DETERMINACIÓN DE ANTIGENOS DE ESTREPTOCOCOS POR

AGLUTINACIÓN DIRECTA EN PACIENTES CON FRECUENTES

ENFERMEDADES RESPIRATORIAS

Resumen

Para poder abordar a fondo este proyecto se debe contar con conocimientos básicos de
inmunología, en cuanto a técnicas en este caso de aglutinación, se debe de conocer el
fundamento del adyuvante completo de Freud que se utilizará para potencializar la
interacción entre el Ag administrado con las células del sistema inmunológico. De tal
manera se deben conocer a las bacterias en estudio en este caso las del género
estreptococos beta hemolíticos que son causantes de múltiples padecimientos.

Primeramente la aglutinación es la técnica que nos ayudara a confirmar que realmente

se cuenta con los anticuerpos o antígenos en este caso y que de manera cualitativa se
podrá dar un diagnostico rápido. Las reacciones de aglutinación directa son aquellas en
las que el antígeno se halla sobre la superficie de corpúsculos naturales, como los
microorganismos y los eritrocitos. Este tipo de prueba se utiliza para detectar
anticuerpos en suero contra los antígenos de las membranas de las células y pueden
realizarse en tubo o en placa; en las pruebas en placa se mezcla una suspensión de las
células, se hace oscilar la placa durante unos minutos y se observa la aparición de
aglutinación.

Las pruebas de aglutinación directa se han usado para diagnosticar infecciones

bacterianas.
Los cuerpos bacterianos pueden generar diferentes formas de aglutinación. Los
anticuerpos frente a los antígenos del cuerpo bacteriano formar un entrecruzamiento de
los microorganismos, que resulta en un precipitado granular compacto que se forma
lentamente, mientras que los anticuerpos frente a los flagelos producen un
entrecruzamiento con ellos, que originan un aglutinado ligero y rápido.

Los antígenos que serán ocupados en este proyecto son de estructura bacteriana de
estreptococos beta hemolíticos mismos que en el marco teórico se desarrollara a detalle.

La finalidad de obtener los eritrocitos es para poder hacer la reacción de aglutinación

visible, de tal modo se recubre a los anticuerpos de los eritrocitos para que al contacto
con el antígeno la reacción se aglutine o en este caso se coagule debido a que el
antígeno de estreptococo contiene estreptolisinas que lisan a los eritrocitos. El método
se extracción de eritrocitos se llevara a cabo con aldehído pirúvico y formaldehido que
más adelante se explica a detalle.

Introducción

En el presente proyecto se pretende determinar la presencia de antígenos siendo estos

bacterias estreptococos β-H, utilizando una técnica de aglutinación directa, la
determinación será en muestras clínicas de saliva (esputo) con la finalidad de detectar la
presencia de estos antígenos en faringe (garganta), para esto se sembrara en medio
liquido (BHI) estreptococos β-H, se incubara a 37°C/48 hrs para obtener una biomasa
de la bacteria, para esto se centrifugara, se realizaran lavados a esta, posteriormente se
inactivara por medio de calentamiento para después inmunizar a ratas wistar de manera
intraganglionar, con adyuvante completo de freund (ACF), durante 3 semanas. Se
obtendrán muestras sanguíneas de las ratas por punción cardiaca, se centrifugaran estas
muestras con la finalidad de obtener anticuerpos contra la estructura bacteriana de
estreptococos β-H.

Se obtendrán eritrocitos de sangre de bovino, tratándolos con aldehído pirúvico, para

con estos realizar un marcaje a los anticuerpos obtenidos del centrifugado de la sangre
de las ratas, de esta forma obteniendo una solución la cual se enfrentara con exudado
faríngeo o muestras de saliva o esputo, para asi determinar la presencia de estreptococos
β-H, si se observara aglutinación.

Marco teórico

Los estreptococos son organismos anaerobios facultativos y Gram Positivos que a

menudo aparecen formando cadenas o por pares y son catalasa-negativa. Los
estreptococos se subdividen en grupos mediante anticuerpos que reconocen a los
antígenos de superficie. Estos grupos incluyen una o más especies. Las agrupaciones de
estreptococos más importantes son A, B, y D. Entre los grupos de estreptococos, la
enfermedad contagiosa (especificamente faringitis) es causada por el grupo A, que es el
Streptococcus pyogenes. El Streptococcus pneumoniae (es la causa principal de
pulmonía humana), Streptococcus mutans y otros estreptococos llamados viridans (entre
las causas de caries dental) no pertenecen a grupos antigénicos.

Estreptococo del grupo A  (S. pyogenes)

Este organismo causa tradicionalmente faringitis supurativa pero no invasiva y menos

frecuentemente infecciones en la piel, el impétigo. A mediados de los 1900, las serias
complicaciones de las infecciones por estreptococos del grupo A comenzaron a declinar
drásticamente y han disminuido ya en la década de los 70's. Por lo tanto el interés por
este microorganismo disminuyó. En los años 80's y 90's, ha habido un resurgimiento de
la "fiebre reumática" clásica (enfermedad del corazón no supurativa) pero también
surgieron nuevas formas de enfermedad estreptococal las cuales incluyen a la
bacteremia invasiva y al síndrome de choque tóxico (como se ha visto con S. aureus) y
la conocida “bacteria carnívora”.

Las infecciones de estreptococos del grupo A afectan todas las edades con incidencia
máxima de 5-15 años de edad. Las complicaciones serias (incluyendo  fiebre reumática
y bacteremia invasiva) parecía que afectaban primariamente aquellos individuos con
defectos importantes en su sistema inmune (incluyendo niños, personas de edad
avanzada y pacientes inmuno-comprometidos). Sin embargo, hoy en día es claro que los
niños y adultos previamente saludables, una vez que se infectan están definitivamente
en riesgo de presentar complicaciones graves.
Fiebre reumática. La fiebre reumática, es una enfermedad inflamatoria que afecta
principalmente el corazón y las articulaciones. Aunque es severa puede tomar un
periodo de tiempo para desarrollarse. El mecanismo de la inmunopatológía  crónica de
la fiebre reumática no se ha  resuelto. La proteína M presenta reacción cruzada con la
miosina del corazón y esto conduce a autoinmunidad. Aunque la pared celular de los
estreptococos del grupo A es altamente resistente a la degradación en el hospedero.
Estos antígenos persisten in vivo por meses y experimentalmente causan enfermedades
que se asemejan a la artritis y a la carditis reumatoide. La artritis reumática no se
debería  confundir con la enfermedad reumática más común la artritis reumatoide. La
terapia temprana de las infecciones de la garganta usando penicilina, disminuye la
incidencia del desarrollo subsecuente de carditis reumática.

Características generales de la patogénesis

La identidad de la adhesina que permite la adherencia al epitelio respiratorio (vía

fibronectina) es controversial. El ácido lipoteicoico se localiza en la membrana celular
de muchas bacterias. Para el estreptococo del grupo A mucho ácido lipoteicóico
también está presente en las  fimbrias del exterior de la célula. Un trabajo clásico
sugiere que el ácido lipoteicoico es la adhesina del grupo A, aunque más recientemente
se ha sugerido que ese papel lo realiza la "proteína F” (de unión a fibronectina).

El estreptococo del Grupo A en ausencia del fibrinógeno que fija complemento al

encontrarse con la lamina de peptidoglicano y en ausencia de anticuerpos, ya no es
fagocitado. La proteína M (que también se encuentra en las fimbrias) se une al
fibrinógeno del suero y bloquea la unión del complemento con la capa mas interna del
peptidoglicano. Esto permite la sobrevivencia del microorganismo debido a la
inhibición de la fagocitosis. Sin embargo, en individuos que son inmunes, los
anticuerpos neutralizantes que reaccionan contra la proteína M causan la fagocitosis
misma que resulta en muerte del micro organismo. Este es el mecanismo principal por
el cual la inmunidad es capaz de detener las infecciones del estreptococo del grupo A.
Las vacunas contra la proteína M son por lo tanto un candidato de importancia que se
puede usar contra la fiebre reumática. Clásicamente se había considerado que la cápsula
del estreptococo del grupo A  posee limitada actividad antifagocítica. Muchas de las
cepas virulentas recientemente descritas son altamente mucoides y sus cápsulas son
importantes en la patogénesis.
Desafortunadamente, ciertos tipos de la proteína M presentan reacción antigénica
cruzada con proteínas del corazón y esto puede ser responsable de carditis reumática. El
temor que se tenia de adquirir autoinmunidad lo ha inhibido positivamente el uso de las
vacunas contra el estreptococo del grupo A. Sin embargo, distintos epítopes protectores
contra aquellos de reacción cruzada ya se han definido y la disponibilidad de una
vacuna parece más probable. Las proteínas M varían antigénicamente entre las cepas;
por lo tanto la inmunidad contra una proteína M no implica  inmunidad general contra
todas las cepas de S. pyogenes. La tipificación por proteína M junto con otros antígenos
(T y R) se usan en la serotipificación.

Justificación académica

La importancia de determinar este agente patógeno que es el estreptococo beta

hemolítico es que es causante de múltiples padecimientos que si no se trata a tiempo
puede desencadenar a problemas como fiebre reumática entre otras. Los laboratorios
clínicos no se hace el diagnóstico de estreptococo a menos de que se haga un exudado
faríngeo pero el resultado es tardado y únicamente hacen referencia a su presencia; sin
tomar en cuenta el daño que ocasiona si no es tratado a tiempo. Nuestro proyecto
propone una identificación rápida para que el paciente este enterado de que contiene el
antígeno bacteriano y podrá ser puesto en alerta inmediata para poder llevar a cabo un
tratamiento. Se propone que el paciente tome conciencia de la importancia de portar un
estreptococo beta hemolítico y de que su presencia se debe a sus frecuentes
enfermedades respiratorias.

Planteamiento del problema

La realización de este proyecto se hace con la finalidad de un diagnostico rápido para la

identificación de estreptococos beta hemolíticos en pacientes con frecuentes
enfermedades respiratorias debido a que muchas de ellas se les atribuye una procedencia
viral sin darle mucha importancia al género bacteriano que hoy en día es muy común, y
de tal manera poder hacer un descarte de infecciones virales y poder proponer un
posible tratamiento terapéutico frente a estos agentes.

Hipótesis

Si se aíslan las proteínas presentes en los estreptococos del grupo A, y se logran recubrir
eritrocitos con proteínas después de modificar su superficie con acido tánico, será
posible llevar a cabo una reacción inmunológica de hemaglutinacion al someter suero
del paciente del cual se sospecha estar infectado con estreptococo del grupo A.

Objetivo General

Identificar la presencia del Streptococo del grupo A, por medio de la reacción antígeno-
anticuerpo, para detectar un proceso infeccioso con dicho microorganismo en un
paciente.

Objetivos particulares
 Obtener una Cepa pura de Streptococos del grupo A.
 Liberar las proteínas presentes el microorganismo por sonicado.
 Aislamiento de eritrocitos con el propósito modificar la superficie con acido
tanico.
 Recubrir los eritrocitos tratados con proteínas extraidas del m.o.
 Identificación de un proceso infeccioso provocado por el m.o. en estudio, con
ayuda de una hemaglutinación.
Diseño
 Sembrar en medio liquido BHI
Obtener la cepa de Streptococo del
grupo A.
para obtener biomasa de
estreptococos

Realizar el tratamiento
obtenida la biomasa lisar las
correspondiente a los eritrocitos
bacterias por sonicado
con acido tanico.

Sensibilización de los glóbulos rojos

tanizados con las proteinas de S. del
grupo A.
Obtención de la cepa.
1.- Obtener la cepa de Straptococos del grupo A procedente de un exudado faríngeo.
2.- confirmar que se trate de los microorganismos a utilizar con ayuda de la identificación por purebas
bioquímicas primarias y secundarias pertinentes.

Obtención de la biomasa.

Lisis por sonicacion.

Suspensión de hematíes
1.- Obtener sangre humana por punción venosa (se recomienda que el paciente sea O (+)).
2.- Lavar los glóbulos rojos por 3 veces con suero fisiológico, centrifugando a 3000 r.p.m. durante 10
minutos.
3.- Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 2,8% en buffer fosfato pH 7,2.
Ejemplo: Para preparar 5mL de suspensión de glóbulos rojos, tomar 0,14 mL del sedimento de
glóbulos rojos y resuspenderlo en 4,86 mL de buffer fosfato, pH 7,2.

Tanización de los glóbulos rojos

1.- Mezclar 5 mL de glóbulos rojos con 5 mL de una solución de Acido Tánico 1/20,000 e incubar a
37°C por 10 minutos.
2.- Centrifugar a 2 000 r.p m. por 7 minutos.
3.- Decantar el sobrenadante.
4.- Resuspender el sedimento en 10 mL de buffer fosfato pH 7,2.
5.- Centrifugar a 2 000 r.p.m. por 7 minutos.
6.- Descartar el sobrenadante.
7.- Resuspender el sedimento en 5 mL de solución salina.

Sensibilización de los glóbulos rojos tanizados con proteínas.

1.- Tubo N°1: colocar 5 mL de antígeno ( diluido 1/20 en buffer fosfato pH 6,4)
2.- Adicionar 5 mL de suspensión de glóbulos rojos tanados
3.- Tubo N°2 (control): colocar 5 mL de buffer pH 6,4
4.- Incubar los tubos en Baño María a 37°C durante 20 minutos
5.- Centrifugar a 2 000 r.p.m. por 10 minutos
6.- Eliminar el sobrenadante
7.- Lavar el sedimento con 10 mL de solución diluyente
8.- Centrifugar a 2 000 r.p.m.
9.- Descartar el sobrenadante
10.- Resuspender el sedimento en 5 mL de solución diluyente

Hemaglutinación
1.- Rotular una placa de microtitulación para realizar diluciones de los sueros, incluyendo los sueros
controles positivo y negativo. Iniciar en la dilución 1/16 hasta1/2048.
2.- Colocar en los pozos de la fila A 75 μL de la solución diluyente (Anexo G) y 50 μL de la misma
solución en los pozos de las filas B,C,D,E,F,G,H.
3.- Agregar a cada pozo de la fila A, 25 μL del suero a evaluar, homogenizar aspirando y expeliendo
varias veces con la pipeta.
4.- Luego realizar diluciones sucesivas. Con la ayuda de una micropipeta multicanal tomar 50 μL de
la dilución 1/16 de cada suero a evaluar y verterlo en los pozos de la fila siguiente, homogenizar y
repetir igual con la siguiente fila, teniendo cuidado de descartar las puntas.
5.- Agregar 50 μLde la solución de glóbulos rojos sensibilizados con proteínas en cada
pocillo.
6.- Agitar con suaves golpes en los bordes de la placa.
7.- Dejar la placa en reposo sobre una superficie plana.
8.- Realizar la lectura a la hora y a las 24 horas.
9.7 LECTURA (Figura Nº 28)
La reactividad del suero (positivo), se manifiesta por la formación de una malla homogénea de bordes
irregulares que cubren al 50-100% del fondo del pocillo, en tanto, la falta de reactividad (negativo) se
manifiesta por la sedimentación de glóbulos rojos en forma de botón en el fondo del pocillo. Se
considera positiva la muestra a partir de la dilución 1/32 y se informa con el título de la última dilución
positiva.
Técnicas y métodos de laboratorio clínico

José Manuel González de Buitrago

4 Reseñas
Elsevier España, 2004 - 527 páginas

http://www.espatentes.com/pdf/0378524_A1.pdf

http://pathmicro.med.sc.edu/Spanish/chapter12.htm

www.ins.gob.pe/.../MAN%20%20PROC%20%20SEROLOGICO%20p65.pdf