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Tesis_analisis_transgenesis_20_polentas_14022011

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Las muestras fueron homogeneizadas utilizando morteros de cerámica (previamente

autoclavados y descontaminados) hasta obtener polvillo fino.

Para las extracciones de ADN se utilizaron el protocolo Dellaporta et al (Dellaporta, 1983) con

pequeñas modificaciones y el Kit QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit.

Dellaporta: A 70 mg de muestra homogenizada se agregan 700 de Buffer de extracción

(Tris-HCl 50 mM pH 8.0; EDTA 10 mM pH 8.0; NaCl 100 mM;

-mercaptoetanol 10

mM). Se mezcla por inversión unas 10 veces hasta que el buffer de extracción llega a toda la

muestra y se incuba a 65 ºC durante 20min, agitando cada 2 min. Posteriormente se agregan 200

potasio 5M, se invierte el tubo 5 veces, y se incuba en hielo por 10 min. Luego

se centrifuga a 12000 rpm por 20 min, y se toman 500

los cuales se les

incorporan 500 L de isopropanol y se mezcla por inversión unas 10 veces. Se centrifuga por 15

min a 12000 rpm, y luego de descartar el sobrenadante se agregan 250

%,

centrifugando nuevamente por 5 min a 12000 rpm. Por último, se descarta el sobrenadante, se

seca el precipitado, se resuspende en 100

y se guarda en freezer a -20o

C para su

posterior utilización.

QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit: Las muestras son homogenizadas mecánicamente y luego

lisadas químicamente con un buffer proporcionado por el Kit. El ARN es removido mediante

digestión con ARNasa para asegurarnos de obtener ADN celular puro. Los restos celulares son

removidos al pasar la muestra por una columna tipo filtro (QIAshredder) y centrifugar. Se

precipitan las proteínas y polisacáridos y el lisado es cargado en una columna de sílica-gel. Esta

columna pega selectivamente el ADN dejando pasar el resto de los contaminantes. Los

contaminantes que quedan pegados débilmente a la columna son eliminados mediante dos pasos

de lavado. El ADN es luego eluido de la columna con agua o buffer salino.

Para hacer las extracciones se partió de la misma cantidad de muestra para ambos protocolos de

extracción de manera de poder comparar tanto la cantidad como la calidad del ADN purificado

a partir de ambos métodos y decidir mediante un balance costo/beneficio cual utilizar para el

trabajo.

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