad renal severa. Standard de proteína: Pueden usarse suero claro normal de concentración conocido o un suero control adquirido comercialmente. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LAS PROTEÍNAS EN ORI NA: Coagulación por el calor. mieloma múltiple.0 Someter a ebullición por 1 minuto. La proteinuria puede ser renal o extrarrenal. gravídica. etc.60 PRACTICA Nº 24 DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE PROTEINAS EN ORINA I. algunas enzimas. Acido acético al 2%. febril. Acido tricloroacético.85%. II. albúmina. nefropatía diabética. nefropatía tóxica.5% (en agua destilada) Cloruro de sodio 0. 12. glomerulonefritis focales proliferativas.). La proteinuria fisiológica (proteinuria ortóstatica) se presenta después de ejercicios y de permanecer largo tiempo en posición de pie. Extrarrenal: proteinuria ortostática. por ejemplo la proteína de Bence Jones. la cantidad es pequeña alcanzando máximo de 150 mg en orina de 24 horas. en la eclampsia. INTRODUCCION: La orina normal contiene una pequeña cantidad de proteínas solubles (albúminas. Se diluye con cloruro de sodio 0. riñón poliquístico etc. En el mieloma múltiple y macroglubinemia de Waldestrom.

0 III 4. 5. Leer el standard (I) calibrando con agua destilada y luego a la lectura del problema (II) restar el blanco de la orina (III). 3.0 Dejar reposar 5 a 10 min.0 4. ¿Cómo diferencia usted un precipitado en un tubo de ensayo que no c orresponde a proteínas en orina? Señale algunos tipos de proteínas anormales que pueden ser encontradas en la orina. CUESTIONARIO: 1.61 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS EN LA ORINA : Método turbidimétrico de Heavy. 4.= proteína total de orina de 24 H en mg. orina Absorbancia del standard Volumen total en ml orina -----------------------------------. y leer en fotocolorímetro con filtro (420 um).5% I 4.0 1. .0 II 1. mg/100 ml orina x 100 IV.0 1. CALCULO: Desde que 4 ml de orina se trata igual que un standard de 4 ml conteniendo 25 mg/100 ml entonces: Calcular de la siguiente manera: Absorbancia problema ± Absorbancia blanco x 25 = mg/100 ml. En qué consiste el método de Heavy para la determinación de proteínas ¿Cuál es el mecanismo por el cual un paciente con glomeruloesclerosis elimina mucha proteína por la orina? Señale algunas causas de proteinuria fisiológica y patológica. NOTA: Antes de leer los tubos deben ser mezclados totalmente evitando que burbujas de aire puedan interferir con la lectura. En tres tubos marcados previamente agregar: COMPONENTES (ml) /TUBOS Solución standard de proteína Orina previamente filtrada Agua destilada Acido tricloroacético 12. 2.

en la hepatitis o en el infarto de miocardio. Repetir las lecturas a intervalos de 60 segundos.glutamato.Piruvato + L . estas enzimas proveen un medio de interconversión de proteínas e intermediarios metabólicos de los carbohidratos y hacen disponibles las reservas proteicas almacenadas en el hígado al ciclo del ácido cítrico. CALCULOS: Actividad ALAT (UI/l) = A/min x 1768 Nota: de las absorbancias. INTRODUCCION: La transaminasa glutámica pirúvica. II..62 PRACTICA N° 25 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ALANINA AMINOTRANSFERASA SERICA (ALT) o TRANSAMINASA GLUTAMICO PIRUVICA (SGTP) I. Cuando se produce destrucción tisular de estos órganos como sucede por ejemplo. REACTIVOS A UTILIZAR. relativamente en bajas concentraciones pero en los tejidos están presentes en grandes cantidades. estas enzimas son liberadas dentro de la corriente sanguínea y pueden elevar sus niveles.1 Mezclar y transferir a la cubeta del espectrofotómetro. sacar diferencias y determinar una media que luego se multiplica por el factor determinado. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Reactivo reconstituido (ml) 1. llamada también alanina aminotransferasa cataliza la reacción L-alanina + alfa-cetoglutarato . hasta por tres minutos. se mide colorimétricamente por reacción con dinitrofenil hidrazina en medio alcalino. particularmente en el hígado y corazón. Las transaminasas están normalmente presentes en la sangre..5  a-cetoglutarato  L-alanina  LDH  NADH III. VALORES DE REFERENCIA: Hasta 29 U/l a 30 ºC Hasta 45 U/l a 37 ºC . producto resultante después de la incubación. En la presente práctica la glutámico pirúvico transaminasa (GPT) es determinada agregando suero a una solución bufferada conteniendo ácido alfa cetoglutarato y L-alanina y el ácido pirúvico formado. Incubar 60 segundos a la temperatura de reacción. Reactivo para SGTP:  Buffer TRIS pH 7.0 Volumen de muestra (ml) 0. Leer la absorbancia inicial (A1) a 340 nm. Con la aspartato transaminasa.

Cuál es la utilidad práctica de la utilización del dosaje de transaminasas. TGO-S algunas veces separadas y otras veces juntas. ¿Cuáles serían las razones para solicitar. colocando los nombres de las moléculas que participan. 2. Diga usted en que consiste el mecanismo de transaminación.63 IV. en el diagnóstico diferencial clínico? 4. 6. CUESTIONARIO: 1. . ¿Cuál es la importancia metabólica de la transaminasa glutámico pirúvico? 3. Haga un esquema de una transaminación. ¿Cuál es la ubicación intercelular de las TGP y TGO? 5.

05 0.4N (NaOH 0. pero tiene el inconveniente de elevarse en diversos cuadros.10 0.40 0. una vez sintetizadas. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) : 1) CURVA DE CALIBRACIÓN: Antes de usar los reactivos por primera vez. salen de las células y funcionan fuera de ellas. es la determinación por método colorimétrico de una de estas transaminasas de importancia clínica como es la aspartato aminotransferasa.4N III. cuando sobreviene la mejoría clínica. presentes en cantidades muy bajas en el suero aun cuando en ciertas enfermedades suben considerablemente.4N diluido con agua destilada 1:10) Mezclar y reposar por 15 minutos a temperatura ambiente antes de leer. En la clínica son importantes dos transaminasas. las enzimas se sintetizan en las células y en la mayoría de los casos ejercen su función en su interior.1 0.5 ml de reactivo de color.25 AST 0 22 55 96 150 212 Agregar 0.20 0.25 Standard 0. El tejido miocárdico es muy rico en TGO y el ascenso de esta enzima acompaña a los procesos destructivos del corazón. a veces proporciona datos positivos en casos con datos electrocardiográficos de difícil interpretación.1 Sustrato AST (ml) 0. por ejemplo) y las enzimas de escape. proporcional a la extensión del infarto.0 0.1 0. la glutámico pirúvica (TGP) y la glutámico oxalacética (TGO) o aspartato aminotransferasa (AST).30 0.35 0. INTRODUCCION: En condiciones normales. En las lesiones o hepáticas aumentan ambas transaminasas en el suero.64 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST) I.15 0. sube al máximo entre las 12 y 48 horas y suele volver a lo normal a los 4 ó 7 días. éstas. Agregar 5 ml de NaOH 0. las dos suben nuevamente.4 NaOH 0. descienden en forma paralela y. preparar una curva de calibración para AST. Las enzimas con actividad en el suero sanguíneo (las que intervienen en la coagulación. Leer a 505 nm. como es el caso de: Las enzimas del tubo digestivo.1 0. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente.45 0. II. . El color es estable sólo por 30 minutos. Armar el siguiente sistema: Tubo 1 2 3 4 5 6 Agua Destilada (ml) 0. El ascenso es. en general.1 0. Otras enzimas.1 0. La finalidad del presente trabajo experimental. REACTIVOS A UTILIZAR Sustrato AST: Buffer de DL-aspartato y -cetoglutarato pH 7. aunque se hallan en todos los tejidos se relacionan preferentemente con los procesos de ³escape´ de enzimas del mi cardio o el hígado.50 0.4 Reactivo de color: 2-4 dinitrofenilhidrazina Standard: Buffer piruvato pH 7. sobre todo en la cogestión hepática. si aparece una recaída.

Incubar a 37 ºC durante 60 minutos.Agregar 0. . 2. exactamente.Incubar a 37 ºC durante 5 minutos.5 ml de reactivo de color. Inmediatamente empezar el control de tiempo. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. 3. . ¿Cuál es la utilidad y el comportamiento en sus concentraciones de la AST en casos de infarto agudo de miocardio? Interprete y explique todo lo actuado en la práctica.4 N Mezclar y dejar reposar por 15 minutos antes de la lectura.65 Construir en papel semilogarítmico los valores de transmitancia en el eje vertical y en el eje horizontal las U/ml de AST 2) PROCEDIMIENTO DE LA MUESTRA (disponer de un tubo de ensayo): . agregar 0.Agregar 5 ml de Na OH 0.Colocar 0. . .Al cumplirse los 60 minutos. .5 ml de sustrato AST en cada tubo.Obtener el valor de U/ml de AST a partir de la curva de AST de calibración. . . Haga un resumen de seis líneas sobre AST. IV. según instrucciones previas. CUESTIONARIO: 1.1 ml de suero.

que también puede deberse a problemas en la maduración de los glóbulos rojos como la deficiencia de ácido fólico. menor de 13 g/dl. Pero la hemoglobina puede también disminuír por pérdida de sangre como en las hemorragias o por hemólisis (anemias hemolíticas). II. La disminución de la síntesis de hemoglobina. con dos subunidades alfa y dos beta. que es sin duda uno de los exámenes más solicitados. En la práctica médica es por ello importante determinar la concentración de la hemoglobina. REACTIVO MATERIAL Y EQUIPOS Tensioactivo/CNX: ampollas autorrompibles conteniendo solución estabilizada de tensioactivo/CNX. en niños existe variación con la edad. produce disminución de su concentración dando lugar a la anemia por menor producción como en la anemia ferropénica. una causa pueden ser las hemoglobinopatías por defecto en la síntesis de una de las cadenas (talasemias) o de cambios en la estructura de una de las subunidades por mutaciones que cambian un aminoácido por otro como en la hemoglobina S. tetramérica. por diferentes causas. Standard de Hemoglobina. En este último grupo. cuya función es el transporte de oxígeno. da lugar a las diferentes tipos de porfirias. que termina con la adición del hierro por la ferroquelatasa. El defecto enzimático en algunas de las etapas de síntesis del grupo Hemo. La concentración normal es de 12 a 14 g/dl en mujeres y de 14 a 16 g/dl en varones en nuestro medio y a nivel del mar.66 REUNION DE LABORATORIO N° 12 PRACTICA N° 26 CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA I. de modo que en mujeres se considera si esta es menor de 12 g/dl y en varones. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración de hemoglobina en sangre de personas normales. Buffer/Ferricianuro: comprimidos estabilizados de ferricianuro de potasio y buffer de fosfatos. agregar: hemogloWiener Standard 20 ul DESCONOCIDO 5 ml ----Armar el siguient e sistema: III. Se sintetiza en la médula ósea por una vía común a la síntesis de porfirinas. utilizando el método enzimático de determinación de hemoglobina. Hemoglowiener reactivo Tubos de vidrio Lancetas Pipetas ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: COMPONENTES STANDARD hemogloWiener Reactivo 5 ml Con pipeta limpia y seca. En la hipoxia por altura por otro lado se produce aumento de su síntesis llevando a la policitemia. . INTRODUCCION: La hemoglobina es una hemoproteína. que puede tener también otras causas como la Policitemia Vera La OMS basa su definición de anemia en la concentración de hemoglobina.

0 ± 16. enjuagando tres veces en el propio reactivo antes de agregar cada muestra. 3. Mezclar y luego de 3 minutos leer en espectrofotómetro a 540 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520 -550). Qué es la anemia. Interprete y explique el procedimiento de la práctica. indicando sus aminoácidos importantes en cada polipéptido.67 Muestra (sangre total) ----20 ul Medir primero el Standard y luego usar la misma micropipeta.0 g/dl . . 4.0 g/dl IV. llevando el aparato a cero con Reactivo CALCULO DE RESULTADOS: Hemoglobin a (g/dl) ! D v factor factor ! Standard (g/l) S VALORES DE REFERENCIA: .Hombres: 13. 2. Haga un esquema con la estructura de la hemoglobina. Cuál es la más frecuente y cuántos tipos de anemia conoce. el número de ellos y las interacciones del ión Fe++ dentro del grupo hemo. CUESTIONARIO: 1.Mujeres: 11. Una anemia importante es la anemia de células falciformes: Haga un resumen de las causas de su etiología y su patogenía.0 ± 18.

Directa Bil. donde el defecto limitante es la excreción.Desarrollador o solvente .5 ml Reactivo Sulfanílico 200 ul --------Diazorreactivo ----200 ul 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión. que es finalmente excretada con la bilis al intestino por un proceso de transporte activo. y el origen de esta alteración obedece a causas de origen pre hepático. la indirecta. habrá III.Reactivo sulfanílico . Si lee antes. al cabo de la cual son destruidos en el sistema retículo endotelial.5 ml 2. llevando el aparato a cero con agua destilada. II. siendo en su mayoría bilirrubina indirecta. Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos. Total Muestra (suero) 200 ul 200 ul 200 ul Agua destilada 2. o de la bilirrubina conjugada en las hepatopatías. . La hemoglobina es liberada y se separa la globina del hem. que utiliza el diazorreactivo de Erlich.5 ml ----Desarrollador --------2. La bilirrubina indirecta o no conjugada llega al hepatocito y se separa de la albúmina. La manifestación clínica más importante de las hiperbilirrubinemias es la ictericia. ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Bil.68 CUANTIFICACION DE BILIRRUBINAS SERICAS I. o en las enfermedades extrahepáticas obstructivas. . INTRODUCCION: Los hematíes tienen una vida media de 120 días. La concentración sanguínea de bilirrubina total es de 1 mg / dl. hepático y post hepático. da color a las heces y ultrafiltra el glomérulo. se convierte en una forma soluble. leer en espectrofotómetro a 530 nm o fotocolorímtero con filtro verde (520-550 nm). habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta. Si se lee después. La hiperbilirrubinemia puede ser a predominio de la bilirrubina no conjugada como en las anemias hemolíticas o en los defectos congénitos de conjugación. REACTIVOS . denominada bilirrubina directa o conjugada. sólo reacciona después de agregar alcohol a la mezcla. después de un proceso de captación y conjugación con dos moléculas de ácido glucurónico por la enzima bilirrubina glucuronil transferasa. Luego de 5 minutos.Nitrito de Sodio . Cada gramo de hemoglobina degradada origina 35 mg de bilirrubina.Diazorreactivo: Mezclar: 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo sulfanílico.Bilirrubina Standard. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total y de las fracciones (bilirrubina directa e indirecta) en el suero de personas normales. Este pigmento insoluble en agua es transportado unido a la albúmina. por el método de Malloy Evelyn. éste es convertido en biliverdina y luego en bilirrubina. por el método enzimático de determinación de bilirrubina. que no se excreta por orina. excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. que varían con la edad de presentación y también en cuanto a su gravedad La bilirrubina directa da una reacción inmediata con el diazorreactivo. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total de las fracciones de bilirrubina en el suero o plasma de personas normales y con ictericia.

¿Cuáles son las principales causas de hiperbilirrubinemia no conjugada? 3. Elabore un esquema con los tipos de ictericia que se pueden producir durante el metabolismo de la bilirrubina. ¿Cuáles son las causas de hiperbilirrubinemia conjugada? 4. 2.Abs.Bilirrubina Directa VALORES DE REFERENCIA: . Directa .69 sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre CALCULOS: Bilirrubina total (mg/l) = (Abs. Bil.) x F Bilirrubina Libre (indirecta) = Bilirrubina total . CUESTIONARIO: 1. B. ¿Cuál es el comportamiento de las bilirrubinas en caso de una insuficiencia hepática. ¿Cuál es la acción bioquímica que realiza cada uno de los reactivos utilizados en la práctica? 5. total . ¿Cuál es el riesgo de aumento de bilirrubina no conjuda en el recién nacido? 6.Abs Blanco.Adultos: o Directa: hasta 2 mg/l o Total: hasta 10 mg/l IV. Blanco) x F Bilirrubina Directa (mg/l) = Abs. Por qué? .

que es el más común de los desórdenes del metabolismo de las purinas. En las alteraciones renales severas son comunes los niveles altos de ácido úrico como resultado de una excreción disminuida. cantidad que puede incrementarse con una dieta rica en purinas. enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm). la uricemia se incrementa después de la ingestión de nucleoproteínas con los alimentos. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento . En el plasma. Reactivo de fenol. el pH ácido favorece la formación de ácido úrico no disociado y puede precipitar. el resto se degrada y es eliminado como CO2 y NH3. por otro. Aproximadamente 80 % de esa cantidad es excretada por orina. En orina. en alcalinidad. los que se degradan y en un primer momento liberan los ácidos nucleicos de las proteínas. ocurre lo contrario. III. En el hombre. o urea. La presente práctica tiene por finalidad cuantificar las concentraciones séricas de ácido úrico en personas adultas normales y / o con alteraciones patológicas mediante el procedimiento químico de Folin-Dennis que se basa en la acción reductora del ácido úrico en medio alcalino sobre el ácido fosfotúngstico. llevando el aparato a cero con el blanco.Muestra: suero o plasma heparinizado . . podemos encontrar concentra ciones incrementadas de ácido úrico sérico en la gota. INTRODUCCION: El ácido úrico es un producto de la degradación hepática de las bases nitrogenadas purínicas adenina y guanina. Un adulto normal produce unos 500 mg de ácido úrico por día. II. En condiciones patológicas. Retirar.5 ml Mezclar suavemente e incubar 15 minutos en baño de agua a 37 °C o 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). Standar: solución de ácido úrico 100 mg/dl Uricasa: solución de uricasa mayor o igual a 3U/I Reactivo 4-AF/POD: frasco conteniendo más de 100 U de peroxidasa (POD). Al pH sanguíneo predomina la forma desprotonada o urato. a pH menores predomina la forma protonada no disociada o ácido úrico. La cantidad de uratos excretados varía normalmente de 250 a 750 mg / 24 hrs. Como sucede con otros constituyentes séricos. También existe hiperuricemia proveniente de la destrucción excesiva de células (material nuclear) en leucemias y linfomas.5 ml 2. que circulan en la sangre (en el plasma y en los glóbulos rojos humanos) y es la orina su vía de excreción. colocar: B S D Standard 50 ul Muestra 50 ul Reactivo de trabajo 2.5 ml 2. etc. S (Standard) y D (Desconocido). diferencia que desaparece después de los 45-50 años de edad. la concentración de ácido úrico en suero o plasma depende de un neto balance entre el grado de síntesis de purinas y fraccionamiento de nucleoproteínas por un lado y. más frecuente en hombres. policitemias. del grado de eliminación de ácido úrico.70 PRACTICA N° 27 CUANTIFICACION DEL ACIDO URICO SERICO I.En tres tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas marcadas B (Blanco). el ácido úrico alcanza una concentración de 4 a 6 mg/dl. REACTIVOS A UTILIZAR. Los varones tienen niveles 1 mg/dl más altos que las mujeres.

con ingesta normal de proteínas. 5. IV. incluso se ha observado una variación estacional. CUESTIONARIO: 1.71 - CALCULO DE RESULTADOS: Acido Urico (mg/dl) ! D v f donde " f " ! 100 mg/dl S - VALORES DE REFERENCIA: En adultos normales. el sexo y las diferentes dietas. se observan los siguientes rangos de valores: Hombres: 26-60 mg/l Mujeres: 20-50 mg/l Los valores de ácido úrico varían de acuerdo a la edad. . ¿Cómo explica el uso del alopurinol en el tratamiento de la gota? ¿Cuál es el proceso de la artritis y de la formación de los tofos en la gota? Explique por qué existe hiperuricemia en las enfermedades de leucemia. Y dónde se realiza esta síntesis. 2. Señale la deficiencia parcial enzimática que ha sido encontrada en algunos pacientes con gota. Cuál es la fisiopatología de las hiperuricemias. Cómo se sintetiza el ácido úrico. 3. 6. 4.

La creatinina es un constituyente habitual de la orina. aumenta en el cuerpo humano fundamentalmente por síntesis.1.5 g/24hs. edad. El suero es depurado de creatinina en el riñón por filtración glomerular proporcionando una buena base para el test de clearance. ya que los niveles de creatinina sérica dependen del grado de excreción. y es excretada en una cantidad casi constante. . La concentración de creatinina en suero no es afectada por la dieta. mientras que en eritrocitos sólo corresponde a un 40%. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento III. precursora de la creatinina. La determinación de creatinina tiene utilidad en la práctica médica para la evaluación de la función renal. El clearence de creatinina normal es mayor de 100 ml / min. La creatinina es fácilmente difusible y es igualmente distribuida en el agua corporal. La creatininuria es determinada mediante el método enzimático. INTRODUCCION: La creatina. 9 . La creatina fosfato se forma en los miocitos y es un compuesto importante como fuente de energía en la contracción muscular. catabolismo de proteínas. la cantidad total depende de la masa muscular. Es excretada fundamentalmente por el riñón el cual clarifica el plasma de creatinina. La cantidad eliminada por las personas del sexo masculino generalmente es más grande que en las de sexo femenino. como las glomerulonefritis o la nefropatía diabética o post renal. Esto.0 mol/l . esta última determinación se prefiere porque proporciona mayor información relacionada con el estado de la función renal.Standard: Solución de creatinina 2 mg/l. aunque una pequeña cantidad pre formada es ingerida con los alimentos. Elevadas concentraciones se producen solamente cuando la función renal está muy alterada y aunque el mismo tipo de información acerca del diagnóstico y pronóstico se obtiene por la determinación de nitrógeno ureico o creatinina. como las uropatías obstructivas La creatinina en medio alcalino reacciona con el ácido pícrico para dar un tautómero de picrato de creatinina de color anaranjado (reacción de Jaffe). La determinación de hace de ordinario en un filtrado libre de proteínas obtenido a partir del suero. las que pueden ser de origen pre renal como el shock o la insuficiencia cardíaca.5 a 1. Usando métodos enzimáticos para determinar específicamente creatinina y comparando con los valores obtenidos por la reacción de Jaffe en personas normales y nefriticos se encuentra que la creatinina verdadera del suero comprende aproximadamente un 90% del total. sexo o ejercicios.16 mmol/l . II. las variaciones fluctúan entre 0. hace remarcable la necesidad de usar suero y no sangre total para la determinación de creatinina por el método colorimétrico.Reactivo 2: Acido pícrico 4.4 mg /100 ml. . la cual puede alterarse por diversas causas. La creatinina urinaria disminuye en la insuficiencia renal y es útil para medir el grado de filtración glomerular y lo poco que es transferido a través de las células tubulares. REACTIVOS A UTILIZAR.Reactivo 1: Hidróxido de sodio 0. Aproximadamente 2% de la creatina fosfato muscular es convertida en creatinina diariamente. siendo la producción endógena constante. La concentración normal en suero varía de 0. renal.72 REUNION DE LABORATORIO N° 13 PRACTICA N° 28 DETERMINACION DE CREATININA SERICA EN PERSONAS SANAS Y NEFROPATAS I.

CALCULOS: ¨A Muestra (A2-A1) y ¨A Standard (A2-A1) CALCULOS: SUERO/PLASMA : ¦ ¦ Creatinina(mg/dl)! ORINA : Creatinina(mg/dl)! Standard(mg/dl)A v? A Standard A Muestra A Muestra CLEARANCE DE CREATININA : /100 ?mg/min/1.73 m2 .73m2A ! mgcreatinina mlOrinav mlorina/24h mgcreatinina ml suerov 1440 /100 VALORES REFERENCIA: DE SUERO/PLASMA: Mujeres Varones ORINA: Mujeres Varones Clearance de Creatinina: Mujeres Varones IV. Mezclar. ¦ ¦ Standard(mg/dl)Av 50 v? A Standard 0. su determinación. Incubar 5 minutos a 20-25 °C/30 °C/37 °C. luego agregar: Reactivo 2 250 ul 250 ul 250 ul Llevar el espectrofotómetro a cero con el blanco.1 mg/dl 0. Explique por qué se incrementa la creatinina en tres estados patológicos que conozca. Haga dibujos del procedimiento. ¿Qué información o presunción obtiene al dosar la creatinina sérica? ¿Por qué se prefiere la determinación de creatinina urinaria a la de nitrógeno ureico? Interprete y explique el procedimiento de la práctica.73 PROCEDIMIENTO En caso de que la muestra a utilizar sea en suero. S (Standard). M (Muestra) Componentes Blanco Standard Muestra Reactivo 1 1000 ul 1000 ul 1000 ul Muestra --------50 ul Standard ----50 ul ----Mezclar. A que se denomina clearence de creatinina y que importancia tiene.6 ± 1.9 ± 1.3 mg/dl 11 ± 20 mg/kg/d 14 ± 26 mg/kg/d 95 ± 160 ml/min/1. 5. En tubos de ensayo marcados B (Blanco). CUESTIONARIO: 1. 3.73 m2 98 ± 156 ml/min/1. 4. Incubar exactamente por 2 minutos y leer A2. 2. Incubar 1 minuto a 20-25 °C y leer A1.

4665 = Nitrógeno ureico sanguíneo Los riñones eliminan diariamente entre 20 a 40 gramos de urea. es convencionalmente reportado co nitrógeno ureico. Las concentraciones de urea en sangre total. en personas normales y / o con procesos patológicos.01 Standard (ml) ----0. La uremia es determinada colorimétricamente por el uso de ureasa. . El grado de azoemia depende de la extensión y tipo de lesión renal. es excretado casi enteramente por los riñones. pero en condiciones normales aproximadamente el 40% de este filtrado regresa p difusión a la sangre. La urea en el plasma es filtrada por los glomérulos renales. o 3 minutos a 37 °C. suero o plasma. .01 ----Reactivo de trabajo (ml) 1. éste reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimétricamente. Cuando el nitrógeno ureico es determinado por el método de la ureasa. son muy similares.00 1.14 = UREA En sentido inverso. II. Agregar a cada tubo: Reactivo hipoclorito (ml) 1.00 Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente (20 a 25 °C) o 5 . La or importancia clínica de la urea viene del hecho de una elevada concentración sanguínea puede estar asociada con una mala función renal. REACTIVOS A UTILIZAR.Suspensión de ureasa.Reactivo de salicilato. Este método es altamente específico y aunque está basado en reacciones de urea. La concentración de la urea en la corriente sanguínea es el resultado del balance entre el grado de degradación de las proteínas y el grado de eliminación por los riñones. .74 PRACTICA N° 29 CUANTIFICACION DE UREA EN SANGRE I.Solución standard III.00 1.00 Incubar 5 minutos a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C). es el principal producto final del catabolismo de las proteínas y se distribuye en todos los tejidos. conociendo los valores de urea. ésta transforma a la urea en carbonato de amonio y con la adición del reactivo de Nessler el amoníaco liberado forma un compuesto de color amarillo bruno cuya intensidad se mide en fotocolorímetro. Los valores de urea se mo reportan siguiendo la siguiente fórmula: Nitrógeno ureico sanguíneo x 2.00 1. La finalidad de la presente práctica es cuantificar la uremia por el método de la ureasa. INTRODUCCION: La urea es sintetizada en el hígado.00 1. La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoniaco. Los valores normales de urea en suero (como nitrógeno ureico sanguíneo o BUN) es de 9 ± 19 mg/100 ml. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento PROCEDIMIENTO Componentes Blanco Standard Desconocido Muestra (ml) --------0.Reactivo hipoclorito. Normalmente no tiene función útil en el organismo. se informa el BUN según la siguiente fórmula: Urea x 0. .

Señale las características comunes que se encuentran en los efectos enzimáticos hereditarios del ciclo de la úrea. ¿Qué alteraciones en las concentraciones séricas de úrea y NH4+ podrían encontrarse en el coma hepático? ¿Cuál es la importancia metabólica de la existencia del ciclo de la ornitina en el hígado de los seres humanos? ¿Cuál es la importancia metabólica que en el hígado humano exista una relación entre el ciclo de los ácidos tricarboxilicos y el ciclo de la ornitina? 10 a 50 mg/dl : 15 a 30 g/24 hrs. .5 a 22. conocer las concentraciones séricas de úrea? ¿Qué influencia tiene la ingesta proteica sobre la concentración sérica de úrea? En relación a las concentraciones séricas de úrea y NH4+. 6. 4. Leer las absorbancias dentro del plazo de una hora CALCULOS: FACTOR ! 66 Absorbancia Standard Urea (mg/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: SUERO/PLASMA: Urea : Nitrógeno Ureico ORINA: Urea : Nitrógeno Ureico IV.7 mg/dl 7 a 14 g/24 hrs. 3. 5. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué importancia clínica tiene para usted. 2.75 minutos a 37 °C. : 4.

0 3.5 III 4.0 0.Acido tricloroacético al 10% .1M pH 7. Esto es importante porque el L-glutamato es el único aminoácido en el hígado que experimentan desaminación oxidativa a una tasa apreciable y esta reacción se cataliza por la L glutamato deshidrogenasa.4 Solución L-alanina 0. . Añadir ácido tricloroacético al 10% Mezclar y añadir agua destilada I 4.0 3.0 1. Si se agrega una determinada cantidad de L-alanina a un homogeneizado de hígado después de un período de incubación (30 minutos) podemos demostrar que se ha producido desaminación si encontramos determinada cantidad de cetoácidos (ácido pirúvico y ácido alfa-cetoglutarato) los que pueden ser identificados frente a una solución de 2-4 Fenihidrazina en medio alcalino.2M .Buffer fosfato 0.2-4-Dinitrofenilhidrazina: solución 0.1% en HCl 2 N. .5 1. todo el nitrógeno amino proveniente de los aminoácidos que puede experimentar transaminación se puede concentrar en el glutamato.5 1. Dos sistemas enzimáticos de transaminación: la alanina piruvato transaminasa(ALT) y la glutamato alfa-cetoglutarato transaminasa (AST) catalizan la transferencia de grupos amino de la mayor parte de los aminoácidos para formar alanina a partir del piruvato o glutamato a partir de alfa-cetoglutarato.NaOH: solución 2N .76 PRACTICA N° 30 DEMOSTRACION DE LOS PROCESOS DE DESAMINACION OXIDATIVA DE LOS L-E-AMINOACIDOS I. La presencia de estos cetoácidos se debe fundamentalmente a los procesos de transdesaminación y desaminación del ácido glutámico (transdesaminación) que se estimula fundamentalmente y en mucha menor proporción por desaminación de la L-Alanina por la acción de la L-aminoácido.0 3. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente esquema de incubación: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0. REACTIVOS A UTILIZAR.5 1.Homogeneizado de hígado o riñón de rata 10% y conservado en baño helado. INTRODUCCION: La remoción del grupo amino de las L-aminoácidos es el primer paso en la degradación metabólica general de estos compuestos (catabolismo). II.0 1. Puesto que la alanina es también sustrato para la reacción de glutamato transaminasa.1 M pH 7. La finalidad de la práctica es demostrar los procesos de desaminación (oxidativa o no) que sufren los L aminoácidos en el hígado utilizando a la L-Alanina como un ejemplo de éstos y al 2-4 Dinitrofenilhidrazina como indicador de los cetoácidos formados provenientes de la desaminación.0 1.L-alanina: solución 0. Filtrar y medir a otros tubos previamente marcados: .0 0.4 .2M Agua destilada Homogeneizado de hígado Colocar en baño maría a 37°C durante treinta minutos.5 III.5 TUBOS DE ENSAYO II 4.0 0.

4-Dinitrofenilhidrazina solución al 1% Mezclar y dejar en reposo durante veinte minutos.0 1. De un ejemplo de desaminación oxidativa de un aminoácido. Realizar las lecturas con el espectrofotómetro.0 1.0 4.77 COMPONENTES (ml) Filtrado 2.0 TUBOS DE ENSAYO II 4. de los resultados de su práctica de laboratorio? . ¿Cuál es la razón por la que se utiliza 2.0 4.0 III 4.0 Señale los sistemas enzimáticos flavinodependientes que producen desaminación oxidativa de los aminoácidos.0 4.0 1. IV.4-Dinitrofenilhidrazina en el sistema? ¿Cómo explica usted los resultados fotocolorimétricos obtenidos en los tres diferentes tubos de experimentación del sistema? ¿Cuál es la importancia biológica de la desaminación oxidativa de los aminoácidos? ¿Qué conclusiones puede establecer usted. CUESTIONARIO: 1 2 3 4 5 6 I 4. NaOH 2N Dejar en reposo durante 10 minutos.

hemorragias subcutáneas y sangrado de encías.2 mg/100ml. Ciertas células sin vitamina C no son capaces de producir o mantener sustancias de importancia intracelular. dolor de las extremidades. Aunque no se conoce con seguridad sus funciones metabólicas precisas hay pruebas que señalan su requerimiento para el metabolismo de la tirosina . Muchas de estas propiedades podrían depender de las propiedades reversibles de óxido reducción (redox) de esta vitamina (ácido ascórbico . En el escorbuto no tratado. Un excelente test clínico para la deficiencia de vitamina C es la determinación del promedio de resistencia capilar. el escorbuto clínico tarda 6 meses en manifestarse. Para ello es necesario que los. Los síntomas son vagos y generalmente limitadas alteraciones del crecimiento de los dientes. En los leucocitos la concentración es mucho mayor que en el plasma (15 mg/100 g) de capa blanca leucocitaria. INTRODUCCION: La vitamina C o ácido ascórbico es hidrosoluble y antiescorbútica. La corteza suprarrenal. El principal resultado de tal deficiencia es el escorbuto.1 gm/100ml y en glóbulos blancos menos de 2 mg/100 g.2 mg/100ml o en glóbulos blancos a 8 mg/100 g indican una deficiencia importante que puede significar cicatrización tardía o dehiscencia de las suturas. Se presenta en alimentos frescos y en vegetales.78 V UNIDAD NUTRICION: REQUERIMIENTOS ENERGETICOS. alimentos antes del cocimiento contengan 70 mg de vitamina C. PRACTICA N° 32 DOSAJE DE VITAMINA ³C´ I. Las necesidades mínimas diarias de vitamina C son 10 mg y son preferibles 30 mg por día. la hipófisis y el ojo son espacialmente ricos en vitamina C. En caso de alimentación deficiente. Se necesita también para la producción normal de fibrinas del tejido conectivo y de la sustancia del baso intercelular (por ello el aumento de fragilidad capilar en el escorbuto). Esto puede ser hecho con un simple aparato para medir la presión sanguínea con la cual la presión dentro de los capilares se incrementa por la constricción de .5 mg de ácido ascórbico para niños y 7. La vitamina C es destruida rápidamente por el calor de cocimiento o la pasteurización. Se estima que una ingestión diaria de 2.5 mg para adultos es suficiente para prevenir síntomas de deficiencia. una enfermedad caracterizada por debilidad.ácido dehidroascórbico). lesiones en las encías y ligera anemia. La única acción en el cuerpo es debido principalmente a que es una clase especial de agente reductor que influye en los procesos de óxido reducción. el nivel plasmático de ácido ascórbico es inferior de 0. Casos subclínicos de deficiencia de vitamina C son muy comunes entre la población pobre de las grandes ciudades.5 y 1. Las intervenciones quirúrgicas dan lugar a disminuciones de 17 a 20% de contenido en el plasma y en glóbulos blancos. VITAMINAS Y MINERALES REUNION DE LABORATORIO N° 14 PRACTICA N° 31 DOSAJE DE VITAMINA ³A´ El instructivo de la presente práctica se les proporcionará durante la práctica respectiva. Los nivelas ² plasmáticos en una población bien alimentada varían entre 5. PROTEICOS. Antes de la intervención quirúrgica las cifras plasmáticas inferiores de 0.

y Los valores inferiores a 0.5 0.5 0. y Solución de tioúrea al 10% en etanol al 50%.5%. y Leer en fotocolorimetro (540 nm). Del Standard . y Agregar 1. El ácido ascórbico es estable durante varias horas en el filtro.Blanco x 2. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento y Extraer más o menos 5 mi de sangre de la flexura del codo e introducirlos en frascos previamente oxalatados. Se prepara en el mismo dia de uso. En un pH ácido. y 0. y Reactivos 2. y Dejar los tubos en reposo por 30 min. .4 0. total o plasma. y Acido sulfúrico al 85%. Absorbancia se compara con patrones adecuados de ácido ascórbico.79 la vena del brazo. REACTIVOS A UTILIZAR: y Acido tricloroacético al 10& (P/V).). Mezclar: COMPONENTES (ml) TUBOS Liquido sobrenadante de paso anterior Acido tricloroacético al 10% Standard de ácido ascórbico.1 de la solución tioúrea. por el método colorimétrico de Roe y Ructher modificado. y Standard de ácido ascórbico 2 ml/100ml. y El ácido ascórbico utilizado para preparar la solución patrón debe ser de grado analítico. se tapan en tubos con papel parafinado y se colocan en baño de agua a 56°C durante una hora. Esta sufre rearreglo molecular en ácido fuerte dando un compuesto rojo.2 mg/dl pueden preceder en 2-3 meses a la aparición de un escorbuto clínico.4 III 0. II.4 dinitrofenilhidracina. Para la determinación del ácido ascórbico en sangre. CÁLCULOS: Abs. mezclando: 5 ml del reactivo 2.5% III.5 0.1 mil de la solución de sulfato cúprico. y Reactivo de color. Por 6'ste procedimiento el ácido ascórbico del plasma o sangre es oxidado a ácido dehidroascórbico. y Agregar a cada tubo lentamente y mezclando. El propósito de la siguiente práctica es determinar la concentración de ácido ascórbico en el plasma de personas adultas normales o carenciales. Transcurrido el tiempo se enfrian los tubos en baño de hielo durante 5 minutos. 2 mi de ácido sulfúrico al Q5°o. y Oxalato de litio al 6. Hemorragias que en la piel aparecen con excesiva frecuencia podrían indicar fragilidad capilar.4 - y Se mezclan los reactivos. y Solución de sulfato cúprico al 1. 0. enfriando el hielo. Por ello es indispensable separa el plasma de ids glóbulos rojos y realizar el análisis sin tardar.6 ml de agua destilada. y Mezclar nuevamente. el acide dehisroascórbico se transforma rápidamente en ácido dicetoglucónico que se une a 2 dinitrofenilhidracina -4 para formar una hidrazona de color pardo. Se utilizará el método de Roe y Kutcher modificado para la cuantificación del ácido del ácido ascórbico en sangre.5 0.Blanco NOTA: y El ácido ascórbico es muy inestable. La excreción normal diaria de vitamina C en orina de adultos varia entre 10 y 30 mg.4 dinitrifenilhidracina al 2% en ácido sulfúrico 9 N. esta debe ser fresca (no después de 30 min. Agua destilada Reactivo de color combinado I II 1 0.5 = mg/dl Abs. Del problema .

CUESTIONARIO 1. Desde el punto de vista metabólico ¿Cómo explica que los requerimientos de vitamina C sean mayores en el curso de las enfermedades infecciosas. ¿Por qué las necesidades de vitamina C deben ser satisfechas en la dieta normal? 2. . Mencione algunas funciones metabólicas importantes del ácido ascórbico. lactancia e intervenciones quirúrgicas? 4. hipertiroidismo. ¿Cómo explicaría que las dosis superiores a 1 g/dia pueden ocasionar hemolisis en portadores de deficiencia eritrocitica de G-6-P-deshidrogenasa? 5. embarazo. neoplasias. ¿Qué relaciones metabólicas podría mencionar entre el ácido fólico y Fe+++ en la producción de anemia en el escorbuto? 3.80 IV.

05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos. El contenido de hierro en el cuerpo humano se encuentra distribuido en tres formas: el almacenado. que se encuentra en la hemoglobina. fiebre reumática. El 90 % de anemias en las mujeres es por deficiencia de Fe. su disminución se asocia entre otras patologías a problemas de absorción y almacenaje. hidroxilamina clorhidrato. La capacidad de fijación de hierro (TIBC) aumenta en casos de anemias ferroprivas y disminuye en las hemocromatosis. así como de otras hemoproteínas como los citocromos ± componentes de la cadena respiratoria. Prácticamente todo el hierro corporal se encuentra unido a proteína. el hierro en uso. El hierro es absorbido en el intestino delgado como Fe2+ y su regulación ocurre a ese nivel y es transferido a la transferrina para su transporte sérico. El hierro forma parte de los centros Fe-S de la cadena respiratoria.y la mioglobina. De la misma manera. La evaluación de la concentración de hierro sérico es de gran utilidad. aumento de Capacidad Total de Fijación de Hierro y disminución de la Saturación de Hierro  Anemia por deficiencia de hierro: microcítica hipocrómica. etc.0. lo que lleva a la disminución de la ferritina sérica  Disminución de hierro sérico.5 2.50 0. defectos en el mecanismo de almacenaje.50 Reactivo color (ml) ----0. REACTIVOS A UTILIZAR: Buffer ácido: buffer acetato pH 4. Buffer alcalino: buffer TRIS pH 8.81 REUNION DE LABORATORIO N° 15 PRACTICA N° 33 DETERMINACION DE HIERRO SERICO TOTAL Y TIBC I. II. etc. enzimas y varios tipos de proteínas. dado que un aumento en sus niveles se encuentra asociado a diversas patologías tales como destrucción aumentada de los glóbulos rojos. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm . tumores. que se encuentra dentro de las células. etc. Solución Standard: Fe (II) en hidroxilamina clorhidrato 500 ug/dl III.0 Reactivo color: ferrozina. y el circulante.5 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) --------Muestra (ml) 0. hidroxilamina clorhidrato. La deficiencia de hierro pasa por tres estadios:  Deficiencia de los depósitos de hierro. sino que además es tóxico. INTRODUCCION: El hierro sérico es importante en el organismo porque es componente esencial de la hemoglobina encargada del transporte de oxígeno. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACION DE HIERRO Armar el siguiente sistema Componentes Blanco (suero) Muestra Buffer Acido (ml) 2. dado que no sólo es relativamente insoluble.

160 ug/dl  Mujeres : 40-150 ug/dl DETERMINACION PARA TIBC (capacidad de fijación de hierro) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Muestra Muestra Buffer Alcalino (ml) 2.Muestra Abs.50 Muestra (ml) 0.Bl.Standard Abs.muestra % Saturación! Ferremia (ug/dl) TIBC (ug/dl) Valores de Referencia: TIBC: Hasta 6 años Sobre 6 años % Saturación IV.00 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) 0.Reactivo v 500 Abs.50 0.Bl.50 0. 5.muestra Abs.82 Cálculos: Ferremia (ug/dl) ! Valores de referencia:  Varones: 50 .Muestra Abs. : : : 100 ± 400 ug/dl 250 ± 400 ug/dl 20 ± 55 % Señale al menos 5 funciones del hierro Causas de deficiencia de hierro Informe sobre estructura de la ferritina ¿Qué exámenes solicitaría para evaluar la deficiencia de hierro? ¿Qué importancia tiene medir la saturación de hierro? ©¨ § (ug/dl) ! Ferremia(ud/dl) I (ug/dl) ©¨ v 100 .reactivo Abs.00 2.standard Abs. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm Calculos: UIBC (ug/dl) ! 500  TI v 500 Abs.Bl. 3.Bl.05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos.50 Reactivo color (ml) ----0. 4. 2. CUESTIONARIO: 1.

3) enfermedad pulmonar. tensión de oxígeno disminuida (altura).83 PRACTICA N° 34 DETEMINACION DE CLORO. REACTIVOS A UTILIZAR: . 6) dieta alta en grasas o en ayuno prolongado el cloro es desplazado por los cuerpos cetónico por sobre producción de estos. Este tipo de alcalosis que es de tipo respiratorio resulta por hiperventilación que puede ser causada a su vez por: a) drogas.4. después de incubar 5 minutos a oscuras. II. b) enfermedades que producen estímulo del centro respiratorio como: histeria. todas estas alteraciones tienen exceso de C02 (que produce hipocloremia). 2) parálisis de los músculos respiratorios. fiebre. No exponer a la luz CALCULOS Lectura tandard   ! 355 v Lectura uestra ?mg/dlA  . 5) en la diabetes mellitus no controlada. 4) enfermedad renal crónica. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES ESTANDAR PROBLEMA Estándar diluido 20 ul --Suero diluido --20 ul Reactivo de color 1 ml 1 ml Mezcla. igualmente sucede en el ClK. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Antes de la determinación el estándar y las muestras de suero deben ser diluidas en relación 1/50 con agua destilada (20 µL de muestra/1 ml de agua). De todos los aniones es uno de los de más baja concentración en el líquido intracelular. 7) en hiper o en s hipofunción de las glándulas adrenales (corteza).Reactivo de Color 2. Medir en el transcurso de 60 minutos la absorbancia de problema y estándar. Se puede presentar concentración de cloruro disminuido (hipocloremia) en hipoventilación causada por: 1) depresión del sistema nervioso central. En el suero normal el cloruro se encuentra en concentraciones que varían entre 100 y 106 mEqL.6 TPZ existente parcialmente como complejo Hg(II)+Sulfato de Hierro . ansiedad. c) algunos tipos de enfermedad tubular renal con acidosis pueden producir incremento del cloruro sérico. d) excesiva ingestión de ClNH4 (cloruro de amonio) produce acidosis que puede ser seguida de altos niveles de cloruro sérico. SODIO Y POTASIO EN EL SUERO DE PERSONAS SANAS Y EN ESTADO PATOLOGICO DETEMINACION DE CLORO I.Estándar de cloruro: 355 mg/dl III. INTRODUCCION: El ión cloro comprende aproximadamente el 65% del total de aniones del liquido extracelular. La concentración de cloruro se puede incrementar (hipercloremia) en muchos casos como resultado del déficit primario de C02.

¿Qué influencia tiene la Aldosterona en el metabolismo del cloro? 2. (Convertir en mEq/l dividiendo entre 3. la deficiencia acentuada del cloro en la enfermedad de Addison? 3. ¿Puede señalar cinco causas de hipocloremia? 5 ¿Cual es la relación de las alteraciones de la cloremia con el equilibrio ácido básico? . ¿Cómo explicaría usted.55) IV. ¿Puede señalar cinco causas de hipercloremia? 4.383 mg/dl.84 VALORES NORMALES : 335 . CUESTIONARIO: 1.

El estado clínico de hidratación es importante para evaluar el significado de los niveles séricos de sodio. La determinación del sodio de los fluidos biológicos se realiza sea por electrodo ión selectivo o menos frecuentemente por método colorimétrico II. Del total de sodio corporal hay un 18% que fundamentalmente se encuentra en los huesos. sulfato y otros aniones (sales). Diariamente y tiene acceso al suero por difusión a través de la mucosa intestinal o sea que cerca del 4% del sodio corporal total se recambia. cuando el líquido ingerido no es suficiente para eliminar la sobrecarga de solutos por el riñón. INTRODUCCIÓN Debido a la predominante concentración del ión sodio en el líquido extracelular éste influye sobre la presión osmótica que juega un rol preponderante en la distribución del agua entre el espacio extra o intra celular. Son ingeridos cerca de 3 gr. hay por lo tanto un 82% del total que es capaz de recambio y participa en las reacciones fisiológicas. El ión sodio es importante en el mantenimiento del equilibrio ácido básico ya que constituye aproximadamente el 90% del total de cationes extra celulares. fístula intestinal. La cantidad presente dentro de la célula no puede ser medida sin biopsio del tejido. Algunos pacientes con enfermedad cerebral.85 DETERMINACION DE SODIO I. tratado sólo con insulina y solución salina. Se puede encontrar incremento de sodio con hiperosmolaridad en individuos con deficiencia predominante de agua corporal. sudor y saliva.diariamente. Puede ocurrir deshidratación con sodio sérico elevado. El riñon puede regular la excreción de sodio y agua por lo tanto. Se observan concentraciones bajas si las concentraciones de sodio exceden a las del agua. en pacientes con diarrea. La concentración sérica es representativa de toda la concentración celular. Pequeñas cantidades aparecen también en las heces. En el hombre adulto hay cerca de 43 mEq de sodio intercambiable por kg. en mujeres hay sólo 39 mEq por kg. si el líquido ingerido es insuficiente por razones anormales. El suero o plasma contiene más del 90% del sodio total de la sangre. Como sucede con el agua corporal los valores varían inversamente con la grasa corporal. pacientes con diarrea. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante: Acetato de uranilo más acetato de magnesio  Reactivo de color: tioglicolatop de amonio  Standard de sodio: 50 mmol/l . es el principal factor de regulación de este ion corporal y de sus concentraciones. En condiciones anormales pueden ser muy considerables las pérdidas de agua por el sudor u otr s o fluidos. enfermedad renal con disfunción tubular. con pequeñas diferencias debido al equilibrio de Donnan. El ion sodio es ingerido en los alimentos en combinación con el cloro fosfato. en diabetes mellitus no controlada. como en el coma diabético. Un adulto de 70 kg de peso contiene aproximadamente 80 g de sodio de los cuales 44 se encuentra en el % líquido extra celular y el 35% en los huesos. es aparentemente inerte (no ionizable). La concentración sérica normal es de 135 a 145 mEq por L (310 A 340 mg%). En el suero. El exceso de sodio se elimina por el riñón. por peso corporal. alimentación nasogástrica con alto contenido de proteínas. Tales valores no dan información acerca del volumen y distribución de la cantidad total presente ni de la cantidad intracelular existente. El sodio se excreta casi exclusivamente en la orina. y en niños es mayor. por ejemplo en pacientes con diabetes insípida no controlada. el sodio esta en equilibrio con el del líquido intersticial.

¿Qué semejanza existe en la absorción intestinal de este ion y la glucosa? 4. Señale las concentraciones séricas normales. ¿Cuál es la importancia biológica del ion sodio? 2. Dejar reaccionar durante 30 minutos Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm).86 III. ¿Por qué la clasificación de deshidratación por alteración de la osmolaridad. incluye básicamente las concentraciones de esté ion? . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (PROCEDIMIENTO) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco de Standard Problema Reactivo Standard 20 ul Problema 20 ul Precipitante 1 ml 1ml Tapar los tubos y mezclar cuidadosamente. Dejar reaccionar durante 5 minutos Agitar fuertemente por 50 segundos. ¿Cuál es el principal factor de regulación del ion sodio corporal? 3. 5. Emplear el sobrenadante Precipitante 20 ul Sobrenadante 20 ul Standard Sobrenadante 20 ul Problema Reactivo de color 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar bien. Después de 5 a 30 minutos medir las absorbancias contra agua destilada a 405 nm CALCULOS: Factor: 150 /Lectura Bco Reactivo-Lectura Standard Na (mmol/l)= (Lectura Bco Reactivo-Lectura Muestra) x factor IV. CUESTIONARIO: 1.

cerebro y de los glóbulos rojos se recambia más lentamente que en otros órganos. en deshidratación. en administración continua de glucosa endovenosa y terapia salina. son perdidos a través del vómito.87 DETERMINACION DE POTASIO I. en fístulas gastrointestinales y vómitos. en hiperfunción adrenocortical o sobredosis de cortisona o ACTH. Hiperpotasemia se puede encontrar en: Shock o falla circulatoria de cualquier causa. pues la falta de esferoides adrenales provocan retención de potasio sérico. Entonces el 2<26 del total del potasio corporal son recambiados diariamente. en hipoventilación tanto central como periférica cuyo incremento de potasio es frecuente. El potasio es rápidamente removido del líquido extracelular después que es ingerido. influye activamente en el metabolismo celular ya que es cofactor de muchas reacciones enzimáticas intercelulares. Déficit de potasio corporal puede resultar en: Pobre ingestión de alimentos. en insuficiencia de la corteza adrenal. El potasio del hueso. varían entre 4-5. El potasio se pierde en el cuerpo principalmente en la orina aunque pequeñas cantidades son perdidas en la respiración insensible. Los niños tienen relativamente menos contenido de potasio por kilogramo de peso debido a que la relación de agua intracelular/extracelular es menor que en adultos. en íleo paralitico y anastomosis intestinal no funcionante. Se produce hiperpotasemia con pérdida intracelular de potasio cuando la permeabilidad de la membrana celular está alterada por lesión tisular. en intoxicación temprana con salicilatos. en recién nacidos los niveles son algo más altos. Bajo estas condiciones el potasio se eleva si el riñon no puede excretar esta sobrecarga. diarrea o fístula gastrointestinal segundo por excreción urinaria incrementada en individuos con anormalidades tubulares renales. en alcalosis con hiperventilación. Existe también una pérdida lenta de potasio de los glóbulos rojos hacia el suero cuando la sangre permanece guardada. así mismo en algunos casos de . en la diabetes no controlada. La concentración de potasio intracelular varia con los cambios del agua que gene ralmente acompaña a las alteraciones de los niveles de sodio extracelular. la excesiva destrucción de células del cuerpo y la utilización de proteínas para propósitos calóricos se acompañaría de pérdida de potasio celular. en adultos masculinos hay aproximadamente 46 mEq de recambio de potasio. Bajo condiciones de incremento de pH (alcalosis) asociado con la disminución de cloruros. En los niños donde la ingestión de potasio es relativamente más grande. De potasio en forma de sal son ingeridos diariamente y recambiados con el potasio corporal. Con ingestión calórica inadecuada y la utilización de proteínas celular para propósitos calóricos. Del sue el ro potasio es transferido el líquido intersticial antes de penetrar a las células o al filtrado glomerular a través de la membrana de los capilares glomerulares del riñón. el potasio es liberado de las células y excretado dando como resultado hipopotasemia. se produce intercambio entre el sodio intersticial y el potasio intracelular. Además de este rol pasivo. Existe aproximadamente 130 gr.5 -5-3 mEq/L. (3300 mEq) de potasio en un adulto de 70 kg. INTRODUCCIÓN El potasio es el principal catión intracelular y por lo tanto es un factor importante de la presión osmótica que determina la distribución de agua entre las células y el líquido extracelular. El déficit de potasio celular es reflejado en los hallazgos séricos y bajo estas condiciones la regla es hipopotasemia debido a la elevada excreción urinaria de cloruro de potasio. el recambio diario es de 14%. asi mismo en algunos casos de insuficiencia renal se encuentra elevada la concentración de potasio. Aproximadamente 293 gr. del cual el 98% es intracelular mientras que el 2% está presente en el liquido extracelular. Se debe evitar la hemolisis en la toma de muestras de sangre porque el potasio puede ser liberado de los eritrocitos lisados. en mujeres solamente 40 mEq por kilogramo de peso. El 95% del total del potasio corporal es intercambiable aunque el grado de recambio de cada tejido varía en los diferentes órganos. La concentración de potasio en el suero de personas normales es de 3. esto es debido a que la excreción de potasio por orina se mantiene constante.9 mEq/L. Excesiva cantidad de potasio puede liberarse del cuerpo bajo dos condiciones: primero cuando las secreciones intestinales con su contenido relativamente alto de potasio.

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insuficiencia renal crónica. II. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante :ácido tricloroacético  Reactivo TPB-Na: tetrafenilborato de sodio  NaOH  Estándar de Potasio III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): 1. Precipitación: en un tubo de ensayo pequeño añadir 50 ul de suero y 500 ul de reactivo precipitante. Mezclar cuidadosamente. Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). 2. Armar el siguiente sistema: Componentes Reactivo de trabajo Standard Sobrenadante Standard 1 ml 100 ul 100 ul Problema 1 ml

Para producir una turbidez homogénea el Standard y el sobrenadante transparente deben de ser agregados en el centro de la superficie del reactivo de trabajo Mezclar cuidadosamente Dejar reposar por lo menos 5 minutos Medir las absorbancias dentro de los 5 y 30 minutos CÁLCULOS: Factor: 5/Lectura del Standard Problema: lectura del problema x factor VALORES NORMALES: Suero de 3.5 a 5.5 mmol/l IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es el principio o fundamento del método de Hoffman para determinación del potasio sérico? 2. ¿Cómo explica metabólicamente la influencia sobre la concentración sérica de potasio producida por la administración de glucosa e insulina? 3. Explique usted los efectos metabólicos de la aldosterona en la excreción renal de potasio. 4. De ejemplos de hiperpotasemia y de hipopotasemia

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PRACTICA N° 35
DETERMINACION DE CALCIO SERICO
I. INTRODUCCION: El calcio sérico se encuentra en dos formas: Una combinada con proteínas séricas, inactivo e incapaz de difundir a través de las membranas de los capilares. Y la forma no unida a las proteínas, es principalmente iónico, difusible y activo. Varios factores influyen en la concentración de calcio sérico total. La hiperproteinemia está asociada con una elevación en los niveles de calcio, mientras que la hipoproteinemia se acompaña con disminución de la concentración de calcio; sin embargo la concentración de calcio ionizado no se altera. El calcio ionizado se altera en las siguientes situaciones: 1) Por variaciones del pH sérico; la alcalosis tiende a disminuir el calcio y la acidosis tiende a incrementarlo. 2) La ingestión de vitamina D aumenta el calcio ionizado a través de la absorción de calcio y por la excreción del fósforo. 3) La hormona paratiroidea es el factor más importante que controla los niveles de calcio sérico y su efecto es casi exclusivamente limitado a la forma iónica del calcio. La concentración del calcio sérico en individuos normales es de 9 a 11,5 mg por 100 ml Aproximadamente 4,5 a 5,5 mg% es ionizado y cerca de 0,5 mg% está presente como citrato de calcio y el resto se encuentra unido a las proteínas. El propósito de la presente práctica es determinar la concentración sérica de calcio total en personas adultas normales y/o en estado patológico por el método colorimétrico directo

II.

REACTIVOS A UTILIZAR: - Buffer alcalino: buffer lisina pH 11,1 - Reactivo de Color: 8-hidroxiquinolina, o-cresolftaleina-complexona, ácido clorhídrico - Solución estándar de calcio: 8 mg/dl

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Standard Muestra Muestra --------20 ul Standard ----20 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar y medir la absorbancia de la muestra (¨A muestra) y del Standard (¨A Standard) contra el blanco en un lapso de 5 a 30 minutos CALCULOS: A muestra C ! 8v ?mg/dlA A standard VALORES DE REFERENCIA: Suero o Plasma: 8,1 ± 10,4 mg/dl 


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IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es la importancia biológica del calcio en el ser humano? 2. ¿Cuáles son las formas de calcio sérico? 3. ¿Cuáles son los factores que controlan los niveles de calcio sérico? 4. ¿Cuál es la concentración normal de calcio sérico total? 5. Señale algunas alteraciones fisiológicas y/o patológicas que producen alteraciones de los niveles séricos de calcio.

La muestra de sangre debe ser obtenida con un mínimo de estancamiento y de trauma.Heparina III. Cuando éstos son colocados en una solución hipertónica pierden líquido arrugándose y destruyéndose hasta que se establece el equilibrio osmótico con el líquido circulante. Demostrar la fragilidad osmótica de los eritrocitos cuando éstos son colocados en diversas soluciones de CINa de diversas concentraciones. 4. Sin embargo cuando los eritrocitos son colocados en solución hipotónica aceptan líquido (hinchándose) hasta que se alcanza el equilibrio osmótico o hasta que se rompen. anemia falciforme y en la anemia hipocrónica ordinaria (ferropénica). Sin embargo en ciertas anemias hemolíticas adquiridas.0. Se afora con 2 litros de agua destilada y se conserva a 0° C (dura varios meses).NaCl al 15%. .91 PRACTICA N° 36 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. .31 g). . lo que se conoce con el nombre de fragilidad osmótica de los eritrocitos (0.NaCl al 8. Utilizar heparina como anticoagulante de elección. es observada en la talasemia. 2.5% EXPERIMENTO N°2 .5% . cuando estos son puestos en soluciones hipertónica e hipotónica respectivamente. . Las células esferociticas se rompen más rápidamente que las demás y de hecho la prueba de la fragilidad osmótica puede ser considerada como un índice más sensible que la de la magnitud de eritrocitos a la lisis en solución hipotónica. no deben hacer contacto con las paredes de los tubos secos porque estos pueden causar . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS ERITROCITOS : PRECAUCIONES: 1.Cloruro de sodio (180 g).5 . Aunque en la prueba de la osmosis la ruptura de las células resulta de la alteración de su forma y disminución de su resistencia a las fuerzas osmóticas más que a un cambio en la composición de la célula o su osmolaridad. La presente práctica tiene la finalidad de: Verificar el desplazamiento de agua desde el medio extracelular hacia el medio intracelular y viceversa en los eritrocitos.NaH2 PO4.3%).Solución salina amortiguada concentrada 10%. Cuidar que las gotas de sangre caigan directamente en las soluciones salinas. la resistencia de los eritrocitos a las soluciones hipotónicas disminuye. II. de allí que se emplee el término de fragilidad. Si utilizamos una serie de soluciones de CINa de concentraciones gradualmente progresivas es posible comprobar que la hemolisis de los eritrocitos se producen dentro de ciertos limites de hipotonicidad. INTRODUCCION: La membrana de los eritrocitos es semipermeable. 3.2H2O (4. .86 g).NaCl al 4. El uso de anticoagulantes del tipo de los oxalatos que comprende la adición de sales osmóticamente activas son indeseables. REACTIVOS A UTILIZAR: EXPERIMENTO N°1 .Na2P04 (27. La muestra debe ser procesada tan pronto como sea posible después de tomada.

50 8 2. Mezclar el contenido de cada tubo antes de agregar la sangre.50 4. 5. Mezclar correctamente cada tubo y dejar a temperatura ambiente por 30 minutos.00 0.50 3. añadir 0.00 0. Conviene preparar una solución al 1% a partir de la solución concentrada al 10% y armar la siguiente serie de tubos: N° de NaCl al 1% Agua destilada % de NaCl tubo (ml) (ml) 1 0. Utilizando con precisión una pipeta para hemoglobina o una pipeta Pasteur calibrada. con un algodón empapado en alcohol yodado.50 0.50 0. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 2 y 4 de cada mesa de trabajo). LECTURA: Observar cuidadosamente y marcar los tubos donde se inicia la hemólisis.75 0.00 3.50 0.75 2.25 0. Proceder de la siguiente manera: Láminas (gotas) I II III .45% de NaCl). Marcar el tubo donde la hemólisis es completa (color rojo intenso). Observar que la fragilidad globular media de los eritrocitos se produce entre los tubos 5 y 6 (0. Utilizando lancetas descartables o lanceta de Link estéril pinchar el dedo. por acción de soluciones salinas de diferente concentración).25 1.50 1. Colocar cantidades similares de sangre control del sujeto normal en cada uno de los tubos de una segunda hilera.25 0. Se debe rotar cada muestra suavemente en el tubo hasta que el color sea rojo brillante (plenamente oxidado). La sangre del paciente y del sujeto normal son tomadas.30 4 1. PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES Las diluciones se pueden preparar inmediatamente antes de la prueba: 1.92 hemólisis.00 0.10 2 1.60 10 3.00 4. con las precauciones señaladas.40 y 0. objetivado por el color rojizo pálido que toma el líquido sobrenadante en los tubos centrifugados. 7.20 3 1.75 0. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 1 y 3 de cada mesa de trabajo).25 2.40 6 2.50 0. EFECTO DE LAS SOLUCIONES HIPERTÓNICAS E HIPOTONICAS SOBRE LA INTEGRIDAD DE LOS ERITROCITOS: (Verificar por inferencia el desplazamiento del agua entre los medios intra y extracelular. Procedimiento: Realizar asepsia del pulpejo del dedo escogido de la mano. Anotar los resultados.00 0. en tubos heparinizados.50 2.35 5 2.65 11 3. 3.00 2.75 3.02 ml de sangre del paciente a cada uno de los doce tubos de una primera hilera.70 12 4.45 7 2. 6.80 2. 4.55 9 3. Depositar una gota de sangre en cada una de las tres láminas porta-objeto. Volver a mezclar y luego centrifugar a 2000 rpm.00 1.

¿Cuál es la relación normal existente que permite la forma de disco bicóncavo del eritrocito? B. CUESTIONARIO: 1. 3. 4. Señale causas de alteraciones en la fragilidad osmótica. diga: A. señale los porcentajes de inicio y finalización (total) de la hemólisis.93 Sangre del pulpejo de dedo Solución isotónica de CINa 8. Establecer las comparaciones morfológicas y/o lisis de los glóbulos rojos en rel ción a cada tipo de a soluciones empleadas en cada caso. Según observación cuidadosa. ¿Cuáles son las relaciones normales existentes para la formación de los esferocitos y de las células tipo tiro al blanco? (target cell). Anotar los resultados. IV. señale la concentración o porcentaje de NaCl del tubo en el cual empezó la hemólisis. Si el test de fragilidad osmótica de los eritrocitos de un modo general evalúa la relación entre el área superficial y el volumen de la célula.5% Mezclar bien. .5% Solución hipertónica de CINa 15% Solución hipotónica de CINa 4. 1 2 - 1 2 - 1 2 Utilizando el microscopio observar los eritrocitos de cada una de las láminas. De acuerdo a los valores normales del test de fragilidad osmótica de los eritrocitos. así mismo el tubo en donde la hemólisis fue completa. 2.

en el diagnóstico de las anemias hemolíticas por autoinmunidad (en la que los pacientes producen anticuerpos para las membranas de sus propios eritrocitos). En la membrana de los glóbulos rojos de cualquier persona normal se pueden encontrar determinados antígenos (antígeno de superficie o determinantes antígenos). otras personas tienen otro tipo de antígeno de superficie que se llama antígeno B (eritrocitos tipo B). dirigidos contra el mismo antígeno.94 PRACTICA N° 37 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. Se denomina reacción de aglutinación al fenómeno en que la mezcla de las partículas de antígeno con los antisueros específicos provoca una agrupación de dichas partículas antigénicas. con cinco sitios eficaces de fijación de antígeno por cada moléculas de 19S tengan una actividad aglutinante superior a la de los anticuerpos IgG con dos sitios de fijación de antígeno por cada molécula. etc. ambos tipos de reacciones se producen por medio de anticuerpos multivalientes que se combinan con partículas de antígeno formando complejos de antígeno anticuerpos. pueden quedar suspendidas en una solución salina y mezclarse con antisueros específicos. Algunas personas . en la Prueba de Paul-Bunnell (Prueba de aglutinación en pacientes con mononucleosis infecciosa). En otras palabras. tanto para medir antígenos como para determinar las concentraciones de los anticuerpos. En general las pruebas de aglutinación son fáciles de prac ticar. en las condiciones empleadas en la prueba. En efecto dichas pruebas permiten habitualmente descubrir hasta 0. Por lo tanto no es sorprendente que los anticuerpos IgM. pero en algunos casos se necesita el examen microscópico de la preparación estudiada. para descubrir la presencia de anticuerpos del receptor. etc. Al igual que las reacciones de precipitación las pruebas de aglutinación requieren de un pH apropiado y de la moralidad de amortiguadores salinos y debe existir una proporción adecuada de antígeno respecto del anticuerpo. La concentración del anticuerpo aglutinante se define como la mayor dilución de antisuero que aglutina el antígeno examinado. eritrocitos. Por lo general la aglutinación puede observarse a simple vista.1 Ugr de anticuerpos/ml de suero Las pruebas de aglutinación se utilizan rutinariamente en las pruebas cruzadas con sangre antes de administrar transfusiones endovenosas en pacientes.). Los anticuerpos de las distintas clases de inmunoglobulinas difieren en su capacidad de producir reacciones de aglutinación. como el tifus endémico). Las pruebas de aglutinación tienen muchos usos en el laboratorio clínico. en la Prueba de Widal (en pacientes infectados con bacterias gram negativas como Salmonella. La única diferencia entre una reacción de precipitación y otro de aglutinación es que los antígenos son moléculas pequeñas en tanto que los antígenos aglutinantes están asociados con partículas de mayor tamaño. en la Prueba de Weil Felix (en pacientes con enfermedades provocadas por Ricketsias. en la prueba del factor reumatoideo (en pacientes con artritis reumatoides). El mecanismo de una reacción de aglutinación es semejante al de las reacciones de precipitación. en pruebas inmunitarias del embarazo. bastante reproducibles y sumamente sensibles. Estas partículas (bacterias. Estas diferencias dependen principalmente de la valencia del sitio de fijación del antígeno en las diversas clases de los anticuerpos. en la superficie de los eritrocitos del donador (Prueba indirecta de Coombs). una baja concentración de anticuerpos IgM produce una reacción de aglutinación cuya intensidad es igual a la que se produce con una elevada concentración de anticuerpos IgG. Pasteurella). Brucella. INTRODUCCION: Frecuentemente los antígenos se asocian con partículas que son demasiado grandes para formar soluciones o suspensiones coloidales en los medios acuosos. partículas de látex. Algunas personas son poseedoras de un antígeno de superficie designado en forma arbitraria como antígeno A (eritrocitos tipo A).

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. De acuerdo con esta hipótesis todos los recié nacidos n están expuestos a los antígenos A y B. La misma lógica explicaría que una persona del grupo B forma sólo anti A y no anti B. Utilizando los símbolos (+ )= positivo y (-)= negativo complete el cuadro de aglutinación de los grupos sanguíneos ABO: . en el suero existe también normalmente anticuerpos contra los antígenos A y B. En cada extremo de una lámina porta objetos poner una gota del suero recientemente obtenido y marcar 1 y 2 respectivamente. REACTIVOS A UTILIZAR: y Kit para identificar grupos sanguíneos (Diagnóstica). III.95 pueden tener ambos antígenos A y B (eritrocitos AB) y una cuarta posibilidad es que no tengan ninguno de los antígenos mencionados (eritrocitos tipo 0 o H). CUESTIONARIO: 1. Como existe un desarrollo gradual de estas isoglutininas. II.  Identificación de isoaglutininas en suero: y De uno de los estudiantes de cada grupo (o masa) de trabajo. Por otra parte. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo B sobre la gota de suero con marca 2 y mezclar. para eliminar los anticuerpos inespecíficos adicionados a la superficie de los glóbulos rojos. Los antígenos de superficie A y B son llamados también aglutinógenos y se ha estimado que pueden haber hasta un millón de sitios antigénicos A o B en un solo hematíe. Es un hecho bien conocido que muchas bacterias instestinales (salmonellas y shigellas) tienen antígenos que reaccionan en forma cruzada con los antígenos humanos AB0 (H). Estos anticuerpos (isoaglutininas) son del tipo IgH y son poco detectables en los sueros de los recién nacidos. ya que su propio antígeno A. porque producen aglutinación de los glóbulos rojos que poseen el correspondiente antígeno y porque los antígenos son de origen humano (iso=de una misma especie). tomar una muestra de sangre sin anticoagulante y obtener el suero por centrifugación.000. pero aumentan con rapidez su titulación en los primeros meses de vida. del tipo A y B en solución salina fisiológica. llamados isoaglutininas. y Obtener muestras de sangre tipo A y tipo B. previamente identificadas. Los antígenos aparecen a comienzos de la edad fetal en cuanto se forman los eritrocitos . aunque quizá sea más realista una cifra de 5000. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo A sobre la gota de suero con marca 1 y mezclar. Observar si hay o no aglutinación de los glóbulos rojos en 1 y/o en 2 de isoaglutininas en el suero problema del estudiante y deducir el grupo sanguíneo que posee. y Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos y descartar el plasma. y Preparar una suspensión al 5% de glóbulos rojos lavados. con hepsrina como anticoagulante. Pero una persona del grupo A forma sólo anti B y no anti A. y Llevar los glóbulos rojos sedimentados con suero fisiológico por tres veces. le ha conferido una tolerancia inmunológica específica hacia él. y y y y IV. se ha sugerido que las inmunizaciones inaparentes durante la infancia y el comienzo de la niñez pueden ser responsables de la producción de anti A o anti B.

En el siguiente cuadro anote los anticuerpos en el suero: GRUPOS SANGUÍNEOS ABO ANTIGENOS EN LOS POS ERITROCI. Diga usted ¿Por qué ya no es costumbre corriente utilizar sujetos de tipo O como ³donadores universales´ y personas de tipo AB como ³receptores universales´? 3. EN EL SUERO Anti Anti Anti Anti POSIBILIDADES DE TRANSFUSIÓN Puede recibir Puede donar De A AyO ByO O Todos (receptor Universal) A y AB B y AB Todos (donador Universal) AB 4. ¿Cuál es el fundamento de las reacciones antígeno-anticuerpo? . (G. ¿Qué aplicaciones de las reacciones antígeno anticuerpo puede señalar? 5. SANG) A B O AB ANTICUER.96 SUERO DEL GRUPO O B A AB ( ( ( ( AB ) ) ) ) ERITROCITOS DEL GRUPO A B ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( C ) ) ) ) 2.

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