1.

INTRODUCCIÓN

El ser humano posee el sentido de la vista desarrollado. Sin embargo, no se

pueden ver a simple vista cosas que midan menos de una décima de
milímetro. Y muchos de los avances en química, biología y medicina no se
hubieran logrado si antes no se hubiera inventado el microscopio.
En su afán de llegar siempre más lejos en la investigación de la naturaleza,
de lo que los límites de sus órganos sensoriales le imponen, el hombre ha
construido múltiples instrumentos que le han permitido acceder allí donde
los sentidos no podían penetrar.

Así como el telescopio abrió a la humanidad las puertas de lo infinitamente

grande, el microscopio hizo posible conocer los mundos de dimensiones
ínfimas, entre ellos la célula, base de la vida. Se contaban así las bases de
las modernas ciencias biológicas que hasta bien entrada la edad moderna se
habían fundado en las observaciones directas.

Los microscopios son aparatos que, en virtud de las leyes de formación de

imágenes ópticas aumentadas a través de lentes convergentes, permiten la
observación de pequeños detalles de una muestra dada que a simple vista
no se percibirían.
 1. MICROSCOPIA Y DESARROLLO HISTÓRICO DEL MICROSCOPIO

1.1. Microscopia

La microscopía es la técnica de producir imágenes visibles de estructuras o

detalles demasiado pequeños para ser percibidos a simple vista. En la
microscopía se evidencia los grandes aportes que la física ha hecho a la
biología. Deriva del griego (micro- pekeño, scopen-ver)
El microscopio se define como todo instrumento q permite aumentar la
imagen de un objeto pequeño.

Consta de un sistema de iluminación que nos permite visualizar el objeto y

un sistema de lentes que nos permite aumentar el tamaño del objeto.

Cuando un observador se acerca a un objeto el ángulo visual aumenta y el

objeto parece ser mayor. Por debajo de una distancia de 20 cm. perdemos
claridad por la deformación que sufre el cristalino para intentar adaptarse a
ese ángulo. De aquí se saca la conclusión de que colocando una lente entre
el ojo y el objeto que mantenga o aumente el ángulo, el objeto podrá ser
observado con claridad.

1.2 Desarrollo histórico del microscopio desde sus inicios

El microscopio fue inventado hacia los años 1610, por Galileo Galilei, según
los italianos, o por Zacharias Janssen, en opinión de los holandeses. En
1628 aparece en la obra de William Harvey sobre la circulación sanguínea al
observar al microscopio los capilares sanguíneos y Robert Hooke publica su
obra Micrographia.

En 1665 Hooke observó con un microscopio un delgado corte de corcho y

notó que el material era poroso, en su conjunto, formaban cavidades poco
profundas a modo de celditas a las que llamó células. Se trataba de la
primera observación de células muertas. Unos años más tarde, Malpighi,
anatomista y biólogo italiano, observó células vivas. Fue el primero en
estudiar tejidos vivos al microscopio.

A mediados del siglo XVII un holandés, Anton van Leeuwenhoek, utilizando

microscopios simples de fabricación propia, describió por primera vez
protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos. El microscopista
Leeuwenhoek, sin ninguna preparación científica, puede considerarse el
fundador de la bacteriología. Tallaba él mismo sus lupas sobre pequeñas
esferas de cristal, cuyos diámetros no alcanzaban el milímetro (su campo de
visión era muy limitado, de décimas de milímetro). Con estas pequeñas
distancias focales alcanzaba los 275 aumentos. Observó los glóbulos de la
sangre, las bacterias y los protozoos; examinó por primera vez los glóbulos
rojos y descubrió que el semen contiene espermatozoides. Durante su vida
no reveló sus métodos secretos y a su muerte, en 1723, 26 de sus aparatos
fueron cedidos a la Royal Society de Londres.

Durante el siglo XVIII continuó el progreso y se lograron objetivos

acromáticos por asociación de vidrios flint y crown obtenidos en 1740 por H.
M. Hall y mejorados por John Dollond. De esta época son los estudios
efectuados por Isaac Newton y Leonhard Euler. En el siglo XIX, al
descubrirse que la dispersión y la refracción se podían modificar con
combinaciones adecuadas de dos o más medios ópticos, se lanzan al
mercado objetivos acromáticos excelentes.

Durante el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos mecánicos que

aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso, aunque no se desarrollaron
por el momento mejoras ópticas. Las mejoras más importantes de la óptica
surgieron en 1877, cuando Ernst Abbe publicó su teoría del microscopio y,
por encargo de Carl Zeiss, mejoró la microscopía de inmersión sustituyendo
el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos de 2000. A
principios de los años 1930 se había alcanzado el límite teórico para los
microscopios ópticos, no consiguiendo éstos aumentos superiores a 500X o
1000X. Sin embargo, existía un deseo científico de observar los detalles de
estructuras celulares (núcleo, mitocondria, etc.).

El microscopio electrónico de transmisión (TEM) fue el primer tipo de

microscopio electrónico desarrollado. Utiliza un haz de electrones en lugar
de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de 100.000X. Fue
desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931.
Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido
(SEM).

1.3 Primera persona en observar microorganismos y células

reproductoras con el uso del microscopio

Los primeros microorganismos se observaron hace 300 años y sin embargo

pasaron unos 200 años hasta que se reconoció su importancia. Anthony Van
Leeuwenhork . Se tenían teorías acerca de la existencia y posibles formas
de algunos microorganismos, sin embargo este fabricante de lentes creador
del microscopio (1676) fue el primero en observar microorganismos y
materia microscópica, que según sus dibujos y descripciones, podrían
tratarse de protozoos y bacterias. Esto encendió el interés por el mundo
microscópico. El comerciante holandés, Antón van Leeuwenhork usaba
lentes simples de pequeños trozos de cristal perfecto. Puliéndolos
cuidadosamente, logró aumentar un objeto hasta 270 veces sin perjuicio de
la nitidez. Tenía 419 lentes alguna de las cuales eran de cristal de roca y
hasta de diamante, en algunos casos no eran mayores que el tamaño de un
alfiler, por lo que sus microscopios tenían un tamaño diminuto comparados
con otros de la misma época. Con esas lentes observaba todo lo que podía y
logró describir los glóbulos rojos de la sangre y los capilares con mayor
detalle.
Fue el primero en ver a lo que más tarde se llamarían bacterias y a los
protozoarios, que él denominó “animalículos”. En esta misma época, Anton
van Leeuwenhoek construyó su microscopio óptico rudimentario y observó
muestras de agua, en las cuales vió protozoos y algas unicelulares. Van
Leeuwenhoek también observó los glóbulos rojos de la sangre y los
espermatozoides humanos (aunque no se cuenta de donde obtuvo la
muestra).

Por tanto A van Leeuwenhoek fué el primero en observar células vivas,

aunque pocos años antes R Hooke había visto la estructura del corcho y
acuñó la palabra célula.

1.4. Primer constructor del microscopio compuesto

El microscopio compuesto, que se ha hecho de uso general a partir de

mediados del siglo XIX y que fue de importancia crucial para la evolución de
la microbiología como ciencia, es todavía, con ciertas variaciones, el
principal apoyo de la investigación microbiológica rutinaria.

El microscopio compuesto es el microscopio más utilizado en la ciencia, el

trabajo y el hobby. Consiste en dos partes ópticas: lentes oculares (el que
está próximo a tus ojos) y los lentes objetivos (el que está posicionado
cerca de la prueba observada). El microscopio compuesto fue introducido
por inventor holandés Zacarías Janssen (el también es conocido por
inventar el telescopio). Su aparato sofisticado para el año 1590, llevaba a
cabo dos tareas: para ver estrellas y pequeños objetos. El instrumento se
convirtió en una invención del primer microscopio compuesto y un
telescopio al mismo tiempo.

Este tipo de microscopio está formado básicamente por una parte mecánica
y una parte óptica y es capaz de conseguir aumentos considerablemente
mayores que el microscopio construido con una sola lente. Este último,
llamado microscopio simple, se usa principalmente en el formato de lupa.

• Un microscopio compuesto es un microscopio óptico que tiene más de

una lente de objetivo. Los microscopios compuestos se utilizan
especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en
láminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o
ampliar las imágenes de objetos y organismos no visibles a simple
vista.
1.5. Graficar un microscopio compuesto con sus partes y definir
cada una de ellas.

• Sistema óptico
o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la
imagen del objetivo. se encuentra situado en la parte superior del
tubo. Su nombre se debe a la cercanía de la pieza con el ojo del
observador. Tiene como función aumentar la imagen formada por
el objetivo. Los oculares son intercambiables y sus poderes de
aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de
potencias mayores a 20X y otros que poseen una escala
micrométrica; estos últimos tienen la finalidad de medir el tamaño
del objeto observado.
o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la
imagen de ésta. se disponen en una pieza giratoria denominada
revólver y producen el aumento de las imágenes de los objetos y
organismos, y, por tanto, se hallan cerca de la preparación que se
examina.
o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos
sobre la preparación. está formado por un sistema de lentes, cuya
finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la
preparación, formando un cono de luz con el mismo ángulo que el
del campo del objetivo. El condensador se sitúa debajo de la
platina y su lente superior es generalmente planoconvexa,
 quedando la cara superior plana en contacto con la preparación
cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor
ampliación).
o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el
condensador. El condensador está provisto de un diafragma-iris,
que regula su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede
emplearse, de manera irregular, para aumentar el contraste, lo
que se hace cerrándolo más de lo que conviene si se quiere
aprovechar la resolución del sistema óptico.
o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

Sistema mecánico

• El pie y soporte: Constituye la base sobre la que se apoya el

microscopio y tiene por lo general forma de Y o bien es rectangular.
• La columna o brazo: llamada también asa, es una pieza en forma
de C, unida a la base por su parte inferior mediante una charnela,
permitiendo la inclinación del tubo para mejorar la captación de luz
cuando se utilizan los espejos. Sostiene el tubo en su porción
superior y por el extremo inferior se adapta al pie.
• El tubo: tiene forma cilíndrica y está ennegrecido internamente para
evitar los reflejos de la luz. En su extremidad superior se colocan los
oculares y en el extremo inferior el revólver de objetivos. El tubo se
encuentra unido a la parte superior de la columna mediante un
sistema de cremalleras, las cuales permiten que el tubo se mueva
mediante los tornillos.
• El tornillo macrométrico: girando este tornillo, asciende o
desciende el tubo del microscopio, deslizándose en sentido vertical
gracias a un mecanismo de cremallera. Estos movimientos largos
permiten el enfoque rápido de la preparación.
• El tornillo micrométrico: mediante el ajuste fino con movimiento
casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se
logra el enfoque exacto y nítido de la preparación. Lleva acoplado un
tambor graduado en divisiones de 0,001 mm., que se utiliza para
precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos.
• La platina: es una pieza metálica plana en la que se coloca la
preparación u objeto que se va a observar. Presenta un orificio, en el
eje óptico del tubo, que permite el paso de los rayos luminosos a la
preparación. La platina puede ser fija, en cuyo caso permanece
inmóvil; en otros casos puede ser giratoria; es decir, mediante
tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares.
• Las pinzas: son dos piezas metálicas que sirven para sujetar la
preparación. Se encuentran en la platina.
• Carro móvil: es un dispositivo que consta de dos tornillos y está
colocado sobre la platina, que permite deslizar la preparación con
movimiento ortogonal de adelante hacia atrás y de derecha a
izquierda.
• El revólver: es una pieza giratoria provista de orificios en los que se
enroscan los objetivos. Al girar el revólver, los objetivos pasan por el
 eje del tubo y se colocan en posición de trabajo, lo que se nota por el
ruido de un piñón que lo fija.

1.6. Procedimiento para realizar una observación utilizando un

microscopio.

Para realizar una observación a través de los microscopios debe de seguir

unos pasos para que así tenga un resultado óptimo. Lo primero que debería
tener en cuenta es que el objeto o muestra a observar por los microscopios
sea sometido a un proceso para destacar algunas de las partes que le
interese observar especialmente. Se debe de conservar la muestra u objeto
para realizar observaciones posteriores. Las dos fases de este proceso son:
la de fijación y la tinción. La fijación consiste en que la muestra que
deseamos observar no se mueva y para ello se utilizan diferentes sustancias
líquidas o temperaturas elevadas para que la muestra se deshidrate, y
posteriormente debe lavarse en un medio apropiado para poder realizar la
observación. En cuanto a la tinción se trata de colorear la muestra que
deseamos observar a través de los microscopios, para así destacar las
partes que nos interesan. Para realizar esta tinción la gama de colores es
muy amplia, y cada uno de ellos destaca una parte diferente de la muestra,
por ejemplo si la muestra que tenemos para observar a través de los
microscopios es una célula, la tinción que deberíamos de utilizar para la
observación del núcleo de la célula sería la fucsina básica, el verde metilo.
Si queremos observar el citoplasma de la misma se utilizaría la fucsina
ácida, el verde luz o la eosina, etc.

1.7. Procedimiento para realizar un montaje o preparación

microscópica

Una vez que ya tiene preparada las muestras para observarlas a través de
los microscopios, debería de colocarlas en un vidrio transparente
(portaobjetos) y la cubrimos con otro vidrio transparente más fino
(cubreobjetos). Las muestras se pondrían en los microscopios para realizar
la observación. Para obtener una imagen aumentada de las muestras en los
microscopios debe de tener en cuenta que para obtener el aumento
deseado debe de combinar los objetivos con el ocular. Posteriormente para
enfocar las muestras debe de realizarlo con el tornillo macrométrico y
después con el tornillo micrométrico para afinar el enfoque y así
obtendremos una visión perfecta de las muestras. Cuando las muestras ya
estén perfectamente enfocadas se van cambiando los objetivos hasta
encontrar el aumento que necesitamos. Y ya para tener una observación
perfecta la fuente de luz que tienen los microscopios, la pueden regular con
el diafragma hasta tener la iluminación adecuada para la observación. Antes
de observar la preparación al microscopio, esta debe de ser montada sobre
vidrio. Para ello existen dos piezas de vidrio denominadas portaobjetos
(porta), que, como su nombre indica, es el soporte sobre el que va la
muestra, y cubreobjetos (cubre) que siempre ha de colocarse sobre la
muestra. Una vez colocada la muestra en el porta, se debe añadir una gota
de agua, o de la solución acuosa pertinente, antes de colocar el cubre, para
evitar interfases agua-aire, que provocan zonas ciegas.
Para enfocar la preparación se ha de seguir de forma minuciosa el
protocolo.

Consejos prácticos
- En los microscopios que requieren transformador, el enchufe a la red
y desenchufe debe hacerse sobre el transformador, y nunca debe
desenchufarse el microscopio del transformador.
- Se debe mantener apagada la luz del microscopio siempre que no se
esté utilizando, ya que la vida media de la bombilla es corta.
- Siempre se debe comenzar el enfoque con el objetivo de menor
aumento.
- Anotar siempre el número de aumentos con el que se observa la
preparación. Para calcularlo basta multiplicar el número de aumentos
del objetivo por el de los oculares. Hacer esquemas y dibujos de lo
observado con cada aumento.
- Salvo que se indique lo contrario no utilizar nunca el objetivo de
inmersión, ya que se requiere un aceite especial sin el que, además
de no enfocar bien, existe una gran probabilidad de dañar la lente al
rozar con el cubreobjetos.
- Una vez enfocada, procurar recorrer, con los tornillos de la platina,
toda la preparación

1.8. Clases de Microscopios. Definir cada uno de ellos

Existen diversas clases de microscopios, según la naturaleza de los

sistemas de luz, y otros accesorios utilizados para obtener las imágenes.
Hay varios tipos de microscopios disponibles en el mercado. Seleccionar un
tipo adecuado no es una tarea simple, ya que tienes la necesidad de
determinar para qué fin será utilizado exactamente.

• El microscopio compuesto u óptico utiliza lentes para ampliar las

imágenes de los objetos observados. El aumento obtenido con estos
microscopios es reducido, debido a la longitud de onda de la luz
visible que impone limitaciones. El microscopio óptico puede ser
monocular, y consta de un solo tubo. La observación en estos casos
se hace con un solo ojo. Es binocular cuando posee dos tubos. La
observación se hace con los dos ojos. Esto presenta ventajas tales
como mejor percepción de la imagen, más cómoda la observación y
se perciben con mayor nitidez los detalles.
 Microscopio compuesto

• Microscopio estereoscópico: el microscopio estereoscópico hace

posible la visión tridimensional de los objetos. Consta de dos tubos
oculares y dos objetivos pares para cada aumento. Este microscopio
ofrece ventajas para observaciones que requieren pequeños
aumentos. El óptimo de visión estereoscópica se encuentra entre 2 y
40X o aumento total del microscopio.

Microscopio Estereoscopico

• Un microscopio digital tiene una cámara CCD adjunta y esta

conectada a un LCD, o a una pantalla de computadora. Un microscopio
digital usualmente no tiene ocular para ver los objetos directamente. El tipo
triocular de los microscopios digitales tienen la posibilidad de montar una
cámara, que será un microscopio USB.

Microscopio Digital
• Microscopio de campo oscuro. Este microscopio está provisto de
un condensador paraboloide, que hace que los rayos luminosos no
penetren directamente en el objetivo, sino que iluminan oblicuamente
la preparación. Los objetos aparecen como puntos luminosos sobre
un fondo oscuro.

Microscopio de campo oscuro

• Microscopio de fluorescencia. La fluorescencia es la propiedad que

tienen algunas sustancias de emitir luz propia cuando inciden sobre
ellas radiaciones energéticas. El tratamiento del material biológico
con flurocromos facilita la observación al microscopio.

Microscopio de fluorescencia

• Microscopio de contraste de fases. Se basa en las modificaciones

de la trayectoria de los rayos de luz, los cuales producen contrastes
notables en la preparación.
 Microscopio de contraste de fases

• Un microscopio electrónico es uno de los más avanzados e

importantes tipos de microscopios con la capacidad más alta de
magnificación. En los microscopios de electrones los electrones son
utilizados para iluminar las partículas más pequeñas. El microscopio de
electrón es una herramienta mucho más poderosa en comparación a los
comúnmente utilizados microscopios livianos.

Microscopio Electrónico

1.9. Para que se realizan la tinciones

Es un método utilizado para estudiar microorganismos. (no vivos); en estas

tinciones se observa morfología, estructura y agrupamientos de
microorganismos. El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal
que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad
es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio
más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos
pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para
revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como
flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad
respiratoria, etc.

1.10. Diferencia entre tinción simple y diferencial. Escriba tres

ejemplos de cada una.
Tinción Simple: utiliza un solo colorante Se utiliza un solo colorante, por lo
que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta
china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol). La tinción simple es
una tinción sencilla en la cual la bacteria es teñida con un solo reactivo.

La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes

capsuladas (Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares
rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de
los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las
preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.

Ejemplo: Un ejemplo de uso de tincion simple esta cuando quieres ver

levaduras y diferenciar las vivas de las muertas. Las levaduras muertas se
tiñen en su interior y se ven con el mismo color del tinte que aplicaste. Las
levaduras vivas no se tiñen por dentro.

Tinción diferencial: Se utilizan varios colorantes combinados. Las

estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes
que fijan de acuerdo con su propia constitución química. (Tinción de Gram,
Coloración de ácido resistencia). Es aquella donde usas mas de un (1)
colorante. Con esta tincion tu vas a poder ver morfologia, tamaño,
organizacion de las bacterias y ademas categorizar los microorganismos en
varios grupos, segun su afinidad con el colorante que tu estas utilizando

Ejemplo: Hay varios tipos de tincion diferencial pero las que uno mas usa
son la TINCION DE GRAM O COLORACION DE GRAM y la COLORACION DE
ZIEHL NEELSEN.

Con la TINCION DE GRAM tú puedes diferencias las bacterias en dos

grupos: BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y BACTERIAS GRAM NEGATIVAS. Eso
va a depender de si retienen o no el colorante CRISTAL VIOLETA o el
colorante SAFRANINA. La capacidad que tengan de retener un colorante o
no va a depender de la composicion de la pared celular de la bacteria.

Las GRAM POSITIVAS cuando realizar el procedimiento de tincion de gram,

puede ver que luego de añadir lugol, el colorante cristal violeta se mantiene
en el interior de la bacteria. Las GRAM NEGATIVAS al añadir lugol pierden la
coloracion del cristal violeta y si le añades otro colorante, por ejemplo la
safranina, adoptaran ese color.