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Tema 3. DNA recombinante y manipulación de genes

Tema 3. DNA recombinante y manipulación de genes

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3.

MANIPULACIÓN DE GENES
DNA recombinante y manipulación de genes

Análisis de ácidos nucleicos
RNA
Tipos de RNA 
   

RNA mensajero (mRNA) RNA ribosomal (rRNA) RNA de transferencia (tRNA) RNA pequeño nuclear (nsRNA). Aproximadamente el 10% del RNA total corresponde al mRNA.

OBTENCIÓN DE RNA 
A partir de muestras de tejidos frescos, incluidos en parafina o de

tejidos momificados. 
Incluye la trituración u homogenización del tejido en una solución que

contenga agentes caotrópicos (TRIZOL) capaces de desnaturalizar proteínas (nucleasas), eliminar carbohidratos y lípidos. 

Separación de los restos de lisis celular, por cloroformo y

centrifugaciones. 

Por lo general se obtiene de 1mg a 10 mg de RNA total por mg de

tejido o 1mg por 1x105 células en cultivo.

Evaluación del RNA 
Existen dos tipos de métodos para verificar la pureza del RNA  Espectofotometría
La concentración del RNA total se evalúa por luz UV, al leer a una longitud de onda de 260 nm. La pureza del RNA se evalúa por la relación de las lecturas A260/A280. El rango de pureza aceptable es de 1.8 a 2.0. 

Electroforesis

Electroforesis 
Al teñir el gel con bromuro de etidio debe de visualizarse un barrido (mRNA) y dos bandas de RNA ribosomal, una banda de 5 kpb (28s) y otra de 2 kpb (5s).

28s 1000pb 18s 5s 100pb

Transcriptasas Reversas Codificadas por retrovirus (Moloney murine leukemia o Avian myeloblastosis) DNA polimerasa: in vivo copia sólo RNA.RT-PCR . in vitro puede usar ssRNA o ssDNA (siempre necesita cebador de RNA o DNA) Usos: .generación de cDNA .

Síntesis de cDNA RT Purificación de RNA Hibridación con poly(dT) Copia del DNA con RT PCR Degradación del RNA Síntesis de la hebra complementaria .

Análisis del DNA RNA MUESTRA cDNA DNA .

dGTP y dCTP) de 10 mM.  Dos secuencias de iniciadores (primers) que flanquean la región que se desea amplificar. Kary Mullis en el año de 1983.Reaccion en cadena de la polimerasa (PCR)  El objetivo es sintetizar un cadena de DNA nueva a partir de una cadena molde de cDNA.  Cloruro de magnesio ( 1. .5 a 3 mM). dTTP. de manera exponencial.  Para esto se utiliza una :  DNA polimerasa termoestable  Nucleotidos trifosfatados dNTPs (dATP.  Técnica desarrollada por el Dr.

Para la PCR se necesitan tres temperaturas específicas:  temperatura de desnaturalización  temperatura de hibridación de los iniciadores  temperatura de extensión Repitiéndose ciclos de 35 a 40 veces. lo que permite amplificar el DNA molde. . Obteniéndose millones de copias de la misma secuencia.

4 PBS 5.8 A91 9.sham 3. Con bromuro de etidio 1000pb 500 pb M marcador 1.10 Cop-1 100pb Actina 604 pb iNOS 394 pb .PCR M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 PCR convencional en gel de agarosa al 2% .2.6 OVA 7.

.

de manera especial.PCR TIEMPO REAL  Los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea  Los sistemas de detección por fluorescencia pueden ser de dos tipos:  Agentes intercalantes  Sondas específicas marcadas con fluorocromos. diseñadas. .

Agentes intercalantes  La emisión de fluorescencia se da cuando se unen a DNA de doble hélice. El principal inconveniente es su baja especificidad No permiten la identificación de polimorfismos en la secuencia diana. El más empleado es el SYBR Green I .    .

. las sondas molecular beacons y las sondas FRET.Sondas de hibridación específicas  Son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos. un donador y un aceptor.  El proceso es la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia entre las dos moléculas.  Las más utilizadas son las sondas de hidrólisis. denominadas también sondas TaqMan.

alterar secuencias de DNA modificando genes .La tecnología de DNA recombinante comprende una mezcla de técnicas. para determinar un gen y la secuencia de a. dentro de estas se encuentran:  Rotura específica para DNA mediante nucleasas o enzimas de restricción para la manipulación de genes individuales. un fragmento de DNA se integre en un elemento génico autorreplicante (virus o plásmido)  Ingeniería genética.a que codifica  Hidridación de los ácidos nucleicos permite localizar secuencias determinadas de DNA o de RNA  Clonaje del DNA.  Secuenciación de los nucleótidos de un fragmento purificado.

Rotura específica para DNA mediante nucleasas o enzimas de restricción  Estas enzimas.1. . las cuales son purificadas de bacterias cortan el DNA en sitios especificos creando fragmentos de tamaño definido.

ser Transiluminador de luz UV . Electroforesis en gel Tinción -  La complejidad del mapa depende del tamaño de la molécula y del número de enzimas utilizadas.Mapas de restricción. + Gel Bromuro de etidio  Dos moléculas de DNA del mismo tamaño pueden fácilmente diferenciadas.

Mapas de restricción E H B E B E 0 Gel de agarosa E B E-B B B 5Kb EH B B E B B E .

Cortan fuera de la Secuencia que reconocen. Son ATP-dependientes. ATP-dependientes. * Enzimas producidos de manera natural por microorganismos cuya función es la de degradar el DNA exógeno. Tipo I: poseen actividad metilasa y de restricción. Rompen el DNA lejos del sitio que reconocen (>1Kbp) de manera aleatoria carecen de interés práctico. Tipo III: poseen actividad de restricción y modificación. Requieren dos secuencias de reconocimiento en orientación opuesta en la misma cadena de DNA. .Endonucleasas de restricción.

.Tipo II sólo actividad de restricción. Punto de rotura característico para cada uno y próximo a la secuencia reconocida. Reconocen secuencias palindrómicas específicas de DNA (de 4 a 8 bp). No ATP-dependientes.

2.  Para saber la estructura. . uno químico y otro enzimático desarrollados en la década de los 70 por Maxam y Gilbert y Sanger .Secuenciación nucleotídica del DNA.  Existen dos métodos para la secuenciación del DNA. función y mutación de un fragmento de DNA depende de la secuencia de nucleótidos.

Separar las cadenas sintetizadas por electroforesis en gel Autorradiografía Lectura del gel ‡ ‡ ‡ ‡ .Secuenciación : Método enzimático ‡ Reacción de síntesis enzimática de una cadena de DNA complementario ± DNA de cadena sencilla o DNA de doble cadena desnaturalizado ± DNA polimerasa ± dNTP * ± Dideoxinucleotidos ‡ Carecen del grupo OH en la posición 3¶ del azúcar del nucleótido (bloquean la reacción) Las reacciones de síntesis se realizan en 4 tubos diferentes y en cada uno se añade un ddNTP diferente.

dTTP dGTP. dCTP* ddATP c) Electroforesis en gel de poliacrilamida A C G T T A C A G T A C G A C T C T T T T b) Síntesis de la cadena complementaria (En cuatro tubos distintos) ddATP ddGTP ddCTP ddTTP .a) Anillamiento del primer M13 Primer DNA polimerasa dATP.

.

NDB. y rojo de texas ± Una sola reacción Lectura del gel con un conectado a un ordenador deduce la secuencia láser que ‡ .Secuenciación Método automático ‡ Marcar los ddNTP fluorocromos distintos ± Fluoresceina. Tetrametil rodamina.

Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia .

3. proporciona información de su tamaño y procesamiento.Técnicas de Hidridación NORTHERN BLOT  Técnica de mancha utilizada para detección de moléculas de RNA por hibridación con un DNA complementario.  Permite detectar la presencia de un transcrito. .

Visualización 3. Extracción del RNA 4. Generación de una sonda marcada dATP dTTP dGTP dCTP pGEM-T 2. Hibridación 6.NORTHERN BLOT 1. Electroforesis del RNA 5. Transferencia a membrana .

Métodos de síntesis de una sonda marcada ‡ Random priming DESNATURACION ALINEAMIENTO DE PARTIDORES DNA POLIMERASA + dNTPs + dNTP-P .

‡ End-labeling POLINUCLEOTIDO KINASA + ATP MARCADO ENZIMA DE RESTRICCION SEPARACION DE FRAGMENTOS .

Nick-translation ds DNA DNase I rompe el DNA al azar DNA polimerasa I agrega nucleótidos .

Eficiencia Marcaje extremo 5¶ (polinucleótido quinasa) Nick translation (DNAsa I + DNA polimerasa I Random priming (Klenow) PCR (polimerasas termoestables) Baja Media Alta Alta .

VISUALIZACIÓN ‡ Captura de la radiación ionizante por una emulsión fotográfica ‡ La membrana es expuesta a un film por tiempos variables ‡ El film es revelado y analizado .

 .SOUTHERN BLOT  Técnica descubierta por Ed Southern en 1925 que permite transferir fragmentos de DNA que han sido separados por electroforesis de un gel de agarosa a un filtro de nitrocelulosa Detectar fragmentos específicos de ADN mediante su hibridación con sondas radioactivas.

La técnica de Southern blot .

WESTERN BLOT  Técnica de separación e identificación de proteínas basada en su distinta movilidad electroforética y que utiliza anticuerpos específicos para cada proteína. . Permite la detección de proteínas. usualmente por métodos inmunológicos.

‡Requiere de un molde asociado a succión con vacío para colocar el RNA que puede producir círculos o puntos (dot blot) o hendiduras (slot blot).DOT BLOT Y SLOT BLOT: ‡Son similares al Northern con la diferencia de que el RNA no es sometido a electroforesis sino que se sitúa directamente sobre la membrana. .

2. Microarrays de cDNAs: ‡ DNAs (cDNA o productos de PCR 0. ‡ Contienen 40.6-2.4 Kb) son inmovilizados en una superficie solida (nylon o vidrio). Tipos de arreglos 1. ‡ Alta densidad de sondas inmovilizadas (107 copias/punto de siembra).MICROARREGLOS DE cDNAS ‡ Permite analizar cientos o miles de genes diferentes en un solo experimento. Microarrays de oligonucleótidos: ‡ Oligonucleótidos (20-80 pb) son sintetizados sobre una matriz de vidrio o plástico.000 sondas. ‡ La muestra a hibridar es marcada con radioactividad. .000-60.

El nivel de expresión de cada gen es representado por la intensidad de la señal asociada a un color: Rojo (Cy5) = > expresión en la muestra experimental Verde (Cy3) = < expresión en la muestra experimental Por convención el RNA de referencia es marcado con Cy3. .

 La metodología consiste en sembrar los clones sobre placas de Petri con agar para después transferirlos a membranas de nylon o nitrocelulosa. . Hibridación de colonias bacterianas: Identificar colonias bacterianas que contengan determinada secuencia de ácidos nucleicos de interés.

 Puede realizarse en material fijado e incluido en parafina lo que permite realizar estudios retrospectivos en material de archivo.  La cantidad de tejido requerido para realizar un estudio es mínima en comparación con otras técnicas de biología molecular . así como también el estudio de expresión génica a escala celular y subcelular.Hibridación in situ  Ventajas:  Detectar translocaciones y otras alteraciones.

 Análisis de la expresión génica (detección de RNAm)  Análisis cromosómicos Hibridación in situ Localización de un gen clonado sobre un cromosoma eucariótico visualizado a microscopio óptico ± Preparación citológica de cromosomas ± Tratamiento con RNasa: degrada el RNA ± Tratamiento con NaOH: desnaturaliza el DNA ± Sonda marcada: el gen clonado . Aplicaciones:  Detección de RNA o DNA de origen viral.

Principios de clonación molecular Para llevar a cabo la clonación molecular se requiere lo siguiente: a) Una fuente adecuada de DNA   DNA genómico (cromosómico) cDNA b) Vectores de clonación: es una molécula pequeña de DNA que puede replicarse de manera autónoma en un huésped (células bacterianas o de levaduras). .

o menos comúnmente en levaduras .Los vectores se utilizan para clonación porque: Pueden seguir su desarrollo normal a pesar de que secuencias adicionales de DNA sean incorporadas en su material genético Se autorreplican utilizando la maquinaria enzimática de la célula huésped Dentro de los vectores más comunes encontramos: Plásmidos: Son moléculas circulares de DNA de doble cadena que se replican de modo extracromosómico en bacterias.

 Algunos presentan una cola. se encuentran el lambda y sus derivados . y son incapaces de replicarse autónomamente por lo que necesitan infectar a la célula para poder hacerlo. Bacteriófagos: Son virus que infectan a las bacterias y están constituidos. por un núcleo de DNA o RNA y una cubierta proteica. Dentro de los fagos más utilizados como vehículos moleculares de clonación.

del inglés yeast artificial chromosome). "Cromosomas artificiales" de levadura: Permite clonar hebras de DNA de gran tamaño y se conocen como cromosomas artificiales de levadura (YAC. .

‡Poseer un gen marcador con el que puedan identificarse y seleccionar las células clonadas. .Preparación de un vector de clonación El vector es el portador de la secuencia de ADN que se desea clonar. Un vector debe presentar las siguientes características: ‡Una pequeña secuencia de ADN ‡Contener distintos puntos de ataque a enzimas de restricción ‡Poder ser incluido en la célula anfitriona con facilidad. ‡Replicarse de forma independiente al ADN de la célula anfitriona.

.c) Enzimas de restricción o endonucleasas que permitan el corte en sitios específicos del fragmento de DNA a clonar y su posterior fusión con el vector y a la DNA ligasa  DNA ligasa: La DNA pueden unir covalentemente DNAs de diferentes orígenes para formar moléculas híbridas.

inserto. o pegajosos.Las etapas del proceso consisten en: ‡ ‡ Cortar el vector y DNA Unir el vector y el ADN que se va a clonar mediante los llamados extremos cohesivos. o simplemente. . Una vez que el ADN ha sido introducido en el vector se denomina ADN inserto. o escalonados.

Células tumorales: apropiadas en procesos de clonación. un bajo costo de mantenimiento.Introducción del ADN en la célula anfitriona   Los tipos de células anfitrionas son: Células bacterianas: son las más utilizadas. en general. ya que la velocidad de replicación es muy alta y se mantienen los caracteres sin producirse cambios. Células eucariotas: aunque las células eucariotas son.  . ya que tienen una alta velocidad de replicación. difíciles de mantener se usan levaduras y células tumorales: Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigación de la expresión y la regulación génica y la síntesis de proteínas eucariotas. pues son muy estables.

Librerías  Una librería de DNA es una colección de clones de vectores que contienen fragmentos de DNA Para tener una librería deberemos tener: Un sistema eficiente de clonaje de ADN. . Un sistema para la obtención de una muestra representativa del DNA a estudiar. para manejar un número considerable de clones. Un sistema de selección de los clones que nos interesan de entre toda la colección.

 Librerías de cDNA: se realizan a partir de mRNAs de un tejido particular. . clonado en el vector de una manera mas o menos al azar.  Librerías de expresión: el clonaje se realiza de tal manera que la bacteria es capaz de transcribir y traducir la proteína codificada por el fragmento de DNA.Existen diversos tipos de librerías:  Librerías genómicas: a partir de DNA genómico de una especie.  Librerías de cromosomas específicos: a partir de DNA de determinados cromosomas purificados.

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