Colorantes

Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste;

son compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les confieren
color. Están formados por un grupo cromóforo, que en la parte de la molécula
responsable del color y un grupo auxócromo que, al formar sales, les permite
disociarse y combinarse. Existen algunos, llamados colorantes vitales, que pueden
añadirse directamente a una preparación en fresco; por tanto, colorean células
vivas. No obstante, la mayoría de los colorantes son solamente efectivos después
de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, se encuentren muertos y
adheridos al portaobjetos. Para la fijación por calor, se realiza una fina extensión
de una gota de muestra líquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a
continuación, se pasa la preparación de Forma rápida sobre la llama de un
mechero; El calor de la llama mata las células microbianas por desnaturalización
de sus proteínas. Las proteínas coaguladas unen las células al porta. Cuando se
desea fijar especimenes delicados se utiliza la fijación química, que es menos
agresiva que el calor. Para ello se añade una gota del fijador, por ejemplo, ácido
ósmico, formaldehído, o glutaraldehído, sobre la muestra líquida con los
microorganismos.

La fijación posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona la

apariencia real de las células, lo cual dificulta la identificación; además, no permite
la observación del movimiento de los microorganismos. Después de la fijación, se
añade el colorante, que debe permanecer el tiempo suficiente en contacto con el
espécimen, para que pueda ser absorbido. A continuación, se retira el exceso de
colorante, normalmente lavando con agua.

Tipos de colorantes Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por
iones cargados. Los colorantes básicos son aquellos en los cuales el agente que
tiñe es el ion cargado positivamente (el cromóforo) y se combinan con los
componentes ácidos de la célula como ADN y ARN, mientras que en los ácidos, el
colorante es el ion cargado negativamente y se combinan con los componentes
básicos de la célula, como el citoplasma; es decir se combinan con los
componentes celulares en función de sus respectivas cargas; por lo tanto, los
factores como fuerza iónica, composición del medio, temperatura y pH afectan las
tinciones.

Los colorantes más utilizados son los de tipo básico, ya que la mayor parte de las
células microbianas poseen cargas débilmente negativas en su superficie, lo cual
facilita su unión.
Entre los colorantes básicos, más comunes se encuentran la safranina, la
fucsina básica, el cristal violeta y el azul de metileno.
Los colorantes ácidos se unen a las partes de las células cargadas
positivamente. Se utilizan para teñir tejidos animales infectados con
microorganismos. Entre los más frecuentes están la eosina, la fucsina ácida y el
rojo Congo.

Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen gran importancia en algunas

técnicas de tinción. Los mordientes intensifican la tinción porque aumentan la
afinidad de la célula por el colorante. Se usa cuando la afinidad química entre el
componente celular y el colorante es baja; también se pueden utilizar para
producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los
flagelos, que debido a su delgadez no podrían ser visualizados de otra forma.

Finalmente, algunos colorantes precipitan o se disuelven en componentes

celulares tales como el negro de Sudán, que es liposoluble y permite distinguir los
glóbulos de grasa.
Tipos de tinciones:

Pueden agruparse en: tinciones simples, diferenciales y selectivas.

TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA BACTERIAS

Tinción Uso Técnicas
Tinciones Un colorante; Se tiñe con un colorante básico (azul de
simples proporciona contraste metileno, cristal violeta, o fucsina básica)
para observar mejor un durante unos 5 minutos. Aclarar
organismo completo brevemente con agua. Se tiñen casi
todas las bacterias; la rnayoría de los
tejidos no se tiñen.
Tinciones diferenciales
Tinción de Dos o más colorantes; Se cubre la preparación de bacterias
Gram. distingue entre fijadas con cristal violeta y después con
bacterias Gram una solución de iodo (mordiente). Todas
positivas y Gram las células quedan tenidas de color
negativas violeta oscuro. Se decolora con acetona
al 95%.

Las células Gram positivas permanecen

tenidas, pero las negativas pierden el
colorante. Se tiñe con safranina
(contraste). El color violeta de las Gram
positivas se vuelve más oscuro y las
Gram negativas se tiñen de rosa.
Tinción de Dos colorantes; Se tiñen las células con fucsina básica y
ácido-alcohol distingue entre las se calienta a emisión de vapores durante
resistencia micobacterias (ácido- 5 minutos. Todas las bacterias se tiñen
(Ziehl- alcohol resistentes) y el de rojo. Se decolora brevemente con una
Neelsen) resto de las bacterias mezcla de alcohol-HCl. Las bacterias
resistentes permanecen teñidas de rojo;
todas las demás se decoloran. Se trata
con el colorante de contraste azul de
metileno. Las bacterias ácido-alcohol
resistentes continúan tenidas de rojo, las
otras se tiñen de azul.

Tinciones selectivas
Tinción de Tiñe selectivamente las Se cubre la preparación con verde de
esporas de endosporas malaquita y se calienta a emisión de
Wirtz-Cortitlin vapores durante 60 segundos. Se lava
con agua durante 30 segundos y se tiñe
con safranina. Las endosporas retienen
el color verde; el resto de la célula toma
el color rosa.
Tinción Revela la presencia de Se utiliza tinta china o nigrosina para
negativa cápsulas teñir una preparación en fresco del
espécimen. Las partículas de colorante
no pueden penetrar en la cápsula, que
se observa como una región clara
alrededor de la célula.

1) Tinciones simples

En las tinciones simples se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico
como safranina, azul de metileno o cristal violeta. Se utilizan solamente para
incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán
teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple mejora la observación de la
célula completa. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo
adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparación
ya está lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente, hay que añadirlo justo
antes del colorante.

Coloración de azul de metileno

Procedimiento:

1. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor.

2. Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar 3-5 minutos
3. Lavar con agua y dejar secar
4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
Coloración de tinta china o negativa

1. Colocar una gota de tinta china sobre la lamina portaobjetos

2. Agregar una gota de la mezcla bacteriana.
3. Cubrir la preparación con una laminilla cubreobjetos
4. Observar con lente de menor y mayor aumento

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

Coloración de azul de lactofenol

 1. Colocar una gota de colorante sobre la lamina portaobjetos
2. Colocar una muestra de cultivo de hongos sobre el colorante
3. Cubrir con una lamina cubreobjetos.
4. Observar con lente de menor mayor aumento.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

2) Tinciones diferenciales

Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir entre tipos de

microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta de dos etapas: una
tinción primaria (siguiendo el mismo método que en una tinción simple) seguida de
una tinción de contraste. En la tinción de contraste se utiliza otro colorante que tiñe
(y por tanto, revela) las células no teñidas por el primer colorante. Estas tinciones
son muy utilizadas en microbiología. Por ejemplo, la tinción de Gram y la tinción de
ácido-alcohol resistencia, ambas aplicadas a bacterias.

a) Tinción de Gram

Método   de identificación de bacterias mediante una tinción específica.

Desarrollado por el médico danés Hans Christian Joachim Gram en 1884. Esta
tinción clasifica las bacterias en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas. Se
denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tinción azul y
bacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas. Algunas bacterias
presentan capacidad variable de tinción de Gram y se llaman Gram variables.
Bacterias Gram positivas típicas son los estafilococos que producen forúnculos;
Gram negativas representativas son la Escherichia coli de la flora intestinal o los
bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos de Koch de la tuberculosis. 

La técnica incluye tinción primaria, decoloración y tinción de contraste:

En un primer momento las bacterias se tiñen con violeta de genciana (derivado

metilado anilínico) y después se tratan con la solución de Gram (1 parte de yodo, 2
partes de yoduro potásico y 300 partes de agua); por último se lavan con alcohol
etílico, o acetona y unas bacterias retienen el fuerte color azul de la violeta de
genciana y otras se decoloran por completo (en este momento, las bacterias Gram
negativas pierden su tinción violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante)

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

CUESTIONARIO
1. ¿Qué tipo de colorantes son el azul de metileno, tinta china y el azul de
lactofenol, ácido, básico o neutro?

El azul de metileno es un colorante básico.

La tinta china es un colorante acido.
Azul de lactofenol es un colorante básico.

2. ¿Qué estructura de la bacteria se colorea con el azul de metileno?

El azul de metileno es un colorante básico que tiene el núcleo de la célula.