P. 1
15838239

15838239

|Views: 20.068|Likes:

More info:

Published by: Rorris Rorris Rorris on Mar 01, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

07/21/2013

pdf

text

original

Sections

  • PRESENTACIÓN
  • INTRODUCCIÓN
  • Trypanosoma cruzi
  • DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
  • EXAMEN DE SANGRE: FRESCO, GOTA GRUESA, FROTIS
  • HEMOCULTIVO
  • HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA (HAI)
  • ELISA
  • INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
  • CONTROL DE CALIDAD
  • BIOSEGURIDAD
  • REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

SERIE DE NORMAS TÉCNICAS Nº 00

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA (ENFERMEDAD DE CHAGAS)

Instituto Nacional de Salud
Calle Cápac Yupanqui 1400, Lima 11, Perú Apartado Postal 471, Teléfono: (0511) 471-9920 Fax: (0511) 471-0779 Correo electrónico: revmedex@ins.gob.pe Página web: www.ins.gob.pe

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

SERIE DE NORMAS TÉCNICAS Nº 00

Lima, 2005

MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Ministerio de Salud

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA (ENFERMEDAD DE CHAGAS)

ELABORACIÓN: Bióloga Silvia Vega Chirinos Doctor César Náquira Velarde Laboratorio de Leishmaniosis y Chagas Centro Nacional de Salud Pública-INS

Catalogación hecha por el Centro de Documentación e Información del INS

Vega Chirinos, Silvia ; Náquira Velarde, César Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de la trypanosomiosis americana (enfermedad de Chagas) / Elaborado por Silvia Vega Chirinos y César Náquira Velarde. — 2ª. Ed. — Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2006. 106 p.: 14.5 x 21 cm. — (Serie de Normas Técnicas; 26) 1. TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO 2. ENFERMEDAD DE CHAGAS I. Náquira Velarde, César II. Vega Chirinos, Silvia III. Instituto Nacional de Salud (Perú) IV. Perú. Ministerio de Salud

1ª. edición, 1999 ISBN 9972 – 857 – 26 – 3 (O.C.) ISBN 9972 – 857 – 30 – 1 (N°26) (2da. ed.) ISSN 1607 – 4904 Hecho el Depósito Legal Nº 1501132002-5854 © Ministerio de Salud, 2006 Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jesús María, Lima, Perú Teléfono: (511) 431-0410 © Instituto Nacional de Salud, 2006 Cápac Yupanqui 1400, Jesús María, Lima, Perú Teléfono: (511) 471-9920 Fax: (511) 471-0179 Correo electrónico: postmaster@ins.gob.pe Página Web: www.ins.gob.pe Publicación aprobada con R.J. Nº 164 – 2006 –J–OPD/INS Portada: Observación microscópica de formas móviles del Trypanosoma cruzi. Aspectos de identificación y diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Se autoriza su reproducción total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.

...................................................... 11 CAPÍTULO II Diagnóstico de laboratorio .......................... 33 CAPÍTULO V Técnicas de concentración: microconcentración.......................................... 41 CAPÍTULO VII Xenodiagnóstico ........ 9 CAPÍTULO I Trypanosoma cruzi ..........................CONTENIDO Resolución jefatural .............................................................................................................................................................................................................. 29 CAPÍTULO IV Examen de la sangre: en fresco........................... 37 CAPÍTULO VI Hemocultivo ...... 47 CAPÍTULO VIII Hemaglutinación indirecta (HAI) .................................................................................. 57 ............................................................................... frotis ......................... 21 CAPÍTULO III Obtención de la muestra sanguínea ............... 7 Introducción ................................................................ gota gruesa........ 51 CAPÍTULO IX ELISA ........................................................................................................................... concentración de Strout ..................................................................................................................... 5 Presentación ....................................................

........................................................CAPÍTULO X Inmunofluorescencia indirecta (IFI) ............................................................ 77 Anexo 1: Preparación de reactivos y medios de cultivo .......................... 69 CAPÍTULO XII Bioseguridad ................................................ 63 CAPÍTULO XI Control de calidad ............................ 87 Anexo 3: Preparación de antígenos ...................................................................................................................... 89 Anexo 4: Conservación y envío de muestras Examen de laboratorio solicitado según tipo de muestra ...................................................................... 79 Anexo 2: Aislamiento y mantenimiento del Trypanosoma cruzi en el laboratorio ............ 93 Anexo 5: Solicitud para el diagnóstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas Anexo 6: Solicitud de control del diagnóstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas Anexo 7: Registro de muestras para investigación y monitoreo de casos de enfermedad de Chagas Anexo 8: Protocolo para la detección de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi por ELISA Anexo 9: Protocolo para la detección de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi por inmunofluorescencia indirecta (IFI) ... 73 Referencias bibliográficas .................................................................

.

002 6 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA MPR .INS .

así como los canales de envío de muestras e información. intermedios y regionales de la Red Nacional de Laboratorios en Salud Pública. El comité de redacción MPR . El presente manual hace una descripción de los métodos más frecuentes e incluye el fundamento.INS . el xenodiagnóstico. Se sabe que las manifestaciones clínicas de la enfermedad no son características. principalmente por transfusión sanguínea. En el fluxograma se señalan las pruebas que pueden desarrollarse en los laboratorios locales. Se han añadido los capítulos de bioseguridad. gota gruesa y más complicadas como el hemocultivo.002 7 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . El manual está especialmente dirigido para ser usado en todos los laboratorios de la red por el personal encargado del diagnóstico parasitológico y serológico de la trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas. por lo cual muchos casos pasan desapercibidos. el cual se refiere a los reactivos y la preparación requerida para los métodos de diagnóstico. el procedimiento y la lectura de los resultados. Los métodos de diagnóstico incluyen pruebas tan simples como los exámenes de sangre en fresco. en forma congénita y también por transplante de órganos. frotis. La presencia de estos insectos infectados ha sido demostrada en todo el país. por lo que la transmisión vectorial de la infección está establecida en el territorio nacional. Al lado de la transmisión vectorial ocurre la no vectorial. control de calidad y anexos. las pruebas serológicas y moleculares.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA PRESENTACIÓN La trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas es una infección parasitaria producida por Trypanosoma cruzi y transmitida por insectos hematófagos de la familia Reduvidae. Cabe puntualizar que el avance en la búsqueda de métodos más específicos y sensibles. permitirá disponer de técnicas más eficientes y que en su oportunidad serán incorporados a los que usa la red.

INS .002 8 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA MPR .

INS . En estas áreas. especialmente el corazón y tubo digestivo. cuyo hábitat es domiciliario y en la zona nororiental (Cajamarca. de los cuales 1209 corresponden a formas agudas u oligosintomáticas y 22 962 a formas crónicas de la enfermedad. se estima en 24 170 el número de infectados por T. envío de muestras y medidas de bioseguridad que deben seguirse durante el trabajo en el laboratorio. MPR . utilizando procedimientos uniformes y comparables. con la presencia del vector Triatoma infestans. valles interandinos de Ayacucho y Apurímac). de hábitat peridomiciliario y silvestre. en el diagnóstico parasitológico y serológico de la trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas. Amazonas.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA INTRODUCCIÓN La enfermedad de Chagas o trypanosomiosis americana constituye un problema de salud pública en la mayoría de países latinoamericanos. procesamiento. el mayor impacto en la salud de los pobladores. la vía transplacentaria o transmisión congénita y el transplante de órganos. La infección por sexo es equitativa y el grupo de edad más afectado está entre los 20 a 50 años (MINSA. El presente manual tiene por objeto guiar al personal de la Red Nacional de Laboratorios en Salud Pública. Se ha calculado que por lo menos 90 millones de personas están expuestas a contraer la infección y que 18 millones están infectadas (Organización Mundial de la Salud. sistemas y aparatos.002 9 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . al igual que a otros mamíferos.1998). 1991). Arequipa. Pastrongylus y Rhodnius. Esta enfermedad metaxénica es causada por el protozoario flagelado. Trypanosoma cruzi y transmitida al ser humano. Tacna. Moquegua. cruzi. Afecta diversos órganos. con los vectores de los géneros Triatoma. San Martín). es endémica desde México hasta el sur de Chile y Argentina. Otras formas de contraer la infección son la transfusión sanguínea. comúnmente conocido como "chirimacha". por insectos hematófagos conocidos como triatominos. ocurre en la zona sur occidental (Ica. En el Perú. El manual desarrolla los procedimientos de obtención. Se calcula que 3142 casos corresponden a niños menores de cinco años.

002 10 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA MPR .INS .

Se caracteriza por ser de aspecto fusiforme. forma que también se desarrolla en medios de cultivo. En el recto del triatomino. se aloja principalmente en los tejidos del músculo cardíaco y del sistema neurovegetativo del tubo digestivo. mide de dos a cuatro micras. como reservorio. utiliza dos hospederos: insectos de la familia Reduvidae. presenta núcleo central y cinetoplasto subterminal del cual emerge una membrana ondulante que recorre el parásito en toda su longitud y cuyo borde libre lleva un flagelo que emerge por el extremo anterior. Es de aspecto fusiforme. MPR . mide 20 micras. que hacen las veces de vector. c) Epimastigote: Es la forma libre que se multiplica por fisión binaria en el interior del tubo digestivo del vector. Es de forma redondeada.INS . Se le encuentra en la sangre de mamíferos y en las heces del vector.1. presenta núcleo y cinetoplasto ubicados en la parte central del parásito. El parásito presenta tres formas evolutivas (figura 1): a) Trypomastigote: Es la forma infectante para los mamíferos y el insecto vector.002 11 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Los trypomastigotes se diferencian en epimastigotes en la parte anterior del tubo digestivo del triatomino. posee núcleo y cinetoplasto. Se dividen y forman seudoquistes conocidos como "nidos de amastigotes". CICLO BIOLÓGICO El ciclo biológico del Trypanosoma cruzi (figura 2) se inicia cuando el triatomino libre de infección se alimenta de sangre humana o de animales infectados que contiene los trypomastigotes. es un protozoario flagelado que durante su ciclo de vida. y mamíferos. mide 2030 micras. los que se multiplican y mantienen en el intestino medio durante toda la vida del insecto. 1. No se divide. se transforman en trypomastigotes llamados metacíclicos y son eliminados con las heces. incluyendo al ser humano.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO I Trypanosoma cruzi Trypanosoma cruzi agente causante de la enfermedad de Chagas. b) Amastigote: Es la forma intracelular del parásito.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA AMASTIGOTE (INTRACELULAR EN EL MAMÍFERO) TRYPOMASTIGOTE (EN SANGRE CIRCULANTE DEL MAMÍFERO Y HECES DEL INSECTO) EPIMASTIGOTE (EN PARTE ANTERIOR DEL TUBO DIGESTIVO DEL INSECTO Y EN CULTIVOS) Figura 1 MPR .002 12 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .INS .

INS .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Figura 2 MPR .002 13 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

• Transplante de órganos. serían los más importantes que han sido hallados infectados naturalmente (figura 5).002 14 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . El período de incubación es aproximadamente de 4 a 15 días. MECANISMOS DE TRANSMISIÓN a) VECTORIAL El principal mecanismo de transmisión se produce por contacto de la piel abierta o mucosas con las heces de los triatominos infectados. Triatoma carrioni y Pastrongylus chinai. MPR . • Accidentes en el laboratorio. formas infectantes para el mamífero. Triatoma infestans. • Transmisión transplacentaria. De las 19 especies descritas hasta el momento. Los trypomastigotes atraviesan la piel erosionada por el rascado a causa de la picadura y en ocasiones. Pastrongylus herreri (figura 4). después de multiplicarse rompen la célula que los hospeda y se diseminan en la sangre como trypomastigotes e invaden los tejidos de órganos. por la conjuntiva. Generalmente esto ocurre en forma mecánica al rascarse después de la picadura del insecto. sistemas y aparatos importantes como el corazón y plexos nerviosos del tubo digestivo. 1. b) NO VECTORIAL Otras formas de adquirir la infección son: • Transfusión sanguínea. donde se reproducen como amastigotes. defeca y deposita sobre la piel las heces que contienen trypomastigotes metacíclicos.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Cuando el insecto infectado pica o succiona la sangre al reservorio.2. Se introducen en las células adyacentes y se transforman en amastigotes.INS . Rhodnius ecuadorensis. En el Perú todas las regiones naturales registran especies de triatominos (figura 3).

002 15 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .INS . 3. Guillén Z. Distribución de los vectores de la enfermedad de Chagas. (2002).MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA DISTRIBUCIÓN DE TRIATOMINOS EN EL PERÚ Fig. Fuente: Lumbreras H. MPR . Cáceres et al.(1992). (1972). Calderón F.(1982).

forma que infecta al hombre. A) Triatoma infestans espécimen adulto (hembra). Giemsa 1000 X.002 16 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Se observa el cinetoplasto en el extremo posterior. Triatominos vectores de la enfermedad de Chagas. Izq.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA A B Fig.INS .: Trypomastigote metacíclico en heces de triatómico infectado. B) Pastrongylus herreri espécimen adulto (hembra). MPR . Der. Fig.: Epimastigotes en división en el intestino del triatómico infectado. Giemsa 1000 X. 4. se observa el cinetoplasto anterior al núcleo y agrupados en colonias. 5.

MPR .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 1.3. con un cuadro febril y presencia o no del chagoma de inoculación como nódulo o úlcera. Paciente que presenta chagoma de inoculación en el ojo izquierdo. 6.002 17 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .INS . generalmente en cara o miembros superiores. Fig. Guillén). produciendo el complejo oftalmo-ganglionar conocido como signo de Romaña (cortesía Dr. que consiste en edema bipalpebral unilateral y ganglio preauricular aumentado en volumen (Figura 6). Los trypomastigotes invaden la piel periorbitaria o conjuntiva. ACCION PATÓGENA Las formas clínicas más conocidas de la efermedad de Chagas o trypanosomiosis americana son: Forma aguda Se hace evidente después de las primeras semanas de ocurrida la adquisición del parásito. Ocasionalmente se observa el signo de Romaña. A.

002 18 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . El núcleo se observa en posición central y el cinetoplasto subterminal. MPR .INS . Formas redondeadas muy pequeñas. Arriba: Trypomastigote de Trypanosoma cruzi en sangre circulante. alteraciones electrocardiográficas e insuficiencia cardíaca secundaria a miocarditis aguda. Figura 7.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Las manifestaciones generales más importantes son concomitantes con síntomas cardíacos. Menos frecuentes son las manifestaciones de otros órganos. Se les observa agrupadas en el interior de las fibras musculares (nidos de amastigotes). En estas formas son abundantes los trypomastigotes en sangre y los amastigotes en tejido (Figura 7). presentan núcleo y cinetoplasto. Giemsa 1000 X. Abajo: Amastigote de Trypanosoma cruzi en corte histológico del corazón. Hematoxilina-Eosina 1000 X.

Se trata de niños prematuros que presentan generalmente hepatoesplenomegalia con gran cantidad de trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos. megacolon). generalmente. Las manifestaciones más frecuentes son de naturaleza cardíaca (insuficiencia cardíaca). En estas formas son escasos los trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos. MPR . son muy escasos los trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos. En esta forma.INS . Forma congénita Corresponde a niños que nacen infectados por pasaje del parásito a través de la placenta de la madre. La situación del portador se evidencia. Un portador puede ser asintomático toda la vida o presentar manifestaciones clínicas aun después de muchos años de haberse infectado. Forma indeterminada o de portador Se trata de personas aparentemente sanas. nerviosa y digestiva (megaesófago.002 19 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . en las que la inoculación del parásito y los síntomas de las formas agudas o crónicas no son reconocidos por el portador del parásito. cuando la persona desea donar sangre y el tamizaje demuestra serología positiva para Trypanosoma cruzi.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Forma crónica Se hace evidente después de meses o años de ocurrido el ingreso del parásito.

.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO II DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Para realizar el diagnóstico del laboratorio. Actualmente está siendo ensayada por su alta sensibilidad y especificidad. es una técnica que amplifica fragmentos de ADN del parásito y se detecta mediante hibridación con cebadores (fragmentos de DNA) conocidos del Trypanosoma cruzi. Concentración de Strout. Xenodiagnóstico. principalmente en la forma congénita de la infección y en el seguimiento del tratamiento. PCR. Es aplicable tanto en la forma clínica aguda y congénita como en la crónicaportador y permite la multiplicación del parásito in vivo el cual se detecta examinando las heces del insecto a partir del 30. Microconcentración. concentración de Strout.INS . microconcentración. MPR . Gota gruesa-frotis. El PCR o reacción en cadena de la polimerasa.º día de su alimentación. existen distintos procedimientos técnicos. Los directos o parasitológicos. Durante las dos a ocho primeras semanas después ocurrida la infección. hemocultivo y xenodiagnóstico. Se usan también en la investigación de Chagas congénito. gota gruesa-frotis. existe un gran número de trypomastigotes circulando en el torrente sanguíneo y pueden detectarse mediante el examen en fresco. Biopsia.002 21 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .1. que se basan en la demostración de la presencia del parásito en sangre circulante y excepcionalmente en biopsias y los inmunológicos. TÉCNICAS PARASITOLÓGICAS PARA LA DEMOSTRACIÓN DIRECTA DE LA PRESENCIA DEL PARÁSITO • • • • • • • • Gota fresca. El xenodiagnóstico es una técnica bastante sensible que consiste en hacer picar al posible portador del parásito con el vector libre de infección. que detectan la presencia de anticuerpos antiTrypanosoma cruzi (figura 8). 2. Su empleo está indicado principalmente cuando existe sospecha clínica o epidemiológica de la forma aguda. Hemocultivo.

Así mismo.002 22 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . pero el resultado negativo no la descarta. Las técnicas inmunológicas.. 2. Técnicas inmunoenzimáticas: ELISA.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA La biopsia de músculo esquelético. Son de mayor aplicación durante la forma clínica crónica-portador cuando la parasitemia en el torrente sanguíneo es baja o nula y las técnicas directas no pueden evidenciar la presencia del parásito. Inmunofluorescencia indirecta (IFI). El resultado parasitológico positivo confirma la infección. En la actualidad se están ensayando fracciones antigénicas del parásito que permitirán la interpretación del estadio clínico del paciente. son de utilidad en la selección de donantes de sangre. técnicas inmunocromatográficas basadas en proteínas recombinantes o péptidos sintéticos para un diagnóstico rápido de la infección (18). Esta técnica está limitada a casos especiales de estudio por lo que no se desarrollará en el presente manual. Detectan anticuerpos a partir de la segunda o tercera semana de iniciada la infección. ganglio etc. Los métodos son seleccionados dependiendo de la forma clínica por investigar (Figura 9). TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA Trypanosoma cruzi Las técnicas más empleadas en nuestro medio son: • • • Hemaglutinación indirecta (HAI).INS . además de aplicarse en el dignóstico individual de la enfermedad. los estudios de prevalencia de anticuerpos específicos en poblaciones para conocer la epidemiología de la enfermedad y la evaluación del impacto de las medidas de control. permite la observación de los "nidos de amastigotes". MPR .2.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA ALGORITMO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Y SU SEGUIMIENTO ANTECEDENTE EPIDEMIOLÓGICO TRANSMISIÓN VECTORIAL TRANSFUSIÓN SANGUÍNEA TRANSMISIÓN CONGÉNITA TRANSPLANTE DE ÓRGANOS NO INFECCIÓN POCO PROBABLE SÍ SINTOMÁTICO ASINTOMÁTICO ( PORTADOR) SOSPECHA FORMA AGUDA : BÚSQUEDA DE TRYPANOSOMAS EN SANGRE MÉTODOS PARASITOLÓGICOS : EXAMEN EN FRESCO. GOTA GRUESA CONCENTRACIÓN DE STROUT MICROCONCENTRACIÓN HEMOCULTIVO . XENODIAGNÓSTICO.002 23 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .INS . PCR NEGATIVO FORMA CRÓNICA: DETECCIÓN DE ANTICUERPOS EN SUERO MÉTODOS SEROLÓGICOS: HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO ELISA OTROS NEGATIVO DIAGNÓSTICO IMPROBABLE POSITIVO EN DOS PRUEBAS XENODIAGNÓSTICO PCR NEGATIVO SEGUIMIENTO CLÍNICO POSITIVO POSITIVO DIAGNÓSTICO CONFIRMADO Figura 8 MPR .

2. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO. que considera necesaria la detección de anticuerpos anti T. se aplican las técnicas que detectan anticuerpos específicos contra el parásito ya que tienen la capacidad de evidenciarlos a partir de la tercera semana de ocurrida la infección (figura 11). DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO EN LA RED NACIONAL Los laboratorios de la red pueden realizar la diferentes técnicas según sus posibilidades (figura 10).3. la primera altamente sensible para el tamizaje de la infección y la segunda de elevada especificidad que complemente y ratifique el resultado reactivo obtenido en el tamizaje.1.INS .3. Siguiendo las recomendaciones de la Organización Panamericana de la Salud. Utilidad de las técnicas de diagnóstico en las formas clínicas.002 24 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . MPR .Al inicio +++ Después de 20 días +/+ Ac : No útil : : Utilidad relativa Util : Anticuerpos Figura 9. con mayor frecuencia. ELISA. IFI) . 2. Para el diagnóstico de laboratorio de la infección chagásica.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO FORMAS CLÍNICAS DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS AGUDA CRÓNICA PORTADOR CONGÉNITA GOTA FRESCA + ++ +++ +++ +++ +++ ++++ +/+ ++ +++ + ++ +++ +++ +++ +++ ++++ IgG +: Ac de la madre IgM +: Ac del recién nacido hasta los seis meses GOTA GRUESA MICROCONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN DE STROUT HEMOCULTIVO XENODIAGNÓSTICO PCR PRUEBAS SEROLÓGICAS (HAI. cruzi con por lo menos dos técnicas de principio diferente. En conjunto ambas pruebas alcanzan el 95-98% de sensibilidad y especificidad. empleamos las técnicas de ELISA e IFI.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA ACTIVIDADES POR NIVELES LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL COMPONENTE PARASITOLÓGICO MICROCONCENTRACIÓN .INS . INMUNOBLOT CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA Y MOLECULAR DE T. IFI DE DE RESULTADOS .FROTIS CONCENTRACIÓN DE STROUT . ELISA. ELISA.TRIATÓMINICO CAPACITACIÓN CONTROL DE CALIDAD LABORATORIO DE NIVEL LOCAL EXAMEN DE GOTA FRESCA . MICROCONCENTRACIÓN OBTENCIÓN DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO RECONOCIMIENTO DEL HÁBITAT Y CAPTURA DE TRIATOMINOS Figura 10. CONCENTRACIÓN DE STROUT. cruzi DESARROLO DE TÉCNICAS BIOMOLECULARES: PCR COMPONENTE ENTOMOLÓGICO XENODIAGNÓSTICO CONFIRMACIÓN TAXONÓMICA DE LOS VECTORES INVESTIGACIÓN DE INFECCIÓN NATURAL DE TRIATOMINOS SUSCEPTIBILIDAD DE LOS TRIATOMINOS A LOS INSECTICIDAS TÉCNICAS ALTERNATIVAS DE CONTROL VECTORIAL ESTUDIOS MORFOMÉTRICOS Y DE VARIABILIDAD GENÉTICA INFORMACIÓN Y MUESTRAS CAPACITACIÓN CONTROL DE CALIDAD LABORATORIO DE REFERENCIA REGIONAL ENVIO COMPONENTE ENTOMOLÓGICO IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA. HEMOCULTIVO HAI. Fluxograma de estudio de la enfermedad de Chagas en la red MPR . INVESTIGACIÓN DE INFECCIÓN NATURAL DEL TRIATOMINO DETERMINACIÓN DE LA DENSIDAD POBLACIONAL DEL VECTOR E ÍNDICE TRIPANO . MICROCONCENTRACIÓN HEMOCULTIVO HAI. GOTA GRUESA .002 25 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD ENVIO EXAMEN DE GOTA FRESCA . GOTA GRUESA – FROTIS CONCENTRACIÓN DE STROUT . IFI .

: No reactivo +: Reactivo + y +: Reactivo en ELISA y reactivo en IFI + y -: Reactivo en ELISA y no reactivo en IFI DE Figura 11.MANUAL FLUXOGRAMA PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS EN LA RED LABORATORIO REFERENCIA REGIONAL LABORATORIO REFERENCIA NACIONAL MPR . Si persiste el resultado se solicita y se examina una nueva muestra. Las muestras con resultado indeterminado.INS . S ALUD .002 ELISA (Tamizaje) ELISA e IFI LABORATORIO LOCAL OBTIENE MUESTRA SANGRE Resultado Resultados REPORTA NO REACTIVO -y+ Discordante +y+ REGISTRA INFORMACIÓN REPORTA REACTIVO +yREPORTA NO REACTIVO DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 26 IFI Resultado OTRA PRUEBA (HAI o IB) SEPARA EL SUERO O PLASMA Envía muestra I Resultado Envía muestra + REPORTA REACTIVO + REPORTA REACTIVO I NSTITUTO N ACIONAL . se vuelve a examinar.

002 27 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . y. DIAGNÓSTICO E INVESTIGACIÓN DE LA FORMA CLÍNICA CONGÉNITA En el recién nacido.2. no es posible distinguir si los anticuerpos (IgG) específicos detectados son propios o adquiridos vía transplacentaria de la madre por lo que es de importancia realizar el seguimiento de la evolución del título serológico al tercer mes. La detección de anticuerpos IgM como respuesta de infección temprana tiene baja sensibilidad. MPR . 2.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA FLUXOGRAMA PARA EL DIAGNÓSTICO E INVESTIGACIÓN DE LA FORMA CLÍNICA AGUDA EN LA RED LABORATORIO LOCAL OBTENCIÓN DE MUESTRA DE SANGRE (Persona con sospecha clínica o epidemiológica ) LABORATORIO REFERENCIA REGIONAL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO LABORATORIO REFERENCIA NACIONAL HEMOCULTIVO GOTA GRUESA MICROCONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN STROUT BIOLÓGICA Y MOLECULAR DE TRYPANOSOMAS NO SE CONFIRMA EL CASO - Resultado Resultado + Envía cultivo Una prueba + CASO CONFIRMADO Envía muestra de sangre (5mL) + AISLAMIENTO DEL PARÁSITO Figura 12. proceder a examinar simultáneamente la presencia del parásito por las técnicas de microconcentración o PCR y el nivel basal de anticuerpos (IgG) anti Trypanosoma cruzi por ELISA e IFI (Figura 13). Antes de los seis meses. se examina una nueva muestra y simultáneamente se investiga la presencia de anticuerpos (IgG) anti Trypanosoma cruzi. Por otro lado. en este último caso.3. si este disminuye la descartaría. la elevación o mantenimiento del título de anticuerpos con relación al nivel basal certificaría la infección. a los seis meses y al año de vida. hijo de la gestante chagásica.INS . el título de anticuerpos permitirá monitorizar el tratamiento. por el contrario. Si el examen parasitológico en el recién nacido resulta negativo. si el examen parasitológico en el recién nacido resulta positivo. pero el resultado negativo no asegura que está libre libre de ella. confirma la infección. El resultado positivo en la gota gruesa o microconcentración.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA GESTANTE CHAGÁSICA RECIÉN NACIDO Búsqueda del parásito MICROCONCENTRACIÓN PCR Basal de Ac IgG + - ELISA e IFI Titulación de suero + DIAGNÓSTICO CONFIRMADO (Tratamiento) Control serológico a los 3.002 28 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Se considera gestante chagásica cuando presenta serología reactiva en dos técnicas de principios diferente o cuando es positiva a alguna de las técnicas que demuestren la presencia del parásito. MPR . 6 y 9 meses ELISA e IFI Titulación de suero IgG < Basal Resultado IgG > Basal DIAGNÓSTICO CONFIRMADO (Tratamiento) NO CONFIRMA EL CASO Figura 13.INS .

ELISA. gota gruesa.002 29 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . 3.1. Sangre venosa total para el examen por concentración de Strout y el hemocultivo (aislamiento e identificación del parásito). Suero sanguíneo para detección por HAI. Lancetas estériles descartables. Láminas portaobjetos (examen en fresco. frotis y microconcentración. Capilares heparinizados (microconcetración). d) Rotular el tubo donde se colectará la muestra con los siguientes datos: nombre.1. código y la fecha de obtención de la muestra.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO III OBTENCIÓN DE MUESTRA SANGUÍNEA En el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. OBTENCIÓN DE SANGRE CAPILAR 3. Materiales • • • • • • • • • • • Guantes.INS . Depósito para descarte de lancetas. Lejía al 3-5%. frotis). Alcohol. b) Colocar sobre la mesa de trabajo el material necesario para obtener la muestra. c) Lavarse las manos y colocarse los guantes. empleamos: • • • Sangre capilar para el examen directo en fresco. Laminillas cubreobjetos. Antes de iniciar el procedimiento de obtención de la muestra de sangre: a) Completar el formato de solicitud de diagnóstico de laboratorio (anexo 5).1. IFI. Plumón indeleble. Algodón. gota gruesa. MPR . Plastilina.

d) Desechar la primera gota de sangre. Sellar con plastilina uno de los extremos del capilar y mantenerlo en posición vertical hasta su procesamiento. MPR . procedencia y fecha. Para rotular los capilares se recomienda sujetarlos con cinta adhesiva a una lámina portaobjeto o cartón.002 30 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . hacer que el paciente extienda y flexione los demás (en niños pequeños usar el dedo pulgar del pie o talón).1. retirar la suciedad y la grasa de la yema del dedo.2. Procedimiento a) Sostener la mano izquierda del paciente con la palma hacia abajo y seleccionar el dedo medio. b) Limpiar el dedo con una torunda de algodón ligeramente humedecida en alcohol para desinfectar. Hacerlo con un movimiento rápido. f) Colecta en tubos capilares heparinizados para microconcentración: acercar el capilar al lugar de la puntura en posición horizontal y dejar que la sangre ingrese por capilaridad y llene el tubo. que servirá como soporte y brindará espacio para anotar el nombre.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 3. limpiando el dedo con una torunda seca de algodón. que deberá ser inmediantamente o dentro de las tres horas posteriores para asegurar el rendimiento de la prueba. Obtener la muestra de sangre en tres o cuatro capilares heparinizados.INS . frotis y examen en fresco en láminas portaobjetos.2. OBTENCIÓN DE SANGRE VENOSA La muestra sanguínea se puede obtener mediante el empleo de jeringa descartable o tubos al vacío. 3. Se recomienda su uso de vacutainers para conservar la esterilidad de la muestra y por medidas de seguridad. e) Colectar gotas de sangre para la gota gruesa. c) Pinchar directamente la yema del dedo con una lanceta estéril.

Ligadura de jebe 2. de modo que reduzca el paso de sangre por las arterias. Materiales • • • • • • • • • • Jeringas y agujas descartables 21 1/2 G Tubos de ensayo o tubos al vacío sin anticoagulante (serología). para favorecer la dilatación de las venas.2. Plumón indeleble.2. MPR . Guantes. Procedimiento a) Solicitar al paciente que se siente y coloque el brazo sobre la mesa de trabajo. Alcohol.5 mm de diámetro. Lejía al 3-5%.INS . c) Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces. ajustarla lo suficiente para aminorar la corriente sanguínea y dilatar las venas. Tubos de ensayo o tubos al vacío con /EDTA (hemocultivo). Depósito de metal o vidrio para descarte de agujas y jeringas. con la palma de la mano hacia arriba. Algodón. e) Desinfectar la zona de la piel donde se realizará la punción con un pedazo de algodón embebido en alcohol. sin apretarla tanto.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 3.1. 3. d) Con el dedo índice de la mano izquierda palpe la vena en la que introducirá la aguja. b) Colocar la ligadura dos dedos por encima de la flexión del codo.002 31 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .2.

• En congelación (-20 ºC) más de cinco días.INS .y luego proceder a sacar la aguja con movimiento rápido por debajo de la torunda de algodón. Retirar la aguja con movimiento rápido por debajo de la pieza de algodón.002 32 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA f) Introducir la aguja insertada en el tubo al vacío en el centro de la vena (1 a 1. REGISTRO DE MUESTRAS Los datos de las fichas de diagnóstico deben registrarse en el cuaderno de laboratorio o base de datos. I) Si la muestra no va a ser sembrada inmediatamente después de la extracción. c) Separe el suero y deposítelo en un frasco o vial estéril con tapa. g) Si usa jeringa: Aplique una porción seca de algodón sobre la parte donde se encuentra oculta la punta de la aguja.4. OBTENCIÓN DE SUERO SANGUÍNEO Una vez extraída la sangre. h) Si usa tubo al vacío:Retirar el tubo primero. • Fecha de obtención de la muestra. Si no se cuenta con los materiales y condiciones de esterilidad adecuadas.3. d) Rotular el vial con los siguientes datos: • Nombre/Código. trasladarla inmediatamente al laboratorio de referencia regional de su jurisdicción (figura 10). b) Centrifugar la muestra a 2000-2500 rpm por 15 minutos.5 cm aproximadamente) y extraiga la sangre. 3. 3. ya sea con jeringa descartable o tubo al vacío sin anticoagulante: a) Dejarla en posición vertical aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente para que la sangre coagule. conservarla en refrigeración (4-8 ºC). e) Conservar el suero hasta el momento de uso de la siguiente manera: • En refrigeración (4-8 ºC) hasta cinco días. MPR .

según 3. e) Conservar las preparaciones en cámara húmeda hasta su lectura. rápida y económica que permite demostrar la presencia del parásito en la forma aguda o congénita de la enfermedad de Chagas. Buscar formas móviles (trypomastigotes) del parásito.1. Materiales • • • • • • • Guantes.1. El rendimiento del examen es bueno. Laminillas cubreobjetos. Láminas portaobjetos limpias y desengrasadas. 4. Procedimiento a) Rotular tres láminas portaobjetos.1.1. FROTIS 4. c) Colocar una gota de sangre sobre cada lámina portaobjeto rotulada. Algodón.1.1. 4. GOTA GRUESA. d) Cubrir la muestra con una laminilla. Lanceta estéril.3.y la prueba es útil cuando la parasitemia es elevada. b) Obtener la muestra de sangre capilar en lámina.2.002 33 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Alcohol corriente. Cámara húmeda (Anexo 1).MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO IV EXAMEN DE SANGRE: FRESCO. Lectura Observar al microscopio con objetivo de 10X y 40X reduciendo la abertura del condensador.INS . Si MPR . EXAMEN DE SANGRE EN FRESCO Consiste en examinar directamente con el microscopio una gota de sangre de la persona con sospecha de infección. 4. Es la prueba más sencilla.

de modo que la sangre se distribuya uniformemente (en un área de 1cm2). Solución amortiguadora (Anexo 1). la que posteriormente será deshemoglobinizada y teñida con Giemsa durante 30 minutos. 4. sin embargo el movimiento de los glóbulos rojos indica su presencia. Coloración Giemsa 4.2.1.2. Procedimiento a) Colocar las láminas sobre la varilla de coloración. b) Preparar el volumen necesario de solución Giemsa diluida. Procedimiento Obtener la muestra de acuerdo con lo indicado en 4.2. realizamos movimientos circulares. 4.2. c) Dejar secar a temperatura ambiente.1 a) Colocar una gota de sangre sobre la superficie limpia de una lámina portaobjetos. MPR .1.2. Probeta 10 mL.002 34 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . desde el centro de la gota. 4. 4. b) Empleando la esquina de otra lámina. Varilla de coloración. GOTA GRUESA La gota gruesa consiste en concentrar y defibrinar la gota de sangre de la muestra.2.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA el resultado es negativo repetir el examen interdiario por lo menos durante una semana.2.2. Algunas veces no se puede observar al parásito.2.INS . aproximadamente 2 mL por lámina. Materiales • • • • Solución Giemsa stock (Anexo 1). por lo que se recomienda hacer láminas con gota gruesa y frotis en forma simultánea y colorear con Giemsa para la confirmación. d) Colorear con Giemsa.

d) Dejar actuar el colorante durante 30 minutos.1. d) Dejar secar a temperatura ambiente. c) Conservando el ángulo de 45º. deslizar la lámina auxiliar sobre la superficie de la lámina con la muestra.3. (figura 14). b) Acercar a la muestra el borde de otra lámina portaobjetos. Figura 14. MPR . 4. c) Cubrir la muestra con la solución Giemsa diluida. e) Lavar con agua corriente y dejar secar a temperatura ambiente. El extendido de sangre o frotis debe ser una película fina. La coloración Giemsa.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA • En la probeta colocar 0.002 35 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Procedimiento Obtener la muestra de acuerdo con lo descrito en el ítem 3. FROTIS El frotis es el extendido de una gota de sangre en una lámina portaobjetos seguida de la fijación de la muestra y posterior tinción con Giemsa (Figura 15). • Homogeneizar la solución colorante.1.3. posesionándola de tal manera que formen un ángulo de 45º y dejar que la muestra se distribuya en el borde de la lámina.1 mL (2 gotas) de solución Giemsa stock por cada mL de solución amortiguadora. facilita la identificación del parásito en base a sus características morfológicas tintoriales. 4.INS . a) Colocar una gota de sangre en el extremo de la superficie de una lámina portaobjetos limpia.

Trypomastigote de Trypanosoma cruzi en preparaciones de frotis y gota gruesa de sangre circulante. Figura 15. Se observa el cinetoplasto posterior al núcleo central. luego. Resultado Informar la presencia o ausencia de formas trypomastigotes de Trypanosoma cruzi. LECTURA DE LA GOTA GRUESA Y FROTIS Enfocar con el objetivo de 10X. 4. Examinar toda la lámina en el microscopio.4. MPR .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA e) Fijar la muestra con metanol absoluto P. colocar una gotita de aceite de inmersión sobre la muestra y examinar con el objetivo de inmersión 100X.A durante un minuto f) Colorear con Giemsa. la membrana ondulante y el flagelo.INS .002 36 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

1. concentrándose los glóbulos rojos en la parte inferior del capilar.1. b) Centrifugar la muestra durante un minuto a 5000 rpm.002 37 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . MPR . sobre ella se ubica un anillo blanquecino de 1 mm de altura conformado por los glóbulos blancos y en la parte superior líquida transparente constituida por el plasma. Láminas portaobjetos.1.2. MICROCONCENTRACIÓN La técnica consiste en concentrar los parásitos de una muestra de sangre colectada en tubos capilares heparinizados por centrifugación.1. Los elementos de la sangre se separan por gradiente de densidad. 5. Microcentrífuga o centrífuga.2.1. Los tripanosomas presentes en la muestra se ubicarán entre los glóbulos blancos y el plasma. Equipos y materiales Microscopio con objetivos de 10X y 40X. Figura 16.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO V TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN 5. Procedimiento a) Obtener la sangre en los capilares heparinizados según ítem 3. Laminillas cubreobjetos. 5.INS . Separación de los elementos sanguíneos por gradiente de densidad. Tubos capilares heparinizados.

5.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA c) Sujetar el capilar a una lámina portaobjetos con cinta adhesiva (Figura 16) . También se puede realizar la lectura colocando la muestra entre la lámina y laminilla. para ello. Dejar caer la muestra sobre un portaobjetos.INS .1. d) Conservar el capilar en forma vertical hasta el momento de la lectura.4. 5.3. Figura 17. Microconcentración. MPR .002 38 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Focalizar inicialmente con el objetivo de 10X de aumento y luego buscar las formas trypomastigotes móviles del parásito con el objetivo de 40X (Figura 17). Resultado Positivo: Se observan formas flageladas móviles de trypomastigotes de Trypanosoma cruzi. cubrirla con una laminilla y observar el microscopio.1. con el borde de una lámina portaobjetos hacer una marca en la zona donde se ubican los parásitos y luego quebrar el capilar con cuidado. Negativo: No se observan formas de trypomastigotes de Trypanosoma cruzi. Lectura Observar directamente en el microscopio la zona del plasma aproximadamente a 10 mm de los glóbulos blancos.

2. Jeringa hipodérmicas estéril o sistema de tubos al vacío sin anticoagulante.3. Tubos de centrífuga. b) Dejar a temperatura ambiente hasta que se coagule.2.002 39 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Centrífuga. El suero se debe conservar para ser examinado por técnicas inmunológicas. Procedimiento a) Extraer 5-10 mL de sangre venosa en un tubo sin anticoagulante. Es una técnica simple y de buena sensibilidad en casos agudos de enfermedad de Chagas y en el seguimiento de congénitos.2. Equipos y materiales Microscopio. MPR . CONCENTRACIÓN DE STROUT Esta técnica se basa en la concentración de los parásitos en la muestra sanguínea por centrifugación y examen del sedimento al microscopio en busca de trypomastigotes móviles de Trypanosoma cruzi. c) Separar el suero.INS . d) Centrifugar este suero a 160g (800 rpm) durante dos minutos para descartar los glóbulos rojos.1. e) Centrifugar nuevamente el sobrenadante a 300-600 g (2000-2500 rpm). Láminas portaobjetos. durante diez minutos. Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. según ítem 3. Asas microbiológicas. 5. f) Separar el sobrenadante (suero) y conservarlo a 4 ºC para el análisis serológico. 5.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 5. Laminillas cubreobjetos.2.

5.002 40 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Lectura Observar en el microscopio la presencia de trypomastigotes móviles de Trypanosoma cruzi.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA g) Colocar una alícuota del sedimento obtenido en una lámina portaobjetos. con objetivos de 10X ó 40X de aumento. h) Cubrir la muestra con una laminilla y proceder a la lectura. MPR .INS .3.2. Es aconsejable observar cuidadosamente varias preparaciones en busca de formas móviles del parásito.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO VI HEMOCULTIVO Consiste en sembrar una muestra de sangre en medio de cultivo artificial o celular. Gradillas para tubos de ensayo. Refrigerador. El cultivo en medio artificial requiere: 6. Cabina de flujo laminar o cubículo.2. Micropipeta 5 – 50 uL. Presenta una sensibilidad alta en los casos agudos y congénitos. Microscopio óptico 10x. MATERIALES Y REACTIVOS (Figura 18) Tubos al vacío heparinizados. Balanza. El cultivo en medio artificial es factible de realizar en cualquier laboratorio bacteriológico. Solución de antibióticos (Anexo 1). La limitación de la prueba está en el prolongado tiempo de incubación que se requiere (hasta dos meses) para emitir el informe del resultado.002 41 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Asa de siembra. Cubreobjetos 22 x 22 mm. MPR . Agujas para tubos al vacío. Portaobjetos. Centrífuga. 100x de aumento y ocular 10x. Solución salina estéril (Anexo 1). EQUIPO Estufa 28 – 30°C. Tubos con medio de cultivo agar sangre (Anexo 1). 6. no así en medio celular que requiere de laboratorio mejor equipado.1. 40x. 50 – 1000 uL.INS . con la finalidad de amplificar el número de parásitos presentes y confirmar el diagnóstico. Puntas amarillas y azules estériles.

c) Adicionar la solución salina estéril (0. Con el asa de siembra extraer una gota del cultivo.INS .5 mL) a cada tubo. PROCEDIMIENTO (Figura 19) Trabajar en condiciones de esterilidad bajo la cabina de flujo laminar o en un cubículo con luz UV o mechero. MPR . a) Retirar los tubos conteniendo medio de cultivo del refrigerador.4. d) Sembrar 1 mL de la sangre heparinizada en cada tubo. Agitarlos una vez al día.3.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Figura 18.002 42 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . f) A los siete días revisar el cultivo.2. Materiales y reactivos empleados en el hemocultivo. colocarla entre lámina y laminilla y observar al microscopio con objetivo de 10 X. e) Colocar los tubos en estufa graduada a 28 °C. 6. Cinco tubos por cada muestra. b) Rotularlos con un marcador tinta indeleble la fecha y código de muestra. 6. MUESTRA. 5 mL de sangre de la vena del brazo obtenido en tubo heparinizado según 4.

INS . núcleo y cinetoplasto de color azul violeta SUBCULTIVO CADA 15 DIAS 28 °C LECTURA FINAL 60° DÍA EN FRESCO Observación al microscopio 10 x ó 40 x Formas móviles del parásito COLORACIÓN GIEMSA Formas típicas. MPR . Pasos para el hemocultivo.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA HEMOCULTIVO SANGRE OBTENCIÓN DE MUESTRA CONCENTRACIÓN POR CENTRIFUGACIÓN 5 MIL rpm x 15minutos CULTIVO 28 °C LECTURA 7° DÍA EN FRESCO Observación al microscopio 10 x ó 40 x Formas móviles del parásito 15° DÍA COLORACIÓN GIEMSA Formas típicas. con citoplasma. azul claro.002 43 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . núcleo y cinetoplasto de color azul violeta Figura 19. con citoplasma. azul claro.

centrifugar el sobrenadante del cultivo y observar en el sedimento.5. g) Antes de realizar la lectura final.INS . Se caracterizan por ser de aspecto fusiforme y presentar movimiento ondulante (1000X). MPR . LECTURA a) El movimiento característico de los epimastigotes (figuras 20 y 21) permite detectarlos con facilidad.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 6. el núcleo de color azul violeta y el cinetoplasto más denso y oscuro. Observación directa de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en alícuota de cultivo positivo. d) Si no se observan formas móviles continuar la incubación a 28 °C y repetir la lectura a los siete días. Generalmente esto ocurre después de uno a dos meses. es necesario colorearlos para confirmar su morfología. (resiembra a ciegas). depende de la densidad parasitaria de la muestra sembrada y de la adaptabilidad del parásito al medio.5 mL de los cultivos negativos en medio fresco. Figura 20. e) Cada 15 días repicar 0. f) El tiempo que se requiere para demostrar la positividad del cultivo. c) Observar en el microscopio la forma típica.002 44 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Se les visualiza aislados o agrupados a manera de rosetas. luego fijar con metanol durante tres minutos y colorear con Giemsa. b) Realizar un extendido con el asa de siembra. sin embargo. la presencia o ausencia del parásito.

Epimastigote de Trypanosoma cruzi en medio de cultivo.6. RESULTADO Cultivo positivo: Se observa la presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi. Cultivo negativo: No se observa la presencia de epimastigotes de Trypanosoma.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Figura 16. cruzi.INS . MPR . Giemsa 1000 X.002 45 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . 6.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA MPR .002 46 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .INS .

2. Laminillas cubreobjetos. Bandas elásticas. Material biológico Ninfas de III o IV estadio de triatominos que proceden de criaderos en laboratorio. 7. Sujetadores de tela. 7. Pollos para alimentación de triatominos.1.INS . MPR .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO VII XENODIAGNÓSTICO Es una técnica que permite la multiplicación del parásito in vivo y consiste en hacer picar a la persona sospechosa de infección por el vector libre de infección. Tul. Pinzas punta fina. Materiales Cajas de madera o plástico apropiadas (Figura 22).3. Láminas portaobjetos. de preferencia la especie de triatomino de mayor importancia en la región. 7. Equipos Microscopio con objetivo de 20X de aumento. Es aplicable tanto en la forma clínica aguda como en la crónica portador.002 47 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

e) Conservar la caja con los triatominos a temperatura del laboratorio 25º-30 ºC y 70% de humedad relativa. asegurándolo con una banda elástica.002 48 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .INS . examinar otra alícuota del contenido digestivo del triatomino a los 60 días. Caja para xenodiagnóstico. paloma u otro). i) De ser negativo. f) Alimentarlos cada 15 días.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Figura 22. examinar en el microscopio una muestra de heces de los triatominos. d) Sujetar la caja sobre el brazo del sospechoso de infección mediante una venda de tela. b) Cubrir la caja con tul. permitiendo que los triatominos se alimenten por 20 minutos o hasta observar que las ninfas hayan aumentado su volumen por la sangre ingerida (Figura 23). los que deben estar en ayuno por lo menos 15 días. c) Rotular la caja con el número de muestra. g) A los 30 días.4. nombre y fecha de aplicación. sujetando las cajas con las ninfas sobre la piel desnuda de un ave (pollo. Se puede realizar el examen individual de cada triatomino o una alícuota del pool de las muestras fecales. Procedimiento a) Colocar en cada caja de cinco a diez ninfas de triatominos del III y IV estadio. MPR . Obtener la muestra sobre una lámina portaobjetos por presión del abdomen del insecto con una pinza. 7. h) Cubrir la muestra con una laminilla para examinarla en el microscopio.

INS . Figura 24.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Se aconseja la aplicación de por lo menos cuatro xenodiagnósticos para alcanzar su mayor sensibilidad en los casos de infección crónica o portador.5. Lectura Examinar la muestra en el microscopio (objetivo de 20X de aumento).002 49 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . buscando formas móviles: epimastigotes o trypomastigotes metacíclicas del parásito que son identificadas por el movimiento ondulante característico (Figura 24). Figura 23. 7. MPR . Aplicación del xenodiagnóstico.

Xenodiagnóstico negativo: No se observan tripanosomas o epimastigotes. se puede realizar el aislamiento del parásito sembrando la muestra en medios de cultivo o inoculando experimentalmente en ratones (anexo 2) para posteriores estudios de caracterización e identificación.INS .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 7.002 50 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Resultado Xenodiagnóstico positivo: Se observan formas trypomastigotes o epimastigotes de Trypanosoma cruzi. MPR .6. De ser la prueba positiva.

previamente tratados con ácido tánico. MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • • • • • • • • Placas de poliestireno con fondo en U. 8.4 (Anexo 1). Solución Alsever (Anexo 1). Es una prueba altamente sensible y específica. Buffer fosfato salino pH 7.1. 8. Micropipeta multicanal de 5 a 50 µ. Sangre de carnero. Buffer fosfato salino pH 6. MPR . proporcionando el antígeno absorbido a los glóbulos rojos. MUESTRA: Suero problema. Solución diluyente (Anexo 1). Los kits comerciales simplifican la ejecución de la técnica. Suero control positivo a Trypanosoma cruzi.2. Antígeno de Trypanosoma cruzi (Anexo 3). Suero control negativo a Trypanosoma cruzi. Suero fisiológico (Anexo 1). Ácido tánico (Anexo 1).MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO VIII HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA (HAI) La hemaglutinación indirecta emplea glóbulos rojos de carnero.INS . En la figura 17 se muestra un diagrama de la prueba. Micropipeta de 5 a 50 µL.002 51 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .2 (Anexo 1). como soporte de extractos solubles del parásito (antígeno). Puntas para micropipeta.

tomar 0. adicionar 0.6.8% buffer fosfato pH 7. Adicionar 5 mL de suspensión de glóbulos rojos tanados.1 mL de suspensión de glóbulos rojos.3. 8. centrifugando a 3000 rpm durante diez minutos.° 1: Colocar 5 mL de Antígeno (diluido 1/20 en buffer fosfato pH 6. Tubo N. b) Centrifugar durante siete minutos a 2000 rpm. c) Mantener durante dos horas a 4ºC. d) Resuspender el sedimento en 10 mL de buffer fosfato pH 7.2. b) Lavar los glóbulos rojos por tres veces con suero fisiológico.14 mL del sedimento de glóbulos rojos y resuspenderlo en 4.86 mL de buffer fosfato pH 7.2. MPR . SENSIBILIZACIÓN a) Tubo N. c) Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 2.002 52 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . b) Incubar 30 minutos a 37 ºC (baño María).4.2. g) Resuspender el sedimiento en 5 mL de solución salina. d) Centrifugar por diez minutos a 2000 rpm Separar el suero absorbido de los glóbulos rojos.5. Adicionar 5 mL de suspensión de glóbulos rojos tanados.° 2 (Control): Colocar 5 mL de buffer pH 6. SUSPENSIÓN DE GLÓBULOS ROJOS a) Obtener sangre estéril de carnero mediante punción de la vena yugular en un recipiente también estéril que contiene igual volumen de Alsever. 8. e) Centrifugar durante siete minutos a 2000 rpm. 8.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 8. Ej: para preparar 5 mL de suspensión de glóbulos rojos. c) Descartar el sobrenadante.4).4. f) Descartar el sobrenadante. TANIZACIÓN DE LOS GLÓBULOS ROJOS a) Mezclar 5 mL de suspensión de glóbulos rojos con 5 mL de ácido tánico diluido 1/20 000 e incubar por 10 minutos a 37 ºC.INS .5 mL del suero problema. ADSORCIÓN DE ANTICUERPOS HETERÓFILOS a) A 0.

e) Lavar el sedimento con 10 mL de solución diluyente. d) Eliminar el sobrenadante. HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA TANIZACIÓN + HEMATÍES ÁCIDO TÁNICO HEMATÍES TANADOS SENSIBILIZACIÓN + HEMATÍES TANADOS ANTÍGENO DE T.INS . cruzi HEMATÍES SENSIBILIZADOS DESAROLLO DE LA PRUEBA + HEMATÍES SENSIBILIZADOS ANTICUERPOS ESPECÍFICOS HEMAGLUTINACIÓN Figura 25 MPR . h) Resuspender el sedimento en 5 mL de solución diluyente.002 53 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA b) Incubar los tubos durante 20 minutos a 37 °C. f) Centrifugar por siete minutos a 2000 rpm. g) Descartar el sobrenadante. c) Centrifugar por siete minutos a 2000 rpm.

75 uL de la solución diluyente y 50 uL en los pozos de las filas B. incluyendo los sueros controles positivo y negativo. d) Agregar a cada pozo de la fila A. LECTURA (Figuras 26 y 27). 8. en un segundo ensayo. Seguir el esquema adjunto (Figura 26). MPR . Cuando se evalúan muchos sueros (Figura 27) es apropiado. se manifiesta por la formación de una malla de bordes irregulares que cubre al 50-100% del fondo del pocillo. proceder a titularlos realizando las diluciones correspondientes. G y H. 25 uL del suero a evaluar. g) Agitar con suaves golpes en los bordes de la placa. F. b) Se recomienda colocar la placa de microtitulación sobre un papel. Se considera positiva la muestra a partir de la dilución ¼ y se informa con el título de la última dilución positiva. La falta de reactividad (negativo). homogeneizar aspirando y expeliendo varias veces con la pipeta. i) Realizar la lectura después de una hora y a las 24 horas. toalla o franela humedecida para prevenir el efecto de la electricidad estática.INS . Iniciar en la dilución ¼ hasta 1/512. f) Agregar 50 uL de la suspensión antigénica en cada pocillo. E. c) Colocar en los pozos de la fila A. De esta manera. e) Luego realizar diluciones sucesivas al doble. La reactividad del suero (positivo).7.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 8. C. realizar el tamizaje con la dilución de valor diagnóstico (¼). se manifiesta por la sedimentación del antígeno en forma de botón. seleccionar los positivos y.8. h) Dejar la placa en reposo sobre una superficie plana. PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA a) Rotular una placa de microtitulación para realizar diluciones de los sueros a evaluar al doble. homogeneizar y repetir igual con la siguiente fila. Con la ayuda de una micropipeta multicanal tomar 50 uL de la dilución ¼ de cada suero por evaluar y verterlo en los pozos de la fila siguiente. primero. D.002 54 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA DILUSIÓN DEL SUERO Figura 26 MPR .INS .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 8. RESULTADO Reactiva: Se detecta la presencia de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. Título: según lectura.002 55 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . No reactiva: Ausencia de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi.9.

G12 y H12 corresponden a sueros reactivos (positivos) Figura 27 MPR .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA Tamizaje de sueros en la dilución de valor diagnóstico 1/4 CP: SUERO CONTROL POSITIVO A T.002 56 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . cruzi CN: SUERO CONTROL NEGATIVO A T.INS . cruzi CGR: CONTROL DE GLÓBULOS ROJOS En esta placa los pozos D4.

Reloj. Refrigeradora.05% (Anexo 1). como detectores de la reacción antígenoanticuerpo (Figura 28).2 . Suero control positivo a Trypanosoma cruzi. pero cuya especialidad está sujeta a la calidad de los antígenos y reactivos empleados por lo que exigen una rigurosa estandarización. Balanza de precisión. PBS pH 7. EQUIPOS E INSTRUMENTOS • • • • • • • • • Estufa de incubación 37 °C.2 (Anexo 1). Los kits comerciales contienen las placas con antígeno y reactivos. Buffer de lavado. Suero control negativo a Trypanosoma cruzi.Tween 20 al 0. 9. Potenciómetro.002 57 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Buffer fosfato salino (PBS) pH 7. Micropipeta de 0. MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • • Placas con fondo plano. Suero control interno. 9.INS . Es un método de gran sensibilidad. Lavador de placas ELISA. La reacción suele hacerse positiva después de 20 días de infección.2. Antigammaglobulina G humana conjugada con peroxidasa (titulado).5 a 10 µL y 10 a 100 µL.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO IX ELISA La técnica ELISA emplea antígenos solubles de Tripanosoma cruzi. MPR .1. adheridos a soportes inertes (placa de microtitulación) y antiglobulinas humanas conjugadas con enzimas. Lector ELISA. sensibilizadas con antígeno de Trypanosoma cruzi (ver anexo 3). Peróxido de hidrógeno 30%. Micropipeta multicanal de 50-200 µL.

5 M. Cromógeno: Orto-phenilendiamina (OPD).INS .BSA 1%) (Anexo 1).MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA • • • • • Solución de bloqueo (PBS pH 7.2 .2 . Ácido sulfúrico 2. ELISA MÉTODO INDIRECTO PARA LA DETECCIÓN Y MEDICIÓN DE ANTICUERPOS ANTI Trypanosoma cruzi Figura 28 MPR .BSA 3%) (Anexo 1). Solución estabilizadora para el sustrato. Solución diluyente (PBS pH 7.002 58 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

1.3.3. Se aconseja realizar duplicados. • Dejar en oscuridad y a temperatura ambiente durante 15 minutos. • Dejar una hora a temperatura ambiente.2. • Lavar los pozos adicionando a cada uno de ellos 300 µL de PBS Tween 0.3. • Lavar al igual que en 9. • Lavar al igual que en 9.1. por pozo.3. 9. 9.BSA 3% en cada pozo. • Incubar 30 minutos en estufa a 37 ºC. Retirar del refrigerador la placa sensibilizada con el antígeno y dejar que tome la temperatura ambiente. 9.3. de las diluciones de los sueros (1/100).5. • Incubar 30 minutos en estufa a 37 ºC.INS . Incubación de los sueros: • Rotular la placa de acuerdo con el esquema de distribución de suero (Figura 29).3.1.3.3. invirtiendo la placa sobre papel absorbente (aplicar golpes firmes). • Colocar 100 µL en cada pozo. • Detener la reacción adicionando 100 µL de ácido sulfúrico 2. • Lavar los pozos al igual que en el punto 9. 59 MPR .5 M. • Incluir en cada ensayo dos controles positivos y tres controles negativos. 9. con la placa tapada para evitar la evaporación.1. • Retirar el líquido de los pozos con la ayuda de una micropipeta y descartar dicho líquido en un recipiente que contenga hipoclorito de sodio al 5%.3.3. Repetir el lavado por tres veces. Reacción con el sustrato: • Preparar minutos antes de su uso la solución del sustrato más cromógeno (OPD) ver anexo.002 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Bloqueo de sitios inespecíficos mediante la adición de 100 µL de PBS . • Colocar 100 µL por pocillo. PROCEDIMIENTO (Figura 28). un control interno y un blanco de reactivos.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 9.05%. Mezclar aplicando suaves golpes en las paredes laterales de la placa.4. 9. Incubación del conjugado: • Colocar 100 µL por pozo del conjugado preparado de acuerdo con el título obtenido previamente. • En el último lavado eliminar por completo el líquido residual.

los controles positivo.320 Reactivo: Muestras con absorbancias mayores de 0. No reactivo: Muestras con absorbancias menores de 0. 9. Indeterminado: Se consideran así aquellas cuyas absorbancias caen entre ±20% del valor de corte. seguir estrictamente las instrucciones del inserto contenido en la caja tanto en el procesamiento. Titulación Para obtener el título de las muestras reactivas en el tamizaje.5. es decir que la absorbancia de cada uno de ellos corresponda al valor predeterminado.1. Se ha definido el valor del corte (VC) como el punto de cruce entre el promedio de las lecturas de los sueros controles no reactivos y reactivos más dos desviaciones estándar (DS).5. MPR .002 60 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . 9. como para determinar la validez del ensayo y calcular el valor de corte. relacionando la absorbancia de la muestra a 450 nm respecto al valor del corte. negativo y control interno deben reaccionar como tales.4.INS .5.3. Estas muestras deben ser ensayadas nuevamente.256. LECTURA Para que el examen tenga validez. tiempo suficiente para que el nivel de anticuerpos sea mayor en caso de tratarse de una infección reciente. Colores tenues mayores que el del control negativo.384. No reactiva: Toda muestra que no presente coloración o que ésta sea igual que la de los controles negativos.5. REACTIVOS COMERCIALES (KITS) En caso de usar kits.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 9. Lectura visual: Si se opta por este método de interpretación debe considerarse: Reactiva: Muestra con coloración netamente amarillo-naranja. VC = CN + 2 DS El valor de corte promedio encontrado en nuestro laboratorio es de 0.3. requieren la interpretación instrumental. 9. si el resultado persiste solicitar una nueva muestra luego de un mes. 9. se realiza diluciones dobles de los sueros a partir de 1/100 y se procede de acuerdo con el punto 9. Con lector de ELISA La presencia o ausencia de anticuerpos anti Tripanosoma cruzi se determina.2.

002 61 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . INFORME E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS • Reactivo: Se detecta anticuerpos (lgG) anti Trypanosoma cruzi.6. Título: el título de la muestra es la dilución del suero en la que la absorbancia resulta mayor o igual que el valor de corte.INS . • Figura 29 MPR .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 9. No reactivo: No se detecta anticuerpos (lgG) anti Trypanosoma cruzi.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA MPR .INS .002 62 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

10.5-10 µL. Pizetas.1. Reloj. Cámara húmeda. Prueba altamente sensible y específica. Laminillas cubreobjetos de 24 x 48 mm. fondo en U. toalla o secante. La formación de este complejo es evidenciada por una antiglobulina humana marcada con fluoresceína (Figura 30).INS . 10. Potenciómetro.002 63 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Papel. Refrigerador. Los kits comerciales proporcionan la lámina preparada y los reactivos. MPR . Secadora o ventilador. Estufa graduada a 37 °C. Puntas de 10-100 µL y de 0.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA CAPÍTULO X INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) La técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI).2. emplea como antígeno epimastigotes de Trypanosoma. EQUIPO • • • • • • • Microscopio para fluorescencia. MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • Placas para microtitulación. Couplin o recipientes para lavado de láminas. Balanza de presición. obtenidos de cultivo y fijados en láminas sobre las que se realiza la reacción antígeno-anticuerpo.

4 (Anexo 1). titulado (Anexo 1). Buffer fosfato salino pH 7. Glicerina tamponada pH 8. Suero control negativo a Trypanosoma cruzi. Láminas IFI impregnadas con Trypanosomas (Anexo 3).INS .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA • • • • • • • Solución de azul de Evans.FITC. Conjugado Anti lgG humana . INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PRIMERA ETAPA + ANTÍGENO DE TRYPANOSOMA ANTICUERPO COMPLEJO Ag-Ac SEGUNDA ETAPA + COMPLEJO Ag-Ac ANTIGLOBULINA MARCADA CON FLUORESCEINA COMPLEJO Ag-Ac MARCADO Figura 30 MPR .002 64 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .5 (Anexo1). Suero control positivo a Trypanosoma cruzi.

f) Colocar la lámina sobre papel secante y dejar secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un ventilador o secador.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 10. c) Homogeneizar el suero diluido absorbiendo y expeliendo con la micropipeta varias veces. control negativo (CN).INS .002 65 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . MPR . b) En una placa para microtitulación. PROCEDIMIENTO Elaborar el protocolo de trabajo en el fomato del anexo 9. luego siguiendo el protocolo elaborado. dispensar en cada pozo 155 µL de buffer diluyente y 5 µL de cada suero por evaluar. realizar la dilución 1/32 de cada suero y de los controles. dispensar 15 uL de la dilución 1/32 de cada suero sobre el área del círculo correspondiente en la lámina IFI.3. a) Retirar del congelador las láminas IFI fijadas con Trypanosomas y dejarlas secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un ventilador o secador. d) Colocar la lámina en una cámara húmeda y llevarla a incubar a la estufa 37 °C durante 30 minutos. la segunda y tercera vez en un frasco Coplin mantenido en agitación suave durante ocho minutos cada vez. control interno para IFI (CI) y control de reactivos o blanco (B). asignar un casillero para cada suero por evaluar y anotar en él su código. En cada corrida se debe incluir el control positivo (CP). e) Retirar la lámina de la estufa y lavarla por tres veces consecutivas con PBS-Tween 80 al 1% de la siguiente manera: la primera vez con la ayuda de una pizeta retirar los sueros de la lámina. Para ello.

en cada área circular e incubar a 37 °C por 30 minutos. sin fluorescencia. enjuagar con agua destilada y dejar secar al igual que en el ítem f. en el control positivo debe observarse la superficie y el flagelo de los parásitos de un color verde manzana fluorescente. la corrida es válida y se continua con la lectura de las muestras examinadas De acuerdo con la intensidad o ausencia de fluorescencia que muestran los trypanosomas se registran las lecturas como: REACTIVO (+). (Figura 31) y en el control negativo al igual que en el blanco de reactivos. i) Agregar 15 uL de la solución diluida de azul de Evans en cada pocillo y dejar durante cinco minutos a temperatura ambiente.4. con objetivo de 20X. h) Retirar la lámina de la estufa y lavar al igual que en el ítem e. empleando una pizeta.INS . Primero revisar los controles. j) Enjuagar la lámina con agua destilada. debe observarse el parásito de color rojizo opaco. Si los controles responden como tales. 10. dejarla secar a temperatura ambiente.002 66 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Si los parásitos se observan opacos entre rojizos y marrones oscuros INDETERMINADO (I). NO REACTIVO (-). Luego.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA g) Agregar 15 uL del conjugado Anti IgG humano marcado con fluoresceína (titulado). se recomienda que sea el mismo día del procesamiento para evitar la pérdida de fluorescencia. después del último lavado. Cuando la superficie o los bordes de los parásitos fluorescen francamente de un color verde manzana. LECTURA La lectura se realiza en microscopio para fluorescencia. se observa una débil fluorescencia no homogénea en los parásitos. MPR . k) Colocar una gotita de glicerina tamponada y sobre ella una laminilla cubreobjetos l) Conservar la lámina en oscuridad hasta la lectura.

TITULACIÓN DE SUERO REACTIVO Realizar la titulación del suero reactivo 1/32. cruzi CN: SUERO CONTROL NEGATIVO A T. cruzi CI: SUERO CONTROL INTERNO B: BLANCO (control de reactivos) MPR . INFORME E INTERPRETACIÓN DE DE RESULTADOS El título de valor diagnóstico en el laboratorio es 1/32 REACTIVO: Se detectan anticuerpos IgG anti Trypanosoma cruzi. NO REACTIVO: No se detectan anticuerpos IgG anti Trypanosoma cruzi. a) Suero Reactivo.7. tiempo necesario para que el nivel de anticuerpos sea mayor y detectable en caso la infección sea reciente.5. 10. Es necesario repetir el ensayo y de persistir el resultado se debe evaluar una nueva muestra. INDETERMINADO: No concluyente.002 67 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . b) Suero No reactivo 10.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Figura 31: Epimastigotes de T. DILUCION 1 1/32 S6 2 1/64 3 1/128 4 1/256 5 1/512 6 1/ 1024 SUERO S6 CN B CI CP 7 8 9 10 11 12 CP: SUERO CONTROL POSITIVO A T. cruzi en la prueba de Inmunofluorescencia Indirecta.INS . de acuerdo con el esquema siguiente. obtenida tres semanas después de la primera.

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

Efectuar el procedimiento de la técnica IFI evaluando cada suero en diluciones seriadas al doble a partir de 1/32 Se considera el título a la mayor dilución que presente franca fluorescencia en la superficie del parásito.

10.8. INVESTIGACIÓN DE ANTICUERPOS IgM Para investigar la presencia de anticuerpos IgM anti T. cruzi, se seguirá el procedimiento descrito en 9.3, 9.4 y 9.5, seguir los mismos pasos, la diferencia está en el uso, en este caso, de conjugado anti IgM humano.

MPR - INS - 002

68

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

CAPITULO XI

CONTROL DE CALIDAD
La evaluación de la calidad del diagnóstico de laboratorio o proceso de aplicación de medidas de control de calidad interno y externo, permiten determinar la fiabilidad de los resultados que emite el laboratorio. CONTROL DE CALIDAD INTERNO El objetivo del control de calidad interno es asegurar que los procesos se ejecutan correctamente, desde que la muestra ingresa al laboratorio hasta la emisión de los resultados y que los equipos e instrumentos usados tengan óptimo desempeño. Una de las actividades del control de calidad interno en el diagnóstico serológico de la enfermedad de Chagas, consiste en la inclusión de un Suero Control Interno (CI), en el trabajo diario, además de los habituales controles positivos y negativos. El CI es un suero caracterizado como reactivo débil a la detección de anticuerpos (IgG), anti Trypanosoma cruzi, con título conocido y cercano al valor de corte, es específico para cada técnica o kit y debe ser tratado al igual que las demás muestras por examinar. Permite monitorizar la calidad del procedimiento ya que su resultado refleja objetivamente las variaciones ocurridas en cada ensayo y facilita la toma de decisión oportuna para corregir fallas o errores. Las lecturas diarias de absorbancia del CI se anotan en la gráfica de Levey Jennings y se analizan e interpretan de acuerdo con las reglas de Shewart (9). (Figura 32). Cuando la lectura de absorbancia del suero control interno cae fuera de los límites permitidos (+/- 2 desviaciones estandar), se debe repetir el ensayo y si se reitera el resultado se procederá al análisis para detectar las posibles causas de error. Recomendaciones generales • Las muestras de suero por procesar no deben presentar hemólisis ni contaminación (turbidez). Deben estar rotuladas con el código y fecha de obtención de muestra y ser conservadas en refrigeración (4-8 °C), hasta su procesamiento. 69

MPR - INS - 002

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

DO/VC

Valores de Absorbancia / Valor de Corte

+ 3 ds

+ 2 ds

0,3

x
- 2 ds

- 3 ds

Ensayos
1 4 8 12 16 20

Figura 32. Gráfico de Levey y Jennings. X : media ds: desviación estándar

• •

No usar reactivos o kits con fechas vencidas. Emplear equipos e instrumentos en óptimas condiciones, con mantenimiento y calibración (balanza, potenciómetro, lector ELISA, lavador de placas, microscopio para inmunofluorescencia, micropipetas). Seguir los instructivos de uso de cada equipo. Tener en cuenta la rutina básica de mantenimiento requerido por cada equipo (8). Chequear los filtros del lector ELISA antes de iniciar los ensayos y llevar el registro de tiempo de uso de la lámpara del microscopio para inmunofluorescencia. Realizar el control diario de la temperatura ambiente del laboratorio y de los siguientes equipos: refrigerador donde se conservan los kits, estufa empleada para los pasos de incubación 37 °C y congeladora donde se conservan los sueros controles y otros reactivos. En el procesamiento de las muestras se debe seguir estrictamente las instrucciones descritas en el manual de procedimientos o en los insertos proporcionados por el fabricante de reactivos comerciales (kits), en uso. Incluir en cada ensayo el CI además de los controles positivo, negativo, y blanco de reactivos propio de cada técnica.

MPR - INS - 002

70

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

el Laboratorio de Referencia Nacional del INS. los laboratorios de referencia regionales. A su vez. permite evaluar el desempeño del laboratorio. todas las láminas positivas y sueros reactivos examinados durante el trimestre y 10% de las láminas negativas y sueros no reactivos. con los datos y resultados de las muestras y reactivos empleados. Es indispensable adjuntar el formato de solicitud de control de diagnóstico (Anexo N° 6).002 71 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . remitidos a los laboratorios de la red nacional anualmente. CONTROL DE CALIDAD INDIRECTO Para fines de control indirecto del diagnóstico parasitológico y serológico de la enfermedad de Chagas. esta actividad la desarrolla el Laboratorio de Referencia Nacional del Instituto Nacional de Salud mediante un panel de sueros caracterizados. participa en programas de evaluación externa internacional. MPR . seleccionados aleatoriamente.INS . CONTROL DE CALIDAD EXTERNO O EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO La participación en programas de evaluación externa. envian al Laboratorio de Referencia Nacional.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA • Analizar la validez del ensayo considerando los parámetros establecidos en el kit y el resultado del control interno.

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

MPR - INS - 002

72

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL DE

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

CAPÍTULO XII

BIOSEGURIDAD
Las medidas de bioseguridad son indispensables para proteger la salud y seguridad del personal que trabaja en laboratorios donde se manipulan productos biológicos. Sangre, suero sanguíneo, biopsias y material fecal de triatominos, son productos biológicos que se procesan en las pruebas de diagnóstico parasitológico e inmunológico de la enfermedad de Chagas. Los laboratorios que procesan las muestras mencionadas, son de nivel de bioseguridad 2, es decir, se trata de laboratorios que cuentan con cámaras de bioseguridad y otros dispositivos para la protección personal. 12.1. DEL PERSONAL DE LABORATORIO Toda persona que manipula sangre o sus derivados, debe estar vacunada contra el virus de la hepatitis B. Al momento de extraer la sangre: • • • Vestir mandil, usar guantes, jeringas y agujas descartables o tubos al vacío. Nunca extraer sangre solamente con la aguja. El cabello largo debe conservarse sujetado o usar gorro. No usar brazaletes ni collares.

El personal que va a manipular al parásito ya sea cultivo, material fecal de triatominos infectados o sangre de individuos infectados, debe: • • • • Inicialmente trabajar bajo supervisión cercana. Conocer aspectos biológicos del parásitos. Someterse a evaluación serológica por lo menos una ves al año. Practicar las normas de bioseguridad y conocer el procedimiento que se debe seguir en caso de accidente.

MPR - INS - 002

73

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

MANUAL

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

12.2. DEL AMBIENTE DEL LABORATORIO a) Las paredes deben ser lisas, preferiblemente enchapadas con mayólica y los pisos de marmolina o cemento. Esto facilitará la limpieza con soluciones desinfectantes. b) Los pisos deben limpiarse todos los días con soluciones desinfectantes (pinesol, cresol, etc.). No se debe barrer en seco ni encerar. c) Al sistema de desague, sólo se debe eliminar los agentes biológicos o químicos, previamente descontaminados, neutralizados o inactivados.

d) El ambiente debe estar adecuadamente ventilado e iluminado y los servicios de agua, luz y gas deben funcionar satisfactoriamente. e) Las mesas de trabajo deben estar confeccionadas de material sólido, con superficies lisas, impermeables de fácil limpieza resistentes a las sustancias corrosivas. Uso de cabinas de seguridad: Clase I y II: • Cabina clase I: Son de frente abierto, presión negativa y con filtros HEPA (alta eficiencia en filtrado de partículas). Se puede usar con ventanas a medio abrir. Cabina clase II: Son de flujo laminar vertical, similar a la anterior, pero con aire filtrado por HEPA circulando.

12.3. MANIPULACIÓN Y ELIMINACIÓN DE SANGRE Y SUS PRODUCTOS a) La extracción, centrifugación y separación de suero debe hacerse usando guantes. b) Las agujas usadas no deben devolverse al capuchón de plástico. Antes de ser eliminadas colocarlas junto con las jeringas usadas en un recipiente que resista la esterilización en autoclave o hervido. c) El operador es el responsable de desinfectar el área de trabajo antes y después de su uso con fenol al 5%, cresol al 3% u otro desinfectante, dejándolos actuar durante 30 minutos.

d) El coágulo y suero innecesarios deben eliminarse en un recipiente con lejía. e) Los tubos de prueba, pipetas y láminas de microscopio pueden descontaminarse sumergiéndolas en mezcla sulfocrómica o lejía antes de lavarlas.
MPR - INS - 002

74

I NSTITUTO N ACIONAL

DE

S ALUD

asímismo la evaluación serológica para la detección o el seguimiento del nivel de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi.4. favorecer el sangrado de la lesión y. posible contaminante.4. Los mecanismos son variables. suero.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 12. En caso de resultar negativo solicitar el examen de nuevas muestras de sangre cada semana durante dos meses. Informar el accidente al jefe inmediato y concurrir al servicio médico más cercano.INS . éste se encuentra en la sangre de los pacientes chagásicos y de animales infectados experimentalmente en el laboratorio. ingesta de aerosoles o gotitas en mucosas. alcohol o desinfectante. cortes o abrasiones. entre ellos tenemos la autoinoculación con agujas. el accidentado debe recibir tratamiento preventivo inmediato con Nifurtimox o Benznidazol. MPR . quemaduras pequeñas • • • • La persona accidentada debe lavarse la zona afectada con jabón. 12.2. El personal que trabaja con estos materiales está expuesto a infecciones accidentales. Si la probabilidad de adquirir la infección es alta. • 12. cubrir la herida con un apósito. fluidos corporales) a) Se debe lavar la zona afectada con agua y jabón. ojos o piel. EN CASO DE ACCIDENTES La forma celular infectante de Trypanosoma cruzi al hombre es el trypomastigote. si es necesario. Inoculación accidental.3. c) Se tomará una muestra de suero del accidentado para descarte de infección de hepatitis B y VIH. Ingestión de material peligroso Acudir al servicio médico más cercano para el tratamiento adecuado. en las heces de los triatominos y en cultivos de parásitos. También debe examinarse la muestra del paciente.002 75 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . b) Se concurrirá al servicio médico más cercano para determinar la gravedad del caso e informar del accidente a las autoridades competentes.4.1.4. En caso de herida. 12. Contacto con material infectado con virus de la hepatitis B o virus del VIH (sangre. Solicitar el examen de una muestra de sangre (microconcentración) en busca de parásitos a partir del quinto día de producido el accidente.

5. etc. dependerán de la naturaleza del agente presente en el material de vidrio u otro. Se puede emplear también una olla a presión provista de una rejilla. material plástico. lejía. 12.3.).002 76 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . etc.1. Se usa para soluciones.a Autoclave (vapor saturado a presión) Permite controlar la temperatura (121 ºC) y la presión (15 atmósferas). La continuidad negativa de la muestra indica que el trabajador no se ha contaminado.22 µm).INS . 12.b Horno (calor seco) Suele ser eléctrico y permite el control de la temperatura (180-200 ºC) Por este sistema no puede esterilizarse papel.2 Lavado Después de la eliminación de los agentes infecciosos (desinfección).c Agentes físicos Para reactivos biológicos degradables por calor seco o húmedo. Material de vidrio con medio de cultivo.5.3. Desinfección a) Los procedimientos para eliminar elementos causantes de infecciones virales. etc. b) Los más comunes son: agentes químicos en estado líquido (mezcla sulfocrómica. se emplean membranas de filtración (0. 12. material de goma. LIMPIEZA Y ESTERILIZACIÓN 12. 12. el material de vidrio sucio debe ser lavado. 12. recomendándose el uso de detergentes.5. autoclave. irradiación ultravioleta.5.5. de goma. este examen debe repetirse mensualmente hasta el sexto mes.3. bacterianas. plástico. vidrio o metal. micóticas y parasitarias. MPR .5. hervido.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA d) Si la muestra es negativa para VIH. DESINFECCIÓN.) y los agentes físicos como el calor.

Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública. Valverde A. Bonilla C. Velásquez C. Lima. pp. p.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Chang J. (1958). 5. 8. Serie de normas técnicas nº 18. Yáñez C. Reduviidae) presentes en Cajamarca y Amazonas. 61 págs. 7. Triatominos del Perú. Instituto Nacional de Salud. Cáceres A. Lumbreras H. Cornejo A. Manual de laboratorio. (1972).002 77 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . (Zavaleta A. I. Carrillo C. 10. Parasitología clínica. 1998. 2. 60. Manual de mantenimiento para equipos de laboratorio. Manual de normas de bioseguridad. 143. Enfermedad de Chagas en la region nororiental del Perú. (1979). Llontop E. Troyes L. MPR . Anales de la Facultad de Medicina. (1977). 421-453. Organización Panamericana de la Salud. 17-23. Zavaleta A (1996). 6. 4. 9. (2002). IV Congreso Peruano de Microbiología y Parasitología. Primera edición editorial Inter. eds. Doctrina. Guillén Z. Enfermedad de Chagas. Guillén A. Buenos Aires p. normas y procedimientos para el control de la enfermedad de chagas en el Perú. Triatominos (Hemiptera. infección natural por tripanosomas. Heredia N.º 3 .Universidad Peruana Cayetano Heredia. 3. Manual de procedimientos de control de calidad para los laboratorios de serología de los bancos de sangre. Red Peru Med Exp Salud Publica. Atias A. El problema de la enfermedad de Chagas en los diferentes departamentos del Perú. Murias E. MINSA. Beltrán M. Cabezas C. 19(1). Mario Fatala Chaben. Cáceres et al. (1996). Tesis de la Facultad de Medicina .Tercer trimestre. 216-227.INS . Lautrec. Instituto Nacional de Chagas.) Ministerio de Salud. p. Febrero 1994. Dr. Buenos Aires. Estado actual en el Perú. Médica. Washington DC. Octava edición. art. Neghme A. Organización Panamericana de la Salud. Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública. 2005. Gonzáles A. tomo XLI-N. Enfermedad de chagas y otras parasitosis. Quispe N.

A. Essential Inmunology Sixth Edition. Lorca M.68. Cabezas C. Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública. 50. 12. (1996) Inmunología e inmunoquímica. Carrillo C. 14. Guillén A. 23 págs. Tecnologías aplicadas al diagnóstico e investigación de enfermedades parasitarias.A. Zaman V. WHO. Camargo M. Fundamentos. Cart. eds. Editorial Médica Panamericana. Ponce C. P.E. (1992). 82. Lima. Buenos Aires. Atlas color de parasitología clínica. Wendel S. Validation of a rapid and reliable test for diagnosis of Chagas disease by dectection of Trypanopsoma cruzi specific antibodies in blood of donors and patients in Central America.) Ministerio de Salud .002 78 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . (Zavaleta A.INS . Buenos aires. et al. Guerra H. Lautrec. WHO Technical Report Series 811 95 págs. 2005. Roitt I. (1994). Blackwell Scientific Publications Boston. 286. 18. Manual de procedimientos de laboratorio para la obtención y envío de muestras (I). Serie de normas técnicas nº 15. American Trypanosomiasis as a public health problem. (1991). p. Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública. Nº 10. p. 17. Brenner Z. (1997). Vol 43. p. Quinta edición. (1995). Chagas disease (American Tripanosomiasis): Its impact on transfusión and clinical medicine. 43 (10). (2005). 800. (1998). MPR . Guevara M. Editorial Médica Panamérica. Network for research and training in parasitic diseases in the southern cone of Latinoamérica SIDA/SAREC. 15. 5065-68. Report a WHO Expert Committee. (1988). Santiago de Chile. Instituto Nacional de Salud. 270 págs. Journal of Clinical Microbiology. 98 págs. Geneva. 16. Carlos Ponce et al. Editorial. Solari A. Palacios R. Segunda edición.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 11. Sao Paulo. 13. Margini R. Schmunis G. Validation of a rapid and reliable test for diagnosis of Chagas’disease by detection of Trypanosoma cruzi-specific antibodies in blood of donors and patients in Central America. 19. Journal of Clinical Microbilogy. 20. Chang J. Náquira C. Control of Chagas disease. Graf. art. 198. p 5065 .

.... El rango de pH apropiado oscila entre 6........ Generalmente el colorante está listo al tercer día cuando.3......................................00 mL Glicerina pura .......90 mL Otra forma de preparar la solución Giemsa diluida es agregando dos gotas de Solución Giemsa stock por cada mililitro de solución diluyente......00 mL En un frasco ámbar que contiene perlas de vidrio....... 0........................ 5....... 4.10 mL Solución diluyente ................. certificado .............................. 35......................6 y 7................... en el ensayo de tinción........1..2............. mezclar los reactivos agitándolos vigorosamente varias veces al día... MPR ........ Filtrar la solución Giemsa stock con papel de filtro y conservarla en frasco oscuro a temperatura ambiente......... Colorante Giemsa stock ................... Diluir un gramo de la mezcla de sales en un litro de agua destilada.. 1...... 0. 0............INS ...... los parásitos muestran los colores apropiados..............002 79 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .75 g Metanol puro (sin acetona) ............. COLORACIÓN GIEMSA 1.......0 g Fosfato monopotásico (KH2PO4) ...2......... Solución Giemsa stock Colorante Giemsa en polvo.... 1............... Solución Giemsa diluida Preparar el volumen necesario en una probeta..0 g Mezclar las sales a homogeneidad....................... 65..... agua de lluvia o de caño........................ Solución diluyente (agua amortiguada) Fosfato disódico anhidro (Na2HPO4) .....MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA ANEXO 1 PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO 1...........

INS .4.002 80 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .1. Solución de 5-fluorocitosina (500 mg/mL) Diluir 5 gr de 5-fluorocitosina en 10 mL de solución salina estéril. Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo agregar 0.º 18 y jeringa de vidrio de 50 mL (estéril).22 µ de porosidad). Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo agregar 0. MPR . Alcohol yodado y algodón. Tijeras. Solución de penicilina G sódica : (200 000 UI/mL) Diluir 1 millón de unidades de penicilina en 5 mL de agua destilada estéril.3.1 mL de la solución de penicilina.1 mL de la solución de estreptomicina. 2. CULTIVO 2. La concentración final del antibiótico en el medio de cultivo o solución salina debe ser 500 µg/mL.4. 2. 2. Nota: Esterilizar las soluciones por filtración (0. Mechero Bunsen o de alcohol.1. Obtención de sangre desfibrinada de conejo 2.2. Aguja N. Materiales y reactivos • • • • • • Conejo adulto. Concentración final: 500 µg de 5-fluorocitosina por cada mililitro de medio de cultivo o solución salina. La concentración final del antibiótico en el medio de cultivo o solución salina debe ser 200 000 UI/mL. Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo agregar 0. Matraz o balón que contenga perlas de vidrio (estéril). Solución de estreptomicina: (500 mg/mL) Diluir 5 gr de sulfato de estreptomicina en 10 mL de agua destilada estéril.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 2.1 mL de la solución de 5-fluorocitosina.

.. para conservar la esterilidad de la sangre.1..5.... e) Controlar la esterilidad del medio a 37 ºC durante 18 horas...... 0.. MPR .1mL de la solución de estreptomicina y 0...... Materiales y reactivos Medio base para agar sangre .......... en ambiente de esterilidad. c) Agregar las soluciones de antibióticos 0..... cortar con una tijera el pelaje y desinfectar con alcohol yodado el área elegida..........MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 2.002 81 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .. 46 ºC y aun estando el agar licuado............... Procedimiento a) En un balón de 500 mL diluir el agar (baño María 80 ºC) en 100 mL de agua destilada y autolavar a 121 ºC por 15 minutos.. b) Ubicar la zona de punción (latido cardíaco)..........1 mL de penicilina................... 15 mL Tubos de prueba de 13 x 100 2......................................... agregar 15 mL de sangre desfibrinada de conejo.. el cual contiene perlas de vidrio......... d) Muy cerca al mechero.................. Medio de cultivo agar sangre 2....1 mL Solución de penicilina ..... vaciar la sangre a un matraz o balón estéril...2.......4....5............................... f) Guardar a 4 ºC hasta el momento de uso... d) Revertir 1...... c) Obtener por punción al corazón de 20 a 40 mL de sangre..INS .......2......................... 2.....5.. 100 mL Solución de estreptomicina ....... b) Dejar enfriar a temperatura ambiente hasta.. 0................. 4 g Agua destilada ..... e) Agitar suavemente con movimientos rotatorios para desfibrinar la sangre durante cinco minutos..1 mL Sangre desfibrinada de conejo .........5 mL del medio en tubos de prueba con tapa rosca... Procedimiento a) Sujetar al conejo en posición cúbito dorsal.... aproximadamente.......

............................INS .................................................. 100 mL REACTIVOS Solución 1 Solución 2 NaCI Agua destilada PBS ph 7............................. 1000 mL 3....................................... 8..... HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA 3.................................... Solución de Alsever Glucosa anhidrida ......... Solución diluyente Suero humano negativo al 1% en PBS pH 7.....................2.2 MPR . 100 mL Solución 2: NA2HPO4 ..............4 18....1 g 250 mL 3.................1 g 250 mL PBS ph 6..............13 g H2O destilada ...00 g Ácido cítrico ....15 mL Preparar: Solución 1: KH2PO4 ............ 2... Solución salina tamponada ..............04 g H2O destilada ....55 g Agua destilada ... 2................ 18................66 g Cloruro de sodio ..buffer fosfato salino (PBS) 0..............................MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 3......................................... 4........2 7 mL 18 mL 2....002 82 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .......1....4 mL 6...............................7 mL 2............ 0........................5 mL suero humano 45 mL de PBS pH 7........18 g Citrato de sodio ...3........2 Ejemplo: 0................

.......................... 8................................................. Ácido tánico solución stock al 1% Ácido tánico ...................................................148 g Na H2PO4 anhidro ............1.... 1....................... 0.......................................... negativo y control de inespecificidad y evaluar diluciones dobles del conjugado mayores y menores a la dilución propuesta por el laboratorio fabricante.............. ELISA 4.... 4...... Buffer de lavado Buffer fosfato salino + Tween 20 al 0............MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 3.. 0.............5.................................INS .......................... Conjugado Antiinmunoglobulina humana marcada con peroxidasa Para determinar el título del conjugado ejecutar el procedimiento de la técnica ELISA con sueros controles positivo (con título conocido)..........................2 KCI ..................... 100 µL Solución salina ............2 g NaCI .............. 10 mg Solución salina .............05%.......................... 4.............. 20 mL 4.............. Buffer fosfato salino (PBS) pH 7.. 1000 mL Conservar a 4 ºC......... Solución de bloqueo Buffer fosfato salino + seroalbúmina bovina al 3% 4.........0 g Agua destilada ................................................2 g Na2HPO4 anhidro .............4..........................2......................................... 1 mL Solución de trabajo 1/20 000 Ácido tánico solución stock ................................... Solución diluyente Buffer fosfato salino + seroalbúmina bovina al 1% 4........................... MPR .....3.........002 83 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .................4.............

..INS .................3 g Diluir las sales en 900 mL de agua destilada.................................................................................................................. 0...................................................1g Na2HPO4 12 H2O ..0 g Na2HPO4 anhidro ............................ 4............................ 2...................4 mL Agua destilada ................... Ajustar el pH a 7.......................6........... Solución del sustrato Solución estabilizadora para el sustrato ............................. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) 5.....................MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Considerar como título del conjugado a la mayor dilución con la que se obtiene la lectura de la absorbancia esperada en los sueros control............... 100 mL Ajustar el pH a 6 Antes de su uso.................. 8........ 25 mL Orto-phenilendiamine ......... Ácido sulfúrico 2........... 8...... pesar: NaCI .6 mL 5.................... Solución estabilizadora para el sustrato pH 6 Ácido cítrico ...............................................7........... 10 µL 4..... 4.........................................4 utilizando NaOH 1 M MPR ................. 3....................... 10.................6 g Na2HPO4 1 H2O ....... Buffer fosfato salino (PBS) 0.........................7 g Agua destilada ............001 M pH 7......... 1... 10 mg Peróxido de hidrógeno al 30% ....................5 M Ácido sulfúrico .............4 Para preparar un litro de PBS.......002 84 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD ..................................................1............8.... diluir la solución estabilizadora del sustrato (8 mL) con agua destilada (17 mL)................

............5.................. Buffer carbonato ..............4.........................................s........ 9 partes 5................5 y la solución B si está por encima de este valor.......... Buffer diluyente (PBS + tween 80 al 1%) PBS .......... 1 mL 5....... 100 mL Solución B NaHCO3 ............ 100 mL Conservar en refrigeración (4 ºC) Preparar la solución de trabajo antes de usarla Solución stock ....... ................................tween 80 ............................................... enrasar a un litro con el agua destilada.....MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA En una probeta.. 99 mL Tween 80 .................. 1 parte PBS tween 80 ....... MPR ................................... Solución de azul de Evans Preparar la solución stock de la siguiente manera: Azul de Evans .......................................................INS ..... 5.......... .................................5 Solución A Na2CO3 ........3................................................................................................................................. Verificar o ajustar el pH a 8............................................................................... Utilizar la solución A si está por debajo de 8...............................p.....................................002 85 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD ............................5 M pH 8... 100 mL Mezclar 0........................................................ 100 mg PBS ....... Conservar en refrigeración (4 ºC)............................................ 4.....bicarbonato 0........... 5..s......p.....................4 mL de la solución A con 10 mL de la solución B......2 g Agua destilada c....................3 g Agua destilada c.2.............................................

. asimismo... 1 mL Glicerina bidestilada ... Titulación del conjugado antiinmunoglobulina humana asociada a isocianato de fluoresceína El fabricante estima el título del conjugado... MPR .bicarbonato 0..INS ....6...... TÍTULO RECOMENDADO CONJUGADO 1/50 1 1/100 2 1/200 3 1/400 4 1/800 5 6 CP 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 B CN 1 /32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 B 12 7 8 9 10 11 CP : SUERO CONTROL POSITIVO A T... cruzi CI: SUERO CONTROL INTERNO B: BLANCO (control de reactivos) El título del conjugado es la mayor dilución del conjugado en la que fluoresce el suero positivo en su título conocido... sin embargo..5 . Titular cada lote nuevo del conjugado.... Elaborar el protocolo de trabajo siguiendo el esquema siguiente y efectuar el procedimiento de la técnica IFI.. antes de su uso corroborarlo o determinarlo evaluándolo en diluciones dobles mayores y menores al título indicado........5 M................ Emplear en la evaluación un suero control positivo de título conocido y un suero control negativo....... Glicerina tamponada Buffer carbonato ....... pH 8.............002 86 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD ..MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 5. los controles o alguno de los reactivos de la batería IFI...5...... cuando se cambia el lote de antígeno.......... 9 mL 5... cruzi CN : SUERO CONTROL NEGATIVO A T..

cruzi sumergiéndolo durante un minuto en una solución alcohólica al 70%.1. Xenodiagnóstico: • • Aplicar el xenodiagnóstico a un paciente chagásico agudo. 1. Sembrar el material fecal y el tubo digestivo en medio de cultivo bifásico agar sangre-suero fisiológico e incubar a 28 ºC. Proceder igual que en el hemocultivo para el diagnóstico.b.a. por hemocultivo o xenodiagnóstico 1. Vectores Procedimiento: • • Desinfectar el insecto positivo a la infección por T.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA ANEXO 2 AISLAMIENTO Y MANTENIMIENTO DE Trypanosoma cruzi EN EL LABORATORIO 1. • MPR . 1.INS .002 87 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Cortar la parte terminal del abdomen del insecto con la ayuda de unas pinzas y tijeras finas desinfectadas retirar el tubo digestivo y colocarlo sobre una lámina porta objetos.1.suero fisiológico. Hemocultivo: • • • Sembrar la muestra de sangre heparinizada de un paciente chagásico agudo en medio de cultivo bifásico agar sangre .1. AISLAMIENTO El parásito se puede aislar a partir de: 1. Pacientes. Generalmente. a mayor volumen de sangre sembrada. Seguir el procedimiento que se detalla para el aislamiento a partir de los vectores.2. mayor posibilidad de éxito en el aislamiento. la parasitemia en sangre circulante es baja por lo que.

este procedimiento mantiene las características nativas del parásito.INS . esto permitirá continuar los cultivos en caso de contaminación. Se usa ratones jóvenes y el control se realiexaminando periódicamente la parasitemia en una gota de sangre.002 88 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Así se conserva la capacidad de infección del parásito. fresco. En medio de cultivo • Los parásitos aislados se mantienen en cultivo por repiques semanales en nuevos tubos con agar sangre. MANTENIMIENTO 2. Es recomendable mantener dos tubos del mismo cultivo y manipular solamente uno de ellos. Criopreservación Es la conservación de los parásitos a -80 ºC. obtenida por corte en la porción terminal de la cola. 2.2.3. • El traspaso de animal a animal se hace por inoculación intraperitoneal de sangre positiva. Se realiza colocando una suspensión de parásitos procedentes de cultivo en medios de conservación con glicerol a diferentes concentraciones.1.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 2. MPR . 2. En animales • La lar za en inoculación en animales de experimentación es otra forma de aisy mantener el parásito.

Repetir el lavado.01 M pH 7.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA ANEXO 3 PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS 1. 1. Solución formolada: PBS + formol al 2% V:V. b) Centrifugar el cultivo a 4000 rpm durante diez minutos. . ANTÍGENO PARA LA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Las láminas empleadas para la prueba de inmunofluorescencia indirecta. Cámara de Newbauer 1. en el sedimento se encuentran los parásitos d) Lavar los parásitos por tres veces de la siguiente manera: . Tubos de centrífuga 10 mL.INS . evitar las rosetas. . Los parásitos deben estar aislados para fijarse en las láminas. Centrífuga. Buffer fosfato salino (PBS) 0. 1. .2.01 mL pH 7. PROCEDIMIENTO PARA OBTENER LA SUSPENSIÓN DE PARÁSITOS a) Filtrar el cultivo a través de una capa fina de gasa o lana de vidrio. c) Retirar el sobrenadante. Láminas para inmunofluorescencia. MPR . Se emplean cultivos de cuatro días (fase exponencial del crecimiento).Retirar el sobrenadante. 0. se preparan con epimastigotes de Trypanosoma cruzi obtenidos en medio de cultivo y tratados con formol.1.4 (Anexo 1). MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • • 5 mL de cultivo de epimastigotes.5 mL con tapa.4.Centrifugar a 4000 rpm por diez minutos. Acetona. EQUIPOS.Resuspender los parásitos en 5 mL de PBS.002 89 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .

002 90 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . sumergir las láminas para fijar el parásito. • MPR .4. g) Resuspender el sedimento en 0. sellando los bordes con esparadrapo para evitar la humedad.01 M pH 7.INS .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA e) Resuspender el sedimento en 0.01 M pH 7. Luego proceder al lavado al igual que en el punto d. f) Adicionar 0.3. Conservarlas en congelación (-4 a -20ºC) hasta el momento de su uso. Dejar secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un secador o ventilador.50 µL de solución formolada y dejarlo durante una hora en refrigeración (4%C).25 mL de PBS 0. FIJACIÓN DE LOS PARÁSITOS A LAS LÁMINAS • • • • Depositar 25 µL de la suspensión diluida de parásitos sobre el área de los círculos de la lámina IFI.4. Mantenerlo en refrigeración (4 ºC) durante diez minutos. h) Colocar una alícuota de la suspensión de parásitos en una cámara de Newbauer y realizar el contaje de parásitos en el microscopio a 40X.50 mL de PBS 0. Las láminas fijadas envolverlas en papel aluminio o guardarlas en una caja portaláminas. En un frasco couplin que contiene acetona fría. 1. i) Diluir la suspensión con PBS hasta obtener de 25 a 40 parásitos por campo microscópico a 40X.

Conservarlas en su caja o en una placa Petri hasta su uso. que contiene alcohol acetona V:V. Solución salina estéril. • - 2. Centrífuga.1. Las láminas IFI usadas. lavarlas previamente con detergente y luego proceder al igual que con las nuevas. para facilitar la fijación uniforme de la suspensión de parásitos a la lámina y para evitar los artefactos que dificultan la lectura. Tubos de centrífuga. Solución NaCL 1. Secarlas con una gasa limpia y conservarlas envueltas con papel hasta el momento de su uso.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 1. Congeladora -20 ºC.INS . obtenido de cultivo in vitro. MATERIALES Y REACTIVOS • • • • • • • • • • 50 mL de cultivo de epimastigotes. EQUIPOS. sumergir las láminas IFI nuevas. Los cubreobjetos dejarlos en un recipiente que contenga alcohol al 70% durante 30 minutos.002 91 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD .4.7%. ANTÍGENO PARA LA HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA El antígeno es un extracto acuoso de epimastigotes de Tripanosoma cruzi. durante 1 a 24 horas. libres de grasa. Proceder de la siguiente manera para la limpieza: En un frasco couplin o frasco con tapa. luego secarlos con gasa limpia una a una. Merthiolate 1:10 000. 50 mL y 10 mL con tapa. Gasa. Baño María.4 (PBS) (Anexo 1). Buffer fosfato salino pH 7. MPR . RECOMENDACIONES • Emplear láminas limpias. 2.

b) Centrifugar el cultivo a 4000 rpm durante 10 minutos. o por ultrasonido (sonicación). el cual contiene infusión de cerebro y corazón. e) Repetir el lavado. -Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos. suero fetal bovino. Agregar la solución de Merthiolate al 1:10 000. ANTÍGENO PARA ELISA El antígeno es un extracto soluble acuoso de epimastigotes lisados mecánicamente (por presión o congelamiento y descongelamiento sucesivo). El sobrenadante constituye el antígeno. en el sedimento se encuentran los parásitos. Conservar en congelación (-4 a -20 ºC) hasta el momento de su uso. extracto de levadura y como suplemento hemina. f) Resuspender los parásitos en agua destilada (1:10).2. c) Retirar el sobrenadante. i) j) k) Centrifugar durante 30 minutos a 4000 rpm y 2 ºC. PROCEDIMIENTO a) Filtrar el cultivo a través de una capa de gasa o lana de vidrio.7%.MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA 2. Los epimastigotes son obtenidos de preferencia en medio líquido LIT. caldo de infusión de hígado.INS .002 92 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . -Retirar el sobrenadante. 3. d) Lavar los parásitos de la siguiente manera: -Resuspender el sedimento en 5 mL de PBS. MPR . h) Agregar un volumen igual de solución Nacl al 1. La suspensión antigénica alicuotada se conserva a -20 ºC hasta su uso. g) Congelar (-70 ºC) y descongelar (37 ºC) por seis veces sucesivas.

luego acondicionarlos en un contenedor secundario (recipiente de cartón grueso o plástico. Procedimiento: a) Colocar las muestras en una bolsa plástica. ejemplo. rodeado con hielo seco o cubos de hielo).LIMA 11 TELEFONOS: 471-9920 / 471-2529 ATENCIÓN: LABORATORIO DE LEISHMANIOSIS Y CHAGAS MPR . el hemocultivo o el examen serológico. b) El recipiente secundario debe ser colocado en una caja de «tecnoport» (poliestireno) u otro material que conserve las temperauras bajas.002 93 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . c) Cerrar y sellar herméticamente la caja térmica. Sangre en capilares y en tubos en frío (4-8 ºC). cuando lo considere necesario. URGENTE MATERIAL BIOLÓGICO PERECIBLE DESTINO: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DIRECCIÓN: CALLE CÁPAC YUPANQUI 1400 JESÚS MARÍA .MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA ANEXO 4 CONSERVACIÓN Y ENVÍO DE MUESTRAS El laboratorio enviará las muestras de sangre o suero y la ficha correspondiente (anexo 5) al laboratorio del nivel inmediato superior para realizar el estudio de láminas. considerar las temperaturas adecuadas de conservación de las muestras: • • Suero en congelación (<0 ºC). d) Rotular la caja térmica con los siguientes datos: destino dirección y nombre del laboratorio al que se envia las muestras.INS . Al realizar el embalaje. Incluir la ficha de solicitud de examen en bolsa plástica sellada.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA Anotar en lugar visible la temperatura de conservación de la muestra.6 tubos capilares Antes de las cuatro horas Con refrigerante CONCENTRACIÓN STOUT Y HEMOCULTIVO Sangre venosa En tubo 5 mL vacutainer sin anticoagulante Refrigeración Esteril (4 . La vía de transporte debe ser la más rápida posible.20 ºC).80 ºC Con refrigerante MPR . En caso de contar con contenedores prefabricados.002 94 I NSTITUTO N ACIONAL DE S ALUD . Colocar una flecha indicando la posición en la que debe mantenerse la caja. MUESTRA EXAMEN DE LABORATORIO OBTENCIÓN DE SANGRE CARACTERÍSTICAS PROCESAMIENTO TIPO CANTIDAD CONSERVACIÓN TRANSPORTE GOTA GRUESA Sangre capilar Sangre capilar En láminas 2 Láminas Homogénea Evitar las burbujas de aire en el capilar Temperatura ambiente Temperatura ambiente y en posición vertical Inmediato Temperatura ambiente MICROCONCENTRACIÓN En capilares con EDTA 4 .8 ºC ) Inmediato o antes de siete días Con refrigerante ELISA IFI HAI IB Suero o En tubo plasma 1 . refrigeración (4-8 ºC) o congelación (0 .INS . seguir las instrucciones que indica el envase.2 mL vacutainer sanguíneo sin anticoagulante No hemolizado No contaminado Hasta 5 días: Refrigeración 4-8 ºC Mediato Mayor de 5 días: Congelación -20 a .

de Chagas No Sí Quién Vivió o visitó área endémica No Sí Lugar / Hace cuánto tiempo Antecedente de Uta o Espundia (Leishmaniosis ) No Sí Hace cuánto tiempo Gestante No Sí Fecha última regla Fecha probable parto Resultados anteriores de laboratorio y tratamiento recibido No Sí Fecha Donde se realizó el dx . DATOS PERSONALES Apellidos y Nombres Dirección Calle y N° Localidad Distrito Fecha Edad Años _____/_____/_____ Día Mes Año Sexo Meses Fem Masc Provincia Departamento II. V. ANTECEDENTES Diagnóstico clínico Sintomático Agudo Asintomático Signo de Romaña Chagoma de inoculación Fiebre Manifestaciones cardiacas Crónico Insuficiencia cardiaca Disfagia Estreñimiento Megaesófago Megacolon Congénito Aumento de ganglios Prematuro Hepato-esplenomegalia Recibió transfusión sanguínea No Sí Hace cuánto tiempo Aspectos epidemiológicos Presencia de chirimachas en su vivienda Vivienda rociada con insecticida No Sí Hace cuánto tiempo Código de vivienda No Sí Hubo Dónde Cuándo Familiar con Dx . muestra Resultado Abs. Técnica empleada /Nombre reactivo Abs. Strout Hemocultivo Xenodiagnóstico ELISA HAI IFI IB Responsable de solicitud de diagnóstico Nombres y apellidos Firma Responsable del diagnóstico Nombres y apellidos Firma . muestra Resultado Examen serológico Fecha obt. ELISA: OTRA: Valor de corte Parasitemia positiva Serología reactiva Recibió medicamento No Sí Hace cuanto tiempo Nombre del medicamento Completó el tratamiento No Sí III.frotis Microconcentración Concent. muestra Fecha recep. EXÁMENES DE LABORATORIO SOLICITADO Diagnóstico Confirmación del diagnóstico Seguimiento del tratamiento Examen parasitológico Fecha obt . de C Título Gota gruesa .Anexo 5 Solicitud para diagnóstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas Establecimiento de salud Dirección Regional de Salud Banco de sangre No Sí I. muestra Fecha recep.

Anotar la fecha. Aspectos epidemiológicos Llenar o marcar con una X los casilleros correspondientes.INSTRUCTIVO DE LA SOLICITUD PARA DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS Llenar los casilleros con los datos solicitados. Precisar en lo posible las fechas de los datos solicitados. Debe colocarse las fechas según el momento del proceso: al obtener la muestra y al ingresar al laboratorio que efectuará el examen. Cajamarca. Resultados anteriores de laboratorio y tratamiento recibido Marcar el casillero que corresponda. Marcar con una X el casillero confirmación del diagnóstico. ANTECEDENTES Diagnóstico clínico Sintomático: marcar con X si hay alguna sintomatología compatible con la enfermedad. crónico portador. Dejar en blanco los casilleros de resultados hasta el momento de emitirlos. Asintomático o indeterminado: marcar con una X cuando no hay sintomatología pero hay antecedentes epidemiológicos que hacen sospechar de la infección. Moquegua. en caso de ELISA absorbancia (Abs) de la muestra y el valor de corte (Vc) correspondiente. DATOS PERSONALES En el casillero dirección. En caso de infecciones agudas o crónicas. la técnica y nombre del kit usado. en caso de tener resultados de laboratorio anteriores y el de seguimiento cuando se solicita el examen de laboratorio de persona con tratamiento. anotar el lugar de residencia habitual II. el nombre del establecimiento que realizó el diagnóstico. Áreas endémicas: Arequipa. congénito. Amazonas y San Martín. EXAMEN SOLICITADO Los exámenes solicitados serán los apropiados para confirmar el diagnóstico presuntivo y estarán de acuerdo a la situación clínica de la persona: agudo. . identificar con una X el casillero correspondiente a los síntomas presentes. I. El solicitante será el responsable del laboratorio local o regional. III. Ica. Tacna.

Abs . Lugar y fecha Nombres y apellidos del responsable del laboratorio Firma . concentración).c. Adjuntar el presente formato con la información solicitada empleando una hoja para cada actividad y el formato de solicitud de diagnóstico de las muestras positivas o reactivas .° Código Laboratorio Nombres y Apellidos Resultados Laboratorio Referencia Regional Gota ELISA IFI HAI V. 1/32 gruesa Observaciones : Nombre de reactivos o kits empleados por el laboratorio de referencia regional NOTA: Enviar todas las láminas o sueros positivos y 10% de los negativos examinados en el trimestre (láminas coloreadas con Giemsa de exámenes de sangre por gota gruesa.Anexo 6 Solicitud de control del diagnóstico de laboratorio de la trypanosomiosis americana DIRECCIÓN REGIONAL DE SALUD ESTABLECIMIENTO DE SALUD RESPONSABLE DEL DIAGNÓSTICO ACTIVIDAD EN CONTROL NOMBRE DE LA ACTIVIDAD (Lugar) PERIODO N° Muestras evaluadas N° Muestras Reactivas/Positivas Vigilancia serológica Diagnóstico de laboratorio Proyecto de investigación Otro N.

CULT. HAI ELISA IFI OBSERVACIONES (*) D CD M : : : Diagnóstico Confirmación diagnóstico Monitoreo o seguimiento de caso GG : CONC. : Gota gruesa Concentración Cultivo HAL ELISA IFI : : : Hemaglutinación indirecta Ensayo inmunoenzimático Inmunofluorescencia indirecta .ANEXO 7 REGISTRO DE MUESTRAS PARA INVESTIGACIÓN Y MONITOREO DE CASOS DE ENFERMEDAD DE CHAGAS N.º FECHA CÓDIGO DE LABORATORIO NOMBRES Y APELLIDOS EDAD SEXO PROCEDENCIA SOLICITA (*) GG EXAMEN DE LABORATORIO CONC. : CULT.

ANEXO 8 DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI Trypanosoma cruzi POR ELISA Ejecutor del ensayo Nombre del kit Fecha Valor de corte 1 A 1 1 1 1 1 1 2 3 4 5 6 7 1 1 8 1 9 1 10 11 12 1 1 B 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 C 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 D 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 E 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 F 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 G H 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 .

cruzi Suero control positivo a T.cruzi Suero control positivo a T. cruzi Suero control interno Blanco de reactivos CN CN CN CP CP CI B CONTROLES Lectura (Abs) VALIDACION DE LA CORRIDA Sí No CALCULO DEL VALOR DE CORTE Valor de corte (Vc): OBSERVACIONES Firma Responsable del control interno Fecha Día Mes Año .NOMBRE DEL KIT Lote N° Fecha de vencimiento Día Mes Año CONJUGADO Título Fecha de vencimiento Código N° Suero control negativo a T.cruzi Suero control negativo a T.cruzi Suero control negativo a T.

ANEXO 9 DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI Trypanosoma cruzi POR IFI Ejecutor del ensayo 1 2 3 4 5 Fecha 6 1 1 1 1 1 1 7 1 8 2 9 3 10 4 11 5 12 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 1 8 2 9 3 10 4 11 5 12 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 OBSERVACIONES 8 9 10 11 12 .

ANTIGENO IFI Lote N° Fecha de vencimiento Día Mes Año CONJUGADO Lote N° Título CONTROLES Código N° Suero control positivo a T.cruzi Suero control interno Blanco de reactivos CP CN CI B Sin suero Título 1/ 1/ 1/ - Lectura LECTURA E INTERPRETACIÓN Título de valor diagnóstico: 1/32 Leyenda de lecturas: Fluorece francamente No fluorece Fluorece débilmente Validez de la corrida Sí No Leyenda de resultados: + Reactivo No reactivo Indeterminado R NR +/- I OBSERVACIONES Firma Responsable del control interno Fecha Día Mes Año .cruzi Suero control negativo a T.

PE TIRAJE: 1000 EJEMPLARES . PARURO 119. LIMA 1.CEPREDIM SE TERMINÓ DE IMPRIMIR POR ENCARGO DEL INS EN EL MES DE ABRIL DE 2006. ANEXO: 6009 / FAX: 6015 E-MAIL: CEPEDIT@UNMSM. TELÉFONO: 619-7000. EN LOS TALLERES GRÁFICOS DEL CENTRO DE PRODUCCIÓN EDITORIAL E IMPRENTA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS JR.EDU.

You're Reading a Free Preview

Descarga
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->