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3. TECNICAS AUTOINMUNES

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VI JORNADA DE FORMACIÓN INTERHOSPITALARIA DEL LABORATORIO CLÍNICO

3. TÉCNICAS EN EL LABORATORIO DE AUTOINMUNIDAD

PATRICIA MORAIS FERREIRA RI. BIOQUÍMICA CLÍNICA

PRINCIPALES TÉCNICAS DE INMUNOANÁLISIS Aglutinación Inmunoprecipitación en medio líquido Turbidimetría Nefelometría Inmunodifusión doble Contrainmunoelectroforesis Inmunofluorescencia Citometría de flujo Inmunoanálisis con indicadores marcados ELISA Inmunotransferencia Western blot. Slot blot .

AGLUTINACIÓN Primeras técnicas empleadas en los estudios de autoinmunidad. Antígeno particulado + Acs agregados macroscópicos con aglutinación. .

también en tubo.Se realiza generalmente en placa. Se mezcla la suspensión de células o partículas con el suero. Se hace oscilar la placa durante unos minutos y se observa la aglutinación. Ventajas: facilidad de realización no equipamiento Desventajas: baja sensibilidad dificultad de cuantificar .

APLICACIONES Detección del factor reumatoide isotipo IgM aglutina partículas recubiertas con IgG humana. Anticuerpos contra la actina. Algunos anticuerpos específicos de órgano. Determinación anticuerpos contra el núcleo (ANA). . Anticuerpos contra los espermatozoides.

INMUNOPRECIPITACIÓN Antígeno soluble + Anticuerpos precipitación .

ZONA DE EQUIVALENCIA .

NEFELOMETRÍA Mide la luz dispersada a diversos ángulos por la suspensión particulada proporcional a la concentración de partículas del medio.INMUNOPRECIPITACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO TURBIDIMETRÍA Mide la disminución de la intensidad de la luz cuando atraviesa una solución proporcional a la cantidad y tamaño de las partículas. .

INMUNOPRECIPITACIÓN EN GELES .

INMUNODIFUSIÓN DOBLE Patrón de identidad Patrón de disparidad Patrón de semiidentidad .

CONTRAINMUNOELECTROFORESIS Migración electroforética Atg (-) ánodo (+) Ac (+) cátodo (-) Más sensible que la inmunodifusión Cualitativa ANODO (+) CATODO (-) .

INMUNOFLUORESCENCIA Emplea anticuerpos que llevan unidos compuestos fluorescentes o fluorocromos. Excitación Emisión Isotiocianato de fluoresceína Rodamina B Ficoeritrina 488nm 545nm 488nm 530nm 585nm 576nm directa indirecta .

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Aparición fluorescencia presencia de autoanticuerpos Patrones de fluorescencia posibilidad de orientar y caracterizar el autoanticuerpo Corte de tejido Antiinmunoglobulina marcada .

Ventajas: posibilidad de discriminar entre diversos patrones buen método de escrutinio Desventajas: interpretación subjetiva margen de referencia baja sensibilidad difícil de estandarizar no es posible la automatización .

Enzimas: peroxidasa de rábano fosfatasa alcalina B-galactosidasa G6PD .ELISA Enzimoinmunoanálisis conjugación del anticuerpo con un enzima que produce una reacción cuyo producto puede ser medido espectofotométricamente.

ELISA INDIRECTO + suero + E E antianticuerpo marcado Espectrofotometría 450nm E E sustrato .

-la concentración de autoanticuerpos se obtiene al leerla en la curva de calibración.Evaluación cuantitativa -curva de saturación de los calibradores : absorbancia de cada calibrador frente a su concentración. Evaluación cualitativa DOCut-off = DOCP* Factor .

Enzimas peroxidasa.INMUNOTRANSFERENCIA La transferencia de proteínas o `blotting´ supone la inmovilización de las proteínas sobre membranas sintéticas ya sea mediante transferencia o mediante aplicación directa. Detección reacción antígeno-anticuerpo: Métodos radioquímicos emiten radiaciones ionizantes. fosfatasa alcalina Reacción de quimioluminiscencia y radiografía .

.

WESTERN BLOT .

SLOT BLOT .

CITOMETRÍA DE FLUJO Tecnología que permite la determinación simultánea de varios autoanticuerpos en células en suspensión mediante el empleo de fluorocromos. . Utiliza conjuntos de microesferas de látex marcadas internamente con diferentes proporciones de dos fluorocromos..

biotina Atg suero estreptavidina-ficoeritrina 576 nm .

Fluorescencia de los dos fluorocromos internos de las microesferas. Fluorescencia de los conjugados unidos a las microesferas (detectores de fluorescencia). .PARÁMETROS Dispersión frontal captada por la lente del detector Forward Scatter (FSC). Relacionado con el tamaño de la partícula. En posición frontal respecto a la fuente de luz. Dispersión lateral captada por el detector Side Scatter (SSC). Medida relativa de la complejidad interna de la célula.

FL3 FL2 complejidad láser Argón 488nm side scatter FL1 FL4 forward scatter forward scatter tamaño .

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